JP2006526983A - ｉｎｖｉｔｒｏ免疫感作により創製されたハイブリドーマからの抗体の高生産量の生成方法 - Google Patents

ｉｎｖｉｔｒｏ免疫感作により創製されたハイブリドーマからの抗体の高生産量の生成方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、骨髄腫細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫したドナー細胞と融合することにより製造されるハイブリドーマ細胞からの高力価の高親和性抗体の生成方法を提供する。高親和性抗体を産生するハイブリドーマからのクローン化された抗体遺伝子をもつハイブリドーマ細胞若しくは哺乳動物発現細胞は、該ハイブリドーマ細胞を超変異性にさせるミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルの発現による内因性ミスマッチ修復サブユニットの欠損によりミスマッチ修復欠損でありうるか、化学的手段により超変異性にされうるか、若しくは天然にミスマッチ修復欠損でありうる。高親和性抗体および抗体を産生する高力価産生体細胞を本発明の方法により製造しうる。

Description

関連出願への交差引用
本出願は、２００２年１１月１５日出願の米国仮出願第６０／４２７，１６５号明細書および２００３年９月１０日出願の米国仮出願第６０／５０１，６５０号明細書（それらの開示はこれによりそっくりそのまま引用することにより組込まれる）の利益を主張する。
本発明は高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の生成に関する。より具体的には、本発明は、高親和性で抗原に結合するＩｇＧサブクラスの高力価の抗原特異的抗体を産生するためのドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子若しくはミスマッチ修復の化学的阻害剤を使用するハイブリドーマ技術とともにのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作方法の使用に関する。
外来および／若しくは内因性のポリペプチドの活性を阻害するための抗体の使用は疾患の根底にある原因を治療するための効果的かつ選択的な戦略を提供する。具体的には、ＦＤＡに承認されたＣｅｎｔｏｃｏｒからの抗血小板モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、レオプロ（ＲｅｏＰｒｏ）（非特許文献１）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈからの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ
ＭＡｂ、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（非特許文献２）；およびＭｅｄｉｍｍｕｎｅにより製造されている抗ＲＳウイルスＭＡｂ、サイナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（非特許文献３）のような有効な治療薬としてのＭＡｂの使用である。
候補タンパク質標的に対するＭＡｂの標準的生成方法は当業者により既知である。簡潔には、マウス若しくはラットのようなげっ歯類に、免疫応答を生成させるためのアジュバントの存在下、精製した抗原を注入する（非特許文献４）。陽性の免疫血清を伴うげっ歯類を殺しそして脾細胞を単離する。単離した脾細胞を骨髄腫に融合して不死化細胞株を生じさせ、それをその後抗体産生についてスクリーニングする。陽性株を単離しそして抗体産生について特徴付けする。ヒト治療薬としてのげっ歯類ＭＡｂの直接使用は、げっ歯類由来抗体で治療した患者のかなりの数においてヒト抗げっ歯類抗体（ＨＡＲＡ）応答が発生したという事実のため混乱した（非特許文献５）。ＨＡＲＡの問題を回避するために、相補性決定領域（ＣＤＲ）（抗原結合ドメインを構成する免疫グロブリン（Ｉｇ）サブユニットのＨおよびＬ鎖可変領域内で見出される決定的に重要なモチーフである）のヒト抗体バックボーンへのグラフトが、これらのキメラ分子がＨＡＲＡ応答を欠きつつ抗原に対するそれらの結合活性を保持することが可能であることを見出した（非特許文献６）。げっ歯類由来ＭＡｂの「 ヒト化」（下でＨＡｂと称される）の間に存在する共通の一問題は、ヒトＩｇバックボーンへのグラフトに際してのＣＤＲドメインの三次元構造のコンホメーション変化による結合親和性の喪失である（特許文献１）。この問題を克服するために、通常、高親和性ＨＡｂを再創製するために枠組み領域および／若しくはＣＤＲコーディング領域それ自身内で付加的なアミノ酸残基を挿入若しくは欠失することにより工作するために付加的なＨＡｂベクターが必要とされる（特許文献１）。この過程は、高親和性ＨＡｂに至るかもしれない変化を予測するための高価なコンピュータモデル化プログラムの使用を必要とする、非常に時間のかかる処置である。いくつかの例においては、ＨＡｂの親和性はＭＡｂのものにまで復帰されることはなく、それらをほとんど治療的に有用でなくしている。
抗体工学に存在する別の問題は臨床材料のための分子の製造に必要とされる安定な高収
量産生体細胞株の生成である。この問題を回避するためにいくつかの戦略が当業者により標準的実務で採用されている。一方法は、抗体全体、若しくは抗原結合ポリペプチドを形成するＬおよびＨ鎖双方を含有するキメラ分子である一本鎖抗体を製造するために、グラフトされたヒトＬおよびＨ鎖を含有する外因性Ｉｇ融合遺伝子でトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の使用である（非特許文献７）。別の方法は、ヒトのグラフト免疫系を含有するトランスジェニックマウス若しくはヒトＩｇ遺伝子レパートリーを含有するトランスジェニックマウス由来のヒトリンパ球の使用を使用する。なお別の方法は、ヒト抗サル応答を欠くことが報告されている霊長類ＭＡｂを製造するためのサルの使用を使用する（非特許文献８）。全部の場合において、十分な量の高親和性抗体を生成させることが可能である細胞株の生成は、臨床研究に十分な材料を製造するための大きな制限を有する。これらの制限のため、 ヒト化抗体の安定な高レベル製造につながることができる系としての植物のような他の組換え系の有用性が現在探究されている（非特許文献９）。
外来抗体に対するヒトの反応の問題を克服するための一戦略は、ヒト免疫グロブリン産生細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激することである。ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体産生を刺激するための多様な試みは、典型的に、ＩｇＭサブクラスの低親和性抗体をもたらした（非特許文献１０）。
抗原に対する高い結合親和性をもつＨＡｂおよびＭＡｂをもたらす可変ドメイン内の多彩な抗体配列の生成方法は、それぞれより強力な治療的および診断的試薬の創製に有用であるとみられる。さらに、抗体分子全体を通じての無作為に変えられたヌクレオチドおよびポリペプチド残基の生成は、より少なく抗原性でありかつ／若しくは有益な薬物動態特性を有する新たな試薬をもたらすであろう。本明細書に記述される本発明は、生化学的に活性の抗体をコードする免疫グロブリンを産生する宿主細胞の内因性のミスマッチ修復（ＭＭＲ）活性を阻害することによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗体構造全体での無作為遺伝子突然変異の使用に向けられる。本発明はまた、反復されたｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子変化方法ならびに高められた結合および薬物動態プロファイルをもつ抗体の選択方法にも関する。
加えて、増大された量の抗体を分泌することが可能である遺伝子的に変えられた宿主細胞を開発する能力は、製品開発のための宿主細胞の貴重な創製方法をもまた提供するであろう。本明細書に記述される本発明は、ＭＭＲの阻害を介する増大された抗体産生を伴う遺伝子的に変えられた宿主細胞の創製にさらに向けられる。本発明は、高親和性抗体の生成、およびハイブリドーマ細胞由来の高められた抗体産生レベルを伴う細胞株の製造を助長する。本明細書に記述される本発明は抗原特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成方法を提供する。本発明の他の利点は本明細書に記述される実施例および図面に記述される。
Ｑｕｅｅｎらへの米国特許第５，５３０，１０１号明細書 Ｇｌａｓｅｒ、（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２１６−１２１７ Ｗｅｉｎｅｒ、（１９９９）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３−５１ ＳａｅｚＬｌｏｒｅｎｓら（１９９８）Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：７８７−７９１ Ｓｈｉｌｅｄら（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２７：８５５−８６４ Ｋｈａｚａｅｌｉら、（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２−５２ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＩＥＥＲＩＮＧ、Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９５中、ＥｍｅｒｙとＨａｒｒｉｓ，"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎａｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"、ｐｐ．１５９−１８３ Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５７３−５７６ ＮｅｕｂｅｒｇｅｒとＧｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８６：２５−２６ ＦｉｅｄｌｅｒとＣｏｎｒａｄ（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１０９０−１０９３ Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００：１８１−１９０
［発明の要約］
本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも該抗原に対し高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を提供する。
いくつかの態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルはＰＭＳ２遺伝子の短縮突然変異（例えばＰＭＳ２−１３４遺伝子）を含んでなる。本発明の方法のいくつかの態様において、抗体はＥＬＩＳＡに基づくアッセイ、または抗体−抗原結合を測定し得る他のアッセイを使用してスクリーニングされる。いくつかの態様において、スクリーニングアッセイは、親ハイブリドーマにより産生された抗体よりも高親和性の抗体を産生する超変異ハイブリドーマについてスクリーニングする。他の態様において、スクリーニングアッセイは、親ハイブリドーマよりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマについてスクリーニングする。
本発明の方法のいくつかの態様において、該方法は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルの不活性化、それによる前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化することをさらに含んでなる。
本発明の方法のいくつかの態様において、ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子は、免疫グロブリン産生細胞との前記骨髄腫の融合後にハイブリドーマ細胞に導入される。他の態様において、ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子は、免疫グロブリン産生細胞との融合前に骨髄腫細胞に導入される。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー血液細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ
細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価で産生された抗原特異的抗体についての超変異ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法も含んでなる。
いくつかの態様において、ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルはＰＭＳ２遺伝子の短縮突然変異（例えばＰＭＳ２−１３４遺伝子）を含んでなる。本発明の方法のいくつかの態様において、抗体はＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用してスクリーニングされる。いくつかの態様において、該スクリーニングアッセイは、親ハイブリドーマにより産生された抗体よりも高親和性の抗体を産生する超変異ハイブリドーマについてスクリーニングする。他の態様において、該スクリーニングアッセイは、親ハイブリドーマより高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマについてスクリーニングする。
本発明の方法のいくつかの態様において、該方法は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルの不活性化、それによる前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化することをさらに含んでなる。
本発明の方法のいくつかの態様において、ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子が前記骨髄腫の免疫グロブリン産生細胞との融合後にハイブリドーマ細胞に導入される。他の態様において、ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子は免疫グロブリン産生細胞との融合前に骨髄腫細胞に導入される。
本発明の方法のいくつかの態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは、該細胞のゲノムを再安定化するためにその後不活性化される。
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは免疫グロブリン産生細胞との融合前に骨髄腫細胞に導入してよい。かように、生じるハイブリドーマ細胞は骨髄腫細胞と同一のミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する。あるいは、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルをハイブリドーマ細胞に導入してよい。
本発明は該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体もまた含んでなる。
本発明はさらに、ドミナントネガティブなミスマッチ修復タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換え骨髄腫細胞を提供する。該ドミナントネガティブなミスマッチ修復タンパク質は、ドミナントネガティブな形態の例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、ならびに、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６およびＨｏｒｉｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１２５７−１２６４に記述されるところのＰＭＳＲ遺伝子のホモログによりコードされるＰＭＳＲタンパク質であってよい。いくつかの態様において、組換え骨髄腫細胞はＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレル（例えばＰＭＳ２−１３４遺伝子のようなＰＭＳ２遺伝子の短縮突然変異）をコードするポリヌクレオチドを発現する。
いくつかの態様において、組換え骨髄腫細胞はヒト細胞である。他の態様において、組換え骨髄腫細胞は免疫グロブリン遺伝子および／若しくはエプスタイン−バーウイルスを発現しない。他の態様において、骨髄腫細胞はＨＡＴ感受性である。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する哺乳動物発現細胞にクローン化すること；（ｅ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対してより高い親和性をもつ抗体を分泌する哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施して；それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も提供する。
いくつかの態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは免疫グロブリン遺伝子の導入前に前記哺乳動物発現細胞に導入される。他の態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは前記免疫グロブリン遺伝子の導入後に前記哺乳動物発現細胞に導入される。他の態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは免疫グロブリン遺伝子と同時に哺乳動物発現細胞に導入される。
本発明はまた、該哺乳動物発現細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現するハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生される抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも前記抗原に対してより大きい親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；（ｆ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化して；それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫したヒト免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も提供する。
いくつかの態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは細胞融合前に骨髄腫細胞中に存在する。他の態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは細胞融合後にハイブリドーマ細胞に導入される。
本発明はまた、該哺乳動物発現細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）該ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親哺乳動物発現細胞にクローン化すること；（ｅ）突然変異誘発を見込んで該親哺乳動物発現細胞をインキュベートしてそれにより超変異哺乳動物発現細胞を形成すること；（ｆ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対してよ
り高親和性をもつ抗体を分泌する超変異性哺乳動物発現細胞のスクリーニングを実施すること；および（ｇ）親哺乳動物発現細胞よりも高力価の抗体を分泌する超変異性哺乳動物発現細胞のスクリーニングを実施して；それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も提供する。
いくつかの態様において、ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルは免疫グロブリン遺伝子の導入前に前記哺乳動物発現細胞に導入される。他の態様において、ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルは前記免疫グロブリン遺伝子の導入後に前記哺乳動物発現細胞に導入される。他の態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは免疫グロブリン遺伝子と同時に哺乳動物発現細胞に導入される。
本発明はまた、該哺乳動物発現細胞により産生された抗体も提供する。
本発明はまた、ドミナントネガティブなミスマッチ修復タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換えの超変異性哺乳動物発現細胞も提供する。
該ミスマッチ修復遺伝子は、限定されるものでないが、ドミナントネガティブの形態のＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、ならびに、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６およびＨｏｒｉｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１２５７−１２６４に記述されるところのＰＭＳＲ遺伝子のホモログを挙げることができるドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子であってよい。制限しない一例はＰＭＳ２のドミナントネガティブな短縮変異体（例えばＰＭＳ２−１３４遺伝子）を包含する。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも該抗原に対するより大きな親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法も提供する。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より高力価で産生された抗原特異的抗体についての超変異ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを実施すること；および（ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高力価
抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法も提供する。
本発明の方法のいくつかの態様において、超変異ハイブリドーマ細胞はまた親ハイブリドーマにより生じられる力価よりも高力価の抗体の産生についてもスクリーニングされる。該スクリーニングは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ、若しくは抗体−抗原結合を測定するためのいずれかの他の手段を使用することであってよい。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）該ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化すること；（ｅ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該哺乳動物発現細胞をインキュベートすること；（ｆ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対するより高親和性をもつ抗体を分泌する哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施して；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も提供する。
本発明の方法のいくつかの態様において、該方法は、超変異哺乳動物発現細胞からの化学的阻害剤の除去、それによる前記超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該哺乳動物発現細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該ハイブリドーマ細胞をインキュベートして超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも該抗原に対するより大きな親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；（ｆ）該超変異ハイブリドーマ細胞からの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化してそれにより親哺乳動物発現細胞を形成して；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの選択された抗原に対する高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も提供する。
いくつかの態様において、親哺乳動物発現細胞をミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下でさらにインキュベートしてそれにより超変異哺乳動物発現細胞を形成し；そして、該超変異哺乳動物発現細胞を、親哺乳動物発現細胞の産生量より高い抗体産生量についてスクリーニングする。
本発明の方法のいくつかの態様において、該方法は、超変異ハイブリドーマおよび／若
しくは超変異哺乳動物発現細胞からの化学的阻害剤の除去、それによる前記超変異ハイブリドーマ細胞および／若しくは超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該哺乳動物発現細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化すること；（ｅ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で前記哺乳動物発現細胞をインキュベートして、それにより超変異哺乳動物発現細胞を形成すること；（ｆ）前記親哺乳動物発現細胞から産生された抗体に比較して抗原に対するより高親和性をもつ抗体を分泌する超変異哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施すること；および（ｇ）親哺乳動物発現細胞により生じられる力価よりも高力価の抗体を産生する超変異哺乳動物発現細胞についての第二のスクリーニングを実施し；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も提供する。
本発明の方法のいくつかの態様において、該方法は、超変異ハイブリドーマおよび／若しくは超変異哺乳動物発現細胞からの化学的阻害剤の除去、それによる前記超変異ハイブリドーマ細胞および／若しくは超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該哺乳動物発現細胞により産生された抗体も含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復が天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を、免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択し；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
該方法はさらに、ミスマッチ修復の野性型遺伝子を前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞に導入してミスマッチ修復欠損を補完して、それにより前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞のゲノムを再安定化することを含んでもよい。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復遺が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合して、それにより、ミ
スマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
該方法は、ミスマッチ修復の野性型遺伝子を前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞に導入してミスマッチ修復欠損を補完して、それにより前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞のゲノムを再安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復を天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；（ｆ）親ハイブリドーマ細胞に比較して増大された力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞についての第二のスクリーニングを実施すること；（ｇ）該親ハイブリドーマ細胞により産生されるよりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
