JP2007215412A - 悪性転移性胃癌の判定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】胃癌腹膜播種転移におけるメカニズムの解明及び新規治療薬のターゲットとなりうるタンパク質や特異性の高い腫瘍マーカーを同定し、悪性転移性胃癌の判定方法、胃癌腹膜転移再発のリスク評価方法、抗癌剤の有効性の判定方法、及びそれらのためのキットを提供すること。
【解決手段】二次元ディファレンシャル電気泳動（２Ｄ―ＤＩＧＥ）法を用いて胃癌細胞株ＭＫＮ４５とその腹膜播種転移株クローンであるＭＫＮ４５Ｐ由来のセルライセートの二次元電気泳動像の比較を行った。次に、統計学的手法により両細胞株間でタンパク質の発現量が有意に異なるスポットをゲルからピックアップし、各スポットのタンパク質についてマススペクトル解析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：proteomics analyzer 4700）を実施し、データベース検索を行った。その結果、胃癌細胞株に比べて腹膜播種転移株において有意に増加、もしくは減少したタンパク質を数種類同定できた。
【選択図】なし

Description

本発明は、悪性転移性胃癌の判定方法及びそのためのキット、腹膜転移再発のリスク評価方法及びそのためのキット、抗癌剤の有効性の判定方法及びそのためのキット、並びに、腹膜転移再発抑制剤のスクリーニング方法に関する。

胃癌は、日本と東南アジアでは消化管で最も多くみられる悪性腫瘍であり、癌死亡率では、胃癌が世界で第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や胃癌の治療法の発達により改善しているが、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率が３５％と低い。また、進行胃癌術後の腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。胃癌細胞のこのような悪性の特性のうちで、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。胃癌の腹膜播種には、接着分子、アポトーシス関連遺伝子および他の遺伝子が深く関与しているという報告があるが、胃癌の転移のメカニズム解明には、さらなる研究が必要であるとされている。

胃癌腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定する方法としては、被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む方法により、胃癌由来の転移癌細胞を検出し、これらを胃癌由来の転移癌細胞のマーカーとして使用することによって、胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料を提供することができる方法（例えば、特許文献１参照。）が開発されている。

また、新規な腫瘍マーカーを提供するものであって、既知のＩ型コラーゲンのＣ端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の変動をマーカーにすることを特徴とする、進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（例えば、特許文献２参照。）や、従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサンプルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か否かを診断することのできる技術を確立するものであって、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて、肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病といった癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法（例えば、特許文献３参照。）が知られている。

さらに、転移性結腸直腸癌あるいは原発性および／または転移性の胃癌または食道癌をスクリーニング・診断するための試薬、キットおよび方法や、その患者を処置するためにインビボでイメージングするための化合物や組成物、その治療や予防のための薬物、遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物を運搬するための組成物、ワクチンおよび方法（例えば、特許文献４参照。）や、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質およびミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、ｈｓｐ６０やチトクロームオキシダーゼのサブユニットＩおよびＩＶ）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（Ｈ^＋−ＡＴＰ合成酵素のβ−触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素およびピルビン酸キナーゼＭなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β−ＡＴＰａｓｅ／ｈｓｐ６０比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩ比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩＶ比）を使用することからなる、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法（例えば、特許文献５参照。）等が提案されている。

特開２００４−３２１１０２号公報 特開２００１−３３４６０号公報 特開２００２−１１２７９９号公報 特表２００３−５３２３８９号公報 特表２００５−５２６９８０号公報

癌転移には、複数の遺伝子が協同して関与することが知られているにもかかわらず、単一の遺伝子又は少数の遺伝子と転移との関連についてのみしか報告されていない。また、癌原発巣の転移能の相違は、発現された遺伝子の組み合わせが異なることに起因するものと考えられている。そのため、転移の程度および転移先の点で異なる転移能を有する胃癌細胞の遺伝子発現及び産物のプロテオミクス解析は、胃癌腹膜播種のメカニズムの解明に重要である。本発明の課題は、胃癌腹膜播種転移におけるメカニズムの解明及び新規治療薬のターゲットとなりうるタンパク質や特異性の高い腫瘍マーカーを同定し、悪性転移性胃癌の判定方法、胃癌腹膜転移再発のリスク評価方法、抗癌剤の有効性の判定方法、及びそれらのためのキットを提供することにある。

