CN101168744A - 一种在体基因转导装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在体基因转导方法及其装置，包括带有双注射器针管的双电极针头；高压交流正弦波信号发生器；高压直流信号发生器和微机控制斩波模块组成，本发明采用双注射器针管的双电极针头给肌肉组织注射DNA，同时给DNA所在之处的肌肉组织施加具有特定参数的激励电场，从而实现了在保持与普通电极具有同等转导效率的情况下，将原有普通电极装置施加到肌肉组织层上的激励电场强度从200－700V/cm降低到20－50V/cm，进而大大减少了肌肉组织的损伤。本发明具有体积小、重量轻、参数可调、临床使用界面友好、操作方便等优点，从而实现了安全、高效的在体基因转导。为进一步开展临床基因治疗试验研究提供了新方法和新工具。

Description

一种在体基因转导装置

技术领域

本发明涉及一种临床医学研究的实验用仪器，特别是一种在体基因转导装置，该装置可对提供高效、安全的基因转导，为进一步基因治疗提供新的方法和工具。

背景技术

基因治疗的效果紧密依赖于是否能将转导基因安全、有效地输送到靶器官组织中。在基因载体中，有病毒载体和非病毒载体。其中：病毒载体在携带病毒进入细胞，并导致细胞感染毒性的过程中起着重要作用。然而，最近有报道称，AAV载体的血友病可以通过反作用的免疫反应而阻断病毒载体进入细胞(1，2)。另外，病毒载体和宿主基因组的结合，可能会使病毒插入染色体，引起严重后果。据报道：有3个患有重度联合免疫缺陷(SCID)的儿童参加了法国基因治疗实验，实验采用的逆病毒载体治疗方法引起了白血病，从而导致其中2个儿童死亡。究其原因，是因为病毒插入了患者的11号染色体(3，4)。因此，发明一套没有病毒载体和人工合成载体的基因输送体系将大大有利于人类。

裸pDNA被认为是一种最简单和最安全的基因转导系统(5)。它由于没有外源蛋白质，不会刺激获得性免疫系统(9)，因而比病毒载体具有更多的优点。同时，骨骼肌可被用做裸pDNA转导的主要靶器官。注射了脂质体DNA的肌肉会出现长期的蛋白质反应(8)，这就使肌肉犹如一所能分泌治疗蛋白质的加工厂(10)。目前，由脂质体DNA结合来自于病原体、过敏原和肿瘤蛋白的DNA疫苗已经完成了临床第一、第二阶段的实验(6，7)。然而，转导到肌肉的裸脂质体DNA的最大缺点是它的转导效率太低。

最近，通过电极途径在体内进行基因转导已经成为热门课题，特别是电基因转导到骨骼肌的方法。这是因为：1)骨骼肌细织中没有细胞替代，所以在有丝分裂后不出现基因快速丢失(12)，而且转导基因可以存在较长时间；2)骨骼肌含有丰富的血供，为分泌蛋白质进入血液循环提供了良好的转运条件。电基因转导相比裸DNA注射转导的优点在于其个体内部变异较小(14)。另外，电转导持续时间较长，可以用在不同物种的不同组织中，例如用在灵长类动物组织中(14)。在老鼠实验中，电基因转导可用于调节人类凝血因子IX，2％人类凝血因子IX保持了正常状态并持续数月时间(15，16)。目前，通过电基因脉冲转导药物的临床试验已经广泛开展(17)。

电基因转导是一项应用电脉冲强化细胞外分子的技术操作，它破坏了血浆细胞膜(18)，使得DNA、酶、抗体和其他大分子物质可以进入细胞膜。最典型的是施加高达200-700V/cm的电流到肌肉组织(19)，从而达到高效的基因转导率。但这种方法会导致组织发生不可逆转的损伤(19，20)。据研究调查报道，这种方法的损伤程度远远高于电流为100V/cm所造成的组织损伤，甚至可直接导致细胞死亡(21)。

