CN103717249A - 注射针和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于向受试者的组织递送预防性和/或治疗性物质（即，递送试剂）的多种针组件和细胞内递送装置。优选地，所述针组件和/或细胞内递送装置包括设置成一个阵列（例如，具有三根外部针和一根中心针的Y型阵列）的针和/或针电极，其中在所述阵列中的每一根针均具有一个封闭端和沿每个针梗的多个孔，在所述阵列的外部针的针梗上的孔被设置向中心针和/或邻近针的孔递送所述递送试剂、但不向由针的阵列内的区域所限定的作用区外的位置处递送，所述中心针的针梗上的孔被设置在向外部针递送所述递送试剂的位置处。

Description

注射针和装置
对序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起递交。所述序列表以名称为SequenceListingTRIPEP125.TXT的文件（创建于2012年6月6日，146KB大小）提供。电子格式序列表的信息的全部内容以引用的方式被结合到本说明书中。
技术领域
在本说明书中公开的实施方案的方面总体上涉及用于递送并由受试者（例如人）的组织摄取治疗性物质（例如，化学制品、化合物、蛋白和核酸）的装置和方法。优选实施方案涉及用于向多种细胞（优选为动物细胞，例如人类细胞）递送遗传物质或核酸（包括但不限于DNA、RNA和修饰的核酸）的装置和方法。
背景技术
向组织递送治疗性物质（例如遗传物质）有各种各样有用的应用，包括接种、缺陷基因的替换、DNA免疫、免疫原的导入、反义疗法，以及miRNA、RNAi、适配体或siRNA疗法。例如，核酸，比如说DNA，举例来说，可被注射入组织中，在该处核酸可由周围的细胞摄取（即使低效）。以这种方式导入的DNA会产生该DNA编码的蛋白。向组织成功地递送核酸以及所述核酸成功地被细胞摄取是比较困难的，尤其是在需要产生大量的蛋白表达的时候（例如，对于基于DNA的接种的需要）。传统的向组织注射遗传物质通常会导致较差的细胞摄取和低水平的蛋白表达（如果还有的话）。
将来基因治疗会是治疗人类和动物疾病的一种重要手段。近年来已经取得了一些临床上的进展，其中一个例子是通过基因治疗使病人部分恢复了视觉（Bainbridge，New Engl JMed.（新英格兰医学杂志），2008，358(21):2231）。基因治疗在临床应用的一个主要领域是用于传染病的基因疫苗接种。然而，使基因治疗成为现实的一个主要限制是难以可再生地递送遗传物质。基因可通过病毒载体或以质粒DNA的形式进行递送。病毒载体的限制是它们会引起抗载体的应答，这限制了它们重复使用，并且它们的生产和储存都很昂贵。DNA的优势是其不会引起抗载体的应答，并且生产和储存相对比较便宜。然而，DNA的一个重大问题是难以被体内的人类细胞所摄取。因此，新型实用的且可耐受的向体内的人类细胞递送DNA的方法能够加速基因治疗的整个领域。
血管内的施用方法也已经被开发用于向动物递送治疗试剂（参见例如，美国专利第6,379,966、6,897,068、7,015,040、7,214,369、7,473,419和7,589,059号，所有这些专利的全部内容以引用的方式被明确结合到本说明书中）。血管内的施用很难在实际操作中执行；然而，需要熟练的临床医生，并且如果执行不正确的话，该程序可导致血管穿孔、血肿，以及出现内部血块，这会导致栓塞。此外，血管内的施用方法会导致被导入的治疗试剂（例如，核酸和蛋白）的广泛分布，这在尝试促进身体对所递送的试剂建立免疫反应时是不希望的。因此，对于能够促进治疗性分子（例如核酸和蛋白）的递送和摄取的装置和方法仍然存在需要。
发明内容
本说明书公开了用于向动物（例如，人）组织递送预防性和/或治疗性试剂（例如化学制品、化合物、化学治疗剂、蛋白、特异性交换剂、核酸（例如DNA、RNA、其它天然核酸、修饰的核酸）、或DNA或核酸适配体）的装置和方法，凭借所述装置和方法，所述试剂（“递送试剂”）可被位于注射位点周围组织的细胞所摄取，所述试剂表达，以产生治疗性或美容性的益处。在本说明书中使用时，术语“递送试剂”可以指代在向组织或受试者注射或递送之前或递送之后的预防性和/或治疗性试剂，包括上文中所列举的任何物质。
在一些实施方案中，本文中描述的一种或多种针和/或装置被用于施用细胞群（例如，再生细胞、干细胞、祖细胞或它们的混合物），以产生治疗性和/或美容性的益处。在这些实施方案中，所述细胞被导入到有需要的受试者的组织（例如，乳房的脂肪组织、心、肾、骨、皮肤、脂肪组织、椎间盘）中，以促进产生治疗性或美容性的益处（例如，促进或完成乳房再造术，改善缺血性区域，修复退化的椎间盘，促进骨修复，促进伤口愈合，或改善皮肤上的皱纹或痘痕）。
本说明书所公开的多个实施方案包括能够用于活体动物（包括人）的细胞内递送装置。一些细胞内递送装置的操作方式是在局部（例如，在由装置的针阵列限定的区域内）向动物组织过载递送试剂并向该区域或注射区域提供电场以促进更大量的递送和/或摄取递送试剂。一些实施方案，例如包括：细胞内递送仪，所述细胞内递送仪包括控制注射参数的递送单元，与所述递送单元相连、包括至少一个电连接件的集合器（hub）；与所述集合器相连的多根针，其中所述多根针的每一根针包括：封闭端；针梗（needle barrel）；设置在所述针梗上的多个孔，其中位于每个针梗上的孔相向于位于至少一个其它针梗上的孔，以便形成使递送试剂以相向的递送方向递送或使递送试剂以交叉喷射模式的递送；电极；以及被设置为用于在所述电极处生成电场的电源供应装置，其中所述电源供应装置通过至少一个电连接件与电极相连。
在一些实施方案中，细胞内递送仪的多根针中的至少一根针为针电极，所述针电极与电源供应装置电连接并被设置为形成电场。
在一些实施方案中，细胞内递送仪包括多个针电极，所述多个针电极与电源供应装置电连接并被设置为形成电场。
在一些实施方案中，细胞内递送仪包括排列成Y形样式的四根针，含一根中心针及三根设置在中心针周围的外部针，其中中心针为针电极，被设置为应用第一极性电压，三根外部针为针电极，被设置为应用第二极性电压。
在细胞内递送仪的一些实施方案中，所述中心针包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向位于三根外部针的每根针上的孔处递送，三根外部针的每一根针均包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向位于中心针上的孔处递送，并且其中所述外部针不具有被设置为将递送试剂远离中心针递送的孔。
在一些实施方案中，细胞内递送仪包括一阵列的针，所述一阵列的针包括一根中心针和设置在中心针周围的多根外部针，其中所述中心针为设置为应用第一极性电压的针电极，所述外部针为设置为应用第二极性电压的针电极，其中所述中心针包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向外部针处递送，所述外部针包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向中心针和/或邻近的针处递送，并且其中所述外部针不具有能够将递送试剂向远离由针的阵列内的区域限定的作用区递送的孔。
在一些实施方案中，细胞内递送仪进一步包括排列成六角形样式的七根针，其中作为针电极的一根针位于六角形样式的中心。
本文中公开的一些实施方案描述了如上所述的细胞内递送仪，包括：与集合器流体连接的注射器；用于接收注射器的通道；用于可操作地将注射器固定在所述通道内的套环；手柄，用于将注射器及集合器封装在通道内，使得针梗的封闭端从所述通道中伸出并可用来与受试者接合；加料元件，所述加料元件被设置为由手柄的操作而进行加料，所述加料元件与触发器和注射器连结，使得触发器的运行释放了加料元件，所述加料元件作用于注射器，从而将预防性和/或治疗性物质从注射器中置换出来；以及电端口，所述电端口被设置为与皮下注射针装置的集合器上的电连接件配合，从而建立起在电源供应装置和电极和/或针电极之间的电连接。
在一些实施方案中，所述集合器为袋形集合器，包括对于每根针或针电极的递送试剂的单独储存器。
在一些实施方案中，所述集合器包括对于每根针或针电极的递送试剂的单个储存器。
在一些实施方案中，所述多根针的至少一根针至少部分地由不导电材料层压。
在一些实施方案中，所述细胞内递送仪进一步包括被设置为控制电场生成的电源供应装置控制器。
在一些实施方案中，控制电场的生成包括控制一个或多个脉冲电压、针电极的极性、脉冲数量、脉冲类型或脉冲持续时间。
在一些实施方案中，所述加料元件为被设置成由手柄的运行而压缩且被设置成在触发器运行时减压的弹簧。
在一些实施方案中，应用到所述电极和/或针电极的电场为整流电场。
本文所公开的其它实施方案包括将递送试剂导入受试者的组织中的方法，包括：提供如本文所描述的细胞内递送仪；提供电压源；将所述电穿孔仪的多根针和多个电极或多个针电极插入受试者的组织中；将递送试剂通过多根针或多个针电极的腔道置换出来并导入受试者的组织中；以及向受试者的组织施加电场。
在一些实施方案中，在向组织施加电场之前进行递送试剂的置换。
在一些实施方案中，在向组织施加电场之后进行递送试剂的置换。
在一些实施方案中，递送试剂的置换以两阶段法进行，其中第一阶段包括将递送试剂置换进入作用区的组织中，第二阶段包括将一个或多个电极或针电极通电以使作用区内的细胞电穿孔。
在一些实施方案中，注射参数为注射速度或注射压力。
在一些实施方案中，本文所描述的电穿孔仪用于DNA接种。
在一些实施方案中，所述DNA接种包括导入编码肝炎抗原的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述肝炎抗原为丙型肝炎病毒（HCV）抗原。
在一些实施方案中，所述HCV抗原包括NS3。
附图说明
图1A示出了含两个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的侧视图，每个针梗具有5个孔，用于向针梗之间的区域递送预防性和/或治疗性试剂。
图1B示出了含四个针梗的皮下注射针集合器的一个实施方案的分解立体图，所述针梗用于向所述针梗之间的区域递送预防性和/或治疗性试剂。
图2A示出了含两个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的侧视图，每个针梗具有三个孔，用于向针梗之间的区域递送预防性和/或治疗性试剂。
图2B示出了细胞内递送仪的一个实施方案，在每根针上以相同的间距设有五个孔。
图2C示出了含三根针的针集合器的一个实施方案，并描述了皮下注射针集合器的尺寸。
图2D示出了含四根交错设置的针的针集合器的一个实施方案。
图3示出了含两个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的侧视图，每个针梗具有十个孔，用于向针梗之间的区域递送治疗性试剂。
图4示出了细胞内递送仪的一个实施方案的侧视图，所述细胞内递送仪用于向肌细胞中递送包括DNA的预防性和/或治疗性试剂。
图5A是含三根针的细胞内递送仪的俯视图。
图5B示出了含三个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的侧视图。
图5C示出了通过交叉喷射方式向受试者的组织递送治疗性试剂的图5B的细胞内递送仪的立体图。
图6A示出了含两个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的侧视图，其中每个针筒以相对于所述装置的纵向轴呈一定角度进行设置。
图6B示出了含两个针梗和一个连接器配件的细胞内递送仪的一个实施方案的立体图。
图6C示出了含一个连接器配件的细胞内递送仪的俯视图。
图7A示出了含六个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的立体图，每个针梗具有多个孔，用于向受试者的组织递送预防性和/或治疗性试剂。
图7B是图7A的细胞内递送仪的俯视图。
图8A示出了含四个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的侧视图。
图8B示出了具有“Y”形样式的图8A的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图8C示出了具有“O”形样式的图8A的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图9示出了含四个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图10A示出了含具有星形样式的七个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图10B示出了含七个针梗的针集合器的立体图。
图11示出了含十个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图12示出了含三个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图13示出了含三个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图14示出了含四个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图15示出了含四个针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图16示出了包括环形针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图17示出了包括环形针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图18示出了包括环形针梗的细胞内递送仪的一个实施方案的俯视图。
图19示出了含单个腔道的一个针梗的一个实施方案的剖视图。
图20示出了含两个腔道的一个针梗的一个实施方案的剖视图。
图21A-D为与本文中描述的细胞内递送装置配套使用的弹簧驱动装置的一个实施方案的立体图和侧视图。
图22A-B为与本文中描述的细胞内递送装置配套使用的触发器装置的一个实施方案的立体图和侧视图。
图23A-C示出了含一个顶端集合器部分和一个底部集合器部分的针集合器的一个实施方案。
图24示出了与本文所描述的细胞内递送装置配套使用的可调节的递送装置的一个实施方案的立体图。
图25示出了与细胞内递送装置配套使用的可调节递送单元的一个实施方案的截面图。
图26示出了含切口形孔和封闭端的细胞内递送仪的一个实施方案。
图27A-C示出了含微集合器及封闭端针的细胞内递送仪的实施方案。
图28A-B示出了与含连接至注射器的微集合器的细胞内递送仪一起使用的可调节的递送装置的立体图。
图29A-C示出了用于电穿孔的细胞内递送仪的一个或多根针的电连接。
图30A-F示出了微集合器注射装置的针和电极设置的实施方案，显示了针或电极的极性、电场以及喷射流的方向。
图31A示出了含非袋状集合器的细胞内递送仪的远端的实施方案。
图31B示出了另一个含袋状集合器的细胞内递送仪的远端的实施方案。
图32A-B示出了含层压针（部分电绝缘）的细胞内递送仪的实施方案。
图33A-D示出了含双注射器的细胞内递送仪的实施方案以及含双注射器的皮下注射针装置的递送和电场模式。
图34A-C示出了含隔离阀的细胞内递送仪的实施方案以及含隔离阀的皮下注射针装置的针和电极结构。
图35A示出了处于两阶段递送法的第一阶段的细胞内递送仪的实施方案。
图35B示出了处于两阶段递送法的第一阶段的针和电极结构的实施方案。
图35C示出了处于两阶段递送法的第二阶段的细胞内递送仪的实施方案。
图35D示出了处于两阶段递送法的第二阶段的图35B的装置的针和电极结构。
图36示出了与含连接至注射器的微集合器的细胞内递送装置一起使用的提供了电源的可重复使用的递送装置的立体图。
图37示出了内部设有细胞内递送仪的提供了电源的可重复使用的递送装置的内部视图。
图38A-C示出了含设置用于电穿孔的微集合器的细胞内递送仪的实施方案。
图39A-C示出了含设置用于电穿孔的微集合器的、具有Y形结构的细胞内递送仪的实施方案。
图40A-B描绘了小号HIP（高注射压力）注射器和大号HIP注射器。
图41为用编码NS3/4A的核酸免疫5天后的兔研究的图示，提供了在T细胞增殖试验中当将细胞与不同浓度的各种抗原孵育时以每分钟计数的细胞的放射性，以显示放射性胸苷的摄入。
图42为示出了作为用HIP注射器免疫的结果的HCV NS3特异性T细胞增殖情况的图。增殖可通过用抗原孵育的细胞的放射性除以仅用培养基孵育的细胞的放射性而测量。
图43A-C为用常规的27号针（图43A）、小号HIP注射器（图43B）和大号HIP注射器（图43C）在注射位点处组织的组织学评价。
图44A-I示出了包含NS3/4A平台和含及不含NS3蛋白酶切割位点的HBcAg的各种构建体。
图45A描述了用于测量使用本发明公开的一种注射针装置注射物质时所需要的力的装置的一个实施方案。
图46A-F为显示使用本文描述的细胞内递送仪向鸡胸注射染色水的试验7-9的俯视图和截面图。
图47A-F为显示使用本文描述的细胞内递送仪向鸡胸注射染色水的试验25-27的俯视图和截面图。
图48A-F为显示使用本文描述的细胞内递送仪向鸡胸注射染色水的试验16-18的俯视图和截面图。
图49A-F为显示使用本文描述的细胞内递送仪向鸡胸注射染色水的试验34-36的俯视图和截面图。
图50A-F为使用本文描述的细胞内递送仪手动注射染色水的鸡胸的俯视图和截面图。
图51A-F为使用单根针手动注射染色水的鸡胸的俯视图和截面图。
图52示出了使用5mL注射器采用针构造“3Y01(72)”、“3O01(96)”和“6X01(144)”注射安慰剂液体的最大力的图。
图53示出了使用10mL注射器采用针构造“3Y01(72)”、“3O01(96)”和“6X01(144)”将水注入空气中的最大力的图。
图54示出了使用10mL注射器采用针构造“3Y05(72)”、“3O05(72)”和“3X05(72)”将水注入空气中的最大力的图。
图55示出了采用标准针手动递送，或使用具有“3Y05(72)”、“3O05(72)”、“3X05(72)”、“3Y01(72)”或“3O01(96)”针构造的劳埃德张力计将染色水注入鸡的图像。
图56A1-B2为采用标准针和使用本文所描述的细胞内递送仪联合电穿孔注射的示例性结果。
图57A1-C2为使用在两个注射力值下的本文所描述的细胞内递送仪联合电穿孔相比于常规针联合电穿孔的注射的示例性结果。
图58A示出了使用IVIN细胞内递送仪而没有使用电穿孔的小鼠的免疫数据。
图58B示出了使用常规注射针而没有使用电穿孔的小鼠的免疫数据。
图58C示出了使用IVIN细胞内递送仪及电穿孔的小鼠的免疫数据。
图58D示出了使用常规注射针及电穿孔的小鼠的免疫数据。
图59A-B示出了非免疫猪的免疫数据。
图59C-D示出了免疫猪的免疫数据。
具体实施方式
在本文中描述的本发明的方面涉及向组织递送试剂（比如核酸）的装置和方法。有些实施方案涉及被设置为向靶组织导入试剂（例如核酸，尤其是DNA）的细胞内递送仪，其中这些分子被位于靠近或注射位点附近处的区域中（例如，在由本文所描述的细胞内递送仪的一个针阵列内的区域所限定的区域内）的细胞所摄取。
细胞内递送仪的针可包括适配连接器或针集合器，其可包括含内螺纹的套管。所述适配连接器或针集合器被设置为将所述针附接到含待导入的试剂的注射器或导管上。在一些实施方案中，所述套管构成了附接器件，可被旋拧到注射器的附接部分的外部螺纹上。所述适配连接器或针集合器也可包括压紧组件、扣紧组件或鲁尔锥形连接器（Luer Taperconnection），例如鲁尔旋锁接口（Luer Lok）或鲁尔滑锁接口（Luer Slip）连接器或蝴蝶连接器。
本文所描述的细胞内递送仪的针可以附接至一个或多个注射器针筒（例如，永久附接或可移除的连接），并且所述注射器针筒或装置可包含待递送的预防性和/或治疗性试剂。例如，在一些实施方案中，所述针和连接的注射器可预先装入预防性和/或治疗性试剂，例如一次性使用的核酸、蛋白、修饰的核酸、适配体或细胞群。在一些实施方案中，试剂可通过设置在针上的孔被吸入注射器中。注射器针筒可具有不同尺寸（例如，0.3cc-100cc或更大）。即，注射器针筒可以为大于或等于0.1、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100cc的尺寸或为上述数字之间的任意尺寸。所述注射器针筒可以用多种材料（例如，金属、塑料、尼龙、聚乙烯、玻璃）制作而成。
本文所描述的细胞内递送仪的针可被附接到帮助将预防性和/或治疗性分子或试剂递送到组织中的一个或多个装置上，包括但不限于基因枪、电穿孔系统和微针装置。可以对在本文中描述的注射针进行改进，以与现有的技术一起使用，所述现有技术包括基因枪递送系统（参见例如美国专利第5,036,006号、5,240,855号和5,702,384号，这些专利公开的全部内容因此以引用的方式被明确结合至本文），使用电穿孔的递送系统（参见例如美国专利第6,610,044和5,273,525号，6,132,419号和6,527,216号，这些专利所公开的全部内容因此以引用的方式被明确结合至本文）和微针递送系统（参见例如美国专利第6,960,193号、6,623,457号、6,334,856号、5,457,041号、5,527,288号、5,697,901号、6,440,096号、6,743,211号和7,226,439号，这些专利公开的全部内容因此以引用的方式被明确结合至本文）。
如本文所描述的，包括针的细胞内递送装置也可包含多种预防性和/或治疗性试剂（例如细胞群（如包括干细胞的细胞群）、化学制品、化合物、化学治疗剂、蛋白、特异性交换剂、核酸（例如DNA、RNA、其它天然核酸、修饰的核酸）、或DNA或核酸适配体）。在一些实施方案中，包括一根或多根在本文中描述的针的细胞内递送装置包括DNA，所述DNA编码免疫原（优选为病毒抗原，例如丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、流感病毒、日本脑炎病毒（JEV）、人乳头瘤病毒（HPV）；或寄生虫抗原，例如疟疾抗原；或植物抗原，例如桦树抗原；或细菌抗原，例如葡萄球菌或炭疽抗原；或肿瘤抗原）。在一些实施方案中，包括一根或多根在本文中描述的针的细胞内递送装置包括预装载有一种或多种上述的DNA（例如，预装载的、与含测量剂量的递送试剂的针连接的一次性使用的注射器）。
