JP2021519451A - 改良された走査光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

光学走査顕微鏡は、焦点体積内で試料からの発光放射線の発光を引き起こすのに十分な強度で、焦点体積（１２４）内で励起放射線（１５２、１５４）を提供するように、共に動作可能な照射システム（１６０）および対物レンズ（１３４）を含む。対物レンズ（１３４）は、対物スキャナ（１３０、１３２）によって走査される。この例では、ｘ−ｙ変換器（ｘｙＸＤ）（１３０）は、走査レンズマウントとして機能する運動学的フレクシャ機構（１３２）に接続されている。運動学的フレクシャ機構は、対応する次元において発光焦点体積を走査するために、対物レンズの光軸に対して横方向の２次元で対物レンズを走査するように動作可能である。運動学的フレクシャ機構は、単一の３Ｄ印刷された部材であり得る。【選択図】図１

Description

本発明は、光学走査顕微鏡に関する。本発明は、例えば、単一光子励起を使用する共焦点蛍光顕微鏡検査で使用することができる。本発明は、例えば、二光子励起（ＴＰＥ）顕微鏡検査を含む多光子励起蛍光顕微鏡検査（ＭＦＭ）などの、非線形走査光学顕微鏡検査でも使用することができる。

光学走査顕微鏡検査の分野において、蛍光顕微鏡では、レーザで試料に励起光子を照射して蛍光を発生させる。対物レンズは、励起光子を焦点体積において集束させる。励起光子はフルオロフォアによって吸収され、蛍光光子が発光され、検出される。焦点体積を試料全体で走査して、発光の画像を取得する。

共焦点蛍光顕微鏡（ＣＦＭ）は、ピンホールの周りのスクリーンを使用して浅い焦点深度を実現する。ピンホールは、焦点体積と共焦点の位置にある。焦点体積からの蛍光光子はピンホールを通過して検出器に到達するが、スクリーンは空間フィルタリングによって焦点外の蛍光光子を排除する。

照射と同じ側から検出することにより、高い信号対雑音比が実現される。これは落射蛍光と呼ばれる。同じ光学系を使用して、照射／励起レーザビームの集束と走査の両方を行い、さらに発光された蛍光光子を焦点体積から収集してデスキャンすることが便利である。

最初の共焦点レーザ走査顕微鏡はＵＳ２３４３０１５ Ａ（Ｄａｖｉｄｏｖｉｔｓ＆Ｅｇｇｅｒ）に記載されており、これは、光学コントラストの低い標本の表面下を走査、特に埋没した組織および細胞を走査するのに適した光学顕微鏡を開示している。光学的手段は、対象物内に平行光のビームを集束させ、光軸に直交する２つの軸に沿って対物レンズシステムを動かすことにより走査する手段が提供される。画像は陰極線管で生成される。

それ以来、対物レンズ走査はほとんど使用されていない。例えば、Ｄ Ｋ Ｈａｍｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｔ Ｗｉｌｓｏｎ，“Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｂｙ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｓ ｓｃａｎｎｉｎｇ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｅ： Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｎｕｍｂｅｒ １，１９８６，ｐｐ５２−５４において、著者は、対物レンズを機械的に走査することで走査が達成される走査型光学顕微鏡によって得られる高分解能の顕微鏡写真を紹介している。著者らは、このアプローチが、重いものまたは扱いにくい形状の物体の顕微鏡検査において非常に重要であることを示唆した。

共焦点顕微鏡における対物走査の問題は、フレームレートおよび走査領域が限られているなど、性能が低いことである。

フレームレートは、対物レンズの質量によって制限される。複合対物レンズは、ユーザが試料を見て設定できるようにするのに役立つが、質量が大きいため、対物走査ではフレームレートが制限される。ｘ変換器が、「ピギーバックされた」ｙ変換器の質量を受けて移動して、複合ｘ−ｙスキャンを実現しなければならない場合、走査する必要のある質量が大きいため、結果としてフレームレートが制限される。

対物走査の問題は利点を上回るため、対物走査は、深度走査の場合、ｚ方向での対物レンズの走査に限定されていた。

試料平面での走査を実現するために、他のアプローチが開発されている。
初期の共焦点レーザ顕微鏡は、試料ステージを走査していた。その後、例えば、ガルバノメータ走査ミラーを使用して、照射ビームの角度偏向によって焦点体積走査が実行されていた。このような「ガルボ」ミラーは、ミラーが小さく、質量が小さく、中央の移動範囲にわたって線形近似を用いて回転によって走査が可能であるため、対物走査よりも好ましいことが分かっている。これが、複合光学対物レンズが走査型光学顕微鏡に遍在するようになった理由である。しかし、このアプローチでは、角度走査したビームを試料平面に投影しながら、収差を減らして焦点を維持するために、マルチレンズ対物レンズが必要となる。ガブロミラーの別の問題は、ノイズが多く、ミラーの振動周波数で高強度の音に長時間さらされると、人間の聴覚に損傷を与える可能性があることである。

最近になって、多光子励起蛍光顕微鏡検査（ＭＦＭ）を含む非線形光学走査顕微鏡検査が開発されている。二光子励起（ＴＰＥ）顕微鏡検査は、この一例である。

Ｄｅｎｋ、ＳｔｒｉｃｋｌｅｒおよびＷｅｂｂは、二光子励起顕微鏡検査を発明した。彼らの特許であるＵＳ５０３４６１３Ａ（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｉｎｃ）は、２つの光子を同時に吸収することによってターゲット材料に分子励起を発生させ、それによって固有の３次元分解能を提供するレーザ走査顕微鏡を開示している。励起レーザビームの走査は走査ミラーを用いた照射ビームの角度偏向で行い、集束は試料面に対して固定された対物レンズで行った。

ＣＦＭのように特定のエネルギーの励起光子を１つだけ使うのではなく、ＭＦＭではエネルギーの半分（波長の２倍）の光子を２つ使用して蛍光を発生させることができる。その非線形プロセスは、強度の２乗に依存する。非常に高い強度の照射は、モードロックされたパルスレーザを使用して実現される。強度は、非線形蛍光が焦点体積内で発生するのに十分に高いが、非線形蛍光が焦点体積外で発生するほど十分に高くはない。したがって、空間フィルタリングによって排除されなければならない焦点外の蛍光はない。共焦点ピンホールを省くことができるので、これらは厳密には共焦点顕微鏡ではないが、焦点体積内にのみ存在する非線形発光により「仮想ピンホール」が提供される。

