CN103340698B - 一种基因免疫苗的接种方法及接种装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因免疫苗的接种方法，包括如下步骤：（1）基因免疫苗经皮内注射至活体动物表皮与真皮间隙中，并在注射部位形成皮丘；（2）在注射部位施加电场，将正极板贴于皮丘表面，负极贴于注射部位对侧，促使基因免疫苗进入表皮细胞内。本发明还提供了一种基因免疫苗的接种装置。采用本发明方法接种基因疫苗，免疫效果优良，产生的抗体滴度高，操作简便，成功率高，重复性好，应用前景良好。

Description

一种基因免疫苗的接种方法及接种装置

技术领域

本发明涉及一种基因免疫苗的接种方法即接种装置，属于免疫领域。

背景技术

基因免疫又称DNA免疫、核酸免疫或遗传免疫，是90年代初发展起来的新的免疫学技术，是将表达某种抗原蛋白的外源基因与质粒重组，并将裸露的质粒DNA直接转导入活体动物细胞，进而在动物体内表达外源性重组蛋白抗原，激发产生强而持续的体液免疫应答和细胞免疫应答。

基因免疫苗（质粒DNA）的接种方式多种多样，主要有高压电击法、皮下注射法以及基因枪法。

高压电击和皮下注射法的免疫效果差，难以引起的体液免疫，产生抗体的滴度低。基因枪法的免疫效果相对较优，但是基因枪技术中，附着有质粒DNA的金微粒或质粒DNA溶液需要穿过皮肤角质层进入表皮细胞，而动物皮肤角质层厚度因实验动物周龄，季节，注射部位以及个体等差异极大，使得免疫结果极不稳定，另外，制作子弹的金微粒原材料价格昂贵，子弹制作方法操作复杂，需特殊惰性气体高压设备，成本高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种新的基因疫苗接种方法。

本发明基因免疫苗的接种方法，包括如下步骤：

（1）基因免疫苗经皮内注射至活体动物表皮与真皮间隙中，并在注射部位形成皮丘；

（2）在注射部位施加电场，将正极板贴于皮丘表面，负极贴于注射部位对侧，促使基因免疫苗进入表皮细胞内。

随着表皮细胞不断增殖，所转导的基因免疫苗在动物体内大量表达外源性重组蛋白抗原而达到动物免疫的目的。

步骤（1）中，所述皮丘的面积为0.09～2500mm²。

步骤（2）中，所述电场的电流为3～5mA。

步骤（2）中，电场的施加时间为5～30min。优选地，所述电场的施加时间为5～10min。

步骤（2）中，采用如下接种装置施加电场：它包括直流电源E、毫安表A、开关K、电位器R、电极J1、电极J2，所述直流电源E、开关K串联形成串联支路，所述串联支路与电位器R并联后连接毫安表A的一极，毫安表A的另一极连接电极J1，所述电极J2连接电位器R的中间抽头。

其中，所述毫安表的变化范围为3～5mA；所述直流电源E由二个6V锂电池组合串联形成，电位器R为5kΩ；

其中，所述直流电源E由至少二个干电池组合形成或为整流电源。

其中，所述电极J1、电极J2为不易锈蚀的导电金属材料制成。

其中，所述电极J1、电极J2的截面为边长0.3-50mm的正方形或0.3-50mm×0.3-50mm的长方形或直径为0.3-50mm的圆形，厚度为0.05-5mm。

所述接种装置还包括用于包裹电极J1、电极J2的二个电极套，所述电极套的尺寸与电极J1、电极J2相适配，所述电极套为吸水材料制成。

所述电极套材料为棉布。

本发明基因免疫苗的接种装置，它包括直流电源E、毫安表A、开关K、电位器R、电极J1、电极J2，所述直流电源E、开关K串联形成串联支路，所述串联支路与电位器R并联后连接毫安表A的一极，毫安表A的另一极连接电极J1，所述电极J2连接电位器R的中间抽头；所述电极J1、电极J2的截面为边长0.3-50mm的正方形或0.3-50mm×0.3-50mm的长方形或直径为0.3-50mm的圆形，厚度为0.05-5mm。

从电极J1到电极J2电流为3～5mA。

所述直流电源E由二个6V锂电池组合串联形成，电位器R为5kΩ；

所述电极J1、电极J2为不易锈蚀的导电金属材料制成；

所述直流电源E由至少二个干电池组合形成；所述直流电源E为整流电源。

所述接种装置还包括用于包裹电极J1、电极J2的二个电极套，所述电极套的尺寸与电极J1、电极J2相适配，所述电极套为吸水材料制成。

所述电极套材料为棉布。

采用本发明方法接种基因疫苗，主动免疫效果优良，产生的抗体滴度高，采用本发明基因免疫苗接种装置进行接种，操作简便，成功率高，重复性好，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明的电路原理图。

