JP2011528564A - 導電性材料内に電場を印加するプロセスおよびデバイス - Google Patents

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ジュリアン・ヴィルメジャヌ
ブルーノ・ル・ピウフル
ルイ・マリア・ミル
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サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィーク・（セ・エン・エール・エス）
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Abstract

本発明は、たとえば、細胞のエレクトロポレーションのため、パルス状電場を使用した組織細胞内への核酸の電気媒介型遺伝子導入のため、かつ／または、一般に細胞膜または細胞内部の電気操作のために、任意の有機または無機導電性材料および／または任意の生物学的材料および／または細胞に、インビボで、エクスビボで、またはインビトロで電気パルスを送達することに関する。生物学的材料などの導電性材料を処置するための、前記導電性材料の特性を変更するように前記導電性材料に電場が印加されることを可能にする電気パルスアプリケータは、処置される導電性材料内に、かつ／または、導電性材料の近傍に導入されることを意図された導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む少なくとも１つの電極と、１０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きな傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを電極に送出するパルス発生器とを備える。

Description

本発明は、たとえば、細胞のエレクトロポレーションのため、パルス状電場を使用した組織細胞内への核酸の電気媒介型遺伝子導入（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）のため、かつ／または、一般に細胞膜または細胞内部の電気操作（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）のために、任意の有機または無機導電性材料および／または任意の生物学的材料および／または細胞に、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で、またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で電気パルスを送達することに関する。
ＤＮＡ電気的導入（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）または電気遺伝子療法（ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ）とも呼ばれる電気媒介型遺伝子導入は、前記組織内に挿入するための、パルス発生器に接続された針電極として通常設計される、種々の単一電極設計または２つ以上の電極のアレイなどの複数電極設計を使用する。この方法は、種々の組織、すなわち、筋肉、肝臓、皮膚、腫瘍、マウス精巣などへプラスミドＤＮＡを電気的導入するのに有効であることが示されている。
電気パルスが標的細胞内へのＤＮＡ導入を媒介するメカニズムは、十分には理解されていない。それでも、組織内へのＤＮＡ導入を改善するには、その組織内の細胞が透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）されなければならないという一般的な合意が存在している。こうした透過化は、短い（１００μ秒の範囲の）方形波電気パルスの単純な実行を使用して達成され得る。この種のパルスは「抗腫瘍電気化学療法」と呼ばれる処置において、（ブレオマイシンまたはシスプラチンのような）非透過性抗癌薬を局所送達するために広く使用されている。実際に、インビトロでもインビボでも、たとえば１３００Ｖ／ｃｍおよび１００μ秒の８個のパルスを腫瘍に送達すれば、過渡的な細胞膜の再配列を誘発すのに十分であり、これによって、ブレオマイシンのような非透過性抗癌分子を拡散により細胞に進入させ、その細胞毒活性を十分に発揮させることが可能となる。
これらの短い透過化電気パルスは、いくつかの組織内へのプラスミドＤＮＡの導入を増大させることが示されている。しかし、別のタイプの方形波電気パルスは、筋肉、腫瘍、肝臓、およびその他のいくつかの組織に印加され、ＤＮＡ電気的導入にとってより効果的であることが見出された。これらのパルスは通常、電圧がより低いが、持続時間がずっと長い（数１０ミリ秒の範囲）。このタイプのパルスは、電場送達中における（短パルスと同様の）細胞透過化およびＤＮＡ電気泳動を含む２つの別個の効果を誘発することによって、細胞内へのＤＮＡ導入を媒介すると推測される。
細胞内への効率的な電気的導入は、とりわけ特許文献１および特許文献２に記載されている。
１９６０年〜１９７０年の間、生細胞に対するパルス状電場（ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ）（ＰＥＦ）送達が、電気的透過化と呼ばれる、細胞膜の可逆的または非可逆的破壊を誘発することを、インビトロ調査が示した（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。１００μｓ〜１００ｍｓおよび２５〜１５００Ｖ／ｃｍの範囲では、ＰＥＦは、遺伝子または分子が細胞に入るのを可能にするために使用される（非特許文献６）。いくつかの古典的な化学療法薬（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ）（ブレオマイシンまたはシスプラチン）に関連して、ＰＥＦは、周りの組織に損傷を与えることなく癌組織内で薬物をベクトル化し得る（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。この技法は電気化学療法である。遺伝子電気的導入と呼ばれ、かつ、同じ物理的方法に基づく別の技法は、血漿膜に非可逆的損傷をもたらすことなく、ＤＮＡプラスミドを細胞内に内部移行させるのに使用される（非特許文献１０；非特許文献１１）。
新しい種類のＰＥＦ、ナノ秒パルス状電場（ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ）（ｎｓＰＥＦ）は、実際は調査中である。ｎｓＰＥＦは、高い電場強（１０〜１５０ｋＶ／ｃｍ）を有する超短パルス（１０〜３００ｎｓ）であり、暴露される細胞の温度を上げない（非特許文献１２）。ｎｓＰＥＦが、細胞内膜（顆粒、小胞、ミトコンドリア、核…）の透過化を誘発したが、血漿膜の透過化を誘発しなかったことを、最初の調査が示した（非特許文献１２；非特許文献１３）。しかし、非特許文献１４は、複数のｎｓＰＥＦまたは長いナノパルスの印加中の考えられる膜のポレーションを示す。
動物の細胞に及ぼすｎｓＰＥＦの効果、特にアポトーシスに関するいくつかの調査が出版されている。これらの調査は、カスパーゼ活性のようなアポトーシスマーカの誘発、フォスファチジルセリン外在化（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、および細胞質内へのシトクロムｃ放出を報告している（非特許文献１５；非特許文献１６）。ＤＮＡ損傷（非特許文献１７；非特許文献１８）ならびに細胞に及ぼすｎｓＰＥＦ効果の細胞特異性が見出された。Ｓｔａｃｅｙ等（非特許文献１７）は、接着細胞に比較して浮遊細胞において生存率の減少およびＤＮＡ損傷の増加を実証した。