ピンホール／スクリーンを除去することで、発光後に散乱した蛍光光子の収集と検出が可能になり、より高いコントラストを得ることができる。静止したピンホールへの焦点体積の走査移動をデスキャンする必要はない。収集された蛍光光子は、焦点ずれしており、かつ／または検出器を越えて走査されていても、直接検出することができる。より多くの励起光子は、焦点体積に近づくにつれて吸収されず、その波長が長いために散乱が少ないので、焦点体積に到達し、試料の奥深くまで進むことができる。また、波長が長くなると、有害な光退色と光毒性が減少する。これらの効果により、厚みのある試料において高いコントラストが得られる。焦点体積内のみにおける蛍光は、有害な光退色および光毒性が少ないことも意味している。化学反応は、焦点体積に局所的に発生する可能性がある。励起波長が長いと、ＣＦＭよりも分解能がわずかに低くなる。

第２高調波画像顕微鏡検査（ＳＨＩＭ）は、非線形光学効果の第２高調波発生（ＳＨＧ）に基づく非線形光学走査顕微鏡検査の別の形式である。

コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡検査は、試料内の分子の固有の振動コントラストを画像化する非線形光学走査顕微鏡検査の別の形式である。

したがって、従来の非線形光学走査顕微鏡検査は、角度走査された励起レーザビームを用いる空間サンプリングを使用する。従来のシステムでは、さまざまな角度から到達する角度走査された励起レーザビームを、収差を制御しながら試料平面に投影するために、対物レンズにおいて多くのレンズが必要になる。多くのレンズを使用すると、インターフェースで損失が発生するため、非線形発光を励起するには高いレーザ出力が必要になる。複雑で高価なレーザが必要であり、レーザ出力の多くが無駄になる。

従来のＭＦＭシステムでは、走査領域が制限されている。励起放射線の角度走査で走査領域を増やすには、大きな光路形状と高価な多素子対物レンズが必要であり、大型で高価なシステムになってしまう。

走査光学顕微鏡における顕微鏡対物レンズのＺ調整については、運動学的フレクシャ機構が知られている。

運動学的フレクシャ機構も試料ステージとして知られている。例えば、Ｎａｎｏｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｎｇｈａｉ Ｒｕ、Ｘｉｎｙｕ Ｌｉｕ、Ｙｕ Ｓｕｎ編著、６７ページには、スパイラル走査、サイクロイド走査、およびリサジュー走査パターンのような方法を使用して、試料プラットフォームの非ラスター走査に平行運動学的構成を使用できることが開示されている。

３Ｄ印刷された運動学的フレクシャステージについては、“Ｏｎ ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｌｉａｎｔ ＸＹ ｍｉｃｒｏ−ｍｏｔｉｏｎ ｓｔａｇｅ”、Ｘａｖｉｅｒ Ｈｅｒｐｅ、Ｒｏｓｓ Ｗａｌｋｅｒ、Ｍａｔｔｈｅｗ Ｄｕｎｎｉｇａｎ、Ｘｉａｎｗｅｎ Ｋｏｎｇ、Ｒｏｂｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ４９（２０１８）６６−７６に記載されている。

複雑さが少なく、コストが低く、作動距離が大きく、広い走査領域をカバーする光学走査顕微鏡を提供することが望ましい。

本発明の第１の態様によれば、励起放射線を提供するように動作可能なレーザ照射システムを使用して、試料内で光学発光を誘発するための光学走査顕微鏡であって、
−励起放射線を集束させるように構成された対物レンズであって、
照射システムおよび対物レンズが、焦点体積内で励起放射線を提供し、焦点体積内の試料から発光放射線の発光を引き起こすように、共に動作可能になっている、対物レンズと、
−対応する次元で発光焦点体積を走査するために、少なくとも２次元で対物レンズを走査するように動作可能な運動学的フレクシャ機構を含む対物スキャナと、を含む光学走査顕微鏡が提供される。

好ましくは、運動学的フレクシャ機構は、対応する次元で発光焦点体積を走査するために、対物レンズの光軸に対して横方向の２次元で対物レンズを走査するように動作可能である。

好ましくは、運動学的フレクシャ機構は、２次元にそれぞれ対応するアクチュエータを運動学的に分離するように構成される。

好ましくは、運動学的フレクシャ機構が、単一の３Ｄ印刷された部材である。

好ましくは、運動学的フレクシャ機構は、二次元の平面内で、対物レンズを支持する中桁フレクシャを取り囲む剛性外枠を含む。

好ましくは、中桁フレクシャは、剛性外枠の穴を通して作動される。

好ましくは、光学走査顕微鏡は、運動学的フレクシャ機構に統合された光学位置センサをさらに含む。

好ましくは、対物レンズは非球面対物レンズである。好ましくは、非球面対物レンズは、球面対物レンズの球面収差と比較して、球面収差を低減するように構成される。

好ましくは、対物レンズは、球面収差なしで、または最小限で、励起放射線を集束させるように構成される。

好ましくは、対物スキャナは、対応する試料平面内で発光焦点体積を走査するために、対物レンズの光軸に垂直な平面内で対物レンズを走査するように動作可能である。

好ましくは、対物スキャナは、１０ミクロンの走査範囲から１ｍｍを超える走査範囲まで対物レンズを走査するように動作可能である。

好ましくは、対物スキャナは、１ｍｍを超える走査範囲まで、対物レンズを走査するように動作可能である。

好ましくは、対物スキャナは、５ｍｍを超える走査範囲まで、対物レンズを走査するように動作可能である。

好ましくは、対物スキャナは、１０ｍｍを超える走査範囲まで、対物レンズを走査するように動作可能である。

好ましくは、光学走査顕微鏡は、走査された焦点体積からの発光放射線を検出するように動作可能な検出器と、検出された発光放射線に基づいて、焦点体積による走査に対応する画像を構築するように構成された画像モジュールと、をさらに含む。