進行胃癌術後の腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。そこで、我々は腹膜播種転移におけるメカニズムの解明および新規治療薬のターゲットとなりうるタンパク質や腫瘍マーカーの同定を目的として、プロテオミクスによる網羅的なタンパク質の発現解析を行った。まず、二次元ディファレンシャル電気泳動（２Ｄ―ＤＩＧＥ）法を用いて胃癌細胞株ＭＫＮ４５とその腹膜播種転移株クローンであるＭＫＮ４５Ｐ由来のセルライセートの二次元電気泳動像の比較を行った。次に、統計学的手法により両細胞株間でタンパク質の発現量が有意に異なるスポットをゲルからピックアップし、各スポットのタンパク質についてマススペクトル解析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：proteomics analyzer 4700）を実施し、データベース検索を行った。その結果、胃癌細胞株に比べて腹膜播種転移株において有意に増加、もしくは減少したタンパク質を数種類同定することができた。本発明は、上記プロテオミクスによる網羅的なタンパク質の発現解析を行って得られた知見に基づき完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、（１）胃癌患者から採取した生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価することを特徴とする悪性転移性胃癌の判定方法や、（２）配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする悪性転移性胃癌の判定用キットや、（３）配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする悪性転移性胃癌の判定用キットに関する。

また本発明は、（４）胃癌患者から採取した生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価することを特徴とする腹膜転移再発のリスク評価方法や、（５）配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腹膜転移再発のリスク評価用キットや、（６）配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腹膜転移再発のリスク評価用キットに関する。

また本発明は、（７）抗癌剤を服用している胃癌患者から採取した生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価することを特徴とする抗癌剤の有効性の判定方法や、（８）配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする抗癌剤の有効性判定用キットや、（９）配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする抗癌剤の有効性判定用キットに関する。

さらに本発明は、（１０）ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ）を被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする腹膜転移再発抑制剤のスクリーニング方法や、（１１）細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする上記（１０）記載の腹膜転移再発抑制剤のスクリーニング方法に関する。

本発明によると、腹膜播種転移におけるメカニズムの解明および新規治療薬のターゲットとなりうるタンパク質や腫瘍マーカーの同定において有用であるタンパク質を用いることによって、悪性転移性胃癌の判定、腹膜転移再発のリスク評価、抗癌剤の有効性の判定、腹膜転移再発抑制剤のスクリーニングを行うことができ、本発明により進行胃癌術後の腹膜播種再発を治療しうる可能性がある。

本発明の悪性転移性胃癌の判定方法としては、胃癌患者から採取した血清、胃癌組織等の生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の悪性転移性胃癌の判定用キットとしては、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、ここで、悪性転移性胃癌とは、肝臓や腹膜やリンパ節など胃以外の他の臓器・組織に転移する胃癌を意味する。また、上記タンパク質のうち少なくとも一つの発現量の測定は、血清、胃癌細胞溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の悪性転移性胃癌の判定用キットを用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。

本発明の腹膜転移再発のリスク評価方法としては、胃癌患者から採取した血清、胃癌組織等の生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の腹膜転移再発のリスク評価用キットとしては、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、ここで、腹膜転移再発のリスクとは、胃癌の摘出手術後に腹膜に転移する腹膜転移や腹膜播種のリスクを意味する。また、上記タンパク質のうち少なくとも一つの発現量の測定は、血清、胃癌細胞溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の悪性転移性胃癌の判定用キットを用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。

本発明の抗癌剤の有効性の判定方法としては、抗癌剤を服用している胃癌患者から採取した血清、胃癌組織等の生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の抗癌剤の有効性判定用キットとしては、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、抗癌剤の有効性を判定することにより、各患者個人に適した治療、いわゆるテーラーメイド治療が可能となる。また、上記タンパク質のうち少なくとも一つの発現量の測定は、血清、胃癌細胞溶解物等を対象サンプルとして、上記本発明の悪性転移性胃癌の判定用キットを用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法の他、二次元電気泳動に供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。