該方法は、ミスマッチ修復の野性型遺伝子を前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞に導入してミスマッチ修復欠損を補完して、それにより前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞のゲノムを再安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合してそれによりミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；（ｆ）親ハイブリドーマ細胞に比較して増大された力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞についての第二のスクリーニングを実施すること；（ｇ）該親ハイブリドーマ細胞により産生されるよりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロ
ブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
該方法は、ミスマッチ修復の野性型遺伝子を前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞に導入してミスマッチ修復欠損を補完して、それにより前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞のゲノムを再安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復が天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を、免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；（ｆ）前記超変異ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化し；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価で高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法を含んでなる。
いくつかの態様において、親哺乳動物発現細胞は、ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下でさらにインキュベートしてそれにより超変異哺乳動物発現細胞を形成し；そして、該超変異哺乳動物発現細胞を、親哺乳動物発現細胞の産生量より高い抗体産生量についてスクリーニングする。
本発明の方法のいくつかの態様において、該方法は超変異哺乳動物発現細胞からの化学的阻害剤の除去、それによる前記超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該哺乳動物発現細胞により産生された抗体も含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合して、それによりミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；および（ｆ）前記超変異ハイブリドーマ細胞からの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化し；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も含んでなる。
いくつかの態様において、該親哺乳動物発現細胞は、ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下でさらにインキュベートして、それにより超変異哺乳動物発現細胞を形
成し；そして、該超変異哺乳動物発現細胞を、親哺乳動物発現細胞の産生量より高い抗体産生量についてスクリーニングする。
本発明の方法のいくつかの態様において、該方法は、超変異哺乳動物発現細胞からの化学的阻害剤の除去、それによる前記超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでもよい。
本発明はまた、該ハイブリドーマ細胞により産生された抗体も含んでなる。
本発明の方法のいくつかの態様において、免疫グロブリン産生細胞は、限定されるものでないがマウス細胞、ラット細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウサギ細胞、トリ細胞、サル細胞およびヒト細胞を挙げることができる哺乳動物細胞である。好ましい態様において、細胞はヒト細胞である。
いくつかの態様において、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、ならびに、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６およびＨｏｒｉｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１２５７−１２６４に記述されるところのＰＭＳＲ遺伝子のホモログのドミナントネガティブなアレルである。しかしながらミスマッチ修復遺伝子はこれらの例に制限されない。
本発明の方法のいくつかの態様において、免疫原性抗原は、限定されるものでないが破傷風トキソイド、卵アルブミン、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ジフテリアトキソイド、ＢＣＧおよびコレラトキシンを挙げることができるポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなる分裂促進性ポリペプチドに結合される。いくつかの態様において、抗原は成熟タンパク質を変性させることにより生成される。
本発明の方法のいくつかの態様において、産生された抗体は最低約１×１０７Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０８Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０９Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１０Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１１Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１２Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１３Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する。
いくつかの態様において、抗体は、親細胞株より最低約１．５倍より多い量でのような、親細胞株より高力価で産生される。他の態様において、力価は親細胞株より最低約１．５〜３倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約３〜５倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約５〜７倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約７〜９倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約９〜１０倍より高い。
本発明の方法のいくつかの態様において、突然変異率は、限定されるものでないがＮ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素、プロカルバジン塩酸塩、クロラムブシル、シクロホスファミド、メタンスルホン酸メチル、メタンスルホン酸エチル、ジエチル硫酸、アクリルアミド単量体、トリエチレンメラミン、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロニトロソグアニジン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキサイド、ヘキサメチルホスホルアミドおよびビスルファンを挙げることができる化学的突然
変異原とともにハイブリドーマ細胞をインキュベートすることによりさらに高められる。
本発明の方法のある態様にて使用されるミスマッチ修復の化学的阻害剤は、限定されるものでないがアントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの最低１種を挙げることができる。いくつかの態様において、化学的阻害剤は、式：
Figure 2006526983
（式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を場合によっては含有する炭水化物であり；ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびにここで前記アミノ基は１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で場合によっては置換される）
を有するアントラセンである。ある態様において、Ｒ５およびＲ６は水素である。他の態様において、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである。アントラセンの制限しない例は、１，２−ジメチルアントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、７，８−ジメチルアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、９，１０−ジヒドロキシメチルアントラセン、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−３，４−ジオールおよび９，１０−ジ−ｍ−トルイルアントラセンを包含する。
化学的阻害剤は細胞の増殖培地に導入してよい。いくつかの態様において、化学的阻害剤は、細胞のゲノムを再安定化するために、超変異ハイブリドーマ細胞から除去してよい。
本発明はまた：（ａ）ドナー細胞を動物から単離すること；（ｂ）前記細胞をＬ−ロイ
シル−Ｌ−ロイシンメチルエステル臭化水素酸塩で処理すること；（ｃ）前記ドナー細胞を、免疫原性の抗原とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで５〜１５％の血清および増殖を促進するサイトカインを補充した培地中、２５〜３７℃、５〜１０％ＣＯ２で４日間インキュベートすること；（ｄ）前記細胞を培地で洗浄すること；ならびに（ｅ）前記細胞を、５〜１５％の血清を補充した培地中で追加の８日培養し；それにより抗原特異的免疫グロブリン産生細胞の産生を刺激することを含んでなる、抗原特異的免疫グロブリン産生細胞のｉｎ
ｖｉｔｒｏ製造方法も含んでなる。
いくつかの態様において、免疫グロブリン産生細胞はヒト細胞である。
本発明の方法のいくつかの態様において、免疫原性抗原は、限定されるものでないが破傷風トキソイド、卵アルブミン、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、ジフテリアトキソイド、ＢＣＧおよびコレラトキシンを挙げることができるポリペプチドの少なくとも一部分を含んでなる分裂促進性ポリペプチドに結合される。いくつかの態様において、抗原は成熟タンパク質を変性させることにより生成される。
本発明の方法のいくつかの態様において、産生された抗体は最低約１×１０７Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０８Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０９Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１０Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１１Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１２Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１３Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する。
いくつかの態様において、抗体は、親細胞株より最低約１．５倍より多い量でのような、親細胞株より高力価で産生される。他の態様において、力価は親細胞株より最低約１．５〜３倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約３〜５倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約５〜７倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約７〜９倍より高い。他の態様において、力価は親細胞株より最低約９〜１０倍より高い。
本発明の方法のいくつかの態様において、突然変異率は、限定されるものでないがＮ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素、プロカルバジン塩酸塩、クロラムブシル、シクロホスファミド、メタンスルホン酸メチル、メタンスルホン酸エチル、ジエチル硫酸、アクリルアミド単量体、トリエチレンメラミン、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロニトロソグアニジン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキサイド、ヘキサメチルホスホルアミドおよびビスルファンを挙げることができる化学的突然変異原とともにハイブリドーマ細胞および／若しくは哺乳動物発現細胞をインキュベートすることによりさらに高められる。
本発明の方法にて使用される哺乳動物発現細胞は、限定されるものでないが、チャイニーズハムスター卵巣、ベビーハムスター腎細胞、ヒト胚腎株２９３、正常イヌ腎細胞株、正常ネコ腎細胞株、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ＣＯＳ細胞、および非腫瘍形成性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞、線維芽細胞株、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトーリ細胞、ヒト子宮頚癌細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌細胞、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ならびにＦＳ４細胞を挙げることができる。
これらおよび他の態様は次の節により完全に記述され、そしてある種の制限しない例を
含む。
［発明の詳細な記述］
本明細書で言及される、ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列に対する受託番号を包含する引用される特許、特許出願および学術論文はこれによりそっくりそのまま引用することにより組み込まれる。本明細書で引用されるいかなる参考文献と本出願の特定の教示との間のいかなる不一致も後者に好都合に解消されるべきである。同様に、語若しくは句の技術に理解される定義と本明細でとりわけ教示されるところの語若しくは句の定義の間のいかなる不一致も後者に好都合に解消されるべきである。
当業者に既知の組換えＤＮＡ技術の一般的原則を示す標準的参照著作は、限定されるものでないがＡｕｓｕｂｅｌら ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州プレインビュー（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎら編、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、ボカレイトン（１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＤＩＲＥＣＴＥＤ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード（１９９１）を挙げることができる。
本発明は、高親和性および／若しくは増大された産生量を伴うｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した細胞からの抗体産生細胞および抗体の製造方法の多様な態様を提供する。いくつかの態様において、抗体を産生する細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原に対して免疫されたリンパ系細胞と骨髄腫細胞を融合することにより形成されるハイブリドーマ細胞である。他の態様において、抗体を産生する細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原に対して免疫されたリンパ系細胞からクローン化した免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトした哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、該方法はハイブリドーマ細胞および哺乳動物細胞の双方を使用する。本発明の方法のいくつかの基本的な態様は後に続くとおり記述しうる。
一態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも該抗原に対しより大きな親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択し；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の生成方法を提供する。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価で産生された抗原特異的抗体についての該超変異ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価の抗体を産生する
超変異ハイブリドーマ細胞を選択し；それにより高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を提供する。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する哺乳動物発現細胞にクローン化すること；および（ｅ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対してより高親和性をもつ抗体を分泌する哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施して；それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を提供する。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現するハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生される抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも前記抗原に対してより大きい親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；および（ｆ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化して；それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体が産生されるを産生する哺乳動物発現細胞の製造方法を提供する。
なお別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）該ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親哺乳動物発現細胞にクローン化すること；（ｅ）突然変異誘発を見込んで該親哺乳動物発現細胞をインキュベートしてそれにより超変異哺乳動物発現細胞を形成すること；（ｆ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対してより高親和性をもつ抗体を分泌する超変異性哺乳動物発現細胞のスクリーニングを実施すること；および（ｇ）親哺乳動物発現細胞よりも高力価の抗体を分泌する超変異性哺乳動物発現細胞のスクリーニングを実施して；それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体が産生されるを産生する哺乳動物発現細胞を提供する。
なお別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートし
て、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも該抗原に対するより大きな親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体が産生されるを産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より高力価で産生された抗原特異的抗体についての該超変異ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを実施すること；および（ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の抗体が産生されるを産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を提供する。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）該ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化すること；（ｅ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該哺乳動物発現細胞をインキュベートすること；および（ｆ）該ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対するより高親和性をもつ抗体を分泌する哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施して；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体が産生されるを産生する哺乳動物発現細胞の製造方法を提供する。
なお別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で該ハイブリドーマ細胞をインキュベートして超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも該抗原に対するより大きな親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；および（ｆ）該超変異ハイブリドーマ細胞からの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化して、それにより親哺乳動物発現細胞を形成して；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの選択された抗原に対する高親和性抗体が高力価で産生されるを産生する哺乳動物発現細胞の製造方法を提供する。
なお別の態様において、本発明はまた：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）前記
ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｄ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化すること；（ｅ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で前記哺乳動物発現細胞をインキュベートしてそれにより超変異哺乳動物発現細胞を形成すること；（ｆ）前記親哺乳動物発現細胞から産生された抗体に比較して抗原に対するより高親和性を伴う抗体を分泌する超変異哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施すること；および（ｇ）親哺乳動物発現細胞により産生されるよりも高力価の抗体を産生する超変異哺乳動物発現細胞に対する第二のスクリーニングを実施して；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法も提供する。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復が天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を、免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体についての抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも該抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合して、それによりミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生される抗体よりも該抗原に対して高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復が天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を、免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；（ｆ）親ハイブリドーマ細胞に比較して増大された力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞についての第二のスクリーニングを実施すること；および（ｇ）該親ハイブリドーマ細胞により産生されるよりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）該免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合して、それによりミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）該超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）該親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；（ｆ）親ハイブリドーマ細胞に比較して増大された力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞についての第二のスクリーニングを実施すること；および（ｇ）該親ハイブリドーマ細胞により産生されるよりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；それにより高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法を含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復が天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；および（ｆ）前記超変異ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化し；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価で高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法を含んでなる。
別の態様において、本発明は：（ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合して、それによりミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｃ）突然変異誘発を見込んで該親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；（ｄ）超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；（ｅ）親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；および（ｆ）前記超変異ハイブリドーマ細胞からの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化し；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法を含んでなる。
