JP2011214944A - 試料分析チップ及びこれを用いた試料分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ウェルへの送液を行う試料分析チップにおいて、送液方法が簡便で、かつ複数の試料を同時に分析する際に、それぞれの試料がコンタミネーションしないような試料分析チップを提供すること。
【解決手段】複数の反応場と、反応場に繋がる主流路と、主流路の両端の一方に第一の溶液、他方に第二の溶液を注入するための注入口を有し、前記主流路の両端が、それぞれ前記注入口と連絡していることを特徴とし、一方の主流路と反応場のなす角度が、もう一方の主流路と反応場のなす角度よりも大きいことを特徴とする試料分析チップとする。
【選択図】図１

Description

本発明は、生化学反応の検出や分析方法に用いる試料分析チップ及び試料分析方法に関する。

従来、例えばＤＮＡ反応、たんぱく質反応等の生化学反応の分野において、微量の試料溶液を処理する反応装置として、μ−ＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐと呼ばれる技術が知られている。これは、１個のチップやカートリッジに複数の反応室（以下、ウェル）や流路を供えたものであり、複数の検体の解析、あるいは複数の反応を行うことができる。これらの技術はチップ及びカートリッジを小型化することで扱う薬品を少量にすることが出来、様々なメリットがあるとされてきた。

そのメリットとは例えば従来使用していた強酸や強アルカリ薬品の分量が微量化することで人体への影響や環境への影響が格段に低くなること、また、生化学反応等に用いられる高額な試薬類の消費量が微量化することで分析、反応に費やすコストを低減できること、などが挙げられる。

チップやカートリッジを用いて生化学反応を最も効率よく行うためには、複数のウェルにそれぞれ異なる種類の薬品や検体、酵素を配置し、これら薬品や検体、酵素と反応を起こす試薬を一本ないし数本の主導管からまとめてウェルに流し入れ、異なった複数の反応を生じさせる必要がある。

この手法を用いれば、複数種の検体を同じ試薬で同時に処理をしたり、また逆に一種類の検体に同時に複数の処理を施したりすることが出来、従来かかっていた時間や手間を大幅に減らすことが可能である。

この種の手法を用いる際、複数の反応場に等量のサンプルを送液する技術と、各ウェルの中身を混ざり合わないようにする技術が重要となる。このようなウェルへの送液を行うチップについての先行技術としては以下のものが挙げられる。

特許文献１では、主流路の両端に注入口と排出口を有し、主流路に溶液を貯蔵する反応容器を有する分析用チップが公開されているが、注入口に溶液を入れた後、チップを密封容器に入れ、真空ポンプで減圧することにより、主流路から反応容器への溶液を送液している。そのため、真空ポンプのように、減圧するための設備及び装置が必要になり、自動化が困難である。また、反応容器と別の反応容器を結ぶ主流路が湾曲していた場合、圧力差だけでは配液しきれず、チップを自転させる必要があり、複雑な機構とスペースが必要となる。

特開２００９−１７８１４６

上述のような従来技術の問題を踏まえ、本発明はウェルへの送液を行う試料分析チップにおいて、送液方法が簡便かつ少ない設備でも検出や分析が可能な試料分析チップを提供することを課題とする。また、複数の試料を同時に分析する際に、それぞれの試料がコンタミネーションしないような試料分析チップを提供することを課題とする。ここで言うコンタミネーションとは、本来混合すべきでない試薬同士が混ざり合うことである。混ざり合う量に制限はなく、混ざり合う一方の試薬量が、残り一方の試薬量に対して非常に微量であった場合でも、コンタミネーションとなる。コンタミネーションすることで、本位ではない試薬反応が起きる可能性が高くなるため、出来る限り発生を防ぐ必要がある。