ｎｓＰＥＦはまた、（ｉ）血漿膜完全性を維持する条件下での細胞内の小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）からの細胞内カルシウムの放出（非特許文献１７：非特許文献１９：非特許文献２０）および（ｉｉ）遺伝子トランスフェクション効率の増大を誘発することを示された。これらの論文の中で、懸濁液中の細胞内へのＧＦＰ遺伝子電気的導入後３０分して、１個のｎｓＰＥＦ（１０ｎｓ、１５０ｋＶ／ｃｍ）を印加することが、電気的導入だけの場合と比較して、ＧＦＰ発現の３倍の増加を可能にすることを、ある実験が示した（非特許文献２１；非特許文献２０）。非ウィルス性遺伝子治療用の他の手法のような電気的遺伝子導入は、遺伝子治療用のウィルス性手法より効率が低いと考えられるため、ＧＦＰレポータ遺伝子発現の３倍以上の増加は、ウィルス性手法に比べて安全でかつ容易であると一般に考えられる、この非ウィルス性遺伝子治療手法の開発にとって非常に重要である。
さらに、エレクトロポレーションは、種々の単一電極設計または２つ以上の電極のアレイなどの複数電極設計を使用して表面下の組織に分子を送達することに適用されており、２つ以上の電極は、通常、前記組織に挿入するための針電極として設計され、前記電極は、パルス発生器に接続される。一般に、こうしたアレイは、アレイの針電極間に存在する処置ゾーンを画定する。したがって、こうした処置ゾーンは、組織の３次元容積を備え、処置ゾーン内の細胞は、３次元容積内に、かつ／または、３次元容積の近くに存在する細胞に対して、細胞膜の一時的なまたは可逆的なポレーションあるいはさらにときには非可逆的なポレーションを引き起すのに十分な強度の電場に暴露される。
特許文献３は、生物学的組織の細胞に、その膜の特性を変更するために、電場を印加する、生物学的組織処置のためのこうしたプロセスおよび電気パルスアプリケータを開示している。
組織内の細胞に電気穿孔する現在の慣行は、３次元処置ゾーンを通して比較的均一な電場を与えるために、かなりの電圧の使用を含む。「比較的均一な（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｕｎｉｆｏｒｍ）」によって、ポレーションをもたらすのに十分な電気パルスの印加に一致する電気力線が、３次元処置ゾーン容積全体を通して細胞にわたってある程度均等に与えられることが意味される。
複数の針を有するデバイスの侵襲的側面の他に、先に述べた典型的なエレクトロポレーション技法は、処置ゾーン内の細胞のエレクトロポレーションの可変性をもたらす。これは、注入されたボーラスの処置分子の周囲組織内への分散が、エレクトロポレーション事象によって処置ゾーン内の細胞内に最終的に移入される（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）処置分子の量に関するコントロールの喪失をもたらす点で、エレクトロポレーションの医療使用にとって欠点である。
さらに、皮膚または生物学的組織の接触部上での金属電極の使用は、皮膚上で目に見え、かつ、患者に苦痛を与え得る熱傷をもたらす可能性がある。これらの熱傷は、おそらく電気化学的な種類のものである。実際に、電極の酸化可能な金属ならびに電極の周囲にまた前記電極の接触部上に存在するＨ２ＯおよびＮａＣｌの分子は、パルスが送達されると、種々の反応性種を生成する。これらの熱傷を回避するか、または、低減するために、電極を同化する（ｅｌａｂｏｒａｔｅ）生体適合性材料、たとえば特定の金属または合金を使用することが必要である。この制約は、重金属、毒性イオン、すなわち、一般に非生体適合性物質を含む可能性がある、最適な電気特性（導電率、誘電率）を有する材料の使用を排除する可能性がある。電気化学的熱傷は、正常細胞に影響を及ぼし、電気的遺伝子導入の有効性を減少させるか、または、電気化学療法によって処置される容積を減少させる可能性がある（その理由は、電気パルスが、それ自体、この用途で細胞を殺傷せず、ブレオマイシンが、悪性腫瘍細胞をほぼ排他的に殺傷し、非分割正常細胞を残すからである）。さらに、超短ナノパルスは、接触部にまたは電極の近くに位置する筋肉の収縮を誘発することができないように思われ、そのことは、古典的な１００μｓ長パルスを使用する電気化学療法による処置に関して患者に快適さを付加し得る。
ＷＯ−Ａ−９９／０１１５８ ＷＯ−Ａ−９８／４３７０２ ＵＳ５，６７４，２６７
Ｃｏｓｔｅｒ ＨＧ （１９６５）．Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｆｉｘｅｄ ｃｈａｒｇｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ「ｐｕｎｃｈ−ｔｈｒｏｕｇｈ」．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ５：６６９−６８６． Ｓａｌｅ ＡＪおよびＨａｍｉｌｔｏｎ ＷＡ（１９６８）．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ ｏｎ ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ． ３． Ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６３：３７−７３． Ｎｅｕｍａｎｎ ＥおよびＲｏｓｅｎｈｅｃｋ Ｋ（１９７２）．Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅｓ ｉｎ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １０：２７９−２９０． Ｃｒｏｗｌｅｙ ＪＭ（１９７３）．Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｐｉｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｓ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １３：７１１−７２４． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｕ， Ｐｉｌｗａｔ Ｇ， Ｒｉｅｍａｎ Ｆ（１９７４）．Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １４：８８１−８９９． Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ ＭＪ， Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｒ， ｎｉｃｏｌａｕ Ｃ， Ｈｅｌｌｅｒ Ｒ（２０００）． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ． Ｉｎ Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ ＭＪ， Ｈｅｌｌｅｒ Ｒ， Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｒ， ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｃｅｌｌｓ． Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎ ｐｒｅｓｓ： １７３−１８６． Ｂｅｌｅｈｒａｄｅｋ Ｊ， Ｏｒｌｏｗｓｋｉ Ｓ， Ｒａｍｉｒｅｚ ＬＨ， Ｐｒｏｎ Ｇ， Ｐｏｄｄｅｖｉｎ Ｂ， Ｍｉｒ ＬＭ（１９９４）． