JP2007090290A

JP2007090290A - 反応チップおよび反応方法

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Publication number: JP2007090290A
Application number: JP2005285930A
Authority: JP
Inventors: Ryoko Imagawa; 僚子今川; Rika Sato; 里佳佐藤; Kousuke Ueyama; 公助植山
Original assignee: Toppan Printing Co Ltd
Current assignee: Toppan Inc
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2005-09-30
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2025-09-30
Also published as: JP5015441B2

Abstract

【課題】コンタミネーションの発生を防止することが可能な反応チップを提供する。
【解決手段】反応試薬１２が配置された複数のウェル状反応容器１０と、複数のウェル状反応容器１０に対して順に反応試液４２を供給する試液流路４０とを備えた反応チップであって、反応試薬１２が、ウェル状反応容器１０内に配置された熱溶融型の封止剤２０で覆われている。この封止剤２０は、反応試薬１２および反応試液４２より比重が小さい材料で構成されている。
【選択図】図２

Description

本発明は、反応チップおよび反応方法に関するものである。

近年、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などをチップ上にて行うμ−ＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ技術や、Ｌａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ技術などが研究され実現されつつある。これにより、今まで大型の実験装置や大量の反応試薬が必要であった反応実験が、数ミリ角以下の反応チップを用いて少量の反応試薬で行えるようになってきている。

この反応チップ上には、ウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが複数形成され、反応容器として用いられている。複数のウェル状反応容器は、試液貯留部から延設された試液流路により接続されている（例えば、特許文献１参照）。
この反応チップを用いて反応を行うには、まず複数のウェル状反応容器内に反応試薬を配置する。次に、試液貯留部に反応試液を注入することにより、試液流路を介して、複数のウェル状反応容器に反応試液を供給する。これにより、反応試薬と反応試液とが接触して反応が開始する。なお必要に応じて、反応時にウェル状反応容器を加熱する。
特表２００２−５０３３３６号公報

しかしながら、上述した反応方法では、試液流路を介してウェル状反応容器内に反応試液を供給する際に、予めウェル状反応容器内に配置されていた反応試薬が、隣接するウェル状反応容器に流出するおそれがある。これにより、コンタミネーションが発生するという問題がある。
また、各ウェル状反応容器での反応中に、反応試薬や反応試液、検出用の蛍光物質等が隣接するウェル状反応容器に拡散するおそれがある。これにより、正確な反応データを測定することができなくなるという問題がある。

本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、コンタミネーションの発生を防止することが可能であり、また正確な反応データを測定することが可能な、反応チップおよび反応方法の提供を目的とする。

上記目的を達成するため、請求項１の発明に係る反応チップでは、反応試薬が配置された複数のウェル状反応容器と、前記複数のウェル状反応容器に対して順に反応試液を供給する試液流路とを備えた反応チップであって、前記反応試薬が、前記ウェル状反応容器内に配置された熱溶融型の封止剤で覆われていることを特徴とする。

また請求項２の発明に係る反応チップでは、前記封止剤は、前記反応試薬および前記反応試液より比重が小さい材料で構成されていることを特徴とする。

また請求項３の発明に係る反応チップでは、前記試液流路は、試液貯留部から延設されていることを特徴とする。

また請求項４の発明に係る反応チップでは、前記試液貯留部から、複数の前記試液流路が延設されていることを特徴とする。

また請求項５の発明に係る反応チップでは、前記反応試薬が、核酸プローブを含むことを特徴とする。

一方、請求項６の発明に係る反応方法では、基板上に形成された試液貯留部と、前記試液貯留部から延設された試液流路と、前記試液流路により順に連結された複数のウェル状反応容器と、前記ウェル状反応容器内に配置された反応試薬と、前記反応試薬を覆って前記ウェル状反応容器内に配置された熱溶融型の封止剤と、を備える反応チップを用いた反応方法であって、前記試液貯留部に反応試液を注入することにより、前記試液流路を介して、前記複数のウェル状反応容器における前記封止剤の上方に前記反応試液を供給する工程と、前記封止剤を加熱して溶融させることにより、前記反応試薬と前記反応試液とを接触させる工程と、を有することを特徴とする。

請求項１の発明によれば、反応試薬を覆った封止剤の上方に反応試液が供給されるので、反応試薬が隣接するウェル状反応容器に流出することがなくなる。したがって、コンタミネーションの発生を防止することができる。

請求項２の発明によれば、反応温度で溶融する封止剤を使用することで、反応試液と封止剤が反応温度で入れ替わり、反応試薬と反応試液とが接触して反応している間、反応容器の開口部が封止剤により塞がれた状態となる。これにより、主反応中に反応試薬および反応試液が隣接するウェル状反応容器に拡散することがなくなる。したがって、正確な反応データを測定することができる。

