JP2007527237A - 生体物質を抽出する方法、チップ、デバイス及びシステム - Google Patents
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Abstract
Description
細菌及びウィルスの最も感受性の高い検出方法は、有機体の細胞内成分、例えば遺伝物質にアクセスすることに依存する。
本発明の対象は、抽出のための、すなわち、生体細胞の生体物質にアクセスするための方法、チップ、デバイス及びシステムを提供することに関する。
本発明の1観点は、生体細胞から生体物質を抽出する方法であって、該方法は、
a) 試料チャンバと、第1及び第2の電極とを用意し、該第1及び第2の電極、並びに該試料チャンバは、該試料チャンバの少なくとも一部が該第1の電極と該第2の電極との間にあるように位置決めされ、
b) 該試料チャンバ内に、生体細胞を含む液体試料を提供し、
c) 前記液体試料を前記試料チャンバ内の交流電場に対して暴露し、前記交流電場は、該第1及び第2の電極によって提供され、また、該生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有する
ステップを含む、生体細胞から生体物質を抽出する方法に関連する。
- 該試料チャンバは、周囲空気と流体連通する第1の開口と、デバイスと流体連通を形成するための第2の開口とを含み、
- 該第1及び第2の電極は、該試料チャンバの互いに対向する側に位置決めされている、
生体細胞から生体物質を抽出するチップに関する。
- 該デバイスと機能上連携するための、チップが配置されるべきチップ位置、
- 該試料チャンバの電極間に交流電場を印加するための、該デバイスと該チップとの間の電気界面、及び
- 該デバイスが、
- 該チップが該デバイスと機能上連携しているかどうかをチェックすること、
- 該試料チャンバ内に、生体細胞を含む液体試料を提供すること、
- 前記液体試料を前記試料チャンバ内の交流電場に対して暴露し、前記交流電場は、該第1及び第2の電極によって提供され、また、該生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有すること、及び
- 該生体細胞から抽出された生体物質を含む、該暴露された液体試料の一部に対する分析を行うこと
から成る群から選択された1つ又は2つ以上の作用を実施するようにするソフトウェアを含むプログラム可能ユニット
を含む、生体細胞から生体物質を抽出するデバイスに関する。
本発明の1観点は、生体細胞から生体物質を抽出する方法であって、該方法は、
a) 試料チャンバと、第1及び第2の電極とを用意し、該第1及び第2の電極、並びに該試料チャンバは、該試料チャンバの少なくとも一部が該第1の電極と該第2の電極との間にあるように位置決めされ、
b) 該試料チャンバ内に、生体細胞を含む液体試料を提供し、そして
c) 前記液体試料を前記試料チャンバ内の交流電場に対して暴露し、前記交流電場は、該第1及び第2の電極によって提供され、また、該生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有する、
ステップを含む、生体細胞から生体物質を抽出する方法に関する。
加熱電極は、種々異なる形状又は寸法を有することができる。例えば加熱電極は、シート、プレート、ディスク、ワイヤ、又はロッドから成る群から選択された実質的な形態を有することができる。
交流電場の振幅、すなわち第1の電極と第2の電極との間の最大電位差は、例えば1〜100 V、例えば1〜2、2〜3、3〜4、4〜5、5〜6、6〜8、8〜10、10〜15、15〜20、20〜30 V、例えば30〜100であってよい。好ましくは、第1の電極と第2の電極との間の最大電位差は、5〜50 V、例えば10〜25 Vである。
- 該試料チャンバは、周囲空気と流体連通する第1の開口と、デバイスと流体連通を形成するための第2の開口とを含み、
- 該第1及び第2の電極は、該試料チャンバの互いに対向する側に位置決めされている、
生体細胞から生体物質を抽出するチップに関する。
- 該デバイスと機能上連携するための、チップが配置されるべきチップ位置、
- 該試料チャンバの電極間に交流電場を印加するための、該デバイスと該チップとの間の電気界面、及び
- 該デバイスが、
- 該チップが該デバイスと機能上連携しているかどうかをチェックすること、
- 該試料チャンバ内に、生体細胞を含む液体試料を提供すること、
- 前記液体試料を前記試料チャンバ内の交流電場に対して暴露し、前記交流電場は、該第1及び第2の電極によって提供され、また、該生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有すること、及び
- 該生体細胞から抽出された生体物質を含む、該暴露された液体試料の一部に対する分析を行うこと
から成る群から選択された1つ又は2つ以上の作用を実施するようにするソフトウェアを含むプログラム可能ユニット
を含む、生体細胞から生体物質を抽出するデバイスに関する。
- 液体試料を前記試料チャンバ内の交流電場に対して暴露し、前記交流電場は、生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有すること、及び
- 暴露された液体試料の生体物質に対する分析を行うこと
から成る群から選択された1つ又は2つ以上の作用、例えば2つ又は3つの作用を実施するようになってよい。
