JP2001500268A

JP2001500268A - 可変方向を有する電界で材料を処理する方法および装置

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Publication number: JP2001500268A
Application number: JP11502301A
Authority: JP
Inventors: ウォルターズ、リチャード，イー．; キング，アラン，デイ．; ウォルターズ，ダーリン，シー．
Original assignee: ウォルターズ、リチャード，イー．; キング，アラン，デイ．; ウォルターズ，ダーリン，シー．
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 2001-01-09
Also published as: ATE258980T1; EP0968275A1; EP0968275B1; WO1998056893A1; DE69727500T2; CA2263720A1; DE69727500D1; EP0968275A4

Abstract

(57)【要約】この発明の目的は、電界と追加された処理物質により、膜を有する物質を処理する方法と装置に関する。複数の電極（１２１−１２８）が、処理すべき材料の周りに配置され、かつ、電極選択装置（１１０）の出力に接続される。電極選択装置の入力は、電気アジャイルパルス発生装置の出力に接続され、処理物質が膜を有する物質に添加させる。電気パルスが電極選択装置に印加され、予め決められコンピュウター制御によって、一連の電極よりいくつかの電極が選択され、その際、膜を有する物質は、追加された処理物質と、順次変化する方向の電界により処理される。

Description

【発明の詳細な説明】可変方位を有する電界で材料を処理する方法および装置技術分野本発明は、原料（特に、生きている細胞）にパルスされた電界の定義されたパターンを印加する分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、特に、エレクトロポレーション，エレクトロフュージョンおよびエレクトロマニュピュレーションの分野に関連する。エレクトロポレーションとエレクトロフュージョンは、原核細胞および真核細胞の操作に種々に使用される現象に関する。エレクトロポレーションは、細胞膜を横切る短時間の電位（パルス）の印加による細胞膜の穿孔（destabalization ）である。正しく管理されていれば、穿孔の結果、細孔が存在する間に高分子が通ることができる一時的な細孔が膜にできる。したがって、エレクトロポレーションにおいて、膜包含物質の膜は、処理物質を入れるために開く。エレクトロフュージョンは、細胞膜を横切る短時間の電位の印加での少なくとも２つの細胞の融合である。エレクトロフュージョンにおいて、膜包含物質の膜は、他の膜包含物質の膜と融合するために開く。この点で、ある膜含有材料は、他の膜含有材料用の処理物質としてみなされるかもしれない。エレクトロフュージョンの物理的および生物学的パラメータは、エレクトロポレーションのそれらに似ている。細胞膜に印加される電位は、種々のパルス波形を供給す装置を使用して印加される。２つの最も共通のパルス波形は、指数関数的な減衰と矩形波とである。指数関数的な減衰パルスは、キャパシタンス放電パルスジェネレーターで発生させられる。それは、最も安価なパルスジェネレーターであって、操作者にパルス・パラメータを介して最少の制御を与える。矩形波パルスジェネレーターは、より高価で、パルス・パラメータを介してより多くの制御を与えて、細胞により死に至らしめないパルスを発生させる。両方のパルス波形について、細胞に修復可能な細孔を発生させるために必要なエネルギーは、細胞のサイズ，形および組成に関係する。エレクトロフュージョンで、細胞が膜穿孔の時点で接触しなければならない。これは、遠心のような物理的手段，抗体ブリッジングのような生化学的手段および誘電泳動を通した電気的手段によって果たされる。誘電泳動は、不均等な電界における細胞膜を横切る低い電圧電位の印加による細胞内の双極子の生成である。双極子は、ＤＣまたはＡＣ電場において生成することができる。ＤＣ電場は容認できない熱を発生させる傾向があるので、ラジオ周波数ＡＣは誘電泳動のためにたびたび使用される。エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンの使用は、多い。部分的なリストは、以下の通りである。（１）真核細胞および原核細胞の両方へのＤＮＡまたはＲＮＡの一時的導入、（２）真核細胞および原核細胞の両方へのＤＮＡの永久トランスフェクション、（３）遺伝子治療のための人間および動物細胞へのＤＮＡの永久および一時的トランスフェクション、（４）細胞への抗体，他の蛋白質類または医薬品の導入、（５）ハイブリドーマを生成する抗体の生成、（６）植物における花粉電気形質変換、（７）電気挿入、（８）動物胎児の操作、（９）付着細胞のエレクトロフュージョン、（１０）植物体細胞雑種の生産、（１１）ＤＮＡワクチン接種、および（１１）ガン治療。エレクトロポレーションまたはエレクトロフュージョンが働く方法の一つは、細胞膜にホールまたは細孔の形成を引き起こすことである。細胞への電気パルスの印加によって引き起こされる細胞細孔の正確な性質についていくつかの論争がある。しかし、実質的な効果は、引き起こされた細胞透磁率にあり、接近した接触にある他の同様に影響された細胞と融合する傾向である。細胞膜の融合におけるまたはそのための細孔の導入については直流電圧閾値がある。閾値以下の電圧は実質的な細胞膜障害をもたらさない。多くの細胞のための閾値電位は、細胞膜を横切る約１ボルトである。したがって、細胞膜を横切って１ボルトの電位を与えるために電極間でセンチメートルにつき印加される全直流電圧は、細胞の直径に比例する。より大きい細胞（例えば、多くの哺乳類の細胞）がいくぶんより低い電圧を必要とする間、小さい細胞（例えば、バクテリア）は高い直流電圧を必要とする。その細胞に必要とされる電圧に影響する細胞骨格の構造のような他の細胞に特定の変数がある。細胞のエレクトロポレーションまたはエレクトロフュージョンをもたらすのに十分強力であるＤＣ電気パルスを用いるとき、主な問題は、プロセスが細胞の容認できない割合でたびたび死に至らしめるということである。致死性率は、５０％と同じくらいかそれよりも高いかもしれない。細胞へのそのような高い致死率が好ましくないたくさんの理由がある。細胞が前の生きている遺伝子療法に更なる使用のために扱われるとき、細胞への致死性は、適切な数の細胞が治療の遺伝物質を取り込むことを妨げる。生体内遺伝子治療が患者に行われるとき、細胞への致死性は、ほとんど効果のない処置になるだけでなく、患者に危害を与えるかもしれない。たくさんの方法が、エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンにおける細胞殺傷を減軽するために用いられている。最も一般に用いられている方法は、指数関数的な減衰パルスにの代わりに矩形波形状のＤＣパルスを細胞に印加することである。この方法は、閾値を超えるのに十分な直流電圧を印加している間に細胞に印加される全エネルギーを減軽する。矩形波形状のパルスは改良したが、細胞に電気エネルギーを効果的に印加している間にまだ相当な細胞殺傷がある。エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンのために現在市場に出されている矩形波パルサーは、たくさんの調整可能パラメータ（電圧，パルス幅，パルスの合計数およびパルス周波数）をもつ。一旦セットされたならば、これらのパラメータは各パルス・セッションにおける各パルスに対して固定される。例えば、１，０００ボルト／センチメートル，２０マイクロ秒のパルス幅，１０に等しいパルス数および１Ｈｚのパルス周波数の電圧が選ばれるならば、１０のパルスの各々が、パルス・セッションに対して１，０００ボルト／センチメートルおよび２０マイクロ秒で固定される。しかしながら、固定されたパルス・パラメータを使用する矩形波パルサーを用いるときでも、細胞の望ましくなく高い致死率がまだ生じるかもしれない。この点で、細胞の致死率がかなり減軽されろように波形パルスが制御されることができるならば、それは望ましいだろう。 “Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cell”と題する Sukharevらによる記事（Biophys．J.，第６３巻，1992年１１月，１３２０〜１３２７頁）には、３台の発電機がＤＣパルスを発生させるために使われることの開示がある。遅延発生器は、第１のパルジェネレーターを制御して、生物学的Ｃｏｓ−１細胞に印加する第１のＤＣパルスを発生させる。遅延発生器は、時間遅延を発生したのち、第２のパルスジェネレーターを制御して、細胞に印加される第２のＤＣパルスを発生させる。第２のＤＣパルスは、第１のパルスから形成された誘発された細孔を維持するために不十分である。しかしながら、第２のパルスは、前にパルスされた細胞にＤＮＡ物質の電気泳動をもたらすのに十分である。いくつかのキーポイントは、Sukharevらの論文における開示に関して注意される。まず、第１のパルスの結果として細胞に形成された誘発された細孔は、誘発された細孔を維持するのに十分な付加パルスを細胞に印加することなしに、第１のパルスが終了した後に、収縮し始める。第２に、Sukh arevらの論文は、誘発された細孔形成パルスの後に、細胞生存能力の問題に関係しない。第３に、Sukharevらで与えられるパルスは２つだけである。したがって、ＤＮＡ物質が細胞に入ることができる時間は、２つだけの短時間パルスの効果によって制限される。この点で、エレクトロポレーションにおいて形成された誘発された細孔を維持するパルス・プロトコルが与えられるならば、それは望ましいだろう。さらに、エレクトロポレーションを受けた細胞に細胞生存能力を改善する方へ向けられたパルス・プロトコルが与えられるならば、それは望ましいだろう。さらに、エレクトロポレーションを受けた細胞に物質が入る時間をもっと許すために、少なくとも３つのパルスを与えるパルス・プロトコルが与えられるならば、それは望ましいだろう。 “Somatic Hybridization between Humanand Mouse Lymphoblast Cells Produ ced by in Electric Pulse-Induced Fusion Technique”と題されたＳ.大野らによる記事（細胞構造と機能，第９巻，1984年，１９３頁〜１９６頁）に、一緒に生物学的細胞を溶かす100ｋＨｚで０．８ｋＶ／ｃｍの交番電界の使用が開示されている。交流が一連の電気パルスを与える点に注意する。この一連の電気パルスはすべて、同じ持続期間，同じ大きさおよび同じパルス間隔を有する。 “Optimization of Electroporation for Transfection of Human Fibroblast CellLines with origin-Defective SV40 DNA:Development of Human Transform ed Fibroblast Cell Lines with Mucopolysaccharidoses(I--VII)”と題されたオカモトらによる記事（細胞構造と機能，第１７巻，１９９２年，１２３頁〜１２８頁）には、いろいろな電気パラメータが最適条件エレクトロポレーションを得るためにテストされた開示がある。電気パラメータは、電圧，パルス持続期間，パルス数およびパルス波形を含む。選択された電気パラメータのどんな特別なセットに対して、選択されたパラメーターをもつパルスのすべてが同じ持続期間，同じ大きさおよび同じパルス間隔を持つ点に注意される。 “Replacement of the macronudear ribosomal RNA genes of ａ mutant Tetr ahylmena using electroporation”と題されたOriasらによる記事（遺伝子，第７０巻，１９８８年，２９５頁〜３０１頁）には、２台の異なるエレクトロポレーション装置が使用される開示がある。各エレクトロポレーション装置が各エレクトロポレーション・ラン用の一連の電気パルス（パルス列）を与える点に注意される。どんな特別なエレクトロポレーション・ランに対しても、パルス列のパルスのすべては同じ持続期間，同じ大きさおよび同じパルス間隔を持つ。 “High-voltage electroparatian of bacteria:Genetic transformation of C ampylobacter jejuni with plasmid DNA”と題されたミラーらによる記事(Proc. Natl.Acad.Sci USA，第85巻，１９８８年２月，８５６頁〜８６０頁）には、いろいろな電気パルス・パラメータが最適条件エレクトロポレーションを得るためにテストされた開示がある。電気パルス・パラメータは電界強度と時定数とを含む。選択されたパルス・パラメータのどんな特別なセットに対しても、選択されたパラメーターをもつパルスのすべてが同じ電界強度と同じ時定数とを持った点に注意される。 “Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with roun d spermatids”と第されたOguraらによる記事（Proc.Nitl.Acad.Sci USA，第91 巻，1994年８月，7460頁〜7462頁）には、ダルベッコのPBS媒体へのＡＣ（２ＭＨｚ，１０秒間の２０〜５０Ｖ／ｃｍ）およびＤＣ（８０マイクロ秒間の1５００Ｖ／ｃｍ）パルスの露出によって卵母細胞が電気励起された開示がある。続く電気励起で、細胞はダルベッコのPBS媒体から離され、Hepes/Whitten媒体に置かれ、一つの精子細胞で注入された。卵母細胞スーパーマティッド（oocyte-spermatid）対は、融合媒に置かれ、体ＡＣパルス（２ＭＨｚ，１５〜３０秒間の1００Ｖ／ｃｍ），融合ＤＣパルス（１０マイクロ秒間の３７５０〜４０００Ｖ／ｃｍ）および次のＡＣパルス（２ＭＨｚ，１５〜３０秒間の１００Ｖ／ｃｍ）のシーケンスに露出された。卵母細胞活性化パルスとｏ卵母細胞スーパーマティッド融合パルスとの印加の間の時間間隔は、１５〜４０分であつた。いくつかの点は、Oguraらの論文の開示に関して注意される。最初に、エレクトロポレーションは管理されない。その代わりに、エレクトロフュージョンは管理される。さらに、卵母細胞への精子細胞のエントリは、エレクトロポレーションではなく注入によってである。第２に、２つだけのＤＣパルスが使用される。ＡＣパルスのいずれも、エレクトロポレーション閾値を与えるのに十分な電圧レベル（例えば、２００Ｖ／ｃｍ）を有しない。２つのＤＣパルスのシーケンスは、誘発された細孔形成を具備するとして開示されていない。細孔形成は、細胞融合のこの方法に役立たない。規定は、形成された細孔を維持するか、扱われる細胞の生存能力を維持するためにはない。 “Optimization of electroporation for transfection of mammaliancell li nes”と題されたAndreasonらによる論文（Anal.Biochem，第１８０巻，No.２，２６９頁〜２７５頁、１９８９年８月）には、矩形波パルスを用いたエレクトロポレーションによるトランスフェクションが、指数的に減少するパルスと反対に、反復パルスによってかなり増やされるとわかったとの開示がある。異なるパルス振幅は、異なる電界強度の効果を決定するために異なる実験ランにおいて試された。所定の実験的ランのために、各ＤＣパルスは、他の各ＤＣパルスと同じ電圧と同じ持続期間とを有する。 “Transdermal Delivery of Metoprolol by Electroporation”と題するVanbe verらによる記事（Pharmaceutical Research，第１１巻，Ｎｏ１１，１６５７頁〜１６６２頁，１９９４年）には、エレクトロポレーションが皮組織を横切って薬を供給するために用いられることができるという開示がある。論文は、最適のエレクトロポレーション条件を決定する目的で一連のエレクトロポレーション実験を開示する。指数的に減衰している容量性の放電に基づいて３種類のパルスを作り出すために、プログラムされたエレクトロポレーション装置が使用された。一つのＨＶパルス（３５００Ｖ〜１００Ｖの範囲）と、一つのＬＶパルス（４５０Ｖ〜２０Ｖの範囲）と、第１のＨＶパルス，インターパルス遅れ（１秒）からなるツイン・パルスおよび第２のＬＶパルスとである。２以上のパルスが印加されるならば、それらは１分までに分離された。印加されるパルスのどれも形状は矩形ではない点に注意される。対のパルスを用いて、実際の実験において、第２のＬＶパルスは、１００ボルト（１６５９頁の図１および図２を参照）の３つのパルス振幅をもつ。なされた実際の実験の結果の比較結果として、「単一パルスは、メトプロロール（metoprolol）浸透性を助成するために対のパルスと同じように効果的であり、対のパルスの印加が必要でなかったことを示している」と１６５９頁の第２のカラムで結論付けられている。さらに、同じ頁の同じカラムで始まり１６６０頁の第１のカラムまでの更なる結論は、「低い電圧での長いパルス（６２１±３９ｍｓ）は、メトプロロール（metoprolol）浸透性を助成するために、短いパルス時間（３．１±０．１ｍｓ）の高電圧パルスよりもはるかに効果的であった」と述べている。１６６０頁の第１のカラムの第１のパラグラフで始まる部分で、著者は、「数百ボルトで数ミリ秒の時定数のパルスが経皮浸透性についてドラマティックな効果を有すると報告されているが、この研究で用いられた短い高電圧パルスはほとんどどんな効果も持たなかった。」と述べている。明らかに、Vanbeverらは、異なる振幅のパルスをもつパルス列を用いることから離れることを教える。さらに、Vanbeverらの論文は、エレクトロポレーションを受けている細胞のために細胞生存能力の問題に関係しない。 “Addition of serum to electroporated cells enhances survival and transfection efficiency”と題されたBahnsonらによる論文の抄録（Bioc hem.Biophys.Res.Commun,第１７１巻，Ｎｏ．２，７５２〜７５７頁，１９９０年９月１４日）には、血清はエレクトロポレーションされた（electroporated）細胞の膜を迅速に閉じる（reseal）ことと、エレクトロポレーションに続く血清のタイムリーな追加が細胞生き残りおよびトランスフェクシヨン効果を向上することとを開示する。血清の使用を必要とするよりはむしろ、細胞生き残りおよびトランスフェクション効果を向上するのに電気的方法が与えられることが好ましい。 “Electroporation:parameters affecting transfer of DNA into mammalian cells”と題されたKnutsonらによる論文（Anil.Biochem，第１６１巻，Ｎｏ．１，４４〜５２頁，１９８７年７月）の抄録には、高電圧放電波形が立上り時間，ピーク電圧および立下り時間に関して変えられる装置を開示する。哺乳類の細胞が複数の電圧放電に晒されるテストがなされた。しかし、複数の露出はＤＮＡ転移を向上させなかった。複数のパルスの使用で、各パルスが他のパルスと同じ電圧および同じ持続期間をもつ点に注意される。 “Effects of pulse length and pulse strength on transfection by electroporation”と題されるKubiniecらによる論文（Biotechniques，第８巻，Ｎｏ．１，１６〜２０頁，１９９０年１月）の抄録には、パルス電界強度Ｅとパルス長１／２τ（指数関数的な減衰するパルスの半減衰時間）の比較的重要性がヘルまたはHUT-78細胞に対して研究されたことを開示する。理論的には、エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いる開示はない。数年の間、たくさんの革新が電界およびエレクトロポレーション，エレクトロフュージョンおよび誘電泳動とについてなされ、以下に述べる米国特許はそれらの革新の一部の代表である。米国特許4,441,972号は、均一でない電界を与える特別に設計された電極を含むエレクトロフュージョン，細胞ソーティングおよび誘電泳動の装置を開示する。均一でない電界は、細胞をソートするために用いられる。特に、少なくとも一つの電極は、複数の実質的に同心円の溝を含む表面を有する。そのような同心円の溝を包含している電極の準備は高価で時間がかかるかもしれないので、同心円の溝を含む電極の使用なしに、生きている細胞に印加される電界にバリエーションを与えるエレクトロフュージョン装置が与えられることができるならば、それは望ましいだろう。米国特許4,441,972号の装置は、誘電泳動によってソートしている細胞のために用いることができる。細胞ソーティングについては、電極に印加されるＡＣ電圧の周波数および強度は、コレクションのために望ましい細胞が開孔部から所定の放射距離に達したのちに、電界が緩められたときに出口部分を通って引き揚げるように変えらたかもしれない。ＤＣ電気パルスは、細胞ソーティンのために用いられる。米国特許4,141,972号の装置は、また、エレクトロフュージョンのために用いられることができる。この使用方法については、低いＡＣ電圧は、細胞が電極間で隣接して整列するために電極に印加される。典型的には、約２５０ｋＨｚで約１０ボルト／ｍｓの穏やかなＡＣ電界が用いられるかもしれない。その後、約５０マイクロ秒間に約１０〜約２５０ボルトのＤＣの一つの短時間パルスが、整列された細胞の融合を引き起こすのに印加されるかもしれない。その特許は、インパルスの周波数，電圧および継続時間が、ソートされたか融合された細胞の型および大きさに従って、または、用いられるキャリヤー・ストリームの型に従って調整されるかもしれないことを明らかにする。その特許には、コンピュータを含むいろいろな装置が電極への入力周波数およびと電圧を制御するために用いられることができるという開示がある。しかしながら、米国特許4,441,972号には、エレクトロフュージョンに払われている特別な注意について、エレクトロフュージョンを実施するための一つ以上ののＤＣパルスを用いるという開示はない。米国特許4,476,004号が米国特許4,441,972号に密接に関連しているとともに類似した開示をもつ点に注意される。米国.特許4,695,547号は、エレクトロフュージョン，エレクトロポレーションなどのための探針（プローブ）を開示する。高電圧パルスの適当な電源が、１アンペアまでの電流と１〜９９０ミリ秒の継続時間で２５〜１７５ＤＣの範囲の出力電圧パルスを与えることができるとして開示されている。エレクトロフュージョンまたはエレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許4,750,100号は、エレクトロポレーション用の指数関数的に減衰するパルスまたは矩形波パルスを供給することができる高電圧および高アンペア・スイッチ素子を開示する。エレクトロポレーションまたはトランスフェクションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許4,832,814号は、生きている細胞のエレクトロフュージョンを行うために用いられるエレクトロフュージョン細胞を開示する。電源は、一連の３つのＤＣパルス（それぞれ１２マイクロ秒で，１秒のパルス間隔をもつ６８ボルト）を与える。各ＤＣパルスが他のＤＣパルスと同じ電圧および同じ持続期間をもつ点に注意される。米国特許4,882,281号は、エレクトロフュージョン，エレクトロポレーションなどのための探針を開示する。上述した米国特許4,695,547号に開示されているように、高電圧パルスの適当な電源が１アンペアまでの電流および１〜９９０ミリ秒の継続時間で２５〜１７５ＤＣの範囲で出力電圧パルスを与えることができるとして開示されている。エレクトロフュージョンまたはエレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許4,910,140号は、短い持続期間の高強度電界を印加することによる原核細胞のエレクトロポレーションの方法を開示する。この特許は、パルスが所望の全期間を含む単一パルスから通常なることを明らかにする。代わりに、パルスは、所望の２〜２０ｍｓｅｃで来る累積時間をもつ複数のより短いパルスからなるかもしれない。結合された効果が細胞壁の透過になるように、そのような一連のパルスはお互いの近くに十分に間隔をあけられなければならない。典型的には、そのようなパルスは５ｍｓｅｃ以下まで離れて間隔をあけられる。より好ましくは、２ｍｓｅｃ以下まで離される。米国特許4,955,378号は、生体内エレクトロフュージョンを実施するための動物または人間の解剖サイトにパルスを供給するための電極を開示する。それは、一般に、エレクトロフュージョンが、２０ボルトの振幅および１パルス／秒のパルス・レートでの２０マイクロ秒持続期間の３つの方形波を電極に印加して一定の電圧条件下で好のましくはなされることを開示する。各ＤＣパルスが他のＤＣパルスと同じ電圧および同じ持続期間をもつ点に注意される。米国特許5,007,995号は、生きている細胞のエレクトロフュージョン用の装置を開示する。ＤＣパルスを用いる代わりに、ＡＣパルスが使用された。一連の研究は、ＡＣ周波数，印加されたＡＣ電圧およびＡＣパルスの継続期間の変数間で行われた。各研究では、３つの変数のうちの２つは一定の状態に保たれ、１つの変数は異なる徐々に増加する設定でその変数を設定することによって変えられた。エレクトロフュージョンを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,019,034号は、組織に大きい分子を運搬する目的で組織をエレクトロポーレーションする方法を開示する。カエルの皮が、一例として用いられる。エレクトロポレーションを実施する際に、パルスの形状，持続期間および周波数が選択される。ピーク電圧は、また、初期設定で置かれる。エレクトロポレーションが起こるまで、パルスはより高い電圧に徐々に循環される。その点、パルス波形，持続期間、周波数および電圧は、所望の量の分子移転が起こるまで維持される。米国特許5,124,259号は、塩化物イオンが排除される特に定義されたバッファを用いているエレクトロポレーションの方法を開示する。エレクトロポレーションを実施する際に、電圧が１００〜１０００ｖ／ｃｍで、電圧を印加するための時間が０．１〜５０ミリ秒であるという開示がある。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,128,257号は、いくつかの試験槽と、エレクトロポレーションのために用いた電極とを開示する。電力供給は、２００から２０００ボルトまでの電圧範囲を与える。パルス幅は、０．１から１００ミリ秒までの範囲、好ましくは１から１０ミリ秒までの範囲である。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,131,070号は、細胞が培養される特別に覆われた電極を開示する。電極上の細胞はエレクトロポレーションにかけられる。エレクトロポレーションを実施する際に、電界強度を計る装置は、細胞が穿孔するまで増加す電位を印加することができ、また、どの電界で細胞が穿孔したかを検知できる「知的な」エレクトロポレーション装置が与えられるように、マイクロプロセッサーに適切にインターフェースされる。装置が穿孔を引き起こすのに必要な条件を測定し、穿孔が起こるときを検出するので、穿孔を引き起こすのに十分なエネルギーだけがシステムに導入されてから、現在の調停された細胞死に相当な減少が生じる。