請求項３の発明によれば、試液貯留部に反応試液を注入することにより、試液流路に連結された複数のウェル状反応容器に連続して一気に反応試液を供給することができる。

請求項４の発明によれば、試液貯留部に反応試液を注入することにより、複数の試液流路にそれぞれ連結された複数のウェル状反応容器に連続して一気に反応試液を供給することができる。

請求項５の発明によれば、ハイブリタイゼーションによるＤＮＡ検出反応を実現することができる。

請求項６の発明によれば、反応試薬を覆った封止剤の上方に反応試液を供給するので、反応試薬が隣接するウェル状反応容器に流出することがなくなる。したがって、コンタミネーションの発生を防止することができる。また反応温度で溶融する封止剤を使用することで、反応試液と封止剤が反応温度で入れ替わり、反応試薬と反応試液とが接触して反応している間、反応容器の開口部が封止剤により塞がれた状態となる。これにより、主反応中に反応試薬および反応試液が隣接するウェル状反応容器に拡散することがなくなる。したがって、正確な反応データを測定することができる。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
図１は、実施形態に係る反応チップの平面図である。この反応チップ１は、長方形状の基板２に、反応試薬が配置された複数のウェル状反応容器１０と、複数のウェル状反応容器１０に対して順に反応試液を供給する試液流路４０とを備えたものである。

基板２は、全体的に略長方形状を呈しており、使用中に容易に折れ曲がることのない厚みをもたせて形成される。この基板２は、ＰＰ（ポリプロピレン）やＰＣ（ポリカーボネート）、アクリル樹脂（ポリメチルメタクリレート）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥ（ポリエチレン）、ＰＶ（ポリ塩化ビニル）、ＰＳ（ポリスチレン）等の樹脂材料で構成されている。このような合成樹脂を用いて基板２を作製すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。さらに、２種類以上の樹脂を接合して用いてもよい。この場合、それぞれの樹脂の特徴を活かして基板２を作製することにより、反応試薬及び試料等の特性に応じた多様な基板２とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板２の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。なお、基板２の素材として石英ガラスを用いてもよい。

基板２には、反応試薬を収容する試薬収容部３と、反応後の反応試液を貯留する試液貯留部４と、反応試液内の特定物質を検出する検出部５とが設けられている。なお試薬収容部３と試液貯留部４との間または試薬収容部３を挟んで試液貯留部４の反対側に、ＰＣＲ反応等を実施するための反応部が設けられていてもよい。検出部５では、反応試液内の特定物質を検出するため、反応試薬を用いた検出反応が実施される。そこで、検出部５には複数のウェル状反応容器１０が形成され、各ウエル状反応容器内に反応試薬が配置されている。このウェル状反応容器１０に反応試液を供給するため、試液貯留部４から複数の試液流路４０が延設されるとともに、マイクロポンプ等の強制的な送液装置（不図示）が設けられている。それぞれの試液流路４０には、複数のウェル状反応容器１０が接続されている。またウェル状反応容器１０および試液流路４０を覆うように、蓋部材５０が設けられている。

図２（ａ）はウェル状反応容器の説明図であり、図１のＡ−Ａ線における側面断面図である。図２（ａ）に示すように、ウェル状反応容器１０は、半球状（椀状）や逆円錐台状（鉢状）等に形成されている。ウェル状反応容器１０の開口部の直径は、０．０１ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが望ましい。これにより、ウェル状反応容器１０に対する反応試液の供給が容易になり、気泡の混入を防止することができる。

図１に示すように、ウェル状反応容器１０は、樹脂材料からなる基板２を切削する方法や、金型内で樹脂材料を射出成型する方法等によって形成されている。基板２をＰＣ（ポリカーボネート）などの硬質の樹脂材料で構成する場合には、切削法を用いてウェル状反応容器１０を形成することができる。また、基板をＰＰ（ポリプロピレン）などの軟質な樹脂材料で構成する場合には、成型法を用いてウェル状反応容器１０を形成することが好ましい。またＰＣで成型法を用いてウェル状反応容器１０を形成することもできる。

複数のウェル状反応容器１０に対して順に反応試液を供給するため、基板２の表面に試液流路４０が形成されている。この試液流路４０により、複数のウェル状反応容器１０が連結された状態となっている。この試液流路４０も、ウェル状反応容器１０と同様に、切削法や成型法等によって形成されている。

このように、ウェル状反応容器１０および試液流路４０が形成された基板２の表面に、反応試液を円滑に流動させるための表面処理を施してもよい。表面処理としては、プラズマ処理、コロナ処理や、バフ処理などの各種親水化処理が挙げられる。基板２に表面処理を施すことにより、試液貯留部４から試液流路４０を介してウェル状反応容器１０に反応試液を供給しやすくなり、送液装置の消費電力を低減することができる。さらに、基板２内の空気がうまく逃げるので、反応試液内への気泡の混入を防止することができる。