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞、本発明の方法のいずれかにより製造された発現細胞、ならびに、本発明のハイブリドーマ細胞および発現細胞のいずれかにより産生された
抗体も提供する。
なお別の態様において：（ａ）ドナー細胞を動物から単離すること；（ｂ）前記細胞をＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル臭化水素酸塩で処理すること；（ｃ）前記ドナー細胞を、免疫原性の抗原とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで５〜１５％の血清および増殖を促進するサイトカインを補充した培地中、２５〜３７℃、５〜１０％ＣＯ２で４日間インキュベートすること；（ｄ）前記細胞を培地で洗浄すること；ならびに（ｅ）前記細胞を、５〜１５％の血清を補充した培地中で追加の８日培養して；それにより抗原特異的免疫グロブリン産生細胞の産生を刺激することにより、抗原特異的免疫グロブリン産生細胞が製造される。
本発明の方法で使用される血液細胞は抗体を産生するいかなる動物由来であってもよい。好ましくは、ドナー細胞は、限定されるものでないがヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、トリ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマおよびウシを挙げることができる哺乳動物由来である。血液の供給源は必ずしも制限されないが、しかし全血、若しくはリンパ球を含有する画分であってよい。血液は例えばドナー血若しくは臍帯血であってよい。いくつかの態様において、血液細胞は好ましくはヒトドナー細胞である。
本発明の方法でハイブリドーマ細胞を創製するのに使用される骨髄腫細胞は、適する骨髄腫細胞を有することが既知のいかなる種由来であってもよい。例えば、しかし制限としてでなく、骨髄腫細胞は便宜的にヒト若しくはマウス由来であってよい。骨髄腫細胞の適する例は、限定されるものでないが、Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅへの米国特許第４，７２０，４５９号明細書に記述されかつＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＣＲＬ ８６４４として寄託されたところのＨｕＮＳ１骨髄腫；ＧＭ４６７２；ＲＰＭＩ ８２２６；ならびにマウス骨髄腫細胞株（例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１；Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３；Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４；ＮＳ／Ｏ、ＮＳ／１、ＳＰ１およびＳ１９４）を挙げることができる。
本発明の方法のある態様での使用に適する哺乳動物発現細胞は、限定されるものでないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ細胞）、ヒト胚腎株２９３（ＨｅＬａ細胞、Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｏｌ．、３６：５９）、正常イヌ腎細胞株（例えばＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、正常ネコ腎細胞株（ＣＲＦＫ細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ−７）細胞、および非腫瘍形成性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １２４６）、線維芽細胞株（例えばヒト、マウス若しくはニワトリ胚線維芽細胞株）、骨髄腫細胞株、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞、マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ
２）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２）Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；ならびにヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）を挙げることができる。
哺乳動物発現細胞に対する一代替として、クローン化した免疫グロブリン遺伝子を発現させるのに他の非哺乳動物細胞を使用してよい。こうした非哺乳動物細胞は、限定される
ものでないが昆虫細胞（例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞など）を挙げることができる。ベクターおよび非哺乳動物宿主細胞は当該技術分野で公知であり、そして継続的に至適化かつ開発されている。抗体を発現することが可能ないかなる宿主細胞系も本発明の方法で使用してよい。
本明細書で使用されるところの「ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレル」は、発現された場合に、野性型アレルの存在下でさえミスマッチ修復系の阻害に至る細胞若しくは生物体において優性の表現型を発揮するミスマッチ修復遺伝子のアレルを指す。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する細胞は、野性型細胞よりも高率で超変異性でありかつ突然変異を蓄積する。本発明の方法で有用なミスマッチ修復タンパク質をコードする核酸配列の例は、限定されるものでないが、以下すなわちＰＭＳ１（配列番号１）；ＰＭＳ２（配列番号３）；ＰＭＳ２−１３４（配列番号５）；ＰＭＳＲ２（配列番号７）；ＰＭＳＲ３（配列番号９）；ＭＬＨ１（配列番号１１）；ＭＬＨ３（配列番号１３）；ＭＳＨ２（配列番号１５）；ＭＳＨ３（配列番号１７）；ＭＳＨ４（配列番号１９）；ＭＳＨ５（配列番号２１）；ＭＳＨ６（配列番号２３）；ＰＭＳＲ６（配列番号２５）；ＰＭＳＬ９（配列番号２７）；酵母ＭＬＨ１（配列番号２９）；マウスＰＭＳ２（配列番号３１）；マウスＰＭＳ２−１３４（配列番号３３）；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＭＳ２（配列番号３５）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＭＳ２−１３４（配列番号３７）シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＭＳ１（配列番号３９）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＳＨ７（配列番号４１）シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＳＨ２（配列番号４３）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＳＨ３（配列番号４５）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＳＨ６−１（配列番号４７）；およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｖｉａ）ＭＬＨ１（配列番号４９）を挙げることができる。列挙された核酸配列の対応するアミノ酸配列は：ＰＭＳ１（配列番号２）；ＰＭＳ２（配列番号４）；ＰＭＳ２−１３４（配列番号６）；ＰＭＳＲ２（配列番号８）；ＰＭＳＲ３（配列番号１０）；ＭＬＨ１（配列番号１２）；ＭＬＨ３（配列番号１４）；ＭＳＨ２（配列番号１６）；ＭＳＨ３（配列番号１８）；ＭＳＨ４（配列番号２０）；ＭＳＨ５（配列番号２２）；ＭＳＨ６（配列番号２４）；ＰＭＳＲ６（配列番号２６）；ＰＭＳＬ９（配列番号２８）；酵母ＭＬＨ１（配列番号３０）；マウスＰＭＳ２（配列番号３２）；マウスＰＭＳ２−１３４（配列番号３４）；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＭＳ２（配列番号３６）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＭＳ２−１３４（配列番号３８）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＰＭＳ１（配列番号４０）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＳＨ７（配列番号４２）シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＨＳ２（配列番号４４）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＳＨ３（配列番号４６）；シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＭＳＨ６−１（配列番号４８）；およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｖｉａ）ＭＬＨ１（配列番号５０）である。
本明細書で使用されるところの「高力価」は親細胞株より最低約１．５倍より高い力価を指す。いくつかの態様において、力価は親細胞株より最低約１．５〜３倍より高いか、３〜５倍より高いか、５〜７倍より高いか、７〜９倍より高いか、若しくは９〜１０倍より高い。
本明細書で使用されるところの「高親和性」は、式Ｋａ＝８／３（Ｉｔ−Ｔｔ）（式中「Ｉｔ」は５０％トレーサーでの阻害剤取り込みの総モル濃度であり、また、「Ｔｔ」はトレーサーの総モル濃度である）により標準的方法に従って計算しうる高い抗体結合親和性を指す。Ｍｕｌｌｅｒ（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３４：３４５−３５２を参照されたい。結合親和性は、式Ｂ／Ｔ＝ｎ×ＮＡｂ×Ｗ１０８［（Ｖ−Ｖｍ）Ｋ＋Ｑ×Ｗ］を使用して計算してもまたよい（ＡｎｔｏｎｉとＭａｒｉａｎｉ（１９８５）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８３：６１−６８を参照されたい）。本明細書で使用されるところの「高親和性」は最低約１×１０７Ｍ−１である。いくつかの態様において、抗体は最低約１×１０８Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０９Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１０Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１１Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１２Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１３Ｍ−１の親和性を有する。他の態様において、抗体は最低約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する。
本明細書で使用されるところの「抗原特異的」は、抗原のエピトープと免疫グロブリン分子のＣＤＲ領域との間の相互作用を指し、ここで免疫グロブリン分子のＣＤＲ領域はエピトープに結合する。
本明細書で使用されるところの「治癒される」は、ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子が細胞から排除されている、若しくはドミナントネガティブなアレルの発現のスイッチが切られて安定化されたゲノムに至り免疫グロブリンのような安定な生物学的産物を産生する細胞の状態を指す。
本発明の方法のいくつかの態様において、ミスマッチ修復は、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを細胞に導入することにより阻害される。
本発明の方法の他の態様において、ミスマッチ修復は、ミスマッチ修復を阻害する化合物に抗体を発現する細胞を曝露することにより阻害される。いくつかの態様において、化合物はＡＴＰアーゼ阻害剤である。適するＡＴＰアーゼ阻害剤は、限定されるものでないが、細胞中でのミスマッチ修復に必要なＡＴＰアーゼ活性を阻害することが可能であるＡＴＰ類似物を挙げることができる。本発明の方法で使用してよいＡＴＰ類似物の例は、限定されるものでないが、ミスマッチ修復活性を阻害するＡＭＰ−ＰＮＰおよびＡＴＰγＳのような加水分解不可能な形態のＡＴＰを挙げることができる（Ｇａｌｉｏら（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３３１；Ａｌｌｅｎら（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ．１６：４４６７−４４７６；Ｂｊｏｒｎｓｏｎら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：３１７６−３１８３）。他の適するＡＴＰアーゼ阻害剤は、候補のＡＴＰアーゼ阻害剤を用いてスクリーニングして細胞中のＡＴＰアーゼ活性を効果的に阻害する化合物を同定しうるミスマッチ修復レポーター細胞を使用して同定しうる。
本発明の方法の他の態様において、ミスマッチ修復はヌクレアーゼ阻害剤に抗体を発現する細胞を曝露することにより阻害される。ヌクレアーゼ阻害剤はミスマッチ修復の生化学的経路中のエキソヌクレアーゼ活性を阻害することが可能である。ミスマッチ修復レポーター細胞は、候補のヌクレアーゼ阻害剤を用いてスクリーニングしてミスマッチ修復系のエキソヌクレアーゼ活性を効果的に阻害する化合物を同定しうる。本発明の方法で使用してよい適するヌクレアーゼ阻害剤は、限定されるものでないがエンドヌクレアーゼ阻害剤Ｎ−エチルマレイミドの類似物（Ｈｕａｎｇら（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｐｏｈｙｓ．３１６：４８５）；エキソヌクレアーゼＩＩＩ阻害剤のヘテロ二量体アデノシン鎖アクリジン化合物（Ｂｅｌｍｏｎｔら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．１０：２９３−２９５）；ならびにヘリカーゼ阻害活性を有するヘリキノマイシンのような抗生物質化合物（Ｃｈｉｎｏら（１９９８）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）５１：４８０−４８６）を挙げることができる。他の適するヌクレアーゼ阻害剤は、候補のヌクレアーゼ阻害剤でスクリーニングして細胞中のヌクレアーゼ活性を効果的に阻害する化合物を同定しうるミスマッチ修復レポーター細胞を使用して同定しうる。
本発明の方法の他の態様において、ミスマッチ修復はＤＮＡポリメラーゼ阻害剤に抗体を産生する細胞を曝露することにより阻害される。ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、機能的ミスマッチ修復に必要とされるＤＮＡの重合を阻害することが可能である。適するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の例は、限定されるものでないが、アクチノマイシンＤ（Ｍａｒｔｉｎら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１８５９）；アフィジコリン（Ｋｕｗａｋａｄｏら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：１９０９）；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｌ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（Ｌ−ＦＭＡＵ）（Ｋｕｋｈａｎｏｖａら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：１１８１−１１８７）；および２’３’−ジデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）（Ｏｎｏら（１９８４）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．３８：３８２−３８９）を挙げることができる。他の適するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、候補のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を用いてスクリーニングして細胞中のＤＮＡポリメラーゼ活性を効果的に阻害する化合物を同定しうるミスマッチ修復レポーター細胞を使用して同定しうる。
本発明の方法の他の態様において、ミスマッチ修復は抗体を産生する細胞をアントラセンに曝露することにより阻害される。本明細書で使用されるところの「アントラセン」という用語は化合物アントラセンを指す。しかしながら、「アントラセン類」、「１種のアントラセン」若しくは「該アントラセン」のような一般的意味で称される場合、こうした用語は、置換の程度に関係なく、アントラセンの縮合トリフェニル核構造を含有するいかなる化合物、すなわち
Figure 2006526983
も指す。アントラセンは置換されていても未置換であってもよい。
本明細書で使用されるところの「アルキル」は１から約２０個までの炭素原子を含有する炭化水素を指す。アルキル基は直鎖状、分枝状、環状若しくはそれらの組合せであってよい。アルキル基は従って、具体的説明のみとしてメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、シクロペンチル、シクロペンチルメチル、シクロへキシル、シクロへキシルメチルなどを包含する。例えばアダマンタンのような縮合かつ／若しくは多環脂肪族環状環系もまた「アルキル」の定義内に包含される。本明細書で使用されるところの「アルケニル」という用語は最低１個の炭素−炭素二重結合を有するアルキル基を示す。本明細書で使用されるところの「アルキニル」という用語は最低１個の炭素−炭素三重結合を有するアルキル基を示す。
いくつかの好ましい態様において、上述されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールオキシおよびヘテロアリール置換基は１個若しくはそれ以上のさらなる置換基をもってよい；すなわちそれらは「置換されて」いてよい。いくつかの好ましい態様において、これらの置換基は、ハロゲン（例えばフッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、アラルキルオキシ基、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシならびにアミノ基を包含し得る。加えて、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニルおよびアリールオキシカルボニル基のアルキルおよびアリール部分もまたこうした置換基をもち得る。従って、例のみとして、置換アルキル基は、例えばアルキル基、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨー
ドアルキル基、アミノアルキル基、ならびにヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチルなどのようなヒドロキシアルキル基を包含する。いくつかの好ましい態様において、こうしたヒドロキシアルキル基は１から約２０個までの炭素を含有する。
本明細書で使用されるところの「アリール」という用語は、フェニル、ビフェニルおよびナフチルのような最低１個の芳香環を含有する５ないし約２０個の炭素原子を有する基を意味する。好ましいアリール基は未置換若しくは置換フェニルおよびナフチル基を包含する。「アリールオキシ」という用語は酸素原子により結合されているアリール基、例えばフェノキシ基を示す。
一般に、接頭語「ヘテロ」は最低１個のヘテロ（すなわち非炭素）原子の存在を示し、それらはいくつかの好ましい態様においては独立に１ないし３個のＯ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ若しくは金属原子である。従って、「ヘテロアリール」という用語は、１個若しくはそれ以上の環炭素原子がこうしたヘテロ原子により置き換えれているアリール基を示す。好ましいヘテロアリール基はピリジル、ピリミジル、ピロリル、フリル、チエニルおよびイミダゾリル基を包含する。
「アラルキル」（若しくは「アリールアルキル」）という用語は、１個のアリール基をもつアルキル基よりなる６から１５個までの炭素を有する基を示すことを意図している。アラルキル基の例はベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルおよびナフチルメチル基を包含する。
「アルキルアリール」（若しくは「アルカリール」）という用語は、１個のアルキル基をもつアリール基よりなる６から１５個までの炭素を有する基を示すことを意図している。アラルキル基の例はメチルフェニル、エチルフェニルおよびメチルナフチル基を包含する。
「アリールスルホニル」という用語はスルホニル基により結合されているアリール基、例えばフェニルスルホニルを示す。「アルキルスルホニル」という用語はスルホニル基により結合されているアルキル基、例えばメチルスルホニルを示す。
「アルコキシカルボニル」という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ（式中Ｒはアルキル、アルケニル若しくはアルキニルである）の基を示し、ここでそれらのアルキル、アルケニル若しくはアルキニル部分は本明細書に記述されるとおり場合によっては置換され得る。
「アリールオキシカルボニル」という用語は、式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ（式中Ｒはアリールである）の基を示し、ここでそのアリール部分は本明細書に記述されるとおり場合によっては置換され得る。
「アリールアルキルオキシ」若しくは「アラルキルオキシ」という用語は同等であり、かつ、Ｒ’がＲが本明細書に記述されるとおり場合によっては置換され得るアルキル、アルケニル若しくはアルキニルでありかつＲ’’がアリール若しくは置換アリール基を示す式−Ｏ−Ｒ’−Ｒ’’の基を示す。
「アルキルアリールオキシ」若しくは「アルカリールオキシ」という用語は同等であり、かつ、Ｒ’がアリール若しくは置換アリール基でありかつＲ’’が本明細書に記述されるとおり場合によっては置換され得るアルキル、アルケニル若しくはアルキニルである式−Ｏ−Ｒ’−Ｒ’’の基を示す。
本明細書で使用されるところの「アルデヒド基」という用語は式−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈの部分をもつ基を示す。「ケトン」という用語は、式−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ＝の基を含有する部分を示し、式中、ＲおよびＲ＝は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル若しくはアルカリールであり、それらのそれぞれは本明細書に記述されるとおり置換されてよい。
本明細書で使用されるところの「エステル」という用語は式−Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ＝若しくは−Ｒ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ＝の基を有する部分を示し、式中、ＲおよびＲ＝は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル若しくはアルカリールであり、それらのそれぞれは本明細書に記述されるとおり置換されてよい。
「エーテル」という用語は、式−Ｒ−Ｏ−Ｒ＝若しくはの基を有する部分を示し、式中、ＲおよびＲ＝は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル若しくはアルカリールであり、それらのそれぞれは本明細書に記述されるとおり置換されてよい。
「クラウンエーテル」という用語は数個の酸素原子を含有する環状エーテルというその通常の意味を有する。本明細書で使用されるところの「有機イオウ化合物」という用語は脂肪族若しくは芳香族イオウ含有化合物、例えばチオールおよびジスルフィドを示す。「有機金属基」という用語は最低１個の金属原子を含有する有機分子を示す。
「有機ケイ素化合物」という用語は脂肪族若しくは芳香族ケイ素含有化合物、例えばアルキルおよびアリールシランを示す。
「カルボン酸」という用語はアミノ酸以外のカルボキシル基を有する部分を示す。
本発明の方法で使用してよい適するアントラセンは、式：
Figure 2006526983
（式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を場合によっては含有する炭水化物であり；ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリール
および置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびに、ここで、前記アミノ基は１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で場合によっては置換される）
を有する化合物を含んでなる。いくつかの態様において、Ｒ５およびＲ６は水素である。他の態様において、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである。本発明の方法での使用に適するアントラセンは、限定されるものでないが１，２−ジメチルアントラセン、９，１０−ジメチルアントラセン、７，８−ジメチルアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、９，１０−ジヒドロキシメチルアントラセン、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン、ジメチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−１，２−ジオール、９−ヒドロキシメチル−１０−メチルアントラセン−３，４−ジオールおよび９，１０−ジ−ｍ−トルイルアントラセンを挙げることができる。
他の適するアントラセンは、候補アントラセンを用いてスクリーニングして細胞中のミスマッチ修復活性を効果的に阻害する化合物を同定しうるミスマッチ修復レポーター細胞を使用して同定しうる。いくつかの態様において、ミスマッチ修復の化学的阻害剤は、本発明のミスマッチ修復遺伝子に相同であるＲＮＡ干渉分子である。配列特異的ＲＮＡ干渉分子の生成技術は当該技術分野で公知でありかつ例えばＳｈａｒｐら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１−２４３３；Ｍａｒｘ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１３７０−１３７２；Ｇｒｉｓｈｏｋら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４９４−２４９７；およびＦｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１（それらの開示はとりわけそっくりそのまま引用することにより組み込まれる）に見出しうる。
本発明の方法の他の態様において、ミスマッチ修復は、ミスマッチ修復遺伝子をコードする１種若しくはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズする「アンチセンス化合物」に抗体を産生する細胞を曝露することにより阻害される。本明細書で使用されるところの「標的核酸」および「ミスマッチ修復遺伝子をコードする核酸」という用語は、ミスマッチ修復遺伝子をコードするＤＮＡ、こうしたＤＮＡから転写された（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを包含する）ＲＮＡ、およびまたこうしたＲＮＡ由来のｃＤＮＡも包含する。アンチセンス化合物のその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、複製および転写のような核酸の正常な機能を妨害する。アンチセンス化合物により破壊されるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、および１種若しくはそれ以上のｍＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシングのような機能を包含する。アンチセンス化合物はそれによりミスマッチ修復遺伝子の発現若しくは機能を阻害する。
所定のミスマッチ修復遺伝子の機能を可逆的に破壊するために、ミスマッチ修復のアンチセンスの阻害に特異的な核酸にターゲッティングすることが好ましい。本発明の情況において特定の核酸へのアンチセンス化合物の「ターゲッティング」は、機能が調節されるはずである核酸配列の同定で開始する多段階過程である。本明細書に開示されるとおり、アンチセンス戦略により標的としうる数種のミスマッチ修復遺伝子が存在する。標的としうる多様なミスマッチ修復遺伝子は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡを包含する、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２
