JP2006526779A - 増強ナノ分光学的走査のための方法および装置 - Google Patents

Abstract

サンプル（８２）中の化学基の同一性を調べるための装置および方法が開示される。この装置（３５）は、サンプル（８２）が支持されているプラズモン共鳴表面を有する基板（８０）、光ビーム源、ならびにチップ領域およびナノレンズ（６２）を有するレンズアセンブリを有し、このナノレンズ（６２）は、そのチップ領域上の１つ以上のプラズモン共鳴粒子（ＰＲＰ）からなる。このＰＲＰは、ナノレンズ（６２）と基板（８０）との間のギャップが３０ｎｍ以下の場合に、ナノレンズ（６２）と基板表面（８０）上の直面する検出領域との間の空間に近距離場電磁ギャップモードを生ずるように配置される。この装置における焦点合わせ機構が作動し、３０ｎｍ未満のギャップで基板表面（８０）に向けておよび離してレンズアセンブリを動かし、検出領域におけるサンプル（８２）により生じたラマン分光学シグナルを高める電磁ギャップモードを生じる。

Description

（発明の分野）
本発明は、ナノ分光学的走査の分野に関し、特に、基板上に担持された単一分子構造または単一化学基構造の分光学的同定が可能な方法および装置に関する。

（参考文献）
以下の参考文献は、本発明の背景の一部として、および／または本発明の特定の局面に適用され得る方法論を提供するものとして記載される。これらの参考文献は、本明細書中で参考として援用される。

（発明の背景）
種々の手段および方法が、表面特徴および表面構造をマイクロスケールレベルおよびさらにナノスケールレベルで調べるために存在する。走査原子分子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、片持ち梁の自由端に保有された検出器チップを、マッピングされている材料の表面上またはその表面にわたって動かすことにより、表面トポグラフィーをマイクロスケールレベルでマッピングすることが可能である。この型の顕微鏡は、上記表面との直接的な物理的接触により作動し得るか、またはチップが上記表面から選択距離である場合、トンネルモードで、トンネル電流の検出により作動し得る。この型のデバイスは、表面位相をマッピングすることについて（例えば、集積回路チップの不完全性を検出することについて）非常に有用であると証明されたが、特定の化学化合物または化学基を検出するようには設計されていないか、または作動され得ない。この概念は、平行高速ＡＦＭ（例えば、Ｍｉｎｎｅ，１９９８；１９９９）へと広がっている。

走査チップアプローチもまた、表面マッピングの光学的検出に適合されてきた。例えば、米国特許第６，４４１，３５９号は、近距離場光学的走査システムを記載し、ここで近距離場光学部品は、片持ち梁の自由端に保持される。この特許はまた、光学走査システムについてこのような光学素子のアレイを構築するためのミクロ製造方法を開示する。装置におけるチップ〜サンプル間の距離は、先端をサンプル表面近くに維持するのに作用する光学レベル偏向システムにより制御され得る。このシステムは、波長以下の大きさのアパーチャを走査することによるか、またはサンプルに非常に近い固体浸漬レンズを走査することにより、波長以下の分解能を達成し得る。このデバイスは、群の個々の化学分子を検出するように設計されても使用され得てもおらず、生じるシグナルは非常に小さいシグナルレベルになってしまう。走査近距離場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）は、他の者により提唱された（例えば、Ｗｏｌｆ）。

化学分析のための１つの非常に感応性のプローブは、表面増強ラマン分光法またはＳＥＲＳである（例えば、Ｋｎｅｉｐｐを参照のこと）。さらに、ＳＥＲＳは、高分解能分光学的情報をサンプル表面より得る目的で、高分解能走査顕微鏡に適用されている（例えば、米国特許第６，００２，４７１号）。このデバイスは、小さな導電性エレメント（プラズモン共鳴粒子またはＰＲＰ）を走査カンチレバーの自由端に備え、プローブ近接で放出される光を増強する。このサンプル基板は、ガラスから形成される。この特許は、単一の化学構造（例えば、ＤＮＡ塩基）を分解する可能性が高い分光学的分解能を増強するように電磁ギャップモードを開発するための方法を示しても示唆してもおらず、この特許は、複数のサンプル（例えば、伸長ＤＮＡ鎖）を並行で読み得るシステムを示しても示唆してもいない。