发明内容

本发明的目的在于，为临床医学研究实验提供一种高效、安全在体基因转导装置，进而为基因治疗提供新方法和新工具。

为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：

一种在体基因转导装置，其特征在于，该装置的硬件包括：

1)带有双注射器针管的双针头电极，用于：a)给肌肉组织注射DNA；b)给DNA所在之处的肌肉组织施加具有特定参数的激励电场。

2)激励信号源，用以产生两种激励信号，正弦波脉冲信号和方波脉冲信号。激励信号的幅度可在10V-50V范围内调整。脉冲宽度在10ms-1000ms之内可调，脉冲间隔也在10-1000ms之内可调。一次激发的脉冲数量在1-10个之内可调；

3)微处理机，用以对刺激信号进行控制和调节，根据人为设定的特殊刺激参数控制系统进行斩波操作，以产生符合参数设定要求的不同的刺激信号；

4)键盘输入与显示模块，输入模块用以实现刺激参数的设定，显示模块用以指示当前设定的特殊的刺激参数。

微处理机内设有支持软件，这些软件包括：

1)支持产生高压、脉宽可调的交流正弦波脉冲信号的斩波控制软件；

2)支持产生高压、脉宽可调方波脉冲信号的斩波控制软件；

3)支持产生每次输出脉冲数可调的控制软件；

4)键盘管理模块：用于对实验参数进行设定、查询、修改和删除；

5)显示器管理模块：用于监视设定的参数和出错报警。

软件由以下模块构成：

1)定时模块，实现以10ms为单位的软件定时功能；

2)显示模块，实现设定好的特殊参数的显示功能；

3)参数设置模块，根据系统检测到的键盘按键的状态变化来改变产生的刺激信号的参数；

4)波形输出模块，用以在设置好刺激信号的特殊参数后启动刺激信号的输出；

5)中断服务模块，使用51单片机的外部中断0，当发生中断时系统自动调用此模块进行中断处理。

本发明的装置具有下列技术特点：

1.这种注射器电极可以将激励电场直接施加到DNA所在之处。因此，在保持与普通电极具有同等转导效率，甚至高于10倍的转导效率的情况下，注射器电极可大大降低施加在组织层上的激励电场。如：施加到肌肉组织层上的激励电场强度可从200-700V/cm降低到20-50V/cm，从而大大减少了肌肉组织的损伤。

2.高效、安全的在体基因转导装置含有正弦波脉冲和方波脉冲两种电场激励源。施加的脉冲个数、脉冲宽度、脉冲间隔均可根据实验需要调整。

3.高效、安全的在体基因转导装置巧妙地利用了调压斩波技术，直接将电网电压或外置高压通过开关器件，进行斩波输出，从而降低了装置对高压放大器件的要求，简化了电路设计，缩小了装置的体积。

附图说明

图1是本发明在体基因转导装置的硬件框图；

图2是本发明具体实现的双针管注射器电极；

图3是本发明高压直流稳压源模块的电原理图；

图4是本发明正弦波交流电压源模块的电原理图；

图5是本发明具体实现微处理机控制斩波器的一种电原理图；

图6是本发明具体实现输出接口的一种原理图；

图7是本发明具体实现键盘控制功能的一种原理图；

图8是本发明具体实现显示模块的一种电原理图；

图9是本发明在体基因转导装置的系统软件框图；

图10是本发明的软件系统中主程序的流程图；

图11是本发明的软件系统中定时模块(a)和显示模块(b)的程序流程图；

图12是本发明的软件系统中波形输出模块的流程图；

图13是本发明软件系统中的中断服务模块的流程图；

图14是在体基因转导装置软件部分的整体的流程图；

图15为本发明具体实现的在体基因转导装置的一种输出波形；

图16为采用本发明装置所做实验的基因表达水平的比较；

图17为采用本发明装置所做基因电转导后肌肉损伤程度情况

图18为采用本发明装置所做实验的动态基因表达和基因转导到其他组织的情况。

以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

1.在体基因转导装置的构成

本发明采用双注射器针管的双电极针头给肌肉组织注射DNA，同时给DNA所在之处的肌肉组织施加具有特定参数的激励电场，从而实现了高效、安全的在体基因转导。本发明为基因药物长效治疗人类一些疑难疾病提供了新方法和新工具。

该装置针对普通电基因转导方法及其普通电极需要对肌肉组织层上施加高激励场强(200-700V/cm)，会造成肌肉组织的损伤，甚至直接导致细胞死亡，进而限制基因药物在人类疑难疾病治疗中应用的现状，设计了一种用于研究如何在保持与普通电基因转导方法具有同等转导效率，甚至高于其转导效率的情况下，降低施加到肌肉组织层上激励电场强度、减少了肌肉组织的损伤的有效方法及其工具。