具体实施方式

实验仪器：

本发明基因免疫苗的接种装置：如图1所示，包括直流电源E、毫安表A、开关K、电位器R、电极J1、电极J2，直流电源E、开关K串联形成串联支路，串联支路与电位器R并联后连接毫安表A的一极，毫安表A的另一极连接电极J1，电极J2连接电位器R的中间抽头。

直流电源E由若干个6V锂电池通过串、并联组合形成；电极J1、电极J2采用铜或者铝等不易锈蚀的导电金属材料制成，也可以表面镀金或者镀银，电极J1、电极J2的截面为边长0.3-50mm的正方形或0.3-50mm×0.3-50mm的长方形或直径为0.3-50mm的圆形，厚度为0.05-5mm；用于包裹电极J1、电极J2的二个电极套的尺寸与电极J1、电极J2相适配，电极套采用棉布等吸水材料制成。

实施例1本发明接种方法

1、接种方法

（1）用胰岛素注射器（配以30号针头），采取皮内注射的方式，在小鼠后肢足垫部注射50微升基因免疫苗，形成的皮丘的形状为椭圆形，短轴为5毫米，长轴为10毫米。

（2）采用本发明基因免疫苗的接种装置施加电场，具体操作：1).将电极板装入电极套中，电极板宽5毫米，长10毫米；2).滴加少许磷酸缓冲液于电极套上，使电极套完全湿透；3).将阳极电极板贴附于质粒DNA注射皮丘上，将阴极电极板贴附于小鼠注射后肢的背侧；4).接通电源，调节电流至3毫安，通电5分钟后关闭电源，即可。

实施例2本发明接种方法

1、接种方法

（1）用一次性1.0毫升注射器，采取皮内注射的方式，在新西兰白兔耳部外侧注射500微升基因免疫苗，形成的皮丘形状为长方形，宽20毫米，长30毫米。

（2）采用本发明基因免疫苗的接种装置施加电场，具体操作：1).将电极板装入电极套中，电极板宽20毫米，长30毫米；2).滴加少许磷酸缓冲液于电极套上，使电极套完全湿透；3).将阳极电极板贴附于兔耳外侧质粒DNA注射皮丘上，将阴极电极板贴附于兔耳内侧皮肤；4).接通电源，调节电流至5毫安，通电10分钟后关闭电源，即可。

实施例3本发明接种方法

1、接种方法

（1）用胰岛素注射器（配以27号针头），采取皮内注射的方式，在小鼠后肢足垫部注射50微升基因免疫苗，形成的皮丘的形状为椭圆形，短轴为5毫米，长轴为10毫米。

（2）采用本发明基因免疫苗的接种装置施加电场，具体操作：1).将电极板装入电极套中，电极板宽5毫米，长10毫米；2).滴加少许磷酸缓冲液于电极套上，使电极套完全湿透；3).将阳极电极板贴附于质粒DNA注射皮丘上，将阴极电极板贴附于小鼠注射后肢的背侧；4).接通电源，调节电流至3毫安，通电30分钟后关闭电源，即可。

实施例4本发明接种方法

1、接种方法

（1）用一次性1.0毫升注射器，采取皮内注射的方式，在新西兰白兔耳部外侧注射500微升基因免疫苗，形成的皮丘形状为长方形，宽20毫米，长30毫米。

（2）采用本发明基因免疫苗的接种装置施加电场，具体操作：1).将电极板装入电极套中，电极板宽20毫米，长30毫米；2).滴加少许磷酸缓冲液于电极套上，使电极套完全湿透；3).将阳极电极板贴附于兔耳外侧质粒DNA注射皮丘上，将阴极电极板贴附于兔耳内侧皮肤；4).接通电源，调节电流至3毫安，通电20分钟后关闭电源，即可。

实验例1：balb/c小白鼠DNA免疫

1、实验材料和仪器

本发明的基因免疫苗的接种装置：如图1所示，包括直流电源E、毫安表A、开关K、电位器R、电极J1、电极J2，直流电源E、开关K串联形成串联支路，串联支路与电位器R并联后连接毫安表A的一极，毫安表A的另一极连接电极J1，电极J2连接电位器R的中间抽头。