（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、表面に付着されたサンプル中の化学基の同一性を調べるための装置を包含する。この装置は、プラズモン共鳴基板（すなわち、サンプルが支持されている鏡表面を有する基板）、光ビーム光源（好ましくはコヒーレント光）ならびに、チップ領域および１つ以上のプラズモン共鳴粒子（ＰＲＰ）から構成されるナノレンズを有するレンズアセンブリを有する。ＰＲＰは、光ビームがナノレンズを通って方向付けられる場合、上記ナノレンズと上記基板表面上の直面する検出領域との間の空間中の、４０ｎｍ以下である、上記ナノレンズと基板との間のギャップに近距離場電磁ギャップモードを生じるようにチップ領域上に配置される。

装置における焦点合わせ機構（例えば、圧電ドライブ）は、これらの間の４０ｎｍ未満のギャップで、レンズアセンブリを基板表面に向けて動かしかつ基板表面から離して動かすことに作動可能であり、検出領域におけるサンプルにより生じたラマン分光学的シグナルを増強する電磁ギャップモードを生じる。検出領域のサンプルから放出または散乱される光は、検出器で受け取られ、この検出器は、受け取った光を特有のラマンスペクトルに変換し、これにより、検出領域におけるサンプルの化学基が同定され得る。この装置は、基板に対してレンズアセンブリを移動させ、このレンズアセンブリを基板の異なる検出領域の上に位置させるための、移動機構（例えば、圧電ドライブ）を備え得る。

アセンブリにおけるナノレンズは、好ましくは、上記基板表面の平面に対して垂直である中心軸について対称に配置された少なくとも上記３つのＰＲＰを備え、各ＰＲＰは、その最も大きい寸法が５０ｎｍ〜２００ｎｍ未満であり、そして任意の対のＰＲＰ間の距離は、実質的に光ビームの波長より短い。このＰＲＰは、球状であり得るか、または楕円体であって、これらの主軸が中心軸を交差する方向に置かれて配置され得る。この実施形態において、光源は、円偏光のビーム、好ましくはコヒーレント光のビームを生じ得、これら光の偏光面は、上記中心軸に対して垂直である。

上記レンズアセンブリは、チップ領域をその自由端に有する片持ち梁を備え得、焦点合わせ機構が作動的にビームに結合されている。この機構は、好ましくは、ナノレンズを基板表面より０．１ｎｍと５ｎｍとの間の選択された距離に持っていくように作動的である。

核酸鎖の塩基（化学基）を連続的に調べることにより、核酸の線状鎖を配列決定することにおける使用について、鎖の各塩基を連続して調査および同定するために、上記基板は、核酸鎖を伸長した線状状態で保持するための分子アンカーを備え、そして移動機構は、この鎖の長さに沿ってレンズアセンブリを動かすように作動可能である。複数の実質的な核酸サンプルを同時に調べるために、上記装置は、複数の線状に整列されたカンチレバーレンズアセンブリを提供し、基板表面に向かいかつ基板表面から離れるこのカンチレバーレンズアセンブリの位置の各々は、各レンズアセンブリに関連する対応する焦点合わせ機構により個々に制御され得、そして各カンチレバーレンズアセンブリは、単一の移動機構により一体として移動される。