上記のような問題を解決するために為された本発明の請求項１に係る発明は、複数の反応場と、反応場に繋がる主流路と、主流路の両端の一方に第一の溶液、他方に第二の溶液を注入するための注入口を有し、前記主流路の両端が、それぞれ前記注入口と連絡していることを特徴とし、一方の主流路と反応場のなす角度が、もう一方の主流路と反応場のなす角度よりも大きいことを特徴とする試料分析チップである。
また、本発明の請求項２に係る発明は、前記第一の溶液の流入側の主流路と反応場のなす角度が１００°から１４０°に収まることを特徴とする請求項１記載の試料分析チップである。
また、本発明の請求項３に係る発明は、前記第二の溶液の流入側の主流路と反応場のなす角度が２０°から１００°に収まることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の試料分析チップである。
また、本発明の請求項４に係る発明は、主流路内表面を親水処理したことを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の試料分析チップである。
また、本発明の請求項５に係る発明は、前記試料分析チップは前記反応場及び前記流路を形成した第一の基材と、該基材と貼り合わせた第二の基材とを有する請求項１ないし請求項４に記載のいずれかに試料分析チップである。
また、本発明の請求項６に係る発明は、前記基材のいずれか一方が光透過性材料で形成されていることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の試料分析チップである。
また、本発明の請求項７に係る発明は、第一の基材が光透過性の樹脂材料であり、第二の基材が金属材料であることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の試料分析チップである。
また、本発明の請求項８に係る発明は、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の試料分析チップの主流路に流す第一の溶液が親水性であり、第二の溶液が前記第一の溶液と親和性の低い性質を持つ物質であり、前記主流路に溶液を配液する工程の後に、前記第一の溶液を注入した方とは異なる注入口から主流路へ前記第二の溶液を注入する工程を特徴とする試料分析方法である。
また、本発明の請求項９に係る発明は、請求項８に記載の試料分析方法を用いたことを特徴とする遺伝子解析方法である。

本発明による試料分析チップによれば、簡易的で機能的、かつ安価な反応チップを実現することができる。さらに１種類の検体に対して、複数の試薬を用いて反応を見ることができる。

また、本発明による試料分析チップによれば、主流路から反応場に送液された際、余剰分を、溶液を注入した注入口とは異なる注入口から排出することができる。そのため、全てのウェルに所望の液量よりも多く送液することで、すべての反応場に均一量の配液をすることができ、バラツキをなくすことができる。

また、異なる溶液が疎水性であった場合、主流路に満ちた疎水性の溶液が、反応場の封をすることになるので、反応場内に配液された溶液が他の反応場内の溶液と接触することがなくなり、試薬同士のコンタミネーションを防ぐことができる。

本発明の試料分析チップの一様態の断面図 本発明の試料分析チップにおける反応場の拡大図

本発明の試料分析チップを図面に基づいて説明する。
図１は本発明の試料分析チップの一様態を示した断面図である。本発明のチップは、第一の基材上に、複数の反応場１０２と、反応場に溶液、例えば液体検体を送液するための流路と、流路へ溶液、たとえば液体検体を注入するための注入口を有している。流路は、各反応場へ溶液を送液するため、各反応場を連絡する主流路１０１を有する。流路には溶液を注入するために主流路の一端と連絡する注入口１０３と、主流路のもう一端と連絡する注入口１０４を有する。

本発明の試料分析チップは、注入口１０３から親水性の溶液（第一の溶液）を主流路１０１に注入することで、親水性の溶液を反応場１０２へ配液し、他端の注入口１０４から疎水性の溶液（第二の溶液）を主流路１０１に注入する。反応場に溜まった親水性溶液を疎水性溶液で封をするものであることから、疎水性の溶液が反応場へ流入しないことが望ましい。親水性の溶液を注入する注入口１０３側の主流路と、反応場１０２のなす角度Ａ２０１が、疎水性の溶液を注入する注入口１０４側の主流路と反応場１０２のなす角度Ｂ２０２よりも大きいことで、反応場に溜まった親水性の溶液を巻き込むことなく、疎水性の溶液を主流路に流すことができる。親水性溶液は、少なくとも溶媒である水および分析用の試薬が含まれた水溶液であり、各反応場に配液された親水性溶液ごとに検出あるいは分析が行なわれる。

本発明によれば、主流路に満ちた疎水性の溶液が、反応場の封をすることになるので、反応場内に配液された溶液が他の反応場内の溶液と接触することがなくなり、試薬同士のコンタミネーションを防ぐことができる。また、全てのウェルに親水性の溶液を所望の液量よりも多く送液することで、すべての反応場に均一量の親水性の溶液を配液することができ、バラツキをなくすことができる。

親水性の溶液を注入する注入口側の主流路１０１と反応場１０２がなす０°〜１８０°の角度Ａ２０１は１００°から１４０°が望ましい。０°〜９９°もしくは１４１°〜１８０°であれば反応場を親水性の溶液で満たすことが難しいため望ましくない。なお図２に示すように、主流路１０１と反応場１０２が曲面で繋がっている場合、主流路１０１側から延長した接線Ａ２０３と、反応場の直線形状部分からの接線Ｂ２０４とがなす角（０°〜１８０°）で定義することができる。

疎水性の溶液を注入する注入口側の主流路１０１と反応場１０２がなす０°〜１８０°の角度Ｂ２０２は、２０°から１００°が望ましい。０°〜１９°もしくは１０１°〜１８０°であれば疎水性の溶液が反応場に流れ込む可能性があるため望ましくない。