しかしながら、エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示がない点に注意される。それに加えて、エレクトロポレーション装置は、いろいろな細胞線のために必要とされる穿孔電位に関係している情報と、起こるかもしれない穿孔の型および大きさについてのいろいろな中間構成物の効果とを記録することができる。しかしながら、供給は、引き起こされた細孔形成維持するためなされていない点に注意される。米国特許5,137,817号は、生体内にエレクトロポレーションを行うために特別に設計された電極を用いたエレクトロポレーションの装置および方法を開示する。エレクトロポレーションを実施する際に、一つのＤＣ電圧パルスが宿主細胞に印加される。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,173,158号および米国特許5,283,194号はそれぞれ、選択的にあるサイズの細胞を許し他を除外する電極を使用するエレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンのための装置および方法を開示する。単一パルスは、エレクトロポレーションを起こす電界を発生させる。エレクトロポレーションまたはエレクトロフュージョンを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,186,800号は、上述した米国特許4,910,140号でなされたように、短期間の高強度電界を印加することによる原核細胞のエレクトロポレーションの方法を開示する。米国特許5,186,800号も、印加されたパルスが、所望の全期間を含む単一パルスから通常なることを開示する。代わりに、パルスは、所望の２〜２０ｍｓｅｃの範囲で起こる累積時間をもつ複数のより短いパルスからなるかもしれない。結合された効果が細胞壁の透過となるように、そのような一連のパルスはお互いの近くで十分に間隔をあけられなければならない。典型的には、そのようなパルスは５マイクロ秒以下まで離され、好ましくは２マイクロ秒以下まで離れる。一連の実験は、最大細胞転移を与えた方法パラメータを確かめるために行われた。核実験において、一つの電気パルスがエレクトロポレーションをもたらすために用いられた。実験的なパラメータは、電気パルス，宿主細胞の密度，転移材料の密度およびポスト・ショック潜伏期間のたくさんのパラメータを含んだ。エレクトロポレーションを受けている細胞の生存能力と転移能力（transfor mability）がパルスの初期電界強度に非常に敏感であることが観察された。達した結論は、細胞生き残りは電界強度を増やすことで着実に下がるということであった。また、行われた核実験では、最大転移効率は細胞の３０〜４０％がパルスを耐えぬくと結論された。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。上述したことを考慮して、４０％を超える細胞がエレクトロポレーションを実行しているパルスを耐えぬくときに最大転移率が達せられるエレクトロポレーションの方法が与えられたならば、それは望ましいだろう。米国特許5,211,660号は、生体内エレクトロフュージョンを行う方法を開示する。使用された直流電流電荷の電気的パラメータに関する詳細は開示されていない。米国特許5,232,856号は、特別に設計された電極を使用するエレクトロポレーション装置を開示する。たくさんのエレクトロポレーション実験が、たくさんの異なる宿主細胞と異なる転移材料を用いて行われた。各実験において、一つのＤＣパルスだけが宿主細胞に印加された。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,273,525号は、薬と遺伝子供給のために注射器ベースのエレクトロポレーション電極を開示する。エレクトロポレーション電極を用いる際に、一定のパルス振幅，一定のパルス幅および一定のパルス間隔を有する１〜１００の連続的パルスを与える従来の電源が使用されている。米国特許5,304,120号および米国特許5,318,514号はそれぞれ、人に生きている細胞の生体内エレクトロポレーションにのための電極を開示する。エレクトロポレーションをもたらすために電気エネルギーを印加する際に、電源は、好ましくは、電界を繰り返し印加し、また、電界の振幅および持続期間は、薬または遺伝子が生きている細胞を殺すことなくそれらに入るのに細胞の壁を十分に浸透させる。電源は、単極発振パルス列と二極発振パルス列とを含む。選ばれたパルス列に対して、各パルスは、パルス列の他のパルスと同じ電圧に上昇し同じ持続期間をもつ点に注意される。たくさんの理論的な考察とたくさんの既知の発明開示を説明したが、注意は、生物学的細胞への細孔形成の導入に関するある理論的な概念の更なる議論に戻る。しかしながら、ここで討論される理論的な概念のどれも本発明の範囲を規制するつもりでないことが理解される。その代わりに、本発明の範囲は、クレームとその等価物とによってのみ制限される。パルス・セッションの間にパルス・パラメータを変えることは、エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョン効率を維持するか向上させる間の細胞への損傷を減少させることが、本発明の発明者によって発見された。減軽された細胞損傷は、細胞に印加される減少されたエネルギーに関係させることができる。特に、パルス当りに印加される全エネルギーを決定する２つのパラメータは、パルス振幅とパルス幅とである。パルス幅のバリエーションは、パルス振幅のバリエーションと異なる効果を有する。、より広いパルスの印加に続くパルス幅の減少は、一連のパルスの全エネルギーを減少する間の上記のスレッショルド電圧の印加を許す。さらに、以下に記述される理論的な理由のために、細胞にすでに形成される細孔のメンテナンスは、新しい細孔を起こすのに必要とされるエネルギーよりも少ないエネルギーを必要としなければならない。上記のスレッショルド電圧を維持している間のパルス幅のバリエーションは、非常に小さい細孔がより広いパルスによって起こされるそれらの例において特に役に立つ。より狭いパルスは、制御された方法に細孔伸張を援助することができた。任意の特別な種類の細胞のための理想的な条件は、外の分子（例えば、小さい有機的分子またはＤＮＡ）が回復不可能なサイズに細孔サイズを伸張することなしに細胞に入れるのに十分な大きさのサイズに細孔伸張を起こす一組の電気パルス・パラメータを見つけることであろう。この目標を果たすパルス・パラメータは、各細胞の型について実験的に決定されなければならない。パルス振幅のバリエーションは、下記の閾値メンテナンス・パルスの印加を許す。一旦上記のスレッショルド電圧に対する十分なエネルギーのパルスが細胞に印加されるならば、細胞膜を横切る電気抵抗に一時的な減少が起こる。細胞膜の減少された電気抵抗のため、閾値以下のパルス電圧は、上記の閾値パルスによって引き起こされる細胞細孔を維持するのに十分でなければならない。このように、先行技術の実体はエレクトロポレーションを引き起こすために電気パルスを用いることは公知であることを示すが、上述の先行技術は、望ましい特徴の以下の組合せを持つパルスされた電界で物質を処理する方法を示唆も教示のしない。(1)電気的パルスが減少された細胞致死性をもたらす生きている細胞への一連の電気パルスの印加のためのプロセスを与える；(2)電気パルス装置のオペレーターに印加されたパルス・シリーズの最大オペレータ制御のためのプロセスを与える；(3)一連の電気パルスの間にパルス幅を変化するプロセスを与える；(4)一連の電気パルスの間にパルス電圧を変化するプロセスを与える；(5) プロセスの制御する機械を与える；(6)は、エレクトロポレーションで形成される引き起こされた細孔を維持するパルス・プロトコルを与える；(7)原料がエレクトロポレーションを受けている細胞に入るためにより多くの時間を許すために少なくとも３つのパルスを与えるパルス・プロトコルを与える；(8)細胞生存率およびトランスフェクション効率を向上させる電気的方法を与える；(9)４０％を超える細胞がエレクトロポレーションを実行しているパルスを耐えぬくとき、最大転移効率が達成されるエレクトロポレーションの方法を与える。前述の所望の特性は、以下の説明から明らかなように、本発明のパルスされた電界で原料を処理するユニークな方法によって与えられる。先行技術を超える本発明の他の利点も、明白になる。ここで、エレクトロポレーションされている原料に加えられる処理物質の他の態様に着目すると、Gunter，A.Rofmann，Sukhendu B.Dev，Gurvinder S,Nandaによる論文“Electrochemotherapy:Transition from Laboratory to the Clinic” （IEEE工学，薬と生物学，１９９６年１１月／１２月，１２４〜１３２頁））には、生体内器官の周りに配置された一組の電極に印加される電界の方向を変える機械的スイッチング配置の開示がある。機械的スイッチング配置は電極の６個のニードル列の電極を機械的に選択する機械式回転スイッチの形である。そのような機械的スイッチング配置は、点火栓にエネルギーを割り当てるために自動車分配器に近い関係を負う。そのような機械的スイッチング配置は、電極用のパルス・パターンの選択可能なシーケンスに広いバリエーションを許さない。エレクトロポレーションの電界を除いて、電界の方向を逆転させる概念は、心臓の電気除細動，電気的除細動，ゲル電気泳動およびフィールド逆転毛管電気泳動のようなたくさんの分野で使用されている。心臓応用に関して、Kallokの米国特許5,324,309号は、電気除細動と電気的除細動のための方法および装置を開示する。この方法を用いることに、複数のパルスは、動物の心臓のまわりの場所の配列に置かれる複数の電極に向けられる。スイッチ素子を制御するマイクロプロセッサーはパルスを所定の電極に向ける。Kallokの方法および装置の目的は、細動または他の導電問題が補正されるように心臓の電気系統を修正することである。Kallokは、心臓に処理物質を加えることを開示しない。この点で、Kallok は、電界を変えることは心臓による処理物質の取り込みを助けることを明らかにしない。ゲル電気泳動に関する重要な問題として、異なる方向からの電界は、比較的長い期間（例えば、０．６〜１２５秒）にわたって、また、比較的低い電圧（例えば、３．５〜２０Ｖ／ｃｍ）で印加される。また、フィールド逆転毛管の電気泳動に関する重要な問題として、逆方向電界は、比較的長い期間（例えば、２秒）にわたって、また、比較的低い電圧（例えば、５０Ｖ／ｃｍ）で印加される。さらに、ゲル電気泳動とフィールド逆転毛細管電気泳動に関して、膜含有材料は( 例えば、細胞，組織，器官およびリポソーム)は処理を受けない。発明の開示電気パルスシーケンスは、それらの電位可変性にほとんど無限である。大きい種類のパルスシーケンスは、電気通信とレーダの分野で用いられる。例えば、パルスシーケンスは連続でありえる。連続パルスシーケンスは、単極でも双極でもありえる。パルスシーケンスは、矩形波または方形波または矩形波の特殊ケースを含むことができる。所定の数の矩形形パルス（ユニポーラかバイポーラ）は、ゲートで制御されるかバーストされたパルス・シーケンスに与えられる。パルスシーケンスでは、パルスは、異なるレベルの振幅（パルス振幅変調）で与えられることができる。これは、この型のパルス列は計算機通信でモデムおよびコンピュータに一般に用いられる。パルスは、異なるパルス幅または持続期間（パルス幅変調）で与えられることができる。そのような場合、一定のパルス間隔が維持される。パルスは、異なるパルス間隔（パルス間隔変調）で与えられることができる。そのような場合、一定のパルス幅が維持される。電気パルス・シーケンスの特定のカテゴリーは、「鋭敏なパルスシーケンス」として知られている。この特許の目的として、定義によって、鋭敏なパルスシーケンスは、以下の特性を持つ：(1)シーケンスのパルスの数は２〜１，０００まで変動する；(2)シーケンスのパルスは形状が矩形である；(3)シーケンスの各パルスはパルス幅をもつ；(4)シーケンスのパルスの始めと次のパルスの始めとの間にはパルス間隔がある；(5)シーケンスのパルスのためのパルス振幅は、１００ボルト以上であり、好ましくは２００ボルト以上である；(6)パルス極性は、シーケンスのパルスに対して単極でもバイポーラでもよい。存在するかもしれない鋭敏なパルスシーケンスのもう一つの特性は、シーケンスの方形パルスの「オン」時がパルス間隔の１０％未満であるということである。鋭敏なパルスシーケンスがコミュニケーションおよびレーダ応用に使用されたけれども、鋭敏なパルスシーケンスは原料を処理するためには使用されなかった。特に、材料のよく定義され制御された永久または一時的変化を起こす触媒として変えられ操作され機能するよく制御された強度の電界を与えるために物質を処理するのに鋭敏なパルスシーケンスを使用することは、先行技術は開示しないは、本発明は与える。特に、本発明によると、パルスされた電界による原料（特に、有機的原料）を処理する方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスをもつ鋭敏なパルスシーケンスを物質に印加するステップを含み、鋭敏なパルスシーケンスは以下の特性のうちの１つ、２つまたは３つを有する。(1)少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる；(2)少なくとも３つパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる；(3)少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組についての第１のパルス間隔は、少なくとも３つパルスの２つの第２の組についての第２のパルス間隔と異なる。特に、本発明によると、パルスされた電界による原料（特に、有機的原料）を処理するための方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有する鋭敏なパルスシーケンスを材料に印加するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つはパルス振幅が互いに異なる。本発明によると、パルスされた電界による原料（特に、有機的原料）を処理するための方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有する鋭敏なパルスシーケンスを材料に印加するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つはパルス幅が互いに異なる。本発明によると、パルスされた電界による原料（特に、有機的原料）を処理するための方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有する鋭敏なパルスシーケンスを材料に印加するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組についての第１のパルス間隔は少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組についての第２のパルス間隔と異なる。本発明の広いもう一つの面による、方法は細胞に細孔形成を引き起こすためにパルスされた電界で生物学的細胞を扱うために与えられる。方法は、それを具備している鋭敏なパルスシーケンスを印加するステップを含む細胞、鋭敏なパルスシーケンスが１を持つその点で、２または以下の特性のうちの３つに最少の３パルス：(1)少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅に互いから異なる；(2)少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス幅に互いから異なる；と、(3)少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットのための第１のパルス間隔は少なくとも３つのパルス（引き起こされた細孔が比較的長い期間のために維持されるようであるもの）のうちの２つの、一瞬セットされる第２のパルス間隔と異なると、細胞のそのようなその生存能力は維持される。より特に、本発明による、方法は細胞に細孔形成を引き起こすためにパルスされた電界で生物学的細胞を扱うために与えられる。方法は細胞に少なくとも３つのパルスを具備している鋭敏なパルスシーケンス、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つがパルス振幅に互いから異なるその点で、比較的長い期間のために維持されるそのようなその引き起こされた細孔怒りを印加するステップを含むと、細胞のそのようなその生存能力は維持される。本発明による、より遠く方法は、細胞に細孔形成を引き起こすためにパルスされた電界で生物学的細胞を扱うために与えられる。方法は細胞に少なくとも３つのパルスを具備している鋭敏なパルスシーケンス、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つがパルス幅に互いから異なるその点で、引き起こされた細孔が比較的長い期間のために維持されるようなものを印加するステップを含むと、細胞のそのようなその生存能力は維持される。また、本発明による、方法は細胞に細孔形成を引き起こすためにパルスされた電界で生物学的細胞を扱うために与えられる。方法は細胞に少なくとも３つのパルスを具備している鋭敏なパルスシーケンス、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットのための第１のパルス間隔が少なくとも３つのパルスのうちの２つの、一瞬セットされる第２のパルス間隔と異なるその点で、引き起こされた細孔が比較的長い期間のために維持されるようなものを印加するステップを含むと、細胞のそのようなその生存能力は維持される。また、本発明による、方法は細胞に細孔形成を引き起こすためにパルスされた電界で生物学的細胞を扱うために与えられる。方法は細胞に少なくとも３つのパルスを具備している鋭敏なパルスシーケンス、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットのための第１のパルス間隔が少なくとも３つのパルスのうちの２つの、一瞬セットされる第２のパルス間隔と異なるその点で、引き起こされた細孔が比較的長い期間のために維持されるようなものを印加するステップを含むと、細胞のそのようなその生存能力は維持される。鋭敏なパルスシーケンスが非正弦波の電気パルスのシーケンスのクラスであることは、上記の説明と関係ない。本発明の原則による、この点で非正弦波の電気パルス・シーケンスの他のカテゴリー使用する鋭敏なパルスシーケンスを除いて原料を扱うことのために。この点で、本発明のより広い面による、方法はパルスされた電界で材料を扱うために与えられてと、材料に200のＶ／ｃｍ100のＶ／ｃｍと好んで同等より大きいか等しい電界強度またはGTを具備して、少なくとも３つの非正弦波の電気パルスのシーケンスを印加するステップを含む。少なくとも３つの非正弦波の電気パルスのシーケンスは、１、２または以下の特性のうちの３つを持つ：(1)少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅に互いから異なる、(2 )少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス幅に互いから異なる、と(3)少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットのための第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの、一瞬セットされる第２のパルス間隔と異なる。好ましくは、材料は有機的な原料である。彼のもの、２または以下の特性のうちの３つの最少の３つの非正弦波の電気パルスでのシーケンス(1)少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅に互いから異なる、(2)少なくとも２の最少の３つのパルスが、パルス幅に互いから異なると(3)少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットのための第１のパルス間隔は少なくとも３つのパルス（引き起こされた細孔が比較的長い期間のために維持されるようであるもの）のうちの２つの、一瞬セットされる第２のパルス間隔と異なると、細胞のそのようなその生存能力は維持される。本発明のさらに別の面による、加算された穿孔にでと電界で穿孔せを扱う方法は、電界の方向が向上されてどちらであるかについて与えられる。エレクトロポレーションのフィールドに、重要な面は、電界が細胞表面のタンジェントに垂直である細胞の上に、最も大きい効果がサイトにあるということである。エレクトロポレーションが最も大きい所で、細胞への加算された穿孔のエントリは容易にされる。細胞が粗く丸いので、細孔がしたがって、通常形成されて、最も近い細胞のポール電極。接触する細胞表面の角度が電界とより平行になるとき、パルスの効果は減少する。そして、エレクトロポレーションの効果は最大限の効果のサイトからの90度離れてゼロ（完全な球の上で）になる。心にこれらの考察で、細胞への加算された穿孔のエントリが容易にされるそれによって最大限の電界に、電界方向の変化が細胞の異なる領域を陳列することは、換価された。電界の方向のこの変化は、細胞により多くの細孔の形成を引き起こしてとしたがって、エレクトロポレーション効率を増やす。本発明（電界の方向が向上される）の方法は、以下のステップの含まれる。複数の電極は、扱われる穿孔せのまわりで場所の配列に整えられる。電極は、電極選択に装置の出力に接続している。電極選択装置の入力は、鋭敏なパルスシーケンスにジェネレーターの出力に接続している。処理物質は、膜含有材料に加算される。電気パルスは、電極選択装置に印加される。印加されたパルスは、材料が加算された穿孔でとシーケンシャルに様々な方向の電界で扱われるそれによって電極の列に、選択された電極にあらかじめ決められたシーケンスに電極選択装置によって発送される。電極の列に選択された電極へのあらかじめ決められたシーケンスに電極選択装置による印加されたパルスのルーティングは、本発明でたくさんのやり方にされることができる。１種類のパルス経路選択に、第１のパルスは、第１の選択されたグループの電極に印加されることができる。その後、第２のパルスは、第２の選択されたグループの電極に印加されることができる。その後、第３のパルスは、第３の選択されたグループの電極に印加されることができる。この種類のパルス経路選択は、Ｎパルスのシーケンスが次々とＮ選択されたグループの電極に発送されることができると述べることによって一般化されることができる。例証として、まわりで配列される８本の電極が、あることがありえる生体内である組織。印加されるパルスは、ここで、100のＶ／ｃｍより大きいか等しい電界強度を具備して、少なくとも３つの非正弦波の電気パルスの高電圧の鋭敏なパルスシーケンスでありえるそれのシーケンス最少の３非正弦波の電気パルス１、２または以下の特性のうちの３つを持つ：(1)少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅に互いから異なる；(2)少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、異なるパルス幅に市街電車互い；と、(3)少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットのための第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの、一瞬セットされる第２のパルス間隔と異なる。鋭敏なパルスシーケンスの第１のパルスは、第１の、第３の、第５のと第７の電極に発送されることができる。鋭敏なパルスシーケンスの第２のパルスは、第２の、第４の、第６のと第８の電極に発送されることができる。鋭敏なパルスシーケンスの第３のパルスは、第１の、第２の、第４のと第５の電極に発送されることができる。選択されたグループのパルスからパルスへの８本の電極だけのバリエーションの可能な数は、装置付きの非常に大きい数と本発明の方法であろ。偶数のより多くの電極を用いろことは、可能なバリエーションのよりすばらしい番号さえ与える。この種類のパルス経路選択は、鋭敏なパルスシーケンスを含むＮパルスが次々とＮ選択されたグループの電極に発送されることができると述べることによって一般化されることができる。偶数のより広いステートメントは、あることができる効果にした、本発明で、鋭敏なパルスシーケンスに含むＮパルスが、Ｎ選択されたグループの電極にかぎまわられることができるあらゆる組合せとどんなオーダーにでも。もう一種類の生きている組織にのためのパルス経路選択に、ｌ第１の高電圧の鋭敏なパルスシーケンス・パターンは、第１の選択されたグループの電極に印加されることができる。その後、第２のパルスパターンは、第２の選択されたグループの電極に印加されることができる。その後、第３のパルスパターンは、第３の選択されたグループの電極に印加されることができる。この種類のパルス経路選択は、Ｎパルス・パターンが次々とＮ選択されたグループの電極に発送されることができると述べることによって一般化されることができる。もう一つの例がまだまわりで配列される８本の電極でそこでありえる、生体内である組織。第１のパルスパターンは、第１の、第３の、第５のと第７の電極に発送されることができてと第２の、第４の、第６のと第８の電極を経由して選出されることができる。第２のパルスパターンは、第１の、第２の、第４のと第５の電極に発送されることができてと残っている電極のどんな一つ以上でも経由して選出されることができる。選択されたグループのパルスパターンからパルスパターンへの８本の電極だけのバリエーションの可能な数は、装置付きの非常に大きい数と本発明の方法である。偶数のより多くの電極を用いることは、可能なバリエーションのよりすばらしい番号さえ与える。高電圧の鋭敏なパルス電気パルス処置にかけられる対象はいつである生体内である、細胞がelectroporatedされている、パルスの高電圧の鋭敏なパルスシーケンスに電界の方向が電極に印加した対象（例えば動物の（人間を含むこと）プラント組織または器官）は回転させられることができる、それによって‖エレクトロポレーションに生体内である、ボディ部は向上される。本発明のもう一つの面による、方法は膜含有材料を試験管内でを電界で処理するために与えられる。膜含有材料は、細胞、組織、器官とリポソームを含むことができる。本発明のこの試験管内方法は、ステップを含む：場所の配列に試験管内材料を整えること；配列に複数の電極を整えること場所は、試験管内の配列に該当する材料場所；電極選択に電極を装置の出力に接続すること；電気のパルサ装置の出力に電極選択装置の入力を接続すること；電気パルスを電極選択装置に印加すること；あらかじめ決められたシーケンスに電極選択装置によってパルスを印加される経路選択は、場所の配列に試験管内材料が場所の配列にシーケンシャルに電界で処理されるそれによって電極の列に、電極を選択した。本発明の試験管内方法を実行する１つの方法に、選択された電極に印加される少なくとも２つの連続したパルスは、電界方向に取り消される。本発明の試験管内方法を実行するもう一つの方法に、電極のＭ対がテストしているプレートにＭウェルで共同したとき、電極は配列される。本発明の試験管内方法を実行するもう一つの方法に、一対の電極がキュベットで共同したとき、電極は配列される。本発明の試験管内方法を実行するもう一つの方法に、Ｐ電極がキュベットで共同したとき、電極怒りが配列されて、ここで、Ｐは２より大きい。