好ましくは、対物レンズは、球面収差のない点に励起放射線を集束させるように構成された光学素子を含む。

好ましくは、対物レンズは、非球面レンズ、アキシコンおよび非球面ミラーからなる光学素子のグループから選択される１つ以上の光学素子を含む。

好ましくは、対物レンズは単一の光学素子を含む。

あるいは、対物レンズは、対物レンズの光軸に対して垂直に分布した複数の光学素子を含む。

好ましくは、照射システムは、対物レンズに対して軸上に励起放射線を提供するように、対物レンズと共に配置される。

好ましくは、照射システムは、対物レンズに対して発散する励起放射線を提供するように、対物レンズと共に配置される。

好ましくは、照射システムは、励起放射線で対物レンズの開口を過充填するように構成される。

好ましくは、対物スキャナは、リサジューパターンで対物レンズを走査するように動作可能である。

好ましくは、光学走査顕微鏡は、対物レンズの光軸に沿って発光された発光放射線を収集するように構成された収集光学系を含む。

好ましくは、光学走査顕微鏡は、対物レンズを介して発光放射線を収集するように構成された収集光学系を含む。

好ましくは、光学走査顕微鏡は、焦点体積と共焦点のピンホールを含み、照射システムと対物レンズとは、焦点体積内で励起放射線を提供し、焦点体積内の試料から発光放射線の単一光子発光を引き起こすように、共に動作可能である。

あるいは、光学走査顕微鏡は、励起放射線を提供するように動作可能なパルスレーザ照射システムを使用して、試料内に非線形光学発光を誘発するためのものであり、照射システムと対物レンズとは、焦点体積内の試料から発光放射線の非線形発光を引き起こすに十分な強度で、焦点体積内で励起放射線を提供するように、共に動作可能である。

好ましくは、光学走査顕微鏡は、対物レンズの光軸から外れて、焦点体積を出る励起放射線から離れて発光される発光放射線を収集するように構成された収集光学系を含む。

好ましくは、発光は、多光子蛍光発光を含む。

好ましくは、発光は、第２または第３高調波発生発光を含む。

好ましくは、発光は、コヒーレントアンチストークスラマン発光を含む。

好ましくは、発光はラマン発光を含む。

次に、本発明の実施形態を、図面を参照して、ほんの一例として説明する。

本発明の実施形態による、多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、軸外、かつデスキャンされた発光収集を用いる多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、発散対物照射およびデスキャンされた発光収集を用いる多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、過充填された対物レンズ開口の照射を用いる多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、複数の対物レンズを有する多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、非球面ミラー対物レンズを有する多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、ＳＨＧ対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、ＣＡＲＳ対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態による、対物走査のための運動学的フレクシャ機構を概略的に示す。 本発明の実施形態による、対物走査のためのアクチュエータによる運動学的フレクシャ機構の動作を概略的に示す。 本発明の実施形態による、試料内で非線形光学発光を誘導し検出する方法を示すフローチャートである。 本発明の実施形態による、単一光子蛍光共焦点対物走査顕微鏡を概略的に示す。 本発明の実施形態に係る、過充填された対物レンズ開口の照射を用いる単一光子蛍光共焦点対物走査顕微鏡を概略的に示す。

実施形態は、対物走査顕微鏡、例えば、非線形励起と組み合わされた対物レンズ走査を行なう多光子蛍光顕微鏡を提供する。

実施形態は、横（ｘ−ｙ）平面内で画像を提供するために、複合顕微鏡対物レンズを用いる角度走査レーザビームを使用することを回避する。代わりに、実施形態は、単一の非球面対物レンズを横（ｘ−ｙ）平面内で直接走査することにより、はるかに簡素な光学システムを提供する。また、十分な均一性を有し、対物レンズの開口を大いに充填または過充填する大型の励起レーザビームを適用してもよい。これにより、非球面レンズによって生成される「光点」の特性は、レンズの位置の関数にほとんど、または全く影響されず、収差に依存しない広い走査領域を提供することが保証される。

図において、先行する図に見られる参照番号でラベル付けされた要素は、それぞれの先行する図について説明されたものと同じ要素を表す。例えば、図２の対物レンズ１３４は、図１の対物レンズ１３４と同様に記載される。

図１は、本発明の実施形態による、多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。これは非線形光学走査顕微鏡の例である。パルスレーザ照射システム１６０は、レーザビームの範囲で表す光線１５２および１５４によって示す励起レーザビームの形で、励起放射線を提供するように動作可能である。

この例の多光子蛍光照射システム（ＭＦ−ＩＬＬＵＭ）１６０は、レーザドライバ（Ｌ−ＤＲＶ）１４６と超高速レーザ（ＬＡＳＥＲ）１４８を含む。視覚表示ユニット（ＶＤＵ）１０２を有するパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１０４は、レーザドライバ（Ｌ−ＤＲＶ）１４６および励起ビーム出力制御（Ｐ−ＣＴＲＬ）モジュール１５０を制御する。レーザ１４８はまた、温度制御（Ｔ−ＣＴＲＬ）モジュール１５８を有する。

この例では１０５０ｎｍレーザを使用しており、これは、超高速レーザパルスを生成するのに便利な波長である。実施形態は、主要な用途の波長で動作する低コストの固定波長超高速レーザを備えていてもよい。同時に動作する複数のレーザが提供されてもよく、例えば、異なる画像診断および複数のフルオロフォアを利用できるようになる。重要なレーザ波長範囲は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）試料を用いた用途に使用するのに適したものである。この波長は、高価で広く調整可能なＴｉサファイアレーザを使用する従来のＭＦＭシステムにおいて提供される。しかしながら、本発明の実施形態は、走査された対物レンズにおける損失が低減されるため、より低出力のレーザで非線形発光を誘発することができる。適切なレーザ出力は、４００ｍＷである。通常、従来の非線形顕微鏡に使用されるレーザから１〜３Ｗの電力を利用できるが、ほとんどの場合、１〜数十ｍＷだけが試料で使用されている。低出力レーザは安価であり、水冷を必要としない。

適切なレーザパルスは、通常、１ｆｓから１ｐｓ幅までの超高速状態にある。パルス持続時間とスペクトル幅を選択して、用途に合わせて帯域幅のバランスを取ることができる。これを２００ｆｓ±５０ｆｓに減少させてもよいが、これは、良好な信号レベルを与える短パルスと、パルスを広げるシステム分散とを妥協させるので、システムに事前補正システムを追加する必要がある。さらに、２００ｆｓパルスは通常約５ｎｍの帯域幅を持っているため、パルス幅を狭くすると光パルスの帯域幅が増加し、光学フィルタの許容誤差が減少したシステムとなる。

レーザ１４８によって生成される励起放射線の適切なパルス繰り返し率（繰り返し率）は、１６０ＭＨｚである。通常、８０ＭＨｚの比率を使用できるが、ｋＨｚ程度の低い繰り返し率を使用してもよい。固定パルス幅の場合、ピーク電力は繰り返し率が低いほど高くなる。