反応場１０２の容積は５〜２０μＬであることが望ましい。

また、反応場１０２あるいは反応場を含む流路全体の内表面を親水処理することで、疎水性の溶液よりも親水性の溶液と反応場１０２との親和性が高まることから、配液量のバラつきを低減させることができる。親水処理の手法としては、プラズマ処理やコロナ放電処理もしくは薬品処理や微細加工による処理などが挙げられる。

次に本発明の試料分析チップの製造方法について説明する。

本発明の試料分析チップは反応場及び主流路及び注入口を有する第一の基材に、第二の基材を貼り合わせることで作成することができる。このとき、第二の基材は、配液した溶液が漏れることを防ぐため、第一の基材が有する反応場及び主流路及び注入口を覆うことができる面積を有する必要がある。

基材としては、試薬及び配液する溶液の反応性に影響がでないものであれば、特に制限はないが、良好な可視光透過性を確保できる基材、例えるなら、ポリプロピレン、アクリルが望ましい。本発明における光透過性とは、検出光の波長領域での全平均透過率が７０％以上であるとする。可視光領域で光透過性材料を用いるとチップ内の試料状態の把握が容易になるが、これに限られるものではない。

また、樹脂以外の材料としては金属材料、例えるならアルミニウム、銅、銀、ニッケルなどが望ましい。金属材料を用いる場合、熱伝導率及び貼合性能に優れる。

基材を貼り合わせる前に、反応場１０２に試薬を固定する。反応場は各々隔離されるため、各反応場に異なる試薬を固定することが可能である。反応場ごとに異なる試薬を固定することで、１つの検体に対して、一度に複数の反応を調べることができる。

試薬の固定方法としては、例えば、第一の基材の反応場１０２に液体試薬をピペット等で滴下し、乾燥させることで、反応場に試薬を固定することができる。

また、試薬を反応場１０２上に固定した後に、ワックスを滴下しても良い。例えば、ブロックバス上で溶解させたワックスを、反応場上に固定した試薬の上に、ピペット等で滴下する。このとき、固定された試薬を覆うようにワックスを滴下することで、試薬の流出を防ぐことが可能になる。第一の基材がワックスの融解温度以下であれば、滴下したワックスは直ちに凝固する。

基材の貼合方法としては、一方の基材に接着層として、樹脂コーティングを設け、熱をかけ溶解させることで第一の基材と第二の基材を接着する方法が挙げられる。例えば、第二の基材を金属とすると、樹脂コーティング層は、熱伝導率の高い金属材料側に設け、溶解接着することが望ましい。

次に本発明の試料分析チップを用いた試料分析方法について説明する。

本発明の試料分析チップは、例えばＤＮＡ、たんぱく質等の試料において生化学物質の検出や分析に使用することが出来る。各反応場１０２に試薬を固定し、固定した試薬の上に、ワックスを滴下する。この場合には、各反応場に異なる試薬を使用することができる。
これにより配液中に試薬が溶液に溶解し流出することを抑えることができる。

次に、液体試料を各ウェルに配液する。

次に、第一の基材と第二の基材を貼り合わせた本発明の試料分析チップに対して、まず注入口１０３から試薬等の溶液を主流路１０１に注入する。これにより、主流路１０１と反応場１０２が溶液で満たされる。

次に、試薬等の溶液を注入した試料分析チップに対して、注入口１０４から試料や試薬の反応を阻害しないような疎水性の溶液、例えばミネラルオイルを主流路１０１に注入する。これにより、反応中に液の蒸発を防ぐことができ、反応場に溜まった試薬等の溶液の流出を防ぐことができ、コンタミネーションを防ぐことが可能となる。ミネラルオイルは先に配液した溶液よりも比重が軽いものを用いることで、主流路側で各反応場の栓の役割を果たす。ミネラルオイルの種類としては、試料や試薬の反応を阻害しないものであれば特に制限は無い。

次に本発明の試料分析方法の例を説明する。

遺伝子解析の１例としては、例えば体細胞変異の検出や、生殖細胞変異の検出が挙げられる。遺伝子型の違いによって、発現するタンパク質の種類等が異なるため、例えば薬の代謝酵素の働きの違いを生み、結果として薬の最適投与量や副作用の出やすさ等に個人差が生じる。この事を医療現場で利用し、各患者の“遺伝子型”を調べる事で、オーダーメイド医療を行うことが出来る。