、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、ならびに、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６およびＨｏｒｉｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１２５７−１２６４に記述されるところのＰＭＳＲ遺伝子のホモログなどである。ターゲッティングの次の段階は、ミスマッチ修復遺伝子の機能の阻害が起こるようなアンチセンス相互作用が起こるためのこの遺伝子内の部位（１個若しくは複数）の決定を必要とする。一態様において、遺伝子内部位が標的とされる。「遺伝子内部位」は該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始若しくは終止コドンを包含する領域である。当該技術分野で既知であるとおり、翻訳開始コドンは典型的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子中で；対応するＤＮＡ分子中で５’−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンはまた「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」若しくは「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子はＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ若しくは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、また、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧがｉｎ ｖｉｖｏで機能することが示されている。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、各場合の開始アミノ酸が真核生物において典型的にメチオニンであるとしても、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物および原核生物遺伝子は２種若しくはそれ以上の代替開始コドンを有することがあり、それらのいずれか１つが特定の細胞型若しくは組織または特定の一組の条件下で翻訳開始に優先的に利用されうることもまた当該技術分野で既知である。本発明の情況において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、こうしたコドンの配列（１種若しくは複数）に関係なく、ミスマッチ修復遺伝子をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するのにｉｎ ｖｉｖｏで使用されるコドン（１種若しくは複数）を指す。
遺伝子の翻訳終止コドン（すなわち「終止コドン」）が３種の配列すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）の１つを有してよいこともまた当該技術分野で既知である。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち５’若しくは３’）に約２５から約５０までの連続するヌクレオチドを包含するこうしたｍＲＮＡ若しくは遺伝子の一部分を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち５’若しくは３’）に約２５から約５０までの連続するヌクレオチドを包含するこうしたｍＲＮＡ若しくは遺伝子の一部分を指す。
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指すことが当該技術分野で既知であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）若しくは「コーディング領域」もまた効果的に標的としうる領域である。他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’の方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野で既知かつ従って該遺伝子上のｍＲＮＡ若しくは対応するヌクレオチドの５’ｃａｐ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを包含する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、および翻訳終止コドンから３’の方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野で既知かつ従って該遺伝子上のｍＲＮＡ若しくは対応するヌクレオチドの翻訳終止コドンと３’端との間のヌクレオチドを包含する３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を包含する。ｍＲＮＡの５’ｃａｐは、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’の残基に結合されているＮ７−メチル化グアノシン残基を含んでなる。ｍＲＮＡの５’ｃａｐ領域は、５’ｃａｐ構造それ自身ならびにｃａｐに隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含すると考えられる。５’ｃａｐ領域もまた好ましい標的領域でありうる。
数種の真核生物のｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるとは言え、多くは、翻訳される前に転写物から削除される「イントロン」として知られる１個若しくはそれ以上の領域を含有する。残存する（かつ従って翻訳される）領域は「エキソン」として知られ、そして一緒にスプライスされて連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位すなわち
イントロン−エキソン結合部もまた好ましい標的領域であることができ、そして異常なスプライシングが疾患に関与する場合、若しくは特定の１種のｍＲＮＡスプライス産物の過剰発現が疾患に関与する状況でとりわけ有用である。再配列若しくは欠失による異常な融合結合部もまた好ましい標的である。イントロンもまた、例えばＤＮＡ若しくはプレｍＲＮＡを標的としたアンチセンス化合物の有効なそして従って好ましい標的領域であり得ることもまた見出されている。
１個若しくはそれ以上の標的部位が一旦同定されれば、該標的に十分に相補性である、すなわち所望の効果を生じるのに十分に良好にハイブリダイズしかつ十分な特異性をもつオリゴヌクレオチドを選ぶ。
本発明の情況において、「ハイブリダイゼーション」は、相補ヌクレオシド若しくはヌクレオチド塩基間の水素結合（ワトソン−クリック、フーグステン若しくは逆フーグステン水素結合であってよい）を意味している。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成により対形成する相補核酸塩基である。本明細書で使用されるところの「相補的」は２ヌクレオチド間の正確な対形成の能力を指す。例えば、あるオリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、あるＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子の同一位置のヌクレオチドと水素結合することが可能である場合には、該オリゴヌクレオチドおよび該ＤＮＡ若しくはＲＮＡはその位置で相互に相補的であるとみなされる。該オリゴヌクレオチドおよび該ＤＮＡ若しくはＲＮＡは、各分子中の十分な数の対応する位置が相互と水素結合し得るヌクレオチドにより占められる場合に相互に相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」は、該オリゴヌクレオチドと該ＤＮＡ若しくはＲＮＡ標的との間で安定かつ特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性若しくは正確な対形成を示すのに使用される用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことが当該技術分野で理解されている。アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子への該化合物の結合が該標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡの正常な機能を妨害して利用性の喪失を引き起こし、また、特異的結合が望ましい条件下、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療的処置の場合には生理学的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で該アンチセンス化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補性は好ましくは１００％であるが、しかしながら、相補性がいくつかの態様において８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％若しくは９５〜１００％であるような縮重をオリゴヌクレオチドに導入しうる。
標的にハイブリダイズしかつ標的の発現を阻害する本発明のアンチセンスおよび他の化合物は実験により同定され、そして、これらの化合物の配列は本発明の好ましい態様として本明細書で下に同定されている。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、例えばＰＭＳ２タンパク質のＣ末端部分の翻訳を阻害して短縮変異体を効果的に形成するＰＭＳ２の領域を含んでなる。標的とされた領域は、例えばＰＭＳ２の１３４アミノ酸をコードするＰＭＳ遺伝子の一部分を含んでなる。
本発明の情況において、「オリゴヌクレオチド」という用語はリボ核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー若しくはポリマーまたはそれらの模倣物を指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。こうした修飾若しくは置換オリゴヌクレオチドは、例えば高められた細胞取り込み、核酸標的に対する高められた親和性、およびヌクレアーゼの存在下での増大された安定性のような望ましい特性により天然の形態よりしばしば好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい一形態である一方、本発明は、限定されるものでないが下述されるようなオリゴヌクレオチド模倣物を挙げることができる他のオリゴマーアンチセンス化合物を包括する。本発明のアンチセンス化合物は好ましくは約８から約５０個までの核酸塩基（すなわち約８から約５０個までの結合されたヌクレオシド）を含んでなる。とりわけ好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド、なおより好ましくは約１２から約３０個までの核酸塩基を含んでなるものである。アンチセンス化合物は、リボザイム、外的ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム（ｏｌｙｇｏｚｙｍｅ））、ならびに、標的核酸にハイブリダイズしかつその発現を調節する他の短い触媒的ＲＮＡ若しくは触媒的オリゴヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは長さが最低約１５ヌクレオチドであり、かつ、長さが最低２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００若しくはそれ以上のヌクレオチドであってよい。
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；若しくは配列番号４９に示されるミスマッチ修復配列の一部分に相補的である配列を含んでなる。ある態様において、オリゴヌクレオチドは８５〜１００％の相補性を伴い、長さが最低１５〜５０ヌクレオチドである。
当該技術分野で既知であるとおり、ヌクレオシドは塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常ヘテロ環塩基である。こうしたヘテロ環塩基の２種の最も一般的な分類はプリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するヌクレオシドについて、リン酸基は糖の２’、３’若しくは５’いずれかのヒドロキシル部分に結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドを相互に共有結合して直鎖状ポリマー化合物を形成する。順に、この直鎖状ポリマー構造のそれぞれの端がさらに結合されて環状構造を形成し得るが、しかしながら開放の直鎖状構造が一般に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合若しくはバックボーンは３’から５’のホスホジエステル結合である。
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例は、改変バックボーンすなわち非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。本明細で定義されるとおり、改変バックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーンにリン原子を保持するものおよびバックボーンにリン原子を有しないものを包含する。本明細の目的上、および当該技術分野でときに言及されるとおり、それらのヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有しない改変オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドであるとみなし得る。
好ましい改変オリゴヌクレオチドバックボーンは、例えばホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンリン酸、５’−アルキレンリン酸およびキラルなリン酸を包含するメチルおよび他のアルキルリン酸、ホスフィン酸、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを包含するホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエス
テル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合した類似物、ならびに１個若しくはそれ以上のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、若しくは２’から２’結合である逆の極性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｏｌａｒｉｔｙ）を有するものを包含する。逆の極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合で単一の３’から３’の結合、すなわち塩基性でありうる単一の逆ヌクレオシド残基（該核酸塩基を欠いているか若しくはその代わりにヒドロキシル基を有する）を含んでなる。多様な塩、混合塩および遊離の酸の形態もまた包含される。
上のリンを含有する結合の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号および同第５，６２５，０５０号明細書（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
その中にリン原子を包含しない好ましい改変オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子およびアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１種若しくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーンを有するもの；ならびに混合したＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他者を包含する。
上のオリゴヌクレオシドの製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；同第５，７９２，６０８号；同第５，６４６，２６９号および同第５，６７７，４３９号明細書（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の双方すなわちバックボーンが新規基で置換されている。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため維持される。１種のこうしたオリゴマ
ー化合物すなわち優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物はペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンが、アミド含有バックボーン、とりわけアミノエチルグリシンバックボーンで置換されている。核酸塩基は保持されかつバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接若しくは間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号明細書（それらのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示はＮｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００に見出し得る。
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンをもつオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子バックボーンをもつオリゴヌクレオシド、ならびにとりわけ上で参照される米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）すなわちＭＭＩバックボーンとして知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、天然のホスホジエステルバックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、ならびに上で参照される米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミドバックボーンである。上で参照される米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
修飾オリゴヌクレオチドはまた１個若しくはそれ以上の置換された糖部分も含有してよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位の以下すなわちＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１種を含んでなり、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換若しくは未置換のＣ１ないしＣ１０アルキル若しくはＣ２ないしＣ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（式中ｎおよびｍは１から約１０までである）がとりわけ好ましい。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下すなわちＣ１ないしＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール若しくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、若しくはオリゴヌクレオチドの薬動力学特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基の１種を含んでなる。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）すなわち２’−ＭＯＥとしてもまた知られる）（Ｍａｒｔｉｎら（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７８：４８６−５０４）すなわちアルコキシアルコキシ基を包含する。さらなる好ましい修飾は、下に実施例で記述されるところの２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシすなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、およびまた下に実施例で記述されるところの２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルすなわち２’−ＤＭＡＥＯＥとしてもまた当該技術分野で既知）すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２を包含する。
さらなる好ましい修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’若しくは４’炭素原子に結合されてそれにより二環性の糖部分を形成するロック核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）を包含する。該結合は、好ましくは２’酸素原子および３’若しくは４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基（式中ｎは１若しくは２である）である。ＬＮＡおよびその製造法は第ＷＯ ９８／３９３５２号および同第ＷＯ
９９／１４２２６号明細書に記述されている。
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。２’−修飾はアラビノ（上）位であってもリボ（下）位であってもよい。好ましい２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。類似の修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置、とりわけ３’末端ヌクレオチド若しくは２’−５’結合したオリゴヌクレオチドの糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位でもまた作成してよい。オリゴヌクレオチドはペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣物を有してもまたよい。こうした修飾された糖構造の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４４６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；同第５，７９２，７４７号；および同第５，７００，９２０号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
オリゴヌクレオチドは核酸塩基（しばしば、当該技術分野では「塩基」と単純に称される）の修飾若しくは置換もまた包含してよい。本明細書で使用されるところの「未置換の」若しくは「天然の」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を包含する。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、とりわけ５−ブロモ、５−フルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然の核酸塩基を包含する。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）のような三環性ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のようなＧ−クランプ（Ｇ−ｃｌａｍｐ）を包含する。修飾核酸塩基はまた、プリン若しくはピリミジン塩基が他の複素環で置換されているもの、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび
２−ピリドンも包含してよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、ＴＨＥ ＣＯＮＣＩＳＥ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ ＯＦ ＰＯＬＹＭＥＲ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ（編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０、８５８〜８５９ページに開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ）３０：６１３により開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、ＣｒｏｏｋｅとＬｅｂｌｅｕ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、２８９〜３０２ページにより開示されるものを包含する。これらの核酸塩基のあるものは本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるためにとりわけ有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを包含するＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを包含する。５−メチルシトシン置換が核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、ＣｒｏｏｋｅとＬｅｂｌｅｕ（編）、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ、１９９３、ｐｐ．２７６〜２７８）そして、なおよりとりわけ２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられる場合に現在好ましい塩基置換である。
上に示される修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のあるものの製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、上に示された米国特許第３，６８７，８０８号明細書、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６４５，９８５号；同第５，７５０，６９２号；同第５，８３０，６５３号；同第５，７６３，５８８号；同第６，００５，０９６号；および同第５，６８１，９４１号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布若しくは細胞取り込みを高める１種若しくはそれ以上の部分若しくは複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をオリゴヌクレオチドに化学的に結合することを必要とする。本発明の化合物は一級若しくは二級ヒドロキシル基のような官能基に共有結合された複合物基を包含し得る。本発明の複合物基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬動力学特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態特性を高める基を包含する。典型的な複合物基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素を包含する。本発明の情況において薬動力学特性を高める基は、オリゴマーの取り込みを向上させ、分解に対するオリゴマーの抵抗性を高め、かつ／若しくはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を包含する。本発明の情況において、薬物動態特性を高める基は、オリゴマーの取り込み、分布、代謝若しくは排泄を向上させる基を包含する。代表的な複合物基は１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号明細書（その開示全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている。複合物部分は、限定されるものでないが、コレステロール部分のような脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０