（封止剤）
図２（ａ）に示すように、ウェル状反応容器１０の内部には、核酸プローブ等の固体の反応試薬１２が配置されている。この反応試薬が、ウェル状反応容器１０内に配置された熱溶融型の封止剤２０で覆われている。熱溶融型の封止剤２０とは、常温で固体であり、反応試薬と反応試液との反応（以下「主反応」という。）の開始温度付近で溶融する封止剤である。少なくとも８０〜９０℃付近で溶解するように、融点は３５〜９０℃付近であることが望ましい。この封止剤２０として、反応試薬および反応試液より比重が小さいものを採用することが望ましい。ただし、主反応を阻害しないものであることが前提となる。具体的な封止剤として、タカラバイオ株式会社製のＡｍｐｌｉＷａｘ（登録商標）ＰＣＲＧｅｍ１００／５０を採用する。これは、ＰＣＲ増幅の際に溶解して層をなし反応試液の蒸発を防ぐよう、ミネラルオイルにかわるものとして考案された製品である。常温では固体であり、５５〜５８℃で融解する。なお封止剤２０によって覆われる反応試薬１２は、液体でも固体でもよい。固体の場合、反応試液との混合がより容易に行われるので有利である。

この封止剤２０をウェル状反応容器１０内に配置するには、予め反応試薬が配置されたウェル状反応容器内に、適量の固体の封止剤を投入する。次に、その封止剤を加熱する。これにより、溶融された封止剤がウェル状反応容器１０の底部に濡れ広がる。その後、封止剤を冷却すれば、反応試薬１２を覆った状態でウェル状反応容器１０内に封止剤２０を配置することができる。このように、ウェル状反応容器１０内に封止剤２０を配置した後に、図１に示す蓋部材５０を装着する。

（使用方法）
次に、上述した反応チップの使用方法につき、図１および図２を用いて説明する。図２（ｂ）および図２（ｃ）は実施形態に係る反応方法の工程図であり、図１のＡ−Ａ線における側面断面図である。
まず、図１に示す試液貯留部４に、反応試液を注入する。次に送液装置を運転して、試液貯留部４から試液流路４０に反応試液を流出させる。反応試液は、試液流路４０を通って、複数のウェル状反応容器１０に対して順に供給される。この反応試液の供給は、常温または常温以下の送液可能なまでの低温で行う。

図２（ｂ）に示すように、ウェル状反応容器１０の内部には、反応試薬１２を覆った状態で固体の封止剤２０が配置されている。そのため、ウェル状反応容器１０に供給された反応試液４２は、反応試薬１２と接触することなく封止剤２０の表面に配置される。
このように、本実施形態の反応チップでは、反応試薬を覆った封止剤の上方に反応試液が供給されるので、反応試薬が隣接するウェル状反応容器に流出することがなくなる。したがって、コンタミネーションの発生を防止することができる。

次に図２（ｃ）に示すように、ウェル状反応容器１０を加熱して封止剤２０を溶融させる。この封止剤２０は、反応試液４２より比重が小さいので、反応試液４２と上下が入れ替わる。これにより、反応試薬１２が反応試液４２と接触する。なお主反応の反応開始温度が封止剤２０の融点と同等または封止剤２０の融点より低い場合には、反応試薬１２と反応試液４２との接触と同時に主反応が開始する。また主反応の反応開始温度が封止剤２０の融点より高い場合には、ウェル状反応容器１０をさらに加熱して主反応を開始させる。

ここで、反応試液４２と上下が入れ替わった封止剤２０により、ウェル状反応容器１０の開口部および試液流路４０が塞がれた状態となる。これにより、本実施形態の反応チップでは、主反応中に反応試薬や反応試液等が隣接するウェル状反応容器に拡散することがなくなる。したがって、コンタミネーションの発生を防止することができるとともに、正確な反応データを測定することができる。

次に、本発明に係る反応チップおよび反応方法の実施例として、ハイブリタイゼーションによるＤＮＡ検出法について説明する。なお図３の各図では、上段が比較例であり、下段が実施例である。

図３（ａ）に示すように、厚さ２ｍｍのポリプロピレン樹脂基板に、複数のウェル状反応容器１０を形成して、簡易的な反応チップを作製した。なおウェル状反応容器１０の開口部直径は３ｍｍ、底部直径は１ｍｍ、ウェル容積は理論上７．７μＬである。複数のウェル状反応容器１０を連結するように、基板上に試液流路４０を形成した。なお試液流路４０の幅は０．５ｍｍ、深さは０．５ｍｍであり、切削加工により形成した。

一列に配置された複数のウェル状反応容器１０のうち、奇数番目のウェル状反応容器１０ａに、反応試薬１２としてプローブＤＮＡおよび蛍光物質を配置して減圧乾燥させた。なお偶数番目のウェル状反応容器１０ｂには何も配置しなかった。