別の局面において、上記方法は、サンプル中の化学基の同一性を調べるための方法を包含する。サンプルをプラズモン共鳴鏡表面を有する基板に付着させた後、光ビームは、上記の型のレンズアセンブリ中のナノレンズを通ってサンプル上に方向付けられ、ナノレンズと基板との間のギャップが４０ｎｍ以下である場合、近距離場電磁ギャップモードをナノレンズと基板表面上の直面する検出領域との間の空間に生じる。このレンズアセンブリは、ナノレンズと基板表面との間の４０ｎｍ未満の開きで、レンズを基板表面に向けるかまたは基板表面から離して動かされ、検出領域におけるサンプルにより生じたラマン分光シグナルを増強する電磁ギャップモードを生じる。検出領域のサンプルから放出または散乱された光は、検出器で受け取られ、調べている化学基に特有のラマンスペクトルに変換され、これにより、検出領域におけるこのサンプルの化学基が同定され得る。

レンズアセンブリの位置は、ナノレンズを基板表面より０．１ｎｍと５ｎｍとの間の選択されたギャップ距離に持っていくように制御され得る。このナノレンズは、基板表面の平面に対して垂直である中心軸について対称に配置された少なくとも３つのＰＲＰから構成され得、各粒子は、その最も大きな寸法が５０ｎｍ〜２００ｎｍ未満であり、そして任意の対の粒子間の距離は、実質的に光ビームの波長より短い。レンズ上に方向付けられた光は、好ましくは、その偏光面が中心軸に対して垂直である円偏光のビームである。

核酸の線状鎖を配列決定することに使用されるために、サンプルは、この鎖を直線状に伸長させ、そしてこの鎖の反対の端部を基板に固定することにより、基板表面に付着され得る。上記方法は、基板上のサンプルに対してレンズアセンブリを移動し、ナノレンズを鎖中の連続的な化学基の塩基に隣接して位置させる工程をさらに包含する。核酸サンプルの複数の線状鎖を配列決定することにおける使用について、複数の鎖は、伸長され、そして基板上に平行列で固定される。次いで、複数のこのようなレンズアセンブリ（例えば、片持ち梁のアレイ）は、ＤＮＡ鎖の列に対して移動され、関連のナノレンズを鎖の各々中の連続的な化学基の塩基に隣接して位置させる。

本発明のこれらの目的および他の目的ならびに特徴は、以下の本発明の詳細な説明が添付の図面と併せて読まれる場合、より完全に理解される。

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他で特に示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有する。

「プラズモン共鳴金属」は、表面電磁モードである表面プラズモンポラリトン（ＳＰＰ）（これは、光子およびプラズモンの結合モードである）を支持し得る任意の金属（例えば、金、銀、またはアルミニウム）を包含する。

サンプル中の「化学基」は、ポリマー中のサブユニット、もしくはサブユニット部分（例えば、核酸塩基）、または化学置換基（例えば、ヒドロキシル基、アミン基、アルキル基、酸基、もしくはアルデヒド基）を包含し得る。このような化学基は、独特の増強ラマンスペクトルの特性または特徴により特徴付けられる。

「ギャップモード」とは、２つ以上のプラズモン共鳴粒子間の空間で、およびプラズモン共鳴粒子が金属表面（好ましくはプラズモン共鳴金属表面間）の近くに（４０ｎｍ未満）位置される場合の、外部電磁場により励起される電磁正常モードまたは電磁固有モードをいう。プラズモン共鳴粒子の例は、代表的には５ｎｍ〜２００ｎｍのサイズ範囲の最も大きな寸法を有する、銀粒子または金粒子である。

サンプルの「ギャップモード増強ラマンスペクトル」とは、サンプルにおけるギャップモードの存在により増強される、サンプルのラマンスペクトルのスペクトル特性をいう。

（Ｂ．ナノ分光走査のための装置）
図１は、表面に付着されたサンプル中の化学基の同一性を調べるための装置（一般的に３５で示される）を示す。走査台９０、およびこの台上に保有された複数の伸長したＤＮＡ鎖（例えば、チップ表面に固定され、かつ互いに平行に配置された鎖８２）を有するＤＮＡチップ８０が、この図に示される。伸長ポリマー鎖（例えばＤＮＡ鎖）をチップ表面上に固定するための方法は、以下に記載される。この実施形態における重要な特徴に従って、上記チップの表面（この上にサンプルが支持される）は、プラズモン共鳴金属（例えば、銀、金、またはアルミニウム）の鏡コーティングを有する。