：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７５：４９−５４）、リン脂質、例えばジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール若しくは１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−リン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎら（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：３５６１−３６５４；Ｓｈｅａら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １４：９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２６４：２２９−２３７）、あるいはオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７７：９２３−９３７）を挙げることができる。
こうしたオリゴヌクレオチド複合物の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
所定の化合物中の全部の位置が均一に修飾されることは必要でなく、そして、実際、前述の修飾の１種以上が単一の化合物若しくは１オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドでさえ組込まれていてよい。本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物もまた包含する。本発明の情況における「キメラの（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」アンチセンス化合物若しくは「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、それぞれ最低１個の単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合には１個のヌクレオチドから構成されている２個若しくはそれ以上の化学的に別個の領域を含有するアンチセンス化合物、とりわけオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増大さ
れた抵抗性、増大された細胞取り込み、および／若しくは標的核酸に対する増大された結合親和性を該オリゴヌクレオチドに賦与するように該オリゴヌクレオチドが改変されている最低一領域を含有する。オリゴヌクレオチドの付加的な一領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡ若しくはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素の基質としてはたらきうる。例として、ＲＮアーゼＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は従ってＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく高める。結果、キメラオリゴヌクレオチドを使用した場合に、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較してより短いオリゴヌクレオチドを用いて匹敵する結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動、および必要な場合は当該技術分野で既知の関連した核酸ハイブリダイゼーション技術により慣例に検出し得る。
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述されたところの２種若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／若しくはオリゴヌクレオチド模倣物の混成構造として形成しうる。こうした化合物は当該技術分野でハイブリッド若しくはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）ともまた称される。こうしたハイブリッド構造の製造法を教示する代表的な米国特許は、限定されるものでないが、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
本明細書で使用されるところの、ときに単純に「ドナー細胞」若しくは「ドナー血液細胞」と称される「免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞」若しくは「免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞」は、抗原性化合物で免疫した場合に抗体を産生することが可能である細胞を指す。本発明での使用に適するこうしたドナー細胞の供給源の例は、限定されるものでないが脾細胞、リンパ節細胞、骨髄細胞および不死化腫瘍浸潤性リンパ球を挙げることができる。
本明細書で使用されるところの「アミノ酸」という用語はアミノ基およびカルボキシル基双方を含有する分子を示す。いくつかの好ましい態様において、アミノ酸はそれらの立体異性体およびラセミ化合物を包含するα−、β−、γ−若しくはδ−アミノ酸である。本明細書で使用されるところの「Ｌ−アミノ酸」という用語はα炭素の周囲でＬ−配置を有するα−アミノ酸、すなわちＬ−配置を有する一般式ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）のカルボン酸を示す。「Ｄ−アミノ酸」という用語は同様にα炭素の周囲でＤ−配置を有する一般式ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）のカルボン酸を示す。Ｌ−アミノ酸の側鎖は天然に存在するおよび天然に存在しない部分を包含する。天然に存在しない（すなわち非天然の）アミノ酸側鎖は例えばアミノ酸類似物で天然に存在するアミノ酸側鎖の代わりに使用される部分である。例えばＬｅｈｎｉｎｇｅｒ、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、１９７５、７２〜７７ページ（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。アミノ酸置換基は、それらの酸素若しくはカルボニル炭素によりそれらのカルボキシル基により、またはそれらのアミノ基により、あるいはそれらの側鎖部分に存する官能性により結合されていてよい。
本明細書で使用されるところの「ポリヌクレオチド」は核酸分子を指しかつゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを包含する。
本明細書で使用されるところの「ミスマッチ修復の阻害剤」は、細胞のミスマッチ修復系の最低１種の機能を妨害しかつそれにより細胞を突然変異に対しより感受性にする剤を指す。
本明細書で使用されるところの「超変異性」は、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ
ｖｉｖｏでミスマッチ修復系の喪失若しくは障害により突然変異に対しより感受性にされている状態を指す。
本明細書で使用されるところの、「剤」、「化学物質」および「阻害剤」は、ＭＭＲの阻害に関して使用される場合、ＭＭＲの正常な機能を妨害する化学物質、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ干渉分子、天然の基質の類似物などを指す。
本明細書で使用されるところの「約」は引用される値の±１０％の範囲内の量を指す。
本明細書で使用されるところの「分裂促進性ポリペプチド」は、抗原と組合せの場合に、主題の抗原に対する免疫応答を増大させるために適切な細胞の刺激を提供するポリペプチドを指す。
本明細書で使用されるところの「ハイブリドーマ」は、免疫グロブリン産生細胞と骨髄腫細胞のような形質転換細胞との間の細胞融合の結果を指す。
本明細書で使用されるところの「ＩｇＧサブクラス」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含んでなる免疫グロブリンの一範疇を指す。
本明細書で使用されるところの「ミスマッチ修復遺伝子」は、ミスマッチ修復複合体のタンパク質の１種をコードする遺伝子を指す。いずれか特定の作用機序理論により束縛されることを願わないとは言え、ミスマッチ修復複合体はヌクレオチド塩基の非相補的対形成から生じるＤＮＡへリックスの歪みを検出すると考えられている。より新たなＤＮＡ鎖上の非相補的塩基を切り出し、そして切り出された塩基をより古いＤＮＡ鎖に相補的である適切な塩基で置換する。こうして、細胞はＤＮＡ複製における誤りの結果として生じる多くの突然変異を排除する。ドミナントネガティブなアレルは、同一細胞中で野性型アレルの存在下でさえミスマッチ修復欠損表現型を生じさせる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルの制限しない一例は、コドン１３４に短縮突然変異を運搬するヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４である。該突然変異は、この遺伝子の産物を１３４番目のアミノ酸の位置で異常に終止させてＮ末端の１３３アミノ酸を含有する短縮されたポリペプチドをもたらす。こうした突然変異はＤＮＡ複製後に細胞中に蓄積する突然変異の率の増大を引き起こす。従って、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルの発現は、野性型アレルの存在下でさえミスマッチ修復活性の障害をもたらす。
本明細書で使用されるところの「ＨＡＴ感受性」は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地中で培養される場合の細胞に対する致死的影響を指す。
本明細書で使用されるところの「ＥＢＶ陰性」は、ＥＢＮＡタンパク質の産生若しくはＥＢＶ核酸の検出により測定されるところの細胞中のエプスタイン−バーウイルスの感染の欠如を指す。
本明細書で使用されるところの「Ｉｇ陰性」は免疫グロブリンのいかなるＬ若しくはＨ鎖の細胞中での産生の欠如も指す。
本明細書で使用されるところの「スクリーニング」は、限定されるものでないが、核酸配列、タンパク質配列、タンパク質機能（例えば結合、酵素活性、阻害活性、交差阻害活性、中和活性など）を挙げることができる細胞若しくは細胞産物の遺伝子型若しくは表現型を評価するためのアッセイを指す。該アッセイはＥＬＩＳＡに基づくアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ分析などを包含する。
本明細書で使用されるところの「単離された」は、その天然の環境の成分から分離かつ／若しくは回収されている核酸若しくはタンパク質を指す。その天然の環境の汚染成分は、該ポリペプチドの診断的若しくは治療的用途を妨害するとみられる物質であり、かつ、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性若しくは非タンパク質溶質を包含してよい。いくつかの態様において、核酸若しくはタンパク質はタンパク質の９５重量％以上まで精製される。他の態様において、核酸若しくはタンパク質はタンパク質の９９重量％以上まで精製される。タンパク質純度の測定は、ローリー法のような当該技術分野で既知のいずれかの手段によっても、クマシーブルー若しくは銀染色のような染色を使用する還元若しくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってもよい。核酸の精製は、限定されるものでないが分光法、蛍光若しくは例えばメチレンブルーのような化学的染色を用いるアガロース若しくはポリアクリルアミド分離を挙げることができるいずれかの既知の方法により評価しうる。
本発明は、ＩｇＧサブクラスの免疫グロブリンを産生する抗原特異的免疫グロブリン産生細胞を得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作方法、および本方法により製造された細胞を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作手順はドナー細胞を培養物中で免疫原性の抗原と組み合わせることを含んでなる。一態様において、ドナー細胞のバフィコートを使用する。ドナーは、限定されるものでないが臍帯血、静脈血などを挙げることができるいずれの供給源からであってもよい。血液細胞の供給源は免疫細胞を産生するいかなる動物、具体的には哺乳動物からであってもよい。血液細胞供給源の制限しない例は、マウス、ラット、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トリ、ウシ、モルモットおよび魚を包含する。血液若しくはバフィコートは、限定されるものでないが差次的遠心分離、濾過などを挙げることができるいずれかの既知の方法によりリンパ球についてさらに濃縮してよい。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のようなドナー細胞をＬ−ロイシル−Ｌ−リシンメチルエステル臭化水素酸塩（ＬＬＯＭｅ）中でインキュベートしうる。いずれかの特定の操作理論により拘束されることを願わない一方、ＬＬＯｍｅはリソゾーム向性であると考えられており、かつ、Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞アクセサリー細胞および線維芽細胞に対する影響を有しない一方でＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞およびＣＤ８＋サプレッサーＴ細胞のようなＰＢＭＣプール中の細胞傷害性細胞を特異的に殺す（Ｂｏｒｒｅｎｂａｅｃｋ（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９（１１）：３５５−３５９）。一般に、ＰＢＭＣをＬＬＯＭｅともに１〜３０分間インキュベートしうる。いくつかの態様において、該インキュベーションは１０〜２０分間実施する。他の態様において、該インキュベーションは１５分間実施する。ＬＬＯＭｅは一般に例えばＲＰＭＩ １６４０のような培地の一成分であり、そして約０．１０ないし１ｍＭの濃度で提供される。いくつかの態様において、ＬＬＯＭｅは約０．１０ないし０．５０ｍＭの量で提供される。他の態様において、ＬＬＯＭｅは約０．２５ｍＭの量で提供される。
抗原はいかなる抗原であってもよいが、但しそれは免疫原性である。全タンパク質を使用してもペプチドを使用してもよい。加えて、例えば膜調製物（腫瘍からのものを包含する）、リンパ腫細胞、全細胞、単細胞、ホモジェナイズした細胞、病原体、封入体、細胞ライセート、タンパク質調製物および刻んだ組織（腫瘍組織を包含する）を使用しうる。全タンパク質は天然のコンホメーションであっても変性したコンホメーションであっても
よい。ペプチドは免疫原性を提供するように担体分子に結合してよい。いずれかの特定の操作理論により拘束されることを願わない一方、担体分子は、より確実なｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体応答の刺激において有用でありうる付加的なＴ細胞エピトープを提供しうる。本発明の方法での使用に適する担体の例は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキシン、サイログロブリン、コレラトキシン、ＢＣＧ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵アルブミン（ＯＶＡ）などを包含する。これらの担体は本明細書で「分裂促進性ポリペプチド」と称される。
抗原は当該技術分野で既知のいずれの方法で分裂促進性ポリペプチドに結合してもよい。例えば、分裂促進性ポリペプチドの最低一部分をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合させた抗原の最低一部分をコードするポリヌクレオチドを含んでなる組換え発現系でポリペプチドを発現させることにより融合タンパク質を生成させうる。該融合タンパク質は、分裂促進性ポリペプチドを該抗原のアミノ若しくはカルボキシいずれかの末端に結合させている。いくつかの態様において、１種以上の抗原を分裂促進性ポリペプチドとともに融合タンパク質として発現しうる。他の態様において、１種以上の分裂促進性ポリペプチドを抗原（１種若しくは複数）を伴う融合タンパク質として発現しうる。他の態様において、１種以上の分裂促進性ポリペプチドおよび１種以上の抗原を単一融合タンパク質として一緒に発現しうる。
代替の一態様において、分裂促進性ポリペプチドの最低一部分を、化学的架橋剤を使用して抗原の最低一部分に結合する。化学的架橋剤の例は、限定されるものでないが、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド）を挙げることができる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は光の存在下で架橋を形成することが可能である光活性化可能な中間体を生じる。あるいは、例えば、分裂促進性ポリペプチド若しくは抗原中のリシン残基を、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドでの処理によりそれぞれ該抗原若しくは分裂促進性ポリペプチド中のＣ末端若しくは他のシステインに結合しうる（ＫｉｔａｇａｗａとＡｉｋａｗａ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９、２３３−２３６）。あるいは、分裂促進性ポリペプチド若しくは抗原中のリシン残基は、クロロギ酸イソブチルを使用してそれぞれ該抗原若しくは分裂促進性ポリペプチド中のグルタミン酸若しくはアスパラギン酸残基に結合しうる（ＴｈｏｒｅｌｌとＤｅ Ｌａｒｓｏｎ（１９７８）ＲＡＤＩＯＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ：ＭＥＴＨＯＤＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、ｐ．２８８）。他のカップリング反応および試薬は文献に記述されている。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作処置の条件は、約５〜１０％ＣＯ２を供給される約２５〜３７℃（好ましくは３７℃）で細胞をインキュベートすることを含んでなる。いくつかの態様において、該インキュベーションは約６〜９％の間のＣＯ２を用いて実施する。他の態様において、該インキュベーションは約８％のＣＯ２中で実施する。細胞密度は培地中約２．５ないし５×１０６細胞／ｍｌの間である。いくつかの態様において、培地には約２〜２０％のＦＢＳを補充する。他の態様において、培地には約５〜１５％のＦＢＳを補充する。他の態様において、培地には約７〜１２％のＦＢＳを補充する。他の態様において、培地には約１０％のＦＢＳを補充する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激培地には、細胞を刺激しかつ免疫応答を増大させるためにサイトカインを補充する。一般にＩＬ−２を培地に供給する。しかしながら、免疫応答を増大さ
せるために他のサイトカインおよび添加物もまた包含してよい。こうしたサイトカインおよび因子は例えばＩＬ−４および抗ＣＤ４０抗体を包含してよい。
骨髄腫細胞の免疫グロブリン産生細胞との融合は当該技術分野で既知のハイブリドーマ細胞のいずれの創製方法によってもよい。これらの方法は、限定されるものでないが、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術、（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号明細書）（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−５４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１１）：４９８０−４９８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２９２７−２９３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−２７５もまた参照されたい）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、ならびにＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ
ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）を挙げることができる。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養してもｉｎ ｖｉｖｏで培養してもよい。
モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は当業者に公知であり、そして例えばＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＮＥＷ ＤＩＭＥＮＳＩＯＮ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＮＡＬＹＳＥＳ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）中、Ｋｅｎｎｅｔｈ；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、５４：３８７−４０２；Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２；およびＧｅｆｔｅｒら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−２３６）に記述されている。しかしながら、こうした方法の多くの変法が可能でありかつ当業者により認識されるであろう。従って、ハイブリドーマの生成技術はこれらの参考文献の開示に制限されない。
いかなる骨髄腫細胞も本発明の方法で使用してよい。好ましくは、骨髄腫細胞はヒト細胞であるが、しかし本発明はそれに若しくはそれにより制限されない。いくつかの態様において、該細胞はヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（ＨＡＴ培地）に感受性である。いくつかの態様において、骨髄腫細胞は免疫グロブリン遺伝子を発現しない。いくつかの態様において、骨髄腫細胞はエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）感染について陰性である。好ましい態様において、骨髄腫細胞はＨＡＴ感受性、ＥＢＶ陰性かつＩｇ発現陰性である。いずれの適する骨髄腫を使用してもよい。こうした骨髄腫の一例は、Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅへの米国特許第４，７２０，４５９号明細書に記述されかつＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＣＲＬ ８６４４として寄託されたものである。マウス骨髄腫細胞株（例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３若しくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）を使用してマウスハイブリドーマを生成してよい。これらのマウス骨髄腫株はＡＴＣＣから入手可能である。
本発明の方法のいくつかの態様において、ハイブリドーマ細胞および／若しくは哺乳動物発現細胞をミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルの導入により超変異性にしうる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは、ハイブリドーマ細胞（すなわち骨髄腫細胞との免疫グロブリン産生細胞の融合後）に導入してよいか、若しくは融合前に骨髄腫細胞に導入してよい。本発明は、従って、ハイブリドーマ細胞の生成での使用のための超変異性骨髄腫細胞もまた提供する。該ドミナントネガティブなアレルはまた哺乳動物発現細胞にも導入しうる。
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルはポリヌクレオチドの形態にあり、それらはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ若しくは化学合成したポリヌクレオチドの形態であってよい。該ポリヌクレオチドは、（限定されるものでないがＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１ Ｄ若しくはＬＴＲ配列を挙げることができる）構成的に活性のプロモーターセグメントを含有する発現ベクター中に、またはドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子の発現が調節され得る、テトラサイクリン若しくはエクジソン／グルココルチコイドで誘導可能なベクターからのもののような誘導可能なプロモーター配列にクローン化し得る。該ポリヌクレオチドはトランスフェクションにより細胞に導入し得る。
トランスフェクションはポリヌクレオチドが細胞中に導入されるいずれかの過程である。トランスフェクションの過程はｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば培養物中の１個若しくはそれ以上の単離された細胞の懸濁液を使用して実施し得る。細胞は、モノクローナル抗体の産生のためのハイブリドーマを創製するのに使用されるいずれかの不死化細胞であってよいか、若しくは細胞はハイブリドーマそれ自身であってよい。ハイブリドーマはヘテロハイブリドーマ細胞（例えばヒト−マウス細胞の融合）であってもホモハイブリドーマ細胞（例えばヒト−ヒトハイブリドーマ細胞およびマウス−マウスハイブリドーマ細胞）であってもよい。
一般に、トランスフェクションは細胞の懸濁液若しくは単細胞を使用して実施することができるが、しかし、処理した細胞若しくは組織の十分な画分が、トランスフェクトした細胞を増殖かつ利用させるようにポリヌクレオチドを取り込む限りは、他の方法もまた適用し得る。ポリヌクレオチドのタンパク質産物は細胞中で一過性に若しくは安定に発現されうる。トランスフェクション技術は公知である。ポリヌクレオチドを導入するために利用可能な技術は、限定されるものでないが電気穿孔法、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの使用、および目的の細胞との融合のための脂質と一緒のポリヌクレオチドのパッケージングを挙げることができる。細胞がミスマッチ修復遺伝子で一旦トランスフェクトされれば、該細胞を培養物中で増殖かつ再生し得る。遺伝子が多くの細胞世代の間一貫したレベルで発現されるようにトランスフェクションが安定である場合には細胞株が生じる。
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは、限定されるものでないがＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＨＳ２、ＭＬＨ３若しくはＭＨＳ１、ならびにＮｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６およびＨｏｒｉｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１２５７−１２６４に記述されるところのＰＭＳＲ遺伝子のホモログなどを挙げることができるいずれの既知のミスマッチ修復遺伝子由来であってもよい。本明細書で使用されるところの「ドミナントネガティブなアレル」は、該アレルを発現する細胞に超変異性状態を賦与するアレルの能力を指す。こうした効果を生じるいかなるアレルも本発明で使用し得る。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルはヒト、動物、酵母、細菌若しくは他の生物体の細胞から得ることができる。本発明での使用に適するミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルは、構造の特徴と関連したある種の機能の特徴を有する。ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子の制限しない一例はＰＭＳ２の短縮変異体ＰＭＳ２−１３４である。この遺伝子はＰＭＳ２タンパク質をアミノ酸１３３の後で短縮する突然変異を含有する。ＰＭＳ２タンパク質のＣ末端の欠如は、とのＰＭＳ２の結合を妨害すると考えられている。不完全なミスマッチ修復活性についての細胞のスクリーニングがこうしたアレルを同定し得る。癌を伴う動物若しくはヒトからの細胞を不完全なミスマッチ修復についてスクリーニングし得る。大腸癌患者からの細胞がとりわけ有用でありうる。ミスマッチ修復タンパク質をコードするいずれかの細胞からのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡを野性型配列からの変異について分析し得る。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガ
ティブなアレルはまた、例えばｈＰＭＳ２−１３４アレル若しくは他のミスマッチ修復遺伝子のバリアントを製造することにより人工的にも創製し得る。多様な部位特異的突然変異誘発技術を使用し得る。超変異性細胞若しくは動物の生成における使用のためのこうしたアレル（天然であろうと人工的であろうと）の適合性は、それがドミナントネガティブなアレルであるかどうかを決定するために１種若しくはそれ以上の野性型アレルの存在下で該アレルにより引き起こされるミスマッチ修復活性を試験することにより評価し得る。