ＭがテストしているプレートにＭウェル（キュベット）のために、電極の対になるとき、電極が配列されるとき、高電圧パルス/電界は電極選択装置のコンピュータ制御によって、どんなオーダーにでもこれらのキュベットの何にでも発送されるかもしれない。これは、一度に１つのキュベットを用いることによって実験を進行するために大いに時を減軽している感度分析に例のために、多数の実験を進行するために用いられることができる。電気パルス処置にかけられる対象が細胞がelectroporatedされている、パルスのシーケンスに電界の方向がに取り付けた試験管内対象（例えばキュベット）であるとき、電極が回転させられることができて、エレクトロポレーションは向上されるそれによって。電極がシーケンシャルに取り消されることができて２本の電極が生物学的細胞が存在であるキュベットの反対側がエレクトロポレーションにかける、パルスのシーケンスに電界の方向がに取り付けたオンの位置決めをしたとき、電極が配列されるとき、エレクトロポレーションは向上されるそれによってまだ本発明のもう一つの面による、装置は原料を電気パルスで処理するために与えられる。従属する装置は、電気的に鋭敏なパルスシーケンス・ジェネレーターに接続している電極選択装置に、鋭敏なパルスシーケンス・ジェネレーター終わりを含む。電極選択装置は、電気的に鋭敏なパルスシーケンス・ジェネレーター、セットの少なくとも２つの出力コネクタと入力コネクタと出力コネクタの間で接続される選択可能なスイッチの列に接続しているセットの入力コネクタを含む。電極のセットは、電気的に電極選択装置の出力コネクタのうちの少なくとも２つに接続している。好ましくは、選択可能なスイッチは、プログラム可能なコンピュータ制御されたスイッチである。代わりに、選択可能なスイッチは、手で行使されたスイッチでありえる。簡単な説明が本発明のより重要な事項をむしろ広く述べる上記はそれについてそれに詳細な説明を注文する。そして、よりよくよく理解されているかもしれなくてと芸術に対する現在の貢献がよりよいかもしれないという命令に価値が上がったことになる。もちろん、以下に記述されると主題のためにある本発明の追加の特徴が、あるの主張この文書に追加する。上記から分かるように、本発明の目的は、生細胞に一連の電気パルスを印加する方法に電気パルスが還元した細胞致死率を生産するその点でを提供するパルスされた電界による治療方法原料提供することである。本発明のさらに別の目的は、治療方法原料に応用パルス系列の極大オペレーター制御のために、電気パルス機器のオペレーターにプロセスを提供するパルスされた電界を提供することになっている。本発明のもう一つの目的は、治療方法原料に一連の電気パルスの間、パルス幅をはるかに変更しているプロセスを提供するパルスされた電界を提供することになっている。本発明のもう一つの目的は、治療方法原料にプロセスを一連の電気パルスの間、パルス電圧を変更するために提供するパルスされた電界を提供することになっている。また、本発明のそれ以上の目的は、治療方法原料にプロセスの制御のために機械を提供するパルスされた電界を提供することになっている。なおさらに、本発明のもう一つの目的は、治療方法原料にエレクトロポレーションの中で形づくられる起因性気孔を支えるパルス・プロトコルを提供するパルスされた電界を提供することになっている。本発明のさらに別の目的は、治療方法原料に原料のためにより多くの時間がエレクトロポレーション.を経ているセルを入れるのを許すために少なくとも３つのパルスを提供するパルス・プロトコルを提供するパルスされた電界を提供することになっている。それでも、本発明のもう一つの目的は、治療方法原料にエレクトロポレーションの中で形づくられる起因性気孔を支えるパルス・プロトコルを提供するパルスされた電界を提供することになっている。本発明のさらに別の目的は、治療方法原料に原料のためにより多くの時間がエレクトロポレーション.を経ているセルを入れるのを許すために少なくとも３つのパルスを提供するパルス・プロトコルを提供するパルスされた電界を提供することになっている。それでも、本発明のもう一つの目的は、治療方法原料に細胞生存とトランスフェクション交換効率を改良するために電気のウェイを提供するパルスされた電界を提供することになっている。また、本発明のそれ以上の目的は、治療方法原料に40％を超えるセルがエレクトロポレーションを生じているパルスを耐えぬくとき、格言トランスフォーメーション交換効率がなしとげられるエレクトロポレーションの方法を提供するパルスされたelectrical域を提供することになっている。なおさらに、発明のもう一つの目的は、方法と器械を、生体内でガラス管内で、電気パルスを電極の群列に選択的に適用するために提供することになっている。発明のさらに別の目的は方法を提供することになっている、そして、電界を回転させるための器械は生体内で試験管内に組織または器官かキュベットにあてはまった。発明のもう一つの目的は、試験管内にキュベットに適用されるシーケンシャルに印加、逆転する電界のために、方法と装置を提供することである。本発明を特徴づける種々の新規性とともに、本発明の他目的とこれらは、特に請求項において記載すると同時に、明細書の一部を構成している。本発明、その利用による利点及び特定の目的がその使用によって達成されることをよりよく理解するために、付随する図面を参照しながら、本発明の好ましい具体例を説明する。図面の簡単な説明本発明はよりよく理解され、上記の目的及びそれ以外の目的は、以下の詳細な説明を理解することにより更に明らかになろう。そこで添付図面を参照して説明する：図１は、パルスされた電界で、プログラム可能な電極選択装置で原料を処理する本発明の方法を実施するために使われる装置全体のブロック線図である。図２は、図１で示されるインタフェース・コントロール組立体の主たる機能単位を部分的に模式的に示すブロック線図である。図2A-2Oは、図２のインタフェース・コントロール組立体に関する電気回路図である。より特に、図2Aはマイクロプロセッサ（IN）へのStatusの電気回路図である。図 2Bは、マイクロプロセッサ（OUT）からの制御の電気回路図である。図2Cは、チップセレクトデコーダーの電気回路図である。図2Dは、パルスルータインターフェースの電気回路図である。図2Eは、サインウェーブアンプリチュードに関する電気回路図である。図2Fは、サインウェーブ周波数に関する電気回路図である。図2Gは、高真空電力供給Vprogの電気回路図である。図2Hは、パルス電流モニター（P-IMON）の電気回路図である。図2Iは、高真空電力供給VMONの電気回路図である。図2Jは、パルス幅Conferの電気回路図である。図2Kは、パルス送出駆動装置の電気回路図である。図2Lは、バス接続装置の電気回路図である。図2Mは、パワーとリセットの電気回路図である。図2Nは、RS232の電気回路図である。図2O は、不揮発性静電的なRAMの電気回路図である。図3A-3Iは、図３の中で示される高電圧組立体に関する電気回路図である。より詳しくは、図3Aは高真空コントロールとPS VMONの電気回路図である。図3Bは、リザーヴァ-キャパシターの電気回路図である。図3Cは、高真空スイッチの電気回路図である。図3Dは、欠陥に対する電力供給装置とパルス不能の電気回路図である。図Ｅは、高真空電力供給プログラム電圧と放電コントロールの電気回路図である。図3Fは、パルス電圧モニター（P-VMON）の電気回路図である。図3Gは、パルスコントロールモニター（P-IMON）の電気回路図である。図3H は、シグナルバスインターフェースの電気回路図である。図3Iは、欠陥モニター回路の電気回路図である。図４は、図１で示されるプログラム可能なパルス開閉器の主成分を、部分的に模式的に示すブロック線図である、、図4Aは、図４で示される3-状態の開閉器のうちの１つの電気的な模式図である。図５は、非正弦波のパルスが少なくとも３つのパルスの少なくともが、お互いにパルス振幅において異なることを図で示す。図６は、非正弦波のパルスがそこで少なくとも３つのパルスの最小の二つで、お互いとパルス幅において異なることを図で示す。図６も以下の表ＩにおいてグループＡと一致する点に注目される。図７は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第一のセットのための最初のパルス間隔が、第二のパルス間隔と異なるその点でが少なくとも３つのパルスのうちの２つの、セットした非正弦波のパルスを図で示す。図８は、発明の電極選択装置に接続している２つの電極を備えている単一のキュベットを図で示す。図９は８つの電極を周わりの種々の位置に配置され、本発明の電極選択装置に接続している単一のキュベットを示す。図10A-10Fは、単一のキュベットを通して電界を動かし、2-極電界がキュベットを通して回転される最初の典型的なパターンを図で示す。図11A-11Fは、単一のキュベットを通して電界を動かし、4-極電界がキュベットを通して回転される第二の典型的なパターンを図で示す。図12A-12Cは、単一のキュベットを通して電界を動かし、4-極域から5-極域への3-極域への電気の電界変化第３の典型的なパターンを図で示す。図13は、電極選択装置にそれぞれの終端に接続している電極を持つ８つのテスト穴を持つテストプレートを図で示す。発明の実施態様この発明は、エレクトロポレーションまたは電気融合の目的で電気パルスを生細胞に適用するためにプロセスを含む。パルス幅とパルス電圧のパラメーターは、先のハードウェアまたはソフトウェア・プログラミングによって、パルスからパルスまで変更されることができる。電圧と幅を変更するパルスを適用する重要な目的は、エレクトロポレーションまたは電気融合の要求された結果を最大にすることになっていて、セルに致死損傷を最小（限度）にすることになっている。この目的は、初期のより高いエネルギー・パルスの後、応用エネルギーの還元を通してセルに適用されるエネルギーを最適化することによってなしとげられるかもしれない。エレクトロポレーションと電気融合の域における従来の理論は、限界電圧がセルエレクトロポレーションまたは電気融合をなしとげるために超えられなければならないことを教える。従来の理論を実行することにおいて、単一のパルスは、限界より上に３つの電圧でパルスを適用することによって使われる。さらに、単一のパルス概念は、最初の上記の限界パルスによって、電池膜抵抗起因性の中で変更のために会計なしで一連のパルスを含めるために従来の理論の中でのばされる。ここで記述される被検者発明の発明者は、最初の上記の限界パルスによる電池膜抵抗起因性における変更が次のパルスを適用する際に考慮に入れられなければならないと理解した。また、パルスのエネルギーがパルスの電圧と同じくらい重要であることは、従来の理論の中で受け入れられる。限られたパラメーターの範囲内で、減少するパルス幅は、減少するパルス電圧と同じ効果を持つ。再び、等しいエネルギーのシーケンシャルなパルスが適用されるとき、従来の知恵は最初のパルスをたどっている変更された電気抵抗を考慮に入れない。セルにおける気孔起因性の直径は、エネルギーを増やすことによって増やされる。セル基型とサイズへの被支配頂である危険なエネルギー準位を越えて、セルを無制限の膨張によって破壊する気孔は、つくられる。セル構造（例えばセル・サイトスケルトン）は、セル気孔の膨張を制限する。極大穿孔は、無制限の気孔膨張に終わる細孔寸法より大きいノット以外はに、クローズとしてサイズの気孔の最大数によってなしとげられる。被検者発明の境界とバウンドが理論上の考察によって結合されないと思われる。しかし、使用のよりよい理解と被検者発明の運営の目的のために、簡単な理論上の説明は、役に立つかもしれない。より特に、新しい理論上の考察に従ってここで発明者によって前方に、応用パルスならばセットすること始めるセルとそのパルスにおける生成、質、地合いを皮をむく、パルスが十分の初期のエネルギーのパルスより遅い割合で、気孔を広げる効果を持つ瞬間、より小さいエネルギーのパルスによってたどる。絶えず減少するエネルギーのパルスは、このように偶数のより遅い気孔膨張の効果を危険な極大細孔寸法をより近い気孔膨張のより大きな制御に与えるようにする。上述の通り、エレクトロポレーションに関する従来の理論は、絶えず膨張している細孔寸法で減られた電池膜抵抗の催起を論議しない。しかし、局所の電圧が減られた局所のレジスタンスで配合の中で減るので、この減らされた抵抗が実際に印加電圧のより少ない効果に終わるかもしれないことは、ここで発明者によって認められる。これは、細孔寸法を広げるために傾向の付加減衰，減衰量、繊細化、細長化に終わる。この点で、慣例通りに応用パルス列は、あまりに速く気孔膨張のこの自然の減衰，減衰量、繊細化、細長化を利用するために気孔を広げるかもしれない。一連のパルスの中で段階を追って減らすか、絶えずパルス・エネルギーを減らす塗布を通して極大細孔寸法に接近することは減られた電池膜抵抗を通して細孔寸法膨張の自然の減衰，減衰量、繊細化、細長化の極大利用能を許すことは、発明者の評価である。セルのエレクトロポレーションは、いくつかの理由のための不均質プロセスである。最初に、セルは粗く円脚である、そして、細胞膜への電気の力は電流の方針に細胞膜親族の角に比準である。最も大きな力は、細胞膜が電流への垂線であるセルのサイトである。二番目に、細胞膜は形の中で不規則である。若干のセルは、電極に最も近いサイトに遠いサイトで電流に細胞膜切断垂線を持つ射影を持つ。不規則性サイトスケルトンにある不均質エレクトロポレーション.に貢献する。１つだけが読書で使いすぎるもしもが破壊（セル意志ダイ）を越えて膨張するので、不規則なエレクトロポレーションは難しいエレクトロポレーションから最大化を作る。これは、気孔開始の後、穏やかに気孔を広げる技術を発現させることを肝要にする。被検者発明は、このニーズを満たす。図面に関して、原則を具体化しているパルスされた電界で、治療方法原料を実施するための器械と本発明の概念は、図で示される。発明のパルスされた電界で、治療方法原料を実施するために使われる器械はCy to Pulse Sciences社、コロンビア州、メリーランド、USAのModel PA-4000 Elec tro穿孔システムを含む。そして、図ｌの中で示される。ModelPAー4000E1ectro 穿孔システムは、広範囲にわたるエレクトロポレーションタスク（どちらが既存の機器で可能でないか多く）をなしとげるために設計される。Model PA-4000エレクトロポレーションSystemによって実施されることができる新しいタスクの一部は、以下を含む：１つのパルスから次へのパルス幅を変更すること；１つのパルスから次へのパルス振幅を変更すること；１つのパルスから次へのパルス区間を変更すること；ハイファイ・パルス電界（効果的に荷重から独立している）を生産すること；パルス・アンプを提供する高電圧パルスの非常に正確なレプリカを与えるアンプリチュードモニター；パルス電流の非常に正確なレプリカを与えるパルス電流モニターを提供すること；コンピューター生成の機敏なパルス系列を提供すること；そして、使われる各パルス系列の自動性のデータ検層と想起を提供すること。その結果、Model PA-4000エレクトロポレーションSystemは、非常に見事に管理された、高適合度（プラントと哺乳動物セルを含む多種多様な原料をエレクトロポレーションするパルス電界）のシーケンスを提供する。 Model PA-4000 Electro穿孔システムは、三大成分を含む：高電圧の機敏なパルス系列ガス発生器７（Pulse Agile（TM）ガス発生器として既知の）；結合の制御コンピューターとコンピューター・インターフェイス４；そして、キュベット器械。キュベット器械は、0.4cm、基準、0.2cmと0.1cmのキュベットで動く。カスタム・インタフェースは、他のキュベット・ホルダーとデリバリー系統に利用できる。Model PA-4000 Electro穿孔システム規格は、下で提示されるSpe cifications表の中で含まれる。特により多くの概要が図１の中で見せられる機敏なパルス・シーケンサ（Puls e Agile（TM）ガス発生器として既知の）に関して。この図は、Programmable Pu lse開閉器で構成されるPA-4000系統を示す。キュベットホルダーはまた、Programmable Pulse Switchの産出高で接続されるかもしれない、あるいは、Programmable Pulse Switchが使われないならば、CuvetteHolderは直接にPulsedされた高電圧の外のllに接続しているかもしれない。また、パルス電圧と電流モニター・ポート（10）は、手に入る。オシロスコープは、パルス・シグナルのビュー・レプリカに、これらのポートに接続しているかもしれない。制御ケーブル９が、Programmable Pulse Switchを制御するために使われる。プログラム可能なPulse Switchは、３つの状態、外へパルス、パルス・リターン、無接続13の唯一の一つへのセットであるＮ産出高を持つ。系統は３つのキャビネット、互換PCl、制御マイクロプロセッサ４を含むPA-40 00キャビネット３、インタフェース・コントロール組立体５、高電圧組立体６、高圧電源７から成る、そして、低電圧電力供給８とプログラム可能なパルスはキャビネット12を変える。ユーザーへのインターフェイスは、PCと動くを互換性の上ですえ付けられるPu lseAgilソフトウェアであるMS-Windowsオペレーティングシステム1.オペレーターはパルスパラメータをセットした、そして、プロセス開始と停止を制御しなさい。プロトコルが運転であったあと、データログレポートはコンピューター・スクリーンの上で提示される。互換PCにおけるPulseAgileソフトウェアは、コマンドを生成して、PA-4000キャビネット４の中でZ-80マイクロプロセッサに基準RSの上にコマンドに232の経時的インターフェイス２を送る。Z-80は、コマンドを解読して、順番に全ての他の組立体を制御する。それに加えて、Z-80は電気回路の状態を監視して、PulseAgileオペレーター・インターフェイス・ソフトウェアに、RS-232 Iinkを通して状態報告後部を提供する。経時的インターフェイスの上に通信することは、どんなターミナル・プログラムででもなしとげられることができる。しかし、PCにおけるグラフィックインターフェース・ソフトウェアは、フレンドリーなインターフェイス多くのより多くのユーザーを作る。 Control Assemblyが含むInterface、マイクロプロセッサ、アナログ・ディジタル変換、ディジタル・アナログ変換器、高い/低制御と状態線（パルス発生回路とプログラム可能なパルス開閉器インターフェイス）は、図２を見る。マイクロプロセッサは、40のピン接続器19のDigital Bus 20を通して、全ての他の電気回路に接続している。この母線は、８つのデータ線、５つのアドレス線と６つのチップセレクト線を含む。チップセレクトとアドレス線の状態の他の電気回路基準へのデータ母線線移送情報。不揮発性のランダムアクセス型記憶装置（NVRAM）部18は、また、Digital Bus 20に接続している。NVRAMは、消色リレーが開けられて、閉じられてどれくらいの時間であるか、そして、それがどんな電圧を開けられて、閉鎖である情報を累算する。これは、情報である各プロトコル運転の終わりに印刷されて、そして、故障解析のために使われる。 Analog Converter（DAC）へのDigitalが、電力供給22をセットするために実電圧にマイクロプロセッサ８ビット語をコンバートするために使われる。このDAC 産出高は、６つのボルトに０の電圧範囲を持つ。この、６つの電圧への０は、高圧電源にSignal Bus 24の上に運ばれる。Ａ０高電圧供給７への入力が生じる６つのボルトに0 1100のボルト高電圧産出高に。予備品DACが接続した２が、Digit al Busにある。ＡＤ変換器（A/D） 26が、マイクロプロセッサによつて使われるデジタル語に、５つのボルトに０の高圧電源産出高電圧モニター・シグナル・レベルをコンバートするために使われる。Ａ０結果を出力される1100のボルト高電圧供給に０５つのボルト・モニター・シグナルに。ＡＤ変換器（A/D） 28が、マイクロプロセッサによつて使われるデジタル語に、２つのボルトに０のプレ・パルス電流モニター・シグナル・モニター・シグナル・レベルをコンバートするために使われる。ユーザーがプロトコルを始めるとき、このプレ・パルスはマイクロプロセッサによつて生成される。高電圧が回される、９（s、２つのボルト豆類は、生成される。このパルスは、荷重（キュベット、その他）を通して繁殖する。このパルスから生じている電流は、コンバートされる０２つのボルト・シグナルに。この電圧は、荷重レジスタンスに比準である。荷重レジスタンスがあまりに低（イオン濃縮、その他は、あまりに高い）この燃料被覆であるならば、穿孔されている原料を傷つけることができた過剰の電流に終わりなさい。電流があまりに高いならば、マイクロプロセッサは高電圧の上で回さなくて、「荷重Current Too High」メッセージを出す。マイクロプロセッサ30によつて生産される高い/低いくつかの制御シグナル線がOneであってそこで、持ち越されるHVON（高電圧閉路）は、High Voltage議会（6）へのSignal Busである。もう一つの管理線はまた、High Voltage議会６に、Signal Busを持ち越した。そして、Fault Resetは線である。欠陥が発生するならば、この線がラッチをリセットするために使われる。これらは、マイクロプロセッサによって読まれて、制御32のために使われるいくつかの状態線である。人は、キュベットホルダー33からの線である。キュベットホルダーは、底の中で磁石を持つ。ハンドルがキュベットを露出しているすべられた無充てんであるならば、これは細胞接触を壊す。この電気回路が、閉鎖でない（すなわち完全に中でハンドル押し、マイクロプロセッサ・ディスプレイ、メッセージと高電圧が回されることができない「キュベットOpen」）どうかまたは人が、じかにうんざりするどうか。第二の状態線34は、Programmable Pulse開閉器における細胞接触である。PPS平行制御ケーブルがプラグを差し込まれるとき、この線は地上に釘づけにされる。この低線は、それからPPSが利用できることを示したマイクロプロセッサによる読取りである。第３の線34は、Fault線である。欠陥がHigh Voltage Assemblyに認められるならば、この線は高く行く。マイクロプロセッサは絶えずこの線を監視している、そして、それが高く行くならば、「欠陥」メッセージはディスプレイである、そして、高電圧とパルス発生回路は近い障害者である。マイクロプロセッサは、低電圧パルス励振電気回路36 を制御する。この電気回路はマイクロプロセッサによってプログラムされるパルス幅ガス発生器をパルスを生成するトリガー・シグナルによってたどってもらう。そして、全てのパルスが生成されるまで、次のパルス幅はそれからトリガー・シグナル、その他によってたどられるセットである。 Programmable Pulse Switchインターフェイス40は、マイクロプロセッサからのセットアップコマンドを受け取って、特別なPPS平行インターフェイス９を通して、設定指示を送り出す。このインターフェイスは、Pulse Outは高くなる一組の８つの線から成るプログラムされて、そして、ちよっと、行く８つの線に高いパルス・リターンを設定したプログラムする。接続したままでない開閉器Ｉに両方の線が低くとどまる。 High Voltage Assemblyは、高電圧の開閉器電気回路、ガス溜めコンデンサー、力印加電圧モニター、パルス電圧とパルス電流モニター、消色リレーと欠陥検出電気回路を含むと、図３が知っている。高いvolta9eが割込み可能なとき、リレー・コイル44は生かされる、そして、消色リレー45は開けられる。力印加電圧プログラム電圧は、それから指定されたレベルでのセットである。高電圧供給は、それからガス溜めコンデンサー40を負担させる。浮き斑高電圧開閉器48は、それからSignal Busを通してパルス励振シグナル60によつて、オンにされる。低電圧シグナルは、optoアイソレーター49を通して浮き斑高電圧開閉器に接続している。高電圧開閉器がガス溜めから電流の上で回されるとき、コンデンサーは荷重54の中を流れる。そして、電力供給に接続しているGround53がすりへらしたシステムへのパルス電流モニター表示抵抗器52が電流経路を完了する。抵抗する分圧器42 は、ガス溜めコンデンサーを横切って高電圧に比準の低電圧シグナルを生産する。40.この基準化された電圧57は、マイクロプロセッサによって定期的にSignal Busと読取りに接続している。パルス電流のスケール回転術は、パルス電流流れによって生産される電流表示抵抗器52。100のアンプのためのおよそ20のボルトであるこの電圧は、アンプ62 による緩衝液である。これは、Pulse Current Monitor Portである。基準化されたパルス電圧は、抵抗する分圧器50で生産される。この電圧は、それからあるバッファー付きアンプ85によって。産出高は、Pulse Voltage Monitor Portである。 PA-4000において、発生することができるパルスが125のミリセカンドとしてほとんど時ない次の上で、1100の電圧（極大）から、50のボルト（極小）まで変更されるパルスに、パルス振幅は、パルスから変更されるかもしれない。これは、 Dlscharge Relay Clrcuit 44、45、46、47、56、57、58によってなしとげられる。電圧comparitor 56は、ガス溜めコンデンサー57の上で高圧電源プログラム電圧64と基準化された電圧の間で電圧を比較する。高圧電源プログラム電圧64がコンデンサー基準化された電圧57以上であるならば、comparitorアウト58は低い。産出高58が低い、そして、高電圧が割込み可能なとき、リレー・コイルの対生の側面は高気圧66である。リレー・コイル44を横切るこの差電圧は、コイル44を生かして、リレー45を開ける。高圧電源プログラム電圧64がガス溜めコンデンサー40の基準化された電圧より低いならば、comparit or 58の産出高は高く行く。58が高い、そして、リレー・コイル44の向こう側が高気圧66（高電圧閉路）であるならば、電圧がリレー・コイル44とリレー・クローズ45を横切ってない。リレー45が閉じるとき、ガス溜めコンデンサー40は抵抗器47を通して系統下漬け剤53に接続している。消色の間のこのトータル電流は、リレー細胞接触に対して鍛接を妨げるために抵抗器47によって制限される。極小パルス区間の半分の時間である50のミリセカンドの中で、ガス溜めコンデンサー40と抵抗器47の間の時定数は、95％コンデンサーを横切って電圧を減らすことができる。起こる電圧で、プログラム電圧64がセットされる（例えばcomparitorがそうする電力供給７からの400のボルト）電力供給が行くならば、その電圧が着かれる高気圧58とリレー45はオープンする、そして、Reservoir Capacitor 40はそれ以上吐出さない。このように、Reservoir Capacitor 40の電圧は、最も短いパルス区間の範囲内で極大と極小の間でどんなレベルにでも速くセットであるかもしれない。３つの欠陥検出電気回路が、高いVoltaqe組立体（高電圧開閉器60）にある。8 3、81、76、消色リレー75、80、74、68と荷重84、82、78、79。全ての三つは、ラッチ電気回路72に接続している。３つの線68、76、79のうちの１つの何かが低くラッチを出るならば、35は高く行く。 35が高く行くならば、プログラム電圧64はリレー65を通して切り離される、そして、パルス励振はハードウェアの中でリレー87を通して切り離される。マイクロプロセッサは絶えずラッチ・アウト35を監視する、そして、それが高く行くならば、「欠陥」メッセージは表示される。系統は、休養をしばらく持ってくることは高く線をひくpcからのリセットであるかもしれない31。