本発明の腹膜転移再発抑制剤のスクリーニング方法としては、ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ）を被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、上記タンパク質の発現量を測定する方法としては、ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ）の細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して、後述する実施例に記載されているように、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法の他、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を用いるＥＬＩＳＡ法等の免疫反応を利用する方法や、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を用いるドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Reverse Transcription）−ＰＣＲ法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法を挙げることができる。

上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、interferon-induced Mx protein（AAA36337 gi|188901）であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、glycyl-tRNA synthetase（AAA86443 gi|493066）であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、flavoprotein subunit of complex II（BAA06332 gi|506338）であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ts11 cell cycle control protein（AAA36781 gi|339987）であり、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Tyrosyl-tRNA synthetase（AAH16689 gi|16741793）であり、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Keratin 5（AAH42132 gi|27503816）であり、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、transfer RNA-Trp synthetase（AAA61298 gi|340368）であり、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、adenylate kinase 2（CAI19351 gi|56202448）であり、これらのタンパク質は、胃癌細胞株ＭＫＮ４５に比べて腹膜播種転移株ＭＫＮ４５Ｐにおいて有意に増加するタンパク質（以下、これらを総称して「腹膜播種転移株有意増加タンパク質」ということがある）である。

他方、上記配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、pyruvate kinase（CAA39849 gi|35505）であり、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、cytokeratin 8 (279 AA)（CAA31376 gi|30313）であり、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、dihydrodiol dehydrogenase isoform DD1（BAA05121 gi|556516）であり、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Annexin I（1AIN gi|442631）であり、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Annexin A2, isoform 2（AAH23990 gi|18645167）であり、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Annexin A2, isoform 2（AAH09564 gi|16306978）であり、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Carbonic Anhydrase II (Carbonate Dehydratase) (HCA II) (E.C.4.2.1.1) Mutant With Val 121 Replaced（12CA gi|229657）であり、これらのタンパク質は、胃癌細胞株ＭＫＮ４５に比べて腹膜播種転移株ＭＫＮ４５Ｐにおいて有意に減少するタンパク質（以下、これらを総称して「腹膜播種転移株有意減少タンパク質」ということがある）である。

上記本発明の悪性転移性胃癌の判定方法においては、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意増加タンパク質の発現量が増加しているとき、及び／又は、悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意減少タンパク質の発現量が減少しているとき、被検胃癌患者の胃癌は悪性転移性胃癌と判定され、逆に、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意増加タンパク質の発現量が増加していないとき、及び／又は、悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意減少タンパク質の発現量が減少していないとき、被検胃癌患者の胃癌は良性の胃癌と判定される。

上記本発明の腹膜転移再発のリスク評価方法においては、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意増加タンパク質の発現量が増加しているとき、及び／又は、悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意減少タンパク質の発現量が減少しているとき、被検胃癌患者は腹膜転移再発のリスクがあると評価され、逆に、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意増加タンパク質の発現量が増加していないとき、及び／又は、悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意減少タンパク質の発現量が減少していないとき、被検胃癌患者は腹膜転移再発のリスクがないと評価される。

上記本発明の抗癌剤の有効性の判定方法においては、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検抗癌剤を服用している胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意増加タンパク質の発現量が増加しているとき、及び／又は、悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検抗癌剤を服用している胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意減少タンパク質の発現量が減少しているとき、被検抗癌剤は有効でないと判定され、逆に、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検抗癌剤を服用している胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意増加タンパク質の発現量が増加していないとき、及び／又は、悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比べて、被検抗癌剤を服用している胃癌患者から採取した生体試料中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意減少タンパク質の発現量が減少していないとき、被検抗癌剤は有効であると判定される。

上記本発明の腹膜転移再発抑制剤のスクリーニング方法においては、抗癌剤、抗癌候補物質、低分子化合物、天然有機高分子物質、天然の動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下に、ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ）を５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地等で培養し、培養後の細胞溶解物中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意増加タンパク質の発現量が、被検物質非存在下における場合と比べて有意に減少しているとき、及び／又は、培養後の細胞溶解物中の１若しくは２以上の腹膜播種転移株有意減少タンパク質の発現量が、被検物質非存在下における場合と比べて有意に増加しているとき、被検物質は腹膜転移再発抑制剤として有用である可能性がある。