在一些实施方案中，在如本文中描述的注射器、针或注射装置中递送或容纳的预防性和/或治疗性试剂包括天然核酸，而在其它实施方案中，在如本文中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的预防性和/或治疗性试剂包括非天然核酸（例如，包含人造核苷酸、通用碱基或间隔区）。可用作治疗试剂、在如本文所描述的注射器或注射装置中递送或容纳的天然核酸包括脱氧核糖磷酸或核糖磷酸骨架。可用作预防性和/或治疗性试剂、在如本文所描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的人造或合成的多核苷酸可以包括在体外或在无细胞系统中聚合的任何多核苷酸，所述多核苷酸包含相同或相似的碱基，但可以包含不同于天然核糖磷酸骨架类型的骨架。这些骨架包括：PNA（肽核酸）、硫代磷酸、磷酰二胺、吗啉代，以及天然核酸的磷酸骨架的其它变体。可被包括在本文中描述的一个或多个实施方案的碱基包括嘌呤和嘧啶，进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物。可被包括在本文中描述的一个或多个实施方案的合成的嘌呤和嘧啶衍生物包括但不局限于设置新的反应基团（例如但不局限于胺、醇、硫醇、羧酸和卤代烷）的修饰。
在本文中使用的术语“碱基”，包括任何已知的DNA和RNA的碱基类似物，包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-（羧基羟基甲基）尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羰甲基氨甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧甲基-氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。术语多核苷酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）和DNA、RNA和其它天然的和合成的核苷酸的组合。
在如本文中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的所述预防性和/或治疗性试剂可以包括DNA，其可能的形式有cDNA、体外聚合DNA、质粒DNA、质粒DNA的部分、源自病毒的遗传物质、线性DNA、载体（P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体）、表达盒、嵌合序列、重组DNA、染色体DNA、寡核苷酸、反义DNA或这些组的衍生物。RNA可能的形式为寡核苷酸RNA、tRNA（转移RNA）、snRNA（小核RNA）、rRNA（核糖体RNA）、mRNA（信使RNA）、体外聚合RNA、重组体RNA、嵌合序列、反义RNA、siRNA（小干扰RNA）、miRNA（微小RNA）、核糖酶或这些组的衍生物。在如本说明书中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的所述预防性和/或治疗性试剂也可包括反义多核苷酸，所述反义多核苷酸是一种干扰DNA和/或RNA功能的多核苷酸。反义多核苷酸包括但不局限于：吗啉代、2'-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等等。siRNA包括通常包含15到50个碱基对，优选为21到25个碱基对的双链结构，具有与细胞内表达的靶基因或RNA相同或几乎相同的核苷酸序列。干扰可能会导致抑制表达。所述多核苷酸是一种序列，它在细胞中的存在或表达会改变细胞内基因或RNA的表达或功能。另外，DNA和RNA可以是单链、双链、三链或四链的。双链、三链和四链的多核苷酸可以包含RNA和DNA二者或天然的和/或合成的核酸的其它组合物。这些多核苷酸可被递送到细胞中表达外源性核苷酸序列，以抑制、消除、增加或改变内源性核苷酸序列的表达，或者表达与细胞非天然相关的特殊的生理特征。多核苷酸可以被编码以表达整个或部分的蛋白，或者可以为反义。所述递送的多核苷酸可以停留在细胞质或细胞核内，远离内源性遗传物质。或者，所述聚合物可以再结合内源性遗传物质或成为其一部分。例如，在如本说明书中描述的注射器或细胞内递送装置中递送或容纳的治疗性试剂可以包括DNA，所述DNA能够通过同源或非同源重组，将其本身嵌入染色体DNA中。
在如本说明书中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的所述预防性和/或治疗性试剂也可包括RNA抑制剂，所述RNA抑制剂是包含一种序列的任何的核酸或核酸类似物，所述序列在细胞中的存在或表达会以序列特异的方式引起特定的细胞RNA，通常是mRNA的降解或抑制其功能或翻译。RNA抑制剂也可抑制基因转录为RNA。RNA的抑制可有效地抑制转录所述RNA的基因的表达。RNA抑制剂包括但不局限于siRNA、微小RNA(miRNA),干扰RNA或RNAi、dsRNA、RNA聚合酶Ⅲ转录的DNA、核糖酶和反义核酸，其可以为RNA、DNA或人造核酸。微小RNA（miRNA）也通常有大约15-50个核苷酸的长度，优选大约20-25个核苷酸的长度，并且miRNA可被用作转录后调节剂，与靶信使RNA转录产物（mRNA）上的互补序列结合，通常导致翻译抑制和基因沉默。反义多核苷酸包括但不局限于：吗啉代、2'-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等等。RNA聚合酶Ⅲ转录的DNA可包括启动子，例如U6启动子。这些DNA可在细胞中转录生成起siRNA作用的小发夹RNA或起反义RNA作用的线性RNA。所述RNA抑制剂可以为在体外聚合，重组体RNA，包含嵌合序列或这些组的衍生物。所述RNA抑制剂可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成的核苷酸或任何合适的组合，使得靶RNA和/或基因被抑制。另外，这些形式的核酸可以是单链、双链、三链或四链的。
在如本说明书中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的所述预防性和/或治疗性试剂也可包括结合到载体（例如，表达载体）中的核酸。载体为起源于病毒、质粒或高等有机体的细胞的多核苷酸分子，合适大小的另一核酸片段能够整合至其中；载体通常将外源DNA导入到寄主细胞中，并在宿主细胞中进行复制。示例包括质粒、粘粒和酵母人工染色体；载体通常为包含多个来源的DNA序列的重组体分子。
在本文中使用的术语“载体”指的是可以包括将DNA序列转移进入细胞中进行表达的相关分子的任何DNA分子。示例包括裸DNA、非病毒DNA复合体（例如DNA加聚合物[阳离子或阴离子的]、DNA加转染增强化合物，以及DNA加两性分子化合物）和病毒颗粒。在本文中使用时，载体也可以包括病毒载体：例如，腺病毒，DNA，源自腺病毒相关病毒且比腺病毒小的腺相关病毒载体（AAV）和逆转录病毒（逆转录病毒家族中的任何病毒，以RNA作为其核酸，使用逆转录酶将其基因组复制至宿主细胞的染色体DNA中；示例包括VSV G和包括慢病毒（包括HIV类型病毒）的成分的逆转录病毒）。
在如本说明书中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的所述预防性和/或治疗性试剂也可包括一种或多种可提高所述治疗性试剂（例如，在本说明书中描述的核酸）的摄取的化合物。在如本说明书中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的所述治疗性试剂可包括聚合物，例如，由称为单体的较小单元重复结合在一块形成的分子。术语“聚合物”可包括两种寡聚物，这两种寡聚物为具有两个到约80个单体和具有多于80个单体的聚合物。所述聚合物可以是线形、分支网络状、星形、梳状或梯状的聚合物。所述聚合物可以是同聚物，在其中使用一种的单体；或者可以是共聚物，在其中使用两种或更多种单体。共聚物的种类包括交替、无归、嵌段和接枝。
在如本说明书中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的预防性和/或治疗性试剂也可包括核酸-聚阳离子复合体。阳离子蛋白如组蛋白和鱼精蛋白或合成的聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、DEAE右聚糖苷、聚凝胺和聚乙烯亚胺均是有效的细胞内递送剂。聚阳离子为含净正电荷的聚合物，例如聚-L-赖氨酸氢溴酸盐。所述聚阳离子可包括为正电荷、中性电荷或负电荷的单体单元，然而，所述聚合物的净电荷优选为正的。术语“聚阳离子”也可指包括两个或更多个正电荷的非聚合分子。聚阴离子为含净负电荷的聚合物，例如多聚谷氨酸。所述聚阴离子可包括为负电荷、中性电荷或正电荷的单体单元，然而，所述聚合物上的净电荷必须是负的。术语“聚阴离子”也可指包括两个或更多个负电荷的非聚合分子。术语“聚离子”包括聚阳离子、聚阴离子、两性离子聚合物，以及包括等量的阴离子和阳离子的中性聚合物。术语“两性离子”指的是在属于同一分子的一部分的酸性基团和碱性基团之间反应的产物（盐）。盐为离子化合物，当溶解在溶液中时，会电离成阳离子和阴离子。盐增加了溶液的离子强度，因此减少了核酸和其它阳离子之间的相互作用。
在如本说明书中描述的注射器、针或细胞内递送装置中递送或容纳的所述预防性和/或治疗性试剂也可包括特异性交换剂。有几种类型的特异性交换剂是已知的，在如本文中描述的注射器、针或注射装置中可递送或容纳这些分子中的任意一种或多种。例如，美国专利第7,318,926、7,019,111、6,933,366、6,660,842、6,469,143、6,245,895、6,040,137、5,869,232、7,943,149、6,417,324号描述了特异性交换剂，这些专利的公开内容以其整体被明确结合至本文。优选地，使用包括针对连接至低聚糖的病原体上的受体（例如gal表位或Galαl-3Gal-β1-4GlcNAc-R）的配体的特异性交换剂，优选合成组装的特异性交换剂或复合糖，例如由固相肽合成法制备的特异性交换剂或复合糖。
一些实施方案涉及包括多根针的细胞内递送装置，这些针被安排或被设置为向靶组织递送治疗性试剂。在一些实施方案中，所述试剂由注射器递送经过所述注射装置的近端，所述试剂经过设置在或靠近多个针梗的远端上的多个孔被递送到靶组织中。在其它实施方案中，所述孔的端部可被设置在针梗的近端上。在一些实施方案中，在注射装置上设置具有本文所描述的任意一个或多个上述结构特征的多根针。本文所描述的实施方案还包括含如上所述设置的多根针的插管。即，在一些实施方案中，所述细胞内递送装置和/或插管可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多根针，或由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多根针组成，或基本由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多根针组成。所述针可以是相同大小和长度，或可以具有不同的大小和长度。具有多于一根针的实施方案中的每根针可具有多个孔，可位于如上所述的第一或第二区，或者位于这两个区（例如，沿所述带的长度）。优选地，如上所述，所述细胞内递送装置的针具有封闭端。包括2、3、4、5、6、7、8、9或10根针，或由2、3、4、5、6、7、8、9或10根针组成，或基本由2、3、4、5、6、7、8、9或10根针组成的细胞内递送装置和/或插管可被设置为使得至少两根针具有不同数量的孔和/或不同尺寸的孔和/或不同形状的孔和/或不同位置的孔，并且所述针优选具有封闭端。优选地，所述针和孔的朝向为使得每根针上的孔相向于另一根针上的孔，以便形成递送试剂相向方向的递送或递送试剂交叉喷射模式的递送（例如，在具有一根中心针和三根外部针的四针阵列中，外部针的孔可以引导递送试剂朝向中心针上的孔，中心针上在三个区处有孔，其中每个区朝向外部针上的孔，从中心针流出的递送试剂朝向位于每根外部针上的孔）。在一些细胞内递送装置的实施方案中，这样的针阵列连接至或设置在包括至少一个电连接件的集合器上。再一次，优选地，阵列中每根针上的孔朝向另一根针上的孔，以便形成递送试剂的交叉喷射模式或递送试剂相向递送的区域。这样，针阵列内的某一个区局部过载递送试剂，从而在该区内形成了高浓度的递送试剂，这在当施加电场从而诱导递送试剂的摄取时尤为有用。所述注射装置、皮下注射针组件或细胞内递送装置也优选包括电极（在一些实施方案中，一根或多根针自身即为电极）和设置为在电极处生成电场的电源供应装置，其中所述电源供应装置通过至少一个电连接件连接至电极上。在一些实施方案中，一根针或多根针在靠近针梗的封闭端的第一区具有孔，且一根针或多根针在远离针梗的封闭端的第二区具有孔。另外，一些实施方案可以具有第一针（例如，位于如下所述的单根针装置上的单根针，或具有多根针的装置中的第一针）或第一多根针，所述第一针或第一多根针的孔在其最宽处的尺寸等于、大于或小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95、2.0、2.05、2.10、2.15、2.20、2.25、2.30、2.35、2.40、2.45、2.50、2.55、2.60、2.65、2.70、2.75、2.80、2.85、2.90、2.95、3.0、3.05、3.10、3.15、3.20、3.25、3.30、3.35、3.40、3.45、3.50、3.55、3.60、3.65、3.70、3.75、3.80、3.85、3.90、3.95或4.0mm。在一些实施方案中，一根针或多根针的孔在其最宽处小于1μm。在一些实施方案中，一根针或多根针的孔在其最宽处小于大约900nm。在一些实施方案中，一根针或多根针的孔在其最宽处小于大约500nm。在一些实施方案中，具有多根针的细胞内递送装置中的第一针的孔小于或基本上小于所述装置中第二针或第二多根针的孔。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置仅包括一根针。所述针可包括本文中公开的任何结构特点。例如所述针可具有封闭或开口端。所述针可包括多个孔，例如，至少多于或等于大约5、10、20、30、50、70、100、120、140、160、180、200、500个孔或在其中间的任意数量的孔（例如，至少大约5-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100或5-200、10-200、20-200、30-200、40-200、50-200、100-200、100-500、140-500、150-500、200-500个孔）。这些孔可以均匀间隔，或随意分布。在一些实施方案中，这些孔在针上形成了规则的图案。例如，所述孔可形成沿针的轴旋转对称的图案。所述旋转对称可包括2重轴、3重轴、4重轴、5重轴、6重轴或更高程度的旋转对称。作为另一个例子，所述孔可形成具有螺旋轴对称的图案。所述螺旋轴对称可包括2重轴、3重轴、4重轴、5重轴、6重轴或更高程度的旋转对称。螺旋轴的平移矢量可以，例如，约为、至少为、至少约为、不超过、不超过约0.01mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、1cm、2cm或3cm。在一些实施方案中，所述孔被设置为在注射预防性和/或治疗性物质时形成放射状。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包括流体连接至含预防性和/或治疗性物质的注射器或储存器的一根或多根针，使得所述一根或多根针与注射器或储存器的相对定位是固定的。在一些实施方案中，所述一根或多根针的端部可以两端都是流体连接并设置在靠近含预防性和/或治疗性物质的注射器或储存器的位置。例如，所述一根或多根针的一端可以距离含预防性和/或治疗性物质的注射器或储存器大约为、不超过、不超过约1mm、5mm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或10cm。在一些实施方案中，所述一根或多根针的端部距离与所述针流体连接并含有预防性和/或治疗性物质的注射器或储存器不超过大约10cm。
一些实施方案涉及包括含如在本说明书中描述的试剂（例如，药用化合物、化学制品、核酸、肽、特异性交换剂，以及特别是DNA）的流体的注射装置、细胞内递送装置、插管和针。在一些实施方案中，在本说明书中描述的细胞内递送装置、插管和针为一次性使用的。即，有些实施方案包括在本说明书中描述的与容器（优选为无菌容器，例如灭菌的注射器）连接的一种或多种针的设计，所述容器包括单次应用或剂量的递送试剂（例如，药用化合物、化学制品、核酸、肽、特异性交换剂，以及特别是DNA）。因此，单次应用或装置可被方便地进行包装并提供给医师或最终用户，他们可在合适的位置施用所述试剂，在施用后，可以合适地丢弃使用过的包括多根针的注射装置、针或插管。一些实施方案还包括制造及使用上述装置的方法以及诱导对所希望的抗原的免疫应答的方法。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置并未设置为在注射位点周围的组织和/或通过注射位点的组织导入预防性和/或治疗性物质（例如DNA）之后不久或同时施用电场。例如，所述细胞内递送装置可不包括与所述装置连接并设置为向注射位点处或附近的组织施加电场的电压源。在其它实施方案中，所述细胞内递送装置被设置为在注射位点周围的组织和/或通过注射位点的组织导入预防性和/或治疗性物质（例如DNA）之后不久或同时施用电场。例如，所述细胞内递送装置可包括与所述装置连接并设置为向注射位点处或附近的组织施加电场的电压源。
一些在本说明书中公开的实施方案包括向有需要的受试者递送预防性和/或治疗性物质的方法，其中所述预防性和/或治疗性物质使用在本说明书中公开的任何细胞内递送装置进行施用。所述预防性和/或治疗性物质可以是在本说明书中公开的任何物质。在一些实施方案中，所述方法也可包括在注射完预防性和/或治疗性物质后但在抽回所述一根或多根针之前，维持所述一根或多根针插入在所述组织中至少预设的时间。在注射所述治疗性物质后但在抽回所述一根或多根针之前，所述一根或多根针可在组织中维持，例如，至少大于或等于1s、2s、3s、4s、5s或更长时间。在一些实施方案中，在少于大约60秒、40秒、30秒、20秒、15秒、10秒、5秒、4秒、3秒、2秒、1.5秒、1.0秒、0.8秒、0.5秒、0.4秒、0.3秒或0.2秒的期间内递送全部剂量。
将一根或多根针插进组织和将所述一根或多根针从组织中移出之间的时间也可有所不同。所述时间可以为，例如，大约、至少、至少约、不超过、不超过约0.5秒、1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、15秒、30秒、45秒或60秒。
在一些实施方案中，在本说明书中描述的针和任何装置可被固定到受试者的身体上更长的时间，使得可以长期递送预防性和/或治疗性试剂（例如至少递送大于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天），并且所述的针和装置可被固定到微型泵上，以便在延长的期间内向所述受试者施用少量的预防性和/或治疗性物质（例如细胞群（如包括干细胞的细胞群）、化学制品、化合物、化学治疗剂、蛋白、核酸（例如DNA、RNA、其它天然核酸、修饰的核酸）、或DNA或核酸适配体）。
在一些实施方案中，所述预防性和/或治疗性物质可在使用压力生成元件、在高压下通过本文所描述的任何细胞内递送装置而被递送至身体中。所述压力生成元件可以为注射器中的活塞，并且可以包括弹簧或抑制活塞的其它元件以对预防性和/或治疗性物质产生高的作用力或压力。由压力生成元件生成的高的作用力或压力被施加到预防性和/或治疗性物质上以将其通过针进行置换（例如，通过向连接到针的注射器中的活塞施加作用力）。最大的作用力可以为例如，大约、至少、至少约、不超过、不超过约25N、40N、50N、75N、100N、150N、200N或500N。施加到治疗性物质上的最大压力可以为，例如，大约、至少、至少约、不超过、不超过约50kPa、100kPa、200kpa、300kPa、400kPa、500kPa、600kPa、700kPa、800kPa、900kPa、1000kPa、1100kPa、1200kPa、1300kPa、1400kPa、1500kPa、1600kPa、1700kPa、1800kPa、1900kPa、2000kPa、2100kPa、2200kPa、2300kPa、2400kPa、2500kPa、2600kPa、2700kPa、2800kPa、2900kPa、3000kPa、3100kPa、3200kPa、3300kPa、3400kPa、3500kPa、3600kPa、3700kPa、3800kPa、3900kPa、4000kPa、4100kPa、4200kPa、4300kPa、4400kPa、4500kPa、4600kPa、4700kPa、4800kPa、4900kPa、5000kPa、6000kPa、7000kPa、8000kPa、9000kPa、10MPa、15MPa、20MPa、25MPa或30MPa。
在一些实施方案中，所述预防性和/或治疗性物质可以以高的孔速度（即流体排出孔的平均速度）进行递送。所述孔速度可以为，例如，大约、至少、至少约、不超过、不超过约1mm/s、1.5mm/s、2mm/s、2.5mm/s、3mm/s、3.5mm/s、4mm/s、5mm/s、6mm/s、7mm/s、8mm/s、9mm/s或10mm/s。在一个优选实施方案中，所述孔速度可以为至少约3mm/s。可以例如通过注射预防性和/或治疗性物质的体积速率除以孔的平均尺寸确定孔速度。本文公开的细胞内递送装置可任选地被设置为以如上所述的任何孔速度进行递送。例如，所述细胞内递送装置可与弹簧活塞结合，设置为以足以产生所希望的孔速度的体积速率注射预防性和/或治疗性物质。
本发明的一些方面涉及一种细胞内递送装置，包括针，所述针含适于预防性和/或治疗性物质通过的腔道以及针梗，所述针梗在所述针梗的长度上包括多个孔，其中所述针梗具有封闭端；以及连接件，所述连接件被设置为将所述针连接到压力生成元件上。在一些实施方案中，上述细胞内递送装置包括如本文所述的多根针，在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包括圆形、菱形、三角形、正方形、矩形、梯形、卵形或其它形状阵列的针。优选地，所述细胞内注射递送装置被设计为多根所述的针被设置为位于所述针梗上的孔彼此面对，但在一些实施方案中，所述皮下注射针组件具有多根所述的针，所述针被设置为使得位于所述针梗上的孔彼此背离。在一些实施方案中，所述细胞内递送装置进一步包括与所述细胞内递送装置连接的压力产生元件，所述压力产生元件可以是注射器。上述细胞内递送装置可具有直径约为10nm-4mm、0.01mm-4mm、0.1mm-4mm、1.0mm-4mm、1.5mm-4mm、2.0mm-4mm或3.0mm-4mm的孔。