・ＳＮＰｓの検出
ヒトゲノムの中には、その約０．１％に個人特有の塩基配列の違いが存在し、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と呼ばれおり、生殖細胞変異のひとつである。ＳＮＰの特定方法の一つとして、例えば蛍光を用いたＰＣＲ‐ＰＨＦＡ（ＰＣＲ−Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｈｏｍｏｄｕｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）法が利用されている。ＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法は検出変異部位を増幅するＰＣＲ工程と、増幅断片と対応プローブによる競合的鎖置換反応工程から成り立っている。当該方法によれば、蛍光試薬の発光差によって変異を検出するが、本発明の試料分析チップを用いることで、各ウェルの配液バラツキが少ないため、正確なＳＮＰｓ検出を行うことが出来る。また上記以外のＳＮＰ検出方法としてインベーダー法（登録商標）、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ法等についても同様に本発明の試料分析チップを用いることが可能である。

以下に、本発明を用いてワルファリン（抗血液凝固剤。心臓病や高血圧用の薬として用いられる）に対する副作用に関与するＳＮＰついてＰＣＲ‐ＰＨＦＡ法を使った解析例を説明する。

血液などから得られる検体核酸を精製して、溶液試料とする。本発明の試料分析チップに注入前または注入後配液前に、検体核酸の増幅を行なう。なお、ワルファリンに関与するＳＮＰの検出にはＶＫＯＲＣ１やＣＹＰ２Ｃ９内のＳＮＰが議論されることが多く、ＣＹＰ２Ｃ９＊２やＣＹＰ２Ｃ９＊３などが有名である。検体からこれらのＳＮＰを含む遺伝子断片をマルチプレックスＰＣＲにて増幅する。

上記の検出方法では、一つのＳＮＰを判定するために２つの検出用のウェルが必要となるので１検体試料につき１０個以上のウェルが形成された試料分析チップを使用すると良く、それぞれのウェルに競合的鎖置換反応を行うためのＳＮＰ検出用の試薬を固定する。

上記ＰＣＲにより核酸が増幅された試料を、各ウェルに配液充填する。各ウェルを温調し、前記試薬に混入された蛍光試薬の発光差によって変異を検出する。一つのＳＮＰに対し２つのウェルのうち一つのみ陽性反応ならばホモ、二つ陽性ならヘテロと判定することができる。

本発明の反応チップは、例えば核酸等の試料において生化学物質の検出や分析に使用することができる。特にＳＮＰの変異を検出できることから、変異した細胞や遺伝子の検出に利用することができる。また、複数の乾燥した試薬に液体試薬を同時に混合できることから、反応容器としての応用が可能である。

１０１：主流路
１０２：反応場
１０３：注入口Ａ
１０４：注入口Ｂ
２０１：接線Ａと接線Ｂのなす角Ａ
２０２：注入口１０４側の主流路と、反応場１０２のなす角度Ｂ
２０３：主流路と反応場が接続されている側の壁面の主流路側の接線Ａ
２０４：主流路と反応場が接続されている側の壁面の反応場側の接線Ｂ

Claims (9)

1. 複数の反応場と、反応場に繋がる主流路と、主流路の両端の一方に第一の溶液、他方に第二の溶液を注入するための注入口を有し、前記主流路の両端が、それぞれ前記注入口と連絡していることを特徴とし、一方の主流路と反応場のなす角度が、もう一方の主流路と反応場のなす角度よりも大きいことを特徴とする試料分析チップ。
2. 前記第一の溶液の流入側の主流路と反応場のなす角度が１００°から１４０°に収まることを特徴とする請求項１記載の試料分析チップ。
3. 前記第二の溶液の流入側の主流路と反応場のなす角度が２０°から１００°に収まることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の試料分析チップ。
4. 少なくとも反応場を親水処理したことを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の試料分析チップ。
5. 前記試料分析チップは前記反応場及び前記流路を形成した第一の基材と、該基材と貼り合わせた第二の基材とを有する請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の試料分析チップ。
6. 前記基材のいずれか一方が光透過性材料で形成されていることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の試料分析チップ。
7. 第一の基材が光透過性の樹脂材料であり、第二の基材が金属材料であることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の試料分析チップ。
8. 請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の試料分析チップの主流路に流す第一の溶液が親水性であり、第二の溶液が前記第一の溶液と親和性の低い性質を持つ物質であり、前記主流路に溶液を配液する工程の後に、前記第一の溶液を注入した方とは異なる注入口から主流路へ前記第二の溶液を注入する工程を特徴とする試料分析方法。
9. 請求項８に記載の試料分析方法を用いたことを特徴とする遺伝子解析方法。

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