次に、すべてのウェル状反応容器１０に、封止剤としてタカラバイオ株式会社製のＡｍｐｌｉＷａｘ（登録商標）ＰＣＲＧｅｍ５０を投入した。なお、一つのウェル状反応容器１０に対する封止剤の投入量は２〜４μＬである。この封止剤を８０℃に加熱して溶融させ、室温で再び凝固させた。これにより、奇数番目のウェル状反応容器１０ａでは、反応試薬１２を封止剤で覆った。次に、反応チップの表面に蓋部材を配置して、試液流路４０の両端以外をほぼ密封した。

次に、反応試液として血液等から抽出したＤＮＡを供給した。反応試液は、試液流路４０の端部から常温で供給し、すべてのウェル状反応容器１０に行き渡らせた。なお、一つのウェル状反応容器１０に対する反応試液の供給量は３〜５μＬである。次に、反応チップを加熱して封止剤を溶融させ、反応試薬と反応試液とを反応させた。最後に、ウェル状反応容器内の蛍光物質を検出した。

（比較例）
上記実施例と同様に、基板上に複数のウェル状反応容器１０および試液流路４０を形成した。また奇数番目のウェル状反応容器１０ａに反応試薬１２を配置し、偶数番目のウェル状反応容器１０ａには何も配置しなかった。そして比較例では、すべてのウェル状反応容器１０に封止剤を投入することなく、反応チップの表面に蓋部材を配置した。次に、試液流路４０の端部から常温で反応試液を供給した。なお、一つのウェル状反応容器１０に対する反応試液の供給量は７〜８μＬである。次に、反応チップを加熱して反応試薬と反応試液とを反応させ、ウェル状反応容器内の蛍光物質を検出した。

図３（ｂ）は、反応試液を供給した段階での反応チップの平面図である。上段の比較例では、奇数番目のウェル状反応容器１０ａに配置されていた反応試薬の一部が、反応試液の供給により偶数番目のウェル状反応容器１０ｂに流出していた。これに対して、下段の実施例では、反応試薬が偶数番目のウェル状反応容器１０ｂに流出していないことが確認された。これは、反応試薬を覆った封止剤の表面に反応試液が供給されたからであると考えられる。

図３（ｃ）は、主反応後における蛍光検出結果の説明図である。上段の比較例では、奇数番目のウェル状反応容器１０ａに加えて、偶数番目のウェル状反応容器１０ｂにも蛍光が確認された。これは、奇数番目のウェル状反応容器１０ａに配置されていた反応試薬の一部が、主反応中に偶数番目のウェル状反応容器１０ｂに拡散したからであると考えられる。これに対して、下段の実施例では、偶数番目のウェル状反応容器１０ｂに蛍光が確認されなかった。これは、ウェル状反応容器１０ａの開口部が封止剤により塞がれていたので、主反応中に反応試薬が拡散しなかったからであると考えられる。

なお、本発明の技術範囲は、上述した各実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、上述した各実施形態に種々の変更を加えたものを含む。すなわち、各実施形態で挙げた具体的な材料や構成などはほんの一例に過ぎず、適宜変更が可能である。

実施形態に係る反応チップの平面図である。ウェル状反応容器の説明図および実施形態に係る反応方法の工程図である。実施例および比較例の説明図である。

符号の説明

１…反応チップ４…試液貯留部１０…ウェル状反応容器１２…反応試薬２０…封止剤４０…試液流路４２…反応試液

Claims

反応試薬が配置された複数のウェル状反応容器と、前記複数のウェル状反応容器に対して順に反応試液を供給する試液流路とを備えた反応チップであって、
前記反応試薬が、前記ウェル状反応容器内に配置された熱溶融型の封止剤で覆われていることを特徴とする反応チップ。
前記封止剤は、前記反応試薬および前記反応試液より比重が小さい材料で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の反応チップ。
前記試液流路は、試液貯留部から延設されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の反応チップ。
前記試液貯留部から、複数の前記試液流路が延設されていることを特徴とする請求項３に記載の反応チップ。
前記反応試薬が、核酸プローブを含むことを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の反応チップ。
基板上に形成された試液貯留部と、前記試液貯留部から延設された試液流路と、前記試液流路により順に連結された複数のウェル状反応容器と、前記ウェル状反応容器内に配置された反応試薬と、前記反応試薬を覆って前記ウェル状反応容器内に配置された熱溶融型の封止剤と、を備える反応チップを用いた反応方法であって、
前記試液貯留部に反応試液を注入することにより、前記試液流路を介して、前記複数のウェル状反応容器における前記封止剤の上方に前記反応試液を供給する工程と、
前記封止剤を加熱して溶融させることにより、前記反応試薬と前記反応試液とを接触させる工程と、
を有することを特徴とする反応方法。