直流电源E由若干个6V锂电池通过串、并联组合形成；电极J1、电极J2采用铜或者铝等不易锈蚀的导电金属材料制成，也可以表面镀金或者镀银，电极J1、电极J2的截面为边长0.3-50mm的正方形或0.3-50mm×0.3-50mm的长方形或直径为0.3-50mm的圆形，厚度为0.05-5mm；用于包裹电极J1、电极J2的二个电极套的尺寸与电极J1、电极J2相适配，电极套采用棉布等吸水材料制成。

其余材料和仪器均为市售品。

2、实验方法

（1）质粒D N A准备：常规人EPHB4重组蛋白表达质粒pCMV-EPHB4-myc-DKK扩增与纯化，质粒DN A溶解于无菌双蒸水或无菌磷酸缓冲液中，并将DNA浓度调节至每毫升0.5毫克。

（2）免疫前血清搜集：选取6-8周龄balb/c小白鼠5只，经尾静脉取静脉血50-100微升(microliter)至1.5毫升离心管中，置台式离心机中离心10分钟（离心速度为每分钟13,000-15,000转），将免疫前血清分别收集于新无菌离心管中，保存于4℃。

（3）免疫注射：在每只小鼠同侧后肢足垫部行皮内注射，注射器为胰岛素注射器，配以25号针头。每只小鼠注射50微升质粒DNA溶液，形成的皮丘的形状为椭圆形，短轴为5毫米，长轴为10毫米。

（4）基因免疫苗的接种装置操作：1).将电极板装入电极套中，电极板宽5毫米，长10毫米；2).滴加少许磷酸缓冲液于电极套上，使电极套完全湿透；3).将阳极电极板贴附于质粒DNA注射皮丘上，将阴极电极板贴附于小鼠注射后肢的背侧；4).接通电源，调节电流至3毫安，通电5分钟后关闭电源，结束电渗透。

（5）每周免疫动物1次，共3次。第28天，经尾静脉搜集抗血清，采用免疫细胞化学法测试抗EPHB4蛋白的特异性抗体的滴度。

3、实验结果

免疫前和免疫后小鼠的特异性抗体滴度如下表1所示：

表1 DNA质粒pCMV-EPHB4-myc-DDK电渗透法免疫小白鼠抗血清滴度检测（免疫细胞化学染色法）

抗血清浓度

免疫前対照

#1小白鼠

#2小白鼠

#3小白鼠

#4小白鼠

#5小白鼠

1/100

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1/500

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1/2,500

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1/12,500

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1/62,500

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1/312,500

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1/1,562,500

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如表1所示，免疫前小鼠抗EPHB4蛋白的特异性抗体检测呈阴性，用本发明方法接种免疫苗后，小鼠产生了抗EPHB4蛋白的特异性抗体，抗体平均滴度高于1:625000，抗体最高滴度可达1：30万。

实验结果说明，本发明方法可以有效接种基因疫苗，产生的抗体滴度高，主动免疫效果优良。

实验例2：新西兰大白兔DNA免疫

1、实验材料和仪器

本发明的基因免疫苗的接种装置：如图1所示，包括直流电源E、毫安表A、开关K、电位器R、电极J1、电极J2，直流电源E、开关K串联形成串联支路，串联支路与电位器R并联后连接毫安表A的一极，毫安表A的另一极连接电极J1，电极J2连接电位器R的中间抽头。

直流电源E由若干个6V锂电池通过串、并联组合形成；电极J1、电极J2采用铜或者铝等不易锈蚀的导电金属材料制成，也可以表面镀金或者镀银，电极J1、电极J2的截面为边长0.3-50mm的正方形或0.3-50mm×0.3-50mm的长方形或直径为0.3-50mm的圆形，厚度为0.05-5mm；用于包裹电极J1、电极J2的二个电极套的尺寸与电极J1、电极J2相适配，电极套采用棉布等吸水材料制成。

其余材料和仪器均为市售品。

2、实验方法

（1）质粒D N A准备：常规人EGFR重组蛋白表达质粒pcDNA6-EGFR-Flag扩增与纯化，质粒DN A溶解于无菌双蒸水或无菌磷酸缓冲液中，并将DNA浓度调节至每毫升(milliliter)1.0毫克(milligram)。

（2）免疫前血清搜集：选取8-12周龄新西兰白兔2只，经耳静脉取静脉血5毫升至15毫升离心管中，离心10分钟（离心速度为每分钟3,000-5,000转），将免疫前血清分别收集于新无菌离心管中，保存于4℃。

（3）免疫注射:在每只新西兰白兔耳部外侧行皮内注射，注射器为一次性1.0毫升注射器。每只兔子注射500微升质粒DNA溶液，形成的皮丘形状为长方形，宽20毫米，长30毫米。