ＤＮＡ鎖は、走査台９０（例えば、圧電動作制御台、または電磁動作制御台）により走査される。電磁動作制御を備える台は、数１０ｃｍ以上の走査領域を可能にし、従って、個々の染色体全部を有する単一分子ＤＮＡチップの走査を可能にする。

好ましくはコヒーレントな、円偏光を有する光ビームは、レーザー１０によって発生される。このレーザーは、非線形ラマン分光（例えば、ＣＡＲＳおよびフェムト秒誘導ラマン分光法（Ｄ．ＭｃＣａｍａｎｔ））を実施するための２つのレーザーを含み得る。例示的なレーザーシステムは、パルス化されている連続的な操作モードを用いるＴｉ−サファイア調整可能レーザーを使用する。励起光ビームの波長が、好ましくは、プラズモン共鳴基板のプラズモン共鳴吸収スペクトル中の極大スペクトルピークに近くなるように選択および調整される。プラズモンナノレンズを使用する走査の場合、システム全体（プラズモンナノレンズ＋プラズモン共鳴基板）のプラズモン共鳴吸収スペクトルは、周波数の調整で考慮されるべきである。プラズモンナノレンズのプラズモン共鳴基板表面へのナノスケールでの近接の理由で、プラズモン吸収スペクトルが変化されると留意することが重要である。

光ビームは、ビーム拡大器により拡大されるか、またはビームラスター２０で走査ビームに変換される。この方法において、単一の光ビームは、ナノレンズアレイ６０中の個々のプラズモンナノレンズに各々方向付けられた光ビームの列に分割される。各個々の光ビームは、ビームスプリッター３０および視準オプティクス４０を通ってマイクロレンズアレイ５０に方向付けられる。以下でより詳細に記載されるように、このマイクロレンズアレイは、片持ち梁（例えば、梁６４）の自由端に保有された、個々のプラズモンナノレンズ（例えば、アレイ６０中のレンズ６２）に方向付けられた各個々の光ビームの個々のデジタル制御を可能にする。

以下で理解されるように、本発明で開示されるプラズモンギャップモードナノレンズは、金属ナノ粒子内で外部電磁波により励起され、プラズモン共鳴表面の近くで近距離場帯中の電磁場を増強し、そしてこの電磁場を非常に小さいナノスケールの体積で局在化する、局在化プラズモン（電子の集団的振動）の性能に基づく。この非伝播電磁場は、ナノ粒子表面の近く（数十ナノメートル、３０〜４０ｎｍ）で集結され、そしてこれと遠距離場帯中の伝播電磁場とを区別するために「近距離場電磁場」と命名される。

図１を続いて参照すると、片持ち梁アレイ中の各プラズモンナノレンズに適用される光ビームは、微細加工された鏡アセンブリ５０（例えば、商品名「Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ」でＴｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓにより販売されている）により変調され得る。このシステムは、各個々のプラズモンナノレンズイルミネーション、および各プラズモンナノレンズから散乱された読み取りシグナルのデジタル制御を可能にする。配列情報のコンピュータメモリへの直接的デジタル化を使用して超高速の直接的なＤＮＡ配列決定を実行するのに欠かせない、高速プログラム化された個々にアドレス可能なマルチチャンネルパルス化モードイルミネーションのデジタル制御および散乱されたシグナルの獲得を実行するために、このシステムは特に有用である。

プラズモンナノレンズとサンプルＤＮＡとの間の距離は、フィードバックカンチレバーベンディングシステムにより維持される。このような制御システムは、周知であり、そして原子間力顕微鏡については例えば米国特許第５，８８３，７０５号に、または近距離場走査光学顕微鏡については例えば米国特許第５，３５４，９８５号に記載される。これらの特許は本明細書中に参考として援用される。米国特許第６，４４１，３５９号（これはまた、本明細書中で参考として援用される）に詳細に開示されるように、走査プロセス間のアレイ６０における各片持ち梁の個々の作動および制御の一方法は、圧抵抗器フィードバック制御を使用する。