内部電源は例えばバッテリーを含んでよい。PCR反応中に利用されるべきエネルギーの量は、PCRサイクルの最小温度と最大温度との間で、流体試料の容積と等価の容積の水を加熱するのに必要とされる熱の量として推定することができる。この温度差は約50 Kであり、ひいては、1サイクル当たり移動されるべき熱は、30 μL試料容積に対して約6ジュールである。例えば60サイクル行うと、1PCR反応の総エネルギー消費量は、60*6 = 360ジュールになる。商業的熱サイクラーに匹敵するランプ時間を用いると(すなわち1秒当たり2℃)、所要出力は360*2/50 = 14.4 Wである。
1. 皮層内のNAM残基の約50%は、ムラミン酸-rho-ラクタム(MAL)として存在し、MAL残基の大部分は、グリカン鎖内のムラミン酸位置1つおきに配置されている。
2. NAM残基の約25%が単一のL-アラニンだけを担持し、そしてMAL残基はペプチド側鎖を担持しないので、成長中の細胞と比較して、胞子皮層内の架橋形成に関与するためには、多くのDdm残基の1/4だけが利用可能である。その結果、胞子PGは、増殖性細胞内よりも架橋される量が著しく少ない。しかし、胞子皮層内の正確な分子配列は知られていない。胞子皮層は胞子の浸透膨潤及び収縮に関与することが判っている。
緩衝剤、dNTP及びTaqポリメラーゼを含有する一体化溶液であるTaqMan Universal PCR Master Mixシステム(Applied Biosystems)を使用して、Opticon DNAエンジン(MJ research)上でリアルタイムPCR分析を実施した。全てBacillus thurigiensisの16S及び23S tRNAの遺伝子間スペーサを増幅することを目的として、2つのプライマー269-16-23スペーサ1 5'-TAT GAG CTA CAC TGT TAT CTA GTT TTC AAA GAA-3'(SEQ ID NO:1)及び270-16-23スペーサ2 5'-TTT-CCG TGT TTC GTT TTG TTC AG-3'(SEQ ID NO:2)を最終濃度900 nMで添加し、そして蛍光TAQMANプローブ(FAM-ACT TCT CTC ATA TAT AAA TGT-MGB-NFQ)(SEQ ID NO:3)を100 nMで添加した。標準PCRは15 μl試料容積を使用し、そして15分間95℃でインキュベートしてTaq ポリメラーゼを活性化することにより、PCRを開始した。続いて、15秒、94℃の溶融ステップと、60秒、60℃のアニール・伸長複合ステップとから成る2ステップPCR反応を40サイクル適用した。各サイクルの終了時に、蛍光をオンライン測定することにより、PCR生成物の形成を分析した。
3.2 x 109胞子/g(Valent BioSciences Corp, Libertyville, USA)を含有する100 mgのBiobit Bacillus thuringiensis subsp. kurstakiを、1 mlの脱塩水中に再懸濁し、そして12000 rpmで90秒にわたって遠心分離した。この手順を4回にわたって反復した。上澄みを廃棄した。最終溶液は約3.2 x 108個の胞子を含有した。この溶液を約3.2 x 105胞子/mlの最終濃度まで希釈し、続いて電気分解及びPCRのために使用した。
3.2 x 109胞子/g(Valent BioSciences Corp, Libertyville, USA)を含有する100 mgのBiobit Bacillus thuringiensis subsp. kurstakiを、1 mlの脱塩水中に再懸濁し、そして12000 rpmで90秒にわたって遠心分離した。この手順を4回にわたって反復した。上澄みを廃棄した。最終溶液は約3.2 x 108個の胞子を含有した。この溶液を約3.2 x 105胞子/mlの最終濃度まで希釈し、続いて電気分解及びPCRのために使用した。
周波数及び電圧を一定に保って(それぞれ100 kHz及び30秒)、電解処置の電圧を、暴露電圧を3から10ボルトに変化させる(それぞれ3、5、7及び10 V)ことによって試験した。図5から判るように、膜/胞子破裂のための電圧閾値VTが存在することが明らかである。こうして、印加された電圧は、界面電極抵抗に高く依存する臨界パラメータであり、例えば、印加電圧が低い(<2 V)と、ピーク形状勾配を発生させる長いパルス時間(>100 μs)でも、電極を横切る電位勾配は極めて小さくなる。
ほぼ109CFU/g(Valent BioSciences Corp, Libertyville, USA)を含有する100 mgのBiobit Bacillus thuringiensis subsp. kurstakiを、1 mlの脱塩水中に再懸濁し、続いて5分間にわたって70℃で低温殺菌し、続いて溶液を遠心分離する(5000 x g、5分)。上澄みを廃棄する。この(チンダル化)手順をさらに2回反復する。最終溶液1 mlは約108個の胞子を含有する。
として測定する。dsはカウントされた青色DNAスポット数であり、ssは総胞子数である。
バックグラウンドDNA/RNA解放パーセンテージを対照に関して測定することもでき、そしてこれが5%を上回るバックグラウンド解放を示す場合には、この測定は無効とみなされ、生体細胞の新しい原液において測定が繰り返されることが示唆される。
Claims (22)
- 生体細胞から生体物質を抽出する方法であって、該方法は、
a) 試料チャンバと、第1及び第2の電極とを用意し、該第1及び第2の電極、並びに該試料チャンバは、該試料チャンバの少なくとも一部が該第1の電極と該第2の電極との間にあるように位置決めされ、