上記配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができる。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の方法を用いることができる。

また、一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778 号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号）を用いることができ、ヒト化抗体をつくるために、ヒト化抗体の調製法（米国特許第5,585,089号、Nature, 321, 522-525, 1986、Protein Engineering, 4, 773-783, 1991）を用いることができ、キメラ抗体をつくるために、キメラ抗体の調製法（米国特許第4,816,567号、Science, 229, 1202-1207, 1985、BioTechniques, 4, 214, 1986、Nature, 312, 643-646, 1984、Nature, 314, 268.270, 1985）を用いることができる。二機能性抗体は、２つの関連した抗体を産生する２つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、または２つの抗体の断片の化学結合によって産生することができる。

また、上記抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）_２断片等も、上記抗体と同様に用いることができる。例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）_２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。

これら抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３５Ｓ又は^３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記腹膜播種転移株有意増加タンパク質や腹膜播種転移株有意減少タンパク質を免疫学的測定方法により測定することができる。かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。

上記配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対としては、これらタンパク質のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのうち、上流及び下流の配列の一部とハイブリダイズしうる相補的なプライマー対であれば、プライマー配列の長さ及びｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのどの部位と相補的であるかなどは特に制限されず、例えば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記タンパク質のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プライマーとして用いることができる。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。

上記配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとしては、これらタンパク質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）とハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、上記タンパク質のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる他、検出しやすいように５’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は^３２Ｐなどを例示することができる。

上記配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子として、interferon-induced Mx protein遺伝子（M30817）、glycyl-tRNA synthetase遺伝子（U09510）、flavoprotein subunit of complex II遺伝子（D30648）、ts11 cell cycle control protein遺伝子（M15798）、Tyrosyl-tRNA synthetase遺伝子（BC016689）、Keratin 5遺伝子（BC042132）、transfer RNA-Trp synthetase遺伝子（M61715）、adenylate kinase 2遺伝子（AL020995）pyruvate kinase遺伝子（X56494）、cytokeratin 8 (279 AA) 遺伝子（X12882）、dihydrodiol dehydrogenase isoform DD1遺伝子（D26124）、Annexin I遺伝子（NM_000700）、Annexin A2, isoform 2遺伝子（BC023990）、Annexin A2, isoform 2遺伝子（BC009564）、Carbonic Anhydrase II (Carbonate Dehydratase) (HCA II) (E.C.4.2.1.1) Mutant With Val 121 Replaced遺伝子（CR536526）を例示することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［使用試薬と機器］
１．細胞培養
ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５）と高度の腹膜転移能を持つ胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ）は米村先生よりご供与頂いた。両細胞株は５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。

２．タンパク質の抽出
各細胞株をフラスコ内で８０〜９０％コンフルエンスな状態にまで培養した後、cell dissociation bufferを用いて細胞を剥がし、ＰＢＳ(-)で３回洗った。細胞ペレットにlysis buffer（Ｌ．Ｂ．：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ,ｐＨ８．５,７Ｍurea,２Ｍthiourea,４％ＣＨＡＰＳ）を添加し、よく攪拌した後に氷上で超音波処理を実施した。１５０００ｒｐｍで３０分遠心した後、上清を回収し、２−ＤＣｌｅａｎ−ＵｐＫｉｔ（GE Helthcare Amersham Biosciences）で夾雑物を除去した。ｐＨを８〜９に調整し、タンパク濃度をQuick Start protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories )で測定した後、Ｌ．Ｂ．で５ｍｇ／ｍｌに調製した。

３．タンパク質のＣｙＤｙｅラベル
メーカー推奨通り、５０μｇのタンパク質と４００ｐｍｏｌのアミン反応性ＣｙＤｙｅ(GE Healthcare Amersham Biosciences)を反応させた。内部標準サンプルはＣｙ２で、比較サンプルはそれぞれＣｙ３とＣｙ５を反応させ、氷上暗所で３０分間静置することによってラベル化した。反応停止は１０ｎｍｏｌのリジンを用いた。その後、３つのＣｙＤｙｅでラベルしたサンプルを混合し、等量の×２サンプルバッファー(７Ｍurea,２Ｍthiourea,４％ＣＨＡＰＳ,２％ＩＰＧバッファー,２．４％Destreak Reagent)を加えた。ラベルされた混合物は１％ＩＰＧバッファーを含むrehydration bufferで４５０μｌに調整した。