1.1系统的硬件构成

在体基因转导装置的硬件框图见图1，包括微处理机，微处理机上连接显示器和控制键盘；微处理机的输出连接有斩波器，斩波器上连接有激励信号源，斩波器通过输出接口连接双针管注射器电极。

1.1.1双针管注射器电极

双针管注射器电极为并行放置的一对外径为5mm注射器针管，每个针管出口端接有一电极针头。两电极针头的间距为5～8mm。两针头电极通过斩波器的输出接口分别与激励信号发生器正负输出端相连，以接收来自激励信号发生器的激励脉冲信号(图2)。

1.1.2高压/占空比均可调的激励信号源

本装置的激励信号源有两种，即(10～50)V电压/脉宽占空比均可调直流电压信号发生器和±(10～50)V电压/脉宽占空比均可调的正弦波交流电压信号发生器。

1.1.2.1直流电压信号发生器

为了尽量的简化电路的设计，同时减小本发明的体积，增强安全性，直流电压信号发生器采用了AC/DC模块电源，而没有采用变压、整流、滤波等一系列传统的方法。采用现成的模块电源的另一个优点是输出信号的纹波很小，提升了系统的性能。220V市电经过此模块电源后输出35V左右的直流电压，为了得到10-50V输出电压可调的直流稳压信号，后级又采用了直流可调式三端稳压器。稳压器参考端接一个12V左右的稳压管，将参考电压起点提升到10V左右。通过调整接到参考端的一个电位器来调整参考端的参考电压，稳压器输出端的电压即可实现连续可调。如果将来系统进行升级换代，则可将参考端的参考电压接到一个可编程电压的设计方案。这样，通过编程可以对参考电压进行实时调整，替代了原来系统的电位器，大大的扩展稳压器的输出电压范围，使电压调节更精确(图3)。

1.1.2.2正弦波交流电压信号发生器

装置采用的是50HZ的交流市电输入，以产生±(10-50)V电压输出幅度可调的50Hz交流信号。首先将外界输入的220V电压进行降压处理。为了提高安全性，尽力的避免变压器模块对周围电路产生的电磁辐射影响，这里选用小功率隔离式电源变压器。输出电压大约60V。变压器后级接一个可控硅交流调压电路。当调压电路的参数选择合适的时候，通过调节机械电位器，在输出端就可以得到满足需要的电压(图4)。

1.1.2.3微处理机

微处理机由目前应用比较广泛的89C51单片机及其外围电路来实现。它是整个系统的核心部分。装置的五个键盘按键状态经过一定的逻辑组合后引入到单片机的外部中断0引脚。单片机通过中断处理接收外部通过键盘输入的参数。同时单片机负责控制和驱动五个七段数码管的显示。单片机根据外部输入的参数，结合内部的软件定时模块，控制波形输出模块的通断，实现斩波功能(图5)。

1.1.2.4输出接口

本装置的输出采用交流和直流两个通道分别输出的方式。核心部件是继电器芯片，微处理机模块通过I/O口控制继电器芯片实现斩波功能。另外，为了安全起见，每个输出通道都加上了保险管(图6)。

1.1.3键盘输入与显示模块

装置装有五个机械按钮开关，以实现键盘按键的作用。另外，为了实验过程中使用的方便，系统预置了脚踏开关的接口，可以方便的接入脚踏开关对系统进行控制。当这些开关或者按钮之中有一个按下的时候会引起单片机的外部中断0产生中断。通过中断处理程序单片机读入开关或者按钮的状态并据此对相应的参数进行设置。这样就实现了键盘输入功能(图7)。

