JP2007279721A - レーザ走査型顕微鏡の動作方法 - Google Patents

Abstract

【課題】改善されたレーザ走査型顕微鏡の動作方法を提供すること。
【解決手段】本発明によるレーザ走査型顕微鏡の動作方法では、試料は少なくとも１つのスキャナ２を通じて照明され、撮像が行われ、スキャナ２および／またはスキャナ駆動部において温度測定が行われ、限界温度に達すると冷却装置６が始動され、また有利なことに、冷却装置６のスイッチがオンに入ると撮像が中断され、または限界温度に達すると表示装置が光学的表示または音響的表示を行う。
【選択図】 図２

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡の動作方法に関する。レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）のいくつかの適用において、例えば生理学において極度に速い事象を観察する際におけるような、急速に過ぎ去る事象を把握するために、非常に高い走査速度によって動作することが必要である。

ＬＳＭは、本質的に図１に示すように、４つのモジュールすなわち、光源、走査モジュール、検出ユニット、および顕微鏡によって構成される。これらのモジュールを以下に更に詳しく説明する。このＬＳＭは、特許文献１で参照される。

標本における様々な色素の特定の励起のために、ＬＳＭの中に様々な波長を有するレーザが組み入れられる。励起波長の選択は、調査しようとする色素の吸収特性によって左右される。励起放射は、光源モジュールの中で作り出される。この場合、様々なレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が投入される。さらに結果として、光源モジュールにおいて、波長の選択、および例えば音響光学結晶の導入による必要な励起波長の強度の調整が生じる。続いて、このレーザ光が、ファイバまたは適切なミラー装置を介して走査モジュールに至る。

光源において作り出されるレーザ光は、対物レンズの助けによってスキャナ、走査レンズ、および鏡胴レンズを通じて回折制限され、標本の中に集束される。焦点は試料をｘ−ｙ方向に点状に走査する。試料を覆う走査の際の画素滞在時間は大抵、マイクロ秒未満から数秒までの範囲にある。

蛍光の共焦点検出（ｄｅｓｃａｎｎｅｄ検出）では、焦点面（被検物）からおよび上と下にある平面から突き止められる光が、スキャナを通じて２色性分光器（ＭＤＢ）に至る。これは蛍光を励起光から分離する。続いて、蛍光は絞り（共焦点絞り／ピンホール）の上に集束され、この絞りは、精確に、焦点面に結合された平面の状態にある。これによって、蛍光部分は焦点の外へ抑圧される。絞りの大きさの変化によって、顕微鏡の光学的解像力を調整することができる。絞りの背後には、さらに励起光を抑圧する別の２色性ブロック・フィルタ（ＥＦ）がある。ブロック・フィルタを通過した後、蛍光は点検出器（ＰＭＴ）によって測定される。

多光子吸収を使用する場合、励起強度が特に高い小さな容積において染色蛍光の励起が起る。この領域は、共焦点装置を使用する場合に検出される領域より単にやや大きいだけである。これで共焦点絞りの投入を省略することができ、検出を対物レンズによって直接行うことができる（ｎｏｎ−ｄｅｓｃａｎｎｅｄ検出）。

多光子吸収によって励起される染色蛍光を検出するための別の装置は、さらにｄｅｓｃａｎｎｅｄ検出が起るが、それでもこの場合、対物レンズのひとみが検出ユニットの中に形成される（非共焦点ｄｅｓｃａｎｎｅｄ検出）。

３次元照明画像では、２つの検出装置を通じて対応する単光子または多光子吸収と結びついて平面（光学断面）だけが再生され、この平面は対物レンズの焦点面の中にある。次いでコンピュータ援用によって、試料の様々な深さｚでのｘ−ｙ平面における複数の光学断面を作図することによって、試料の３次元画像を発生させることができる。

したがって、ＬＳＭは厚い標本の調査に適している。励起波長は、使用される色素によりその固有の吸収特性によって決定される。色素の放射特性に合った２色性フィルタに基づいて、その都度の色素から放射される蛍光のみが点検出器によって測定されることが確実になる。

生体臨床医学的適用では、現在、多くの様々な細胞領域が様々な色素によって同時に強調される（多重蛍光）。個別の色素を、現況技術では様々な吸収特性または放射特性（スペクトル）に基づいて別々に検出することができる。このために、多くの色素からの蛍光の追加分裂が、副分光器（ＤＢＳ）と、別の点検出器（ＰＭＴｘ）における個別の色素放射の別の検出とによって起る。

Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｉｍａｇｉｎｇ ＧｍｂＨのＬＳＭ ＬＩＶＥは、約１２０画像／秒の結像を行う非常に速いリニア・スキャナを実現している。
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｅｉｓｓ．ｄｅ／ｃ１２５６７ｂｅ００４５９７９４／ｃｏｎｔｅｎｔｓ−Ｆｒａｍｅ／ｆｄ９ｆａ００９０ｅｅｅ０１ａ６４１２５６ａ５５００３６２６７ｂ）
それでも非常に速い走査過程では、高い走査速度はスキャナと走査ドライブの強い発熱を引き起こすことに注意すべきである。

例えば、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社のＶＭ５００スキャナでは、スキャナの中で５０℃の温度を超過してはならない。
このスキャナは確かにドリフト挙動を改善するために一定スキャナ温度を達成するためのスキャナ加熱装置を有するが、それでも冷却のオプションはメーカー側では準備していない。

スキャナは実際の使用では大抵、適切な固定によって隔離されるか、または材料によってハウジングの中にできるだけ振動がないように直接に結合されて格納される。
この場合、構造は大抵、適当な熱排出が可能であるように選択される。

これは、例えばスキャナの固定具と組み合わせた対応する広い金属面によって達成される。これによって、対応する温度降下が発生し、熱の排出が保証される。この場合の欠点は、構造の重量と体積が非常に増加することである。この走査装置の特性は、走査装置が光学システムの中に統合され、その光学システムの質量と体積は大きくなるのではなく小さくなるべきであるから、大抵の適用のためには不利である。

さらに、走査速度の上昇は受け入れられる出力を上昇させ、これは再び改善された冷却を必要とする。現在、損失熱は熱管（ヒート・パイプ）またはペルチェ素子によって、極端な場合には水冷によって導出される。この場合、費用は高くなり、構造の寸法はかなり大きくなる。
独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書

本発明の目的は、これらの欠点を回避することである。

この課題は、独立請求項によって解決される。
好ましいさらなる実施形態が従属請求項の対象である。
正規の動作では、スキャナは平均して過負荷にはならない。受け入れられる出力を、正規の、最高の場合には適合されない構造によって導き出すことができる。高速の適用では、急速に経過する所定の事象が把握される必要があるが、この測定は相応に長い準備段階を有するので、大抵、短時間になり、ほとんど必要ではなくなる。この時、スキャナは使用されないか、または単にわずかに負荷がかかるだけであり、その定格温度に冷却されることが可能である。スキャナは、その仕様書の中で常に、スキャナが高い力動性を処理できるように述べられている。この場合、スキャナの最高温度を超えてはならないことが指摘されている。それでも、スキャナと走査ドライブの温度監視が行われる場合には、温度限界を超過することなく短時間の高速走査の実施が可能である。この状態は、スキャナと走査駆動部（走査ドライブ）との温度測定、ならびに、このシステムの要件に応じたファンの制御の、本発明による組合せによって達成される。高速走査の場合には、走査ドライブの冷却のために使用されるファンを遮断することは有利であり、これによって、ファンと光学的光線経路に悪影響を及ぼす渦巻運動とによる測定中の可能な振動が回避される。この方法では、水冷、ペルチェ冷却などの費用のかかる冷却方法を放棄して簡単なファンを導入できることは有利である。

走査システムにおいて、スキャナの温度を連続測定中にスキャナの中にある温度センサによって監視すること、および走査ドライブの温度を、ドライブの冷却体と外部で熱的に結合されたファン制御回路の導入によってコントロールすることができる、組合せ温度・ファン制御が導入されることは有利である。このファン制御回路（ファン・コントローラ）は、固有の温度把握を有し、決定された温度しきい値に応じてファンのスイッチを開閉し、この場合、この切替え事象は外部の切替え信号によって解放され遮断されることが可能である。この場合、複数の測定事象および制御事象が同時に経過する。この際、制御と測定値取得は異なる独立した事象によって導かれる。まず、温度の走査速度への依存性は接続されたコンピュータ・システムにおいて管理され、さらにファンは、独立しているがそれでも外的に制御可能な駆動によって作動される。これによって、本発明ではシステムの保護が達成可能である。測定個所の組合せと、使用者が利用する走査−駆動体系と組み合わせたこの測定個所の評価により、高い力動性を有する走査システムのための経済的な解決策に導かれる。１つの好適な解決策が、上記の温度測定システムを備えたファンの導入によって達成され、このファンは、走査ドライブの冷却体における温度が上限界を超えたときのみオンに切り替えられる。温度把握のこの方法は可変走査体系を許容し、この可変走査体系では、スキャナもドライブも同様に短時間に限界まで作動されることができ、熱による破壊の危険性が生じることはない。スキャナの内部限界温度は、走査中にリアルタイムで内部温度センサの試問を通じてアナログ・デジタル変換器（ＡＤＣ）を介して測定される。走査中に限界値を超過すると通告が出され、高速走査は定義通りに断たれる。最低温度を下回ると、短時間に新たな高速走査が許可される。ドライブの温度は、ファン制御のセンサを通じて把握され、内部的にしきい値と比較される。限界温度に達すると、ファンは自動的にオンに切り替えられ、ユーザはファンがオンに切り替えられたという報告を得る。単に調整プロセスのみを実施する概観走査のためには、ファンを、なお十分な冷却を提供するがわずかな風音しか発生しなくなるような様々な速度によっても、常に作動させておくことができる。コンピュータ内で行われるスキャナの内部温度測定および限界温度曲線と、ファンと関係する外部温度測定との協働によって、システム内の走査ユニットの構造と組立ての際に利点がもたらされる。