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｂｌｅｍｏｍｙｃｉｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６４０： １６９−１７８． Ｌ．Ｍ． Ｍｉｒ， Ｊ． Ｇｅｈｌ， Ｇ． Ｓｅｒｓａ， Ｃ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， ＪＲ Ｇａｒｂａｙ， Ｖ． Ｂｉｌｌａｒｄ， Ｐ． Ｇｅｅｒｔｓｅｎ， Ｚ． Ｒｕｄｏｌｆ， Ｇ． Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｍ． Ｍａｒｔｙ（２００６）． Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ： Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｏｒ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｅｉｔｈｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ｏｒ ｌｏｃａｌｌｙ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒＴＭ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｏｒ ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ， ｓｐｅｃｉａｌ ｉｓｓｕｅ「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」， ４， １４−２５． Ｍ． Ｍａｒｔｙ， Ｇ． Ｓｅｒｓａ， ＪＲ Ｇａｒｂａｙ， Ｊ． Ｇｅｈｌ， Ｃ． Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｍ． Ｓｎｏｊ， Ｖ． Ｂｉｌｌａｒｄ， Ｐ． Ｇｅｅｒｔｓｅｎ， Ｊ． Ｌａｒｋｉｎ， Ｄ． Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ， Ｉ Ｐａｖｌｏｖｉｃ， Ｓ． Ｐａｕｌｉｎ−Ｋｏｓｉｒ， Ｍ． Ｃｅｍａｚａｒ， Ｎ． Ｍｏｒｓｌｉ， Ｄ． Ｓｏｄｅｎ， Ｚ． Ｒｕｄｏｌｆ， Ｃ． Ｒｏｂｅｒｔ， Ｇ． Ｏ’ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＬ．Ｍ． Ｍｉｒ．（２００６） Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ａ ｓｉｍｐｌｅ， ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓａｆｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＥＳＯＰＥ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｒａｐｙ）ｓｔｕｄｙ． Ｅｕｒ． Ｊ． ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ， ｓｐｅｃｉａｌ ｉｓｓｕｅ「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」， ４， ３−１３． Ｎｅｕｍａｎｎ Ｅ， Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｅｅｒ Ｍ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＰＨ（１９８２）． Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｏｕｓｅ ｌｙｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ． ＥＭＢＯ Ｊ １： ８４１−８４５． Ｍｉｒ ＬＭ， Ｂｕｒｅａｕ ＭＦ， Ｇｅｈｌ Ｊ， Ｒａｎｇａｒａ Ｒ， Ｒｏｕｙ Ｄ， Ｃａｉｌｌａｕｄ ＪＭ， Ｄｅｌａｅｒｅ Ｐ， Ｂｒａｎｅｌｌｅｃ Ｄ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ， Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｄ（１９９９）． Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｓｋｅｌｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６： ４２６２−４２６７． Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ， Ｂｅｅｂｅ ＳＪ， Ｂｕｅｓｃｈｅｒ ＥＳ（２００１）． Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｐｕｌｓｅｓ． Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ ２２： ４４０−４４８ Ｂｅｅｂｅ ＳＪ， Ｗｈｉｔｅ Ｊ， Ｂｌａｃｋｍｏｒｅ ＰＦ， Ｄｅｎｇ Ｙ， Ｓｏｍｅｒｓ Ｋ， Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ（２００３）． Ｄｉｖｅｒｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ ｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ． ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２： ７８５−７９６． Ｃｈｅｎ Ｎ， Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ， Ｋｏｌｂ ＪＦ， ｗａｎｓｏｎ ＲＪ， Ｇａｒｎｅｒ ＡＬ， Ｙａｎｇ Ｊ， Ｊｏｓｈｉ ＲＰ， Ｂｅｅｂｅ ＳＪ，（２００４）． Ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１７： ４２１−４２７． Ｖｅｒｎｉｅｒ ＰＴ， Ｓｕｎ Ｙ， Ｍａｒｃｕ Ｌ， Ｃｒａｆｔ ＣＭ， Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ ＭＡ（２００４）． Ｎａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｕｌｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８６： ４０４０−４０４８． Ｈａｌｌ ＥＨ， Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ， Ｂｅｅｂｅ ＳＪ（２００５）． Ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ（ｎｓＰＥＦ） ｉｎｄｕｃｅ ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４： ２８３−２９１． Ｓｔａｃｅｙ Ｍ， Ｓｔｉｃｋｌｅｙ Ｊ， Ｆｏｘ Ｐ， Ｓｔａｔｌｅｒ Ｖ， Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ， Ｂｅｅｂｅ ＳＪ， Ｂｕｅｓｃｈｅｒ Ｓ（２００３）． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｕｌｔｒａ−ｓｈｏｒｔ， ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ： ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ， ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ， ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ５４２：６５−７５． Ｃｈｅｎ Ｎ， ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ， Ｋｏｌｂ ＪＦ， Ｓｗａｎｓｏｎ ＲＪ， Ｇａｒｎｅｒ ＡＬ Ｙａｎｇ Ｊ， Ｊｏｓｈｉ ＲＰ， Ｂｅｅｂｅ ＳＪ（２００４）． Ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１７： ４２１−４２７ Ｖｅｒｎｉｅｒ ＰＴ， Ｓｕｎ Ｙ， Ｍａｒｃｕ Ｌ， Ｓａｌｅｍｉ Ｓ， Ｃｒａｆｔ ＣＭ， Ｇｕｎｄｅｒｔｓｅｎ ＭＡ（２００３）． Ｃａｌｃｉｕｍ ｂｕｒｓｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３１０： ２８６−２９５． Ｗｈｉｔｅ ＪＡ， Ｂｌａｃｋｍｏｒｅ ＰＦ， Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ， Ｂｅｅｂｅ ＳＪ（２００４）． Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｅｎｔｒｙ ｉｎ ＨＬ−６０ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ． Ｊ ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９： ２２９６４−２２９７２． Ｂｅｅｂｅ ＳＪ， Ｆｏｘ ＰＭ， Ｒｅｃ ＬＪ， Ｗｉｌｌｉｓ ＬＫ， Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ ＫＨ（２００３）． Ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ， ｈｉｇｈ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． ＦＡＳＥＢ Ｊ １７： １４９３−１４９５．
その結果、パルス状電場を使用する組織細胞内への核酸の電気媒介型遺伝子導入を増大させるための、かつ／または、インビトロでまたはインビボで健康な細胞に損傷を与えないエレクトロポレーションプロセスを得るための必要性が存在する。
上述した必要性は、本明細書の以下の説明で述べる実施形態によって対処される。
一実施形態では、生物学的材料などの導電性材料を処置するための、前記導電性材料の特性を変更するように前記導電性材料に電場が印加されることを可能にする電気パルスアプリケータは、
処置される導電性材料内に、かつ／または、導電性材料の近傍に導入されることを意図された導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む少なくとも１つの電極と、
１０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きな傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを電極に送出するパルス発生器とを備える。
（電気的処置に供される材料に接触することのない、平行板伝送線などのアンテナの代わりに）導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む少なくとも１つの電極の使用は、著しく多くの用途において、本発明による電気パルスアプリケータを使用することを可能にする。特に、導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む少なくとも１つの電極の使用は、インビトロでの細胞への電気パルスの送達を可能にする。さらに、電気絶縁性被膜の使用のおかげで、電極は、細胞に電気パルスを送達するために、インビトロ懸濁液の接触部上にあり得る（または、接触部上にない）。実際に、電気絶縁性被膜の使用は、電極と懸濁液との間の考えられる電気化学的反応を防止することを可能にする。
パルス発生器が１０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きな傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを送出することは、エレクトロポレーションを得ることを可能にする。実際に、エレクトロポレーションを得ることは、電極に印加される電圧振幅（ｔｅｎｓｉｏｎ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）およびパルスの持続時間の関数である。たとえば、１０〜１００ｋＶ／ｍの振幅およびナノ秒程度のパルス長を有するパルスの場合、エレクトロポレーションは達成されない。エレクトロポレーションを得るために、各パルスの振幅は、ナノ秒程度のパルス長について１０００ｋＶ／ｍより大きくなければならない。
パルスは、１０〜２００ｋＶ／ｍの振幅および百または数百ピコ秒〜十または数十あるいは数百ナノ秒のパルス長を有する。
好ましくは、各パルスは、１マイクロ秒より小さな持続時間を有する。
有利には、各パルスは、１ナノ秒と１０ナノ秒との間からなる長さを有する。
さらに、前記電気絶縁性被膜は、絶縁性ポリマー膜または絶縁性エラストマー膜などの絶縁性無機膜である。
あるいは、前記電気絶縁性被膜は、たとえば、鉱物の以下のリスト、ガラス、酸化物、窒化物などから得られる絶縁性鉱物膜である。
あるいは、前記電気絶縁性被膜は、絶縁性セルロース膜、絶縁性脂質膜などのような絶縁性有機膜である。
前記電気絶縁性被膜は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）膜である。さらに、前記電気絶縁性被膜は、約０．５ｍｍのまたは０．５ｍｍより小さい厚さを呈する。
一実施形態では、電気絶縁性層は、パリレンなどのポリ（ｐ−キシレン）ポリマーから作られる。パリレンの１つの利点は、パリレンが、電極の導電性主本体上に気相堆積され得ることである。これは、電極の導電性主本体上への絶縁性被膜の均質堆積を容易にする。優先的に、パリレンの電気絶縁性被膜は、５０μｍより小さい厚さを呈する。これは、電気絶縁性材料でコーティングされていない電極と実質的に同じ寸法を有する絶縁された電極を得ることを可能にする。
別の実施形態では、処置される導電性材料内に、かつ／または、導電性材料の近傍に導入されることを意図された、導電性材料を処置するための電気パルスアプリケータのための電極であって、前記電気パルスアプリケータは、１０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きな傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを電極に送出するパルス発生器を備え、前記電極は、導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む、電気パルスアプリケータ。
さらに、前記電気絶縁性被膜は、絶縁性ポリマー膜または絶縁性エラストマー膜などの絶縁性無機膜である。