b) 該試料チャンバ内に、生体細胞を含む液体試料を提供し、
c) 前記液体試料を前記試料チャンバ内の交流電場に対して暴露し、前記交流電場は、該第1及び第2の電極によって提供され、また、該生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有し、そして
d) 任意には、該生体細胞から抽出された生体物質を含む、該暴露された液体試料の一部に対する分析を行う、
ステップを含む、生体細胞から生体物質を抽出する方法。 - 該第1の電極と該第2の電極とが、20 mm以下、好ましくは10 mm以下、そしてより好ましくは5 mm以下の距離だけ分離されている、請求項1に記載の方法。
- 該生体細胞が、該第1の電極と該第2の電極とに付着させられ、且つ/又は、該第1の電極と該第2の電極との間に配置される、請求項1に記載の方法。
- 前記交流電場の周波数は、5 kHz以上であり、好ましくは20 kHz以上であり、そしてより好ましくは50 kHz以上である、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記交流電場の周波数は、100 kHz以上であり、好ましくは250 kHz以上であり、そしてより好ましくは500 kHz以上である、請求項4に記載の方法。
- 前記交流電場が、該第1及び第2の電極の極性を調節することによって形成される、請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法。
- 該交流電場が、方形、正弦、鋸歯、非対称三角形、対称三角形;又はこれらの任意の組み合わせから成る群から選択された実質的な形態を有する、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- 該交流電場が、周波数領域において、少なくとも第1及び第2の周波数成分を含む、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。
- 該生体物質が、細胞小器官、遺伝物質、及びタンパク質から成る群から選択された成分を含む、請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法。
- 該遺伝物質が、染色体DNA及び/又はプラスミドDNA及び/又は任意のタイプのRNAを含む、請求項9に記載の方法。
- 該タンパク質が、酵素、構造タンパク質、輸送タンパク質、イオンチャネル、毒素、ホルモン、及び受容体から成る群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 該生体細胞が、細菌、古細菌、又は真核微生物、及び真核生物細胞から成る群から選択される、請求項1から11までのいずれか1項に記載の方法。
- 該細菌が胞子形成細菌である、請求項12に記載の方法。
- 該胞子形成細菌が、Bacillus属及び/又はClostridium属から選択される、請求項13に記載の方法。
- 該細菌がBacillus群に由来する、請求項1から14までのいずれか1項に記載の方法。
- 該細菌がBacillus anthracisである、請求項15に記載の方法。
- 該生体細胞が増殖性細菌、又は胞子である、請求項12から16までのいずれか1項に記載の方法。
- 生体細胞から生体物質を抽出するチップであって、試料チャンバを含む該チップは、試料チャンバと、第1及び第2の電極と、任意には該第1の電極と該第2の電極との間の交流電場とを含み、
- 該試料チャンバは、周囲空気と流体連通する第1の開口と、デバイスと流体連通を形成するための第2の開口とを含み、
- 該第1及び第2の電極は、該試料チャンバの互いに対向する側に位置決めされており、
- 任意には、該試料チャンバはさらに、生体細胞を含む液体試料を含み、
- 任意には、該交流電場が、該生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有する、
生体細胞から生体物質を抽出するチップ。 - 該第1及び第2の電極が、該第1の開口と該第2の開口との間に位置決めされている、請求項18に記載のチップ。
- 該生体細胞が、該第1の電極と該第2の電極との間に配置されている、請求項18又は19に記載のチップ。
- 生体細胞から生体物質を抽出するデバイスであって、該デバイスが:
- 該デバイスと機能上連携するための、チップが配置されるべきチップ位置、
- 該試料チャンバの電極間に交流電場を印加するための、該デバイスと該チップとの間の電気界面、及び
- 該デバイスが、
- 試料チャンバ内に、生体細胞を含む液体試料を提供すること、
- 前記液体試料を前記試料チャンバ内の交流電場に対して暴露し、前記交流電場は、生体細胞から生体物質を抽出するのに十分な振幅を有すること、及び
- 該生体細胞から抽出された生体物質を含む、該暴露された液体試料の一部に対する分析を行うこと
から成る群から選択された1つ又は2つ以上の作用を実施するようにするソフトウェアを含むプログラム可能ユニット
を含む、生体細胞から生体物質を抽出するデバイス。 - 生体細胞から生体物質を抽出するシステムであって、該システムは、請求項21に記載のデバイスと機能上連携する請求項18から20までのいずれか1項に記載のチップを含む、生体細胞から生体物質を抽出するシステム。
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