リレー消色欠陥電気回路75、80、74、68は、消色リレー45の適当な運営を監視する。リレー45が連続的に失敗して、下漬け剤53に抵抗器47を通して電力供給７とガス溜めコンデンサー40を接続するならば、内の電気回路への損傷は発生することができる。リレー45が失敗して、閉鎖のままであるならば、本通しの表示抵抗器46が電圧を生産して、それまでのRCコンビナート51、52によって上へ統合されたどの意志が、75であるComparitor関連電圧80より大きい。高圧電源７が極大電圧へのセットであるならば、これは２、３のミリセカンドをとる。高電圧の開閉器欠陥電気回路60、83、81。76は、高電圧開閉器の適当な運営をモニターする。この電気回路は、高電圧開閉器48が連続的に閉鎖に失敗するならば、高電圧が荷重54に現れないと保証することになっている。それが起こる、そして、高圧電源７がオンにされるならば、電圧はスケール・パルス電圧抵抗分割器50に現れる。この電圧83は、励振パルスの存在と比較される。83が１(sの範囲内の10以上のボルトであるならば、励振パルス60なしで、comparitor 81の産出高は低く行く。これはある変える急速な、そして、電力供給にターンオンに時間がない。 78、79が電流をモニターする荷重欠陥電気回路84 82荷重54。高電圧パルスが閉路である間、荷重電流が過剰になるならば、パルスはキュベット、その他において破壊綿毛のためにの上にある。キュベットの含有量は蒸発させることができた、あるいは、内部電気回路は傷つけられるかもしれない。電流が過剰になるならば、表示抵抗器52を横切る電圧が限界バレ82より上に増加して。関連が越水であるとき、comparitor 79の産出高が私より少ないものにおいて低くなって（s。高圧電源７は、商用の単位である1100のボルトでどのデリバリー1 10ママ、そして、プログラムする０６つのボルト・シグナルに。低電圧電力供給８は、全ての制御電気回路、+5のボルト、+12のボルト、-12のボルトに電圧を提供する。それは、商用の単位である。 ProgrammableなPulse Switch 12は、高電圧ケーブル11と平行制御ケーブル９によってPA-4000に接続している。概要は、図４の中で提示される。Programmabl e Pulse Switch（どちらが同じく動くか全て）におけるＮ開閉器93にあるかもしれない。高電圧パルス90、そして、リターン91PA-4000キャビネット５を同軸ケーブル形を通して提供する。外へ選択パルスのための２つの管理線95 １と精選品パルスのための人は、帰る。パルス外の管理線が高いならば、外へパルスは電極94に接続している。パルス・リターン管理線が高いならば、パルス・リターンは電極94に接続している。どちらも高くないならば、何も電極94に接続していない。両方とも高いならば、何も電極94に接続していない。 ProgrammableなPulse Switch 12は、高電圧ケーブル11と平行制御ケーブル９によってPA-4000に接続している。概要は、図４の中で提示される。Programmabl e Pulse Switch（どちらが同じく動くか全て）におけるＮ開閉器93にあるかもしれない。高電圧パルス90、そして、リターン91 PA-4000キャビネット５を同軸ケーブル形を通して提供する。外へ選択パルスのための２つの管理線95 １と精選品パルスのための人は、帰る。パルス外の管理線が高いならば、外へパルスは電極94に接続している。パルス・リターン管理線が高いならば、パルス・リターンは電極94に接続している。どちらも高くないならば、何も電極94に接続していない。両方とも高いならば、何も電極94に接続していない。 Three State Switchの詳細に説かれた電気回路図は、図4Aの中で存在する。各開閉器は高電圧電気回路、高電圧パルス、164と高電圧のパルス・リターン（163 ）からマイクロプロセッサ、パルス・リターン・セレクト、161とパルス外の選択162の、２つの入力から２つの入力を持つ、そして、１はマイクロプロセッサからコマンドに従い全くポート、どちらが高電圧パルスに接続しているか 167、高電圧リターンまたは何も出力しなかった。接続される２つの化学指示薬産出高が、また、発光ダイオード（LED）、166（パルス）、165にある（リターン）、それは開閉器の状態を示す。 Agile Pulseガス発生器からの高電圧パルスと高電圧リターンは、全てのＮ開閉器に接続している。マイクロプロセッサ、セレクト・パルス、162またはセレクト・リターン（161）からの各開閉器のための２つの管理線が、ある。選択パルスならば管理線は高く行く、２つのNORゲートへの入力。UIAとUIBは、高く行く。UIAピン２はそれから高い、そして、ピン２は高い低引き起こしているピン３（外の）でなければならない。第二のNORゲート。 UIBは、それからピン６（外の）が低くなるピン４とピン５つの高気圧を持つ。ピン６が低いならば、なし逆にしている、開存性のコレクター原節U7Cピン６の産出高は低い。このピンがリレーの低ピン16であろとき、K2は低くリレー・コイルを生かしていて、リレーK2を閉じている。このリレーが高電圧パルスを閉じられる時は、産出高電極に接続している。第二の非反転原節は、リレーが生かされるならば、明るくされるLEDに接続している、166。マイクロプロセッサがリターンを選ぶならば、手に入れられる同じものは発生する。症例リレーK1が閉鎖であるという点で、高電圧パルスを接続することは産出高ポート（167）に戻る。マイクロプロセッサが高く不注意に高電圧パルスと高電圧のパルス・リターン線をセットするならば、NOR UIA産出高は低く行く、そして、どちらのリレーも生かされない。これは、起こることは短絡現象である同じ時生かされている両方のリレーの可能性を防ぐ安全機能である。４つの可能な条件が、それからマイクロプロセッサから２つの線にある。パルスSdectは高気圧に線をひく−パルス高電圧はそれから産出高ポートに接続している。パルスReturn Selectは高気圧に線をひく−Pulseリターンはそれから産出高ポートに接続している。全然、高気圧に線をひきなさい−パルスかパルス・リターンは産出高ポートに接続していない。両方の線、パルスもパルス・リターンも、接続していない産出高ポート。概要において、全てのＮ開閉器は、マイクロプロセッサを通して独立して動かされて、高電圧パルス、高電圧リターンまたは何も全く単動で出力しなかったどちらにでも開閉器のポートを贈る。パルス振幅の中で互いに少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つが違うその点でを律動的に送られてnon-sinusoidalな図５は、実例を示す。パルス幅の中で互いに少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つが違うその点でを律動的に送られてnon-sinusoidalな図６は、実例を示す。図６も以下に表Ｉの中でグループＡと通信する点に注意される。図７は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの最初のセットのための最初のパルス区間が一瞬第二のパルス区間から異なるその点でが少なくとも３つのパルスのうちの２つの、セットした非正弦波のパルスを図で示す。次の学術用語がここで大幅に同義である点に注意される：パルス・セレクター器械；電極選択装置110；そして、ProgrammableなPulse Switch内閣12。電極選択装置110は、製造されて、Cyto Pulse Sciences社、コロンビア州、メリーランドのPA-101として売った。そして、それはここで記述されるModel PA-4 000エレクトロポレーションSystemを製作して、売る同じ会社である）。PA-101 は、外にマウントされて、別に高電圧の機敏なパルス系列ガス発生器から購入されるかもしれない。PA-101は、高電圧パルス（下漬け剤関連）へのどんな電極でも接続することができるか、電極（どんな関連からでも切り離されて）を「浮かせることができる」一組の８つのコンピューターに制御された高真空５つの開閉器を含む。PA-4000を制御する同じPA-4000制御ソフトウェアによって、電極選択装置は管理されている。そして、下で記述される。DB-25 制御ケーブルは、PA-4000にPA-101を接続する。上述の通り、Model PA-4000Puls eAgile(TM) エレクトロポレーションSystemは、製造されて、Cyto Pulse Sciencesで売られる。コロンビア州（メリーランド）の会社。Model ５つのPA-4000系統は、全ての基準矩形波と多くのCDプロトコルを実行する。Model PA-4000系統も、後生的なPul seAgileTMプロトコルを実行する。Model PA-4000PulseAgile(TM)Electroporator は、広範囲にわたるエレクトロポレーションタスク（どちらが現在手に入る既存の機器で可能でないか多く）をなしとげる。本機関は、研究者が基準プロトコルを使うのを許して、プロトコルの範囲内でパルスパラメータを変更する増加された可撓性を持つ。より多くの道具は、最適化に利用できる。系統は、水溶液と組織においてプラント・セル、marnmahan セルと細菌性のセルを含む多種多様な原料をエレクトロポレーションするためにハイファイ・パルス電界の非常に細かい制御を提供する。図８に向きを変えて、この図は、２つの電極ll3（ll4）を備えている単一のキュベットll2を図で示す。１つの電極ll3は、電極選択装置110のTerminal No.1に接続している。第二の電極・4は、電極選択装置110のTerminal No.2に接続している。電極選択装置110は、電界の方針が各極性逆反応のためにキュベットll3を横切って逆にされているそれによって２つの電極に適用されるパルスのシーケンシャルに逆の極性にプログラムされることができる。極性逆反応は、各連続したパルスのためにまたは、代わりに、予め定められたパルス・パターンのために実施されることができる。図９は、キュベットのまわりで異なる位置で末梢的に分散される８つの電極を備えている単一のキュベット133を図で示す。電極選択装置110の、電極数字121- 128は、それぞれTerminal数字1-8.に接続している。それぞれ、ポジの/否定の極性は、最初にElectrode数字121と125に適用されることができる。それから、それぞれ、ポジの/否定の極性は、Electrode数字122と126に適用されることができる。それから、ポジの/否定の極性燃料被覆は、Electrode数字123 と127に適用される。それぞれ。それから、それぞれ、ポジの/否定の極性は、Electrode数字124と128に適用されることができる。この点で、極性逆反応は、適用されることができる。すなわち、それぞれ、ポジの/否定の極性は、Electrode数字125と121に適用されることができる。それぞれ、ポジの/否定の極性燃料被覆は、Electrode数字126と122に適用される。それから、それぞれ、ポジの/否定の極性は、Electrode数字127と123に適用されることができる。それから、それぞれ、ポジの/否定の極性は、Electrode数字128と1 24に適用されることができる。パルスをElectrode数字121-128に適用するこの方法がキュベット133ののまわりで、そして、を通して回転する電界に終わることは、上記から透明である。要求されるので、ポジの/否定の極性塗布のそのようなサイクリック・パターンは多くの時間として繰り返されることができる。発明のもう一つの塗布は実例となるので、図９はまた、考えられることができる。大きい円は、生体内の器官（アニマルまたはプラントよりそのようなもの）の代表種でありえる。Electrode数字121-128は、三次元の中で器官のまわりに置かれることができる。電極の各々は、電極選択装置ll0の上で、それぞれのターミナルに接続している。電極選択装置ll0は、高電圧の機敏なパルス系列ガス発生器２に接続している。このように、高電圧の、非正弦波の機敏なパルスは、高電圧の機敏なパルス系列ガス発生器２の中で生成されることができて、選ばれたElec trode数字121-128まで、電極選択装置ll0を通して発送されることができる。大幅に、高電圧の機敏なパルス系列ガス発生器２からのどんな要求された機敏なパルス系列でも、Electrode Nos（どんな要求されたプログラム可能なシーケンスにおけるでも121-128）のどんな要求されたサブセットにでも発送されることができる。 2-極電界があるその点でがキュベットを通して回転させた単一のキュベットを通して、図l0A-l0Fは、移向電界の最初の典型的なパターンを図で示す。 4-極電界があるその点でがキュベットを通して回転させた単一のキュベットを通して、図11A-11Fは移向電界の第二の典型的なパターンを図で示す。図12A-12C は、そこで単一のキュベットを通して移向電界の第３の典型的なパターンを図で示す4-極域から5-極域への3-極域への電気の電界変化。指示を出されるちょうど数例から、電界分配のパターンの非常に大きい数が置換を変更することによるキュベットと電極選択装置ll0に、機敏なパルス系列ガス発生器によって提供されるパルスに関連して、電極選択装置ll0によって選ばれる電極のコンビナートを通して適用されることができることは、透明である。より特に、電極精選品で、発明（それが選ばれた電極の最小の一つで、生体内でガラス管内で電界分配の中でそのような莫大な可撓性を持つのを許すために）の器械ll0はパルス-受付電極の役目を果たす、そして、選ばれた電極のうちの少なくとも１つはパルス-復帰している電極の役目を果たす。さらに、電極のどんなコンビナートにおいてでも、どんな電極でも、パルス-受付電極（パルス-復帰している電極）か非パルス-運んでいる電極の機能を果たさなければならない。一般に、Ｎ応用パルスは、次々と電極のＮ基に発送されることができる。さらに、電極のＮ基における電極の連続した基は、異なる個人の電極から成ることができる。代わりに、電極のＮ基における電極の連続した基は、同じ個人の電極から成ることができる。図13において、Test Well数字1-8を持つテスト乾板135は、図で示される。各テスト坑井は、電極選択装置ll0の上で、それぞれのTermmal No.1-8に接続しているそれぞれの最初の電極141-148を持つ。各テスト坑井も、電極選択装置ll0の上で、Retum Terminal No.9に接続しているそれぞれの第二の電極151-158を持つ。各テスト坑井は、異なる他のテスト坑井としての要求されたウェイまたは同じものにおいて律動的に送られることができる。結果へのダライ粉が、発明のエレクトロポレーションの、方法の１つの見方を実施するために上記の器械を使うことによって得られて、表ｒセットは、前方にここで発明の原則を使って、エレクトロポレーションを実施するために従来の原則を使うことを比較する実験の結果の欄送りである。表Ｉの中で表にされる実験を実施することにおいて、次の話題に関する特性明細は、考慮に入れられた：使われるセル；エレクトロポレーション条件；セルのパーセントの決定は、穿孔した；そして、エレクトロポレーション.を耐えぬいているセルの決定これらの話題に関する明細は、たどる。セル。 CHO-KIセル（ATCC）は、完全培地（中位（Gibco）さらに10％が加熱するCO2インディペンデントは、ウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、100のunits/mlペニシリン、100のμｇ/mlストレプトマイシンと0.25のμｇ/mlアンフォテリシンＢを不活化した）の中で維持された。セルは、扁平な底T-150フラスコの中で育てられた。懸濁培養のために、セルはセルかき取り機でT-150フラスコからスクラップにされた。セル・サスペンションは、100mlのクモ・フラスコに加えられた。完全培地は、100mlのトータル容積を作るために加えられた。クモ・フラスコは、370のｃで維持されたかき混ぜる80のrpmの速度。撹拌培養は、セル・サスペンションの90％を取つて、完全培地で容積をもとへ戻すことによって送られた。エレクトロポレーションのために、50mlのセル・サスペンションは、ログ位相撹拌培養から取られた。セルは、手動で数えられた血球計数器を使う。セルは、10の分のために400のＸｇで遠心分離された。セルは、mlにつき500万のセルの濃縮で、血清自由中位（付加のないCO2インディペンデント中位）の中で再懸濁された。エレクトロポレーション． 250のμｌのＡ細胞サスペンション容積は、種子を生じない、ディスポーザブルなelectropdrationキュベット（バイオ-Rad）に、2mmの電極ギャップと加えられた。もしもは、指示を出した、プラスミドDNAの10のIngがあったことを含んでいる溶液がキュベットに加えたどちらの1％Trypan青色溶液（シグマ）o'rでもの 50のμｌ。キュベットは、手製のキュベット・ホルダーに加えられた。エレクトロポレーションのためのパルサと計算機制御は、この特許で記述されるそれらであった。パルサはオンにされた、そして、電圧はセットであった。パルス列は、計算機制御によって実行されるタスク生成された重なり最上部コンピューターとパルス列にプログラムされた。セルのパーセントの決定は、穿孔した。50マイクロリットルの1％Trypan青色色素溶液（100mlの蒸留水に加えられる44％のトリパンブルー染料の2.4gm）は、エレクトロポレーションキュベットの中でセル・サスペンションの250のμｌに加えられた。高電圧パルスを適用する前に、10のμｌ見本は、エレクトロポレーションに先立ち染料（デッド・セル）を取り上げるセルのパーセントを決定することに労を惜しまなくされた。パルスは、prograrnmed.としてセルに適用されたエレクトロポレーションの後、10のμｌ見本は、electro穿孔されるセルのパーセントを決定することに労を惜しまなくされた。セルは、血球計数器の上で手動で数えられた。青色セルは、ポジのと明細胞ネガ型として数えられた。実際のエレクトロポレーションは、バックをポジで否定のカウントから減ずることによって計算された。エレクトロポレーションを耐えぬいているセルの決定エレクトロポレーションを耐えぬいているセルは、組織培養乾板にタスク生成することができるセルのパーセントによって決定された。24の坑井乾板は、各坑井に完全培地の合計加算Ｉmlによって検定のために調製された。記述されるので、セルはエレクトロポレーションキュベットに加えられた。セルの10μｌ（若干の実験における20のμｌ）見本は、キュベットから取られて、24の坑井乾板の坑井に置かれた。セルは、乾板を横切って均一に彼らを分散させるためにゆさぶられた。パルス・セッションが適用されたあと、等しい見本はキュベットからとられて、24の坑井乾板の異なる、隣接の坑井に置かれた。セルは次の日370℃.Theでの培養された前夜であった、セルはPBSの中で蒸留水に通されて、１時間10％バッファー付きホルマリンの中でフィックスされた。セルは、PBSその時の蒸留水で蒸留水に通された。セルは、400のμｌ染料を各坑井に加えることによって蒸留水の中で1％Crystal Violetで汚された。染料が乾板から溶出されないまで、セルは蒸留水でそれから蒸留水に通される５つの最小値のために培養された。セルは、乾板の読みまで空気乾燥された。70％のアルコールの1mlは、各坑井に加えられて、５つの最小値のために卿卵した。アルコール-染料混合物の光学的疎密は、アルコール・ブランクで592nMで計られた。パーセント生活セルは、エレクトロポレーションの前に見本のODによって分割されるエレクトロポレーションの後、見本のODとして計算された。パーセント穿孔の表Ｉ C omparisonと穿孔.を耐えぬいているセルのパーセント発明に従って、10のμｓパルス幅を持っていて、400のボルト・パルス振幅を持っているパルスの倍数セットがどちらの40のIJLSでもさらに20のより長い持続期間単一パルスの後にあったこと我々（グループＡのために）または一人の（グループＢのために）20μｓ。パルスの先行技術セットは、グループＣによって提供される。 10μ秒パルス数^1,2 グループ A³ ％穿孔％生存０ 25.51 81.98 １ 55.62 87.91 ２ 55.62 86.94 ４ 81.51 85.84 ８ 88.29 95.14 16 96.31 76.99 グループ B⁴ ％穿孔％生存０ 16.45 90.97 １ 15.72 99.45 ２ 12.11 92.11 ４ 29.88 88.46 ８ 85.08 94.34 16 98 80.01 グループ C⁵ ％穿孔％生存０ ND ND １ 5.25 94.05 ２ 12.03 87.75 ４ 28.48 77.2 ８ 70.52 77.36 16 83.96 70.59 1.全てのパルス電圧は、400のボルトであった。 2.パルス区間は、0.1秒であった。 3.発明に従ってA.を寄せ集めなさい、10人のμ二世のパルス列は40のμｓの単一のパルスと20のμｓの単一のパルスの後にあった。 4.発明に従ってB.を寄せ集めなさい、10のパルス列はどうか20のμｓの単一のパルスの後にあった。 5.先行技術の中で提示されるので、C.を寄せ集めなさい、10のμｓのパルス列は以前のパルスなしで摘出された。 In表Ｉの中で表にされる実験の結果を解読して、基Ｃデータが400のボルトの定数パルス振幅を持っていて、0.1秒の定数パルス区間を持つていて、10のマイクロ秒の定数パルス幅を持っているパルスの先行技術パルス列を表示することを思い出される。パルスが３つの異なるパルス幅を持つ発明に従って、「0」付加マイクロ秒パルスを除いては、グループＡのためのデータは、パルス列を表示する。グループＡのためのパルスのために、パルスは定数パルス振幅と定数パルス区間を持つ。パルスが２つの異なるパルス幅を持つ発明に従って、「0」付加マイクロ秒パルスを除いては、グループＢのためのデータは、パルス列を表示する。グループＢのためのパルスのために、パルスは定数パルス振幅と定数パルス区間を持つ。パルスのそれは、一般に、より大きいより麻痺した、注意されてある、より大きい‖穿孔されたセルの百分比。これは、発明（基ＡとＢ）の先行技術パルス列（基Ｃ）と２つのパルス列のために真性である。先行技術パルス列のための極大パーセント穿孔は、83.9G％である。しかし、鋭い差異において、発明のグループＡパルス列のための極大パーセント穿孔は、96.31％である。発明のグループＢパルス列のための極大パーセント穿孔は、98％である。明らかに。発明で、パーセント穿孔が、先行技術パーセント穿孔.を超える生存度に関して、グループＣのための平均値パーセント生活は、81.39％である。データを「0」付加10マイクロ秒パルスから締め出して、グループＡのための平均値パーセント生活は、86.56％である。データを「0」付加10マイクロ秒パルスから締め出して、グループＢのための平均値パーセント生活は、90.87％である。明らかに、両方のグループＡにおいて発明の方法に取り囲まれているデータのための平均値パーセント生存度とグループＢは、グループＣの中で先行技術データのために平均値パーセント生存度を超える。表Ｉの中でデータ・プレゼントからそれ以上の意味を誘導するために、表IIは調製された。表IIは、エレクトロポレーションにおける成功が穿孔されるセルの数と生きたままであるセルの数に依存するという事実をに関する。表IIにおいて、データの各基のために、生成物は％生存のその相当値によって％穿孔の値を増加させることによって得られた。そのような生成物は、穿孔されたセルの数とエレクトロポレーションプロセスを耐えぬくセルの数を表示する複合材数を提供する。そのような複合材数は、エレクトロポレーションの有効性のより多くの代表種であるそれもｔ穿孔または一人の％生存。明らかに、グループＡとＢ（発明）の各々のための生成物は、グループＣ（先行技術）のために、対応する生成物を超える。それから明らかに総体的なエレクトロポレーション交換効率、アカウントに両方とも取得、セルの穿孔と生存度のエクステントは、先行技術で発明のパルス列で大きである。本発明がセットが前方に治療方法原料にパルスされた電界を提供することによってプロセスに提供する目的の全てをなしとげる上記から、電気パルスがどこに還元したセル致死率を生産するかは、生細胞に一連の電気パルスの塗布には明白である。発明で、パルスされた電界で原料を処理する方法は、応用パルス系列の最大オペレーター制御のために、電気パルス機器のオペレーターにプロセスを提供する。発明で、一連の電気パルスの間、パルス幅を変更するために、プロセスを提供するパルスされた電界で原料を処理する方法は、提供される。発明で、一連の電気パルスの間、パルス電圧を変更するために、プロセスを提供するパルスされた電界で原料を処理する方法は、提供される。発明で、パルスされた電界で原料を処理する方法は、プロセスの制御のために機械を提供する。発明で、パルスされた電界で原料を処理する方法は、エレクトロポレーションの中で形づくられる起因性気孔を支えるパルス・プロトコルを提供する。発明で、パルスされた電界で原料を処理する方法は、原料のためにより多くの時間がエレクトロポレーションを経ているセルを入れるのを許すために少なくとも３つのパルスを提供するパルス・プロトコルを提供する。発明で、パルスされた電界で原料を処理する方法は、細胞生存とトランスフェクション交換効率を改良するために電気のウェイを提供する。発明で、パルスされた電界で原料を処理する方法は、40％を超えるセルがエレクトロポレーションを生じているパルスを耐えぬくとき、極大トランスフオーメーション交換効率がなしとげられるエレクトロポレーションの方法を提供する。本発明が図面と関連して記述されて、特殊性で完全に上記を記述した、そして、多くの改造型がそれについて前方にここで原則と概念セットから立ち去ることなく作られるかもしれない芸術において、発明の最も実際的で好まれた具体化であるために現在それと思われることと関連した明細が普通のスキルのそれら（He nce）に明らかな間、本発明の適当な有効範囲は全てのそのような改造型を取り囲むために添付の要求と当量の最も広い解釈だけによって、決定されなければならない。