装置的显示模块由一个译码器和五个最常用的七段数码管及各自的驱动芯片组成，由微处理机控制数码管的显示内容和时间(图8)。

1.2系统的软件构成

在体基因转导装置的软件框图见图9。

1.2.1开发平台和开发工具

本装置的软件部分采用伟福公司的单片机仿真实验系统作为平台，以C51语言作为开发工具开发的。

1.2.2软件的具体实现

1.2.2.1主程序

它是整个软件模块的入口，整个程序流程如图10所示。它首先完成一些初始化工作，例如初始化一些有用的变量，定义一些常量。然后进行系统自检，确定系统是否正确启动。当确定系统启动成功后开放系统外部中断0，然后进入主循环等待中断发生。主程序根据中断处理程序中定义的指示变量判断是否有中断发生。如果系统产生中断，在自动调用中断处理程序后，主程序会根据在中断处理程序中读取到的键盘按键状态进行判断，决定对参数进行何种设置。当接收到信号输出命令后主程序调用波形输出函数进行信号输出。

1.2.2.2定时模块

这是一个全局的函数，实现软件定时。根据系统中单片机的振荡频率计算出函数内部空循环的执行次数，实现以10ms为单位的软件计时功能。它供软件系统的其他函数在需要定时服务的时候调用(图11a)。

1.2.2.3显示模块和波形输出模块

供软件系统主程序调用的一个显示函数。通过对被分配不同地址的七段数码管的驱动芯片写入不同的数据来驱动数码管完成显示功能(图11b)。

波形输出函数实现系统的信号输出功能。当主程序根据外部的输入设置好刺激参数后调用此函数对继电器进行控制，继电器芯片有一个使能端或者称为控制端，输入高电平时继电器就导通，而反之则截止。这个函数正是利用继电器的这个控制端实现斩波功能(图12)。

1.2.2.3参数设置和中断响应函数

当键盘按键动作时会引起单片机中断，在中断处理函数中读入按键的状态，并置位一个指示变量，供主程序检测使用。中断响应函数的程序流程图见图13所示。

整个软件系统是上述这些部分协调工作的整体，本发明的整个软件系统的流程图见图14所示。

2.在体基因转导装置应用实例

2.1实验装置

实验采用本发明设计的在体基因转导装置。图15示出了该在体基因转导装置的一种典型输出波形及其示意波形。

2.2实验材料

内霉素释放出荧光素酶(pNGVL3-Luc，美国国家基因载体实验室)，绿色荧光蛋白(4-氯-3，5-二甲苯酚-表皮生长因子受体-NI，ω-3多不饱和脂肪酸(EPA，DHA)和多种维生素制剂)和人体IX因子(4-氯-3，5-二甲苯酚-hFIX)质体。2，2，2-三溴乙醇是采购于Sigma-阿尔德林化学制品公司(密尔沃基，威斯康新，USA)。美国北卡罗莱纳大学中心设备实验室饲养的携带FIXKO因子和R333Q因子的小白鼠，它们都具有C57BL/6背景。

2.2实验方法

2.2.1向小白鼠骨骼肌的交流正弦波电基因传导

每组有三只小白鼠，每只小白鼠分别腹腔注射8毫克2，2，2-三溴乙醇使之麻醉，并通过手术使每个四头肌剥离。使用本发明研制的在体基因转导装置的双针管注射器电极每次向一块肌肉传递10微克质粒DNA，电转导激励的标准参数为6个脉冲，20V/cm场强，600ms脉宽，300ms间隔。基因向所有6个四头肌转导完毕后一天，再进行荧光素酶表达。溶解的DNA(每20微升10微克)通过注射电极的针管注入手术分离的四头肌中，并立即将每厘米15、20、25、30V等4种交变场强的激励脉冲(其它施加参数同上)分别施加到这6个四头肌上。数据表达单位为每单位四头肌中的相对光照单位(RLU)。在各个实验组内比较交流正弦波和直流方波的值，进行*p＜0.05和**p＜0.01的t检验。

2.2.2蛋白质表达分析

电穿孔并摘除四头肌后，在指定的时间内杀死小白鼠。加入2ml溶解缓冲液(0.1％聚乙二醇辛基苯基醚，2mM乙二胺四乙酸，and 0.1M 3-HCl，pH值7.8)并用组织切割使肌肉得到均匀处理。在微量离心机急速离心2分钟后，表浮物(2微升)用来分析荧光素酶活性。在每个四头肌上，荧光素酶的活性以相对光单位呈现。为了分析凝胶过滤血小板，用CarlZeiss1000倍荧光显微镜检查并拍摄肌肉切片(10μm)(Zeiss，德国)。血液中循环hFIX的采集酶标记免疫吸附测定法决定。俘获抗体及小白鼠抗人因子IX多克隆抗体以1∶1200的比例用碳酸盐缓冲液稀释，并配以一只羊的抗人因子IX多克隆抗体GAFIX-APHRP(生物学的亲和力，Ancaster ON，Canada)以检测抗体。