在一些实施方案中，上述细胞内递送装置包括与至少三根所述的针连接的单个注射器。在一些实施方案中，所述至少三根所述针相距大约2mm和约10mm之间。在其它实施方案中，上述细胞内递送装置可包括与至少四根皮下注射针连接的单个注射器。在一些实施方案中，所述细胞内递送装置具有至少四根皮下注射针，相距在约3mm和约6mm之间。一次性使用的细胞内递送装置也同样是一个实施方案，这种装置优选包括多根附接于至少一个注射器上的针，其中所述针包括沿所述针梗分布的多个孔以及一个封闭端；所述至少一个注射器包括单次剂量的预防性和/或治疗性试剂。在一些实施方案中，细胞内递送装置中的预防性和/或治疗性试剂为核酸。所述预防性和/或治疗性试剂可以是编码蛋白的DNA。在一些实施方案中，上述细胞内递送装置包括与至少三根皮下注射针连接的单个注射器，在一些实施方案中，所述至少三根皮下注射针相距约2mm和约10mm之间。在其它实施方案中，上述细胞内递送装置包括与至少四根针连接的单个注射器，在一些实施方案中，所述至少四根皮下注射针相距约3mm和约6mm之间。
本发明的方面也包括制造和使用上述装置的方法。通过一种方法，在本说明书中描述的有些装置被用于向受试者递送预防性和/或治疗性试剂，所述方法的实践方式为提供在本说明书中描述的一种递送装置，将所述装置的针插入受试者的组织中，然后将所述治疗试剂从注射器中推动，通过所述针进入组织中。在一些实施方案中，所述预防性和/或治疗性试剂为核酸，所述核酸可以编码抗原，例如病毒抗原，优选为肝炎抗原，如HCV或HBV抗原，使得在本文中描述的一些递送装置可用于在受试者中诱导针对由所述的装置递送的抗原的免疫应答的目的。
其它的实施方案包括用于向组织中递送预防性和/或治疗性物质的细胞内递送装置，所述装置包括与压力产生元件连接的连接器；适于预防性和/或治疗性物质通过的腔道；以及针梗，其中所述针梗包括沿所述针梗的长度延伸的多个孔。在一些实施方案中，所述治疗性物质包括核酸、多肽、糖类、特异性交换剂、类固醇、细胞群、化学制品或免疫原。在一些实施方案中，所述预防性和/或治疗性试剂诱导免疫系统。
所述针梗可适于传送电流，所述装置可进一步包括适于传送电磁场的电极。在一些实施方案中，所述预防性和/或治疗性试剂进入细胞，在其它实施方案中，所述试剂保留在细胞外。在一些实施方案中，使用液体介质或气体介质传递压力。在一些实施方案中，所述核酸包括源自肝炎病毒的序列，所述肝炎病毒如乙型肝炎抗原（HBV），例如HBcAg，或丙型肝炎病毒（HCV）抗原，例如NS3/4A，或它们的组合，如源自感染了鹳或苍鹭的HBV病毒的与NS3/4A连接的HBcAg的序列。在其它实施方案中，所述核酸包括源自人猿病毒抗原的序列。优选地，所述核酸包括编码能够生成增殖性T细胞应答的抗原的序列，在一些实施方案中，所述核酸包括源自人类免疫缺陷性病毒的序列。
其它的实施方案包括，用于向组织中递送预防性和/或治疗性物质的细胞内递送装置包括预防性和/或治疗性物质压力产生元件；与所述压力产生元件连接的一阵列的针梗；其中在该阵列中的至少一个所述针梗包括多个孔，所述孔适于将从所述压力产生元件传递来的压力传递进入组织中，以增加细胞膜的渗透性，并且在该阵列中的至少一个所述针梗适于使在本文其它处描述的预防性和/或治疗性物质通过。
更多的实施方案，包括具有纵向轴的细胞内递送装置，所述装置包括被设置为与增压流体源接合的连接器；以及针组件，所述针组件包括在与所述装置的纵向轴基本上平行的方向上从所述连接器延伸的茎，所述茎包括与所述连接器流体连接的第一腔道，在与所述装置的纵向轴基本上平行的方向上从所述茎处延伸的第一针梗，所述第一针梗包括与所述茎流体连接的第二腔道和与所述第二腔道流体连接的至少一个孔，以及在与所述装置的纵向轴基本上平行的方向上从所述茎处延伸的第二针梗，所述第二针梗包括与所述茎流体连接的第三腔道和与所述第三腔道流体连接的至少一个孔。
在一些实施方案中，所述第一针梗和所述第二针梗在它们之间形成了注射腔空间。在一些实施方案中，所述注射腔空间被设置为容纳受试者的至少一部分，例如组织。在一些实施方案中，所述第一针梗和第二针梗每个均包括相同数量的孔。在一些实施方案中，位于所述第一针梗上的每个孔均朝向位于所述第二针的针梗上的孔。在一些实施方案中，所述第一针梗和所述第二针梗包括设置为相对于所述茎的削尖末梢端。在一些实施方案中，所述孔一般为曲线形的。在一些实施方案中，所述孔一般为多边形的。在一些实施方案中，所述孔沿与所述装置的纵向轴基本上平行的线段均匀地设置。在一些实施方案中，第三针梗在与所述装置的纵向轴基本上平行的方向上从所述茎处延伸，所述第三针梗包括与所述茎流体连接的第四腔道和与所述第四腔道流体连接的至少一个孔。在一些实施方案中，至少一个孔被设置为向所述注射腔空间施加负压。
进一步的实施方案涉及向受试者递送预防性和/或治疗性试剂的细胞内递送装置，所述装置具有纵向轴，并包括与所述装置的所述纵向轴基本上平行设置的多个注射器，每个注射器包括一根针，所述针沿所述针的长度上设置了多个孔，其中所述孔朝向所述装置的纵向轴。在这些实施方案中，所述至少一个注射器包括含基因的预防性和/或治疗性试剂。在一些实施方案中，每根针包括尖端，多根针的所述尖端被设置在与所述装置的所述纵向轴基本垂直的平面上。其它的实施方案包括皮下注射针，所述皮下注射针包括沿所述针的所述针梗设置的多个孔，其中所述针的端部闭合。在一些实施方案中，所述的封闭端为钝形的。
在一些实施方案中，所述组件进一步包括附接至针的注射器。在一些实施方案中，所述的注射器包括预防性和/或治疗性试剂，所述试剂可以是核酸，例如编码蛋白的DNA。本发明的进一步方面涉及包含多根皮下注射针的细胞内递送装置，所述皮下注射针包括沿所述针的针梗设置的多个孔，所述针与一个或多个注射器连接。优选地，所述针的端部闭合。在一些实施方案中，所述针的端部为钝形的。在一些实施方案中，所述注射器包括预防性和/或治疗性试剂，例如编码蛋白的DNA。在一些实施方案中，上述注射装置包括与至少三根皮下注射针连接的单个注射器。一些实施方案涉及包括附接到至少一个注射器上的多根针的一次性使用的细胞内递送装置，其中所述针包括沿所述针的针梗设置的多个孔，且所述至少一个注射器包括单次剂量的预防性和/或治疗性试剂。在一些实施方案中，所述针的端部闭合。在一些实施方案中，所述针的端部为钝形的。在一些实施方案中，所述预防性和/或治疗性试剂为核酸。在一些实施方案中，所述核酸为编码蛋白的DNA。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包括含多根针的针集合器，所述多根针部分设置在针集合器中；所述多根针的每一根包括适于治疗性物质通过的腔道，以及针梗，所述针梗在沿所述针梗的长度上包括多个孔，其中所述针梗具有封闭端，并且其中所述孔在每根针的针梗上均匀间隔，孔的平均直径在大约0.01mm到大约6mm的范围内；含活塞的注射器；被设置为流体连接至注射器和针集合器的连接器，所述连接器被设置为在连接器和针集合器之间形成缺口。在一些实施方案中，所述皮下注射针包括位于针梗上的区，其中每个区被设置为以不同方向通过治疗性物质。在一些实施方案中，所述皮下注射针包括具有相当于针梗的轴的第一尺寸和垂直于针梗的轴的第二尺寸的切口，其中第一尺寸长于第二尺寸。
使用任一种或多种上述装置的方法也是实施方案，包括向细胞递送核酸的方法，所述方法包括使用本文所描述的注射装置。在一些实施方案中，向受试者递送预防性和/或治疗性试剂的方法包括：通过提供电压源、向受试者的组织中插入细胞内递送装置的一根或多根针而进行电穿孔，其中所述一根或多根针的每一根都包括具有腔道和多个孔的针梗，所述针梗由导电材料制成，还包括与电压源相连的电连接；将预防性和/或治疗性试剂通过针的腔道置换出来，通过多个孔进入组织中，其中一根或多根针连接至含所述预防性和/或治疗性试剂的注射器，从而使得注射器和一根或多根针形成了刚性或非柔性的结构；以及通过使用作为电极的一根或多根针向受试者的组织施加电场。在一些实施方案中，在向组织施加电场之前进行预防性和/或治疗性试剂的置换。在一些实施方案中，在向组织施加电场之后进行预防性和/或治疗性试剂的置换。在一些实施方案中，在向组织施加电场之前进行预防性和/或治疗性试剂的置换。在一些实施方案中，在与向组织施加电场大致相同的时间进行预防性和/或治疗性试剂的置换（例如，可在向预防性和/或治疗性试剂的注射位点处或附近的受试者组织施加电场之前、期间或之后，通过将所述预防性和/或治疗性试剂穿过针梗上的孔而施加预防性和/或治疗性试剂，如编码抗原的核酸）。在一些实施方案中，所述核酸为编码蛋白（例如抗原）的DNA。
一些实施方案涉及含多对针的细胞内递送装置，所述多对针的每一根针包括封闭端、针梗以及沿所述针梗的多个孔，其中在多对针的至少一根针上的孔相对于至少一根其它针排列以生成交叉喷射模式；其中所述多对针的至少一对包括一对具有相反极性的电极，所述电极被设置为向受试者施加电场。
在一些实施方案中，所述DNA编码病毒抗原。在一些实施方案中，所述病毒抗原为HCV或HBV抗原。此外，在一些实施方案中，使用HBcAg或其片段或编码HBcAg的核酸或其片段作为佐剂。通过一些方法，所述HBcAg或其片段或编码HBcAg的核酸或其片段为选自SEQ.ID NO.1-32的序列。提高针对抗原的免疫应答的方法也同样为一个实施方案，所述方法可包括在向受试者提供HBcAg或其片段或编码HBcAg的核酸或其片段的同时或其不久之后向所述受试者提供所述抗原或编码所述抗原的核酸。在一些方法中，所述HBcAg或其片段或编码HBcAg的核酸或其片段为选自SEQ.ID NO.1-32的序列。在一些方法中，所述DNA编码NS3/4A和/或HBcAg（例如，源自感染鹳和苍鹭的病毒的HBcAg）。
在一些实施方案中，本文中描述的细胞内递送装置用于向有需要的受试者递送致免疫组合物。优选地，所述致免疫组合物为编码抗原（例如，HCV抗原，例如NS3/4A或NS5，和/或HBV抗原，例如HBcAg，优选源自感染鹳或苍鹭的HBV）的核酸。在这些方法中的一部分中，对致免疫组合物（例如由核酸编码的抗原，如NS3/4A、NS5或HBcAg）的免疫应答进行评价、测量、分析或观察。用于递送这些致免疫组合物的优选装置为包括能够连接至本文所描述的一根或多根针的注射器的那种，使得注射器和针组件是非柔性的，或者是刚性的（即，不是导管）。在一些实施方案中，将至少大约0.3mL的预防性和/或治疗性物质（例如，悬浮在0.2、0.3、0.4或0.5ml中的致免疫组合物）在不到60、45、30、15、10、5或1秒内，以及至少大约200kpa的压力下递送给受试者。在一些实施方案中，所述预防性和/或治疗性物质的量可为至少大约1mL。
因此，本发明的方面涉及被设置为用于递送预防性和/或治疗性试剂（例如细胞群（如包括干细胞的细胞群）、化学制品、化合物、化学治疗剂、蛋白、特异性交换剂、核酸（例如DNA、RNA、其它天然核酸、修饰的核酸）、或DNA或核酸适体）的细胞内递送装置，其中所述细胞内递送装置包括多根针，所述多根针含闭合或开口端以及沿每根针的长度延伸的多个孔。在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包括如本文所描述的一根针。在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包括如本文所描述的多根针。所述针可以为钝形端（例如具有封闭端）或可具有斜面形、尖形或尖锐的端部，每根针也可具有封闭端。所述针可被制成多种规格（例如，至少，等于或大于7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34号）。优选地，所述针的规格大于或等于20号（例如，大于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34号），更加优选地，所述针的规格大于或等于23号（例如，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34号），最优选地，所述针的规格大于或等于25号（例如，25、26、27、28、29、30、31、32、33或34号）。在一些实施方案中，所述孔并不位于或靠近于一根或多根针的针尖。例如，所述孔可位于距针尖至少1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、2cm、3cm、4cm或更远处。
针的长度可根据所希望递送的类型发生改变。为了靶向于皮肤或特定组织中的特定细胞上，例如，优选的靶向深度取决于待被靶向的特定细胞或组织以及特定受试者皮肤的厚度（例如为了靶向于人类皮肤真皮处的朗格罕氏细胞，希望所述递送至少部分包含通常在人类中深度约0.025mm到约0.2mm的表皮组织）。因此，在其中需要递送到朗格罕氏细胞的实施方案中，针的长度可以是约0.025mm到约0.2mm。在一些实施方案中，希望将治疗性试剂在角质层正下方且包含表皮和上层真皮的靶向的深度处递送（例如，在这些实施方案中，优选的针的长度包括约0.025mm到约2.5mm）。在其它实施方案中，所述治疗性试剂被递送至肌肉组织或脂肪组织中（例如，在这些实施方案中，优选的针的长度包括约0.5cm到约15cm是所希望的）。因此，本发明的方面涉及包含一个或多根针的细胞内递送装置及其用途，其中针的长度大于、等于、小于或位于如下数字之间的任何数字：约0.025mm、0.05mm、0.075mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、125mm、150mm、175mm、200mm、225mm、250mm、275mm、300mm、325mm、350mm、375mm、400mm、425mm、450mm、475mm、500mm、525mm、550mm、575mm、600mm、625mm、650mm、675mm、700mm、725mm、750mm、775mm、800mm、825mm、850mm、875mm、900mm、925mm、950mm、975mm、1cm、1.25cm、1.5cm、2.0cm、2.25cm、2.5cm、2.75cm、3.0cm、3.25cm、3.5cm、3.75cm、4.0cm、4.25cm、4.5cm、4.75cm、5.0cm、5.25cm、5.5cm、5.75cm、6.0cm、6.25cm、6.5cm、6.75cm、7.0cm、7.25cm、7.5cm、7.75cm、8.0cm、8.25cm、8.5cm、8.75cm、9.0cm、9.25cm、9.5cm、9.75cm、10.0cm、10.25cm、10.5cm、10.75cm、11.0cm、11.25cm、11.5cm、11.75cm、12.0cm、12.25cm、12.5cm、12.75cm、13.0cm、13.25cm、13.5cm、13.75cm、14.0cm、15.25cm、14.5cm、14.75cm或15cm。在一些实施方案中，针的长度大于10mm。在一些实施方案中，针的长度大于约15mm。在一些实施方案中，针的长度大于约20mm。在一些实施方案中，针的长度大于约30mm。
本文所描述的任何针（例如如上所述的形状和尺寸的任意一种或多种针）可包括不同大小与形状（例如，椭圆形、圆形、切口或卵形）的多个孔，这些孔可通过机械加工或激光制成。一根或多根针中的每根针可包括，例如，大于、等于、少于或在下面数字之间的任何数量的孔：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500。在优选实施方案中，装置中的所有的一根或多根针的孔的总量可以为72、96或144。在一些实施方案中，所述孔可沿针的长度均匀间隔。在一些实施方案中，所述孔可聚集在一个区域（例如，位于所述针的第一或第二区（例如，其中所述两个区由相对于所述针的长度的中点处两个侧部所区分）或所述孔位于沿所述针的长度处），或沿所述针的长度非均匀的间隔开。所述针可具有封闭或开口端，但封闭端是优选的，这样设计可在使用小孔径孔（例如，其最宽处的尺寸等于或小于0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0mm）时增加递送的压力。所述针可由手术钢、不锈钢或金属合金（例如基本上由至少大约52%的镍和至少大约48%的钛组成）组成。在一些实施方案中，所述针可包括导电材料。在一些实施方案中，当针例如通过鲁尔锁机制附接或连接至增压流体储存器（例如注射器）时，注射器和针形成了刚性、非柔性体，使得注射器和针组件并不是导管。类似地，本文所描述的许多实施方案包括与本文所描述的一根或多根针连接的注射器，使得注射器和针组件缺少覆盖针的外部的外套，而这是导管所需要的。虽然本文所描述的多种装置具有与在导管中发现的相似的特征，但本发明的许多实施方案并不是导管，当注射器连接至针时（例如，当注射器直接连接至含本文所描述的一根或多根针的集合器时），本文所描述的许多装置是刚性且非柔性的。
在本文中公开的实施方案并不局限于制造所公开的针梗或孔的任何具体制造工艺。针梗可通过使用任何标准的针生产工艺，包括（仅举例来说）压铸、注塑成型、吹塑成型、机器加工、激光加工等等进行制造。类似地，针的材料可从任意数量的已知的针的材料，例如不锈钢、碳钢和各种金属合金中进行选择。针梗上的孔可以作为针梗制造过程的一部分进行制造，或者通过钻孔或激光蚀刻的方式在过后添加上。这些各种制造方法在本领域中都是熟知的。
本发明的方面同样总体上涉及使用如上所述的细胞内递送装置跨膜递送药品、核酸或其它生物活性分子和化合物的方法。有效成分（例如DNA、RNA、核酸、蛋白或化合物）可在多种溶液中进行配制，用于通过在本文中描述的针进行递送。在一些实施方案中，所述有效成分（例如DNA、RNA、核酸、蛋白或化合物）可以在载体溶液（如水、缓冲液、盐水、油乳剂、油或甘油）中混合。该液体可继而通过在本文中描述的针。在一些实施方案中，所述有效成分（例如DNA、RNA、核酸、蛋白或化合物）可被固定在载体上（例如纳米颗粒、蛋白、糖或丸），并与一种或多种上述载体溶液（例如水、缓冲液、盐水、油乳剂、油或甘油）混合，且结合载体的试剂通过在本文中描述的针。应该理解的是，存在多种运载介质和载体，使用本申请未明确提及的运载介质或载体并不会背离本发明的精神。例如，所述运载介质可以是阳离子油。
如上所述，预计与本文所描述的细胞内递送装置配套使用的核酸可以是源自如下的核酸：人、非人的灵长类、小鼠、细菌、病毒、霉菌、原生动物、鸟、爬行动物、鸟类（例如鹳和苍鹭）、小鼠、仓鼠、大鼠、兔、豚鼠、土拨鼠、猪、小型猪、山羊、狗、猫、人和非人的灵长类，例如狒狒、猴和黑猩猩。在一些实施方案中，本文所描述的细胞内递送装置可被用于递送编码在丙型肝炎病毒（HCV）中发现的蛋白的核酸。HCV基因产物可以为已知感染任何物种的动物（包括但不限于两栖类、爬行动物、鸟类（例如鹳和苍鹭）、小鼠、仓鼠、大鼠、兔、豚鼠、土拨鼠、猪、小型猪、山羊、狗、猫、人和非人类的灵长类，例如狒狒、猴和黑猩猩）的病毒。在一些实施方案中，本文所描述的细胞内递送装置可被用于递送编码在乙型肝炎病毒（HBV）中发现的蛋白的核酸。HBV基因产物可以为已知感染任何物种的动物（包括但不限于两栖类、爬行动物、鸟类（例如鹳和苍鹭）、小鼠、仓鼠、大鼠、兔、豚鼠、土拨鼠、猪、小型猪、山羊、狗、猫、人和非人类的灵长类，例如狒狒、猴和黑猩猩）的病毒。
在一些实施方案中，可以向有效成分中添加辅药。例如，根据增加或辅助其效果的需要，可以向由在本文中描述的装置递送的药物中添加药理学试剂。在另一个示例中，可以在本文中描述的装置中使用增加抗原应答的免疫学试剂。例如，美国专利第6,680,059号（其全部内容以引用的方式被结合至本文），描述了含三唑核苷作为疫苗佐剂的疫苗的用途。然而，辅药可以指代有能力提高或促进免疫应答或增加或辅助预防性和/或治疗性试剂效果的任何物质。在一些实施方案中，与本文所公开的一种或多种抗原或编码抗原（例如NS3/4A）的核酸一起施用的辅药为IL-12或编码IL-12的核酸，这些辅药可以位于也可以不位于与编码所关心的抗原（例如，NS3/4A）的核酸相同的构建体上。
在一些实施方案中，可在所提供的装置和方法中使用任何核酸，例如，质粒DNA、线形DNA、反义DNA和RNA。例如，核酸可以是本领域所熟知类型的DNA表达载体。在一些实施方案中，本发明被用于DNA或RNA接种的目的。即，本发明包括提高向细胞内间隙注射DNA或RNA核酸的跨膜流速的方法。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置可用于向有机体的各种组织高压注射，其中希望递送预防性和/或治疗性物质。例如，所述组织可以是骨骼肌、脂肪组织、内脏器官、骨、结缔组织、神经组织、皮肤组织等等。例如，DNA疫苗可通过向动物的骨骼肌进行肌肉注射或者通过向动物的真皮进行皮内注射而进行递送。在其它实施方案中，治疗性物质可通过胃肠外递送的方式递送进入皮下或腹膜内的组织中。根据靶组织和待递送的预防性和/或治疗性试剂，针的参数可进行适当修改，以提供对于达到产生足够用于提高试剂递送的压力所必需的希望的物理性质。
在一些实施方案中，细胞内递送装置可被设置为按照预设的递送速度进行递送预防性和/或治疗性物质。例如，注射器可以由产生用于推压注射器活塞所希望的推动速度的弹簧驱动的装置进行控制，以产生所希望的递送速度。美国专利第6,019,747号公开了一种这类装置的示例，该专利的全部内容以引用的方式结合至本文。在一些实施方案中，注射器可由气体弹簧、机电机构、压缩空气或其它类似的驱动机构进行控制。所述递送速度可以，例如，至少为0.1mL/s、0.3mL/s、0.5mL/s、0.8mL/s、0.9mL/s、1.0mL/s、1.1mL/s、1.2mL/s、1.3mL/s、1.4mL/s、1.5mL/s、2.0mL/s或3.0mL/s。所述递送速度可以，例如，不超过20.0mL/s、10.0mL/s、7mL/s、6mL/s、5mL/s、4mL/s、3mL/s或2mL/s。正如在下面所进一步讨论的，本申请包括使用所述注射装置的方法。因此，所述方法可以包括以预设的速度，如任何在上面所公开的速度递送治疗性物质。
在一些实施方案中，细胞内递送装置包含预防性和/或治疗性试剂。所述装置可包括，例如，配制的用于肌肉内递送的核酸。理想地，在包含本文所描述的一根或多根针的装置中装载编码免疫原的DNA或含DNA的免疫原性组合物（例如，DNA疫苗）。然而，可以通过本文所描述的一个实施方案递送广泛多样的核酸。即，在本文中描述的一个或多个实施方案可包括从如下组成的组中选择的一或多种核酸：mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA（微小RNA）、siRNA（小干扰RNA）、RNAi（干扰RNA）、piRNA（Piwi-干扰RNA）、aRNA（反义RNA）、snRNA（小核RNA）、snoRNA（小核仁RNA）、gRNA（向导RNA）、shRNA（小发夹RNA）、stRNA（小时序RNA）、ta-siRNA（反作用小干扰RNA）、cpDNA（叶绿体DNA）、gDNA（基因组DNA）、msDNA（多拷贝单链DNA）、mtDNA（线粒体DNA）、GNA（乙二醇核酸）、LNA（锁核酸）、PNA（肽核酸）、TNA（苏糖核酸）、含吗啉代的核酸、含硫核酸、2-O-甲基核酸，以及含一种或多种修饰的碱基或间隔区的核酸。