【手続補正書】【提出日】平成１１年４月８日（１９９９．４．８）【補正内容】明細書可変方向を有する電界で材料を処理する方法および装置技術分野本発明は、材料（特に、生きている細胞）にパルス電界の定義されたパターンを印加する分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、特に、エレクトロポレーション，エレクトロフュージョンおよびエレクトロマニュピュレーションの分野に関連する。エレクトロポレーションとエレクトロフュージョンは、原核細胞および真核細胞の操作に種々に使用される現象に関する。エレクトロポレーションは、細胞膜を横切る短時問の電位（パルス）の印加による細胞膜の穿孔（destabalization ）である。正しく管理されていれば、穿孔の結果、細孔が存在する間に高分子が通ることができる一時的な細孔が膜にできる。したがって、エレクトロポレーションにおいて、膜含有材料の膜は、処理物質を入れるために開く。エレクトロフュージョンは、細胞膜を横切る短時問の電位の印加での少なくとも２つの細胞の融合である。エレクトロフュージョンにおいて、膜含有材料の膜は、他の膜含有材料の膜と融合するために開く。この点で、ある膜含有材料は、他の膜含有材料用の処理物質としてみなされるかもしれない。エレクトロフュージョンの物理的および生物学的パラメータは、エレクトロポレーションのそれらに似ている。細胞膜に印加される電位は、種々のパルス波形を供給する装置を使用して印加される。２つの最も共通のパルス波形は、指数関数的な減衰と矩形波とである。指数関数的な減衰パルスは、キャパシタンス放電パルスジェネレーターで発生させられる。それは、最も安価なパルスジェネレーターであって、操作者にパルス・パラメータを介して最少の制御を与える。矩形波パルスジェネレーターは、より高価で、パルス・パラメータを介してより多くの制御を与えて、細胞により死に至らしめないパルスを発生させる。両方のパルス波形について、細胞に修復可能な細孔を発生させるために必要なエネルギーは、細胞のサイズ，形および組成に関係する。エレクトロフュージョンで、細胞が膜穿孔の時点で接触しなければならない。これは、遠心のような物理的手段，抗体ブリッジングのような生化学的手段および誘電泳動を通した電気的手段によって果たされる。誘電泳動は、不均等な電界における細胞膜を横切る低い電圧電位の印加による細胞内の双極子の生成である。双極子は、ＤＣまたはＡＣ電場において生成することができる。ＤＣ電場は容認できない熱を発生させる傾向があるので、ラジオ周波数ＡＣは誘電泳動のためにたびたび使用される。エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンの使用は、多い。部分的なリストは、以下の通りである。（１）真核細胞および原核細胞の両方へのＤＮＡまたはＲＮＡの一時的導入、（２）真核細胞および原核細胞の両方へのＤＮＡの永久トランスフェクション、（３）遺伝子治療のための人間および動物細胞へのＤＮＡの永久および一時的トランスフェクション、（４）細胞への抗体，他の蛋白質類または医薬品の導入、（５）ハイブリドーマを生成する抗体の生成、（６）植物における花粉電気形質変換、（７）電気挿入、（８）動物胎児の操作、（９）付着細胞のエレクトロフュージョン、（１０）植物体細胞雑種の生産、（１１）ＤＮＡワクチン接種、および（１１）ガン治療。エレクトロポレーションまたはエレクトロフュージョンが働く方法の一つは、細胞膜にホールまたは細孔の形成を引き起こすことである。細胞への電気パルスの印加によって引き起こされる細胞細孔の正確な性質についていくつかの論争がある。しかし、実質的な効果は、引き起こされた細胞透磁率にあり、接近した接触にある他の同様に影響された細胞と融合する傾向である。細胞膜の融合におけるまたはそのための細孔の導入については直流電圧閾値がある。閾値以下の電圧は実質的な細胞膜障害をもたらさない。多くの細胞のための閾値電位は、細胞膜を横切る約１ボルトである。したがって、細胞膜を横切って１ボルトの電位を与えるために電極間でセンチメートルにつき印加される全直流電圧は、細胞の直径に比例する。より大きい細胞（例えば、多くの哺乳類の細胞）がいくぶんより低い電圧を必要とする一方、小さい細胞（例えば、バクテリア）は高い直流電圧を必要とする。その細胞に必要とされる電圧に影響する細胞骨格の構造のような他の細胞に特定の変数がある。細胞のエレクトロポレーションまたはエレクトロフュージョンをもたらすのに十分強力であるＤＣ電気パルスを用いるとき、主な問題は、プロセスが細胞を容認できない割合でたびたび死に至らしめるということである。致死性率は、５０ %と同じくらいかそれよりも高いかもしれない。細胞へのそのような高い致死率が好ましくないたくさんの理由がある。細胞が前の生きている遺伝子療法に更なる使用のために扱われるとき、細胞への致死性は、適切な数の細胞が治療の遺伝材料を取り込むことを妨げる。生体内遺伝子治療が患者に行われるとき、細胞への致死性は、ほとんど効果のない処置になるだけでなく、患者に危害を与えるかもしれない。たくさんの方法が、エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンにおける細胞殺傷を軽減するために用いられている。最も一般に用いられている方法は、指数関数的な減衰パルスにの代わりに矩形波形状のＤＣパルスを細胞に印加することである。この方法は、閾値を超えるのに十分な直流電圧を印加している間に細胞に印加される全エネルギーを軽減する。矩形波形状のパルスは改良したが、細胞に電気エネルギーを効果的に印加している間にまだ相当な細胞殺傷がある。エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンのために現在市場に出されている矩形波パルサーは、たくさんの調整可能パラメータ（電圧，パルス幅，パルスの合計数およびパルス周波数）をもつ。一旦セットされたならば、これらのパラメータは各パルス・セッションにおける各パルスに対して固定される。例えば、１，０００ボルト／センチメートル，２０マイクロ秒のパルス幅，１０に等しいパルス数および１Ｈｚのパルス周波数の電圧が選ばれるならば、１０のパルスの各々が、パルス・セッションに対して１，０００ボルト／センチメートルおよび２０マイクロ秒で固定される。しかしながら、固定されたパルス・パラメータを使用する矩形波パルサーを用いるときでも、細胞の望ましくなく高い致死率がまだ生じるかもしれない。この点で、細胞の致死率がかなり軽減されるように波形パルスが制御されることができるならば、それは望ましいだろう。 “Electroporation and electrophoretic DNA transferintocell”と題するSu kharevらによる記事（Biophys．J.，第６３巻，1992年１１月，１３２０〜１３２７頁）には、３台の発電機がＤCパルスを発生させるために使われることの開示がある。遅延発生器は、第１のパルジェネレータ一を制御して、生物学的Ｃｏｓ−１細胞に印加する第１のＤＣパルスを発生させる。遅延発生器は、時間遅延を発生したのち、第２のパルスジェネレーターを制御して、細胞に印加される第２のＤＣパルスを発生させる。第２のＤＣパルスは、第１のパルスから形成された誘発された細孔を維持するために不十分である。しかしながら、第２のパルスは、前にパルスされた細胞にＤＮＡ材料の電気泳動をもたらすのに十分である。いくつかのキーポイントは、Sukharevらの論文における開示に関して注意される。まず、第１のパルスの結果として細胞に形成された誘発された細孔は、誘発された細孔を維持するのに十分な付加パルスを細胞に印加することなしに、第１のパルスが終了した後に、収縮し始める。第２に、Sukh arevらの論文は、誘発された細孔形成パルスの後に、細胞生存能力の問題に関係しない。第３に、Sukharevらで与えられるパルスは２つだけである。したがって、ＤＮＡ材料が細胞に入ることができる時間は、２つだけの短時間パルスの効果によって制限される。この点で、エレクトロポレーションにおいて形成された誘発された細孔を維持するパルス・プロトコルが与えられるならば、それは望ましいだろう。さらに、エレクトロポレーションを受けた細胞に細胞生存能力を改善する方へ向けられたパルス・プロトコルが与えられるならば、それは望ましいだろう。さらに、エレクトロポレーションを受けた細胞に材料が入る時間をもっと許すために、少なくとも３つのパルスを与えるパルス・プロトコルが与えられるならば、それは望ましいだろう。 "Somatic Hybridization between Human and Mouse Lymphoblast Cells Produ ced by in ElectricPulse-Induced Fusion Technique"と題されたS．大野らによる記事（細胞構造と機能，第9巻，1984年，１９３頁〜１９６頁）に、一緒に生物学的細胞を溶かす１００ｋＨｚで０．８ｋＶ／ｃｍの交番電界の使用が開示されている。交流が一連の電気パルスを与える点に注意する。この一連の電気パルスはすべて、同じ持続期間，同じ大きさおよび同じパルス間隔を有する。 "Optimization of Electroporation for Transfection of Human Fibroblast Cell Lines with origin-Defective SV40 DNA:Development of Human Transform ed Fibroblast Cell Lines with Mucopolysacchari doses(I--VII)"と題されたオカモトらによる記事（細胞構造と機能，第１７巻，１９９２年，１２３頁〜１２８頁）には、いろいろな電気パラメータが最適条件エレクトロポレーションを得るためにテストされた開示がある。電気パラメータは、電圧，パルス持続期間，パルス数およびパルス波形を含む。選択された電気パラメータのどんな特別なセットに対して、選択されたパラメータ一をもつパルスのすべてが同じ持続期間，同じ大きさおよび同じパルス間隔を持つ点に注意される。 "Replacement of the macronuclear ribosomal RNA genes of a mutant Tetra hylmena using electroporation"と題されたOriasらによる記事（遺伝子，第７０巻，１９８８年，２９５頁〜３０１頁）には、２台の異なるエレクトロポレーション装置が使用される開示がある。各エレクトロポレーション装置が各エレクトロポレーション・ラン用の一連の電気パルス（パルス列）を与える点に注意される。どんな特別なエレクトロポレーション・ランに対しても、パルス列のパルスのすべては同じ持続期間，同じ大きさおよび同じパルス間隔を持つ。 "High-voltage electroparatian of bacteria:Genetic transformation of Ca mpylobacter jejuni with plasmid DNA"と題されたミラーらによる記事（Proc． Natl．Acad．Sci USA，第85巻，１９８８年２月，８５６頁〜８６０頁）には、いろいろな電気パルス・パラメータが最適条件エレクトロポレーションを得るためにテストされた開示がある。電気パルス・パラメータは電界強度と時定数とを含む。選択されたパルス・パラメータのどんな特別なセットに対しても、選択されたパラメーターをもつパルスのすべてが同じ電界強度と同じ時定数とを持った点に注意される。 "Birth of normal young aftere lectrofusion of mouse oocytes with round spermatids"と題されたOguraらによる記事（Proc．Nitl．Acad．Sci USA，第91 巻，1994年8月，7460頁〜7462頁）には、ダルベッコのPBS媒体へのＡＣ（２ＭＨｚ，１０秒間の２０〜５０Ｖ/ｃｍ）およびＤＣ（８０マイクロ秒間の１５００Ｖ／ｃｍ）パルスの露出によって卵母細胞が電気励起された開示がある。続く電気励起で、細胞はダルベッコのPBS媒体から離され、Hepes/Whitten媒体に置かれ、一つの精子細胞で注入された。卵母細胞スーパーマティッド（oocyte-spe rmatid）対は、融合媒に置かれ、体ＡＣパルス（２ＭＨｚ，１５〜３０秒間の１００Ｖ／ｃｍ），融合ＤＣパルス（１０マイクロ秒間の３７５０〜４０００Ｖ／ｃｍ）および次のＡＣパルス（２ＭＨｚ，１５〜３０秒間の１００Ｖ／ｃｍ）のシーケンスに露出された。卵母細胞活性化パルスと卵母細胞スーパーマティッド融合パルスとの印加の間の時間間隔は、１５〜４０分であった。いくつかの点は、Oguraらの論文の開示に関して注意される。最初に、エレクトロポレーションは管理されない。その代わりに、エレクトロフュージョンは管理される。さらに、卵母細胞への精子細胞のエントリは、エレクトロポレーションではなく注入によってである。第２に、２つだけのＤＣパルスが使用される。ＡＣパルスのいずれも、エレクトロポレーション閾値を与えるのに十分な電圧レベル（例えば、２００Ｖ／ｃｍ）を有しない。２つのＤＣパルスのシーケンスは、誘発された細孔形成を具備するとして開示されていない。細孔形成は、細胞融合のこの方法に役立たない。規定は、形成された細孔を維持するか、扱われる細胞の生存能力を維持するためにはない。 "Optimization of electroporation for transfection of mammalian cell li nes"と題されたAndreasonらによる論文（Anal．Biochem，第１８０巻，No.２，２６９頁〜２７５頁、１９８９年８月）には、矩形波パルスを用いたエレクトロポレーションによるトランスフェクションが、指数的に減少するパルスと反対に、反復パルスによってかなり増やされるとわかったとの開示がある。異なるパルス振幅は、異なる電界強度の効果を決定するために異なる実験ランにおいて試された。所定の実験的ランのために、各ＤＣパルスは、他の各ＤＣパルスと同じ電圧と同じ持続期間とを有する。 "Transdermal Delivery of Metoprolol by Electroporation"と題するVanbeve rらによる記事（Pharmaceutical Research，第１１巻，Ｎｏ１１，１６５７頁〜１６６２頁，１９９４年）には、エレクトロポレーションが皮組織を横切って薬を供給するために用いられることができるという開示がある。論文は、最適のエレクトロポレーション条件を決定する目的で一連のエレクトロポレーション実験を開示する。指数的に減衰している容量性の放電に基づいて３種類のパルスを作り出すために、プログラムされたエレクトロポレーション装置が使用された。一つのＨＶパルス（３５００Ｖ〜１００Ｖの範囲）と、一つのＬＶパルス（４５０Ｖ〜２０Ｖの範囲）と、第１のＨＶパルス，インターパルス遅れ（１秒）からなるツイン・パルスおよび第２のＬＶパルスとである。２以上のパルスが印加されるならば、それらは１分までに分離された。印加されるパルスのどれも形状は矩形ではない点に注意される。対のパルスを用いて、実際の実験において、第２のＬＶパルスは、１００ボルト（１６５９頁の図１および図２を参照）の３つのパルス振幅をもつ。なされた実際の実験の結果の比較結果として、「単一パルスは、メトプロロール（metoprolol）浸透性を助成するために対のパルスと同じように効果的であり、対のパルスの印加が必要でなかったことを示している」と１６５９頁の第２のカラムで結論付けられている。さらに、同じ頁の同じカラムで始まり１６６０頁の第１のカラムまでの更なる結論は、「低い電圧での長いパルス（６２１±３９ｍｓ）は、メトプロロール（metoprolol）浸透性を助成するために、短いパルス時間（３．１±０．１ｍｓ）の高電圧パルスよりもはるかに効果的であった」と述べている。１６６０頁の第１のカラムの第１のパラグラフで始まる部分で、著者は、「数百ボルトで数ミリ秒の時定数のパルスが経皮浸透性についてドラマティックな効果を有すると報告されているが、この研究で用いられた短い高電圧パルスはほとんどどんな効果も持たなかった。」と述ベている。明らかに、Vanbeverらは、異なる振幅のパルスをもつパルス列を用いることから離れることを教える。さらに、Vanbeverらの論文は、エレクトロポレーションを受けている細胞のために細胞生存能力の問題に関係しない。 "Addition of serum to electroporated cell senhancessurvival and transf ection efficiency"と題されたBahnsonらによる論文の抄録（Biochem．Biophys ．Res．Commun，第１７１巻，Ｎｏ．２，７５２〜７５７頁，１９９０年９月１４日）には、血清はエレクトロポレートされた（electroporated）細胞の膜を迅速に閉じる（reseal）ことと、エレクトロポレーションに続く血清のタイムリーな追加が細胞生き残りおよびトランスフェクション効果を向上することとを開示する。血清の使用を必要とするよりはむしろ、細胞生き残りおよびトランスフェクション効果を向上するのに電気的方法が与えられることが好ましい。 "Electroporation:parameters affecting transfer of DNA into mammalian c ells"と題されたKnutsonらによる論文（Anil．Biochem，第１６１巻，Ｎｏ．１，４４〜５２頁，１９８７年７月）の抄録には、高電圧放電波形が立上り時間，ピーク電圧および立下り時間に関して変えられる装置を開示する。哺乳類の細胞が複数の電圧放電に晒されるテストがなされた。しかし、複数の露出はＤＮＡ転移を向上させなかった。複数のパルスの使用で、各パルスが他のパルスと同じ電圧および同じ持続期間をもつ点に注意される。 "Effects of pulse length and pulse strength on transfection by electro poration"と題されるKubiniecらによる論文（Biotechniques，第８巻，Ｎｏ．１，１６〜２０頁，１９９０年１月）の抄録には、パルス電界強度Ｅとパルス長１／２τ（指数関数的な減衰するパルスの半減衰時間）の比較的重要性がヘルまたはHUT-78細胞に対して研究されたことを開示する。理論的には、エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いる開示はない。数年の間、たくさんの革新が電界およびエレクトロポレーション，エレクトロフュージョンおよび誘電泳動とについてなされ、以下に述べる米国特許はそれらの革新の一部の代表である。米国特許4,441,972号は、均一でない電界を与える特別に設計された電極を含むェレクトロフュージョン，細胞ソーティングおよび誘電泳動の装置を開示する。均一でない電界は、細胞をソートするために用いられる。特に、少なくとも一つの電極は、複数の実質的に同心円の溝を含む表面を有する。そのような同心円の溝を包含している電極の準備は高価で時間がかかるかもしれないので、同心円の溝を含む電極の使用なしに、生きている細胞に印加される電界にバリエーションを与えるエレクトロフュージョン装置が与えられることができるならば、それは望ましいだろう。米国特許4,441,972号の装置は、誘電泳動によってソートしている細胞のために用いることができる。細胞ソーティングについては、電極に印加されるＡＣ電圧の周波数および強度は、コレクションのために望ましい細胞が開孔部から所定の放射距離に達したのちに、電界が緩められたときに出口部分を通って引き揚げるように変えらたかもしれない。ＤＣ電気パルスは、細胞ソーティンのために用いられる。米国特許4,141,972号の装置は、また、エレクトロフュージョンのために用いられることができる。この使用方法については、低いＡＣ電圧は、細胞が電極間で隣接して整列するために電極に印加される。典型的には、約２５０ｋＨｚで約１０ボルト／ｍｓの穏やかなＡＣ電界が用いられるかもしれない。その後、約５０マイクロ秒間に約１０〜約２５０ボルトのＤＣの一つの短時間パルスが、整列された細胞の融合を引き起こすのに印加されるかもしれない。その特許は、インパルスの周波数，電圧および継続時間が、ソートされたか融合された細胞の型および大きさに従って、または、用いられるキャリヤー・ストリームの型に従って調整されるかもしれないことを明らかにする。その特許には、コンピュータを含むいろいろな装置が電極への入力周波数および電圧を制御するために用いられることができるという開示がある。しかしながら、米国特許4,441,972号には、エレクトロフュージョンに払われている特別な注意について、エレクトロフュージョンを実施するための一つ以上ののＤＣパルスを用いるという開示はない。米国特許4,476,004号が米国特許4,441,972号に密接に関連しているとともに類似した開示をもつ点に注意される。米国特許4,695,547号は、エレクトロフュージョン，エレクトロポレーションなどのための探針（プローブ）を開示する。高電圧パルスの適当な電源が、１アンペアまでの電流と１〜９９０ミリ秒の継続時間で２５〜１７５ＤＣの範囲の出力電圧パルスを与えることができるとして開示されている。エレクトロフュージョンまたはエレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許4,750,100号は、エレクトロポレーション用の指数関数的に減衰するパルスまたは矩形波パルスを供給することができる高電圧および高アンペア・スイッチ素子を開示する。エレクトロポレーションまたはトランスフェクションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許4,832,814号は、生きている細胞のエレクトロフュージョンを行うために用いられるエレクトロフュージョン細胞を開示する。電源は、一連の３つのＤＣパルス（それぞれ１２マイクロ秒で，１秒のパルス間隔をもつ６８ボルト）を与える。各ＤＣパルスが他のＤＣパルスと同じ電圧および同じ持続期間をもつ点に注意される。米国特許4,882,281号は、エレクトロフュージョン，エレクトロポレーションなどのための探針を開示する。上述した米国特許4,695,547号に開示されているように、高電圧パルスの適当な電源が１アンペアまでの電流および１〜９９０ミリ秒の継続時間で２５〜１７５ＤＣの範囲で出力電圧パルスを与えることができるとして開示されている。エレクトロフュージョンまたはエレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許4,910,140号は、短い持続期間の高強度電界を印加することによる原核細胞のエレクトロポレーションの方法を開示する。この特許は、パルスが所望の全期間を含む単一パルスから通常なることを明らかにする。代わりに、パルスは、所望の２〜２０ｍｓｅｃで来る累積時間をもつ複数のより短いパルスからなるかもしれない。結合された効果が細胞壁の透過になるように、そのような一連のパルスはお互いの近くに十分に間隔をあけられなければならない。典型的には、そのようなパルスは５ｍｓｅｃ以下まで離れて間隔をあけられる。より好ましくは、２ｍｓｅｃ以下まで離される。米国特許4,955,378号は、生体内エレクトロフュージョンを実施するための動物または人間の解剖サイトにパルスを供給するための電極を開示する。それは、一般に、エレクトロフュージョンが、２０ボルトの振幅および１パルス／秒のパルス・レートでの２０マイクロ秒持続期間の３つの方形波を電極に印加して一定の電圧条件下で好ましくはなされることを開示する。各ＤＣパルスが他のＤＣパルスと同じ電圧および同じ持続期間をもつ点に注意される。米国特許5,007,995号は、生きている細胞のエレクトロフュージョン用の装置を開示する。ＤＣパルスを用いる代わりに、ＡＣパルスが使用された。一連の研究は、ＡＣ周波数，印加されたＡＣ電圧およびＡＣパルスの継続期間の変数間で行われた。各研究では、３つの変数のうちの２つは一定の状態に保たれ、１つの変数は異なる徐々に増加する設定でその変数を設定することによって変えられた。エレクトロフュージョンを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,019,034号は、組織に大きい分子を運搬する目的で組織をエレクトロポレーションする方法を開示する。カエルの皮が、一例として用いられる。エレクトロポレーションを実施する際に、パルスの形状，持続期間および周波数が選択される。ピーク電圧は、また、初期設定で置かれる。エレクトロポレーションが起こるまで、パルスはより高い電圧に徐々に循環される。その点、パルス波形，持続期間、周波数および電圧は、所望の量の分子移転が起こるまで維持される。米国特許5,124,259号は、塩化物イオンが排除される特に定義されたバッファを用いているエレクトロポレーションの方法を開示する。エレクトロポレーションを実施する際に、電圧が１００〜１０００ｖ／ｃｍで、電圧を印加するための時間が０．１〜５０ミリ秒であるという開示がある。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,128,257号は、いくつかの試験槽と、エレクトロポレーションのために用いた電極とを開示する。電力供給は、２００から２０００ボルトまでの電圧範囲を与える。パルス幅は、０．１から１００ミリ秒までの範囲、好ましくは１から１０ミリ秒までの範囲である。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,131,070号は、細胞が培養される特別に覆われた電極を開示する。電極上の細胞はエレクトロポレーションにかけられる。エレクトロポレーションを実施する際に、電界強度を計る装置は、細胞が穿孔するまで増加する電位を印加することができ、また、どの電界で細胞が穿孔したかを検知できる「知的な」エレクトロポレーション装置が与えられるように、マイクロプロセッサーに適切にインターフェースされる。装置が穿孔を引き起こすのに必要な条件を測定し、穿孔が起こるときを検出するので、穿孔を引き起こすのに十分なエネルギーだけがシステムに導入されてから、現在の調停された細胞死に相当な減少が生じる。しかしながら、エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示がない点に注意される。それに加えて、エレクトロポレーション装置は、いろいろな細胞線のために必要とされる穿孔電位に関係している情報と、起こるかもしれない穿孔の型および大きさについてのいろいろな中間構成物の効果とを記録することができる。しかしながら、供給は、引き起こされた細孔形成を維持するためなされていない点に注意される。米国特許5,137,817号は、生体内にエレクトロポレーションを行うために特別に設計された電極を用いたエレクトロポレーションの装置および方法を開示する。エレクトロポレーションを実施する際に、一つのＤＣ電圧パルスが宿主細胞に印加される。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,173,158号および米国特許5,283,194号はそれぞれ、選択的にあるサイズの細胞を許し他を除外する電極を使用するエレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョンのための装置および方法を開示する。単一パルスは、エレクトロポレーションを起こす電界を発生させる。エレクトロポレーションまたはエレクトロフュージョンを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,186,800号は、上述した米国特許4,910,140号でなされたように、短期間の高強度電界を印加することによる原核細胞のエレクトロポレーションの方法を開示する。米国特許5,186,800号も、印加されたパルスが、所望の全期間を含む単一パルスから通常なることを開示する。代わりに、パルスは、所望の２〜２０ｍｓｅｃの範囲で起こる累積時間をもつ複数のより短いパルスからなるかもしれない。結合された効果が細胞壁の透過となるように、そのような一連のパルスはお互いの近くで十分に問隔をあけられなければならない。典型的には、そのようなパルスは５マイクロ秒以下まで離され、好ましくは２マイクロ秒以下まで離れる。一連の実験は、最大細胞転移を与えた方法パラメータを確かめるために行われた。各実験において、一つの電気パルスがエレクトロポレーションをもたらすために用いられた。実験的なパラメータは、電気パルス，宿主細胞の密度，転移材料の密度およびポスト・ショック潜伏期間のたくさんのパラメータを含んだ。エレクトロポレーションを受けている細胞の生存能力と転移能力（transfor mability）がパルスの初期電界強度に非常に敏感であることが観察された。達した結論は、細胞生き残りは電界強度を増やすことで着実に下がるということであった。また、行われた各実験では、最大転移効率は細胞の３０〜４０ %がパルスを耐えぬくと結論された。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。上述したことを考慮して、４０% を超える細胞がエレクトロポレーションを実行しているパルスを耐えぬくときに最大転移率が達せられるエレクトロポレーションの方法が与えられたならば、それは望ましいだろう。米国特許5,211,660号は、生体内エレクトロフュージョンを行う方法を開示する。使用された直流電流電荷の電気的パラメータに関する詳細は開示されていない。