３．実験デザイン
内部標準法はＡｌｂａｎらが示した方法論に基づいて実施した。上述したようにＭＫＮ４５由来タンパク質(５０μｇ)はＣｙ３で、ＭＫＮ４５Ｐ由来タンパク質(５０μｇ)はＣｙ５で、内部標準として両細胞の混合物(ＭＫＮ４５＋ＭＫＮ４５Ｐ:２５ｕｇ＋２５ｕｇ)をＣｙ２でそれぞれラベルし、タンパク質の発現差異解析に用いた。一方、タンパク同定用として別にサンプルを調製した。ＭＫＮ４５由来タンパク質(２００μｇ)とＭＫＮ４５Ｐ由来タンパク質(２００μｇ)を混合し、１％ ＩＰＧバッファーを含むrehydration buffer(GE Healthcare Amersham Biosciences)を加えて４５０μＬとした。すべてのサンプルは次のセクションで述べたように２−ＤＥによって分離した(蛍光ラベルサンプル：ｎ＝５、同定用サンプル：ｎ＝１)。再現性を確認するために、当該実験は独立して３回実施した。

４．二次元電気泳動法(２−ＤＥ)によるタンパク分離
全てのサンプルは二次元電気泳動法によって分離した。一次元目は、等電点の違いによって分離し、二次元目は分子量の違いによって分離した。IPGphorII system(GE Healthcare Amersham Biosciences)を用いて、ＩＰＧストリップ(２４ｃｍ、ｐＩレンジ３．０−１１ＮＬ)を各サンプルで２０℃、３０Ｖの条件で１２時間膨潤した後、２０℃で３５ｋＶｈの条件で等電点分離を行った。ＩＰＧストリップを１％ＤＴＴ含有loading buffer (glycerol,ＳＤＳ, urea, trace ＢＰＢ)で１５分処理した後、２．５％ iodoacetamide含有loading bufferで１５分処理することによって、タンパク質中に含まれるシステイン残基を還元アルキル化すると共にストリップの平衡化を行った。その後、ＩＰＧストリップは２４ｃｍアクリルアミドゲル(１０〜１２．５％)に載せ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量分離を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは２．５Ｗ/ゲルで３０分間、１５℃で泳動した後３０Ｗ/ゲル(最大１００Ｗ)で４〜５時間、１５℃で泳動した。全ての工程は暗所で実施した。

５．ゲルイメージング
解析用(蛍光ラベルサンプル)のゲルは、Typhoon 9410(GE Healthcare Amersham Biosciences)を用いてＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５の各最適波長でスキャンした。Ｃｙ２は４８８ｎｍレーザー/５２０ｎｍ band pass(ＢＰ)４０蛍光フィルターで、Ｃｙ３は５３２ｎｍレーザー/５８０ｎｍ ＢＰ３０蛍光フィルターで、Ｃｙ５は６３３ｎｍレーザー/６７０ｎｍ ＢＰ３０蛍光フィルターでそれぞれスキャンした（５枚ゲル×３＝１５画像）。タンパク同定用のゲルは、１０％メタノール、７％酢酸で２時間固定した後、Sypro Ruby(Invitrogen) 染色を行った（暗所、Ｏ／Ｎ）。ゲルを洗浄した後、Typhoon 9410を用いて４５７ｎｍレーザー/６１０ＢＰ３０蛍光フィルターでスキャンした。すべてのゲルは１００ｕｍの解像度でスキャンした。