こうした遺伝子のドミナントネガティブなアレルは、細胞若しくはトランスジェニック動物に導入される場合に、ＤＮＡ修復の有効性を低下させることにより自発的突然変異の率を増大させかつそれにより該細胞若しくは動物を超変異性にする。これは、こうした細胞若しくは動物の自発的突然変異率がこうしたアレルを伴わない細胞若しくは動物に比較して上昇されていることを意味している。自発的突然変異率の上昇の程度は、正常の細胞若しくは動物のものの最低２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍若しくは１０００倍であり得る。超変異性ハイブリドーマ細胞は遺伝子（１種若しくは複数）中に新たな突然変異を蓄積させて該ハイブリドーマ内で新たな出力特質を生じさせることができる。該ハイブリドーマ細胞を所望の特徴についてスクリーニングし得、そしてこれらの特徴をもつ細胞株を拡張しうる。さらに、該ハイブリドーマ細胞は細胞中で該ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子を除外することにより、またはその発現のスイッチを切って変えられた遺伝子、ＲＮＡ若しくはポリペプチドよりなる安定な生物学的産物に至ることにより、ミスマッチ修復欠損のを「治癒」させうる。
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルはベクターの一部として導入しうる。ドミナントネガティブなミスマッチ修復タンパク質アレルをコードするポリヌクレオチドは、該ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルの発現を駆動するように細胞中で機能するプロモーターに作動可能に連結してよい。ベクターの他の要素は、複製起点、増殖阻害性化合物の存在下で細胞を増殖させる薬剤耐性遺伝子のような１種若しくはそれ以上の選択可能なマーカーを包含してよい。
ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞若しくはドナーの免疫グロブリン産生細胞を利用する本発明の態様において、本発明は、野性型ミスマッチ修復遺伝子を細胞に導入して欠損を補完しかつ遺伝的安定性を復帰させることによるハイブリドーマの遺伝的安定性を復帰させる段階をさらに含みうる。
本発明の別の局面は、宿主ゲノム中で高められた突然変異率を生じさせるためのＭＭＲを欠く細胞（内因性のミスマッチ修復遺伝子中の欠損、若しくはドミナントネガティブなＭＭＲ遺伝子の導入のいずれかによる）および化学的突然変異原の使用である。ＭＭＲ活性の欠如はＤＮＡ損傷剤の毒性効果に対し細胞をより抵抗性にすることが知られている。本発明は、ドミナントネガティブなＭＭＲ遺伝子アレルの発現を介して熟達したＭＭＲ細胞をミスマッチ修復欠損にすること、およびその後ＤＮＡ突然変異原の使用を用いてゲノムの超変異性を高めることを含んでなる。化学的突然変異原は化学的特性により分類可能である（例えばアルキル化剤、架橋剤、など）。以下の化学的突然変異原、すなわち、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、プロカルバジン塩酸塩、クロラムブシル、シクロホスファミド、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、ジエチル硫酸、アクリルアミド単量体、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）、エチレンオキサイド、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファンが、ここで列挙されない他者がそうであるように本発明に従って有用であり、そして本発明の方法の態様のいずれでも突然変異率をさらに高めるのに使用してよい。本発明の好ましい一局面において、１００遺伝子ごとに
１個の突然変異；１，０００遺伝子あたり１個の突然変異の範囲の突然変異率を賦与する突然変異誘発技術を使用する。こうした組合せ（ＭＭＲ欠損および化学的突然変異原）の使用は、各特定の剤により優先的に誘発される多彩なゲノム変化（限定されるものでないが遺伝子のコーディング領域、遺伝子のイントロン領域、または５’若しくは３’の近位および／若しくは遠位領域の情況内のＤＮＡセグメントの拡張若しくは欠失、点突然変異、変えられた反復配列を挙げることができる）の生成を見込むことができる。
突然変異は、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＭＡ、メッセンジャーＲＮＡ若しくは目的の遺伝子と関連するアミノ酸の配列を検査することにより細胞若しくは動物の遺伝子型の変化について分析することにより検出し得る。突然変異は遺伝子の表現型をスクリーニングすることによってもまた検出し得る。変えられた表現型は、変異体遺伝子によりコードされるタンパク質の電気泳動移動度、分光学的特性、または他の物理的若しくは構造の特徴の変化を同定することにより検出し得る。タンパク質の変えられた機能についてｉｎ ｓｉｔｕで、単離された形態で、若しくはモデル系でもまたスクリーニングし得る。限定されるものでないがタンパク質分泌、化学物質抵抗性、病原体抵抗性などを測定することを挙げることができる、目的の遺伝子の機能に関連する細胞若しくは動物のいかなる特性の変化についてもスクリーニングし得る。
本発明の方法のいくつかの態様において、ドミナントネガティブのおよび正常に機能するＭＭＲ遺伝子の発現を制御する誘導可能なベクターを使用する。この戦略は、化学的突然変異原の組合せを用いる若しくは用いない特質選択を介して、新たな出力特質、変えられた遺伝子、ＲＮＡ若しくはポリペプチドを表す宿主細胞若しくは生物体が一旦生成されてこの細胞若しくは生物体の遺伝的に安定なバージョンが確立されれば、ＤＮＡの安定性を復帰させる。ドミナントネガティブなＭＭＲ遺伝子アレルを異所性に発現することの結果としてのＭＭＲ欠損細胞の場合には、ＭＭＲの活性が細胞培養物若しくは生物体の環境から誘導物質分子を除去することにより低下若しくは完全に排除される。加えて、ドミナントネガティブなＭＭＲ遺伝子の発現は、生殖細胞若しくは体細胞中でのＤＮＡノックアウト技術の当業者に標準的である方法を使用してＭＭＲ遺伝子アレルをノックアウトすることにより抑制し得る（Ｗａｌｄｍａｎら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：５１８７−５１９０）。
アントラセンの側鎖のキラルな位置はとくに制限されず、そしていかなるキラル位置およびいかなるキラルの類似物であってもよい。アントラセンはまた、アントラセンの立体異性体を含んでなりかついかなる異性体の類似物も包含してよい。
宿主の例は、限定されるものでないが、ヒト、霊長類、哺乳動物、げっ歯類、植物、魚類、は虫類、両生類、昆虫、真菌、酵母若しくは原核生物起源の微生物からの細胞若しくは全生物体である。
本発明の特定の態様のより詳細な開示が特定の実施例で後に続くが、しかしながら、本発明はそれらに若しくはそれらにより制限されない。
［実施例］
破傷風トキシン（ＴＴ）に対するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの生成
Ａ．ＴＴ特異的Ｂリンパ球の生成およびアッセイ
ドナーからのリンパ球の単離。リンパ球は、製造元の説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを通す遠心分離により全血から単離した。単離されたリンパ球を、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ １６４０中で調製した０．２５ｍＭ Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕメチルエステル臭化水素酸塩（ＬＬＯＭｅ）とともに室温で１５分間インキュベートした。細胞をその後培地で３回洗浄した。
単離されたリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激。細胞は、１０％ＦＢＳならびに多様な濃度のＴＴおよびＩＬ−２を補充した培地中で、２．５ないし５×１０６細胞／ｍｌの間の密度で、８％ＣＯ２を供給したインキュベータ中３７℃でインキュベートした。４日培養後に細胞を培地で４回洗浄し、そして培養を追加の８日間継続した。
Ｂ細胞応答の測定。リンパ球培養上清を培養第１２日に収集し、そして抗ＴＴ抗体の存在についてＥＬＩＳＡで試験した。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのＴＴ若しくはＢＳＡをＥＩＡプレートに固定した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングした後に上清をウェルに添加した。ＴＴに結合した抗体をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくは抗ヒトＩｇＭで検出した。ＴＭＢを発色に使用した。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレートリーダーを使用して読み取った。ＴＴに結合したがしかしＢＳＡに結合しなかった抗体を有しかつシグナルがアッセイバックグラウンドの２倍であった上清サンプルを陽性とみなした。陽性細胞をプールし、そしてハイブリドーマ製造に使用した（図１）。
注目すべきことに、数例のドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）がＴＴ特異的抗体を培養物中に分泌するＢ細胞の画分を含有する。これは、米国の人口の約９０％がＴＴに対しワクチン接種されているという事実による。こうした血清はまた１０００より高い力価も有する（図２）。しかしながら、陽性事象の比率は、ＰＢＭＣをｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＴで免疫する場合に大きく増大する（図３）。ＰＢＭＣ応答の強度はまた、単独またはＩＬ−２若しくはＣＤ４０Ｌと組合せのＴＴの刺激でも高められる（図４）。類似の効果が他の抗原で観察された（データは示されない）。
ヒト抗体を分泌するハイブリドーマの生成。活性化されたリンパ球を調製するために、細胞をプールし、そして、融合の１日前に１０％ＦＢＳを補充した培地中０．５〜１×１０６細胞／ｍｌでＴフラスコ中で培養した。融合パートナーを調製するために、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞をＮｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（３）：１６３５−１６４１に記述されるとおりヒトＰＭＳ２−１３４発現ベクターでトランスフェクトした。細胞は１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ
１６４０（完全培地）中で培養し、そして培養物を対数期に保った。
次に、リンパ球を収集かつカウントした。等しい数の骨髄腫細胞を収集した。双方の型の細胞を合わせ、そしてＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄した。緩くした細胞ペレットにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を一滴ずつ添加し、そしてＰＥＧをその後２．５分の間に２５ｍｌのＲＰＭＩ培地でゆっくりと希釈した。ＰＥＧを希釈した後、融合した細胞を、ＨＡＴおよび２０％ＦＢＳを補充した完全培地に懸濁しそして９６ウェルプレートに接種した。
抗原特異的ハイブリドーマクローンのスクリーニングおよび特徴付け。ハイブリドーマ細胞がセミコンフルエンスまで増殖した場合に上清を収集しかつ抗原特異的反応性についてのＥＬＩＳＡにかけた。一例として、ＴＴで免疫したリンパ球由来のハイブリドーマを試験した。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのＴＴ若しくはＢＳＡをＥＩＡプレートに固定した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後に細胞培養上清をウェルに添加した。ＴＴに結合した抗体をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくは抗ヒトＩｇＭで検出した。ＴＭＢを発色に使用した。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレート
リーダーで読み取った。ＴＴに対する反応性を示したがしかしＢＳＡに対し示さなかった細胞クローンを陽性とみなした（図５）。陽性クローンを拡張しかつ制限希釈によりサブクローニングしてモノクローナル細胞を生成させた。
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ）（自己抗原）に対するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの生成
Ａ．ＥＧＦＲ特異的Ｂリンパ球の生成
抗原の調製。Ａ４３１細胞から精製したヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）はＳｉｇｍａから購入した。以前の研究は、この抗原に対する免疫応答が、もっともありそうには寛容により非常に弱かったことを見出した。免疫感作を高めるために、われわれはＥＧＦＲを破傷風トキシンＣに結合し（ＥＧＦＲ−ＴＴ）、そしていかなる免疫寛容も克服するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作の免疫原として該複合物を使用した。
ＥＧＦＲ−ＴＴ複合物の調製。１００μｇの精製したＥＧＦＲを１００μｌの滅菌ＭｉｌｌｉＱ等級の水で再構成した。１ｍｇの精製し凍結乾燥した組換え破傷風トキシンＣフラグメント（ＴＴ−Ｃ）を滅菌ＭｉｌｌｉＱ等級の水に溶解して２ｍｇ／ｍｌのＴＴ−Ｃ溶液を生じさせた。架橋は、０．５％の最終濃度のグルタールアルデヒドを使用し、ＴＴ−Ｃに対するＥＧＦＲの等モル比で５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０中で室温で３時間、次いで４℃で一夜実施した。５０ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ９．０中のホウ水素化ナトリウムの新鮮な１００ｍｇ／ｍｌの溶液の開放雰囲気下４℃で１時間の添加によりグルタールアルデヒドをクエンチした。架橋生成物は、３．５Ｋ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセットを使用して、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理的食塩水に対して４℃で一夜透析した。商業的抗ＥＧＦＲ（ｍＡｂ−１５）および抗ＴＴ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングにより反応をモニターした。この方法により、化合物の７０％以上が架橋され、そして出発原料より大きなＭＷの免疫反応種として出現する（データは示されない）。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激。ＬＬＯＭｅで前処理したＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳおよび刺激混合物を補充した培地中３×１０６細胞／ｍｌの密度でインキュベートした。刺激混合物は、２０ＩＵの組換えヒトＩＬ−２、０．５μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌとしてのマウス抗ヒトＣＤ４０抗体（ＩｇＧクラススイッチを高めるために使用した）を含む若しくは含まない５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＥＧＦＲ−ＴＴから構成された。４日培養後、細胞に、添加された刺激の非存在下で完全培地を３若しくは４日ごとに再供給した。培養上清を第１２〜１８日に収集しかつＥＧＦＲ特異的抗体について試験した。
ＥＧＦＲ特異的抗体応答の検出。刺激に対するＰＢＭＣ応答をＥＧＦＲ特異的ＥＬＩＳＡで検査した。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中０．５μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ、ＴＴ若しくはＢＳＡをＥＩＡプレートに固定した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０を含有するＰＢＳ中５％無脂粉乳でプレートをブロッキングした後、上清をウェルに添加した。固定した抗原に結合した上清からの抗体をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。ＴＭＢ基質キットを発色に使用した。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレートリーダーで読み取った。ＥＧＦＲに結合したがしかしＴＴおよびＢＳＡに結合しなかった抗体を含有する上清サンプルを陽性とみなした。ＥＧＦＲ−ＴＴに対し免疫した培養物で、対照に比較して確実な応答が観察された。ドナーの小さな画分について抗ＥＧＦＲ応答がＰＢＭＣで観察された一方、陽性クローンの比率は、ＴＴと複合体形成したＥＧＦＲでＰＢＭＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した場合に大きく増大した（図６）。陽性細胞をプールし、そしてハイブリドーマ製造に使用した。
ハイブリドーマの生成。活性化されたリンパ球を調製するため、細胞をプールし、そして、融合の１日前に１０％ＦＢＳを補充した培地中０．５〜１×１０６細胞／ｍｌでＴフラスコ中で培養した。融合パートナーを調製するため、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞をＮｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（３）：１６３５−１６４１に記述されるとおり、ヒトＰＭＳ２−１３４発現ベクターでトランスフェクトした。細胞は１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０（完全培地）中で培養し、そして培養物を対数期に保った。
抗原特異的ハイブリドーマクローンのスクリーニングおよび特徴付け。ハイブリドーマ細胞がセミコンフルエンスまで増殖した場合に上清を収集し、そして抗原特異的反応性についてのＥＬＩＳＡにかけた。一例として、ＥＧＦＲ免疫したリンパ球由来のハイブリドーマを試験した。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ、ＴＴ ＴＮＦＲ１若しくはＢＳＡをＥＩＡプレートに固定した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後に細胞培養上清をウェルに添加した。結合した抗体はペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくは抗ヒトＩｇＭで検出した。ＴＭＢを発色に使用した。正常ヒトＩｇＧ（ｎｈＩｇＧ）およびＩｇＭ（ｎｈＩｇＭ）を対照として使用した。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレートリーダーで読み取った。ＥＧＦＲに対する反応性を示したがしかしＢＳＡに対して示さなかった細胞クローンを陽性とみなした（図７）。
Ａ．全血からのＰＢＭＣの単離
２００ｍｌのＰＢＳ−／−と混合したおよそ２００ｍｌの全血を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを通して２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。血清を吸引し、リンパ球を含有する界面層を収集し、そしてＰＢＳ−／−で３倍に希釈しかつ２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清液を吸引し、そしてペレットを１０ｍｌのＰＢＳ−／−に再懸濁した。細胞懸濁液を２本の５０ｍｌコニカルチューブに分割し、そしてＰＢＳ−／−を各チューブに添加して容量をそれぞれ３５ｍｌに調節した。チューブを８００ｒｐｍで７分間遠心分離して血小板を除去した。上清液を吸引した後にペレットを１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁しかつ室温で５分間インキュベートした。溶解後に３５ｍｌのＰＢＳ−／−をチューブに添加し、そしてチューブを１０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。その後細胞を４５ｍｌのＲＰＭＩ培地で洗浄した。
Ｂ．樹状細胞の調製
細胞を１０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、そして２．５×１０６細胞／ｍｌの密度のため４０ｍｌのｃＲＰＭＩあたり１×１０８細胞で再懸濁した。細胞を３７℃／８％ＣＯ２で２時間インキュベートした。非付着細胞をさらなる処置（段階Ｃを参照）のため除去し、そして付着細胞をＰＢＳ−／−で慎重に２回すすいだ。付着細胞は４００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４および５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補充したｃＲＰＭＩ中で培養した。
Ｃ．非付着細胞のＬＬＯＭｅ処理および低温保存
非付着細胞培養物を１０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。上清液を吸引し、そしてペレットを２％ＦＢＳおよび新たに融解した８５μｇ／ｍｌのＬＬＯＭｅを補充した１０ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を室温で１５分間インキュベートした。細胞をｃＲＰＭＩで２回洗浄しかつ４５ｍｌのｃＲＰＭＩに再懸濁した。細胞を、２μｇ／ｍｌのＰＨＡを補充したｃＲＰＭＩ中５×１０６細胞／ｍｌの密度で縦型Ｔ２５フラスコに移し、そして３７℃／８％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。非付着細胞を収集し、１０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、そして細胞ペレットを５ｍｌの冷ｃＲＰＭＩ／５％ＤＭＳＯに再懸濁した。細胞を含有するチューブをペーパータオルで包み、そして必要とされるまで−８０℃で保存した。
Ｄ．腫瘍免疫感作
樹状細胞の単離のための処置の第６日に、腫瘍細胞を３７℃の２．５ｍｌの予め加温した培地中で融解した。樹状細胞のフラスコを１０ｍｌのＰＢＳ−／−で２回すすいだ。樹状細胞を、５ｍｌの細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号１３１５１−０１４）中で穏やかに揺すりながらインキュベートし、そして溶液を収集した（残存する細胞をフラスコから掻き取る）。フラスコを１０ｍｌのｃＲＰＭＩですすぎ、そして培地を収集した。細胞を１０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、そしてペレットを４×１０６細胞／ｍｌ ｃＲＰＭＩで再懸濁した。細胞を１×１０６細胞／ウェルの密度で培養プレートに分配した。腫瘍サンプルをおよそ１〜３ｍｍ３の微細な片に切り刻んだ。腫瘍懸濁液のアリコートをただ１個のウェルに移し、ウェルあたりの腫瘍の量を滴定した。０．２５ｍｌのｃＲＰＭＩのアリコートを対照ウェルに添加した。ウェル中の総容量は０．５ｍｌ／ウェルであった。樹状細胞および腫瘍細胞を３７℃／８％ＣＯ２で２４時間共培養した。
Ｅ．ＰＢＭＣのＤＣとの共培養
凍結ＰＢＭＣは、５０℃に予め加温した４０ｍｌのｃＲＰＭＩ／３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２／６００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４／０．７５μｇ／ｍｌのＣＤ−４０Ｌを凍結細胞に添加することにより融解した。融解した場合に細胞を３７℃で１〜２時間インキュベートした。細胞を１０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、そしてペレットを５ｍｌのｃＲＰＭＩ／６０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２／１２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４／１．５μｇ／ｍｌのＣＤ−４０Ｌの２×カクテルに再懸濁した。細胞懸濁液を、組織培養プレートのウェルに沿って０．５ｍｌ／ウェルの懸濁液で分割し、そして３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、６００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４および０．７５μｇ／ｍｌのＣＤ−４０Ｌの最終濃度のため０．５ｍｌの培地で希釈した。細胞には２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、４００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１０および０．５μｇ／ｍｌのＣＤ−４０Ｌを補充したｃＲＰＭＩを供給した。
Ｆ．融合
腫瘍免疫したＰＢＭＣをその後Ａ６骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを生成させた。簡潔には、リンパ球を７５％腫瘍および１００％腫瘍ウェルから収集し、１ｍｌのＲＰＭＩですすぎ、コニカルチューブに移しそしてｃＲＰＭＩで容量を５ｍｌに調節した。細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを通して遠心分離しかつ上清液を収集した。全部のチューブからの細胞を含有する界面を合わせそして細胞をｃＲＰＭＩですすいだ。細胞をその後７．５ｍｌのｃＲＰＭＩに再懸濁した。生存細胞をトリパンブルー排除により評価した。Ａ６細胞の生存率もまたトリパンブルー排除により評価した。Ａ６細胞および腫瘍免疫したリンパ球を個別に１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清液を吸引し、そして細胞をチューブあたり１０ｍｌのＤＰＢＳ−／−で洗浄した。各細胞株を２ｍｌの冷マンニトール融合培地（ＭＦＭ）（０．３Ｍマンニトール、０．１８ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ Ｈｅｐｅｓ）で３回洗浄し、そして細胞を合わせ、かつ、２００μｌ中に合計６×１０６細胞のため２００μｌ中３×１０６のＡ６細胞および３×１０６のＰＢＭＣの密度でＭＦＭに再懸濁した。ＢＴＸ ４５０マイクロスライドガラスを６５μＬの１００％ＥｔＯＨで滅菌し、そして６５μｌのＭＦＭで予め湿らせた。細胞懸濁液の４０μｌのアリコートをＢＴＸ ４５０−１マイクロスライドガラス上に均一に分配した。細胞を融合するために、ＥＣＭ ２００１の条件を、後に続くとおり（すなわち整列条件、２０Ｖ３０秒間；パルス条件、１５０Ｖ３０秒間（１×）；圧縮条件、２０Ｖ９秒間）設定した。融合後に、１ｍｌのフェノールレッドを含まないｃＲＰＭＩを含有する２４ウェルプレートの１個のウェルに細胞を移した。残存する細胞懸濁液について融合段階を反復し、融合の間にスライドを６５μＬのＭＦＭですすいだ。融合した細胞培養物を含有する培養プレートを３７℃／８％ＣＯ２で一夜インキュベートした。融合した細胞をクローン化し、そしてＩｇＧおよびＩｇＭ産生についてＥＬＩＳＡにより評価した。結果を図８に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作
商業的供給源からの精製したＧＭ−ＣＳＦを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する。
Ａ．ＧＭ−ＣＳＦ特異的Ｂリンパ球の精製およびアッセイ
末梢血からのリンパ球の単離。
リンパ球は、製造元の説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを通す遠心分離により全血から単離する。単離したリンパ球は、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で調製した０．２５ｍＭ Ｌｅｕ−Ｌｅｕメチルエステル臭化水素酸塩（ＬＬＯＭｅ）とともに室温で１５分間インキュベートする。細胞をその後培地で３回洗浄する。
単離したリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激。
細胞を、１０％ＦＢＳならびに多様な濃度のＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２を補充した培地中２．５ないし５×１０６細胞／ｍｌの間の密度で、８％ＣＯ２を供給するインキュベータ中３７℃でインキュベートする。４日培養後に細胞を培地で４回洗浄し、そして培養を追加の８日間継続した。
Ｂ細胞応答の測定。