本発明を、図２の概略図によって以下にさらに詳しく説明する。
スキャナ（２）における温度センサ（１）が、スキャナ（３）の温度を、十分に短い間隔でマイクロコントローラ（３）の支援によって把握する。温度測定が直接スキャナ（３）において行われ、このスキャナ用に記憶された限界値曲線との継続的比較が、走査中にマイクロコントローラ（３）で行われる。走査ドライブ冷却体（４）の温度把握は、これと熱的に結合されたファン・コントローラ（５）によって実施され、ファン・コントローラ（５）は、冷却体の温度に応じてファン（６）をオンおよびオフに切り替えるか、またはパルス幅変調（ＰＷＭ）によってファン６の回転数を調整する。ファン・コントローラ（５）にあるスイッチ入力側（７）を介して、マイクロコントローラ（３）はファン（６）を無効状態にすることができる。ファン・コントローラ（５）は超過温度出力（８）を有し、その超過温度出力（８）はファン・スイッチが入る温度以上の所定の温度を超過した場合に活性化される。この超過温度出力（８）にマイクロコントローラ（３）の入力が接続されている。高速走査の結果として、走査ドライブ冷却体（４）の温度が、超過温度出力（８）が活性化状態になるまで上昇すると、マイクロコントローラ（３）を介してスイッチ入力（７）における無効状態が取り消され、ファン（６）は最大出力で作動して、冷却体の温度を再び低下させる。

スキャナ（２）の温度が５０℃（限界温度）に達すると走査は中断され、所定の温度以下になると再び始動することができる（ソフトウェア・ヒステリシス）。
高速走査は時間的に、上述の場合が発生しないように制限すべきであり、そうすれば故障のない走査動作が保証されるからである。

接続されたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）を使用して、スキャナの温度経過ならびにファン状況をオペレータのために表示装置にグラフ表示することができる。即ち、ＰＣは、限界温度への到達および／またはスキャナ２を冷却するために必要な時間を表示装置に表示することができる。

レーザ走査型顕微鏡の構成を示す図。 レーザ走査型顕微鏡における温度関しの原理を示す概略図。

符号の説明

１…温度センサ、２…スキャナ、３…マイクロコントローラ、４…走査ドライブ冷却体、５…ファン・コントローラ、６…ファン、７…スイッチ入力側、８…超過温度出力側。

Claims (7)

1. レーザ走査型顕微鏡の動作方法であって、
   試料が少なくとも１つのスキャナを通じて照明され、撮像が行われ、
   前記少なくとも１つのスキャナおよび／またはスキャナ駆動部において温度測定が行われ、限界温度に達すると冷却装置が始動される
   方法。
2. 前記冷却装置のスイッチがオンに入ると撮像が中断される請求項１に記載の方法。
3. レーザ走査型顕微鏡の動作方法であって、
   試料が少なくとも１つのスキャナを通じて照明され、撮像が行われ、
   スキャナおよび／またはスキャナ駆動部において温度測定が行われ、限界温度に達すると冷却装置が始動し、前記少なくとも１つのスキャナが停止される
   方法。
4. レーザ走査型顕微鏡の動作方法であって、
   試料が少なくとも１つのスキャナを通じて照明され、撮像が行われ、
   前記少なくとも１つのスキャナおよび／またはスキャナ駆動部において温度測定が行われ、限界温度に達すると表示装置が光学的または音響的表示を行う
   方法。
5. 前記表示装置が、限界温度への到達および／またはスキャナおよび／またはスキャナ駆動部を冷却するために必要な時間を表示する、請求項４に記載の方法。
6. 温度測定が直接スキャナにおいて行われ、このスキャナ用に記憶された限界値曲線との継続的比較が、走査中にコンピュータ中で行われる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 撮像が限界温度に到達するまで行われる、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。

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