６．スポット検出と統計解析
統計解析用ゲルの各スポットは、DeCyderソフトウエアー(GE Healthcare Amersham Biosciences)のＤＩＡモードで計測と定量化を行った。推定スポット検出数はおよそ４０００スポットで、ゴミのような人工的スポットは排除した。１枚のゲルからＣｙ２,Ｃｙ３,Ｃｙ５の３パターンの画像を得た後、Ｃｙ３とＣｙ５のスポット強度を同じゲルのＣｙ２強度でノーマライズした。次に、ＢＶＡモードでＣｙ２画像を用いて５枚のゲルのマッチングを行い、ゲル間の誤差を補正した。各ゲルのＣｙ３:Ｃｙ２とＣｙ５:Ｃｙ２のＤＩＡ比から、平均発現変化比とｐ値（ｔ検定）を算出し、Ｃｙ３とＣｙ５間で２倍以上発現変化があったスポットだけをピックアップした。次に、統計解析によってピックアップした各スポットを、タンパク質同定用ゲルのスポットとマッチングさせ、ＸＹ座標を確定した。

７．ゲル内消化とペプチド精製
タンパク同定用ゲルから目的スポットをピックアップするために、スポットのＸＹ座標をテキストファイルに変換し、SpotPicker（自動スポットコレクター、GE Healthcare Amersham Biosciences）に認識させた。それから、タンパク同定用ゲルをSpotPickerに設置し、目的スポットのピックを自動で行った。ピックしたスポットに含有するタンパク質は、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。まず、ゲル片に１００ｍＭ 重炭酸アンモニウムを加えて２０分間静置し、上清を除去することによってゲルを洗浄した（３回実施）。次に、ゲル片を１０分間アセトニトリル処理し、脱水操作を行った後、完全にゲルを乾固させた。その後、０．１％ RapiGest/１００ｍＭ 重炭酸アンモニウムで溶解したＭＳスペクトル解析用のトリプシン（Promega）を、１２５ｎｇ/ゲルとなるように乾固したゲルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。さらに塩酸を加えて３７℃、４５分間インキュベートすることで、残存するRapiGestを分解した。トリプシン消化されたペプチドをゲルから溶出するために、８０％アセトニトリル/１％トリフルオロ酢酸で３０分処理し（２回）、溶出液をSpeedvacで吸引乾燥させ、５ｕＬ程度に濃縮した。続いてＭＳ解析を実施するために、濃縮液をＣ１８脱塩濃縮マイクロカラム（ZipTip）で精製した。

８．タンパク質の同定
精製ペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)の4700 proteomics analyzer (Applied Biosystems)を用いて解析した。ペプチドをマトリックスであるα-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic acid (SIGMA)と混合し、ターゲットプレートにスポットし、リフレクターモードで質量分析を実施した。バックグランドピーク（トリプシン自己消化産物由来ピークなど）を差し引いて、各サンプルに特異的なピークリストを作成し、ＭＡＳＣＯＴ(www.matrixscience.com)データーベース検索を行った。検索条件は、一部修飾として、システイン残基のカルバミドメチル化とメチオニン残基の酸化を考慮し、トリプシンによるミス分解許容は１として行った。統計学的に有意のあるスコア値を持つ同定タンパク質をピックアップした。

９．結果
図１に示すように、胃癌細胞株（ＭＫＮ４５）と高度の腹膜転移能を持つ胃癌細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ）に発現するタンパクの発現差異解析を、２Ｄ−ＤＩＧＥ法を用いて実施した。ＭＫＮ４５由来タンパクとＭＫＮ４５Ｐ由来タンパクを、それぞれＣｙ３とＣｙ５で蛍光ラベルし、内部標準としてＭＫＮ４５とＭＫＮ４５Ｐの等量混合物をＣｙ２でラベルした。３種の蛍光ラベルサンプルを混合し、同一ゲルで二次元電気泳動を行った後、各最適波長でゲルをスキャンして１枚のゲルから３パターンのゲル画像を得（５枚×３パターン＝１５画像）、統計解析に用いた。図２ＡにＣｙ３とＣｙ５の二色重ね合わせ画像を示した。緑のスポットはＭＫＮ４５のタンパク発現量がＭＫＮ４５Ｐと比較して高いことを示し、赤のスポットはＭＫＮ４５のタンパク発現量がＭＫＮ４５Ｐより低いことを示す。次にDeCyderソフトウエアーを用いてゲル画像を解析した。５枚の各ゲルのスポット数をＤＩＡモードで検出し、それぞれ約４０００のスポットを得た。次に、Ｃｙ３とＣｙ５でタンパク発現量が統計学的に有意に異なるスポットをＢＶＡモードで解析した（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）。Ｃｙ３とＣｙ５のスポットペアを３−Ｄモードに変換し、ピーク体積を数値化した図を図２に示した。スポットＮｏ．８では、ＭＫＮ４５Ｐのタンパク発現量はＭＫＮ４５より２．５８倍高く（図２Ｂ）、スポットＮｏ．１８では、ＭＫＮ４５Ｐのタンパク発現量はＭＫＮ４５より１／２．１倍であった（図２Ｃ）。ＭＫＮ４５とＭＫＮ４５Ｐで２倍以上発現差があったスポットは１回目では２８スポット、２回目では４２スポット、３回目では４２スポット検出された。