在本说明书描述的装置中容纳或由其递送的核酸的浓度可从约0.1ng/ml到约50mg/ml间变化。在一些方面，在本文所描述的装置中容纳或由其递送的核酸浓度（例如，由在本文中描述的装置所递送的核酸的合适剂量）位于约10ng/ml到25mg/ml之间。在进一步的其它方面，所述核酸浓度位于100ng/ml到10mg/ml之间。在有些方面，在本文所描述的装置中容纳或由其递送的核酸浓度（例如，由在本文中描述的装置所递送的核酸的合适剂量）大于或等于或低于约100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、500ng/ml、550ng/ml、600ng/ml、650ng/ml、700ng/ml、750ng/ml、800ng/ml、850ng/ml、900ng/ml、950ng/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml、26μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml、30μg/ml、31μg/ml、32μg/ml、33μg/ml、34μg/ml、35μg/ml、36μg/ml、37μg/ml、38μg/ml、39μg/ml、40μg/ml、41μg/ml、42μg/ml、43μg/ml、44μg/ml、45μg/ml、46μg/ml、47μg/ml、48μg/ml、49μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/ml、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml、550μg/ml、600μg/ml、650μg/ml、700μg/ml、750μg/ml、800μg/ml、850μg/ml、900μg/ml、950μg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml、3.0mg/ml、3.1mg/ml、3.2mg/ml、3.3mg/ml、3.4mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.7mg/ml、3.8mg/ml、3.9mg/ml、4.0mg/ml、4.1mg/ml、4.2mg/ml、4.3mg/ml、4.4mg/ml、4.5mg/ml、4.6mg/ml、4.7mg/ml、4.8mg/ml、4.9mg/ml、5.0mg/ml、5.1mg/ml、5.2mg/ml、5.3mg/ml、5.4mg/ml、5.5mg/ml、5.6mg/ml、5.7mg/ml、5.8mg/ml、5.9mg/ml、6.0mg/ml、6.1mg/ml、6.2mg/ml、6.3mg/ml、6.4mg/ml、6.5mg/ml、6.6mg/ml、6.7mg/ml、6.8mg/ml、6.9mg/ml、7.0mg/ml、7.1mg/ml、7.2mg/ml、7.3mg/ml、7.4mg/ml、7.5mg/ml、7.6mg/ml、7.7mg/ml、7.8mg/ml、7.9mg/ml、8.0mg/ml、8.1mg/ml、8.2mg/ml、8.3mg/ml、8.4mg/ml、8.5mg/ml、8.6mg/ml、8.7mg/ml、8.8mg/ml、8.9mg/ml、9.0mg/ml、9.1mg/ml、9.2mg/ml、9.3mg/ml、9.4mg/ml、9.5mg/ml、9.6mg/ml、9.7mg/ml、9.8mg/ml、9.9mg/ml、10.0mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、26mg/ml、27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml，或位于由这些数值的任意两个所限定且包括的范围内。
由在本文中描述的细胞内递送装置提供的核酸的量可在从约1ng到10g间变化。在一些方面，在细胞内递送装置中容纳或由细胞内递送装置所提供的核酸的量少于、大于或等于约1ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、150ng、200ng、250ng、300ng、350ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、21μg、22μg、23μg、24μg、25μg、26μg、27μg、28μg、29μg、30μg、31μg、32μg、33μg、34μg、35μg、36μg、37μg、38μg、39μg、40μg、41μg、42μg、43μg、44μg、45μg、46μg、47μg、48μg、49μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、105μg、110μg、115μg、120μg、125μg、130μg、135μg、140μg、145μg、150μg、155μg、160μg、165μg、170μg、175μg、180μg、185μg、190μg、195μg、200μg、205μg、210μg、215μg、220μg、225μg、230μg、235μg、240μg、245μg、250μg、255μg、260μg、265μg、270μg、275μg、280μg、285μg、290μg、295μg、300μg、305μg、310μg、315μg、320μg、325μg、330μg、335μg、340μg、345μg、350μg、355μg、360μg、365μg、370μg、375μg、380μg、385μg、390μg、395μg、400μg、405μg、410μg、415μg、420μg、425μg、430μg、435μg、440μg、445μg、450μg、455μg、460μg、465μg、470μg、475μg、480μg、485μg、490μg、495μg、500μg、505μg、510μg、515μg、520μg、525μg、530μg、535μg、540μg、545μg、550μg、555μg、560μg、565μg、570μg、575μg、580μg、585μg、590μg、595μg、600μg、605μg、610μg、615μg、620μg、625μg、630μg、635μg、640μg、645μg、650μg、655μg、660μg、665μg、670μg、675μg、680μg、685μg、690μg、695μg、700μg、705μg、710μg、715μg、720μg、725μg、730μg、735μg、740μg、745μg、750μg、755μg、760μg、765μg、770μg、775μg、780μg、785μg、790μg、795μg、800μg、805μg、810μg、815μg、820μg、825μg、830μg、835μg、840μg、845μg、850μg、855μg、860μg、865μg、870μg、875μg、880μg、885μg、890μg、895μg、900μg、905μg、910μg、915μg、920μg、925μg、930μg、935μg、940μg、945μg、950μg、955μg、960μg、965μg、970μg、975μg、980μg、985μg、990μg、995μg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.0mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg、4.0mg、4.1mg、4.2mg、4.3mg、4.4mg、4.5mg、4.6mg、4.7mg、4.8mg、4.9mg、5.0mg、5.1mg、5.2mg、5.3mg、5.4mg、5.5mg、5.6mg、5.7mg、5.8mg、5.9mg、6.0mg、6.1mg、6.2mg、6.3mg、6.4mg、6.5mg、6.6mg、6.7mg、6.8mg、6.9mg、7.0mg、7.1mg、7.2mg、7.3mg、7.4mg、7.5mg、7.6mg、7.7mg、7.8mg、7.9mg、8.0mg、8.1mg、8.2mg、8.3mg、8.4mg、8.5mg、8.6mg、8.7mg、8.8mg、8.9mg、9.0mg、9.1mg、9.2mg、9.3mg、9.4mg、9.5mg、9.6mg、9.7mg、9.8mg、9.9mg、10.0mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg、24mg、25mg、26mg、27mg、28mg、29mg、30mg、31mg、32mg、33mg、34mg、35mg、36mg、37mg、38mg、39mg、40mg、41mg、42mg、43mg、44mg、45mg、46mg、47mg、48mg、49mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g，或位于由这些数值中的任意两个所限定且包括的范围内。
由本文所描述的细胞内递送装置提供的预防性和/或治疗性物质的体积可在例如从约100μL到100mL变化。在有些方面，皮下注射压力装置容纳或由皮下注射压力装置提供的预防性和/或治疗性物质的体积少于、大于或等于约100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL或位于由这些数值的任意两个所限定且包括的范围内。
本发明的方面也涉及制造一种或多种上述装置的方法。通过一种方法，可提供一种或多种在本文中描述的针，所述针连接在含治疗试剂（例如，核酸（如DNA、RNA）、蛋白或化合物）的注射器上。所述针和所述注射器的连接可以是使得所述针不能从所述注射器上移除（例如，所述针和注射器被共同模铸）或所述连接可以是使得所述针与所述注射器是可拆分的。优选地，在向注射器装载治疗试剂前连接所述针和注射器。所述针和注射器可在加入治疗试剂之前或之后进行灭菌。优选地，所述针和注射器组件在加入治疗试剂前灭菌，在灭菌后不久，以无菌方式加入已灭菌的治疗试剂。使用理想的制造工艺生产包括一根或多根在本文中描述的灭菌针的一次性使用的装置，所述灭菌针被接合在含单次剂量的一种或多种灭菌的治疗试剂的一个或多个灭菌注射器上。这些一次性使用的装置可被分开无菌包装，使得使用者仅仅需要撕开包装并将治疗试剂注射入合适的组织中（例如，通过向肌肉注射的方式一次性使用的DNA接种）。
本发明的方面也涉及使用一种或多种本文所描述的装置的方法。通过一种方式，提供了向细胞内递送化合物的方法，其中容纳在本文中描述的装置中的化合物被施用到受试者上。在一些实施方案中，在本文中描述的装置（如，包括一根或多根在本文中描述的针的注射器）中设置了化合物（例如，核酸，如DNA，或蛋白）。继而通过将针插入受试者组织中，按压活塞以对注射器中的溶液施加压力，从而以所希望的压力将所述化合物压出所述针的孔的方式将该化合物递送给所述受试者。组织中增加的压力提高了细胞对化合物的摄取，从而可以进行化合物的细胞内递送。事实上，任何适于以较高注射压力将物质注入的预防性和/或治疗性物质均可被用于与本发明相结合，包括但不限于多肽、糖类、微颗粒、类固醇或低分子量的分子。例如，核酸和蛋白可同时或连续地被导入承受较高注射压力的组织中。
一些实施方案涉及从DNA表达蛋白的方法，其中提供了如在本文中描述的装置（例如，包括一根或多根在本文中描述的针和DNA的注射器），所述针被插入受试者的组织（例如，肌肉）中，所述DNA在压力下（例如，由使用活塞并将其向注射器中的DNA溶液推压的方式施加的压力）通过排出孔的方式被导入组织中，然后DNA被肌细胞所摄取。可选地，含DNA的所述装置以促进产生炎性应答的方式（例如，活化或激活与炎性应答有关的细胞）被导入或使用。可选地，所述装置的针的设计（例如，多个孔）或配置方式可产生炎性应答（例如，活化或激活与炎性应答有关的细胞）。可选地，对与炎性应答有关的蛋白表达和/或细胞活化的量进行了测量。可以使用免疫学和/或组织化学方式进行这样的测量。
因此,本发明的有些方面涉及对所希望的抗原诱导免疫应答的方法，由此，提供了如在本文中描述的装置（例如，包括一根或多根在本文中描述的针和DNA的注射器），所述针被插入受试者的组织（例如，肌肉）中，所述DNA在压力下（例如，由使用活塞并将其向注射器中的DNA溶液推压的方式施加的压力）通过排出孔的方式被导入组织中，然后DNA被肌细胞所摄取。随后，由所述DNA编码的蛋白在细胞中得以生成，免疫系统对所述蛋白产生反应。可选地，对由导入的DNA所产生的抗原的免疫应答进行测量（例如，抗体、特异性T细胞的存在情况，感染的减少或者清除，或疾病病征的减少或消失的情况）。通过使用本发明的某些实施方案，可以向骨骼肌组织中直接施用基因构建体，便于细胞对所述基因的摄取，用于随后合成所编码的产品。在本发明的一些方法中，可使用高压注射针向受试者的组织中推进含DNA或RNA分子的液体。液体以足够的速度推进，使得在组织的影响下，所述液体向组织上施加了较高的压力，增加了细胞渗透性，并导致DNA或RNA分子渗透该区域处的细胞。在一些实施方案中，可使用本文所描述的细胞内递送装置向其它器官的组织递送遗传物质，从而向所述器官的细胞中导入核酸分子。事实上，很容易地认识到，本领域所熟知的其它的基因递送机制也适合用于本发明的实施方案中，包括脂质体衍生系统、人造病毒包膜和其它的本领域所知的系统（Rossi,J.J.（1995）Br.Med.Bull.51:217-225；Boado,R.J.等人（1998）J.Pharm.Sci.87:1308-1315；Morris,M.C.等人（1997）Nucleic Acids Res.25:2730-2736，所有这些的全部内容均以引用的方式被包括在本申请中）。另外，也可使用多种辅药（例如，三唑核苷或IL-12或编码IL-12的核酸），以提高免疫原性和/或细胞渗透性。
例如，仅通过举例而非任何形式的限制，本发明的一些实施方案可以与在美国公开号2005-0277192和美国公开号2005-0124573中描述的构建体联用，这些申请的全部内容因此以引用的方式被明确结合至本文。这些参考文献描述了编码丙型肝炎病毒（HCV）的非结构性蛋白3/4A（NS3/4A）的核酸在人体中促进免疫反应的用途。例如，观察到当HCV NS3/4A基因被转染进哺乳动物细胞时，相对于真核表达载体，可观察到明显水平的NS3表达。此外，在用NS3/4A基因免疫的小鼠中发现已具有高水平的NS3特异性抗体和抗原特异性T细胞。最近，相似的构建体在临床试验上已被发现对于感染了HCV的病人可以产生强力的免疫应答。
因此，一些实施方案涉及治疗和预防HCV感染的方法，其中，向感染了HCV的病人或处于HCV感染风险下的人提供在本文中描述的一种或多种装置（含有已被显示可以在人身上产生强力的免疫应答的一种或多种HCV DNA构建体）。可选地，识别出对需要预防和/或治疗HCV感染的药物的个体，然后使用在本文中描述的高压注射针装置，向所述个体提供含已发现可在人体中产生强力的免疫应答的一种或多种HCV构建体（例如，编码NS3/4A的表达构建体）的药物。可选地，在治疗后或处于治疗阶段中，对接种过的个体检测对NS3/4A的免疫应答，病毒效价的降低，或者抗HCV抗体的生成。然而，本发明并不局限于用于DNA免疫的HCV的抗原。事实上，本发明可在希望在细胞内表达任何抗原肽的任何时间使用。例如，与特异性疾病状态有关的已知抗原肽的一些非限制性示例包括下列：
HBV：PreSl、PreS2和表面外膜蛋白，核及pol
HTV：gpl20、gp40、gpl60、p24、gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef
乳头状瘤：El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、L1、L2
HSV：gL、gH、gM、gB、gC、gK、gE、gD、ICP47、ICP36、ICP4，如同在美国专利第7,074,770号，Charo等人，标题为“DNA接种的方法（Method of DNAvaccination）”所教导的，且这篇专利的全部内容以引用的方式结合至本文。在本文中描述的一些实施方案也包括和/或施用从如下组成的组中挑选出来的一种或多种核酸：mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA（微小RNA）、siRNA、（小干扰RNA）、piRNA（Piwi-干扰RNA）、aRNA（反义RNA）、snRNA（小核RNA）、snoRNA（小核仁RNA）、gRNA（向导RNA）、shRNA（小发夹RNA）、stRNA（小时序RNA）、ta-siRNA（反作用小干扰RNA）、cpDNA（叶绿体DNA）、gDNA（基因组DNA）、msDNA（多拷贝单链DNA）、mtDNA（线粒体DNA）、GNA（乙二醇核酸）、LNA（锁核酸）、PNA（肽核酸）、TNA（苏糖核酸）、含吗啉代的核酸、含硫核酸、2-O-甲基核酸，以及含一种或多种修饰的碱基或间隔区的核酸。
参考附图，图1A描述了包含两个针梗的皮下注射针装置（也称为细胞内递送装置）的一个实施方案的侧视图，每个针梗具有5个孔，用于向针梗之间的区域递送预防性和/或治疗性试剂。参考图1A，皮下注射针装置的实施方案包括近端103，与所述近端相对的远端101，以及从远端101到近端103之间延伸的纵向轴。在一些实施方案中，细胞内递送装置可包括一根或多根针。在一些实施方案中，细胞内递送装置包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30根针。细胞内递送装置包括标准连接器100和从连接器100延伸的针体102。标准连接器100和针体102被设置在与所述纵向轴基本平行的轴上。在一些实施方案中，标准连接器100为鲁尔（luer）锁或类似的机制，被设置为将所述装置与压力递送装置（未示出），比如注射器或泵进行连接。
所述针的末梢端可以是钝形、斜面形、锥形、削尖或尖角形，使得操作者可穿透受试者（例如，人，家养动物，例如猫或狗，或家畜，如马、母牛、猪或鸡）的皮肤，以到达位于下面的所希望的靶组织。例如，端部105a、105b可包括常规的医疗尖端（例如，“手术刀尖端”）。在一些实施方案中，端部105a、105b可以是钝的。在一些实施方案中，所述针的末梢端闭合，使得端部不能够在针梗的腔部和针体的远端之间形成流体连接。在其它实施方案中，所述末梢端是开放的，使得端部在针梗和针的远端之间建立流体连接。
在一些实施方案中，所述皮下注射针装置或细胞内递送装置可被设置为是一次性处理的装置，其中预防性和/或治疗性试剂容纳在所述装置内，不需要其它的连接。针体102可包括从茎或插管115处延伸的一个或多个针递送针梗120a和120b。茎115可包括中央腔道或通道。每根针梗120a、120b也包括与茎115和标准连接器100流体连接的至少一个腔道。在图示的实施方案中，针体102包括两根针递送针梗120a、120b，每根针梗120包括末梢端105a、105b。针梗120a、120b的长度可以变化。在一些实施方案中，针梗120a、120b每个均为大约相同的长度，而在一些实施方案中，所述针梗为不同的长度。针梗120a、120b可处于从约2mm到约100mm的范围内。针梗120a和120b的规格可以在装置到装置之间或可在同一个装置中的针梗120a到针梗120b之间变化。
在一些实施方案中，由在所述装置远端的针梗120a、120b之间的空间所形成的开口的尺寸足够大，使得针梗120a、120b可以包围一个或多个细胞。
针梗120a、120b每一个均可包括沿所述针梗的长度设置的孔110a、110b。在一些实施方案中，每个针梗120a、120b包括至少一个孔110a、110b。在其它实施方案中，至少有一根针梗120a、120b不包括孔110a、110b。在一些实施方案中，孔110a、110b的每一个的大小与形状可在针梗与针梗间变化。在一些实施方案中，所述针的长度可在针梗与针梗间变化。
每个针梗120a、120b可包括0到100个孔。在一些实施方案中，所述针沿所述针的长度具有1或2个孔（例如，闭合端部的针沿所述针的长度具有至少两个孔）。在其它实施方案中，所述针有许多孔，可以准确是，少于，或多于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个。所述孔可位于靠近针梗的远端处或沿所述针梗长度的任何地方。每个针筒上的每个孔可被设置在与纵向轴基本平行的平面上。所述孔也可沿着基本上与所述装置的纵向轴平行且朝向纵向轴的线段设置。在其它实施方案中，所述孔可被设置在并非基本与所述装置的纵向轴平行的一个或多个平面上。每个孔可朝向同一个点，例如，位于一个基本上与所述纵向轴平行的轴上的点，或者每个孔可朝向不同的点或方向。
所述孔在尺寸和形状上可有所变化。例如，孔可以是圆形、圆、总体为曲线、正方形、矩形、三角形、总体为多边形、总体上为对称、总体上不对称或不规则形状。另外，每个针梗内的孔的尺寸和形状均可有所变化。例如，在一些实施方案中，针梗上的第一孔可以是总体上为曲线的，其直径约1mm，所述针梗上的第二孔可以是与所述第一孔相同的形状，直径约1.50mm。在一些实施方案中，每个孔可具有大体上相同的形状和相同的尺寸。所述孔在尺寸和形状上可有所变化。例如，孔可以是圆形、圆、总体为曲线、正方形、矩形、三角形、总体为多边形、总体上为对称、总体上不对称或不规则形状。另外，每个针梗内的孔的尺寸和形状均可有所变化。例如，在一个实施方案中，针梗上的第一孔可以是总体上为曲线的，其直径约1mm，所述针梗上的第二孔可以是与所述第一孔相同的形状，直径约1.50mm。在其它实施方案中，每个孔可具有大体上相同的形状和相同的大小。
图1B示出了含四个针梗的针集合器的一个实施方案的分解立体图，所述针梗用于向所述针梗之间的区域递送预防性和/或治疗性试剂。含螺纹的鲁尔连接器130被设置为与含预防性和/或治疗性物质的注射器（未示出）接合。集合器插入段140在集合器插入段140的末梢侧包含多根针150。针150可以是不同的构造，包括本文所描述的任何构造。套环160被设置为与含螺纹的鲁尔连接器130接合并固定集合器插入段140。垫圈170可任选地设置在集合器插入段140上，以保证从注射器到多根针150的密封通道。如上面所讨论的，所述针可任选地包括多个孔（例如，在图1A中所描述的）。
孔的尺寸、形状和数量可以进行选择，以将注射流体或遗传物质的递送效率最大化，以在所述注射腔空间内产生最佳的压力从而提高细胞膜透性，或者两者都做到。参考图2A，一种细胞内递送装置包括两个针梗220a、220b，每一个均包括三个孔210a、210b和尖角形的末梢端205a、205b。末梢端205a、205b由间隔203彼此分离开。从末梢端205a、205b在靠近的方向上移动，开口203形成了在针梗220a、220b间形成的注射腔空间204。在一些实施方案中，由位于针梗220a、220b之间的空间所形成的、位于端部205a、205b之间的开口203在尺寸上足够大，使得针梗220a、220b可以围绕注射腔空间204中的一个或多个细胞。