あるいは、前記電気絶縁性被膜は、たとえば、鉱物の以下のリスト、ガラス、酸化物、窒化物などから得られる絶縁性鉱物膜である。
あるいは、前記電気絶縁性被膜は、絶縁性セルロース膜、絶縁性脂質膜などのような絶縁性有機膜である。
前記電気絶縁性被膜は、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）膜である。さらに、前記電気絶縁性被膜は、約０．５ｍｍのまたは０．５ｍｍより小さい厚さを呈する。
一実施形態では、電気絶縁性層は、パリレンなどのポリ（ｐ−キシレン）ポリマーから作られる。パリレンの１つの利点は、パリレンが、電極の導電性主本体上に気相堆積され得ることである。これは、電極の導電性主本体上への絶縁性被膜の均質堆積を容易にする。好ましくは、パリレンの電気絶縁性被膜は、５０μｍより小さい厚さを呈する。これは、電気絶縁性材料でコーティングされていない電極と実質的に同じ寸法を有する絶縁された電極を得ることを可能にする。
なお別の実施形態では、導電性材料の特性を変更するように、導電性材料内に電場を印加する方法が提供される。前記方法は、少なくとも以下のステップ、すなわち、
−導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む少なくとも１つの電極を、処置される導電性材料内に、かつ／または、導電性材料の近傍に配置するステップと、
−１０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きな傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを電極に送出ステップとを含む。
パルスは、約１０〜２００ｋＶ／ｃｍの振幅および百または数百ピコ秒〜十または数十あるいは数百ナノ秒のパルス長を有する。
好ましくは、各パルスは、１マイクロ秒より小さい長さを有する。
有利には、各パルスは、１ナノ秒と１０ナノ秒との間からなる長さを有する。
本発明による電気パルスアプリケータの略図である。 本発明による電気パルスアプリケータの平坦電極の（または、非平坦電極の）断面の略図である。 本発明による実験的な電気パルスアプリケータの図である。 本発明による実験的な電気パルスアプリケータの詳細を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。 従来技術の電気パルスアプリケータおよび本発明による電気パルスアプリケータに関する、インビボおよびインビトロの異なる実験の結果を示す図である。
以下の詳細な説明では、説明の一部を形成し、かつ、実施されてもよい特定の実施形態が例証として示される添付図面が参照される。これらの実施形態は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分に詳細に述べられ、また、他の実施形態が利用されてもよいこと、および、実施形態の範囲から逸脱することなく、論理的変更、機械的変更、電気的変更、および他の変更が行われてもよいことが理解される。したがって、以下の詳細な説明は、制限的な意味で考えられない。
図１を参照して、生物学的材料内に電場を印加するデバイスは、パルス発生器１、セレクタスイッチ２、コントロールユニット３、および少なくとも１つの電極４を備える。パルス発生器１は、主電源に接続される高電圧電源５を備える。
本発明によるデバイスは、一対の電極４間に位置する細胞および／または任意の生物学的材料および／または任意の有機または無機導電性材料に可変電場を印加することを意図される。
各電極４は、高電圧電源５の正極または負極に接続され得る。
さらに、各電極は、電気絶縁性材料７でコーティングされた、アルミニウム、銅など、または任意の導電性材料で作られた金属性主本体６を含む。前記電気絶縁性被膜７は、たとえば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）膜、絶縁性ガラス、酸化物、窒化物などの膜、絶縁性セルロース、脂質、などの膜、絶縁性エラストマーまたはポリマー膜などのような、絶縁性無機、有機、または鉱物膜であり得る。前記絶縁性膜の厚さは、たとえば、約０．５ｍｍかまたはそれより薄くあり得る。本発明の範囲から逸脱することなく、電気絶縁性層の厚さは、特定の産業用途の場合、より厚くまたはずっと薄くあり得ることに留意されたい。たとえば、一実施形態では、電気絶縁性層は、パリレンなどのポリ（ｐ−キシレン）ポリマーから作られる。パリレンの１つの利点は、パリレンが、非常に高い絶縁破壊電圧を有することである。そのため、パリレンは、非常に良好な絶縁性材料であり、非常に均質な表面を得ることを可能にする。好ましくは、パリレンの電気絶縁性被膜は、５０μｍより小さい厚さを呈する。
図１〜４を参照して、各電極４は、チップとして長方形平坦形状を有し、生物学的材料は、２つの平行電極４の間に設置される。
電極４は、本発明の範囲から逸脱することなく、任意の形状、たとえば円盤形状を有することができることに留意されたい。
さらに、各電極４は、特許文献３に開示されるように、絶縁性材料でコーティングされ、ベース、ヘッド、およびコネクタを備える針、または、当業者に既に知られている任意の他の種類の電極に存在し得る。
コントロールユニット３は、オペレータからまたはプログラムによって受信する命令に従って、高電圧電源５および切換えスイッチ２を制御する。
そのため、本発明によるデバイスは、以前に決定されたパルスサイクルを、電極４間に印加できる。各電極４に印加されるパルスは、長方形か、台形か、三角形か、正弦波か、または同様な形状のパルスであるか、あるいは、そのスペクトルが、上述した信号のスペクトルを少なくとも含む形状を有し、約１００Ｖ／ｃｍ〜２００ｋＶ／ｃｍの振幅および１マイクロ秒未満、好ましくは０．１ナノ秒と１０ナノ秒との間、好ましくは１ナノ秒または数ナノ秒未満のパルス長を有し、１０１４Ｖ／ｍ／ｓと１０１８Ｖ／ｍ／ｓとの間を含むレイジングフロントの傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有する。
パルスのこれらの条件では、電極４の電気絶縁性被膜７は、その絶縁特性を失い、「ナノパルス状（ｎａｎｏｐｕｌｓｅｄ）」電場の発生を可能にする。
電極４全体が、電気絶縁性膜でコーティングされ、コーティングされた電極間に設置される生物学的対象物（細胞、組織、器官）内でまたは任意の導電性非生物学的対象物内で発生する電場はまた、絶縁性膜を通過する。もちろん、本発明では、電極４は、完全にコーティングされ得る、あるいは、たとえばパルス発生器との電気接続を容易にするために、電極４は、電気パルスを受ける生物学的または非生物学的対象物から遠い部分で、または、２つの隣接する電極が最も離れている部分で部分的に未コーティングであり得る。
パルスの振幅および長さは、デバイスの使用法および生物学的材料の種類、すなわち、ナノパルスの使用によって実行可能な、組織細胞内への核酸の電気媒介型遺伝子導入および／または非可逆的エレクトロポレーションによる細胞の破壊および／または任意の細胞の電気操作に応じてオペレータによって適合されることになることが留意され得る。
本発明によるデバイスは、特に、電気化学療法および／または電気療法および／または遺伝子療法による腫瘍の処置のために使用され得る。
そして、電気化学療法による腫瘍の処置は、以下のステップ、すなわち、
−（ブレオマイシンまたはシスプラチンのような）非透過性抗癌薬を、身体内に全身にあるいは腫瘍の近傍内でまたは腫瘍の近傍で局所的に注入するステップ、
−事前に検出された腫瘍（または、その近傍）内に少なくとも１つの電極（針など）を導入するステップ、