統計解析用とは別にタンパク質同定用として両細胞の混合サンプルを調製し、二次元電気泳動を実施した。ゲルをSypro Rubyで染色し、最適波長でゲルをスキャンした後、上述の解析用ゲル画像とのマッチングを行った。２倍以上発現差異があったスポットをタンパク同定用ゲル上で確認した後、SpotPickerでゲルをピックした。１〜３回の実験でピックした各ゲルは、トリプシンによるゲル内消化、ZipTipによる精製・濃縮、質量分析、Mascotデータベース検索の各工程を経て同定した。図２のＮｏ．８とＮｏ．１８の質量分析データを図３と図４に示した。３回の繰り返し実験で、２回以上同定できたスポットは、１９個存在した（図５）。そのうち、ＭＫＮ４５Ｐで増加したタンパク質は８個、減少したタンパク質は１１個であった（表１）。

実施例１と同じ実験を繰り返し、ＭＫＮ４５Ｐで増加したタンパク質を９個、減少したタンパク質を１９個検出した（表２）。

２Ｄ−ＤＩＧＥのプロトコールのフローを示す図である。 ２色の色を重ね合わせた２Ｄ−ＤＩＧＥのゲルの図である。 Ａ）緑：ＭＫＮ４５＞ＭＫＮ４５Ｐ、赤：ＭＫＮ４５Ｐ＞ＭＫＮ４５ Ｂ）ＭＫＮ４５とＭＫＮ４５Ｐの間におけるスポットＮｏ．８の量的変化 Ｃ）ＭＫＮ４５とＭＫＮ４５Ｐの間におけるスポットＮｏ．１８の量的変化 スポットＮｏ．８から得られたペプチドのマススペクトルの結果を示す図である。 スポットＮｏ．１８から得られたペプチドのマススペクトルの結果を示す図である。 ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色を行ったゲルのイメージである。 Ratio：≧２．０ あるいは ≦−２．０ Significance level：ｐ＜０．０１ 実施回数：３回（ｎ＝５） 検出されたスポット数：１９スポット（増加：８、減少：１１）

Claims (11)

1. 胃癌患者から採取した生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価することを特徴とする悪性転移性胃癌の判定方法。
2. 配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする悪性転移性胃癌の判定用キット。
3. 配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする悪性転移性胃癌の判定用キット。
4. 胃癌患者から採取した生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価することを特徴とする腹膜転移再発のリスク評価方法。
5. 配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腹膜転移再発のリスク評価用キット。
6. 配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする腹膜転移再発のリスク評価用キット。
7. 抗癌剤を服用している胃癌患者から採取した生体試料中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、良性の胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合、及び／又は悪性の転移性胃癌に罹患している患者から採取した生体試料を用いた場合と比較・評価することを特徴とする抗癌剤の有効性の判定方法。
8. 配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする抗癌剤の有効性判定用キット。
9. 配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうちのいずれか１種以上のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする抗癌剤の有効性判定用キット。
10. ヒト胃癌培養細胞株（ＭＫＮ４５Ｐ）を被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中の、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする腹膜転移再発抑制剤のスクリーニング方法。
11. 細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して、配列番号１〜１５のいずれかに示されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち少なくとも一つの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする請求項１０記載の腹膜転移再発抑制剤のスクリーニング方法。