在一些实施方案中，为了制造用于向靶组织递送包含所希望的试剂的流体的细胞内递送装置，针220a和/或220b可以包括多个总体上为曲线的孔210a、210b，孔210a、210b的宽度或直径为从约0.01mm到约4.0mm。在一些实施方案中，孔210a、210b在它们最宽处的宽度大于、小于或等于约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm、0.75μm、0.8μm、0.85μm、0.9μm、0.95μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm、0.5mm、0.55mm、0.6mm、0.65mm、0.7mm、0.75mm、0.8mm、0.85mm、0.9mm、0.95mm、1.0mm、1.05mm、1.10mm、1.15mm、1.20mm、1.25mm、1.30mm、1.35mm、1.40mm、1.45mm、1.50mm、1.55mm、1.60mm、1.65mm、1.70mm、1.75mm、1.80mm、1.85mm、1.90mm、1.95mm、2.0mm、2.05mm、2.10mm、2.15mm、2.20mm、2.25mm、2.30mm、2.35mm、2.40mm、2.45mm、2.50mm、2.55mm、2.60mm、2.65mm、2.70mm、2.75mm、2.80mm、2.85mm、2.90mm、2.95mm、3.0mm、3.05mm、3.10mm、3.15mm、3.20mm、3.25mm、3.30mm、3.35mm、3.40mm、3.45mm、3.50mm、3.55mm、3.60mm、3.65mm、3.70mm、3.75mm、3.80mm、3.85mm、3.90mm、3.95mm,或位于由这些数值中的任意两个所限定且包括的范围内。在其它实施方案中，可以选择多个（例如，十个）总体上为曲线的孔210a、210b，孔210a、210b的直径的范围是约10nm到约2.0mm。
通过调节孔210a、210b的尺寸、形状和数量，并且结合针220a和220b所插入的压力传输介质的物理特性，所述细胞内递送装置可传递范围是约1到约5000千帕的局部压力。本文所描述的针可被设置为在大于、小于、等于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000或5000千帕或在这些数值之间的任何数值的范围内的压力下递送流体。注射腔空间204内容纳的的组织中增加的局部压力改变了所述组织内细胞的细胞膜透性特征，促进了试剂（例如，DNA）进入细胞。
针220a和220b的长度可在约0.5cm到约15cm间变化。在一些实施方案中，所述针为、约为、至少为、至少约为、不超过、不超过约0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25、11.5、11.75、12.0、12.25、12.5、12.75、13.0、13.25、13.5、13.75、14.0、15.25、14.5、14.75或15cm，或这些值间的任意值。在一些实施方案中，所述针的长度大于1cm。在一些实施方案中，所述针的长度大于15mm。在一些实施方案中，所述针的长度大于20mm。
虽然端部205a、205b被示出朝向所述装置的纵向轴斜面成角，但斜面也可以在相反的方向或不同的方向成角（参见图4），使得可以扩展组织，并通过位于针梗220a、220b之间设置的区域向设置在其间的注射腔空间204中递送至少一些靶组织。在一些实施方案中，每个端部可以包括多个斜边，例如两个、三个、四个、五个、六个或更多个斜边。这可以使得端部沿其轴总体上旋转对称，可以为每根针提供相同的插入。在一些实施方案中，端部205a和205b可包括套针尖端（trocar tip），或含四个斜边的“四棱”（“quadcar”）端部，其可被用于本文所公开的注射装置中的一根或多根针上。在一些实施方案中，针220a和220b可具有相似或不同的端部205a和205b。在一些实施方案中，在针端部的至少一个斜边与在相同的针上的一个或多个孔朝向总体上相同的方向。在一些实施方案中，针端部上没有任何斜边与在相同的针上的任何孔朝向总体上相同的方向。
试剂的递送压力可影响治疗的效果和安全性。例如，施加过多的压力可对细胞带来不希望的损伤，而施加过小的压力可能不会产生摄取所述试剂所需的足够的渗透性改变。流体动力学原理和相关方程可用于计算注射腔空间204中可接受的压力范围。例如，针梗220a、220b的几何特性和试剂的流体特性（比如，粘度和密度），会影响注射腔空间204中的局部压力。在一些实施方案中，可选择孔210a、210b的大小与形状，液体和递送的试剂，以及驱动压力以在注射腔空间204中产生所希望的局部压力。达西韦史巴赫方程，比如说，可被用于根据流动的流速、流体的粘度以及针梗腔道的直径与管长的比值来确定压降情况。当使用不同的载体媒介流体（如磷酸盐缓冲液、甘油、乙醇、去离子水、过滤水、各种油类、乳剂等等）时，由于每种流体具有各自的粘度特性，该方程（除了其它方面以外）在确定合适的孔210a、210b的尺寸时是有用的。标准计算流体动力学软件可被用于确定针梗和孔的最佳物理参数，以达到所希望的压降。然而，本发明并不局限于使用流体产生压降，还可利用其它类型的压力传输介质。例如，在一些实施方案中，空气或其它气体，例如CO2或N2，可被用于将压力传送到组织上。
图2B示出了皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案，在每根针上以相同的间距设孔五个孔。每根针230包括五个孔235，每个孔之间具有间距240，所述间距从每个孔的中心测量，或是从每个孔对应的边缘测量。在一些实施方案中，孔之间的间距对于针中的所有孔都是相同的，或者在一些实施方案中，间距240可以不同。所述间距可以为，大约、至少、至少约、不超过、不超过约0.01mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、1cm、2cm或3cm。孔235被设置为第一根针上的每个孔朝向第二根针上的相应的第二孔。这种设置使得治疗性物质在彼此面向的孔之间进行相对的流体流动或交叉喷射。在一些实施方案中，所有的孔被设置为朝向（或背向）位于不同的针的另一个孔。在一些实施方案中，至少2、4、6、8、10、16、20、30、40、50或60个所述孔被设置为朝向（或背向）位于不同的针上的另一个孔。
图2C示出了含三根针的针集合器的一个实施方案，并描述了皮下注射针集合器的尺寸。集合器245包括流体连接在集合器245远端的三根针250。每根针250均具有从集合器245的远端到针尖257的针的长度255。针的长度255可根据靶组织而不同，以递送预防性和/或治疗性物质。针尖257和针上距针尖257最远处的孔235之间的间距265可以不同。例如，间距265可以在0.1mm和5cm之间，例如约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、3cm、3.5cm、4cm或更大，或这些值中的任意两个值之间的范围。在一些实施方案中，间距265可以大于10mm。在一些实施方案中，间距265可以大于11mm。在一些实施方案中，间距265可以大于15mm。在一些实施方案中，间距265可以大于20mm。类似地，距离针尖257最近处的孔235和距离针尖257最远处的孔之间的间距270也可不同。在一些实施方案中，间距257可以在0.5mm和10cm之间，例如约为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或更大。
图2D示出了含四根交错设置的针的针集合器的一个实施方案。集合器275包括流体连接在集合器245远端的四根针280、285、287和290。针287比针290长出间距295。针280比针285、290长，但短于针287。也可使用多种其它类型的交错布置。在一些实施方案中，所述注射装置包括多根针，其中至少一根或多根针具有第一长度，一根或多根针具有比所述第一长度长的第二长度。在一些实施方案中，每根针可具有不同的长度。在一些实施方案中，间距295可以例如为，至少0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm或5mm。所述针之间长度的差距可以，例如，不超过5cm、2cm、1cm、5mm、4mm、3mm、2mm或1mm。
图3示出了含两个针梗的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的侧视图，其中每个针梗具有十个孔，用于向针梗之间的区域递送治疗性试剂。针梗320a、320b包括与中央腔道315流体连接的腔道。增压的预防性和/或治疗性试剂可通过中央腔道315被引导进入针梗320a、320b中，并且可通过孔310a、310b从针梗320a、320b中流出。每个针梗320a、320b均包括十个沿所述针梗的末梢长度处均匀分布的曲线孔。孔310a、310b被设置为将增压的试剂引导向所述装置的纵向轴，从而，位于针梗320a上的孔310a朝向针梗320b上的孔310b。在一个实施方案中，所述孔可被设置在靠近针梗320a、320b的端部处，位于距针梗的近端约1mm和约3mm之间。
图4示出了皮下注射针装置或细胞内递送装置向肌细胞中递送包括DNA的预防性和/或治疗性试剂的一个实施方案的侧视图。预防性和/或治疗性试剂430可包括如本文所描述的用于递送进入细胞450的部分中或进入多个细胞中的基因、核酸、蛋白或其它大分子。如在图4所图示的，细胞内递送装置已经被插入肌肉组织中，因此注射腔空间404围绕了一个肌细胞450的至少局部。高压源的流体（未示出）被引导进入所述装置的中央腔道415中并穿过每一个针梗420a、420b的腔道，然后通过孔410a、410b排出并进入注射腔空间404中。在每个孔410a、410b处存在的高压起因于将流体压进位于注射腔空间404中的组织中时所施加的压力。所引起的局部压力的增加改变了膜的渗透性，以提高注射成分的摄取。所引起的渗透性的变化使得药物、核酸和其它化合物进入细胞的内部。
如本文所描述的，针梗的数量可根据注射装置所打算的应用、制造所述注射装置所使用的制造工艺、所希望的局部压力的量和/或其它因素进行变化。在一些实施方案中，针梗的数量可以等于或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
图5A示出了细胞内递送装置的俯视图。针梗520a、520b、520c可设置在连接器或中央腔道外壳500的中心的周围。针梗520a、520b、520c可形成等边、等腰、不等边或直角三角形。连接器500的直径D1可以跟针梗520之间的距离L1一样进行变化。在一些实施方案中，连接器500的直径D1在约3mm到约25mm间变化，针梗之间的距离L1在约1mm到约8mm，或更大的范围内变化。L1可从针梗的中心到邻近针梗的中心测量，或从一个针梗的边缘到邻近针梗的对应的边缘测量。
图5B示出了含三个针梗的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的侧视图。针梗520a-c分别连接至三个分开的注射器501a、501b、501c。所述注射器可被设置为容纳有相似或不同量的向病人递送的治疗性试剂。在一个实施方案中，每个注射器被设置为含有1毫升的预防性和/或治疗性试剂。每个注射器501a、501b、501c包括从其中纵向延伸的针梗520a、520b、520c。每个针梗520包括多个朝向所述装置的纵向轴的孔510a、510b、510c。位于每个针梗520a、520b、520c上的孔510a、510b、510c的数量可从1到20变化。在一个实施方案中，位于针梗520上的孔510均匀分布，每个孔相距约超过0.2mm。每单位长度的针梗520的容量范围可根据孔510之间的间距进行变化。在一个实施方案中，每一毫米长度的针梗520对应75μl的预防性和/或治疗性试剂。三个注射器501可被排列成以所述装置的纵向轴为中心的等边三角形的形状，每个针梗520与另外两个针梗的每一个的距离大约相等。
针梗520之间的间距可根据孔510的数量进行变化。在一个实施方案中，每个针梗520包括十个孔510，所述针被设置为彼此距离约3.0mm。在另一个实施方案中，每个针梗520包括8个孔510，所述针被设置为彼此距离约2.2mm。在另一个示例性实施方案中，每个针梗520包括六个孔，所述针被设置为彼此距离约1.5mm。而在另一个实施方案中，每个针梗520包括孔510a-c，所述针被设置为彼此距离约1.0mm。孔510a-c可以朝向不同的方向。在一些实施方案中，孔510a-c可面向邻近的针。在一些实施方案中，孔510a-c可面向相反的针，并产生如在图5C中示出的交叉喷射模式。
图5C示出了向受试者的组织590递送治疗性试剂的图5B的皮下注射针装置或细胞内递送装置的立体图。
现在参考图6A，示出了含两个针梗的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的侧视图，其中每个针梗以相对于装置的纵向轴呈一定角度进行设置。图6A中的注射装置包括两个注射器620a、620b，每个均被设置为相对于所述装置的纵向轴呈一定角度。支架670将注射器620相对于彼此保持就位，并总体上与所述装置的纵向轴对准。
图6B示出了含两个针梗和一个连接器配件的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的立体图。针梗620a、620b流体连接至被罩在外壳或连接器600内的共同的腔道615。针梗620a、620b彼此基本平行，将通过共同的腔道615引入至所述针梗的预防性和/或治疗性试剂分配至受试者。
图6C示出了含连接器配件的皮下注射针装置或细胞内递送装置的俯视图。针梗620a、620b可以彼此相距距离L2，连接器600可具有直径或宽度D2。连接器600的直径D2可以跟针梗620之间的距离L2一样进行变化。在一个实施方案中，连接器600的直径D2在约3mm到约25mm间变化，针梗之间的距离L2在约1mm到约6mm间变化。
图7A示出了含六个针筒的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的立体图，每个针梗具有多个孔，用于向受试者的组织递送预防性和/或治疗性试剂。六个针的针筒720a-f从连接器700基本彼此平行地延伸。连接器700容纳有共同的腔道715，共同的腔道715将增压的预防性和/或治疗性试剂分配到针梗720中。
图7B为图7A的注射装置的俯视图。如图7B所示，五个针梗720形成了以连接器700的中心为中心的五角形或五边形。所述五个针梗720中的每一个与左侧和右侧的针梗720相距距离L3。第六个针梗720设置在五边形的中心，与另外五个针梗相距距离L4。连接器700也可具有最大宽度为D3的直径。在一些实施方案中，直径D3可在约3mm和约25mm之间。距离L4和L3可彼此相等或不同。在一些实施方案中，距离L4在从约1mm到约6mm的范围内，距离L3在从约1mm到约6mm的范围内。
图8A示出了含四个针梗的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的侧视图。针梗820与被罩在连接器800内的共同的腔道815流体连接。每个针梗820可以包括任意数量的内部朝向孔810a-d，比如，六或十个。在一些实施方案中，针梗820a-d可沿所述装置的纵向轴设置，可以不设有孔810a-d，或包括背离所述装置的中心或纵向轴的孔810a-d。例如，针梗820b可包括含孔的三个区，每个区包括朝向选自针820a、针820c或针820d的一根针的孔。所述区可包括孔，每个孔与其它区相比朝向不同的针820a-d。针梗820a-d可从连接器800处延伸出在约3mm和约100mm之间的长度L5。
图8B示出了包括连接器800和针梗820a-d的图8A的注射装置的俯视图。三个针梗820a、820c和820d可被设置为三角形，以所述装置的纵向轴为中心，与连接器800共享同一个中心。针梗820b位于与周围的针梗820a、820c和820d等距离的位置。这种针的排列方式可被称为“Y-形构造”。针梗820a-d可彼此相距距离L6。这一距离L6可以在约2mm和约12mm之间变化。例如，L6可以为约3mm或约6mm。连接器800的直径或最大宽度D4的尺寸在约3mm到约20mm的范围内。
一种所述细胞内递送装置可包括如图8B所描绘的四根针。在一些实施方案中，L6为6mm。在一些实施方案中，L6可以从约0.1mm到约6mm。在四根针上的孔的总量为72。中心针包括沿所述针的轴成三排分布的36个孔，每一排均朝向一根外部针。三根外部针的每一根均包括朝向中心针的单排的12个孔，以产生在针之间的交叉流动。所述孔的直径可以为0.1mm，间距为约0.2mm。在Y-形构造中，所述中心针可具有被设置为向3个方向生成流动的孔，所述流动是从针梗向每根外部针的流动。类似地，所述外部针可具有沿针梗的长度设置的的孔，使得治疗性试剂从每个针梗流向中心针。
在一些实施方案中，一种所述细胞内递送装置包括如图8B所描绘的四根针，其中L6为3mm。在四根针上的孔的总量为72。中心针包括沿所述针的轴成三排分布的36个孔，每一排均朝向一根外部针。三根外部针的每一根均包括朝向中心针的单排的12个孔，以产生在针之间的交叉流动。所述孔的直径可以为0.05mm，间距为约0.2mm。
图8C示出了图8A的细胞内递送装置的一个实施方案的俯视图。针830a-d构成了正方形或任意其它四边形，如梯形、等腰梯形、平行四边形、风筝形、斜方形或矩形的点，在针830d和针830b之间具有距离L7。这一距离L7可在约2mm和约12mm间变化，例如3mm或6mm。在一些实施方案中，L7可以为从约0.1mm到约6mm或这两者间的任意距离。
在一些实施方案中，每根针可被设置为具有第一区的孔，所述第一区的孔朝向第一邻近针。例如，针830b可以包括第一区的孔，所述第一区的孔朝向针830a。在一些实施方案中，每根针可被设置为具有第二区的孔，所述第二区的孔朝向第二邻近针。例如，针830b可以包括第一区的孔和第二区的孔，所述第一区的孔朝向针830a，所述第二区的孔朝向针830c。在一些实施方案中，每根针可被设置为具有第三区的孔，所述第三区的孔朝向第三邻近针。例如，针830b可以包括：（朝向针830a的）第一区的孔，（朝向针830c的）第二区的孔，以及（朝向针830d的）第三区的孔。在一些实施方案中，每根针被设置为具有相同数量的区。在一些实施方案中，每个区包括相同数量的孔。在一些实施方案中，每根针可包括三个区的任一个或其组合。针830可以任选地设置为形成菱形，例如平行四边形或斜方形。根据孔区的具体组成，这种针的排列方式可被称为“O形或X形样式”。在O形样式中，针830a-d上的区被设置为仅朝向邻近的针，形成类似于“O”的喷射模式。在X-形样式中，针830a-d上的区被设置为朝向邻近和对面的针，形成的喷射模式部分类似于“X”。
在一些实施方案中，所述注射装置包括如图8C所描绘的针，其中L7为3mm，每根针包括沿所述针的轴成三排分布的18个孔（18的4倍为总共72个孔）。每一排朝向三根其它针中的一根，以生成在针之间的交叉流动，并在与四根针等距的中心附近聚合流动。所述孔的直径可以为0.05mm，间距为约0.2mm。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包括如图8C所描绘的针，其中L7为3mm，每根针包括沿所述针的轴成二排分布的24个孔（24的4倍为总共96个孔）。每一排朝向邻近的针，以生成在针之间的交叉流动。所述孔的直径可以为0.1mm，间距为约0.2mm。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包含如图8C所描绘的针，其中L7为6mm，每根针包括沿所述针的轴成三排分布的36个孔（36的4倍为总共144个孔）。每一排朝向三根其它针中的一根，以生成在针之间的交叉流动，并在与四根针等距的中心附近聚合流动。所述孔的直径可以为0.1mm，间距为约0.2mm。
在一些实施方案中，所述细胞内递送装置包含如图8C所描绘的针，其中L7为6mm，每根针包括沿所述针的轴成二排分布的18个孔（18的4倍为总共72个孔）。每一排朝向邻近的针，以生成在针之间的交叉流动。所述孔的直径可以为0.05mm，间距为约0.2mm。
图9-15示出了注射装置的多种其它实施方案的俯视图。这些注射装置中的每一个都包括多个针梗，并且可包括设置在针梗上的孔。所述孔可被设置为向受试者递送增压的预防性和/或治疗性试剂和/或向受试者施加负压。
图9示出了含四个针梗的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的俯视图。每个针梗920a-d包括至少一个向内或中心朝向的孔910，孔910被设置为将增压的预防性和/或治疗性物质递送进注射空间904中。
图10A示出了含七个针梗的皮下注射针装置或细胞内递送装置的一个实施方案的俯视图。六个针梗1020形成六边形，第七个针梗设置在靠近该六边形的中心处。
图10B示出了含七个针梗的皮下注射针集合器的立体图。针梗1020a-g被设置为至少部分位于集合器1045内。参考图10A和10B，六个针梗1020a-c和1020e-g被排列在第七个中心针梗1020d周围。孔1010可被排列在区中，使得所述孔指向邻近的针梗和中心针梗。例如，如通过图10A中的箭头所描绘的，在一个针梗1020a上，在第一区中的孔朝向第一邻近针梗1020g，在第二区中的孔朝向第二邻近针梗1020b，在第三区中的孔朝向中心针梗1020d。在一些实施方案中，距离D10可以为从约0.5mm到约12mm的任意距离或这两者间的任意距离。在一些实施方案中，D10可以为约3mm。在一些实施方案中，D10可以为约6mm。
图11示出了含有十个针梗1120a-j的细胞内递送装置的一个实施方案，每个针梗包括至少一个向内的或中心朝向的孔1110a-j，孔1110a-j被设置为向注射空间1104递送增压的预防性和/或治疗性物质。
图12-14示出了细胞内递送装置的实施方案，其中增压的治疗性试剂对于注射腔空间被不对称地进行递送。这在某些情况下，例如，在仅仅向组织的一部分或某一区域，而非是所有部位递送更加聚集的正压时可能是比较理想的。
图12示出了含有三个针梗1220a-c的细胞内递送装置的一个实施方案，其中三个针梗中的两个包括至少一个向内的或中心朝向的孔1210b-c，孔1210b-c被设置为向注射空间1204递送增压的预防性和/或治疗性物质。第三个针梗1220a并不包括用于向注射空间1204递送增压流体的任何孔。