−約１０〜２００ｋＶ／ｃｍの振幅およびナノ秒未満または数ナノ秒のパルス長を有する少なくとも１つのパルス状電場を発生するステップ
に存在する。
そして、電気療法による腫瘍の処置は、以下のステップ、すなわち、
−事前に検出された腫瘍内に少なくとも１つの電極（針など）を導入するステップ、
−前記腫瘍を破壊するために、約１０〜２００ｋＶ／ｃｍの振幅および数ナノ秒のパルス長を有する少なくとも１つのパルス状電場を発生するステップ
に存在する。
電気化学療法による腫瘍の処置における本発明によるデバイスの使用法は、周囲の健康な細胞に熱傷を与える（ｂｕｒｎ）ことなく、また、周囲の細胞内に金属部品を堆積させることなく、腫瘍を破壊するという利点を与えることに留意されたい。
そして、インビトロでの細胞への、エクスビボでの組織への、また、インビボでの腫瘍または骨格筋のような任意の他の組織への遺伝子導入の改善は、以下のステップ、すなわち、
−電極によって包囲される組織内に、特異的遺伝子または短鎖核酸を含む材料を注入するステップ、
−古典的な電気的遺伝子導入手技によって、または、本発明による電極を使用した電気パルスによってエレクトロポレーションが達成される手技によって細胞内に材料を導入するステップ、
−電気的遺伝子導入の効率を改善するために、電気的遺伝子導入の前または後に、約１〜２００ｋＶ／ｃｍの振幅および百から数百ピコ秒〜十または数十あるいは数百ナノ秒のパルス長を有する少なくとも１つの補助パルス状電場を発生するステップ
に存在する。
さらに、本発明によるデバイスは、電極を生体適合性制約から解放することを可能にする。こうして、電極４の主本体は、任意の所望の導電性材料で得られ得る。そのため、この材料は、生体適合性認証済み材料間での選択に制限されることなく、組織について、あるいは、所望の手技または処置について最適な異なる電気特性（導電率、誘電率）を有し得る。
ナノパルス（電気絶縁性被膜を持たない電極を備える従来技術のデバイスによる、１０ナノ秒の持続時間および非常に高い電場強度の電気パルス）が、レポータ遺伝子ルシフェラーゼの発現に影響を及ぼし、非ウィルス性の電気パルス媒介型遺伝子導入の総合効率を改善し得るかどうかを、本発明者等は詳しく調べた。本発明者等は、ｎｓＰＥＦの数、ｎｓＰＥＦ繰返し周波数、ＤＮＡ電気的導入とｎｓＰＥＦ送達との間の遅延、ＤＮＡの振幅および量のようないくつかのパラメータを分析した。次に、本発明者等は、（ｉ）細胞内カルシウム放出に及ぼすｎｓＰＥＦの影響、（ｉｉ）核膜孔輸送に及ぼすｎｓＰＥＦの影響、および（ｉｉｉ）プラスミド転写に及ぼすｎｓＰＥＦの影響を調査することによって、関連するメカニズムを確定したいと思った。
本発明者等は、電極間に１ｍｍの距離を有するエレクトロポレーションキュベット内で、プラスミド電気的導入後６０分して、６０ｋＶ／ｃｍの１回だけのｎｓＰＥＦの印加によって、ルシフェラーゼ遺伝子発現の３倍の増加を示した。しかし、生存率低下が、これらのナノパルスに対する暴露に全く関連しないため、２つ以上のパルスも印加され得る。ＤＮＡ電気的導入とナノパルス（複数可）送達との間の時間（１５分と１８０分との間）は、関連性がなく、ナノパルスの効果が、ＤＮＡ内部移行のレベルにないことを示しているように思える。メカニズムは分析中である。その理由は、電気ナノパルス送達による細胞操作が、遺伝子電気的導入の総合効率を上げる効率的な方法である可能性があるからである。
導入
本調査の目的は、ｎｓＰＥＦの数、ｎｓＰＥＦ繰返し周波数、ＤＮＡ電気的導入とｎｓＰＥＦ送達との間の遅延、ＤＮＡの振幅および量のようないくつかのパラメータを分析して、ｎｓＰＥＦが、インビトロでプラスミド電気的導入効率に実際に影響を及ぼすかどうかを詳しく調べることであった。次に、本発明者等は、（ｉ）細胞内カルシウム放出に及ぼすｎｓＰＥＦの影響、（ｉｉ）核膜孔輸送に及ぼすｎｓＰＥＦの影響、および（ｉｉｉ）プラスミド転写に及ぼすｎｓＰＥＦの影響を調査することによって、関係するメカニズムを確定したいと思った。
材料および方法
ｎｓＰＥＦ暴露システム
ｎｓＰＥＦは、高電圧発生器ＦＰＧ １０−３０ＭＳ（ＦＩＤ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ロシア）によって送達された。ｎｓＰＥＦは、１０００オームのインピーダンスの出力について、２．５ｋＶ〜１０ｋＶの電気パルスを送達することができ、４つの同様な電気パルスを有する。パルスは、１０ｎｓ続き、３ｎｓの遷移時間を有する。ＴＴＹからの外部トリガーが使用されて、ｎｓＰＥＦ発生器が始動される（図３）。印加される信号は、オシロスコープＬｅＣｒｏｙ ＷａｖｅＰｒｏ ７０００および２つの高電圧プローブＴｅｋｔｒｏｎｉｘ Ｐ６０１５Ａ（１０００×、４０ｋＶ最大）によって可視化された。細胞懸濁液は、２つのタイプのエレクトロポレーションキュベット（電極間が１ｍｍまたは２ｍｍ）内でｎｓＰＥＦに暴露された（図４）。
細胞培養
ＤＣ−３Ｆ細胞（チャイニーズハムスター肺線維芽細胞）およびＬＰＢ細胞（マウス線維肉腫）が、完全培地内で成長した。１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５００Ｕ／ｍｌペニシリン、５００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充された最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃｅｒｇｙ−ｐｏｎｔｏｉｓｅ，フランス）が完全培地として規定される。培養は、５％ＣＯ２ ３７℃で加湿雰囲気に維持された。細胞は、２日ごとに通された。
プラスミドＤＮＡ
プラスミドｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｍｏｎｔｉｇｎｙ−ｌｅｓ−Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ，フランス）が、製造業者のプロトコルに従って、内毒素がないプラスミドＤＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｈｏｅｒｄｔ， フランス）を使用して調整された。
ＤＮＡ電気的導入
細胞は、トリプシンによって収集され、細胞懸濁液は、低導電率培地（２５０ｍＭショ糖、１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７）内のエレクトロポレーションキュベット内に設置された（エレクトロポレーションキュベット当たり１×１０６個の細胞）。細胞は、ルシフェラーゼについてのＤＮＡコーディングの存在下でＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒ（ＩＧＥＡ， Ｃａｒｐｉ，イタリア）によって送達された２つの電気的透過化パルス（１２５０Ｖ／ｃｍ、１００μｓ、１Ｈｚ）に暴露された。これらのパルス後、細胞は、５％ＣＯ２の下で室温または３７℃で３０〜１８０分の間、インキュベートされた。
ナノ秒パルス状電場（ｎｓＰＥＦ）送達
細胞は、１ｍｍまたは２ｍｍの電極間ギャップを有するエレクトロポレーションキュベット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， ＶＷＲ，フランス）内でｎｓＰＥＦに暴露された。ｎｓＰＥＦ送達後、細胞は、エレクトロポレーションキュベットから取り外され、５％ＣＯ２の下で３７℃で２４時間または４８時間の間、完全培地内で培養された。ルシフェラーゼ活性および総たんぱく質濃度は、以下で述べるように測定された。
トランスシクロヘキサン−１，２−ジオール（ｔｒａｎｓ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）（ＴＣＨＤ）に対する暴露