図２および図６ａおよび図６ｂに示されるように、近距離場電磁ギャップモードの励起によりナノレンズとＤＮＡサンプルと基板表面との間のギャップにおいて最適な場増幅および局在化を達成するために、各プラズモンナノレンズと関連ＤＮＡサンプルとの間の距離は、好ましくは、０．１ｎｍ〜数ｎｍのレベルに維持される。各ナノレンズとサンプルが保持されている基板表面との間のギャップは変動するので、電磁ギャップモードの局在化および強度もまた、変動する。従って、最大散乱光（読み取り）シグナルおよび最大空間分解能を得る目的で、ナノレンズとＤＮＡサンプル（または基板表面）との間の距離を変化させることにより、電磁ギャップモードの形状および局在化を制御することが可能である。これらのギャップモードを最適化することにより、基板表面上に固定されたＤＮＡ鎖中の個々の塩基間の識別を可能にする分解能レベルを達成することが可能である。チップ上のＤＮＡ鎖の過剰な伸長のレベルに依存して、空間分解能の必要条件は、塩基ごとに、および鎖ごとに変動し得る。しかし、上記距離は、数ｎｍ〜１ｎｍ未満の範囲である。

図１に示される実施形態において、個々のＤＮＡ塩基と相互作用する各プラズモンナノレンズから後方散乱幾何学で反射された光は、マイクロレンズアレイ５０、視準オプティクス４０、およびビームスプリッター３０を通って光ファイバーリボン１００の受け取り用端部に、逆に方向付けられる。しかし、本発明は、光の後方散乱収集に限定されないと理解される。本発明の他の実施において、イルミネーションおよび収集幾何学は、後方散乱幾何学と異なり得、この場合、光イルミネーションおよび収集光学システムは、分離され得る。

光ファイバーリボン１００を通して散乱されたシグナル光は、マルチチャンネルスペクトル分析器１１０のモノクロメーターのスリットに方向付けられる。ノッチフィルターは、入射光を排除するために使用される。回折格子１２０は、散乱光ビームを個々のラマンスペクトルに変換される一連の単色光ビームに分割する。次いで、検出器アレイ１３０で得られたスペクトルは、デジタル形式に変換され、そしてコンピュータ１４０に伝送され、ここでこれらは処理されてチップ上のＤＮＡサンプルの配列情報を作製する。別の適切な光学設計（本明細書中で示さず）は、以前に開示されたような干渉検出法（例えば、Ｆ．Ｚｅｎｈａｕｓｅｎ）を利用する。

（Ｃ．ナノレンズの操作および製造）
この節には、サンプル基板の滑らかな金属表面の近くに位置され、レンズが光ビーム（例えば、コヒーレント光ビームおよび／または円偏光ビーム）で照射される場合に局在化ギャップモードを生じるように設計された特定のナノレンズ構造を記載する。これらのモードは、鏡基板表面のナノレンズの間の空間に位置されする分子の、ナノメートル未満の分解を達成するための高空間分解で、そして単一の低分子（例えば、ＤＮＡ鎖の個々の塩基）のスペクトル特性の検出を可能にするシグナル増幅での、直接的な光学読み取りのために使用され得る。

ナノレンズの最も一般的な設計としては、互いに選択された形態および選択された粒子幾何学を有する、１つの金属ナノ粒子、および好ましくは複数（例えば、２〜６つ）の金属ナノ粒子が挙げられる。以下に例示されるように、好ましい粒子幾何学は、中心軸の周りでの粒子の対称性配置であるが、他の幾何学（例えば、無秩序のフラクタル）もまた企図される。レンズを形成するナノ粒子は、異なる形態および異なる寸法を有し得、そして互いにナノスケールで近くに位置される。しかし、全体として、各ナノ粒子の最も大きな寸法および系の最も大きな寸法は、照射光の波長を超過しない。サイズ範囲が５〜２００ｎｍの間（例えば、２０〜５０ｎｍ）のナノ粒子が好ましい。