米国特許5,232,856号は、特別に設計された電極を使用するエレクトロポレーション装置を開示する。たくさんのエレクトロポレーション実験が、たくさんの異なる宿主細胞と異なる転移材料を用いて行われた。各実験において、一つのＤＣパルスだけが宿主細胞に印加された。エレクトロポレーションを実施するために複数のＤＣパルスを用いることの開示はない。米国特許5,273,525号は、薬と遺伝子供給のために注射器ベースのエレクトロポレーション電極を開示する。エレクトロポレーション電極を用いる際に、一定のパルス振幅，一定のパルス幅および一定のパルス間隔を有する１〜１００の連続的パルスを与える従来の電源が使用されている。米国特許5,304,120号および米国特許5,318,514号はそれぞれ、人の生きている細胞の生体内エレクトロポレーション用の電極を開示する。エレクトロポレーションをもたらすために電気エネルギーを印加する際に、電源は、好ましくは、電界を繰り返し印加し、また、電界の振幅および持続期問は、薬または遺伝子が生きている細胞を殺すことなくそれらに入るのに細胞の壁を十分に浸透させる。電源は、単極発振パルス列と二極発振パルス列とを含む。選ばれたパルス列に対して、各パルスは、パルス列の他のパルスと同じ電圧に上昇し同じ持続期間をもつ点に注意される。たくさんの理論的な考察とたくさんの既知の発明開示を説明したが、注意は、生物学的細胞への細孔形成の導入に関するある理論的な概念の更なる議論に戻る。しかしながら、ここで討論される理論的な概念のどれも本発明の範囲を規制するつもりでないことが理解される。その代わりに、本発明の範囲は、クレームとその等価物とによってのみ制限される。パルス・セッションの間にパルス・パラメータを変えることは、エレクトロポレーションおよびエレクトロフュージョン効率を維持するか向上させる間の細胞への損傷を減少させることが、本発明の発明者によって発見された。軽減された細胞損傷は、細胞に印加される減少されたエネルギーに関係させることができる。特に、パルス当りに印加される全エネルギーを決定する２つのパラメータは、パルス振幅とパルス幅とである。パルス幅のバリエーションは、パルス振幅のバリエーションと異なる効果を有する。より広いパルスの印加に続くパルス幅の減少は、一連のパルスの全エネルギーを減少する間の上記のスレッショルド電圧の印加を許す。さらに、以下に記述される理論的な理由のために、細胞にすでに形成される細孔のメンテナンスは、新しい細孔を起こすのに必要とされるエネルギーよりも少ないエネルギーを必要としなければならない。上記のスレッショルド電圧を維持している間のパルス幅のバリエーションは、非常に小さい細孔がより広いパルスによって起こされるそれらの例において特に役に立つ。より狭いパルスは、制御された方法に細孔伸張を援助することができた。任意の特別な種類の細胞のための理想的な条件は、外の分子（例えば、小さい有機的分子またはＤＮＡ）が回復不可能なサイズに細孔サイズを伸張することなしに細胞に入れるのに十分な大きさのサイズに細孔伸張を起こす一組の電気パルス・パラメータを見つけることであろう。この目標を果たすパルス・パラメータは、各細胞の型について実験的に決定されなければならない。パルス振幅のバリエーションは、下記の閾値メンテナンス・パルスの印加を許す。一旦上記のスレッショルド電圧に対する十分なエネルキーのパルスが細胞に印加されるならば、細胞膜を横切る電気抵抗に一時的な減少が起こる。細胞膜の減少された電気抵抗のため、閾値以下のパルス電圧は、上記の閾値パルスによって引き起こされる細胞細孔を維持するのに十分でなければならない。このように、先行技術の実体はエレクトロポレーションを引き起こすために電気パルスを用いることは公知であることを示すが、上述の先行技術は、望ましい特徴の以下の組合せを持つパルス電界で材料を処理する方法を示唆も教示のしない。（１）電気的パルスが減少された細胞致死性をもたらす生きている細胞への一連の電気パルスの印加のためのプロセスを与える。（２）電気パルス装置のオペレーターに印加されたパルス・シリーズの最大オペレータ制御のためのプロセスを与える。（３）一連の電気パルスの間にパルス幅を変化するプロセスを与える。（４）一連の電気パルスの間にパルス電圧を変化するプロセスを与える。（５）プロセスを制御する機械を与える。（６）エレクトロポレーションで形成される引き起こされた細孔を維持するパルス・プロトコルを与える。（７）材料がエレクトロポレーションを受けている細胞に入るためにより多くの時間を許すために少なくとも３つのパルスを与えるパルス・プロトコルを与える。（８）細胞生存率およびトランスフェクション効率を向上させる電気的方法を与える。（９）４０%を超える細胞がエレクトロポレーションを実行しているパルスを耐えぬくとき、最大転移効率が達成されるエレクトロポレーションの方法を与える。前述の所望の特性は、以下の説明から明らかなように、本発明のパルス電界で材料を処理するユニークな方法によって与えられる。先行技術を超える本発明の他の利点も、明白になる。ここで、エレクトロポレーションされている材料に加えられる処理物質の他の態様に着目すると、Gunter，A．Rofmann，Sukhendu B．Dev，Gurvinder S，Nand aによる論文''Electrochemotherapy:Transition from Laboratory to the Clini c''（IEEE工学，薬と生物学，１９９６年１１月／１２月，１２４〜１３２頁））には、生体内器官の周りに配置された一組の電極に印加される電界の方向を変える機械的スイッチング配置の開示がある。機械的スイッチング配置は、電極の６個のニードル列の電極を機械的に選択する機械式回転スイッチの形である。そのような機械的スイッチング配置は、点火栓にエネルギーを割り当てるために自動車分配器に近い関係を負う。そのような機械的スイッチング配置は、電極用のパルス・パターンの選択可能なシーケンスに広いバリエーションを許さない。エレクトロポレーションの電界を除いて、電界の方向を逆転させる概念は、心臓の電気除細動，電気的除細動，ゲル電気泳動およびフィールド逆転毛管電気泳動のようなたくさんの分野で使用されている。心臓応用に関して、Kallokの米国特許5,324,309号は、電気除細動と電気的除細動のための方法および装置を開示する。この方法を用いることに、複数のパルスは、動物の心臓のまわりの場所の配列に置かれる複数の電極に向けられる。スイッチ素子を制御するマイクロプロセッサーはパルスを所定の電極に向ける。Kallokの方法および装置の目的は、細動または他の導電問題が補正されるように心臓の電気系統を修正することである。Kallokは、心臓に処理物質を加えることを開示しない。この点で、Kallokは、電界を変えることは心臓による処理物質の取り込みを助けることを明らかにしない。ゲル電気泳動に関する重要な問題として、異なる方向からの電界は、比較的長い期間（例えば、０．６〜１２５秒）にわたって、また、比較的低い電圧（例えば、３．５〜２０Ｖ／ｃｍ）で印加される。また、フィールド逆転毛管の電気泳動に関する重要な問題として、逆方向電界は、比較的長い期間（例えば、２秒）にわたって、また、比較的低い電圧（例えば、５０Ｖ／ｃｍ）で印加される。さらに、ゲル電気泳動とフィールド逆転毛細管電気泳動に関して、膜含有材料は（例えば、細胞，組織，器官およびリポソーム）は処理を受けない。発明の開示電気パルスシーケンスは、それらの電位可変性にほとんど無限である。多くの種類のパルスシーケンスは、電気通信とレーダの分野で用いられる。例えば、パルスシーケンスは連続であり得る。連続パルスシーケンスは、単極でも双極でもあり得る。パルスシーケンスは、矩形波または方形波または矩形波の特殊ケースを含むことができる。所定の数の矩形形パルス（ユニポーラかバイポーラ）は、ゲートで制御されるかバーストされたパルスシーケンスに与えられる。パルスシーケンスでは、パルスは、異なるレベルの振幅（パルス振幅変調）で与えられることができる。これは、この型のパルス列は計算機通信でモデムおよびコンピュータに一般に用いられる。パルスは、異なるパルス幅または持続期間（パルス幅変調）で与えられることができる。そのような場合、一定のパルス間隔が維持される。パルスは、異なるパルス間隔（パルス間隔変調）で与えられることができる。そのような場合、一定のパルス幅が維持される。電気パルスシーケンスの特定のカテゴリーは、「アジャイルパルスシーケンス（agile pulse sequence）」として知られている。この特許の目的として、定義によって、アジャイルパルスシーケンスは、以下の特性を持つ。（１）シーケンスのパルスの数は２〜１，０００まで変動する。（２）シーケンスのパルスは形状が矩形である。（３）シーケンスの各パルスはパルス幅をもつ。（４）シーケンスのパルスの始めと次のパルスの始めとの間にはパルス間隔がある。（５）シーケンスのパルスのためのパルス振幅は、１００ボルト以上であり、好ましくは２００ボルト以上である。（６）パルス極性は、シーケンスのパルスに対して単極でもバイポーラでもよい。存在するかもしれないアジャイルパルスシーケンスのもう一つの特性は、シーケンスの方形パルスの「オン」時がパルス間隔の１０ %未満であるということである。アジャイルパルスシーケンスがコミュニケーションおよびレーダ応用に使用されたけれども、アジャイルパルスシーケンスは材料を処理するためには使用されなかった。特に、材料のよく定義され制御された永久または一時的変化を起こす触媒として変えられ操作され機能するよく制御された強度の電界を与えるために材料を処理するのにアジャイルパルスシーケンスを使用することは、先行技術は開示しないが、本発明は与える。特に、本発明によると、パルス電界による材料（特に、有機的材料）を処理する方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスをもつアジャイルパルスシーケンスを材料に印加するステップを含み、アジャイルパルスシーケンスは以下の特性のうちの１つ、２つまたは３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる。（２）少なくとも３つパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる。（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組についての第１のパルス間隔は、少なくとも３つパルスの２つの第２の組についての第２のパルス間隔と異なる。特に、本発明によると、パルス電界による材料（特に、有機的材料）を処理するための方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有するアジャイルパルスシーケンスを材料に印加するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つはパルス振幅が互いに異なる。本発明によると、パルス電界による材料（特に、有機的材料）を処理するための方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有するアジャイルパルスシーケンスを材料に印加するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つはパルス幅が互いに異なる。本発明によると、パルス電界による材料（特に、有機的材料）を処理するための方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有するアジャイルパルスシーケンスを材料に印加するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組についての第１のパルス間隔は少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組についての第２のパルス間隔と異なる。本発明の他の広い面によると、細胞に細孔形成を引き起こすためにパルス電界で生物学的細胞を処理する方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有するアジャイルパルスシーケンスを細胞に印加するステップを含む。ここで、アジャイルパルスシーケンスは、以下の特性のうちの１つ、２つまたは３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる。（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる。（３）引き起こされた細孔が比較的長い期間維持され、かつ、細胞の生存能力が維持されるように、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組の第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組の第２のパルス間隔と異なる。特に、本発明によると、細胞に細孔形成を引き起こすためにパルス電界で生物学的細胞を処理する方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有するアジャイルパルスシーケンス細胞に印加するステップを含む。ここで、引き起こされた細孔が比較的長い期間維持され、かつ、細胞の生存能力が維持されるように、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも３つは、パルス振幅が互いに異なる。さらに、本発明によると、細胞に細孔形成を引き起こすためにパルス電界で生物学的細胞を処理する方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有するアジャイルパルスシーケンスを細胞に印加するステップを含む。ここで、引き起こされた細孔が比較的長い期間維持され、かつ、細胞の生存能力が維持されるように、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる。また、本発明によると、細胞に細孔形成を引き起こすためにパルス電界で生物学的細胞を処理する方法が与えられる。この方法は、少なくとも３つのパルスを有するアジャイルパルスシーケンスを細胞に印加するステップを含む。ここで、引き起こされた細孔が比較的長い期間維持され、かつ、細胞の生存能力が維持されるように、少なくとも３つのパルスのうちの３つの第１の組の第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組の第２のパルス間隔と異なる。アジャイルパルスシーケンスが非正弦波の電気パルスのシーケンスの一種であることは上記の説明から明らかである。この点で、本発明の原理によると、非正弦波の電気パルスシーケンスの他のカテゴリーが、アジャイルパルスシーケンスを除いて、材料を処理するために使用される。この点で、本発明のより広い面によると、パルス電界で材料を処理する方法が与えられ、この方法は、１００Ｖ／ｃｍ以上、好ましくは２００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスを材料に印加するステップを含む。少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスは、以下の特性のうちの１つ、２つまたは３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる。（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる。（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組の第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスのうちの３つの第2の組の第２のパルス間隔と異なる。好ましくは、材料は有機的材料である。この点で、本発明の他のより広い面によると、細胞に細孔形成を引き起こすためにパルス電界で生物学的細胞を処理する方法が与えられる。この方法は、１００Ｖ／ｃｍ以上、好ましくは２００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスを生物学的細胞に印加するステップを含む。少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスは、以下の特性のうちの１つ、２つまたは３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる。（２）少なくとも３つのパルスのうちの２つは、パルス幅が互いに異なる。（３）引き起こされた細孔が比較的長い期間維持され、かつ、細胞の生存能力が維持されるように、少なくとも3つのパルスのうちの２つの第１の組の第１のパルス間隔は少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組の第２のパルス間隔と異なる。本発明のさらに別の面によると、加えられた処理物質および電界で膜含有材料を処理する方法が与えられる。ここで、電界の方向は変えられる。エレクトロポレーションの分野では、重要な面は、電界が細胞表面の接線に垂直である細胞上のサイトで最も大きい効果があるということである。エレクトロポレーションが最も大きい所で、加えられた処理物質の細胞へのエントリは容易にされる。細胞は粗く丸いので、細孔は、通常、電極に最も近い細胞のポールで形成される。細胞表面接線の角度が電界と平行になるほど、パルスの効果は減少する。エレクトロポレーションの効果は、最大限の効果のサイトから９０度離れて（完全な球上で）ゼロになる。これらの考察を考慮に入れて、電界方向の変化が細胞の異なる領域を最大電界に晒し、これにより、加えられた処理物質の細胞へのエントリが容易になる。電界の方向のこの変化は、細胞により多くの細孔の形成を引き起こし、したがって、エレクトロポレーション効率を増加する。電界の方向が変えられる本発明の方法は、以下のステップを含む。複数の電極が、処理されるべき膜含有材料の周りに位置配列で配列される。電極は、電極選択装置の出力に接続されている。電極選択装置の入力は、アジャイルパルスシーケンス・ジェネレーターの出力に接続されている。処理物質は、膜含有材料に加えられる。電気パルスは、電極選択装置に印加される。印加されたパルスは、電極アレイの選択された電極に所定のシーケンスで電極選択装置を介して送られる。これにより、材料は、加えられた処理物質および連続的に変えられた方向の電界で処理される。電極のアレイの選択された電極への所定のシーケンスでの電極選択装置を介した印加されたパルスのルーティング（経路選択）は、本発明では多くの方法でなされる。１つの種類のパルス経路選択では、第１のパルスが、第１の選択された電極群に印加される。その後、第２のパルスが、第２の選択された電極群に印加される。その後、第３のパルスが、第３の選択された電極群に印加される。この種類のパルス経路選択は、Ｎ個のパルスのシーケンスが次々とＮ個の選択された電極群に送られるとすることによって一般化される。一例として、生体内組織の周りに配列された８本の電極がある。印加されたパルスは、少なくとも３つの非正弦波電気パルスの高電圧のアジャイルパルスシーケンスであり得、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する。ここで、少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスは、以下の特性のうちの１つ、２つまたは３つを有する。（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる。（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる。（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組の第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組の第２のパルス間隔と異なる。アジャイルパルスシーケンスの第１のパルスは、第１，第３，第５および第７の電極に送られる。アジャイルパルスシーケンスの第２のパルスは、第２，第４，第６および第８の電極に送られる。アジャイルパルスシーケンスの第３のパルスは、第１，第２，第４および第５の電極に送られる。パルスからパルスへの８本だけの電極の選択された群のバリエーションの可能な数は、本発明の装置および方法では非常に大きい数である。偶数のより多くの電極を用いることは、より大きい数の可能なバリエーションさえ与える。この種類のパルス経路選択は、アジャイルパルスシーケンスを含むＮ個のパルスが次々とＮ個の選択された電極群に送られることができるとすることによって、一般化される。偶数のより広いステートメントは、本発明で、アジャイルパルスシーケンスを含むＮ個のパルスがＮ個の選択された電極群に任意の組合せで任意の順番で送られるという効果をもたらす。生体内組織用の他の種類のパルス経路選択では、第１の高電圧のアジャイルパルスシーケンス・パターンが、第１の選択された電極群に印加される。その後、第２のパルスパターンが、第２の選択された電極群に印加される。その後、第３のパルスパターンが、第３の選択された電極群に印加される。この種類のパルス経路選択は、Ｎ個のパルス・パターンが次々とＮ個の選択された電極群に送られることができると述べることによって、一般化される。他の例として、生体内組織の周りに配列された８個の電極があり得る。第１のパルスパターンは、第１，第３，第５および第７の電極に送られて、第２，第４，第６および第８の電極を経由して戻される。第２のパルスパターンは、第１，第２，第４および第５の電極に送られて、残りの電極の任意の一個以上を経由して戻される。パルスパターンからパルスパターンへの８個の電極だけの選択された群のバリエーションの可能な数は、本発明の装置および方法では非常に大きい数である。偶数のより多くの電極を用いることは、可能なバリエーションのより大きい数さえ与える。高電圧のアジャイルパルス電気パルス処理にかけられる対象が、細胞がエレクトロポレーションされる生体内対象（例えば、（人間を含む）動物や植物組織または器官）であるとき、電極に印加されっるパルスの高電圧のアジャイルパルスシーケンスの電界の方向が回転させられ、それにより、生体内主要部へのエレクトロポレーションが向上される。本発明のもう一つの面によると、試験管内の膜含有材料を電界で処理する方法が与えられる。膜含有材料は、細胞，組織，器官およびリポソームを含むことができる。本発明のこの試験管内方法は、位置の配列に試験管内材料を配置するステップと、試験管内材料の位置配列に対応する配列に複数の電極を配置し、電極を電極選択装置の出力に接続するステップと、電気パルサ装置の出力に電極選択装置の入力を接続するステップと、電気パルスを電極選択装置に印加するステップと、電極の配列内の選択され電極に所定のシーケンスで電極選択装置を介して印加されるパルスを経路選択するステップであって、それにより、位置の配列内の試験管内材料が位置の配列においてシーケンシャルに電界で処理される、ステップと、を含む。本発明の試験管内方法を実行する１つの態様では、選択された電極に印加される少なくとも２つの連続したパルスは、電界方向が逆転される。本発明の試験管内方法を実行するもう一つの態様では、電極は、テスト・プレートのＭ個のウエルに関連されたＭ対の電極として配列される。本発明の試験管内方法を実行するもう一つの態様では、電極は、キュベットに関連された一対の電極として配列される。本発明の試験管内方法を実行するもう一つの態様では、電極は、キュベットに関連されたＰ個の電極として配列される。ここで、Ｐは２より大きい。テスト・プレートのＭ個のウエル（キュベット）用のＭ対の電極として電極が配列されるとき、高電圧パルス／電界は電極選択装置のコンピュータ制御によって任意の順番でこれらのキュベットのいずれにでも送られる。これは、一度に１個のキュベットを用いることによって実験を進行するために大いに時間を軽減する感度分析を例とする多数の実験を進行するために用いられることができる。電気パルス処理にかけられる対象が、たとえば細胞がエレクトロポレーションされているキュベットのような試験管内対象であるとき、電極に印加されたパルスシーケンスにおける電界の方向は回転させられることができ、それにより、エレクトロポレーションが向上される。生物学的細胞がエレクトロポレーションにかけられているキュベットの反対側に配置された２個の電極として電極が配列されているとき、電極に印加されたパルスシーケンスにおける電界の方向は順次逆転され、それにより、エレクトロポレーションが向上される。本発明のもう一つの面によると、材料を電気パルスで処理する装置が与えられる。この装置は、アジャイルパルスシーケンス発生器と、アジャイルパルスシーケンス発生器に電気的に接続された電極選択装置とを含む。電極選択装置は、アジャイルパルスシーケンス発生器に電気的に接続された一組の入力コネクタと、一組の少なくとも２個の出力コネクタと、入力コネクタと出力コネクタとの間に接続された選択可能スイッチの列とを含む。一組の電極は、電極選択装置の少なくとも２個の出力コネクタに電気的に接続される。好ましくは、選択可能スイッチは、プログラマブル・コンピュータ制御スイッチである。代わりに、選択可能スイッチは、手で操作されるスイッチでもよい。以下の詳細な説明をよりよく理解するために、また、この分野に対する本発明の貢献をよりよく認識するために、以上の簡単な説明は本発明のより重要な特徴をむしろ広く明らかにしている。もちろん、以下に記述される本発明の追加の特徴がある。上記から分かるように、本発明の目的は、電気パルスが減少された細胞致死率を生み出す、生細胞に一連の電気パルスを印加するプロセスを与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、印加されたパルス列の最大操作制御のプロセスを電気パルス機器のオペレーターに与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、一連の電気パルスの間にパルス幅を変化するプロセスを与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、一連の電気パルスの間にパルス電圧を変化するプロセスを与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、プロセスの制御用の機械を与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、エレクトロポレーションで形成された誘引された細孔を維持するパルス・プロトコルを与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、エレクトロポレーションを受けている細胞に材料が入るのを許すために３個以上のパルスを与えるパルス・プロトコルを与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、細胞生存およびトランスフェクション交換効率を向上する電気的方法を与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、４０%を超える細胞がエレクトロポレーションをもたらしているパルスを耐え抜くとき、最大トランスフォーメーション交換効率が達成されるエレクトロポレーションの方法を与える、パルス電界で材料を処理する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、生体内または試験管内で電気パルスを電極の配列に選択的に印加する方法および装置を提供することにある。本発明の他の目的は、生体内の組織若しくは器官または試験管内のキュベットに印加された電界を回転させる方法および装置を提供することにある。