在一些实施方案中，皮下注射针装置或细胞内递送装置被设置为通过一个或多个孔向注射腔空间施加负压。负压或反压力可被用于向细胞膜递送最佳量的压力。在这些实施方案中，负压由指向一个或多个针梗的箭头所表示。负压可通过将某些孔和与其它孔不同的腔道连接而进行施加。
图13示出了含有三个针梗1320a-c的细胞内递送装置的一个实施方案，其中三个针梗中的两个1320b-c包括至少一个向内的或中心朝向的孔1310b、1310c，孔1310b、1310c被设置为向注射空间1304递送增压的预防性和/或治疗性物质。第三个针梗1320a包括至少两个向内或中心朝向的孔1310a，孔1310a被设置为向注射空间1304施加负压。
图14示出了含有四个针梗1420a-d的细胞内递送装置的一个实施方案，其中四个针梗的两个1420c-d包括至少一个向内的或中心朝向的孔1410c-d，孔1410c-d被设置为向注射空间1404递送增压的预防性和/或治疗性物质。第三和第四个针梗1420a-b并不包括用于向注射空间1404递送增压流体的任何孔。
图15示出了含有四个针梗1520a-d的细胞内递送装置的一个实施方案，其中四个针梗中的两个1520b、1520d包括至少一个向内的或中心朝向的孔1510b、1510d，孔1510b、1510d被设置为向注射空间1504递送增压的预防性和/或治疗性物质。第三和第四个针梗1520a、1520c包括用于向注射空间1504施加负压的孔1510a、1510c。
如本文所描述的，每个针梗的形状可以不同。图16-18示出了包括向内或中心朝向的孔的环形针梗的实施方案。图16示出了环形的针梗1620，包括三个向内或中心朝向的孔1610。三个孔1610中的两个被设置为向注射空间1604递送增压的预防性和/或治疗性物质，第三个孔1610被设置为向注射空间施加负压。孔1610可形成三角形，例如，等边三角形。图17示出了环形的针梗1720，包括两个彼此面对的向内或中心朝向的孔1710。两个孔1710中的一个被设置为向注射空间1704递送增压的预防性和/或治疗性物质，另一个孔1710被设置为向注射空间施加负压。图18示出了环形的针梗1820，包括两个彼此面对的向内或中心朝向的孔1810。这两个孔1810均被设置为向注射空间1804递送增压的预防性和/或治疗性物质。孔1810可以包括任何合适的形状，例如，总体上为多边形。
在一些实施方案中，针梗可以包括与一个与多个孔流体连接的一个腔道或多于一个腔道。图19为含单个腔道的一个针梗的一个实施方案的剖视图。针梗1920包括单个腔道1935和三个孔1910，每个孔1910均与单个腔道1935流体连接。腔道1935被用于传输压力和递送预防性和/或治疗性试剂。
图20示出了含两个腔道的一个针梗的一个实施方案的剖视图。针梗2020包括与两个孔2010流体连接的第一腔道2035。针梗2020也包括与第三孔2012流体连接的第二腔道2037。例如，如果希望使用第一腔道用于递送增压的预防性和/或治疗性试剂并使用第二腔道用于递送另一种流体、预防性和/或治疗性试剂、或施加负压（或反之亦然），可以使用本实施方案。
在一些实施方案中，与可调节的细胞内递送装置配套使用的可调节的递送单元包括：设置为用于接收皮下注射针的通道；将注射器和针集合器封装进所述通道内的手柄，使得针梗的封闭端从所述通道延伸并可与生物样品接合；被设置为通过手柄的操作而进行加料的加料元件，所述加料元件与触发器和注射器连结，使得触发器的运行释放所述加料元件，其中所述加料元件作用于所述注射器上，从而将预防性和/或治疗性物质置换出所述注射器。在一些实施方案中，可调节的递送单元包括弹簧，所述弹簧被设置为受手柄的运行而压缩及被设置为在触发器运行时减压。
图21A是弹簧驱动装置的一个实施方案，可与本文所描述的针装置配套使用。弹簧驱动装置2100包括位于一侧的上样环形柄2110和位于相对侧的深度调节件2120。深度调节件2120可以旋转接合弹簧驱动装置2100，并且可被设置为在向受试者施用时调节针穿透组织的深度。可以按压触发器按钮2130以触发该装置，从而压缩针的活塞并注射预防性和/或治疗性物质。
图21B示出了正在被插入弹簧驱动装置2100中的细胞内递送装置2140。上样环形柄2110被抽出，以便所述针可插入至弹簧驱动装置2100的腔中。图21C示出了安装在弹簧驱动装置2100内部的细胞内递送装置2140。图21D示出了弹簧驱动装置2100的侧视图，其中弹簧2150沿弹簧驱动装置2120的腔道（沿细胞内递送装置2140的长度延伸）设置。弹簧2150被设置为在上样环形柄2110被抽出时伸展，在按压触发器按钮2130后压缩注射器2140的活塞。
图22A为与本申请的注射针装置配套使用的弹簧驱动递送装置的一个实施方案的立体图。弹簧驱动触发器装置2200包括被设置为用于接收注射器的活塞部分的活塞孔2210，以及被设置为接收注射器的针筒部分的针筒孔2220。触发器2230被设置为压挤触发器2230可推下注射器的活塞。图22A描绘了正在被插入至触发器装置2200中的针装置2240。针装置2240可以是如本文所描述的任何针装置或针集合器。
图22B为触发器装置2200的侧视图，其中触发器2230与活塞孔2210连结（例如，由拉杆或齿轮进行连接），使得压挤触发器2230可压缩针装置的活塞并注射预防性和/或治疗性物质。
图23A示出了针集合器的一个实施方案。底部集合器组件2300被设置为接收多根针，每根针具有针梗2310和设置在所述针的一端的集合器接合件2320。底部集合器组件2300包括接收针梗2310和接合集合器接合件2320以将所述针维持在所述集合器内部的孔2330。图23B示出了被插入至孔2330后的针。孔2330的深度可以变化，以便所述针可以彼此之间相互交错（例如，在图2D中所描述的）。图23C示出了具有孔接合件2350的顶端集合器组件2340，孔接合件2350被设置为当顶端集合器组件2340被设置在底部集合器组件2300上时与孔2330进行接合。孔接合件2350可以将集合器接合件2320固定在集合器内。底部集合器组件2300和顶端集合器组件2340可通过例如将这两个组件焊接在一起而固定在一起。
图24为与细胞内递送装置配套使用的可调节的递送装置或可调节的递送单元的一个实施方案的立体图。可调节的递送单元（ADU）2400包括连结至弹簧触发器2420的弹簧活塞2410。弹簧活塞2410被设置为当启动（例如通过压下）弹簧触发器2420时而压下注射器2430中的活塞。注射器2430由球轴承2440和套环2450固定在ADU2400的腔道2435中。注射器2430连结至包括用于注射预防性和/或治疗性物质的一根或多根针的集合器2460。集合器2460可以具有本文所公开的任何设计。ADU2400可任选地包括穿过ADU2400的壳体和弹簧触发器2420的槽2470。槽2470可被设置为接收在递送预防性和/或治疗性物质之前压缩弹簧活塞2410的启动件。ADU2400也可任选地包括螺纹调节器2480，螺纹调节器2480旋转连结至弹簧活塞2410并被设置为当启动弹簧触发器2420时调节施加到注射器上的力（或压力）。
图25示出了含启动夹具（priming jig）的可调节的递送单元的一个实施方案的剖面图。ADU2400可被设置为用启动件操作，所述启动件连结至调节助件2510和启动夹具2520。ADU2400可被安装在调节助件2510中并与启动夹具2520接合，从而升起弹簧触发器2420并使得可以接触到腔道2435。注射器2430被插入腔道2435中，将注射器2430紧固以将注射器固定在ADU2400的腔道内。现在，准备好的ADU2400便可从调节助件2510上拿下来用在受试者中。为了分配预防性和/或治疗性物质，推下弹簧触发器2420，释放弹簧2530，从而操作弹簧活塞2410，进而操作注射器的活塞2435。
在一些实施方案中，所述触发器装置和弹簧可被设置为执行使用本文所公开的针装置递送预防性和/或治疗性物质的任何方法。例如，所述触发器装置可被设置为在一定时期内（例如，大约1秒或更少）递送预防性和/或治疗性物质，向所述预防性和/或治疗性物质施加最大的力或压力（例如，约50-150N或约50到5000kPa），或以最大速度（例如，至少约2.5mL/s）递送治疗性物质。
图26示出了含切口形孔和封闭端的细胞内递送装置的一个实施方案。四个针梗2620排列成Y-形样式。四个针梗2620部分设置在集合器2645内，所述集合器2645包含一根中心针和三根外部针，所述三根外部针被设置为距中心针等距并彼此等距。孔2610可包括至少一个延长的切口，所述延长的切口具有沿针梗的轴的第一尺寸和与所述针梗的轴垂直的第二尺寸。
孔2610的第一尺寸可以为例如大于、等于或小于约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm、0.75μm、0.8μm、0.85μm、0.9μm、0.95μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.05mm、1.10mm、1.15mm、1.20mm、1.25mm、1.30mm、1.35mm、1.40mm、1.45mm、1.50mm、1.55m、1.60mm、1.65mm、1.70mm、1.75mm、1.80mm、1.85mm、1.90mm、1.95mm或2.0mm，或位于由这些数值中的任意两个所限定且包括的范围内。
孔2610的第二尺寸可以为例如大于、等于或小于约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm、0.65μm、0.7μm、0.75μm、0.8μm、0.85μm、0.9μm、0.95μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.05mm、1.10mm、1.15mm、1.20mm、1.25mm、1.30mm、1.35mm、1.40mm、1.45mm、1.50mm、1.55m、1.60mm、1.65mm、1.70mm、1.75mm、1.80mm、1.85mm、1.90mm、1.95mm、2.0mm、2.05mm、2.10mm、2.15mm、2.20mm、2.25mm、2.30mm、2.35mm、2.40mm、2.45mm、2.50mm、2.55mm、2.60mm、2.65mm、2.70mm、2.75mm、2.80mm、2.85mm、2.90mm、2.95mm、3.0mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm或4.0mm，或位于由这些数值中的任意两个所限定且包括的范围内。
在一些实施方案中，所述至少一个切口的第一尺寸为约2.15mm，第二尺寸为约0.05mm。所述延长的切口可以具有如本文所描述的任何孔尺寸，条件是第一尺寸大于第二尺寸。位于外部针2620上的孔2610可被设置为朝向中心针，位于所述中心针上的孔可被设置为分别朝向每一根外部针。
图27A-C示出了具有部分地设置在微集合器内的多根针的细胞内递送装置的一个实施方案。这种装置的集合器为微集合器，因为其尺寸比本文其它处所描述注射装置小。
参考图27A，描绘了微集合器注射装置2700的分解立体图。参考图27B，描绘了微集合器注射装置的侧部剖面图。微集合器注射装置2700包括设置在微集合器2745内的多个针梗2720，使得针梗包含孔的部分并不位于微集合器内。针梗2720包括如在本文其它处描述的多个孔2710。所述孔沿针梗的长度设置，并设置在针梗2720不位于微集合器2745内的部分上。微集合器2745可以总体上为圆柱形。
所述微集合器细胞内递送装置还包括鲁尔连接器（luer connector）2730。鲁尔连接器2730被设置为在第一端2731与注射器上的鲁尔配件（luer fitting）配合并在第二端2732与微集合器2745配合。鲁尔连接器形成了经过鲁尔连接器2730的中心的导管2735。导管2735为流体流经鲁尔连接器2735提供了流动途径。鲁尔连接器2730的第一端2731可通过使用螺纹连接、摩擦配合（friction fit）会其它合适的附接方法与注射器上的鲁尔配件相配合。与微集合器2745配合的鲁尔连接器2730的第二端2732内部中空，其直径尺寸适于接收集合器2745的第一圆柱直径。
微集合器2745具有第一圆柱直径2746，其尺寸可以提供与鲁尔连接器2730的表面直接接触的表面。微集合器2745具有第二圆柱直径2747，其尺寸与鲁尔连接器2730的第二端2732内的部分配合。设置在鲁尔连接器2730的第二端2732内、相当于微集合器2745的部分的微集合器2745的第二圆柱直径2747的尺寸是使得当持针器2745被完全接合在鲁尔连接器2730内时形成缺口L92。在一些实施方案中，L92可以为大约0.5mm。缺口的尺寸为在微集合器2745的一端和鲁尔连接器2730的第二端2732之间形成腔室2740，使得流经鲁尔连接器2730的流体进入每个针梗2720的开口端2715。腔室2740提供了在每个针梗2720的开口端2715与腔室2735之间的流体连接，使得来自附接的注射器的流体可以最终流经所有针梗2720上的所有孔2710。
图27C示出了含套针尖端针的微集合器细胞内递送装置的视图。套针尖端针具有三个斜面，所述三个斜面由相对于针梗的长轴成一定角度相交的平面所限定并形成一个点。参考图27C，L92A在一些实施方案中可以为从约0.01mm到约3mm。在一些实施方案中，L92A为约1mm。在一些实施方案中，L92B可以从约0.01mm到约4mm。在一些实施方案中，L92B为约1mm。在一些实施方案中，L92C可以为从约1mm到约6mm。在一些实施方案中，L92C为约4mm。针梗2720可以例如每个针梗具有6个孔2710，每个孔的直径约为0.5mm，间隔约0.2mm。在一些实施方案中，孔的直径为0.05mm。
图28A-B示出了与含连接至注射器的微集合器的细胞内递送装置一起使用的可调节的递送单元的立体图。参考图28A和28B，所述可调节的递送单元包括设置为容纳注射器和微集合器细胞内递送装置的空腔2850，锁定手柄2860，以及按钮2870。所述注射器和微集合器注射装置被设置在空腔2850内部，使得针梗从可调节的递送装置的第一端伸出。一旦被放置在空腔内，则降下锁定手柄2850。降下手柄2860则使可调节的递送装置内部的加料元件准备就绪，所述加料元件与设置在靠近可调节的递送装置的第二端的按钮2870连结。所述加料元件可以为弹簧，其由降下手柄2860的作用压缩。一旦手柄完全降下，则注射器和微集合器装置位于空腔2850内，加料元件准备就绪，可调节的递送装置便可如所希望的插入受试者或组织中。用户可按压按钮2870以释放加料元件，引起注射器的活塞运行。注射器的活塞运行将流体或治疗性试剂排出注射器，通过鲁尔连接器、通过针梗而排出孔，最终进入如本文其它处所描述的组织或受试者中。
本文所描述的针梗和细胞内递送装置的实施方案可与其它已知方法和系统联用以提高基因递送。因此，本发明的一些实施方案利用控制电路生成电流或电磁场以改变细胞渗透性。在一些实施方案中，利用一个或多个针梗本身向组织中引导或传送生成的电流或电场可能是希望的。所述针梗可以与任意数量的已知可选的微操作方法联用，所述微操作方法可以使用声能、电磁能、机械能和热能或化学增强剂中的一种或多种，例如在Eppstein的美国专利第6,527,716号中所公布的，该专利以其全部内容被包含在本文中。
本发明的方面还涉及上述装置作为细胞内递送装置的用途或其与电穿孔联用的用途。电穿孔是一种已知的治疗性方法，其使用电极在组织或样品中生成电场，增加细胞外膜的渗透性，从而允许细胞更多地摄取治疗性试剂。（参见美国专利第6,241,701号、美国专利第6,516,223号、美国专利第6,678,556号、美国专利第6,610,044号及美国专利第6,110,161号，所有这些专利的全部内容以引用的方式明确结合至本文。）
在本申请的教导下，本领域技术人员能够很容易地配置本申请的细胞内递送装置和可调节的递送单元以包括用于电穿孔的电极。在一些实施方案中，本文所描述的细胞内递送装置的针可包括被设置为向组织或样品施加电场的电极（也称为针电极或结合的针和电极）。所述针可被设置成电极，用于电穿孔。在一些实施方案中，上述装置的针可被插进样品或组织中。被设置为电极的针可在组织或样品中生成电场，以使得针附近的细胞的细胞膜透性化。然后治疗性试剂便可通过本文所描述的细胞内递送装置进行递送，而细胞的摄取可以被改善。在一些实施方案中，上述装置的针可被插入样品或组织中并递送如本文所描述的治疗性试剂。被设置为电极的针也可被用于在样品或组织中生成电场，使得针附近的细胞的细胞膜透性化。当细胞膜透性化后，细胞对治疗性试剂的摄取便能够得到改善。
在一些实施方案中，通过使用不同的递送单元，注射速度和压力可能会不同。所述递送单元可以具有由弹簧、气体弹簧、机电结构、压缩空气或其它类似装置驱动的压力生成元件。通过改变驱动压力生成元件的力，注射速度和/或注射压力可能会改变。在一些实施方案中，所述细胞内递送仪被设置为向由针阵列限定的区域快递地递送试剂。快速注射预防性和/或治疗性试剂，同时增加细胞内的压力，使得组织局部过载，从而增加了细胞膜的渗透性。通过改变注射压力和/或速度，局部组织的过载可以改变，使得预防性和/或治疗性试剂的摄取发生改变。
图29A-C示出了用于电穿孔的细胞内递送装置的一根或多根针的电连接。参考图29A，针2920a-d由导电材料制成，每一个均通过电连接件2925a-d独立地电连接至电压电源、电源或其它能量源（未示出）。在一些实施方案中，所述电压电源可以是电池供电的。所述电压电源可被设置为向单根针施加不同极性的信号以获得所希望的电场。在一些实施方案中，可以对针2920a、2920b和2920c施加正电压，可以向针2920d施加负电压。在一些实施方案中，可以对针2920a、2920b和2920c施加负电压，可以向针2920d施加正电压。在一些实施方案中，可以向针2920a-d施加恒定电压。在一些实施方案中，所述电压可以是脉冲或变化的。在一些实施方案中，可以向每根针2920a-d施加相同电压。在一些实施方案中，可以向针2920a-d施加不同电压或电压模式。本领域技术人员可以理解，针2920a-d可以具有极性或电压的任意组合。
参考图29B，针2930a-d由导电材料制成，每一根均通过电连接件2935a-d独立地电连接至电压源（未示出）。在一些实施方案中，可以向针2930a和2930b施加正电压，并向针2930c和2930d施加负电压。在一些实施方案中，可以向针2930a和2930c施加正电压，并向针2930b和2930d施加负电压。
参考图29C，针2940a-f由导电材料制成，每一根均通过电连接件2945a-f独立地电连接至电压源（未示出）。所述电压源可被设置为对每根针施加不同极性的信号。在一些实施方案中，可以向针2940a-e施加正电荷，并向针2940f施加负电压。在一些实施方案中，可以向针2940a-e施加负电荷，并向针2940f施加正电压。在一些实施方案中，可以向针2940a、2940c和2940f施加正电荷，并向针2940b、2940d和2940e施加负电压。虽然公开了电压极性样式的具体实施方案，本领域技术人员会明白，在本申请中施加到针上的电压的极性可以不同，并且没有限制，任何组合的极性都可以各种形式施加到单根针上。
图30A-F示出了一种微集合器注射装置的针和电极设置的实施方案。微集合器注射装置3001可包括针3010、电极3020和/或组合的针电极3030。组合的针电极3030和/或单独的针3010可被用于递送在本文其它处描述的预防性或治疗性试剂。通过从针电极3030伸出的箭头描述了预防性或治疗性试剂从微集合器注射装置的针流出的方向。组合的针电极3030和/或单独的电极3020可被用于产生一个或多个电场3040。多根针3010、电极3020和/或组合的针电极3030可被设置为产生所希望的递送类型和所希望的场模式的电极场。递送类型可包括但不局限于“星”形、“X”形和“Y”形。场模式可包括但不局限于平行的场模式、“O”场模式和“Δ”场模式。场模式可以是整流的。参考图30A，组合的针电极3030被设置为“星”形递送和场模式。参考图30B，组合的针电极3030被设置为“Y”形递送和场模式。参考图30C，单独的针3010被设置为“Y”形递送，单独的电极3020被设置为平行的场模式。参考图30D，组合的针电极3030和中心针3010被设置为“星”形递送和整流的“O”场模式。参考图30E，单独的针3010被设置为“Y”形递送，整流电极3020被设置为“Δ”场模式。参考图30F，组合的针电极3030和单独的针3010被设置为“Y”形递送，单独的电极3020被设置为平行的场模式。在图30A-F中示出的针3010的极性仅用于说明目的。极性可以翻转或整流。针极性配对和场模式可能与所示出的不同。例如，所述针极性配对和场模式可进行改变以增加电穿孔。图30A-F还描述了从针和/或针上的孔流出预防性和/或治疗性物质的方向。所述方向由从每根针和/或针电极伸出的箭头所表示。例如，图30A和B描述了两种类型的针的阵列，所述针的阵列包括一根位于中心的针和围绕中心针分别设置成六角形或三角形的外部针。所述针的阵列围住一个作用区或区域，预防性和/或治疗性物质被引导流入该作用区或区域。如所描绘的，所述中心针/针电极具有沿针梗设置的孔，所述孔引导预防性和/或治疗性物质流向每根外部针。所述外部针具有沿针梗设置的孔，所述孔将物流引导向中心针。在一些实施方案（例如在后面描绘的图33D）中，所述外部针还可具有沿针梗设置的孔，所述孔将预防性和/或治疗性试剂流引导向邻近的针，或引导向一根外部针，以及将物流引导向中心针的孔。在一些实施方案中，外部针不具有将物流引导出由针阵列内的区域所限定的作用区的孔。
图31A-31B示出了具有针集合器结构的细胞内递送装置的远端的实施方案。图31A示出了非袋状集合器，而图31B示出了袋状集合器，具有在电极3110之间的间距、套管层3120和电极的隔离区3130。套管层3120可以是绝缘的，以防止将病人电穿孔。非袋状集合器在针3010/电极3020的远端具有可接受的场损耗。电极的隔离的区3130能够形成局部场。袋状集合器增加了针3010和/或电极3020的远端之间的间距，生成在针3010和/或电极3020的远端处可接受的系统损耗。在一些实施方案中，所述袋状集合器降低了针3010的远端处的电损耗。
图32A-B示出了含层压针3010的细胞内递送装置的实施方案。层压针3010可被用于聚集电荷及将损耗降至最低。例如，流经集合器内的药物的电流流动可以被减至最小，以将电能损耗降至最低。层压针3010可包括设置在两个绝缘层3210之间的导电涂层3250。在一些实施方案中，导电涂层3250可作为电极，而针和药物并不会与电信号直接接合。在其它实施方案中，层压针3010可作为电极，针的内部可包覆有非导电涂层3215。非导电涂层3215防止了预防性和/或治疗性试剂在针梗中时与电极直接电接触。这种布置可防止预防性或治疗性物质由于针梗内的电场而分解或降解。层压针3010可以是本文所描述的任何针。例如，如图所示，针3010具有沿每个针梗的长度的孔，所述孔的方向为将治疗性物质引导流向邻近或相对的针的针梗的孔。