パルスレーザは、小さな発光量で高い一時的強度を提供する。これにより、非線形発光が生じるため、ピンホールは不要である。その結果、システムは、合焦しているが散乱した発光光子を収集することができ、柔軟な形状（例えば、デスキャンを避ける）で、（より良いコントラストを与える）より多くの発光を収集することができる。

非線形アプローチでは、より長い波長の励起光子の吸収が減少するか、吸収されないため、試料に深い透過が提供される。焦点外の蛍光が少ないため、光退色および光毒性が少なくなる。より長い波長の励起光子の散乱が少ないため、深い透過も提供される。

ただし、非線形発光顕微鏡では、励起光子の波長が長いため、分解能が低下する。本発明の実施形態は、対物レンズの軸上照射を用いており、これにより収差が低減され、したがって、この欠点が緩和される。非球面対物レンズを使用すると、収差がさらに減少し、前述の欠点がさらに緩和される。非球面対物レンズは、単純な球面レンズまたは球面ミラーなどの球面対物レンズの球面収差と比較して、球面収差を低減するように構成される。

この例の出力制御（Ｐ−ＣＴＲＬ）モジュール１５０は、偏光子を有する半波長板を含み、レーザ出力の可変減衰を提供する。可変ＮＤフィルタを使用できるが、ビームが歪むことがある。可変減衰器の目的は、超高速レーザ１４８を一定の出力で動作させ、その動作パラメータの安定性を保証することである。

励起レーザビーム１５２、１５４は、ミラー１５６で反射されて、対物レンズ１３４の光軸と整列する。したがって、照射システム１６０は、対物レンズに対して軸上に励起放射線を提供するように対物レンズ１３４と共に配置される。軸上照射と非球面レンズ走査により、複合対物レンズを介した軸外角度走査照射と比較して、複雑度の低い光学システムにより低出力レーザを使用した非線形発光が可能になる。あるいは、またはさらに、アキシコンを対物レンズに使用してもよい。アキシコンは円錐形の外形を有しており、光を非回折ベッセルビームに集束させる。これには、分解能が向上するという利点がある。アキシコン対物レンズは、例えば、ラマン走査顕微鏡での表面撮像に役立つ可能性がある。

レンズ１４２、１４４を含む望遠鏡は、対物レンズ１３４の開口数（ＮＡ）の効果的使用を確実にし、対物レンズ１３４の焦点において小さな焦点体積１２４を提供するために使用される。したがって、励起レーザビーム１５２、１５４は、望遠鏡１４２、１４４によって拡大されて、対物レンズ１３４の開口を平行軸上照射放射線で大量に充填する。

さらに、望遠鏡は、ｚ軸方向において区分化を提供するように構成できるので、深度走査のために対物レンズまたは試料のいずれかを物理的に移動させる必要がなくなる。これは、望遠鏡レンズ１４２のうちの１つのマウント１４０に接続されたｚ調整（ｚＡＤＪ）アクチュエータ１３８を使用して、２つの望遠鏡レンズ間の距離を変更することによって達成され得る。アクチュエータは、対物レンズ１３４に到達するビームを、わずかに焦点を合わせるか、または焦点を外すように、ＰＣ１０４によって制御される。対物レンズを出たビームは、「平行」ビームの焦点の上または下のいずれかに集束する。

この例の対物レンズは、単一の非球面レンズ（または非球面）１３４を含む光学素子であり、球面収差なし（または最小）で、入射励起レーザビームを試料平面１２６の点１２４に集束させるために使用される。最小の球面収差は、非球面対物レンズの構成によって、球面収差が可能な限り小さくなるように減少されることを意味する。非球面レンズは、単色波長で回折限界点を生成することができる。これらのレンズは質量が小さく、コンパクトであり、大きな開口数を有することができる。この例では、適切なレンズは、１２ｍｍの焦点距離と０．５５ＮＡを有する直径１５ｍｍの非球面レンズである。非球面レンズは質量が小さいため、対物スキャナですばやく走査することができる。単一の非球面レンズを使用することで、その質量を特に低く抑えることができる。非球面対物レンズ（この例ではレンズであるが、他の例ではミラーまたはアキシコン）は、３０ｇ未満、好ましくは２０ｇ未満の質量を有していてもよい。

レンズが少ないと、インターフェースでの透過損失が少なくなるため、より低いレーザ出力で非線形発光を励起できるため、より低コストのレーザを使用できる。さらに、非球面対物レンズは、より少ない収差を提供するので、励起光子強度を増加させてより小さな焦点体積を提供し、したがって、レーザ出力をさらに低下させたより低コストのレーザの使用がさらに容易になり、非線形発光が励起される。

照射システム１６０および対物レンズ１３４は、焦点体積内の試料（図示せず）からの発光放射線の非線形発光を引き起こすのに十分な強度で、焦点体積１２４内に励起放射線１５２、１５４を提供するように共に動作可能である。この非線形発光は多光子蛍光発光であるが、図７および８を参照して説明される他の実施形態は、異なるタイプの非線形発光のための顕微鏡を示す。

対物レンズ１３４は、対物スキャナ１３０、１３２によって走査される。この例では、ｘ−ｙ変換器（ｘｙＸＤ）１３０は、走査レンズマウントとして機能する運動学的フレクシャ機構１３２に接続されている。運動学的フレクシャ機構は、図９および１０を参照して説明される。ｘ−ｙ変換器１３０には、ＰＣ１０４によって制御される変換器ドライバ（ＸＤ−ＤＲＶ）１２８により、ｘおよびｙ制御信号が提供される。したがって、対物スキャナは、ここではｘおよびｙ方向に対応する、対物レンズの光軸に対して横方向の２次元で対物レンズを走査するように動作可能である。対物スキャナは、ｚ方向に対応する、第３の次元で対物レンズを走査することもできる。この例では、２つの方向は互いと、対物レンズの光軸とに直交している。走査は各方向で線形であるため、試料平面内で焦点体積が走査される。他の例では、対物レンズ、したがって焦点体積の走査は、例えば湾曲したサンプリング面を提供するために、湾曲した経路に沿ったような、非直交方向内および／または直線的ではない経路内であってもよい。

図１０を参照して説明したように、ｘ−ｙ変換器１３０は、別個の独立したｘおよびｙ変換器に分割されてもよい。作動は、電気機械変換器または圧電変換器を使用するなど、さまざまな方法で行うことができる。