ＤＮＡ電気的導入後、細胞は、室温で１時間の間、４０ｍＭ ＴＣＨＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｌ’ｌｓｌｅ−ｄ’Ａｂｅａｕ−Ｃｈｅｓｎｅ，フランス）によってインキュベートされ、その後、１または１０Ｈｚの繰返し周波数を有する１００ｋＶ／ｃｍの２０個のｎｓＰＥＦに暴露されるかまたは暴露されなかった。ｎｓＰＥＦに対する暴露後、非導電性培地が取り除かれ、完全培地に置き換えられた。細胞は、５％ＣＯ２の下で３７℃で２４時間の間、培養され、ルシフェラーゼ活性および総たんぱく質濃度が測定された。
ルシフェラーゼ発現の判定
ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼ・アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ，フランス）を使用して判定された。細胞は、収集され、１０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離された。ペレットは、その後、１分間、１１０００ｒｐｍで遠心分離された、２００μｌ溶解バッファ内（Ｐｒｏｍｅｇａ）で再懸濁され、上澄み液が収集された。キュベット当たりの細胞の量を補正するために、細胞上澄み液内のたんぱく質濃度が、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標）たんぱく質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｒａｎｃｅ ＳＡＳ， Ｂｒｅｂｉｅｒｅｓ，フランス）によって確定された。
ルシフェラーゼ活性の測定は、２０μｌの細胞上澄み液を１００μｌルシフェラーゼバッファに添加することによって、Ｌｕｍａｔ ＬＢ ９５０７ルミノメータ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ， Ｔｈｏｉｒｙ，フランス）を使用して、１０秒間に生成された光を積算することによって実施された。結果は、相対光単位（ＲＬＵ）でルミノメータから収集された。いくつかの濃度の精製蛍ルシフェラーゼたんぱく質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた較正が、線形変換：ｌｏｇ（ｐｇ）＝１．２４ｌｏｇ（ＲＬＵ）−４．８３を使用して、ＲＬＵをルシフェラーゼのｐｇに変換するために実施された。最終結果は、総たんぱく質のμｇ当たりのルシフェラーゼのｐｇとして表された。
内部カルシウム反応の蛍光分析
蛍光指示薬カルシウムグリーン−１−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，フランス）が、分光蛍光計（ＳＦＭ ２５， Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）と共に使用された。細胞は、培養皿内で、３７℃で４５分間、増殖培地内のカルシウムグリーン−１−ＡＭ（１μＭ）と共にインキュベートされた。細胞は、その後、ＰＢＳ内で洗浄され、非導電性ショ糖バッファ内でトリプシン処理され、再懸濁された。細胞は、最初に、基線の読みを確定するために、蛍光計キュベット内に設置され、その後、蛍光計キュベットからエレクトロポレーションキュベットに移された。細胞は、ｎｓＰＥＦによって処置され、そして即座に、エレクトロポレーションキュベットから蛍光計キュベットに移され（分光蛍光計はパルス発生器の非常に近くに位置し、手技は５秒と１０秒との間の時間がかかった）、蛍光測定が実現された。
データ分析
結果は、暴露（電気的導入プラスｎｓＰＥＦ）における総たんぱく質のｍｇ当たりのルシフェラーゼのｐｇと、対照（電気的導入だけ）における総たんぱく質のｍｇ当たりのルシフェラーゼのｐｇとの比率として報告された。
提示された全てのデータは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤである。統計的解析が、スチューデントｔ−検定を使用して実施された。０．０５より小さいＡｐ値は、統計的に有意であると考えられた。
結果
ｎｓＰＥＦの数
ルシフェラーゼ遺伝子電気的導入後４５分して、１０ｎｓおよび６０ｋＶ／ｃｍの１個、２個、５個、１０個、または２０個のｎｓＰＥＦが、ＤＣ−３Ｆ細胞に印加された。ｎｓＰＥＦ暴露に関連する細胞生存の減少は全く見出されなかった。ルシフェラーゼ活性の読みに関する結果は、キュベットが、電極間に１ｍｍギャップを有するか、２ｍｍギャップを有するかで異なった。
１ｍｍのキュベットでは、１個のｎｓＰＥＦが、電気的導入だけに比較して、ルシフェラーゼ発現を約３倍増加させるのに十分であった（図５）。対照的に、２ｍｍのキュベットでは、ルシフェラーゼ発現の同じ増加を得るために、２０個のｎｓＰＥＦが必要とされた（図６）。
ｎｓＰＥＦ繰返し周波数
ＤＣ−３Ｆ細胞は、電極間に２ｍｍを有するエレクトロポレーションキュベット内でＤＮＡ電気的導入後４５分して、４５ｋＶ／ｃｍの２０個のｎｓＰＥＦに暴露された。古典的なエレクトロポレーションキュベットでは、得られた結果は、１００Ｈｚを超える周波数で効果が大きいことを示す。この値を超えると、効果は、（１００００Ｈｚまでの）ｎｓＰＥＦ繰返し周波数に無関係である（図７）。隔離されたキュベットでは、予備実験で得られた効果は、１Ｈｚ以上の周波数について周波数に依存しないように見える（図１１）。
遺伝子電気的導入とｎｓＰＥＦの印加との間の遅延
ＤＣ−３Ｆ細胞が、電極間に２ｍｍを有するエレクトロポレーションキュベット内で６０ｋＶ／ｃｍの２０個のｎｓＰＥＦ、１Ｈｚに暴露された。ＤＮＡ電気的導入とｎｓＰＥＦ送達との間の時間（１５分と１８０分との間）は、関連性がなく、ｎｓＰＥＦの効果が、ＤＮＡ取込みのレベルにないことを示しているように思える。
キュベット内のＤＮＡの量
ＤＮＡ電気的導入後６０分して、ＤＣ−３Ｆ細胞が、電極間が１ｍｍのキュベット内で４５ｋＶ／ｃｍの１個のｎｓＰＥＦに暴露された。使用されたＤＮＡの量がどれだけであっても（キュベット当たり、０．５、１、２、３、または４μｇ）、ｎｓＰＥＦは、対照に比較して、ルシフェラーゼ発現を増加させた。それでも、最も重要な増加は、ＤＮＡの２μｇについて観測された（図９）。
メカニズム：ｎｓＰＥＦが核膜孔に影響を及ぼすかどうか
ＤＮＡ電気的導入後３０分して、ＬＰＢ細胞が、ＴＣＨＤ（４０ｍＭ）±ｎｓＰＥＦ（１または１０Ｈｚの繰返し周波数を有する１００ｋＶ／ｃｍで２０個のｎｓＰＥＦ）に暴露された。ＴＣＨＤに対する暴露は、Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ等（２００７）に従って予見されるように、遺伝子発現の２倍の増加をもたらした。ｎｓＰＥＦ繰返し周波数どれだけであっても、ｎｓＰＥＦだけに暴露された細胞は、やはり（これらの実験の対照の約２倍のレートの）遺伝子発現の増加を示し、ＴＣＨＤに暴露された細胞において観測された増加に似ていた。細胞がｎｓＰＥＦ＋ＴＣＨＤに暴露されると、相加的効果が観測された（図１０）。
内部カルシウム放出の蛍光分析
そのアセトキシメチルエステルの形態では、カルシウムグリーン−１−ＡＭは、非蛍光性でかつ膜透過性がある。細胞内で、エステラーゼが、アセトキシメチルエステルを開裂させる。ＤＣ−３Ｆ細胞が、２ｍｍまたは１ｍｍのキュベット内で１個または２０個（１Ｈｚ）のｎｓＰＥＦに暴露された。蛍光が、パルスの前と後で測定された。
議論