图33A示出了具有双注射器的细胞内递送装置的一个实施方案。双注射器3380可包括两个或更多个注射器。双注射器3380可被用于控制针电极极性。双注射器3380的双药物腔室可防止电流流经集合器内的药物。所述集合器可包括与针电极3330的电连接3310。所述集合器可包括不与含预防性和/或治疗性物质的储存器连接、而仅作为电极使用的一个或多个电极。
图33B-D示出了含双注射器的细胞内递送装置的递送和场模式的实施方案。双注射器的每个注射器3380可与一个或多个针电极3330连接。针电极3330的数量并没有具体限定，可选择所希望的数量以完成所希望的结构或注射模式和电穿孔模式。如本文所讨论的，组合针电极3330可被设置为生成任何所希望的递送类型和/或场模式。图33B示出了六角形的递送和场模式，箭头指示了预防性和/或治疗性物质从位于针电极3330的针梗上的孔流出的方向。图33C示出了“列（Row）”形递送和场模式。图33D示出了“O与Y”形递送和“O与Y”场模式，其中箭头指示了预防性和/或治疗性物质从位于针电极3330的针梗上的孔流出的方向。在“列”形递送和场模式中，六根针为针电极，成对设置，其中每对中的一根具有正极性，每对中的另一根具有负极性。所述对可如在图33C所示的彼此排成列，或它们可以如在图33D所示的设置成另一种样式的对。在一些实施方案中，可以有排列的一、二、三、四或五对或更多对的针电极以形成电穿孔。在一些实施方案中，所述电场可以被整流，或单个针电极或针电极对的极性可根据施加的电信号而具有交互的极性。
图34A示出了具有隔离阀的细胞内递送装置的一个实施方案。集合器3405可包括隔离阀3410。隔离阀3410可帮助消除针电极的远端的损耗。例如，所述隔离阀能够帮助防止电流流经集合器内的药物。一根或多根针电极3010可包括隔离阀3410。隔离阀可以为非导电机械止回阀的形式。隔离阀可包括但不局限于膜、球阀或其它。皮下注射针装置可包括与针电极3430的电连接。所述与针电极3430的电连接可被设置为提供所希望的极性或模式。
图34B-C示出了具有隔离阀的细胞内递送装置的针和电极结构的例子。隔离阀允许任何结构的组合的针电极3430，例如本文中所描述的那些。图34B示出了“星”形模式的整流场，其中单根针沿顺时针或逆时针方向成对整流，导致了在由受试者组织内的针的阵列所限定的区域中形成整流和变化的电场。
图35A示出了处于两阶段递送法的第一阶段的细胞内递送装置的实施方案。在一些实施方案中，本文所描述的方法可包括含第一阶段和第二阶段的两阶段递送。针可以与电极分开，并可以为本文所描述的任意类型。在第一阶段，将可伸缩的针3510插入受试者中。预防性和/或治疗性物质被充分地递送至电极3520的作用区3525内。
图35B示出了处于两阶段递送法的第一阶段的针和电极结构的实施方案。如本文所讨论的，针3530和电极3520可被设置为生成任何所希望的递送类型和/或场模式。例如，在所示出的结构中，针3530被设置为“Y”递送，电极3520被设置为提供平行的电场。
图35C示出了处于两阶段递送法的第二阶段的细胞内递送装置的一个实施方案。在第二阶段期间，可伸缩的针3530在治疗性和/或预防性物质的递送之后而被除去或缩回，电极3520被通电。通电的电极3520在电穿孔期间生成电场。可伸缩的针3530可包括金属部件。应该明白，在电穿孔期间，缩回针3530使得针3530的金属部件从电场处除去。
图35D示出了处于两阶段递送法的第二阶段的图35B的针和电极结构的实施方案。
图36示出了被设置为与细胞内递送装置配套使用的可重复使用的递送装置的立体图，所述细胞内递送装置包括与注射器连接的微集合器和用于电穿孔的电连接。可重复使用的递送装置3600包括启动杆3610、供电电缆3620、注射器接收部分3630和电端口3640。可重复使用的递送装置3600被设置为接收注射器3680。注射器3680包括集合器3685和电连接件3690。注射器3680被插进注射器接收部分3630中，使得电连接件3690与电端口3640匹配，从而形成了从电源供应装置（未示出）通过供电电缆3620至集合器3685中的针电极的传导路径。启动杆3610被设置为操作以将注射器3680保持在注射器接收部分3630内，以及启动可重复使用的递送装置内的压缩弹簧，所述压缩弹簧在驱动后准备就绪以在需要进行递送时操作注射器3680。
图37描绘了可重复使用的递送装置3600，所述可重复使用的递送装置3600含在驱动启动杆3610后设置在其内的注射器3680。如所描绘的，在操作触发装置3750时，启动杆3610驱动了压缩弹簧3730进行释放。在运行触发装置3750后，压缩弹簧3730展开，直接或间接地通过一个或多个组件操作注射器3680，迫使治疗性和/或预防性物质流出注射器3680，经过设置在集合器3685内的针3695而流入受试者体内。针3695可以是本文其它处描述的电极针或针。可重复使用的递送装置3600通过供电电缆3620电连接至电源。可重复使用的递送装置3600也可连接至由操作员控制的电信号发生器（未示出），以通过设置在集合器3685内的电极或针电极将所希望的电穿孔样式或信号递送至受试者中。本领域技术人员应该明白，所述触发装置可通过电或机电机械（例如，螺线管、马达、形状记忆合金肌丝和其它类似的机械）进行操作和/或释放。
图38A-C示出了含设置用于电穿孔的微集合器的细胞内递送装置的实施方案。细胞内递送装置3800包括微集合器3810和注射器附件部分3820。微集合器3810包括针3830。在一些实施方案中，针3830可以包括任意组合的电极针或非电极针。电极和针电极与电导管3840电接触。如在图38B中所描绘的，两根针3830与连接件3845电连接，而连接件3845与电导管3840电连接。在一些实施方案中，一根或多根针3830可以与一个或多个电连接件3845电连接，并且被设置为任何模式或形状以提供所需要的电场。针3830可以类似于本文其它处描述的任何针，例如，具有沿针梗设置的孔的针，其中所述孔被划分以生成特殊的喷射模式，或其它任何合适的设计。例如，如在本文其它处描述的，在带电荷时一根或多根针3830可以具有正极性，或在带电荷时一根或多根针3830可以具有负极性。
图38C示出了包括针3830和电极3835的微集合器3810。如在本文其它处描述的，本领域技术人员会明白，为了在受试者或组织中提供各种电场，针3830和电极3835可以以各种样式进行电连接。
图39A-C示出了含设置用于电穿孔的微集合器的、具有Y形结构的细胞内递送装置的实施方案。如所描绘的，针3930排列成Y形样式，沿针梗具有孔，以提供如本文其它处描述的Y形喷射模式。针3930均与电连接件3945电连接，从而与电导管3940电连接。微集合器3910和注射器连接部分3920可被设置为形成袋状设计或非袋状设计。图38C描绘了袋状设计，图39C描绘了非袋状设计。
在一些实施方案中，根据施加到针电极的电压，施加到受试者的电场可能会有不同。随着细胞类型的不同，对细胞进行电穿孔所需要的电场强度也会有所不同。穿过细胞所需要的电压与细胞的半径成反比。例如，肌细胞需要较低的电压，而肝细胞需要较高的电压。因此，由本文描述的皮下注射针装置生成的电场可根据靶细胞类型而有所变化。由本文描述的皮下注射针装置产生的电场强度可在几V/cm、100V/cm、200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、800V/cm、900V/cm、1000V/cm、1500V/cm、2000V/cm或更大值，或所列出的值之间的任意值中变化。如果电场强度过高，例如，3000V/cm，有可能导致细胞死亡。
本文描述的注射系统可被称为体内细胞内注射（IVIN），以实现DNA的高度局部注射和摄取。在注射期间，治疗性和/或预防性试剂将过载受试者或组织中的针之间的体积，从而增加所述预防性和/或治疗性试剂进入细胞的局部压力。因此，与用标准皮下注射针注射相比，如本文所描述的IVIN实现了治疗性和/或预防性试剂（例如DNA）的高度局部的沉积，以及改善的靶细胞的局部摄取。如已经描述的，电穿孔（EP）装置可以与该技术结合。例如，IVIN可被用于对肌细胞局部过载用体内EP处理的DNA。如果不进行EP，标准的肌肉内IVIN将会大大改善DNA摄取和表达的效率。
IVIN技术可以向肌肉组织过载含DNA的溶液，使得细胞变得可渗透并且DNA被摄取。采用IVIN技术，利用沿围绕组织的圆设置的针并向组织注射DNA，可以在肌肉中高度局部的位点处得以实现。因此，局部过载的组织导致局部炎症和改善的DNA摄取和抗原表达。
更为重要地，在更大的肌肉中（此处以兔胫骨前肌表示），与结合体内EP的常规针注射相比，IVIN显示了在体内转染肌纤维上相似的效率。
在一些实施方案中，当IVIN与体内EP结合时，摄取会被进一步改善，而不会引起其它的组织损伤。在一些实施方案中，体内EP脉冲类型具有一个短的高电压脉冲使细胞可渗透，以及第二更长的低电压脉冲以促进DNA的细胞摄取。所述脉冲类型对组织具有最小的破坏性影响，比同样预计引起组织破坏和炎症的脉冲类型更能被容忍。因此，IVIN和体内EP的组合可带来非常有效及可容忍模式的DNA递送方式。此外，IVIN和体内EP的组合带来了如在下文的实施例12所示的协同效应。
当IVIN与体内EP组合时，如在下文的实施例中所证明的，观察到了显著的炎症和转染。
体内EP脉冲模式可以具有一个短的高电压脉冲使细胞可渗透，以及第二更长的低电压脉冲以促进DNA的细胞摄取。所述脉冲模式对组织具有最小的破坏性影响，比同样预计引起组织破坏和炎症的脉冲模式更能被容忍。因此，IVIN和体内EP的组合带来了非常有效及可容忍的DNA递送方式。
在一些实施方案中，加入了源自高度免疫性的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的序列。通过这样，如在野生型动物中测定的，免疫原性并没有大幅改善。然而，当组合的NS3/4A-HBAcg疫苗被用在具有对HCV功能障碍T细胞的宿主（如慢性感染的人）时，应答得以大幅改善。
因此，一个实施方案可以包括非人来源（因为大约20亿人已经接触过HBV）的HBcAg，例如没有人接触过的鸟（鹳）HBcAg（sHBcAg）。另外，在人和非人的HBcAg之间没有交叉反应性。理想地，四种最终的基因型-1和-2质粒会在野生型和NS3/4A-Tg模型中进行测试，以识别出最具免疫原性的型式，即选择加入至NS3/4A中的最好型式的sHBcAg。构造了基因型3和4NS3/4A-sHBcAg疫苗作为这些基因型的副本，因为它们被认为会有类似的性质。已经生成了对于所有四个NS3/4A基因型优化的疫苗序列。因此，完整的疫苗-混合物包括HCV NS3/4A(gtl)-sHBcAg、NS3/4A(gt2)-sHBcAg、NS3/4A(gt3)-sHBcAg和NS3/4A(gt4)-sHBcAg。该混合物然后与正确量的IL-12质粒结合，制备成最终的最佳混合物，形成最终的疫苗。
下面的实施例被用于说明本发明在DNA免疫领域的各种实施方案，所述DNA可被递送至对其中所含的抗原的免疫应答有需要的受试者中。应该理解，下列的实施例并非是根据本发明所准备的广泛或详尽的多种实施方案。
实施例1
使用大号高注射压力（HIP）注射器，小号HIP注射器或常规的27号针向重3.5Kg的新西兰白兔的胫骨前肌注射含0.9mg的ChronVac-C（coNS3/4A DNA）或coHBcAg的0.3毫升0.9%NaCl溶液。白兔可在右侧胫骨前肌（TA）、左侧胫骨前肌(TA)或这两侧进行注射。
如图40A所描绘的，小号HIP注射器的针长4-5mm。小号HIP注射器具有4根针。如在图上所描绘的，三根外部针呈三角形，每根针之间相等间隔约3mm，形成等边三角形。中心针被设置在由三根外部针形成的三角形中间。每根针有6个孔。所有的外部针均具有向中心开口的孔，中心针具有以90°的角度朝向四个方向开口的孔。如在图40B中描绘的大号HIP注射器的针长为8-9mm。大号HIP注射器具有4根呈三角形构型的针，每根针之间相等间距6mm。中心针被设置在由三根外部针形成的等边三角形中央。大号HIP注射器的每根针有10个孔。所有的外部针均具有向中心开口的孔，中心针具有以90°的角度朝向四个方向开口的孔。注射方案在下面的表1示出：
表1
Figure BDA0000465767200000431
Figure BDA0000465767200000441
在第5天，兔115-118被处死，对外周血单核细胞（PBMC）进行T细胞增殖分析。采用标准96小时增殖试验，对PBMC进行体外增殖性回忆应答分析。（参见Lazinda等人，J.Gen.Virol.82:1299-1308（2001），其全部内容以引用的方式被明确结合在本申请中。）简而言之，向微量滴定板上接种了大约200,000个细胞/孔，将细胞与培养基单独孵育、与重组体NS3或HBcAg孵育。PBMC也与作为阳性对照的伴刀豆凝集素A（ConA）进行孵育。72小时后，加入放射性胸苷，16-24小时后收集细胞。在图41中示出并在表2中列出了每分钟细胞计数的放射量。通过将与抗原进行孵育的每分钟计数（cpm）的细胞的放射量除以与培养基单独孵育的细胞的CPM（样品与阴性对照的比值；S/N）而确定增殖情况。结果在图42中示出。
表2
Figure BDA0000465767200000442
结果显示，用大号HIP注射器进行免疫的兔子，比用小号HIP注射器免疫的兔子出现以更多的T细胞增殖为表现的更加强健的免疫应答。该数据同样为由HIP注射器导入肌肉组织中的DNA被有效地转移进细胞中提供了有力证据，在其中，DNA被转录、翻译，并且可以被动物的免疫系统用于产生强力的免疫应答。编码HCV抗原NS3/4A的DNA和编码HBV抗原HBcAg的DNA二者在哺乳动物中有效地产生了强力的免疫应答表明，使用在本文中描述的递送装置，编码免疫原的多种DNA可被有效地导入到哺乳动物中，诱导接种的动物产生免疫应答。
每只兔子的注射位点也被收集用于组织学分析（如在Ahlen等人，In Vivo ElectroporationEnhances the Immunogenicity of Hepatitis C Virus Nonstructural3/4A DNA by Increased LocalDNA Uptake,Protein Expression,Inflammation and Infiltration of CD3+T Cells.J.Immunol.2007，179（7）:4741-53中所描写的，其全部内容以引用的方式被结合到本文中）。简要来说，所述组织在4%甲醛缓冲液中固定、脱水并石蜡包埋。被包埋的组织被切成4-6μm的切片。将切片固定在载玻片上，用苏木素和伊红染料（H&E）染色或用从被coNS3/4A DNA免疫的小鼠获得的多克隆小鼠血清进行染色，其可由生物素化的山羊抗小鼠的二级抗体和使用不溶解的过氧化物酶底物的过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白进行检测。
结果在图43A-C中示出。如位于注射位点，特别是位于针之间的高浓度的染色免疫细胞所指示的，用两种HIP注射器注射0.9毫克的coNS3/4A产生了大量的局部炎症、再生和纤维化。数据显示，在兔子中，大号注射器比小号注射器产生了更好的炎症反应。如位于注射位点处几乎没有染色的免疫细胞所指示的，用常规的27号针注射0.9mg的coNS3/4A仅引起极少的局部炎症、再生和纤维化。另外，如抗体标记所显示的，两种HIP注射器诱导注射位点周围的细胞产生大量的NS3蛋白；而在这些条件下用27号针进行常规注射没有产生可检测到的NS3蛋白。因此，数据显示，HIP注射器有效地将DNA递送进入细胞中，在细胞中DNA大量地被转录和翻译，这可由NS3特异性抗体检测到，但是用27号针进行常规注射并不能如此。
本实施例提供的数据证明，在本文中描述的HIP注射器可以有效地将编码抗原的表达质粒递送进受试者的细胞中，其数量足以产生可由针对抗原的抗体可检测到的蛋白表达水平，并且该蛋白的量足以产生明显数量的抗原特异性T细胞。即，数据显示，在本文中描述的HIP注射器向身体的细胞中有效地递送了足以在受试者中产生强力的免疫应答的量的核酸。因此，相对于递送疫苗的标准方法，使用HIP注射器注射DNA疫苗改善了免疫应答。
实施例2
高注射压力（HIP）的针改善肌肉DNA接种效能的机制可以使用丙型肝炎病毒非结构性（NS）3/4A基因进行表征。HCV感染的持续控制和清除与有效地免疫应答，特别是针对非结构性NS3蛋白的T细胞应答相关。通过接种激活肝脏外部的T细胞后，可以对现有的T细胞库进行补充或修改。在小鼠上对现有的基于NS3/4A质粒的疫苗的实施例进行检测。体内HIP针施用疫苗被认为增加了肌细胞膜的渗透性，其中质粒可在核中有效摄取并表达，从而诱导了功能性体内免疫应答。体内HIP针的使用，通过增加蛋白表达水平和表达的持续时间，以及通过提高CD3＋T细胞浸润和注射位点处的局部炎症反应这二者，提高了coNS3/4A的免疫原性。
雄性和雌性C57BL/6小鼠每笼五只小鼠进行繁殖笼养。小鼠被饲喂以商业饲料（RM3（p）PL IRR饲料；特别饲料服务公司），可自由接触食物和水。在开展实验之前，所有动物至少6周龄。SV40-荧光素酶质粒（pGL4.13-[Luc2-SV40]；Promega公司）通过标准技术自行生产。coNS3/4A质粒按照药品生产质量管理规范进行生产。
通过用两针梗的27号HIP针向右侧胫骨前肌（TA）肌肉进行单次肌肉注射（小鼠中0.05ml）而施用coNS3/4A DNA疫苗。小鼠中的剂量范围是从0.5到50μg DNA。每只动物、每次注射使用一支两针梗的针。每月的间隔内在小鼠上重复该程序多至三次。
采用标准免疫分析技术通过酶免疫分析检测针对NS3的小鼠抗体。将在405nm下的OD值为相同稀释度的非免疫的动物血清OD值三倍的最后一次血清的稀释度作为抗体效价。关于NS3抗体的水平，在使用或没有使用HIP针施用不同剂量的coNS3/4A-DNA进行接种后观察到了剂量反应关系。免疫后观察到提高的效果。同HIP针一起给予的较小的剂量诱导了与没有用HIP针递送较大剂量时相同的平均的NS3特异性抗体水平。总之，HIP针使得基于coNS3/4A DNA的免疫在抗体应答方面更加有效，支持了由使用HIP针介导的佐剂效果的好处。
实施例3
从商业供应商处购买重2.5-3.5kg的新西兰白兔。通过用四针梗的27号HIP针向右侧胫骨前肌（TA）肌肉进行单次肌肉注射而施用coNS3/4A DNA疫苗。剂量位于从70到700μgDNA的范围内。每只动物、每次注射使用一支四针梗的针。每月的间隔内在兔子上重复该程序最多五次。
采用标准免疫分析技术通过酶免疫分析检测针对NS3的兔抗体。将在405nm下的OD值为相同稀释度的非免疫的动物血清OD值三倍的最后一次血清的稀释度作为抗体效价。
在兔全血中测定针对NS3的增殖性应答。在即将进行第一次接种前以及每次接种后两星期时，从每只兔的耳动脉处获得总共4毫升的全血，并收集在肝素化的管中。血浆和外周血单核细胞（PMBC）由梯度离心进行分离。血浆贮藏在-80℃下，直到通过酶免疫分析对NS3特异性抗体进行分析。使用标准96小时增殖试验对PBMC立即进行体外增殖性回忆应答分析。简而言之，向微孔板中接种200,000个细胞每孔，这些细胞仅与培养基、与ConA、PHA或rNS3进行孵育。72小时后，加入放射性胸苷，16-24小时后，收集细胞。通过将与抗原进行孵育的细胞的每分钟计数（cpm）的细胞放射量除以单独与培养基进行孵育的细胞的cpm（样品与阴性对照的比值S/N）而确定增殖情况。在每个时间点处比较每组的平均S/N比值。
在兔子的右侧TA处注射含有指示量的coNS3/4A DNA的0.3毫升盐水。记录抗体水平作为平均终点效价。在多次注射后达到了峰抗体终点效价。
对与使用HIP针免疫的兔子中PBMC中的NS3特异性增殖性应答的诱导有关的显示剂量应答关系的数据进行记录。将在体外存在rNS3时一式两份或一式三份测定的平均S/N值作为指示增殖性结果的数据进行收集。
NS3特异性增殖会是可检测到的。与对照组相比，在接受更高剂量的coNS3/4A DNA组中平均的NS3-回忆增殖不断增高。因此，接种引起兔子中的在体外可检测到的T细胞应答。
实施例4
在下一系列的实验中，对本文所描述的注射针进行改进以与现有的基因转移技术配套使用，所述基因转移技术包括基因枪递送系统、使用电穿孔的递送系统以及显微针递送系统。在这些实验中，通过改进的基因枪递送系统、改进的电穿孔装置或改进的显微针递送系统向小鼠或兔子施用NS3/4A-pVAXl载体。纯化的NS3/4A-pVAXl载体被用于免疫小鼠或兔子组。通过改进的基因枪递送系统、改进的电穿孔装置或改进的显微针递送系统，将所述质粒直接注入再生的胫骨前肌（TA）肌肉中。用约0.25mg/kg的质粒DNA的DNA进行免疫。在第0、4和8周时进行免疫。
使用酶免疫吸附试验（EIA）检测鼠NS3特异性抗体的存在情况。这些试验基本上按照如Chen等人，Hepatology28（1）:219（1998）所描述的进行。简要来说，在4℃、96孔微量滴定板（Nunc，哥本哈根，丹麦）中，处于50mM的碳酸钠缓冲液（pH9.6）中的1μg/ml的rNS3被动吸附过夜。所述滴定板继而用含PBS、2%山羊血清和1%牛血清白蛋白的稀释缓冲液在37℃下孵育1小时进行封闭。从1:60开始的连续稀释的小鼠血清继而在滴定板上孵育1小时。结合的鼠源和兔源血清抗体，通过碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠或山羊抗-兔IgG（Sigma细胞产品，圣路易斯，密苏里州），然后加入底物pNPP（1片加入5ml的含0.5mM MgCl2的1M二乙基胺缓冲液）进行检测。加入1M的NaOH终止反应，在405nm下读取其吸光度。
四周和六周后，所有用NS3/4A-pVAXl免疫的小鼠和兔子均会出现NS3抗体。类似地，所有用NS3/4A-pVAXl免疫的小鼠和兔子均会出现强力的T细胞应答。所有通过改进的基因枪递送系统、改进的电穿孔装置或改进的显微针递送系统用NS3/4A-pVAXl进行免疫的小鼠和兔子均会出现针对所希望的抗原的强力的免疫应答。
实施例5
众所周知，在所有受试物种中，乙型肝炎病毒（HBV）的外源衣壳蛋白（HBcAg）在CD4＋的T细胞水平上高度致免疫。然而，HBcAg，特别是非人源的HBcAg形式，并没有被探索作为基因疫苗的佐剂。使用非人源HBcAg的一个关键特性是因为HBV是一种非常常见的感染，几乎影响了世界上三分之一的人口。因此，应该使用从亲缘非常远的物种中获得的HBcAg序列，以在对HBV高度地区性流行的地区也能够使用这些疫苗。在本文中对HBcAg作为DNA疫苗佐剂的用途进行了探索。HBcAg序列有效地改善了源自丙型肝炎病毒基因的免疫原性，这支持将HBcAg用作细胞内佐剂（iac）。重要的是，添加HBcAg序列的主要作用在模拟人类HCV感染的模型中观察到。基于HBcAg的疫苗可以克服在共表达人白细胞抗原（HLA）-A2和HCV非结构性（NS）3/4A复合体的转基因小鼠中较深的T细胞耐受性。这里存在的“健康的”非耐受的异种T细胞帮助激活了功能障碍的HCV NS3/4A特异性T细胞。因此，HBcAg有效地起到了细胞内佐剂的作用，可以帮助在持续性存在病毒抗原的宿主（如通常可在慢性的病毒感染中可以看到的）中恢复功能障碍的T细胞应答。