リンパ球培養上清を培養第１２日に収集し、そして抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の存在についてＥＬＩＳＡで試験する。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ若しくはＢＳＡをＥＩＡプレートに固定する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした後に、上清をウェルに添加する。ＧＭ−ＣＳＦに結合した抗体をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくは抗ヒトＩｇＭで検出する。ＴＭＢを発色に使用する。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレートリーダーを使用して読み取る。ＧＭ−ＣＳＦに結合するがしかしＢＳＡにしない抗体を有しかつシグナルがアッセイバックグラウンドの２倍であった上清サンプルを陽性とみなす。陽性細胞をプールし、そしてハイブリドーマ製造に使用する。
ヒト抗体を分泌するハイブリドーマの生成。
活性化されたリンパ球を調製するために細胞をプールし、そして、融合の１日前に１０％ＦＢＳを補充した培地中０．５〜１×１０６細胞／ｍｌでＴフラスコ中で培養する。融合パートナーを調製するために、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞をＮｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（３）：１６３５−１６４１に記述されるとおりヒトＰＭＳ２−１３４発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０（完全培地）中で培養し、そして培養物を対数期に保つ。
次にリンパ球を収集しかつカウントする。等しい数の骨髄腫細胞を収集する。双方の型の細胞を合わせ、そしてＲＰＭＩ １６４０培地で３回洗浄する。緩くした細胞ペレットにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を一滴ずつ添加し、そしてＰＥＧをその後２．５分の間に２５ｍｌのＲＰＭＩ培地でゆっくりと希釈する。ＰＥＧを希釈した後に、融合した細胞をＨＡＴおよび２０％ＦＢＳを補充した完全培地に懸濁し、そして９６ウェルプレートに接種する。
抗原特異的ハイブリドーマクローンのスクリーニングおよび特徴付け。
ハイブリドーマ細胞がセミコンフルエンスまで増殖した場合に、上清を収集しかつ抗原特異的反応性についてのＥＬＩＳＡにかける。一例として、ＴＴ免疫したリンパ球由来のハイブリドーマを試験する。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍ
ｌのＴＴ若しくはＢＳＡをＥＩＡプレートに固定する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後に、細胞培養上清をウェルに添加する。ＧＭ−ＣＳＦに結合した抗体は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくは抗ヒトＩｇＭで検出する。ＴＭＢを発色に使用する。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレートリーダーで読み取る。ＧＭ−ＣＳＦに対する反応性を示したがしかしＢＳＡに対して示さなかった細胞クローンを陽性とみなす。陽性クローンを拡張し、そして限界希釈によりサブクローニングしてモノクローナル細胞を生成させる。
ＧＭ−ＣＳＦ−ＫＬＨに対するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの生成Ａ．ＧＭ−ＣＳＦ特異的Ｂリンパ球の生成
抗原の調製。
ヒトＧＭ−ＣＳＦは製造供給元から購入した。免疫感作を高めるため、ＧＭ−ＣＳＦをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し（ＧＭ−ＣＳＦ−ＫＬＨ）、そして、いかなる免疫寛容も克服するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作の免疫原として該複合物を使用した。
ＧＭ−ＣＳＦ−ＫＬＨ複合物の調製。
精製したＧＭ−ＣＳＦを滅菌ＭｉｌｌｉＱ等級の水で再構成して１ｍｇ／ｍｌの溶液を生じさせた。精製し凍結乾燥した組換えＫＬＨを滅菌ＭｉｌｌｉＱ等級の水に溶解して１ｍｇ／ｍｌのＫＬＨ溶液を生じさせた。ＰＢＳ中のグルタールアルデヒドの０．２％溶液を調製した。架橋は、アルミホイルで覆った微小遠心管中で２５μｌの１ｍｇ／ｍｌのＫＬＨ、２５μｌの１ｍｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび５０μｌの０．２％グルタールアルデヒドを室温で振とうしながら１時間合わせることにより実施した。架橋した後に２５μｌの１Ｍグリシンをチューブに添加し、そして溶液を振とうしながら室温で追加の１時間インキュベートした。架橋生成物を、３００ｍｌのＰＢＳの３回の変更に対し透析した。反応は、商業的な抗ＧＭ−ＣＳＦおよび抗ＫＬＨモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによりモニターした。この方法により、成分の８０％以上が架橋され、そして出発原料より大きいＭＷの免疫反応種として出現した（データは示されない）。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激。
ＬＬＯＭｅで前処理したＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳおよび刺激混合物を補充した培地中３×１０６細胞／ｍｌの密度でインキュベートした。刺激混合物は、２０ＩＵの組換えヒトＩＬ−２、０．５μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌとしてのマウス抗ヒトＣＤ４０抗体（ＩｇＧクラススイッチングを高めるため使用した）を含む若しくは含まない５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＧＭ−ＣＳＦ−ＫＬＨから構成された。培養４日後、細胞に、添加された刺激の非存在下で完全培地を３若しくは４日ごとに再供給した。培養上清を第１２〜１８日に収集し、そしてＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体について試験した。
ＧＭ−ＣＳＦ特異的抗体応答の検出。
刺激に対するＰＢＭＣの応答をＧＭ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡで検査した。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中０．５μｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、ＫＬＨ若しくはニワトリ卵アルブミン（ＣＡＢ）をＥＩＡプレートに固定した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する１％ＢＳＡでプレートをブロッキングした後に上清をウェルに添加した。固定した抗原に結合した上清からの抗体をペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）で検出した。ＴＭＢ基質キットを発色に使用した。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレートリーダーで読み取った。ＧＭ−ＣＳＦに結合したがしかしＫＬＨおよびＣＡＢに結合しなかった抗体を含有する上清サンプルを陽性とみなした。ＧＭ−ＣＳＦ−ＫＬＨに対し免疫した培養物中で観察された、対照に比較して
確実な応答が存在した。ドナーの小さな画分について抗ＧＭ−ＣＳＦ応答がＰＢＭＣで観察された一方、陽性クローンの比率は、ＫＬＨと複合体形成したＧＭ−ＣＳＦでＰＢＭＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した場合に大きく増大した。陽性細胞をプールし、そしてハイブリドーマ製造に使用した。
ハイブリドーマの生成。
活性化されたリンパ球を調製するために、細胞をプールし、そして、融合の１日前に１０％ＦＢＳを補充した培地中０．５〜１×１０６細胞／ｍｌでＴフラスコ中で培養した。融合パートナーを調製するために、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞をＮｉｃｏｌａｉｄｅｓら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（３）：１６３５−１６４１に記述されるとおりヒトＰＭＳ２−１３４発現ベクターでトランスフェクトした。細胞を、１０％ＦＢＳおよび２％グルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０（完全培地）中で培養し、そして培養物を対数期に保った。
抗原特異的ハイブリドーマクローンのスクリーニングおよび特徴付け。
ハイブリドーマ細胞がセミコンフルエンスまで増殖した場合に上清を収集しかつ抗原特異的反応性についてのＥＬＩＳＡにかけた。一例として、ＧＭ−ＣＳＦで免疫したリンパ球由来のハイブリドーマを試験した。簡潔には、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、ＫＬＨ若しくはＣＡＢをＥＩＡプレートに固定した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後に細胞培養上清をウェルに添加した。結合した抗体はペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくは抗ヒトＩｇＭで検出した。ＴＭＢを発色に使用した。正常ヒトＩｇＧ（ｎｈＩｇＧ）およびＩｇＭ（ｎｈＩｇＭ）を対照として使用した。プレートは４５０ｎｍのフィルターを伴うマイクロプレートリーダーで読み取る。ＧＭ−ＣＳＦに対する反応性を示したがしかしＣＡＢに対し示さなかった細胞クローンを陽性とみなした。結果を図９に示す。
増殖の阻害アッセイ
ＴＦ−１細胞を１０％ＦＢＳおよび０．５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ中０．２×１０６／ｍｌで接種した。ＴＦ−１細胞を、ｒｈＧＭ−ＣＳＦを含まない、０．５％ＢＳＡを含有する培地中で血清を２４時間枯渇させた。細胞はその後、４μｇ／ｍｌの多様な抗体を伴い若しくは伴わずに、０．２７５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの存在下で３日間培養した。細胞増殖をＡＴＰＬｉｔｅアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。このアッセイでは、ＡＴＰが生存細胞の溶解により放出され、そしてルシフェリンをオキシルシフェリンに転化する酵素ルシフェラーゼにより利用された。該反応の結果として光が発射され（発光）、そして発射の強度はＡＴＰ含量および従って細胞数に究極的に比例した。照度計で反応を読み取ることにより１秒あたりカウント（ＣＰＳ）を得、そして式：１００−（ＡｂなしＣＰＳ：ＡｂありＣＰＳ）×１００％に従って阻害パーセントを計算した。結果を図１０に示す。
前述の実施例は本発明の単なる具体的説明であり、そして本発明の範囲を制限するといかなる方法でも解釈されるべきでない。本発明の範囲は付属として付けられる請求の範囲により定義される。
抗原刺激に対するＰＢＭＣの免疫応答を示す。ＰＢＭＣをＴＴの存在若しくは非存在下で４日間培養し、その後培地で洗浄しかつＴＴの存在若しくは非存在下で追加の８日間培養した。培養上清を収集しかつＴＴに対し反応性の抗体の存在について試験した。固相に予め被覆したＴＴに結合した抗体をＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくはＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭで検出した。 ドナー抗ＴＴ ＩｇＧの検出によるＴＴに対するドナー血清の反応性を示す。 ドナー抗ＴＴ ＩｇＭの検出によるＴＴに対するドナー血清の反応性を示す。 ＴＴまたはＩＬ−２若しくはＣＤ４０Ｌと組合せのＴＴでのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作に際してのＰＢＭＣの抗ＴＴ応答の頻度を示す。 ＴＴまたはＩＬ−２若しくはＣＤ４０Ｌと組合せのＴＴでのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫感作に際してのＰＢＭＣの応答の強度を示す。 抗ＴＴ抗体を発現するハイブリドーマの応答を示す。 ＥＧＦＲに対する未刺激のＰＢＭＣの反応性を示す。 ＥＧＦＲ−ＴＴでの免疫感作後のＥＧＦＲに対するＰＢＭＣの反応性を示す。 ＥＧＦＲ−ＴＴに対する未刺激のＰＢＭＣの反応性を示す。 ＥＧＦＲ−ＴＴでの免疫感作後のＥＧＦＲ−ＴＴに対するＰＢＭＣの反応性を示す。 ヒトＧＥＦＲに対する抗体を発現するハイブリドーマの応答を示す。固相に予め被覆したＥＧＦＲ若しくはＢＳＡ（対照）に結合した抗体をＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ若しくはＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭで検出した。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞で免疫した細胞のＩｇＧおよびＩｇＭ応答を示す。 ＧＭ−ＣＳＦ、ニワトリ卵アルブミン（ＣＡＢ）若しくはキーホールリンペットヘモシアニンに対するクローンの反応性を示す。 ＴＦ−１細胞の増殖に対する抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体の阻害効果を示す。ＧＭ−ＣＳＦ特異的なブロッキング抗体；ＧＭ−ＣＳＦ特異的な非ブロッキング抗体；および非特異的抗体の効果を示す。
【配列表】
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Claims (138)

  1. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）突然変異誘発を見込んで前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも前記抗原に対しより大きな親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；
    それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法。
  2. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、およびＰＭＳＲ遺伝子のホモログよりなる群から選択される遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルがＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  4. 前記親ハイブリドーマより高力価の抗体もまた産生する超変異ハイブリドーマについてのスクリーニングをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルの不活性化、それによる前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルの不活性化、それによる前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化することをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
  7. 前記高親和性抗体が最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項４に記載の方法。
  9. 前記ドミナントネガティブなアレルをノックアウトすること、若しくは前記ドミナントネガティブなアレルの誘導物質を除去することによりミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルを不活性化する段階をさらに含んでなる、請求項１若しくは４に記載の方法。
  10. 前記親ハイブリドーマ細胞を化学的突然変異原とともにインキュベートすることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  11. ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子が、前記骨髄腫の前記免疫グロブリン産
    生細胞との融合後に前記ハイブリドーマ細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記骨髄腫細胞が、前記ハイブリドーマ細胞中でもまた発現されているドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子を発現する、請求項１に記載の方法。
  13. 請求項１、４、５、６、７若しくは１０に記載の方法により製造された高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
  14. 請求項１３に記載のハイブリドーマ細胞により産生された抗体。
  15. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）突然変異誘発を見込んで前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価で産生された抗体について、前記超変異ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを実施すること；および
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；
    それにより高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法。
  16. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１のドミナントネガティブなアレル、およびＰＭＳＲのホモログよりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルがＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルの不活性化、それによる前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化することをさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項１５に記載の方法。
  20. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記ドミナントネガティブなアレルをノックアウトすること若しくは前記ドミナントネガティブなアレルの誘導物質を除去することにより不活性化される、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記親ハイブリドーマ細胞を化学的突然変異原とともにインキュベートすることをさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
  22. ドミナントネガティブなミスマッチ修復遺伝子が、前記免疫グロブリン産生細胞との前記骨髄腫の融合後に前記ハイブリドーマ細胞に導入される、請求項１５に記載の方法。
  23. 前記骨髄腫細胞が、前記ハイブリドーマ細胞中でもまた発現されているドミナントネガ
    ティブなミスマッチ修復遺伝子を発現する、請求項１５に記載の方法。
  24. 請求項１５、１８若しくは２１の方法により製造された高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
  25. 請求項２４に記載のハイブリドーマ細胞により産生された抗体。
  26. ドミナントネガティブなミスマッチ修復タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換え骨髄腫細胞。
  27. 前記ミスマッチ修復タンパク質が、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、およびＰＭＳＲ遺伝子のホモログよりなる群から選択される、請求項２６に記載の組換え骨髄腫細胞。
  28. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルがＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項２６に記載の組換え骨髄腫細胞。
  29. 前記骨髄腫細胞が免疫グロブリン遺伝子を発現しない、請求項２６に記載の組換え骨髄腫細胞。
  30. 前記骨髄腫細胞がＨＡＴ感受性である、請求項２９に記載の組換え骨髄腫細胞。
  31. 前記骨髄腫細胞がＥＢＶ陰性である、請求項３０に記載の組換え骨髄腫細胞。
  32. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｄ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する哺乳動物発現細胞にクローン化すること；
    （ｅ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対してより高い親和性をもつ抗体を分泌する哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施して；それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫したヒト免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法。
  33. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記免疫グロブリン遺伝子の導入前に前記哺乳動物発現細胞に導入される、請求項３２に記載の方法。
  34. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記免疫グロブリン遺伝子の導入後に前記哺乳動物発現細胞に導入される、請求項３２に記載の方法。
  35. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記免疫グロブリン遺伝子と同時に前記哺乳動物発現細胞に導入される、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記ミスマッチ修復遺伝子が、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳ
    Ｒ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、およびＰＭＳＲ遺伝子のホモログよりなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  37. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、ＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記高親和性抗体が、最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項３２に記載の方法。
  39. 請求項３２に記載の方法により製造された哺乳動物発現細胞。
  40. 請求項３９に記載の哺乳動物発現細胞により産生された抗体。
  41. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現するハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）突然変異誘発を見込んで前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生される抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも前記抗原に対してより大きい親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；
    （ｆ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化して；
    それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法。
  42. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記骨髄腫細胞および前記ハイブリドーマ細胞中で発現される、請求項４１に記載の方法。
  43. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記融合後に前記ハイブリドーマ細胞に導入される、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記ミスマッチ修復遺伝子が、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、およびＰＭＳＲ遺伝子のホモログよりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  45. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルがＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記高親和性抗体が、最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項４１に記載の方法。
  47. 請求項４１に記載の方法により製造された哺乳動物発現細胞。
  48. 請求項４７に記載の哺乳動物発現細胞により産生された抗体。
  49. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｄ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブなアレルを発現する親哺乳動物発現細胞にクローン化すること；
    （ｅ）突然変異誘発を見込んで前記親哺乳動物発現細胞をインキュベートしてそれにより超変異哺乳動物発現細胞を形成すること；
    （ｆ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対しより高親和性をもつ抗体を分泌する超変異性哺乳動物発現細胞のスクリーニングを実施すること；および（ｇ）親哺乳動物発現細胞よりも高力価の抗体を分泌する超変異性哺乳動物発現細胞のスクリーニングを実施して；
    それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法。
  50. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記免疫グロブリン遺伝子の導入前に前記哺乳動物発現細胞に導入される、請求項４９に記載の方法。
  51. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記免疫グロブリン遺伝子の導入後に前記哺乳動物発現細胞に導入される、請求項４９に記載の方法。
  52. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルが、前記免疫グロブリン遺伝子と同時に前記哺乳動物発現細胞に導入される、請求項４９に記載の方法。
  53. 前記ミスマッチ修復遺伝子が、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、およびＰＭＳＲ遺伝子のホモログよりなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  54. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルがＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項４９に記載の方法。
  55. 前記高親和性抗体が、最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項４９に記載の方法。
  56. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項４９に記載の方法。
  57. 請求項４９に記載の方法により製造された哺乳動物発現細胞。
  58. 請求項５７に記載の哺乳動物発現細胞により産生された抗体。
  59. ドミナントネガティブなミスマッチ修復タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる組換えの超変異性哺乳動物発現細胞。
  60. 前記ミスマッチ修復タンパク質が、ＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳＲ３、ＰＭＳＲ２、ＰＭＳＲ６、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、ＭＳＨ３、ＭＳＨ２、ＭＬＨ３若しくはＭＳＨ１、およ