（4）基因免疫苗的接种装置操作：1).将电极板装入电极套中，电极板宽20毫米，长30毫米；2).滴加少许磷酸缓冲液于电极套上，使电极套完全湿透；3).将阳极电极板贴附于兔耳外侧质粒DNA注射皮丘上，将阴极电极板贴附于兔耳内侧皮肤；4).接通电源，调节电流至5毫安，通电10分钟后关闭电源，结束电渗透。

（5）每2周免疫动物1次，共3次。分别于第7，21和35天，经耳静脉搜集抗血清，测试抗EGFR蛋白的特异性抗体滴度。

3、实验结果

免疫前和免疫后小鼠的特异性抗体滴度如下表2所示：

表2.DNA质粒pcDNA-EGFR电渗法免疫新西兰白兔抗血清滴度检测（免疫细胞化学染色法）

免疫次数	免疫前対照	兔子#1	兔子#2
				1	（－）	1:62,500	1:2,500
2	（－）	1:312,500	1:62,500
				3	（－）	1/1,562,500	1:312,500

如表2所示，免疫前小鼠抗EGFR蛋白的特异性抗体检测呈阴性，用本发明方法接种免疫苗，免疫一次即可获得较强的体液免疫反应，特异性抗体滴度为1:2500～1:625000，免疫三次后，特异性抗体滴度高达到1：30万～1：150万以上。

实验结果说明，本发明方法可以有效接种基因疫苗，产生的抗体滴度高，主动免疫效果优良。

实验例3电渗透法与其他DNA免疫技术的比较

1、实验材料和仪器

（1）高压电击法：高压电源及电极系统，由BTX840方波发生器和成圆周排列的6根针形电极组组成（美国Genetronic公司产品）。

（2）皮下注射转染细胞法：质粒DNA pcDNA3-TNFα，细胞转染试剂Lipofectamine2000(美国Invitrogene公司产品），人胚肾腺癌细胞系HEK293。

（3）基因枪法：去毛剂，为市售美容脱毛剂；Helius基因枪系统（美国Bio-Rad公司产品）以及由附着有质粒pcDNA3-TNFα的金粉微粒制成的子弹。

（4）本发明方法：本发明的基因免疫苗的接种装置：如图1所示，包括直流电源E、毫安表A、开关K、电位器R、电极J1、电极J2，直流电源E、开关K串联形成串联支路，串联支路与电位器R并联后连接毫安表A的一极，毫安表A的另一极连接电极J1，电极J2连接电位器R的中间抽头。

直流电源E由若干个6V锂电池通过串、并联组合形成；电极J1、电极J2采用铜或者铝等不易锈蚀的导电金属材料制成，也可以表面镀金或者镀银，电极J1、电极J2的截面为边长0.3-50mm的正方形或0.3-50mm×0.3-50mm的长方形或直径为0.3-50mm的圆形，厚度为0.05-5mm；用于包裹电极J1、电极J2的二个电极套的尺寸与电极J1、电极J2相适配，电极套采用棉布等吸水材料制成。

其余材料和仪器均为市售品。

2、实验准备

（1）质粒D N A准备：常规人TNFα重组蛋白表达质粒pcDNA3-T NFα扩增与纯化，质粒DN A溶解于无菌双蒸水或无菌磷酸缓冲液中，并将DNA浓度调节至每毫升(milliliter)0.8毫克(milligram)。

（2）免疫前血清搜集：选取8-12周龄新西兰白兔2只，经耳静脉取静脉血5毫升至15毫升离心管中，离心10分钟（离心速度为每分钟3,000-5,000转），将免疫前血清分别收集于新无菌离心管中，保存于4℃。

3、免疫方法（基因疫苗接种方法）：

分别采用高压电击法，基因枪法，皮下注射转染细胞法及本发明方法，对新西兰白兔D N A免疫。

（1）高压电击法：

免疫注射:以卡他明肌肉注射麻醉动物（每公斤体重100毫克），待动物深度麻醉后，取0.5毫升质粒D N A溶液，在一侧后肢的薄股肌处注射，注射深度为0.5厘米，注射分布范围为直径1.0厘米圆形。

电击操作：将针形电极组插入注射部位，将注射部位置于电极组中央，电极组插入肌肉深度为0.5-0.7厘米。接通电源。

电击参数：电压200V，波长50ms,共6次电击，每次电击后都要变换电极组角度60度。

（2）皮下注射转染细胞法：

细胞转染：转染实验前一天接种细胞于无抗菌素培养液中，过夜培养细胞至>90%丰度。参照使用手册配制转染混悬液，室温孵育转染混悬液20分钟后，加入培养的H E K293细胞中。继续细胞培养18－24小时收获细胞,转染率一般要求大于80%。