ｘ−ｙトランスデューサ１３０は、運動学的フレクシャ機構１３２によって対物レンズ１３４に結合される。対物スキャナ１３０、１３２は、対応する試料平面１２６内で発光焦点体積１２４を走査するために、対物レンズの光軸に垂直な平面内で対物レンズを走査するように動作可能である。

対物スキャナは、高いフレームレートを提供するリサジューパターンで対物レンズを走査するように動作可能であり得る。リサジュー走査では、対物レンズの極端な加速と減速が少なく、両方の走査方向で同一の適度な走査レートが可能となる。

この例の位置センサ（ＰＳ）１３６は、モノリシックに（図９に示すように）対物キャナに統合されている。位置センサ（ＰＳ）１３６は、そのｘおよびｙ電気信号を、ＰＣ１０４に出力を行う取得（ＡＣＱ）モジュール１２０に出力する。

対物スキャナは、数十ミクロンから数ミリメートル（好ましくは１ｍｍを超える）まで対物レンズを動かすことができ、これは事実上、システムの視野（ＦＯＶ）である。したがって、対物スキャナは、１０ミクロンの走査範囲から１ｍｍを超える、または５ｍｍを超える、または１０ｍｍを超える走査範囲まで対物レンズを走査するように動作可能である。この可変走査範囲は、視野をズームするために対物レンズを切り替える必要がないという利点を有している。走査範囲は、焦点体積サイズおよびナイキスト基準によって決定される限界までの分解能でサンプリングされてもよい。光学分解能はＦＯＶと作動距離に依存しないが、従来のシステムでは、より小さな点を得るために、一般的に作動距離とＦＯＶが小さい光学システムが必要になるため、これは当てはまらない。したがって、実施形態は、大きな作動距離（例えば、１２ｍｍ）だけでなく、同時に大きなＦＯＶも提供する。広い視野は、可変走査範囲に関係なく有用であり、対物スキャナは、１ｍｍを超える、または５ｍｍを超える、または１０ｍｍを超える走査範囲に対して対物レンズを走査するように動作可能である。

収集光学系の場合、大口径の高ＮＡ集光レンズ１２２および１１８は、試料によって生成された光学発光信号を収集する。これらのレンズは、大きな信号収集開口を提供すると同時に、試料からの大きな作動距離を提供する。検出器１０６と第２の集光レンズ１１８との間に、コリメートレンズ１１６も存在している。これは、外光線１０８および１１０によって示される信号ビームを平行にし、これにより、干渉フィルタ１１２およびダイクロイック光学系１１４を光路に最適に挿入することが可能になる。この例では、集光レンズ１１８および１２２はどちらも、５０ｍｍの焦点距離と０．６ＮＡを有する直径７５ｍｍの非球面レンズである。

この図および他のいくつかの図では、試料を出る透過励起放射線は示されていない。それはレンズ１２２、１１８、１１６を通過し、次にダイクロイックビームスプリッタ１１４を通過する。次に、その強度を測定して、検出された発光信号を補正して、照射変動を補償するようにしてもよい。

検出器１０６は、走査された焦点体積１２４からの発光放射線１０８、１１０を検出するように動作可能である。この例では、検出器は、試料から発せられる特定の波長の信号を検出するように選択された光電子増倍管（ＰＭＴ）である。通常、ＰＭＴは、精選されたフィルタ１１２と協働する。これらのフィルタは、この例では蛍光発光である発光放射線から信号を分離する。蛍光発光信号は、異なる蛍光マーカに由来する場合もあるため、異なる波長を有することがある。これらは、適切なフィルタを選択することで検出できる。

ＰＭＴ１０６は、ＰＣ１０４によって制御され、その電気信号を取得（ＡＣＱ）モジュール１２０に出力し、そこから次にＰＣ１０４に出力される。

ＰＣ１０４は、検出された発光放射線に基づいて、焦点体積の走査に対応する画像を構築するように構成されたソフトウェア内に画像モジュール１０５を有する。モジュールは、ＰＭＴ１０６信号およびＰＳ１３６信号から生じる、取得モジュール１２０から受信した信号を使用して、画像を構築する。画像は、表示ユニット１０２上にリアルタイムで記憶され表示１０３され得る。別の例では、取得モジュールは、画像を直接構築して表示するオシロスコープであってもよい。

図２は、本発明の実施形態による、軸外、かつデスキャンされた発光収集を用いる多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的な形で示す。ＰＭＴ２０６および収集光学系２１８、２２２は、対物レンズの光軸から外れて配置され、焦点体積を出る励起放射線２５２、２５４から発せられた発光放射線を収集して、発光放射線２０８、２１０を収集する。

別のＰＭＴ２５８は、対物レンズを介してデスキャンされた発光放射線を収集するためにレンズ２６８と共に配置される。ダイクロイックビームスプリッタ２５６は、発光された蛍光光子２６１、２６２がＰＭＴ２５８を通過することを可能にする。上述したように、照射と同じ側から検出することによって（つまり、落射蛍光）、高い信号対雑音比が実現される。同じ光学系１３４、１４２、１４４を使用して、励起レーザビームの集束と走査の両方を行い、焦点体積１２４から発光された蛍光光子を収集し、デスキャンする。

図２は２種類の収集を示しているが、別々に用いることも、あるいは図１に示す軸上透過検出と組み合わせて、または単独で用いることもできる。

図３は、本発明の実施形態による、発散対物照射およびデスキャンされた発光収集を用いる多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。

負レンズ３４２を使用して、発散ビームの範囲で示す光線３５２および３５４によって示される発散照射レーザビームに、励起レーザビーム１５２、１５４を発散させる。発散ビーム３５２、３５４は、ミラー３５６から反射されて、対物レンズ１３４の光軸と整列する。負レンズ３４２の代わりに、別の光学素子またはシステムを使用して、発散ビームを提供してもよい。例えば、正レンズは、点を介して照射ビームを集束させて発散ビームを提供することができる。発散ビームの利点は、対物レンズの大部分を充填（過充填）しながら、軸上照射を対物レンズ上に揃えることが簡単であることである。

ＰＭＴ３５８は、対物レンズ１３４を介してデスキャンされた発光放射線を収集するためにレンズ３６８と共に配置される。ダイクロイックビームスプリッタ３７０は、発光された蛍光光子３６０、３６２をＰＭＴ３５８に偏向させ、一方で照射ビームの励起放射線を通過させる。上述したように、照射と同じ側から検出することによって（つまり、落射蛍光）、高い信号対雑音比が実現される。図２に示されるように、同じ光学系１３４を使用して、励起レーザビームの集束と走査の両方を行い、焦点体積１２４から発光された蛍光光子を収集し、デスキャンする。