一些实施例包括，例如，在国际专利申请公布号WO2009/130588（指定了美国并且以英文进行公布）中所公开的一种或多种HBcAg核酸或蛋白序列，这篇专利申请公布的所有内容因此以引用的方式被明确结合至本文。一些实施方案包括图44A-I中标记的NS3/4A/HBcAg融合体或编码所述融合体的核酸，或者编码在SEQ.ID NO.1-32中所描述的蛋白的核酸。编码如在WO2009/130588（例如，桦树抗原）和WO2010/086743（这两份专利申请均指定了美国并用英语进行了公布，它们公布的所有内容因此以引用的方式被明确结合至本文）中所描述的抗原肽的其它核酸序列，也可与编码HBcAg的核酸序列结合，所述融合体可使用在本文中描述的一种或多种注射装置向有需要的受试者进行施用。一些实施方案也包括其它的佐剂，包括但不局限于三唑核苷或CPG核苷酸，如SEQ ID NO.33。任何上述实施例可以结合到在本文中描述的一种或多种注射装置中并可施用给有需要的受试者。
实施例6
对使用本文所描述的细胞内递送装置注射物质所需要的力进行了研究。向开放的空间或鸡胸中注射安慰剂液体，使用劳埃德张力计对施加的力进行测量。
图45为用于测量使用本文公开的一种注射针装置进行注射物质时所需要的力的装置的示例。使用劳埃德张力计4500，以预设的速度对含流体4520的注射器4510进行压缩，测量注射0.3ml的流体（例如，空气或水）所施加的力。支持架4530在压缩时固定注射器4510，高速照相机4540记录从针梗4550的喷射模式。测量了两种不同的注射器：（i）注射0.3ml需要活塞深度为5.09mm的3ml注射器，和（ii）注射0.3ml需要活塞深度为2.63mm的5ml注射器。首次测试研究了将空气注射入开放区域（即，并不位于肌肉组织内）中所需要的力。也完成了将染色水注入开放区域或注入鸡胸中的测试。
所测试的注射装置包含四根针，与图8B中描述的结构基本上相同的结构进行设置。长度L6为6mm。具体来说，针820b包括三个区，每个区具有15个孔，所有的孔均朝向邻近的针820a、820c和820d中的一根。即，针820b包括具有15个孔的第一区，所有这些孔均朝向针820a，具有15个孔的第二区，所有这些孔均朝向针820b，以及具有15个孔的第三区，所有这些孔均朝向针820c。同时，针820a、820c和820d每一根均包括15个孔的一个区，所有这些孔均朝向针820b。在指定区的所有这些孔均沿所述针的针梗的轴垂直间隔开。每个孔均由在每个孔中心之间的约0.2mm的间距所隔开。对具有0.05mm的圆孔或0.1mm的圆孔的针进行了测试。
结果在表3中示出。
表3
Figure BDA0000465767200000481
Figure BDA0000465767200000491
使用高速照相机研究了水进入开放区域的喷射模式。一般来说，以1mL/s或更高的流速进行的试验形成了被认为可以增加压力的轮廓分明、对称的喷射模式，可能适合于递送治疗性物质。图46-49示出了在注射染色水后鸡胸的俯视图和截面图。
实施例7
为考虑手动递送物质的实际压力限制，该实施例描述了使用在本文中公开的细胞内递送装置手动向组织样品中注射物质。所述针被设置为与实施例6中的相同，包括0.05mm的孔，每根针之间相距3mm。3mL的注射器通过支持架进行支持，活塞由手动尽快推下。使用高速照相机记录活塞的运动，用于计算向鸡胸中注射0.3mL的染色水的时间。
该测试重复三次，递送物质需要的时间为0.48秒、0.40秒和0.48秒。因此，平均手动递送速度约为0.45秒。图50示出了在手动注射染色水后鸡胸的俯视图和截面图。图51为一个比较实施例，示出了仅使用单根针手动注射染色水后鸡胸的俯视图和截面图。
实施例8
使用与在实施例6中描述的基本上相同的步骤，对使用在本文所描述的细胞内递送装置注射物质所需要的力进行了研究。
测试了多个不同的注射装置。注射装置“3Y01(72)”包括如在图8B中所描绘的四根针，其中L6为3mm。在四根针中孔的总量为72。中心针包括沿针的轴成三排分布的36个孔，每一排均朝向一根外部针。三根外部针的每一根均包括朝向中心针的单排的12个孔，以产生在各针之间的交叉流动。所述孔的直径为0.1mm，间距为约0.2mm。
注射剂装置“3O01(96)”包括如图8C所描绘的针，其中L7为3mm，每根针包括沿针的轴成两排分布的24个孔（24的4倍为96个孔）。每一排朝向邻近的针，生成在针之间的交叉流动。所述孔的直径为0.1mm，间距为约0.2mm。
注射剂装置“6X01(144)”包括如图8C所描绘的针，其中L7为6mm，每根针包括沿针的轴成三排分布的36个孔（36的4倍为144个孔）。每一排朝向三根其它针中的一根，生成在针之间的交叉流动，并在与四根针等距的中心附近也聚合。所述孔的直径为0.1mm，间距为约0.2mm。
注射装置“3O05(72)”具有与“3O01(96)”基本相同的构造，除了每个孔为0.05mm，L7为3mm，以及每根针包括18个孔。注射装置“3X05(72)”具有与“6X01(144)”基本相同的构造，除了每个孔为0.05mm，L7为3mm，以及每根针包括18个孔。注射装置“3Y05(72)”具有与“3Y01(72)”基本相同的构造，除了每个孔为0.05mm和，L6为3mm。
图52示出了使用5mL注射器时在不同喷射速度（mm/秒）下水排出孔的最大力。
图53示出了使用10mL注射器时在不同喷射速度（mms/秒）下水排出孔的最大力。“X”、“Ο”和“Y”形孔分别为“6X01(144)”、“3O01(96)”和“3Y01(72)”。
图54示出了使用10mL注射器时在不同喷射速度（mm/秒）下水排出孔的最大力。“X”、“Ο”和“Y”形孔分别为“3X05(72)”、“3O05(72)”和“3Y05(72)”。当（i）将空气注入开放区域；（ii）将水注入开放区域；以及（iii）将水注入鸡中时，测试了如上所述的六针装置的最大注射压力。最大力在下面的表4中示出。
对将染色水递送进入鸡胸进行了测试。使用劳埃德张力计及针“3Y05(72)”、“3O05(72)”、“3X05(72)”、“3Y01(72)”和“3O01(96)”注射染色水。作为比较实施例，使用在针梗末端含一个孔的单根针将染色水递送进入鸡胸。每个试验注射0.3ml，图55示出了结果。结果显示针“3Y05(72)”、“3O05(72)”、“3X05(72)”、“3Y01(72)”和“3O01(96)”具有改善的局部组织递送。
表4
Figure BDA0000465767200000511
实施例9
使用总共72只兔（36只雌性，36只雄性）进行综合急性重复毒理学研究。在适应两周后，采用本文所描述的针和方法，结合电穿孔，对所有动物肌内注射缓冲液，用于人类使用的临床剂量（DNA量）/kg，或者10倍临床剂量（DNA量）/kg。在注射DNA后每日监测动物的健康状态。在第一次接种7天后，对每组动物中的4只动物采血，进行血液和临床化学分析。然后对动物实施安乐死，解剖相关器官用于组织病理学分析。组织病理学特别关心的是注射位点。
为研究重复施用后的毒性，将剩余的48只动物（24只雄性，24只雌性）接种缓冲液，用于人类使用的临床剂量或者10倍临床剂量（DNA量）/kg，总共4次，每次接种间隔1个月。在最后一次注射后7天，对动物采血，进行血液和临床化学分析。然后对动物实施安乐死，解剖相关器官用于组织病理学分析。组织病理学特别关心的是注射位点。在重复施用期间，采取血样以确定抗体对接种的应答的发展，以及确认疫苗的效力。
实施例10
在第一次研究中，使用大号高注射压力（HIP）注射器，向HCV感染的个体的大腿肌肉中注射含大约0.25 mg/kg体重的ChronVac-C（coNS3/4A DNA）（一种编码密码子优化的HCV NS3/4A的表达质粒）的大约0.5ml的0.9% NaCl溶液。在第二次研究中，使用大号HIP注射器，向HBV感染的个体的大腿肌肉中注射含大约0.25 mg/kg体重的coHBcAg（一种编码密码子优化的HBV核心抗原的表达质粒）的大约0.5ml的0.9% NaCl溶液。大号HIP注射器具有4根呈三角形构型的针，每根针之间相等间距6mm。中心针被设置在由三根外部针形成的等边三角形中央。大号HIP注射器的每根针有10个孔。所有的外部针均具有向中心开口的孔，中心针具有以90°的角度朝向四个方向开口的孔。
在第5天和第10天，从接种后的个体中抽血，分离外周血单核细胞（PBMC），对PBMC进行T细胞增殖性分析。采用标准96小时增殖试验，对PBMC进行体外增殖性回忆应答分析。（参见Lazinda等人，J.Gen.Virol.82:1299-1308（2001），其全部内容以引用的方式被明确结合在本申请中。）向微量滴定板上接种了大约200,000个细胞/孔，将细胞与培养基单独孵育或与重组体NS3或HBcAg孵育。PBMC也与作为阳性对照的伴刀豆凝集素A（ConA）进行孵育。72小时后，加入放射性胸苷，16-24小时后收集细胞。细胞的放射性以每分钟计数进行测量。另外，对NS3/4A和/或HBcAg特异性的抗体的存在情况通过标准试验（例如，ELISA）进行确定。可选地，在两周或三周的间隔内加强注射。结果会显示，使用大号HIP注射器进行免疫的人表现出对NS3/4A和/或HBcAg明显的免疫反应。
实施例11
研究了各种组合中针电极的带电情况，以确定生成的电场对在带电的针电极内所容纳的预防性和/或治疗性物质的影响，以及确定随着注射介质和受试者的变化对电极针的电性能（例如电流消耗、电压等）的影响。所述组合及结果在表5中示出。
在表5中，对设置有针电极的如本文所描述的细胞内递送装置的两个实施方案进行了测试。探针IV为如本文所描述的具有袋形集合器的七针注射装置。探针VII为如本文所描述的具有袋形集合器的4针、Y形注射装置。配置栏描述了以数字所鉴别的哪些针具有正极，哪些针具有负极。针以顺时针前进的方向编号，中心针编号最高。调节电压，以维持在受试者或EP介质中生成的所希望的600V/cm电场。针尖处的电场强度的变化取决于针距。
表5
Figure BDA0000465767200000521
Figure BDA0000465767200000531
本实施例的测试显示，可以实现使用针作为电极和作为预防性和/或治疗性物质（递送试剂）的载体，不会将预防性和/或治疗性试剂降解，也不会不希望地增加电流消耗。针电极可由导电材料制成。在一些实施方案中，所述集合器由非导电材料制成。
实施例12
从本文所公开的本实施例中可以明白，使用两阶段递送的IVIN递送及随后的电穿孔，实现了相对于单独的任一种方法或这两种方法的相加效应来说的协同反应。在以家兔胫骨前肌所代表的较大的肌肉中递送、摄取及表达的结果在图56A1-B2和图57A1-C2中示出。
在本实验中，采用常规的皮下注射针（也可被称为常规针）对第一组动物注射NS3/4A。使用常规对第二组动物注射NS3/4A，然后进行体内EP。使用如本文所描述的IVIN装置对第三组动物注射NS3/4A。使用相同的IVIN装置对第四组动物注射NS3/4A，然后进行体内EP。
在本实施例中，使用由IGEA/Kiritec提供的EC标记的Cliniporator EP装置递送体内EP。体内EP的脉冲类型具有一个很短的高电压脉冲，后面还有一个第二更长的低电压脉冲。并非受限于理论，可以认为所述一个很短的高电压脉冲帮助使得细胞可渗透，而第二更长的低电压脉冲帮助促进细胞摄取DNA。如所观察到的，所述脉冲类型对组织具有最小的破坏性影响，比还可能引起组织破坏和炎症的脉冲类型更能被容忍。
在注射和体内EP（如果有的话）之后，对从每个样品群的组织样品进行NS3/4A表达水平的测试。
如图56A1所示，在用常规针注射且未进行体内EP的组织样品中观察到了NS3/4A的中等到零的表达。如图56A2所示，在用常规针注射且接受体内EP的组织样品中检测到了可觉察到的表达水平的NS3/4A。因此，如图56A1和图56A2所示，与使用常规针而不联合进行体内EP（图56A1）相比，使用常规针且联合进行体内EP（图56A2）的结果显著增强。
类似地，如图56B1-B2所示，与使用IVIN针、125N注射力且不联合进行体内EP（图56B1）相比，使用IVIN针、125N注射力且联合进行体内EP（图56B2）的结果得以增强。
将图56A2与图56B1相比，用125N注射力进行IVIN注射（图56B1）显示出与用常规针注射结合体内EP（图56A2）相比在体内转染肌纤维方面相似的效率。
并非受限于理论，可以认为由于集合器的构造将针沿固定组织的圆放置并将NS3/4A注射在所述组织中央，采用IVIN技术的注射取得了在组织中高度局限的位点。可以认为组织被局部过量装载，导致局部炎症和改善的DNA摄取和抗原表达。
此外，当将图56A2和图56B1与图56B2进行比较时可以看出，采用125N注射力的IVIN针及体内EP的结合（图56B2）与单独进行体内EP（图56A2）或单独采用IVIN针（图56B1）中的任一者相比显示了增强的炎症和转染。此外，可从图56B2中看出，采用125N注射力的IVIN针结合体内EP，相对于体内EP（图56A2）和IVIN针（图56B1）的相加效应产生了真正的协同效应。
图57A1-C2为与采用常规针及电穿孔相比，用两个注射力值使用如上所述的皮下注射针装置联合电穿孔的注射结果示例。如图57A1-A2所示，与使用常规针而不联合进行体内EP（图57A2）相比，使用常规针且联合进行体内EP（图57A1）的结果显著增强。类似地，如图57B1-B2所示，与使用IVIN针、75N注射力且不联合进行体内EP（图57B2）相比，使用IVIN针、75N注射力且联合进行体内EP（图57B1）的结果得以增强。类似地，如图57C1-C2所示，与使用IVIN针、125N注射力且不联合进行体内EP（图57C2）相比，使用IVIN针、125N注射力且联合进行体内EP（图57C1）的结果得以增强。
如图57C2所示，IVIN、125N注射力和体内EP转染的结合非常有效。
图58A示出了C57BL/6小鼠的干扰素γ生成细胞/百万脾细胞的数量，所述C57BL/6小鼠采用IVIN细胞内递送仪向胫骨前肌注射了5μg NS3/4A DNA，没有进行电穿孔。
图58B示出了使用标准注射法向C57BL/6小鼠递送5μg NS3/4A DNA时的相同的量。
图58C示出了C57BL/6小鼠的干扰素γ生成细胞/百万脾细胞的数量，所述C57BL/6小鼠采用IVIN细胞内递送仪向胫骨前肌注射了5μg NS3/4A DNA，并且结合了电穿孔。
图58D示出了C57BL/6小鼠的干扰素γ生成细胞/百万脾细胞的数量，所述C57BL/6小鼠采用常规针向胫骨前肌注射了5μg NS3/4A DNA，同时结合了电穿孔。
因此，使用IVIN递送DNA导致了DNA的局部沉积和摄取及表达，以及局部炎症。同样，当与体内EP结合时，摄取和表达得以进一步改善，而不会引起其它的组织损伤。因此，IVIN和体内EP的结合导致了非常高效且可容忍的DNA递送方式，这在递送基因疫苗（例如，编码所希望的抗原的核酸构建体，如含或不含HBcAg的NS3/4A）中尤为有用。
实施例13
使用含IVIN注射系统的细胞内递送仪对商品猪（outbred pig）进行注射，以将NS3/4ADNA递送至皮肤（6×50μg）或右侧大腿肌肉（1×500μg）中。图59A和B示出了未接受NS3/4A DNA IVIN注射的猪（非免疫猪）的猪-干扰素γ生成细胞/百万外周血单核细胞的数量。图59C和D示出了在注射NS34A DNA之后的猪（免疫猪）的猪-干扰素γ生成细胞/百万外周血液单核细胞的数量。如数据所显示的，在使用细胞内递送装置递送NS3/4A构建体后诱导了可察觉到的免疫应答。
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Claims (25)

1.一种在活体动物中通过对组织局部过载而进行细胞内递送的仪器，包括：
递送单元，所述递送单元控制注射参数；
集合器，所述集合器与所述递送单元连接，并包括至少一个电连接件；
与所述集合器连接的多根针，其中所述多根针中的每根针包括：
封闭端；
针梗；
设置在所述针梗上的多个孔，其中位于每个针梗上的所述孔相向于至少一个其它针梗上的孔，以便形成递送试剂的相向方向的递送或递送试剂的交叉喷射模式的递送；
电极；以及
被设置为在所述电极处生成电场的电源供应装置，其中所述电源供应装置通过至少一个所述电连接件与所述电极相连。
2.根据权利要求1所述的细胞内递送仪，其中所述多根针中的至少一根针为针电极，所述针电极与所述电源供应装置电连接并被设置为形成电场。
3.根据权利要求1或2所述的细胞内递送仪，其中所述细胞内递送仪包括多个针电极，所述多个针电极与所述电源供应装置电连接并被设置为形成电场。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述细胞内递送仪包括排列成Y形样式的四根针，含一根中心针及三根设置在所述中心针周围的外部针，其中所述中心针为针电极，被设置为应用第一极性电压，所述三根外部针为针电极，被设置为应用第二极性电压。
5.根据权利要求4所述的细胞内递送仪，其中所述中心针包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向位于三根外部针的每根针上的孔处递送，所述三根外部针的每一根针均包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向位于中心针上的孔处递送，并且其中所述外部针不具有被设置为将递送试剂递送远离中心针的孔。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述细胞内递送仪包括一阵列的针，所述一阵列的针包括一根中心针和设置在所述中心针周围的多根外部针，其中所述中心针为被设置为应用第一极性电压的针电极，并且所述外部针为被设置为应用第二极性电压的针电极，其中所述中心针包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向所述外部针处递送，所述外部针包括沿着针梗的孔，所述孔被设置为引导递送试剂向所述中心针和/或邻近的针处递送，并且其中所述外部针并不具有能够将递送试剂递送至远离由针的阵列内的区域限定的作用区的孔。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述细胞内递送仪进一步包括排列成六角形样式的七根针，其中作为针电极的一根针位于六角形样式的中心。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的细胞内递送仪，进一步包括：
与所述集合器流体连接的注射器；
被设置为接收所述注射器的通道；
用于可操作地将注射器固定在所述通道内的套环；
手柄，用于将注射器及集合器封装在通道内，使得针梗的封闭端从所述通道中伸出并能用来与受试者接合；
加料元件，所述加料元件被设置为由所述手柄的操作而进行加料，所述加料元件与触发器和注射器连结，使得所述触发器的运行释放了所述加料元件，所述加料元件作用于注射器，从而将预防性和/或治疗性物质从注射器中置换出来；以及
电端口，所述电端口被设置为与皮下注射针装置的集合器上的电连接件配合，从而建立起在所述电源供应装置和所述电极和/或针电极之间的电连接。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述集合器为袋形集合器，包括对于每根针或针电极的递送试剂的单独储存器。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述集合器包括对于每根针或针电极的递送试剂的单个储存器。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述多根针中的至少一根针至少部分地由不导电材料层压。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的细胞内递送仪，进一步包括被设置为控制电场生成的电源供应装置控制器。
13.根据权利要求12所述的细胞内递送仪，其中控制电场的生成包括控制一个或多个脉冲电压、针电极的极性、脉冲数量、脉冲类型或脉冲持续时间。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述加料元件为被设置成由手柄的运行而压缩且被设置成在触发器运行时或当被电操作的传感器所激活时减压的弹簧。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的细胞内递送仪，其中应用到所述电极和/或针电极的电场为整流电场。
16.一种将递送试剂导入受试者的组织中的方法，包括：
提供权利要求1-15中任一项所述的细胞内递送仪；
提供电压源；
将所述电穿孔仪的多根针和多个电极或多个针电极插入受试者的组织中；
将所述递送试剂通过多根针或多个针电极的腔道置换出来并导入受试者的组织中；以及
向受试者的组织施加电场。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在向组织施加电场之前进行所述递送试剂的置换。
18.根据权利要求16所述的方法，其中在向组织施加电场之后进行所述递送试剂的置换。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述递送试剂的置换以两阶段法进行，其中第一阶段包括将递送试剂置换进入作用区的组织中，第二阶段包括将一个或多个电极或针电极通电以使作用区内的细胞电穿孔。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述注射参数为注射速度。
21.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞内递送仪，其中所述注射参数为注射压力。
22.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞内递送仪，所述细胞内递送仪用于DNA接种。
23.根据权利要求20所述的细胞内递送仪，其中所述DNA接种包括导入编码肝炎抗原的多核苷酸。
24.根据权利要求21所述的细胞内递送仪，其中所述肝炎抗原为丙型肝炎病毒（HCV）抗原。
25.根据权利要求22所述的细胞内递送仪，其中所述HCV抗原包括NS3。
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