转染细胞收获：磷酸缓冲液离心洗涤转染细胞2次，1000rpm,每次5分钟。离心去上清后，将细胞混悬于新鲜磷酸缓冲液中，调节细胞浓度至每毫升2百万个细胞。

免疫注射：取上述细胞悬液0.5毫升与0.5毫升弗氏完全获不完全佐剂混匀，在动物背部多点皮下注射。

（3）基因枪法：

免疫部位准备：在待免疫新西兰白兔一侧耳廓背侧涂抹适量去毛剂，5分钟后以湿纸巾将去毛剂和局部毛发清除干净。

免疫接种：将基因枪枪管口贴近清洁干净的耳背皮肤处击发，每次击发后更换新的子弹（内径1厘米，内管壁附有质粒金粉的硅胶管），每次免疫击发4次，形成4个直径约1厘米的圆形质粒DNA接种区。

（4）本发明方法：

免疫注射：在每只新西兰白兔耳部外侧行皮内注射。注射器为胰岛素注射器，配以27号针头。每只兔子注射100-质粒DNA溶液，注射皮丘呈长方形，宽25毫米、长30毫米。

基因免疫苗的接种装置操作：1).将电极板装入电极套中，电极板宽20毫米，长30毫米；2).滴加少许磷酸缓冲液于电极套上，使电极套完全湿透；3).将阳极电极板贴附于兔耳外侧质粒DNA注射皮丘上，将阴极电极板贴附于兔耳内侧皮肤；4).接通电源，调节电流至4毫安，通电8分钟后关闭电源，结束电渗透。

（5）每3周免疫动物1次，共3次。于第7，28和49天，经耳静脉搜集抗血清，测试特异性抗体滴度。

4、实验结果

不同接种方法诱发动物对质粒pcDNA3-T N Fα发生体液免疫反应的时间，以及所产生的特异性抗体滴度如下表3所示：

表3各种DNA免疫技术效果比较

DNA免疫方法	最早免疫反应时间	最大抗血清滴度
			高压电击法	无明显免疫反应	无
皮下注射转染细胞法	第3次免疫后出现	1：2500
			基因枪法	第2次免疫后出现	1：25600
本发明方法	第1次免疫后出现	1:>1,000,000

如表3所示，采用现有接种方法接种疫苗，均需免疫2次以上，才会出现体液免疫反应，其中，高压电击法无明显免疫反应，而采用本发明方法，免疫1次即可引起体液免疫反应；同时，现有方法的抗血清滴度最高仅为1:2.56万，而本发明方法则大于1:100万，是现有方法的39倍。

实验结果说明，采用本发明方法接种基因疫苗，不仅会在短时间内出现体液免疫反应，而且产生的抗体滴度高，显著优于基因枪等其他接种方法。

综上，与现有基因疫苗接种方法相比，本发明接种方法对外源基因的转导最为有效，基因疫苗经本发明方法接种后，免疫动物的体液免疫反应快，产生的特异性抗体滴度高，采用本发明基因免疫苗接种装置进行接种，操作简便，安全有效，无需精密仪器和昂贵的试剂，成本低廉，应用前景良好。

Claims (4)

1.一种基因免疫苗的接种装置，其特征在于：它包括直流电源E、毫安表A、开关K、电位器R、电极J1、电极J2，所述直流电源E、开关K串联形成串联支路，所述串联支路与电位器R并联后连接毫安表A的一极，毫安表A的另一极连接电极J1，所述电极J2连接电位器R的中间抽头；

所述电极J1、电极J2的截面为边长0.3-50mm的正方形或0.3-50mm×0.3-50mm的长方形或直径为0.3-50mm的圆形，厚度为0.05-5mm；从电极J1到电极J2电流为3～5mA。

2.根据权利要求1所述的接种装置，其特征在于：

所述直流电源E由二个6V锂电池组合串联形成，电位器R为5kΩ。

3.根据权利要求1所述的接种装置，其特征在于：

所述直流电源E由至少二个干电池组合形成或者为整流电源；

所述电极J1、电极J2为不易锈蚀的导电金属材料制成；

所述接种装置还包括用于包裹电极J1、电极J2的二个电极套，所述电极套的尺寸与电极J1、电极J2相适配，所述电极套为吸水材料制成。

4.根据权利要求1所述的接种装置，其特征在于：所述电极套材料为棉布。