図３はデスキャンされたばかりの収集を示しているが、個別に使用することも、図２に示す軸外検出と図１に示す軸上透過検出のうちの１つ以上と組み合わせて使用することもできる。

図４は、本発明の実施形態による、過充填された対物レンズ開口を有する多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。望遠鏡１４２、１４４を有する照射システム４６０は、対物レンズ４３４の開口を励起放射線４５２、４５４で過充填するように構成される。あるいは、例えば、図３に示されるような発散照射ビームを使用して、開口を過充填してもよい。この例では、開口はマウント４３２の範囲によって定義される。ただし、他の例では、開口を定義するために虹彩を使用することができる。これにより、広い走査領域が可能になり、対物レンズが照射ビームを横切って走査される一方で、開口が軸上放射線で完全に充填される。これにより、大きな走査領域にわたって、焦点体積が、非線形発光に十分な一定の強度で適切に集束される。これは、複合対物レンズを介して集束される従来の角度走査レーザで達成するには複雑であり、費用もかかるものである。

図５は、本発明の実施形態による、複数の対物レンズを有する多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示している。

対物レンズとして、複数の光学素子５３４が対物レンズの光軸に対して垂直に、この例では横並びに分布して提供される。光学素子は、非球面レンズ、アキシコンまたは非球面ミラーであり得る。光学素子は、球面収差なしに励起放射線を複数の点５２４、５２５に集束させるように構成される。アキシコンの場合、点は光軸に沿って線状に延長される。複数の光学素子は、異なる焦点距離を有することができるので、異なる深度を同時に走査することにより、同時深度プロファイリングが可能になる。

図４と同様に、望遠鏡１４２、１４４を有する照射システム４６０は、対物レンズ５３４の開口を励起放射線４５２、４５４で過充填するように構成される。あるいは、例えば、図３に示されるような発散照射ビームを使用して、開口を過充填してもよい。

上述したように、照明と同じ側から検出することによって（つまり、落射蛍光）、高い信号対雑音比が実現される。同じ光学系５３４、１４２、１４４を使用して、励起レーザビームの集束と走査の両方を行い、焦点体積５２４および５２５から発光された蛍光光子を収集し、デスキャンする。

複数のＰＭＴ５５８および５５９は、光学系５６８、５７２、５７４、５７５と共に配置され、各焦点体積５２４、５２５に対して別々に、対物レンズ５３４を介して、デスキャンされた発光放射線５６１、５６２および５６３、５６４を収集する。

ダイクロイックビームスプリッタ２５６は、発光された蛍光光子がＰＭＴ５５８および５５８を通過することを可能にする。レンズアセンブリ５６８は、第１の焦点体積５２４からの発光放射線５６１、５６２の第１のビームを、スクリーン５７２に伝える。レンズアセンブリ５６８はまた、第２の焦点体積５２５からの発光放射線５６３、５６４の第２のビームを、スクリーン５７２に伝える。２つの焦点体積５２４、５２５に対応するスクリーン５７２内の一対のピンホールは、それぞれの焦点体積からの発光放射線を別々に通過させる。この例では、光ファイバ５７４および５７５は、別々に収集された発光放射線を異なるそれぞれのＰＭＴ５５８、５５９に伝える。位置センサからの出力と、対物レンズ５３４の複数の素子間のオフセットの記憶値とで、光電子増倍器からの２つの出力信号を並べて表示用に位置合わせすることができる。対物レンズの走査がオフセットと同じ距離に及ぶ場合、タイル状のリサジューパターン５７２で示されているように、大きな連続領域を走査することができる。３つ以上の光学素子を対物レンズとして並べて配置することができる。例えば、４ｘ４の非球面レンズの走査されたアレイにより、５７４で示すようにタイル状の走査領域がもたらされる。

大きなタイル状の走査領域が提供されるだけでなく、高速走査も可能である。これは、比較的薄い屈折多素子対物レンズは、単一の屈折対物レンズに比べて質量が少ないためである。軽い素子は質量が小さいため、より速く走査することができる。

複数の光学素子は、マルチレンズアレイのように、あるいは鏡面の副形状またはファセットとして、一体に形成されてもよい。

図６は、本発明の実施形態による、非球面ミラー対物レンズを有する多光子蛍光対物走査顕微鏡を概略的に示す。図１〜５とは対照的に、ｘおよびｚ軸が回転されるので、試料平面６２６を垂直線として示す。照射システム１６０および対物ミラー６３４は、焦点体積内の試料（図示せず）からの発光放射線の非線形発光を引き起こすのに十分な強度で、焦点体積６２４内に励起放射線１５２、１５４を提供するように共に動作可能である。この非線形発光は多光子蛍光発光であるが、図７および８を参照して説明される他の実施形態は、異なるタイプの非線形発光のための顕微鏡を示しており、これもミラー対物レンズを使用する。対物レンズは、１つ以上のレンズとミラーを組み合わせることもできる。

対物ミラー６３４は、対物スキャナ６３０、６３２によって走査される。この例では、図９および１０を参照して説明されたような運動学的フレクシャマウントなどの、ミラーマウント６３２に接続されたｘ−ｙ変換器（ｘｙＸＤ）６３０である。

図７は、本発明の実施形態による、非線形ＳＨＧ対物走査顕微鏡を概略的に示す。この実施形態では、第２高調波発生照射システム（ＳＨＧ−ＩＬＬＵＭ）７６０を使用して、励起放射線７５２、７５４を提供する。この実施形態における非線形発光は、第二高調波発生発光である。

図８は、本発明の実施形態による、非線形ＣＡＲＳ対物走査顕微鏡を概略的に示している。この実施形態では、コヒーレントアンチストークスラマン発光照射システム（ＣＡＲＳ−ＩＬＬＵＭ）８６０を使用して、励起放射線８５２、８５４を提供する。この実施形態における非線形発光は、コヒーレントアンチストークスラマン発光である。

多光子蛍光、ＳＨＧまたはＣＡＲＳ照射システムの組み合わせなどの異なる照射システムは、同じ非線形対物走査顕微鏡において組み合わせることができる。本明細書で説明される異なる照射システムは、図１、２および３を参照して説明されるものなど、本明細書で説明される異なる検出配置と組み合わせてもよい。