2.2.3小白鼠的生物发光成像

在荧光素酶注入活体小白鼠腿中8天之后，使用生物发光/光学成像系统(异基因的，Alameda，CA)对小白鼠进行成像。数据表达单位为每单位四头肌中的相对光照单位(RLU)。在各个实验组内比较交流正弦波和直流方波的值，进行*p＜0.05和**p＜0.01的t检验。D-荧光素酶(ω-3多不饱和脂肪酸(EPA，DHA)，麦迪逊，威斯康辛州)在磷酸盐缓冲溶液中溶解并以150mg/kg的剂量在光产生前10分钟经腹腔注入小白鼠体内。全身麻痹会减少5％异氟烷，在有2.5％的异氟烷通过头锥体进入体内的过程中保持持续麻痹状态。

3.在体基因转导的实验结果

3.1基因表达水平的比较

分别用直流方波脉冲激励信号和交流正弦脉冲激励信号以不同电场强度施加到注射DNA后的肌肉组织上，观察它们对基因电转导效率的影响。结果如图16a所示，利用交流正弦波进行实验，脉冲宽度固定为600ms，当电场强度从10V/cm到30V/cm变化时，所有试验组的基因表达水平都得到了显著提高(p＜0.01)。结果还显示，与直流方波脉冲激励的结果相比，交流正弦波脉冲激励的荧光素酶表达水平提高了10到20倍。同时，荧光素酶的表达水平随着交流正弦波持续时间的增加而提高，并在持续时间达到600ms时达到最大值(图16b)。相反，利用直流方波脉冲法激励，其基因表达水平没有随着刺激时间的增加而提高。同样，对于活体动物大鼠在使用直流方波脉冲激励(左腿)和交流正弦波脉冲激励(右腿)将荧光素酶质粒转导到每条腿8天后进行的活体动物荧光素酶的表达成像(图16c)和对肌肉切片(10微米)在电转导10微克CMV-eGFP质粒(100X)5天后进行GFP表达的荧光图像(图16d)，也观察到用交流正弦波脉冲激励法可显著提高基因表达水平。

3.2基因电转导后肌肉损伤程度的分析

通过波形函数的积分运算可知，理论上正弦函数电流产生的热量只是方波产生热量的70％，故，引起的肌肉组织损伤比方波激励组的小。为检测肌肉损伤，在基因转导后5天采集样本，进行H&E着色(100X)，选取通电部位损伤最严重的肌肉组织切片(10微米厚)进行显微图像显示和评估。研究发现：用直流方波脉冲激励的试验组中发现有大面积的损伤(肌肉组织坏死)，而交流正弦波激励组的基因电转导引起的损伤则较小(图17)。为了确认组织学观测的正确性，从实施电转导后2小时的大鼠的血清样本中提取总肌酸激酶水平(CK)和骨骼肌损伤指标。在场强为30V/cm的情况下，交流正弦波脉冲激励组引起的CK减少量平均比直流方波脉冲激励组引起的CK减少量(p＜0.01)小37％。这与组织学分析结果相吻合，也与认为交流正弦波产生的损伤是直流方波产生损伤的70％的理论计算结果相符合。

3.3动态基因表达和基因转导到其他组织

交流正弦波基因转导的进一步描述包括DNA剂量的检测，基因表达的动态特性和转染到其他组织。为了评估DNA剂量对基因表达水平的影响，给大鼠注入不同剂量的荧光素酶DNA，然后利用交流正弦波进行激励。数据结果如图18所示，只要注入1毫克的DNA，肌肉内荧光素酶的表达水平就能探测到到达很显著的水平图18a。当注入的DNA多于5毫克的时候，基因的表达水平达到了一个高峰。如图18b所示，在荧光素酶DNA注射入6小时后可以探测到基因的表达并且在7天后达到了最大值。荧光素酶可以稳定的表达至少80天，但是第30天和80天之间的表达水平会低于峰值。尽管如此，80天后相同的肌肉通过二次基因电转染可以使基因表达达到原先的峰值水平。交流正弦波不仅使得未修饰的DNA转导到肌肉而且也转导到其他的组织。如图18c所示，用直流方波脉冲激励或者交流正弦波激励进行电转导后6个小时，在肝脏和皮肤可以探测到基因表达，20小时后在肿瘤里可以探测到。数据显示，尽管在这些组织里电转导的条件并不是最好。但是，与用直流方波激励的实验组相比，肝脏里的基因表达水平仍提高了8倍，皮肤和TC-1肿瘤(HPV16E7+，~0.7×0.8Cm²，C57BL/6 mice)中的表达水平则提高了10倍。