発明の他の目的は、試験管内のキュベットに印加される電界をシーケンシャルに印加および逆転する方法および装置を提供することにある。本発明を特徴づける新規性の種々の特徴および本発明の他の目的とともにこれらは、特に明細書の一部を構成している請求項において指摘される。本発明、その使用による利点および特定の目的をよりよく理解するために、本発明の好ましい実施態様を説明する添付の図面および記載事項が参照されるべきである。図面の簡単な説明以下の詳細な説明を理解することにより、本発明はよりよく理解され、上記の目的およびそれ以外の目的が更に明らかになろう。そこで、添付図面を参照して説明する。図１は、パルス電界およびプログラム可能な電極選択装置で材料を処理する本発明の方法を実施するために使われる装置全体のブロック線図である。図２は、図１に示されたインターフェース・コントロール組立体の主たる機能ユニットを部分的に模式的に示すブロック線図である。図２Ａ〜図２０は、図２のインターフェース・コントロール組立体に関する電気回路図である。特に、図２Ａは、マイクロプロセッサへのステータス（ＩＮ）の電気回路図である。図２Ｂは、マイクロプロセッサからの制御（ＯＵＴ）の電気回路図である。図２Ｃは、チップ・セレクト・デコーダーの電気回路図である。図２Ｄは、パルス・ルータ・インターフェースの電気回路図である。図２Ｅは、正弦波振幅に関する電気回路図である。図２Ｆは、正弦波周波数に関する電気回路図である。図２Ｇは、ＨＶ電力供給Vprogの電気回路図である。図２Ｈは、パルス電流モニター（P-IMON）の電気回路図である。図２１は、ＨＶ電力供給VM ONの電気回路図である。図２Ｊは、パルス幅制御の電気回路図である。図２Ｋは、パルス出力駆動装置の電気回路図である。図２Ｌは、バス・コネクタの電気回路図である。図２Ｍは、パワー／リセットの電気回路図である。図２Ｎは、ＲＳ２３２の電気回路図である。図２０は、不揮発性スタティックＲＡＭの電気回路図である。図３は、図１に示した高電圧組立体の主要部品を示す電気回路図である。図３Ａから図３１は、図３に示した高電圧組立体に関する電気回路図である。より詳しくは、図３Ａは、ＨＶコントロールおよびＰＳＶＭＯＮの電気回路図である。図３Ｂは、リザーヴァ・キャパシターの電気回路図である。図３Ｃは、ＨＶスイッチの電気回路図である。図３Ｄは、ＦＡＵＬＴに対する電力供給装置およびパルス不能の電気回路図である。図３Ｅは、ＨＶ電力供給プログラム電圧および放電制御の電気回路図である。図３Ｆは、パルス電圧モニター（P-VMON）の電気回路図である。図３Ｇは、パルス制御モニター（P-IMON）の電気回路図である。図３Ｈは、信号バス・インターフェースの電気回路図である。図３Ｉは欠陥モニター回路の電気回路図である。図４は、図１に示したプログラム可能パルス・スイッチの主要部品を示す部分的に模式的に示すブロック線図である。図４Ａは、図４に示した３−状態スイッチの１つの電気的な模式図である。図５は、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つが互いにパルス振幅が異なる非正弦波パルスを示す図である。図６は、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つが互いにパルス幅が異なる非正弦波パルスを示す図である。図６も以下の表ＩのグループＡに対応する点に注目される。図７は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組の第１のパルス間隔が少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組の第２のパルス間隔と異なる非正弦波パルスを示す図である。図８は、本発明の電極選択装置に接続された２個の電極を備えた単一キュベットを示す図である。図９は、キュベットの周りの異なる位置に配置され、本発明の電極選択装置に接続された８個の電極を備えた単一のキュベットを示す図である。図１０Ａ〜図１０Ｆは、２極電界がキュベットを介して回転される、単一キュベットを介して電界を動かす第１の典型的パターンを示す図である。図１１Ａ〜図１１Ｆは、４極電界がキュベットを介して回転される、単一キュベットを介して電界を動かす第２の典型的なパターンを示す図である。図１２Ａ〜図１２Ｃは、電界が４極から３極、５極へ変化する、単一キュベットを介して電界を動かす第３の典型的なパターンを示す図である。図１３は、電極選択装置の各端子に接続された電極をそれぞれ有する、８個のテスト・ウエルを持つテスト・プレートを示す図である。発明の実施態様この発明は、エレクトロポレーションまたは電気融合の目的で電気パルスを生細胞に印加するプロセスを含む。パルス幅およびパルス電圧のパラメーターは、先行技術のハードウェアまたはソフトウェア・プログラミングによってパルスからパルスまで変更されることができる。電圧および幅を変更するパルスを印加する重要な目的は、エレクトロポレーションまたは電気融合の所望の結果を最大にし、細胞への致死損傷を最小にすることである。この目的は、初期のより高いエネルギー・パルスの後に、印加されたエネルギーの減少を通して細胞に印加されたエネルギーを最適化することによって達成される。エレクトロポレーションおよび電気融合の分野における従来の理論は、閾値電圧が細胞エレクトロポレーションまたは電気融合を成し逐げるために超えられなければならないことを教える。従来の理論を実行することにおいて、単一パルスは、閾値より大きい電圧を有するパルスを印加することによって使われる。さらに、単一パルス概念は、第１の上記の閾値パルスによって引き起こされた細胞膜抵抗の変化を説明することなしに一連のパルスを含めるために従来の理論において拡大解釈される。ここで記述される本発明の発明者は、第１の上記の閾値パルスによって引き起こされた細胞膜抵抗の変化を次のパルスを印加する際に考慮に入れなければならないことを理解した。また、パルスのエネルギーがパルスの電圧と同じくらい重要であることは、従来の理論で受け入れられている。限られたパラメーターの範囲内で、減少するパルス幅は、減少するパルス電圧と同じ効果を持つ。再び、等しいエネルギーのシーケンシャルなパルスが印加されるとき、従来の知識は、最初のパルスに続く変化された電気抵抗を考慮に入れない。細胞に引き起こされた細孔の直径は、エネルギーを増やすことによって大きくされる。細胞の種類およびサイズに依存する臨界エネルギー・レベルを越えて、無制限の膨張によって細胞を破壊する細孔が生成される。細胞構造（例えば、セル・サイトスケルトン）は、細胞細孔の膨張を制限する。最大穿孔は、無制限の細孔膨張の結果である細孔寸法に近いが大きくはないサイズの細孔の最大数によって達成される。本発明の境界および限度は理論上の考察によって束縛されないことが理解される。しかしながら、本発明の使用および動作のよりよい理解のために、簡単な理論上の説明は役に立つかもしれない。特に、本発明者によって明らかにされた新しい理論上の考察によると、印加パルスが細胞への細孔形成を開始し、その細孔がより少ないエネルギーのパルスによって続けられたならば、第２のパルスは、全初期エネルギーのパルスよりも遅い割合で細孔を広げる効果を持つであろう。絶えず減少するエネルギーのパルスは、偶数のより遅い細孔膨張の効果をもち、したがって、臨界最大細孔寸法により近い細孔膨張のより大きい制御に与えるようにする。上述の通り、エレクトロポレーションに関する従来の理論は、絶えず膨張する細孔寸法を有する減少された細胞膜抵抗の生起を論議しない。しかしながら、局所電圧が減少された局所抵抗に比例して減少するので、この減少された抵抗が実際に印加電圧のより少ない効果に終わるかもしれないことは、ここで本発明者によって認められる。これは、細孔寸法を広げる傾向の付加減衰に終わる。この点で、従来の印加されたパルス列はあまりに速く細孔を広げるので細孔膨張のこの自然減衰を利用できないかもしれない。一連のパルスのパルス・エネルギーを段階的に減らしたり連続的に減らす応用によって最大細孔サイズに近づくことは減らされた細胞膜抵抗を通して細孔寸法膨張の自然の減衰の最大使用を許すことが、本発明者の評価である。細胞のエレクトロポレーションは、いくつかの理由のために不均質プロセスである。第１に、細胞は大まかに丸く、細胞膜への電気力は電流の向きに対する細胞膜の角度に比例する。最も大きな力は、細胞膜が電流に対して垂直である細胞のサイトにおいてである。第２に、細胞膜は形状が不規則である。いくつかの細胞は、電極に最も近いサイトに遠いサイトで電流に垂直な細胞膜部を有する射影を持つ。不規則性は不均質エレクトロポレーションへのサイト・スケルトン貢献である。不規則なエレクトロポレーションはエレクトロポレーションの最大化を難しくさせる。なぜならば、１つだけが膨張して破裂すると、細胞が死ぬからである。これは、細孔ができたのちに徐々に細孔を広げる技術を開発することを必須とする。本発明はこの要求を満たす。図面を参照すると、本発明の原理および概念を具体化するパルス電界で材料を処理する方法を実施するための装置が図示されている。本発明のパルス電界で材料を処理する方法を実施するために使われる装置は、図１に示された、Cyto Pulse Sciences社，コロンビア州，メリーランド，米国のModel PA-4000エレクトロポレーション・システムを含む。Model PA-4000エレクトロポレーション・システムは、広範囲にわたるエレクトロポレーション・タスク（その多くは既存の装置で可能でない。）を行うために設計されている。Mo del PA-4000エレクトロポレーション・システムによって実施できる新しいタスクのいくつかは、以下を含む。１個のパルスから次のパルスヘパルス幅を変化すること、１つのパルスから次のパルスへパルス振幅を変化すること、１つのパルスから次のパルスへパルス間隔を変化すること、（負荷から効果的に独立している）高忠実度パルス電界を発生すること、高電圧パルスの非常に正確なレプリカを与えるパルス振幅モニターを提供すること、パルス電流の非常に正確なレプリカを与えるパルス電流モニターを提供すること、コンピューター発生のアジャイルパルス列を提供すること、使われる各パルス列の自動データ・ロギングおよびデータ・レコールを提供することである。その結果、Model PA-4000エレクトロポレーション・システムは、植物および哺乳動物細胞を含む多種多様な材料をエレクトロポレーションするために、非常に見事に制御された高忠実度のパルス電界のシーケンスを提供する。 Model PA-4000エレクトロポレーション・システムは、三大部品を含む。（Pul se Agile^TM発生器として知られている）高電圧のアジャイルパルス列発生器７と、結合された制御コンピューターおよびコンピューター・インターフェース４と、キュベット装置とである。キュベット装置は、標準の０．４ｃｍ，０．２ｃｍおよび０．１ｃｍキュベットで動作する。カスタム・インターフェースは、他のキュベット保持および供給システムに利用できる。Model PA-4000エレクトロポレーション・システム規格は、以下に示される規格表に含まれる。 Model PA-4000エレクトロポレーション・システム用の規格表パルス・パラメータ電界強度対使用されたキュベット 0.4cm 0.2cm 0.1cm 電圧−低域：（ステップ・サイズ１ボルト）最小10ボルト 25v/cm 50v/cm 100v/cm 最大255ボルト 637v/cm 1275v/cm 2550v/cm 高域：（ステップ・サイズ５ボルト）最小50ボルト 125v/cm 250v/cm 500v/cm 最大1100ボルト 2750v/cm 5500v/cm 11000v/cm 振幅を減らすのに要する時間（前のパルスから次のパルスへ） <50のミリ秒最大パルス電流 120アンペアパルス降下 <5% 20オームへの100マイクロ秒のパルス幅で幅 1マイクロ秒から1000マイクロ秒ステップ・サイズ幅 1マイクロ秒立上り時間 <100ns 間隔：最小 0.1秒（振幅変化の関数）最大 4,000秒間隔ステップ・サイズ 1ミリ秒型式 99回9個のパルスまでの矩形波アジャイルパルスシーケンス 9つのグループ；グループ内のパルス・パラメータ定数グループ当たり1から100パルスフロント・パネル・状態液晶ディスプレイキュベット・ホルダー開欠陥パルサ用意プロセス・オン高電圧イネーブル高電圧遮断ゼロパルシングウィンドウズ・オペレイタ・インターフェースパルスシーケンスのセットアップ独自のファイル名でのシーケンス・ファイルの自動保存自動データ・ロギング安全性パルサは、キュベット・ホルダーが開いているときには動かないフロント・パネル・シーケンス停止ボタン高電圧を入れる前の負荷抵抗チェック負荷欠陥の検出時の高電圧パルシング遮断内部欠陥の検出時の高電圧パルシング遮断（Pulse Agile^TM発生器として既知の）アジャイルパルスシーケンサに関しては特に、その概要が図１に示されている。この図は、プログラマブル・パルス・スイッチで構成されたPA-4000システムを示す。キュベット・ホルダーはまた、プログラマブル・パルス・スイッチの出力で接続され、または、プログラマブル・パルス・スイッチが使われないならば、キュベット・ホルダーはパルスされた高電圧出力１１に直接接続される。また、パルス電圧および電流モニター・ポート１０が利用できる。オシロスコープは、パルス信号の複製を見るためにこれらのポートに接続されている。制御ケーブル９が、プログラマブル・パルス・スイッチを制御するために使われる。プログラマブル・パルス・スイッチは、３つの状態（パルス出力，パルス・リターン，無接続）１３の一つおよび一つだけに設定されるＮ個の出力を有する。システムは、３つのキャビネットと、互換ＰＣ１と、制御マイクロプロセッサ４を含むPA-4000キャビネット３と、インターフェース・コントロール組立体５と、高電圧組立体６と、高圧電源７と、低圧電源８と、プログラマブル・パルス・スイッチ・キャビネット１２とを含む。ユーザーへのインターフェースは、互換ＰＣ上にインストールされた、ＭＳ-W indowsオペレーティング・システム１の下で動作するPulseAgilソフトウェアである。オペレーターは、パルスパラメータをセットし、プロセス開始および停止を制御する。プロトコルが動いたあと、データ・ログ・レポートがコンピューター・スクリーン上に提示される。互換ＰＣにおけるPulseAgileソフトウェアは、コマンドを生成して、PA-4000キャビネット４のＺ‐８０マイクロプロセッサに標準ＲＳ２３２シリアル・インターフェース２を介してコマンドを送る。Ｚ‐８０は、コマンドを解読して、順番に全ての他の組立体を制御する。さらに、Ｚ‐ ８０は、電気回路の状態を監視して、Pulse Agileオペレーター・インターフェース・ソフトウェアにＲＳ‐２３２リンクを介して状態報告を送り返す。シリアル・インターフェースを介して通信することは、どんなターミナル・プログラムででも成し遂げられることができる。しかしながら、ＰＣにおけるグラフィック・インターフェース・ソフトウェアは、インターフェースをはるかにユーザー・フレンドリーにする。インターフェース制御組立体は、マイクロプロセッサと、アナログ／ディジタル変換器と、ディジタル／アナログ変換器と、高／低制御および状態線と、パルス発生回路と、プログラマブル・パルス・スイッチ・インターフェースとを含む（図２を参照）。マイクロプロセッサは、４０個のピン接続器１９ディジタル・バス２０を介して全ての他の電気回路に接続されている。このバスは、８つのデータ線と、５つのアドレス線と、６つのチップセレクト線とを含む。データバス線は、チップセレクトおよびアドレス線の状態に基づいて他の電気回路へ情報を転送する。不揮発性ランダム・アクセス・メモリ（NVRAM）部１８はまた、ディジタル・バス２０に接続されている。NVRAMは、どれくらいの時間放電リレーが開閉されるか、および、それがどんな電圧で開閉されるかについての情報を累算する。これは、各プロトコル運転の終わりに印刷される、故障解析のために使われる情報である。ディジタル／アナログ変換器（DAC）は、マイクロプロセッサ８ビット語を実電圧に変換して電源２２をセットするために使われる。このDAC出力は、０〜６ボルトの電圧範囲を持つ。この０〜６ボルトは、高圧電源に信号バス２４を介して運ばれる。高圧電源７に入力される０〜６ボルトは、０〜１１００ボルトの高電圧出力を生み出す。ディジタル・バスに接続された２つの予備DACがある。アナログ／ディジタル変換器（A/D）２６は、マイクロプロセッサによって使われるデジタル語に０〜５ボルトの高圧電源出力電圧モニター信号レベルを変換するために使われる。０〜１１００ボルトの高圧電源出力は、０〜５ボルトのモニター信号となる。アナログ／ディジタル変換器（A/D）２８は、マイクロプロセッサによって使われるデジタル語に０〜２ボルトのプレ・パルス電流モニター信号レベルを変換するために使われる。ユーザーがプロトコルを始めるとき、このプレ・パルスはマイクロプロセッサによって発生される。高電圧がオンされる前に、２ボルトのパルスが発生される。このパルスは、負荷（キュベットその他）を通って伝搬する。このパルスから生じている電流は、０〜２ボルトの信号に変換される。この電圧は負荷抵抗に比例する。負荷抵抗があまりに低い（イオン濃縮その他があまりに高い）と、これは、穿孔されている材料を傷つけるであろう過電流となる。電流があまりに高いと、マイクロプロセッサは高電圧をオンにし、「負荷電流過剰」メッセージを発する。マイクロプロセッサ３０によって生成されるいくつかの高／低制御信号線がある。一つは、高電圧組立体６に信号バスを介して送られるHVON（高電圧オン）である。高電圧組立体６に信号バスを介して送られる他の制御線は、欠陥リセット線である。この線は、欠陥が発生するとラッチをリセットするために使われる。マイクロプロセッサによつて読まれて制御３２のために使われるいくつかの状態線がある。一つはキュベット・ホルダー３３からの線である。キュベット・ホルダーは底に磁石を有する。ハンドルがスライドされて開かれてキュベットを露出すると、これは接触を壊す。この電気回路が閉でない（すなわち、ハンドルが完全に押されている）と、マイクロプロセッサは「キュベット開」メッセージを表示し、高電圧はオンされないか、直ちにオフされる。第２の状態線３４は、プログラマブル・パルス・スイッチにおける接触である。PPSパラレル制御ケーブルがプラグされると、この線は接地される。その後、このロウ線は、PPSが利用できることを示すマイクロプロセッサによって読み取られる。第３の線３４は、欠陥線である。欠陥が高電圧組立体に検出されると、この線はハイとなる。マイクロプロセッサは絶えずこの線を監視し、それがハイになると、「欠陥」メッセージが表示され、高電圧およびパルス発生器は直ちにディスエーブルされる。マイクロプロセッサは、低電圧パルス駆動回路３６を制御する。この回路は、マイクロプロセッサによって、その後パルスを発生するトリガー信号によってプログラムされたパルス幅発生器を有し、全てのパルスが生成されるまで、次のパルス幅はトリガー信号その他によってセットされる。プログラマブル・パルス・スイッチ・インターフェース４０は、マイクロプロセッサからのセットアップ・コマンドを受け取って、特別なPPSパラレル・インターフェース９を介してセットアップ指示を送り出す。このインターフェースは、パルス出力のハイをプログラムされる８つの線の組と、ハイ・パルス・リターンがプログラムされる８つの線の第２の組とからなる。スイッチが接続されないままであると、両方の線はロウに留まる。高電圧組立体は、高電圧スイッチ回路と、蓄積コンデンサーと、電源電圧モニターと、パルス電圧およびパルス電流モニターと、放電リレーと、欠陥検出回路とを含む（図３参照）。高電圧がイネーブルされるとき、リレー・コイル４４が励磁され、放電リレー４５が開けられる。その後、電源電圧プログラム電圧は、指定されたレベルに設定される。その後、高電圧源は、蓄積コンデンサー４０を充電する。その後、フローティング高電圧スイッチ４８は、信号バスを介してパルス駆動信号６０によってオンにされる。低電圧信号は、オプト・アイソレーター４９を介してフローティング高電圧スイッチに接続される。高電圧スイッチがオンされるとき、蓄積キャパシタからの電流が、負荷５４およびパルス電流モニター表示抵抗器５２を通って、電流経路を完了する電源グラウンドに接続されたシステム・グラウンドへ流れる。抵抗分圧器４２は、蓄積コンデンサー４０の両端の高電圧に比例する低電圧信号を生み出す。この基準化された電圧５７は、信号バスに接続され、マイクロプロセッサによって周期的に読み取られる。パルス電流の基準化バージョンは、電流表示抵抗器５２を流れるパルス電流によって生成される。１００アンペアに対して約２０ボルトであるこの電圧は、増幅器６２によってバッファされる。これは、パルス電流モニター・ポートである。基準化されたパルス電圧は、抵抗分圧器５０によって生成される。その後、この電圧は、増幅器８５によってバッファされる。その出力は、パルス電圧モニター・ポートである。 PA-4000において、パルス振幅は、パルスごとに変えられるかもしれず、１２５ミリ秒とほとんど短時間に起こる次のパルスについて１１００ボルト（最大）から５０ボルト（最小）まで変えられる。これは、放電リレー回路４４，４５，４６，４７，５６，５７，５８によってなされる。電圧比較器５６は、高圧電源プログラム電圧６４と蓄積コンデンサー５７上の基準化された電圧との間の電圧を比較する。高圧電源プログラム電圧６４がコンデンサー基準化電圧５７以上であると、比較器の出力５８はロウである。出力５８がロウで高電圧がイネーブルであるとき、リレー・コイルの反対側はハイ６６である。リレー・コイル４４の両端のこの差電圧は、コイル４４を励磁し、リレー４５を開ける。高圧電源プログラム電圧６４が蓄積コンデンサー４０の基準化電圧より低いと、比較器５８の出力はハイとなる。比較器の出力５８がハイでリレー・コイル４４の他の側がハイ６６（高電圧オン）であると、リレー・コイル４４の両端の電圧はなく、リレー４５が閉じる。リレー４５が閉じると、蓄積コンデンサー４０は抵抗器４７を介してシステム・グラウンド５３に接続される。放電の間のこの全電流は抵抗器４７によって制限され、リレー接点が溶接されることを防ぐ。蓄積コンデンサー４０と抵抗器４７との間の時定数は、最小パルス間隔の半分の時間である５０ミリ秒の９５%だけコンデンサー両端の電圧を減らすことができる。電源プログラム電圧６４が例えば電源７からの４００ボルトとなる電圧にセットされると、その電圧になりリレー４５が開となるときに比較器はハイ５８となり、蓄積キャパシタ４５はさらに放電される。このように、蓄積キャパシタ４０の電圧は、最も短いパルス間隔内で最大と最小との間の任意のレベルに速く設定される。高電圧組立体には３つの欠陥検出回路がある。高電圧スイッチ６０，８３，８１，７６と、放電リレー７５，８０，７４，６８と、負荷８４，８２，７８，７９とである。この３つはすべて、ラッチ回路７２に接続されている。３つの線６８，７６，７９のうちの任意の１つがロウになると、ラッチ出力３５はハイとなる。ラッチ出力３５がハイになると、プログラム電圧６４はリレー６５を介して切り離され、パルス駆動はハードウェアのリレー８７を介して切り離される。マイクロプロセッサは絶えずラッチ出力３５を監視し、それがハイになると、「欠陥」メッセージが表示される。システムは、瞬問的にリセット線ハイ３１をもたらすＰＣからリセットされる。リレー放電欠陥回路７５，８０，７４，６８は、放電リレー４５の適当な動作を監視する。リレー４５が働かず電源７および蓄積キャパシタ４０を抵抗４７を介してグラウンド５３に連続的に接続すると、内部回路への損傷が発生し得る。リレー４５が働かず閉じられたままであると、表示抵抗４６を流れる電流が、比較器基準電圧８０より大きい７５になるまでＲＣ結合５１，５２によって積分される電圧を生じる。高圧電源７が最大電圧に設定されると、これは数ミリ秒かかる。高電圧スイッチ欠陥回路６０，８３，８１，７６は、高電圧スイッチの適当な動作を監視する。この回路は、高電圧スイッチ４８が連続的に閉じられると、高電圧が負荷５４に生じないことを保証する。それが起こって高圧電源７がオンにされると、電圧はスケール・パルス電圧抵抗分割器５０に生じる。この電圧８３は、駆動パルスの存在とみなされる。駆動パルス６０なしでは、電圧８３が１秒以内に１０ボルトよりも大きくなると、比較器８１の出力はロウとなる。これは非常に早く、電源がオンになる時間がない。負荷欠陥回路８４，８２，７８，７９は負荷５４を流れる電流をモニターする。キュベットなどのブレーク・ダウンにより高電圧パルスがオンである間に負荷電流が過剰になると、キュベットの内容が蒸発するか内部回路が傷つけられるかもしれない。電流が過剰になると、表示抵抗５２の両端の電圧はしきい値８２よりも増加する。基準が越えられるとき、比較器７９の出力が１マイクロ秒以内に低下する。高圧電源７は、１１００ボルトで１１０ｍＡを供給する商用の単位であり、０〜６ボルトの信号でプログラムされる。低圧電源８は、すべての制御回路に、＋５ボルト，＋１２ボルト，−１２ボルトの電圧を供給する。それは、商用の単位である。プログラム可能なパルス・スイッチ１２は、高電圧ケーブル１１と並行制御ケーブル９とによってＰＡ−４０００に接続されている。概要は図４に示されている。プログラム可能なパルス・スイッチにはＮ個のスイッチ９３があり、それらはすべて同じように動作する。高電圧パルス９０とリターン９１とはＰＡ‐４０００キャビネット５から同軸ケーブルを介して与えられる。２本の制御線９５は、１本はパルス出力を選択するためのものであり、１本はパルス・リターンを選択するためのものである。パルス出力制御線がハイであれば、パルス出力は電極９４に接続される。パルス・リターン制御線がハイであれば、パルス・リターンは電極９４に接続される。どちらもハイでないならば、何も電極９４には接続されない。両方ともハイであれば、何も電極９４に接続されない。３状態スイッチの詳細な回路図が図４Ａに示されている。各スイッチは、マイクロプロセッサからの２つの入力（すなわち、パルス・リターン選択１６１およびパルス出力選択１６２）と、高電圧回路からの２つの入力（すなわち、高電圧パルス１６４および高電圧パルス・リターン１６３）と、マイクロプロセッサからコマンドに従って高電圧パルスまたは高電圧リターンに接続されるか何にも接続されない１つの出力ポート１６７とを有する。スイッチの状態を示す発光ダイオード１６６（パルス）および発光ダイオード１６５（リターン）に接続された２つの指示出力もある。アジャイルパルス発生器からの高電圧パルスおよび高電圧リターンは、Ｎ個のスイッチのすべてに接続されている。マイクロプロセッサ，選択パルス１６２または選択リターン１６１からの各スイッチ用の２本の制御線がある。選択パルス制御線がハイになると、２つのＮＯＲゲートへの入力Ｕ１Ａ，Ｕ１Ｂがハイになる。ＵＩＡピン２はハイであり、ピン２はピン３（出力）をハイにするためにロウでなければならない。第２のＮＯＲゲートＵ１Ｂは、ピン４をハイとし、ピン６（出力）をロウにするピン５をハイとする。ピン６がロウであると、非反転オープン・コレクタ・ドライバＵ７Ｃピン６の出力はロウである。このピンがロウであると、リレーＫ２上のピン１６はロウであり、リレー・コイルを励磁してリレーＫ２を閉じる。このリレーが閉じられると、高電圧パルスは出力電極に接続される。第２の非反転ドライバは、リレーが励磁されるならば明るくされるＬＥＤ１６６に接続される。マイクロプロセッサがリターンを選ぶならば、同じことが生じる。リレーＫ１が閉じられると、高電圧パルス・レターンが出力ポート１６７に接続される。マイクロプロセッサが高電圧パルス線および高電圧パルス・リターン線の両方を不注意にハイにセットすると、ＮＯＲ回路Ｕ１Ａの出力はロウになり、どちらのリレーも励磁されない。これは、両方のリレーが同時に励磁されて短絡が発生する可能性を回避するための安全機能である。マイクロプロセッサから２本の線には４つの可能な条件がある。パルス選択線ハイ−パルス高電圧が出力ポートに接続される。