走査顕微鏡における試料ステージとして運動学的フレクシャ機構を使用しても、角度走査された励起レーザビームに関する上記の問題はいずれも解決されない。しかしながら、本発明者らは、試料ステージに運動学的フレクシャ機構を使用する代わりに、それを対物スキャナとして使用できることに気付いた。したがって、バックラッシュがない、摩擦がない、低ノイズ、簡素、低コストなどの運動学的フレクシャ機構の利点が、対物スキャナに対して生じ得る。

図９は、本発明の実施形態による、対物走査のための運動学的フレクシャ機構を概略的に示す。図９（ａ）は、単一の３Ｄ印刷された部材である運動学的フレクシャ機構９０２を示す。このように、アセンブリが不要で、接続が外れるジョイントがないため、低コストで信頼性が高くなる。図９（ｂ）は、図９（ａ）のＡ−Ａ線に沿った断面を示している。図９（ｃ）は、運動学的フレクシャ機構９０２の投影図である。図９（ｂ）および９（ｃ）はまた、アクチュエータロッド９１４を含む。

運動学的フレクシャ機構は、この例ではｘとｙの２つの次元にそれぞれ対応するアクチュエータを、運動学的に分離するように構成される。

剛性外枠９０４は、ｘ−ｙ平面内で、対物レンズを支持する中桁フレクシャ９０６を取り囲んでいる。フレクシャ桁に対物レンズを取り付けるために、対物レンズ穴９０８が設けられている。試料ステージとは異なり、穴は、光が対物レンズを介して運動学的フレクシャ機構を通過することを可能にする。中桁フレクシャ９０６は、剛性外枠の穴９１０を介して作動される。アクチュエータロッド９１４は、枠の穴を通過し、枠の穴のすぐ内側の中桁フレクシャ９０６に取り付けられる。以下の図１０を参照して説明されるように、アクチュエータロッドの外端は、それをラウドスピーカボイスコイルアクチュエータに取り付けるための磁石を有していてもよい。

光学位置センサ（ＯＰＳ）９１２は、運動学的フレクシャ機構に統合されている。適切な位置センサは光学式であり、運動学的フレクシャ機構にモノリシックに統合された発光ダイオード（ＬＥＤ）、フォトダイオード、および可変シャッタを含む。図９（ｂ）はＯＰＳの断面を示している。ＯＰＳ内の中桁フレクシャ９０６から伸びているのは、シャッタ９０７である。シャッタの端は、ＬＥＤ９１６からフォトダイオード９１８への光ビームと交差する。

走査された対物レンズの位置の測定値を直接統合することは、撮像システムにとって有益である。これにより、実際のステージ位置の直接の読み取り値を提供することで、システムの位相、非線形性、ヒステリシス、サイクル再現性の問題を回避することができる。このような位置センサは、低コスト、高速、正確、非接触である。アクティブＬＥＤの波長は、ＰＭＴのいずれかによって検出され得る光出力を提供しないように最適に選択され得る。例えば、ＬＥＤは、ＰＭＴが約９５０ｎｍを検出できるよりも長い波長を持つ場合がある。これにより、簡素で効果的なシステム制御が提供される。軸の位置の詳細を示す信号を提供する別の方法があり、これらには容量性、磁気的、抵抗性、および光学的手段が含まれる。

図１０は、本発明の実施形態による、対物走査のためのアクチュエータによる運動学的フレクシャ機構の動作を概略的に示す。対物レンズ１０１０は、図９に示される穴９０８に取り付けられる。アクチュエータロッド９１４は、枠の穴を通過し、それぞれの枠の穴のすぐ内側で中桁フレクシャ９０６に取り付けられる。アクチュエータロッドの外端は、ラウドスピーカボイスコイルアクチュエータ１００２および１０１２に取り付けられる。アクチュエータ１００２、１０１２は、概略的に１００６で示されるリサジューパターンを生成するように構成された信号を用いて、信号源１００４および１００８によって駆動される。

図９および１０を参照して説明される運動学的フレクシャ機構は、本明細書に説明された顕微鏡構成のうちのいずれにおいても、対物スキャナとして使用することができる。

図１１は、本発明の実施形態による、試料内で光学発光を誘導し、検出する方法を示すフローチャートである。

この方法は、本明細書に記載される顕微鏡の実施形態を使用して実施され得る以下のステップを有する。

１１０２：励起放射線を提供し、対物レンズを使用して励起放射線を集束させ、焦点体積に励起放射線を提供する。放射線は、焦点体積内で試料からの発光放射線の非線形発光１１０４を引き起こすのに十分な強度であり得る。発光は、多光子蛍光発光、第２または第３高調波発生発光および／またはコヒーレントアンチストークスラマン発光などの非線形発光を含み得る。励起放射線は、対物レンズに軸上で提供され、対物レンズの開口を励起放射線で過充填してもよい。励起放射線を集束させることは、球面収差のない点に励起放射線を集束させることを含む。これは、対物レンズとして１つ以上の非球面レンズまたはミラーを使用して行われる。あるいは、またはさらに、１つまたは複数のアキシコンを対物レンズとして使用して、励起放射線を線に集束させてもよい。

１１０６：対応する次元で発光焦点体積を走査するために、少なくとも２次元で対物レンズを走査する。これは、対応する次元で発光焦点体積を走査するために、対物レンズの光軸に対して横方向の二次元で対物レンズを走査することを含み得る。これは、対応する試料表面内で発光焦点体積を走査するために、対物レンズの光軸に対して垂直な平面内で対物レンズを走査することを含み得る。対物レンズはリサジューパターンで走査されてもよい。これは、本明細書で説明するような運動学的フレクシャ機構を使用して走査されてもよい。

１１０８：走査した焦点体積からの発光放射線を検出する。これには、（ｉ）対物レンズの光軸に沿って発光される、（ｉｉ）（デスキャンモードにおいて）対物レンズを介して、および／または（ｉｉｉ）対物レンズの光軸から外れ、焦点体積を出る励起放射線から離れて発光される、発光放射線の収集が含まれ得る。