この報告において、本発明者等は、電気ｎｓＰＥＦ送達による細胞操作が、遺伝子電気的導入の総合効率を効率的に増加させる可能性があることを確認した。レポータ遺伝子の産生の３倍の増加が達成された。しかし、ルシフェラーゼ活性のこの増加が厳密な条件下で達成されたことを述べるに値する。実際には、あるパラメータ（ＤＮＡ電気的導入とｎｓＰＥＦ送達との間の時間またはいくつかのｎｓＰＥＦが送達されるときの繰返し周波数）は重要であるように見えないが、他のパラメータは非常に重要である。特に、本発明者等は、効果を達成するのに必要なｎｓＰＥＦの数と電極間の距離との間の相関を見出した。１ｍｍのギャップの場合、ルシフェラーゼ遺伝子電気的導入後のルシフェラーゼ産生をシュミレートするのに１個のｎｓＰＥＦで十分である。２ｍｍのギャップの場合、２０個のｎｓＰＥＦが必要とされる。本発明者等は、現在、この意外な観測結果を分析中である。ｎｓＰＥＦの持続時間が非常に短いため、本発明者等は、これらの調査で使用されたナノパルス発生器によって生成されるパルスの形状を分析中である。必要とされるパルスの数は、パルス中のキュベット内の電場の分布に関連し得る。ｎｓＰＥＦパルスが、長方形でも、さらに台形でもなく、むしろ三角形であったことが強調されなければならない。このことは、パルス中に、定常状態に達しないことを意味する。本明細書で報告された効果に達するために必要とされるｎｓＰＥＦの数に及ぼすパルス形状の影響についての調査を、本発明者等がまだ終えていなくても、ＤＮＡ電気的導入の効率における報告された増加を達成するのに、暴露条件が極めて重要であることがメッセージである。
本発明者等は、本明細書で報告されたレポータ遺伝子活性の増加のメカニズムを分析し始めた。ＤＮＡ電気的導入とｎｓＰＥＦ送達との間の遅延の影響が全く存在しないため、報告された増加は、取込みの増加の結果ではないはずである。実際には、１００μｓおよび１２５０Ｖ／ｃｍの１個または２個のパルス後に、細胞が、１時間ではないが、数分間、開いたままであることを、本発明者等はわかっている。
ＴＣＨＤ−プラスミドＤＮＡまたは高分子重量の分子について核を透過性にするトランスフェクション効率を増大させることがわかっている（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ等、２００７）
相加性−ｎｓＰＥＦによってもたらされる有効性の増加に影響を及ぼさず、ｎｓＰＥＦの効果が、シトソールから核へのＤＮＡ導入のレベルにないことを示唆する。
パルス送達後のＣａ＋＋ピークが、文献に既に記載されるように観測された。
同じ方法が、上述した電気絶縁性被膜を備える一対の電極４を含む本発明によるデバイスに関して適用され、最良の結果が、図１１に示すように得られた。他の方法は、実施例１の方法と同様である。
本発明者等は、ナノパルス（ｎｓＰＥＦ、電気絶縁性被膜を含む電極を備える本発明によるデバイスを用いた、数十ナノ秒の持続時間および非常に高い電場強度の電気パルス）が、マウスの脚の脛骨頭側骨格筋内に電気的導入されたレセプタ遺伝子ルシフェラーゼの発現に影響を及ぼし得るかを詳しく調べた。結果は、図１３〜１５に示される。方法は、実施例１で述べた方法（特に、ナノパルス発生器）、または、マウスの骨格筋におけるＤＮＡ電気的導入に関する実験についての文献に古典的に見出される方法である。
「ナノパルス状（ｎａｎｏｐｕｌｓｅｄ）」の印加は、ある条件下でレポータ遺伝子ルシフェラーゼの発現を増大させるように見える（図１２〜１５）。所定の生物学的材料および所定の用途についての正しいプロトコルは、当業者によってルーチンで容易に確定されるであろう。
記述要件は、最良のモードを含む本発明を開示し、また同様に、当業者が本発明を作成し使用することを可能にするために、実施例を使用する。本明細書で述べる主題の範囲は、特許請求項によって規定され、当業者が思い浮かぶ他の実施例を含んでもよい。こうした他の実施例は、特許請求項の逐語的言語（ｌｉｔｅｒａｌ ｌａｎｇｕａｇｅ）と異ならない構造的要素を有する場合、または、特許請求項の逐語的言語からのごくわずかの差を有する等価な構造的要素を含む場合、特許請求項の範囲内にあることを意図される。
１ パルス発生器
２ セレクタスイッチ
３ コントロールユニット
４ 電極
５ 高電圧電源
６ 金属性主本体
７ 電気絶縁性被膜

Claims (13)

  1. 生物学的材料などの導電性材料を処置するための、前記導電性材料の特性を変更するように前記導電性材料に電場が印加されることを可能にする電気パルスアプリケータであって、
    処置される前記導電性材料内に、かつ／または、前記導電性材料の近傍に導入されることを意図された導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む少なくとも１つの電極と、
    １０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きな傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを前記電極に送出するパルス発生器とを備える電気パルスアプリケータ。
  2. 前記パルスは、約１０〜２００ｋＶ／ｃｍの振幅および百または数百ピコ秒〜十または数十あるいは数百ナノ秒のパルス長を有する請求項１に記載の電気パルスアプリケータ。
  3. 前記パルスは、１ナノ秒と１０ナノ秒との間からなる長さを有する請求項１または２に記載の電気パルスアプリケータ。
  4. 前記電気絶縁性被膜は絶縁性無機膜である請求項１から３のいずれか一項に記載の電気パルスアプリケータ。
  5. 前記電気絶縁性被膜は、ガラス膜、酸化物膜、窒化物膜などの絶縁性鉱物膜である請求項４に記載の電気パルスアプリケータ。
  6. 前記電気絶縁性被膜は、絶縁性セルロース膜または絶縁性脂質膜などの絶縁性有機膜である請求項１から３のいずれか一項に記載の電気パルスアプリケータ。
  7. 前記電気絶縁性被膜はパリレンから作られる請求項６に記載の電気パルスアプリケータ。
  8. 処置される導電性材料内に、かつ／または、前記導電性材料の近傍に導入されることを意図された、導電性材料を処置するための電気パルスアプリケータのための電極であって、前記電気パルスアプリケータは、１０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きな傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを電極に送出するパルス発生器を備え、前記電極は、導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む電極。
  9. 前記電気絶縁性被膜は、請求項４から７のいずれか一項で規定される請求項８に記載の電極。
  10. 導電性材料の特性を変更するように、前記導電性材料内に電場を印加する方法であって、少なくとも以下のステップ、すなわち、
    −導電性主本体および電気絶縁性被膜を含む少なくとも１つの電極を、処置される前記導電性材料内に、かつ／または、前記導電性材料の近傍に配置するステップと、
    −１０１５Ｖ／ｍ／ｓより大きなレイジングフロントの傾斜（ｄＥ／ｄｔ）を有するパルスを前記電極に送出するステップとを含む方法。
  11. 前記パルスは、約１０〜２００ｋＶ／ｃｍの振幅および十または数十あるいは数百ピコ秒〜十または数十あるいは数百ナノ秒のパルス長を有する請求項１０に記載の方法。
  12. 前記パルスは、１ナノ秒と１０ナノ秒との間からなる長さを有する請求項１０に記載の方法。
  13. 前記電極は、請求項８または９のいずれか一項で規定される請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
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