一些基因治疗法需要新生的基因转导，为此，用交流正弦波激励法将质体DNA转染到新生大鼠的皮肤，在电转导后4小时测得荧光素酶的表达如图18d所示。基因表达水平随着时间的推移而增加，在14小时后达到了峰值水平，此时皮肤的表达水平为1.1×10⁸RLU。基因转导后的动物行为包括接受母亲的哺乳情况显示它们很活泼、正常，且没有受到伤害。这些结果表明了这种基因治疗方法对婴儿使用是安全可靠的。

以上这些研究结果均显示：

1)电脉冲激励，使细胞膜的失稳态，打开和扩大其毛孔，允许像DNA、酵素和抗体这样的大分子进入细胞膜，增加了对细胞外分子的吸收；

2)电泳力在促使DNA跨细胞膜移动方面不起作用。因此，正弦波脉冲激励可以使在体的电基因转导在远低于人体安全电压(36V)的条件下(通常施加20V/cm的电场强度)，获得高于直流脉冲激励产生的基因转导效率的10倍；

3)本发明所述的在体基因转导装置可方便，并广泛地应用在电基因脉冲转导药物的临床试验中。它提供的高效、安全的基因转导方法将为今后开展对人类疑难疾病的在体基因治疗开辟了新途径。

Claims (5)

1.一种在体基因转导装置，其特征在于，该装置包括：

一带有双注射器针管的双电极针头，用于给肌肉组织注射DNA以及给DNA所在之处的肌肉组织施加具有特定参数的激励电场；双电极针头通过输出接口分别与激励信号源正负输出端相连，以接收来自激励信号源的激励脉冲信号；

一激励信号源，用以产生正弦波脉冲和方波脉冲两种激励信号，激励信号的幅度在10V-50V范围内可调，脉冲宽度在10ms-1000ms之内可调，脉冲间隔也在10ms-1000ms之内可调；一次激发的脉冲数量在1-10个之内可调；

一微处理机，微处理机连接有斩波器，用以对激励信号进行控制和调节，根据设定的激励参数控制系统进行斩波操作，以产生符合激励参数设定要求的不同的激励信号；微处理机连接有键盘输入与显示模块，其中，输入模块用以实现刺激参数的设定，显示模块用以指示当前设定的特殊的刺激参数。

2.如权利要求1所述的在体基因转导装置，其特征在于，所述的微处理机内有支持软件，软件包括：

1)支持产生高压、脉宽可调的交流正弦波脉冲信号的斩波控制软件；

2)支持产生高压、脉宽可调方波脉冲信号的斩波控制软件；

3)支持产生每次输出脉冲数可调的控制软件；

4)键盘管理模块：用于对实验参数进行设定、查询、修改和删除；

5)显示器管理模块：用于监视设定的参数和出错报警。

3.如权利要求2所述的在体基因转导装置，其特征在于，所述的软件由以下模块构成：

定时模块，用于实现以10ms为单位的软件定时功能；

显示模块，用于实现设定参数的显示功能；

参数设置模块，用于根据系统装置测到的键盘按键的状态变化来改变产生的刺激信号的参数；

波形输出模块，用以在设置好刺激信号的特殊参数后启动刺激信号的输出；

中断服务模块，使用51单片机的外部中断0，当发生中断时系统自动调用此模块进行中断处理。

4.如权利要求1所述的在体基因转导装置，其特征在于，所述的激励信号源为10V～50V电压/脉宽直流电压信号发生器或/和±10V～±50V电压/脉宽占空比可调的正弦波交流电压信号发生器。

5.如权利要求1所述的在体基因转导装置，其特征在于，所述的双注射器针管的双电极针头的间距为5mm～8mm。

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