１１１０：検出された発光放射線に基づいて、焦点体積による走査に対応する画像を構築する。

この方法のステップは、さまざまな順序で、または同時に実行することが可能である。

上述の図は、非線形光学走査顕微鏡検査の用途に関連しているが、実施形態は、ピンホールを使用する単一光子共焦点顕微鏡検査に使用することができる。図１２は、本発明の実施形態による、単一光子蛍光共焦点対物走査顕微鏡を概略的に示している。顕微鏡は、図２を参照して説明したものと類似しているが、単一光子蛍光が共焦点蛍光照射システム１２６０によって焦点体積１２２４内で励起される。焦点体積外からの蛍光もあるので、スクリーン１２７２の共焦点ピンホールを使用して、光電子増倍管２５８で受容した発光蛍光を空間的にフィルタリングする。図９および１０を参照して説明した運動学的フレクシャ機構を使用して、対物レンズ１３２を走査する。したがって、対物スキャナは、対応する次元で発光焦点体積を走査するために、少なくとも２次元で対物レンズを走査するように動作可能な運動学的フレクシャ機構を含む。これらの例では、運動学的フレクシャ機構は、対応する次元で発光焦点体積を走査するために、対物レンズの光軸に対して横方向の二次元で対物レンズを走査するように動作可能である。

図１３は、本発明の実施形態による、過充填された対物レンズ開口照射を用いる単一光子蛍光共焦点対物走査顕微鏡を概略的に示す。顕微鏡は、過充填された対物レンズを有する図４を参照して説明したものと類似しているが、図１１の場合と同様に、共焦点蛍光照射システム１２６０によって焦点体積１２２４内で単一光子蛍光が励起され、デスキャンされた落射蛍光発光の収集が用いられる。望遠鏡１４２、１４４を有する照射システム４６０は、対物レンズ４３４の開口を励起放射線４５２、４５４で過充填するように構成される。あるいは、例えば、図３に示されるような発散照射ビームを使用して、開口を過充填してもよい。焦点ボリューム外からの蛍光もあるので、スクリーン１２７２の共焦点ピンホールを使用して、光電子増倍管２５８で受容した発光蛍光を空間的にフィルタリングする。図９および１０を参照して説明した運動学的フレクシャ機構を使用して、対物レンズ１３２を走査する。

Claims (25)

1. 励起放射線を提供するように動作可能なレーザ照射システムを使用して、試料内に光学発光を誘発するための光学走査顕微鏡であって、
   −前記励起放射線を集束させるように構成される対物レンズであって、
   前記照射システムおよび前記対物レンズが、焦点体積内で前記励起放射線を提供し、前記焦点体積内の前記試料から発光放射線の発光を引き起こすように、共に動作可能になっている、対物レンズと、
   −運動学的フレクシャ機構を含む対物キャナであって、前記運動学的フレクシャ機構が、対応する次元で前記発光焦点体積を走査するために、前記対物レンズの光軸に対して横方向の２次元で前記対物レンズを走査するように動作可能である、対物スキャナと、を含む、光学走査顕微鏡。
2. 前記運動学的フレクシャ機構が、前記２次元にそれぞれ対応するアクチュエータを運動学的に分離するように構成される、請求項１に記載の光学走査顕微鏡。
3. 前記運動学的フレクシャ機構が、単一の３Ｄ印刷された部材である、１または請求項２に記載の光学走査顕微鏡。
4. 前記運動学的フレクシャ機構が、前記２次元の平面内で、前記対物レンズを支持する中桁フレクシャを取り囲む剛性外枠を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
5. 前記中桁フレクシャが、前記剛性外枠の穴を通して作動される、請求項４に記載の光学走査顕微鏡。
6. 前記運動学的フレクシャ機構に統合された光学位置センサをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
7. 前記対物スキャナが、対応する試料平面内で前記発光焦点体積を走査するために、前記対物レンズの光軸に対して垂直な平面内で前記対物レンズを走査するように動作可能である、請求項１〜６のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
8. 前記走査された焦点体積からの前記発光放射線を検出するように動作可能な検出器と、前記検出された発光放射線に基づいて、前記焦点体積による前記走査に対応する画像を構築するように構成された画像モジュールと、をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
9. 前記対物レンズが、球面収差のない点に前記励起放射線を集束させるように構成された光学素子を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
10. 前記対物レンズが、非球面レンズ、アキシコン、および非球面ミラーからなる光学素子のグループから選択された１つ以上の光学素子を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
11. 前記対物レンズが、単一の光学素子を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
12. 前記対物レンズが、前記対物レンズの光軸に対して垂直に分布した複数の光学素子を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
13. 前記照射システムが、前記対物レンズに対して軸上に励起放射線を提供するように、前記対物レンズと共に配置される、請求項１〜１２のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
14. 前記照射システムが、前記対物レンズに対して発散励起放射線を提供するように、前記対物レンズと共に配置される、請求項１〜１３のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
15. 前記照射システムが、前記対物レンズの開口を励起放射線で過充填するように構成される、請求項１３または請求項１４に記載の光学走査顕微鏡。
16. 前記対物スキャナが、前記対物レンズをリサジューパターンで走査するように動作可能である、請求項１〜１５のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
17. 前記対物レンズの前記光軸に沿って発光された前記発光放射線を収集するように配置された収集光学系を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
18. 前記対物レンズを介して前記発光放射線を収集するように配置された収集光学系を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
19. 前記焦点体積と共焦点のピンホールを含み、前記照射システムおよび前記対物レンズが、前記焦点体積内で前記励起放射線を提供し、前記焦点体積内で前記試料から発光放射線の単一光子発光を引き起こすように、共に動作可能である、請求項１〜１８のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
20. 前記励起放射線を提供するように動作可能なパルスレーザ照射システムを使用して、試料内で非線形光学発光を誘発するための、請求項１〜１８のいずれかに記載の光学走査顕微鏡であって、前記照射システムおよび前記対物レンズが、前記焦点体積内で前記試料から発光放射線の非線形発光を引き起こすのに十分な強度で、前記焦点体積内で前記励起放射線を提供するように、共に動作可能である、光学走査顕微鏡。
21. 前記対物レンズの前記光軸から外れて、前記焦点体積を出る励起放射線から離れて発光される前記発光放射線を収集するように配置された収集光学系を含む、請求項２０に記載の光学走査顕微鏡。
22. 前記発光が、多光子蛍光発光を含む、請求項２０または請求項２０に記載の光学走査顕微鏡。
23. 前記発光が、第２または第３高調波発生発光を含む、請求項２０および２１のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
24. 前記発光が、コヒーレントアンチストークスラマン発光を含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。
25. 前記発光が、ラマン発光を含む、請求項２０〜２３のいずれかに記載の光学走査顕微鏡。

Images