    びＰＭＳＲ遺伝子のホモログよりなる群から選択される、請求項５９に記載の組換えの超変異性哺乳動物発現細胞。
  61. ミスマッチ修復遺伝子の前記ドミナントネガティブなアレルがＰＭＳ２遺伝子のドミナントネガティブなアレルを含んでなる、請求項５９に記載の組換えの超変異性哺乳動物発現細胞。
  62. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；および
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも前記抗原に対するより大きな親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；
    それにより高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法。
  63. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤が、アントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記阻害剤が、式：
    Figure 2006526983
     （式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または場合によっては１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を含有する炭水化物であり；
    ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘ
    テロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびに
    ここで、前記アミノ基は場合によっては１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で置換されている）
    を有するアントラセンである、請求項６２に記載の方法。
  65. Ｒ１−Ｒ１０が独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記親ハイブリドーマより高力価の抗体もまた産生する超変異ハイブリドーマについてのスクリーニングをさらに含んでなる、請求項６２に記載の方法。
  67. 超変異後に前記増殖培地から前記化学的阻害剤を除去してそれにより前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化する段階をさらに含んでなる、請求項６２に記載の方法。
  68. 超変異後に前記増殖培地から前記化学的阻害剤を除去してそれにより前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化する段階をさらに含んでなる、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記高親和性抗体が最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項６２に記載の方法。
  70. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項６６に記載の方法。
  71. 請求項６２、６６、６７若しくは６８に記載の方法により製造されたハイブリドーマ細胞。
  72. 請求項７１に記載のハイブリドーマ細胞により産生された抗体。
  73. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価で産生された抗原特異的抗体についての前記超変異ハイブリドーマ細胞のスクリーニングを実施すること；および
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価よりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；
    それにより高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法。
  74. 前記化学的阻害剤が、アントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記阻害剤が、式：
    Figure 2006526983
     （式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または場合によっては１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を含有する炭水化物であり；
    ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびに
    ここで、前記アミノ基は場合によっては１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で置換されている）
    を有するアントラセンである、請求項７４に記載の方法。
  76. Ｒ１−Ｒ１０が独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである、請求項７５に記載の方法。
  77. 超変異後に前記増殖培地から前記化学的阻害剤を除去してそれにより前記超変異ハイブリドーマのゲノムを安定化する段階をさらに含んでなる、請求項７３に記載の方法。
  78. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項７３に記載の方法。
  79. 請求項７３若しくは７７に記載の方法により製造されたハイブリドーマ細胞。
  80. 請求項７９に記載のハイブリドーマにより産生された抗体。
  81. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体の抗原への結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｄ）前記ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化すること；
    （ｅ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で前記哺乳動物発現細胞をインキュベートすること；
    （ｆ）前記ハイブリドーマ細胞から産生された抗体に比較して抗原に対してより高親和性をもつ抗体を分泌する哺乳動物発現細胞についてのスクリーニングを実施して；それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法。
  82. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤が、アントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記阻害剤が、式：
    Figure 2006526983
     （式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または場合によっては１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を含有する炭水化物であり；
    ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびに
    ここで、前記アミノ基は場合によっては１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で置換されている）
    を有するアントラセンである、請求項８２に記載の方法。
  84. Ｒ１−Ｒ１０が独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記超変異ハイブリドーマ細胞からの前記抗体の収集の前の前記親ハイブリドーマより高力価の抗体もまた産生する超変異ハイブリドーマについてのスクリーニングをさらに含んでなる、請求項８１に記載の方法。
  86. 前記高親和性抗体が最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項８１に記載の方法。
  87. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項８１に記載の方法。
  88. 前記化学的阻害剤を除去してそれにより前記超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでなる、請求項８１に記載の方法。
  89. 請求項８１、８５若しくは８８に記載の方法により製造された哺乳動物発現細胞。
  90. 請求項８９に記載の哺乳動物発現細胞により産生された抗体。
  91. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で前記ハイブリドーマ細胞をインキュベートして超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原の結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも前記抗原に対するより大きい親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；
    （ｆ）前記超変異ハイブリドーマ細胞からの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化して、それにより親哺乳動物発現細胞を形成して；
    それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの選択された抗原に対する高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法。
  92. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤が、アントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記阻害剤が、式：
    Figure 2006526983
     （式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキ
    ル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または場合によっては１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を含有する炭水化物であり；
    ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびに
    ここで、前記アミノ基は場合によっては１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で置換されている）
    を有するアントラセンである、請求項９１に記載の方法。
  94. Ｒ１−Ｒ１０が独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである、請求項９２に記載の方法。
  95. 前記高親和性抗体が最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項９１に記載の方法。
  96. ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で前記哺乳動物発現細胞をインキュベートして、それにより超変異哺乳動物発現細胞を形成する段階；および
    前記親哺乳動物発現細胞よりも高力価の抗体を産生する超変異哺乳動物発現細胞についてスクリーニングする段階
    をさらに含んでなる、請求項９１に記載の方法。
  97. 前記化学的阻害剤を除去してそれにより前記超変異ハイブリドーマ細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでなる、請求項９１に記載の方法。
  98. 前記化学的阻害剤を除去してそれにより前記超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化することをさらに含んでなる、請求項９６に記載の方法。
  99. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項９６に記載の方法。
  100. 請求項９１、９５、９６若しくは９７に記載の方法により製造された哺乳動物発現細胞。
  101. 請求項１００に記載の哺乳動物発現細胞により産生された抗体。
  102. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復が天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を、免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）突然変異誘発を見込んで前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートして、それにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；
    （ｆ）前記親ハイブリドーマ細胞に比較して増大された力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞についての第二のスクリーニングを実施すること；
    （ｇ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生されるよりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；
    それにより高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法。
  103. ミスマッチ修復の野性型遺伝子を前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞に導入してミスマッチ修復欠損を補完してそれにより前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞のゲノムを再安定化する段階をさらに含んでなる、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記親ハイブリドーマ細胞を化学的突然変異原とともにインキュベートすることをさらに含んでなる、請求項１０２に記載の方法。
  105. 請求項１０２、１０３若しくは１０４に記載の方法により製造されたハイブリドーマ細胞。
  106. 請求項１０５に記載のハイブリドーマ細胞により産生された抗体。
  107. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）前記免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合して、それによりミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）突然変異誘発を見込んで前記親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）前記超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｅ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；
    （ｆ）親ハイブリドーマ細胞に比較して増大された力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞についての第二のスクリーニングを実施すること；
    （ｇ）前記親ハイブリドーマ細胞により産生されるよりも高力価の抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択して；
    それにより高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞の製造方法。
  108. ミスマッチ修復の野性型遺伝子を前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞に導入してミスマッチ修復欠損を補完してそれにより前記選択された超変異ハイブリドーマ細胞のゲノムを再安定化することをさらに含んでなる、請求項１０７に記載の方法。
  109. 前記親ハイブリドーマ細胞を化学的突然変異原とともにインキュベートすることをさら
    に含んでなる、請求項１０７に記載の方法。
  110. 前記高親和性抗体が最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項１０７に記載の方法。
  111. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項１０７に記載の方法。
  112. 請求項１０７、１０８若しくは１０９に記載の方法により製造されたハイブリドーマ細胞。
  113. 請求項１１２に記載のハイブリドーマ細胞により産生された抗体。
  114. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなる、ミスマッチ修復が天然に欠損しているドナー由来であるドナー細胞を、免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；（ｂ）免疫グロブリン産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、ミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）突然変異誘発を見込んで親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｅ）親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；
    （ｆ）前記超変異ハイブリドーマからの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化して；
    それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価で高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法。
  115. 前記高親和性抗体が、最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項１１４に記載の方法。
  117. ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で哺乳動物発現細胞をインキュベートして、それにより超変異哺乳動物発現細胞を形成する段階；および
    親哺乳動物発現細胞の産生量よりも高い抗体産生量について前記超変異哺乳動物発現細胞をスクリーニングする段階
    をさらに含んでなる、請求項１１４に記載の方法。
  118. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤が、アントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記阻害剤が、式：
    Figure 2006526983
     （式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または場合によっては１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を含有する炭水化物であり；
    ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびに
    ここで、前記アミノ基は場合によっては１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で置換されている）
    を有するアントラセンである、請求項１１７に記載の方法。
  120. Ｒ１−Ｒ１０が独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである、請求項１１９に記載の方法。
  121. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤を超可変哺乳動物発現細胞から除去してそれにより前記超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化する段階をさらに含んでなる、請求項１１７に記載の方法。
  122. 請求項１１４、１１７、１１８若しくは１２１に記載の方法により製造された哺乳動物発現細胞。
  123. 請求項１２２に記載の哺乳動物発現細胞により産生された抗体。
  124. （ａ）免疫グロブリン産生細胞を含んでなるドナー細胞を免疫原性の抗原とｉｎ ｖｉｔｒｏで組み合わせること；
    （ｂ）免疫グロブリン産生細胞を、ミスマッチ修復が天然に欠損している骨髄腫細胞と融合して、それによりミスマッチ修復が欠損している親ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｃ）突然変異誘発を見込んで親ハイブリドーマ細胞をインキュベートしてそれにより超変異ハイブリドーマ細胞を形成すること；
    （ｄ）超変異ハイブリドーマ細胞から産生された抗体について、抗原への抗体の結合についてのスクリーニングを実施すること；
    （ｅ）親ハイブリドーマ細胞により産生された抗体よりも抗原に対する高められた親和性をもつ抗体を産生する超変異ハイブリドーマ細胞を選択すること；および
    （ｆ）前記超変異ハイブリドーマ細胞からの免疫グロブリン遺伝子を哺乳動物発現細胞にクローン化して；
    それによりｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞から高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞を製造すること
    を含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫した免疫グロブリン産生細胞からの高力価の高親和性抗体を産生する哺乳動物発現細胞の製造方法。
  125. 前記高親和性抗体が、最低約１×１０７Ｍ−１ないし約１×１０１４Ｍ−１の親和性を有する、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記抗体の前記より高力価が、前記親ハイブリドーマ細胞により生じられる力価より最低約１．５〜８倍より大きい、請求項１２４に記載の方法。
  127. ミスマッチ修復の最低１種の化学的阻害剤の存在下で哺乳動物発現細胞をインキュベートして、それにより超変異哺乳動物発現細胞を形成する段階；および
    親哺乳動物発現細胞の産生量よりも高い抗体産生量について前記超変異哺乳動物発現細胞をスクリーニングする段階
    をさらに含んでなる、請求項１２４に記載の方法。
  128. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤が、アントラセン、ＡＴＰアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉分子、ポリメラーゼ阻害剤、およびミスマッチ修復タンパク質をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記阻害剤が、式：
    Figure 2006526983
     （式中、Ｒ１−Ｒ１０は独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アラルキルオキシ、アリールアルキル、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、アリールスルホニル、アルキルスルホニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、グアニジノ、カルボキシ、アルコール、アミノ酸、スルホネート、アルキルスルホネート、ＣＮ、ＮＯ２、アルデヒド基、エステル、エーテル、クラウンエーテル、ケトン、有機イオウ化合物、有機金属基、カルボン酸、有機ケイ素、または場合によっては１個若しくはそれ以上のアルキル化ヒドロキシル基を含有する炭水化物であり；
    ここで、前記ヘテロアルキル、ヘテロアリールおよび置換ヘテロアリールは、酸素、イオウ、金属原子、リン、ケイ素若しくは窒素である最低１個のヘテロ原子を含有し；また、ここで、前記置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリールおよび置換ヘテロアリールの前記置換基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、低級アルキル、アリール、ヘ
    テロアリール、アラルキル、アラルコキシ、グアニジノ、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシおよびアミノであり；ならびに
    ここで、前記アミノ基は場合によっては１個のアシル基または１ないし３個のアリール若しくは低級アルキル基で置換されている）
    を有するアントラセンである、請求項１２７に記載の方法。
  130. Ｒ１−Ｒ１０が独立に水素、ヒドロキシル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、フェニル、トルイル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピル若しくはヒドロキシブチルである、請求項１２９に記載の方法。
  131. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤を超変異哺乳動物発現細胞から除去してそれにより前記超変異哺乳動物発現細胞のゲノムを安定化する段階をさらに含んでなる、請求項１２７に記載の方法。
  132. 請求項１２４、１２７若しくは１３１に記載の方法により製造された哺乳動物発現細胞。
  133. 請求項１３２に記載の哺乳動物発現細胞により産生された抗体。
  134. （ａ）ドナー細胞を動物から単離すること；
    （ｂ）前記細胞をＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル臭化水素酸塩で処理すること；
    （ｃ）前記ドナー細胞を、免疫原性の抗原とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで５〜１５％の血清および増殖を促進するサイトカインを補充した培地中、２５〜３７℃、５〜１０％ＣＯ２で４日間インキュベートすること；
    （ｄ）前記細胞を培地で洗浄すること；ならびに
    （ｅ）前記細胞を、５〜１５％の血清を補充した培地中で追加の８日培養して；
    それにより抗原特異的免疫グロブリン産生細胞の産生を刺激すること
    を含んでなる、抗原特異的免疫グロブリン産生細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ製造方法。
  135. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤が、配列番号２；配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１０；配列番号１２；配列番号１４；配列番号１６；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２６；配列番号２８；配列番号３０；配列番号３２；配列番号３４；配列番号３６；配列番号３８；配列番号４０；配列番号４２；配列番号４４；配列番号４６；配列番号４８；および配列番号５０よりなる群から選択されるタンパク質をコードする配列の最低１５の連続するヌクレオチドを含んでなるアンチセンス分子である、請求項６２、７３、８１、９１、１１７若しくは１２７に記載の方法。
  136. ミスマッチ修復の前記化学的阻害剤が、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号９；配列番号１１；配列番号１３；配列番号１５；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号２５；配列番号２７；配列番号２９；配列番号３１；配列番号３３；配列番号３５；配列番号３７；配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；および配列番号４９よりなる群から選択される配列の最低１５の連続するヌクレオチドを含んでなるアンチセンス分子である、請求項６２、７３、８１、９１、１１７若しくは１２７に記載の方法。
  137. 請求項９に記載の方法により製造された高親和性抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
  138. 請求項１３７に記載のハイブリドーマ細胞により産生された抗体。
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