パルス・リターン線ハイ−パルス・リターンが出力ポートに接続される。どちらの線もハイでない−パルスおよびパルス・リターンのどちらも出力ポートに接続されない。両方の線がハイ−パルスおよびパルス・リターンのどちらも出力ポートに接続されない。要約すると、Ｎ個のスイッチはすべて、マイクロプロセッサを介して独立に動作され、スイッチの一つの出力ポートには高電圧パルスまたは高電圧リターンが生じるか何も生じないかである。図５は、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つがパルス振幅が互いに異なる非正弦波パルスを示す。図６は、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つがパルス振幅が互いに異なる非正弦波パルスを示す。図６も以下に示す表１でグループＡと一致する点に注意される。図７は、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１の組用の第１のパルス間隔が少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２の組用の第２のパルス間隔と異なる非正弦波パルスを示す。次の用語は実質的に同義である点に注意される。パルス選択装置、電極選択装置１１０およびプログラマブル・パルス・スイッチ・キャビネット１２である。電極選択装置１１０は、Cyto Pulse Sciences社，コロンビア州，メリーランドのPA‐101として製造され販売されている。この会社は、ここで述べたモデルP A‐4000エレクトロポレーション・システムを製造し販売している会社と同じである。PA‐101は、外部に取り付けられて、高電圧アジャイルパルスシーケンス発生器と別に購入される。PA‐101は、高電圧パルス，接地基準またはフロート電極（いずれの基準にも接続されていない）に任意の電極を接続できる一組の８個のコンピュータ制御ＨＶスイッチを含む。以下に述べるPA‐4000を制御する同じPA‐4000制御ソフトウェアによって、電極選択装置は制御される。ＤＢ‐２５制御ケーブルは、PA‐4000にPA‐101を接続する。上述したように、モデルPA‐4000 Pulse Agile^TMエレクトロポレーション・システムは、コロンビア州，メリーランドのCyto Pulse Sciences社によって製造され販売されている。モデルPA‐4000システムは、すべての標準矩形波および多くのＣＤプロトコルを実行する。モデルPA‐4000システムも、改良されたPulseA gile^TMプロトコルを実行する。モデルPA‐4000 Pulse Agile^TMエレクトロポレータは、広範囲にわたるエレクトロポレーション・タスクを実行し、これらのタスクの多くは現在手に入る既存の機器で可能でない。このシステムは、研究者が基準プロトコルを使うのを許し、プロトコル内のパルス・パラメータを変更する向上されたフレキシビリティをもつ。より多くのツールは最適化に利用できる。そのシステムは、水溶液および組織のプラント・セル，哺乳網セルおよび細菌セルを含む多種多様な材料をエレクトロポレートするために、ハイファイ・パルス電界の非常に緻密な制御を提供する。図８に戻ると、この図は、２つの電極１１３，１１４を備えた単一のキュベット１１２を示す。１つの電極１１３は、電極選択装置１１０の端子Ｎｏ．１に接続されている。第２の電極１１４は、電極選択装置１１２の端子Ｎｏ．２に接続されている。電極選択装置１１０は、２つの電極に印加されたパルスのシーケンシャルに逆極性にプログラムされることができる。それにより、電界の向きが各極性反転に対してキュベット１１３を横切って反転される。極性反転は、各連続したパルスに対して、または、予め定められたパルス・パターンに対して実行されることができる。図９は、キュベットのまわりの異なる位置に周囲に分散された８つの電極を備えた単一のキュベット１３３を示す。電極Ｎｏ．１２１〜１２８は、電極選択装置１１０の端子Ｎｏ．１〜８にそれぞれ接続されている。正／負の極性は、まず、電極Ｎｏ．１２１と電極Ｎｏ．１２５とにそれぞれ印加されることができる。次に、正／負の極性は、電極Ｎｏ．１２２と電極Ｎｏ．１２６とにそれぞれ印加されることができる。次に、正／負の極性は、電極Ｎｏ．１２３と電極Ｎｏ．１２７とにそれぞれ印加されることができる。次に、正／負の極性は、電極Ｎｏ．１２４と電極Ｎｏ．１２８とにそれぞれ印加されることができる。この点で、極性反転が印加されることができる。すなわち、正／負の極性は、電極Ｎｏ．１２５と電極Ｎｏ．１２１とにそれぞれ印加されることができる。次に、正／負の極性は、電極Ｎｏ．１２６と電極Ｎｏ．１２２とにそれぞれ印加されることができる。次に、正／負の極性は、電極Ｎｏ．１２７と電極Ｎｏ．１２３とにそれぞれ印加されることができる。次に、正／負の極性は、電極Ｎｏ．１２８と電極Ｎｏ．１２４とにそれぞれ印加されることができる。このようにしてパルスを電極Ｎｏ．１２１〜１２８に印加することがキュベット１３３のまわりおよびそれを通って回転する電界をもたらすことは、上述した説明から明らかである。正／負の極性の印加の周期的パターンは、所望される回数だけ繰り返されることができる。図９はまた、本発明のもう一つの応用例の図示と考えられる。大きい円は、（動物や植物からのような）生体内器官を示す。電極Ｎｏ．１２１〜１２８は、三次元でその器官のまわりに置かれる。各電極は、電極選択装置１１０上の各端子に接続されている。電極選択装置１１０は、高電圧アジャイルパルスシーケンス発生器２に接続されている。このように、高電圧で非正弦波のアジャイルパルスは、高電圧アジャイルパルスシーケンス発生器２で発生され、選択された電極Ｎｏ．１２１〜１２８に電極選択装置１１０を介して送られる。実質的に、高電圧アジャイルパルスシーケンス発生器２からのどんな所望のアジャイルパルスシーケンスでも、どんな所望のプログラマブル・シーケンスで電極Ｎｏ．１２１〜１２８のどんな所望のサブセットに送られることができる。図１０Ａ〜図１０Ｆは、２極電界がキュベットを通って回転される単一のキュベットを通って電界を移動する第１の典型的なパターンを示す。図１１Ａ〜図１１Ｆは、４極電界がキュベットを通って回転される単一のキュベットを通って電界を移動する第１の典型的なパターンを示す。図１２Ａ〜図１２Ｃは、電界が４極電界から３極電界、５極電界に変化する単一のキュベットを通って電界を移動する第３の典型的なパターンを示す。上述したいくつかの例から、非常に大きい数の電界分布のパターンが、アジャイルパルスシーケンス発生器によって電極選択装置１１０に提供されるパルスに関連して電極選択装置１１０によって選択された電極の順列および組合せを変えることによってキュベットを介して適用され得ることは、明らかである。特に、本発明の電極選択装置１１０では、それが生体内又は試験管内での電界分配にそのような莫大なフレキシビリティをもつことを許すために、選択された電極の少なくとも一つはパルス受信電極として動作し、選択された電極の少なくとも１つはパルス・リターン電極として動作する。さらに、どんな電極の組合せにおけるどんな電極でも、パルス受信電極，パルス・リターン電極又は非パルス伝送電極として機能しなければならない。一般に、Ｎ個の印加されたパルスは、次々とＮ個の電極グループに送られることができる。さらに、Ｎ個の電極グループにおける連続した電極グループは、異なる個々の電極からなることができる。代わりに、Ｎ個の電極グループにおける連続した電極グループは、同じ個々の電極からなることができる。図１３において、テスト・ウエルＮｏ．１〜８をもつテスト・プレート１３５が図示されている。各テスト・ウエルは、電極選択装置１１０の各端子Ｎｏ．１〜８に接続された各第１の電極１４１〜１４８をもつ。各テスト・ウエルも、電極選択装置１１０のリターン端子Ｎｏ．９に接続された各第２の電極１５１〜１５８をもつ。各テスト・ウエルは、他のテスト・ウエルと異なる又は同じ所望の方法でパルスされ得る。本発明のエレクトロポレーション方法の一態様を実施するための上述した装置を使うことによって得られる結果に目を向けると、ここに示した表Ｉは、エレクトロポレーションを実施するために本発明の原理を用いた場合と従来の原理を用いた場合とを比較した実験の結果の表である。表Ｉに示された実験を実施する際に、次のトピックスに関する詳細が考慮に入れられた。すなわち、使われる細胞、エレクトロポレーション条件、穿孔された細胞のパーセントの決定、およびエレクトロポレーションを耐え抜いた細胞の決定である。これらのトピックスに関する詳細は次のとおりである。細胞ＣＨＯ‐ＫＩセル（ＡＴＣＣ）は、完全保存液（ＣＯ₂インディペンデント保存液（Ｇｉｂｃｏ）プラス１０％加熱非活性胎児子牛血清，２ｍＭ・Ｌ−グルタミン，１００ユニット／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ）の中で維持された。細胞は、平らな底のＴ‐１５０フラスコの中で育てられた。懸濁液培養のために、細胞は細胞スクラッパーでＴ‐１５０フラスコからスクラップにされた。細胞サスペンションは、１００ｍｌのスピンナー・フラスコに加えられた。完全保存液が、全容積を１００ｍｌとするために加えられた。スピンナー・フラスコは、８０ｒｐｍのかき混ぜ速度で３７℃に維持された。撹拌培養は、細胞サスペンションの９０ %を取って、完全保存液で容積をもとへ戻すことによって与えられた。エレクトロポレーションのために、５０ｍｌの細胞サスペンションが、ログ位相撹拌培養から取られた。細胞は、血球計数器を用いて手動で数えられた。細胞は、１０分間に４００Ｘｇで遠心分離された。細胞、５００万セル／ｍｌの濃縮で血清フリー保存液（追加のないＣＯ₂インディペンデント保存液）の中で再懸濁された。エレクトロポレーション２５０μｌの細胞サスペンション容積は、２ｍｍ電極ギャップで無菌のディスポーザブル・エレクトロポレーション・キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に加えられた。指示されたならば、１%Ｔｒｙｐａｎブルー溶液（Ｓｉｇｍａ）又は１０ μｇのプラスミドＤＮＡを含む溶液のいずれかの５０μｌがキュベットに加えられた。キュベットは、手製のキュベット・ホルダーに加えられた。エレクトロポレーション用のパルサおよびコンピュータ制御は、この特許で記述されたものであった。パルサはオンにされ、電圧がセットされた。パルス列は、付属のラップトップ・コンピューターにプログラムされ、コンピューター制御によって実行されるパルス列であった。穿孔された細胞のパーセントの決定５０マイクロリットルの１%Tｒｙｐａｎブルー色素溶液（１００ｍｌの蒸留水に加えられた４４%のＴｒｙｐａｎブルー色素の２．４ｇｍ）は、エレクトロポレーション・キュベット内の２５０μｌの細胞サスペンションに加えられた。高電圧パルスを印加する前に、１０μｌサンプルが、エレクトロポレーションに先立ち、色素（デッド・セル）を取り上げる細胞のパーセントを決定するために取られた。パルスは、プログラムされたとき細胞に印加された。エレクトロポレーションの後、１０μｌサンプルが、エレクトロポーレートされた細胞のパーセントを決定するために取られた。細胞は、血球計数器で手動で数えられた。青色細胞は正として数えられ、明細胞は負として数えられた。実際のエレクトロポレーションは、正および負のカウントの両方からバックグラウンドを減ずることによって計算された。エレクトロポレーションを耐えぬいた細胞の決定エレクトロポレーションを耐えぬいた細胞は、組織培養プレートにくっつく細胞のパーセントによって決定された。２４個のウエル・プレートが、各ウエルに完全保存液の合計１ｍｌずつ分析のために用意された。記述されたように、細胞はエレクトロポレーション・キュベットに加えられた。細胞の１０μｌ（若干の実験においては２０μｌ）サンプルが、キュベットから取られて、２４個のウエル・プレートのウエルに置かれた。細胞は、プレートを横切って均一にそれらを分散させるために揺さ振られた。パルス・セッションが印加されたあと、等しいサンプルがキュベットからとられて、２４個のウエル・プレートの異なる隣接ウエルに置かれた。細胞は３７℃で夜通し培養された。次の日、細胞はＰＢＳ内で洗われ、１時間の間１０%バッファー付きホルマリン内で固定された。細胞は、ＰＢＳで、その後は蒸留水で洗われた。細胞は、４００μｌ染料を各ウエルに加えることによって蒸留水内で１%ＣｒｙｓｔａｌＶｉｏｌｅｔで着色された。細胞は、５分間培養されたのち、色素がプレートから溶け出されないまで、蒸留水で洗われた。細胞は、プレートの読出しまで空気乾燥された。７０%アルコールの１ｍｌが各ウエルに加えられて、５分間培養された。アルコール−色素混合物の光学的密度は、アルコール・ブランクで５９２ｎＭで計られた。生存細胞のパーセントは、エレクトロポレーション前のサンプルのＯＤで割られたエレクトロポレーション後のサンプルＯＤとして計算された。表Ｉ穿孔パーセントと穿孔を耐え抜いている細胞のパーセントとの比較。本発明に従って、１０μｓパルス幅を有するとともに４００ボルト・パルス振幅を有するパルスの多数のセットが、４０μｓ＋２０μｓ（グループＡ用）または２０μｓだけ（グループＢ用）のより長い持続期間単一パルスの後に続いた。パルスの先行技術セットは、グループＣによって提供される。 10μｓパルスの数^1,2 グループ A³ ％穿孔％生存０ 25.51 81.98 １ 55.62 87.91 ２ 55.62 86.94 ４ 81.51 85.84 ８ 88.29 95.14 16 96.31 76.99 グループ B⁴ ％穿孔％生存０ 16.45 90.97 １ 15.72 99.45 ２ 12.11 92.11 ４ 29.88 88.46 ８ 85.08 94.34 16 98 80.01 グループ C⁵ ％穿孔％生存０ ND ND １ 5.25 94.05 ２ 12.03 87.75 ４ 28.48 77.2 ８ 70.52 77.36 16 83.96 70.59 1. 全てのパルス電圧は、４００ボルトであった。 2. パルス間隔は、０．１秒であった。 3. グループＡ．本発明に従って、１０μｓのパルス列が４０μｓの単一パルスと２０ｐｓの単一パルスの後に続いた。 4. グループＢ．本発明に従って、１０μｓのパルス列が２０μｓの単一パルスの後に続いた。 5. グループＣ．先行技術で提示されたように、１０μｓのパルス列が先行パルスなしで送られた。表Ｉで示された実験の結果を分析すると、グループＣデータが、４００ボルトの一定のパルス振幅と０．１秒の一定のパルス間隔と１０マイクロ秒の一定のパルス幅とを持つパルスの先行技術パルス列を表わすことを思い出される。グループＡ用のデータは、“０”付加マイクロ秒パルスを除いては、パルスが３つの異なるパルス幅をもつ本発明によるパルス列を表す。グループＡ用のパルスに対しては、パルスは一定のパルス振幅と一定のパルス間隔とをもつ。グループＢ用のデータは、“０”付加マイクロ秒パルスを除いては、パルスが２つの異なるパルス幅をもつ本発明によるパルス列を表す。グループＢ用のパルスに対しては、パルスは一定のパルス振幅と一定のパルス間隔とをもつ。一般に、パルスの数が大きいほど、穿孔された細胞のパーセンテージが大きいことに気づく。これは、先行技術パルス列（グループＣ）および本発明の２つのパルス列（グループＡとグループＢ）の両方に対して真である。先行技術パルス列に対する最大穿孔パーセントは、８３．９６%である。しかし、これに対して、本発明のグループＡパルス列に対する最大穿孔パーセントは、９６．３１%である。本発明のグループＢパルス列に対する最大穿孔パーセントは、９８%である。明らかに、本発明では、穿孔パーセントが先行技術の穿孔パーセントを超える。生存度に関して、グループＣに対する平均生存パーセントは、８１．３９%である。データを“０”付加１０マイクロ秒パルスから除くと、グループＡに対する平均生存パーセントは、８６．５６%である。データを“０”付加１０マイクロ秒パルスから除くと、グループＢに対する平均生存パーセントは、９０．８７ %である。明らかに、グループＡおよびグループＢの両方における本発明の方法によってもたらされたデータに対する平均生存パーセントは、グループＣにおける先行技術データに対する平均生存パーセントを超える。表Ｉでのデータからそれ以上の意味を誘導するために、表IIが用意された。表 IIは、エレクトロポレーションにおける成功が穿孔される細胞の数と生きたままである細胞の数とに依存するという事実に関する。表IIにおいて、データの各グループに対して、積は、穿孔％の値にそれに対応する生存％の値を掛けることによって得られた。そのような積は、穿孔された細胞の数およびエレクトロポレーション・プロセスを耐え抜く細胞の数の両方を示す合成数を提供する。そのような合成数は、穿孔％または生存％であるエレクトロポレーションの有効性をより示す。表II 表ＩのグループＡ，Ｂ，Ｃの各データに対して、穿孔％×生存％が掛けられた。この積は、穿孔の大きさおよび細胞の生存の両方を考慮して総体的なエレクトロポレーション効果に対する複合形状を与える。 10μ秒パルスグループA グループB グループC の数 (穿孔％×生存％) (穿孔％×生存％) (穿孔％×生存％) ０ 2091 1493 ― １ 3218 1563 494 ２ 4836 1115 1056 ４ 6997 2643 2199 ８ 8400 8026 5455 16 7415 7841 5927 明らかに、グループＡ，Ｂ（本発明）の各々に対する積は、グループＣ（先行技術）に対する対応する積を超える。それから、明らかに、穿孔の大きさおよび細胞の生存の両方を考慮した総体的なエレクトロポレーション効果は、本発明のパルス列に対しての方が先行技術に対してよりも大きい。電気パルスが減少された細胞致死率を生み出す、生細胞に一連の電気パルスを印加するプロセスを与えるパルス電界で材料を処理する方法を提供することによって、本発明が上述した目的のすべてを達成することは上記説明から明白である。本発明では、パルス電界で材料を処理する方法が、印加されたパルス列の最大オペレーター制御のプロセスを電気パルス機器のオペレーターに提供する。本発明では、一連の電気パルスの間にパルス幅を変更するプロセスを提供するパルス電界で材料を処理する方法が提供される。本発明では、一連の電気パルスの間にパルス電圧を変更するプロセスを提供するパルス電界で材料を処理する方法が提供される。本発明では、パルス電界で材料を処理する方法は、プロセスの制御のための機械を提供する。本発明では、パルス電界で材料を処理する方法は、エレクトロポレーションで形成された誘引された細孔を維持するパルス・プロトコルを提供する。本発明では、パルス電界で材料を処理する方法は、エレクトロポレーションがなされている細胞に材料が入るのにより多くの時間がかかるのを許すために３つ以上のパルスを与えるパルス・プロトコルを提供する。本発明では、パルス電界で材料を処理する方法は、細胞生存とトランスフェクション効率を改良するために電気的方法を提供する。本発明では、パルス電界で材料を処理する方法は、４０%を超える細胞がエレクトロポレーションを生じさせるパルスを耐えぬくとき、最大トランスフォーメーション効率が達成されるエレクトロポレーションの方法を提供する。本発明は図面と関連して説明され、また、本発明の最も実用的で好適な実施形態であると現在思われるものに関連して詳細に説明されたが、多くの変形がここで明らかにした原則や概念から離れることなくなされるかもしれないことは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の適当な範囲は、すべてのそのような変形および均等物を含むように添付の請求の範囲の最も広い解釈によってのみ決定されなければならない。請求の範囲 1. 電界と追加された処理物質とにより材料を処理する方法であって、複数の電極を処理すべき材料の周りの位置のアレイに配置するステップと、電極を電極選択装置の出力に接続するステップと、電極選択装置の入力を電気パルサー装置の出力に接続するステップと、前記材料を前記追加された処理物質に接触させるステップと、電極選択装置に電気パルスを印加するステップであって、電極選択装置に印加された電気パルスが、少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスであり、前記材料に対して１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有し、少なくとも３つの非正弦波電気パルスが、（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つが互いにパルス振幅が異なる（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つが互いにパルス幅が異なる（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１の組に対する第１のパルス間隔が少なくとも３つのパルスの２つの第２の組に対する第２パルス間隔と異なるという３つの特徴の１つ、２つ又は３つを有する、ステップと、印加されたパルスを所定のシーケンスで電極選択装置を介して電極のアレイの選択された電極に経路選択するステップであって、それにより、材料が前記追加された処理物質でおよび連続的に方向が変えられる電界で処理される、ステップと、を含む、方法。 2. 電極の少なくとも一つがパルス受信電極であり、電極の少なくとも一つがパルス・リターン電極である、請求項１記載の方法。 3. 電極の任意の組合せにおける任意の電極が、パルス受信電極，パルス・リターン電極または非パルス伝達電極のいずれかとして機能する、請求項２記載の方法。 4. 少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスがアジャイルパルスシーケンスである、請求項１記載の方法。 5. 電気パルスが２００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、請求項４記載の方法。 6. 電極の選択された数が、印加されたパルスを同時に受信する、請求項１記載の方法。 7. Ｎ個の印加されたパルスが、Ｎグループの電極にシーケンスに経路選択される、請求項１記載の方法。 8. Ｎグループの電極の連続するグループの電極が、異なる個々の電極からなる、請求項７記載の方法。 9. Ｎグループの電極の連続するグループの電極が、同じ個々の電極からなる、請求項７記載の方法。 10．Ｎ個のパルス・パターンが、Ｎ個の選択されたグループの電極にシーケンスに経路選択される、請求項１記載の方法。 11．試験管内膜含有材料を電界で処理する方法であって、試験管内材料を位置のアレイに配置するステップと、試験管内材料位置のアレイに対応する位置のアレイに複数の電極を配置するステップと、電極を電極選択装置の出力に接続するステップと、電極選択装置の入力を電気パルサー装置の出力に接続するステップと、電極選択装置に電気パルスを印加するステップと、印加されたパルスを所定のシーケンスで電極選択装置を介して電極のアレイの選択された電極に経路選択するステップであって、それにより、位置のアレイにおける試験管内材料が位置のアレイにおいて連続的に電界で処理される、ステップと、を含む、方法。 12．選択された電極の少なくとも一つがパルス受信電極として動作し、選択された電極の少なくとも一つがパルス・リターン電極として動作する、請求項１１記載の方法。 13．電極の任意の組合せにおける任意の電極が、パルス受信電極，パルス・リターン電極または非パルス伝達電極のいずれかでなければならない、請求項１２記載の方法。 14．Ｎ個の印加されたパルスが、Ｎグループの電極にシーケンスに経路選択される、請求項１１記載の方法。 15．Ｎグループの電極の連続するグループの電極が、異なる個々の電極からなる、請求項１４記載の方法。 16．Ｎグループの電極の連続するグループの電極が、同じ個々の電極からなる、請求項１４記載の方法。 17．選択された電極に印加された少なくとも２つの連続するパルスが、電界方向を逆転させる、請求項１１記載の方法。 18．電極が、テスト・プレート内のＭ個のウエルに関連されたＭ対の電極として配置されている、請求項１１記載の方法。 19．電極が、キュベットに関連された一対の電極として配置されている、請求項１１記載の方法。 20．電極が、キュベットに関連されたＰ個（Ｐは２よりも大きい）の電極として配置されている、請求項１１記載の方法。 21．生体内組織を追加された処理物質でおよび電界で処理する方法であって、処理される生体内組織の周りの位置のアレイに複数の電極を配置するステップと、電極を電極選択装置の出力に接続するステップと、電極選択装置の入力を電気パルサー装置の出力に接続するステップと、処理される生体内組織に処理物質を加えるステップと、電極選択装置に電気パルスを印加するステップであって、電気パルスが、少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスであり、前記材料に対して１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有し、少なくとも３つの非正弦波電気パルスのシーケンスが、（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つが互いにパルス振幅が異なる（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つが互いにパルス幅が異なる（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１の組に対する第１のパルス間隔が少なくとも３つのパルスの２つの第２の組に対する第２パルス間隔と異なるという３つの特徴の１つ、２つ又は３つを有する、ステップと、電極選択装置のプログラマブル・コンピュータ制御スイッチによって、印加されたパルスを所定のシーケンスで電極選択装置を介して電極のアレイの選択された電極に経路選択するステップであって、それにより、生体内組織が前記追加された処理物質でおよび連続的に方向が変えられる電界で処理される、ステップと、を含む、方法。 22．材料を電気パルスで処理する装置であって、アジャイルパルスシーケンス発生器と、該アジャイルパルスシーケンス発生器に電気的に結合された電極選択装置であって、前記アジャイルパルスシーケンス発生器に電気的に接続された一組の入力コネクタと、一組の少なくとも２つの出力コネクタと、前記入力コネクタと前記出力コネクタとの間に接続された選択スイッチのアレイとを含む、電極選択装置と、該電極選択装置の少なくとも２つの前記出力コネクタに電気的に接続された一組の電極と、を具備する、装置。 23．前記選択スイッチが、手動動作スイッチである、請求項２２記載の装置。 24．前記選択スイッチが、コンピュータ制御スイッチである、請求項２２記載の装置。 25．前記選択スイッチが、プログラマブル・コンピュータ制御スイッチである、請求項２２記載の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウォルターズ、リチャード，イー. アメリカ合衆国21045 メリーランド州, コロンビア，ワイルドスワンウエイ 6248 (72)発明者キング，アラン，デイ. アメリカ合衆国20912 メリーランド州, タコマパーク，リンカンアベニュー 405 (72)発明者ウォルターズ，ダーリン，シー. アメリカ合衆国21045 メリーランド州, コロンビア，ワイルドスワンウエイ 6248

Claims

【特許請求の範囲】１．電界と追加された処理物質により、材料を処理する方法であって、複数の電極の列を処理すべき材料の周りに配置し、電極を、電極選択装置の出力に接続し、電極選択装置の入力を、電気パルサー装置の出力に接続し、前記材料を、前記追加された処理物質に接触させ、前記電極選択装置に電気パルスを印加する、ことを特徴とする方法。