図２は、６個の粒子のナノレンズ１８０をその自由（遠位）端に有する片持ち梁１６０の一部の詳細な斜視図である。見られるように、レーザー源からの円偏光ビーム１９０は、共焦点レンズオプティクス５０を通ってナノレンズ１８０に方向付けられる。このナノレンズは、透明な導電材料から形成されるホルダー１７０に取り付けられる。このホルダー１７０は、１つの実施形態において、走査プローブデバイスにおいてナノレンズとサンプルとの間の距離を制御するために使用される、カンチレバー１６０の自由端であり得る。ナノレンズは、サンプル基板上の金属鏡表面２００の近くに位置される。共焦点オプティクスにより方向付けられる遠距離場は、およそ１ミクロンまたはわずかに１ミクロン未満のスポットサイズに焦点を合わせられ得るので、この遠距離場は、回折光学限界により決定され、そしてナノレンズの直径（ナノレンズ粒子１８２に外接する円の直径）は、好ましくは、５０〜２００ｎｍの範囲であり、すなわち、照射光の波長より短い。図にもまた見られるように、光照射領域（３５０で示される点線の円）は、通常は、ナノレンズの領域より大きい。しかし、焦点を合わせるような０．５〜１．０ミクロン直径のナノレンズを作製することが可能である。この場合、このナノレンズは、ナノアンテナとして機能し、これは、局在化プラズモンの励起によりナノレンズの中心に電磁エネルギーを集中させる。

図２ａに示される実施形態において、プラズモンナノレンズ１８５は、６つの金属ナノ粒子（例えば、粒子１８２）からなる星形様構造を有し、各粒子は、大きな偏心（好ましくは５を超える）を有する幅の広い球体、または端部に半球状キャップを有する円柱状ナノロッド、または金属ナノワイヤのいずれかの形態を有する。この粒子幾何学はまた、５つ、４つ、３つ、および２つの粒子を有するレンズについてのそれぞれのナノレンズ粒子配置１９５、２０５、２１５および２２５とともに図２Ｂの１８５に見られる。

上述のように、各ナノレンズの照射は、好ましくは、レーザービームまたは円偏光を有する非コヒーレント電磁波による。図２ａの２００に示される磁場の最大増強は、ナノレンズの軸に近いレンズの中心部で達成される。この領域は、数ｎｍまたはそれ未満の直径を有する。添付の図６ａ〜６ｃ、図７ａ〜７ｃ、および図８に対する以下に記載される数値シミュレーションの結果により例示されるように、１５００〜３０００までの場増幅定数は、ナノレンズの中心で達成され得る。この増幅定数は、先行技術から公知の球状の粒子および他の形態のナノ粒子から構成される配置で達成可能な増幅を有意に超過する。数値シミュレーションで達成された３００の最大局在場増幅が報告された（Ｈ．Ｘｕ）。

本発明のナノレンズは、種々の公知の方法により構築され得る。一般的に、電子ビームリソグラフィーもしくは集束イオンビームリソグラフィー（Ｇ．Ｒ．Ｂｒｅｗｅｒ）に基づく確立されたナノ製造法を使用して、または走査トンネル顕微鏡リソグラフィーに基づいて、ナノレンズは片持ち梁と一体化して製造される。別の製造法は、鋳型補助自己集合（Ｙ．Ｘｉａ）に基づき得る。浸漬ペンナノリソグラフィーのような代替の方法は、異なる支持材料（例えば、Ｄ．Ｇｉｎｇｅｒ）でかまたはＤＮＡベースの自己集合技術（例えば、Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ）でプラズモンナノレンズ型を作製するために使用され得る。１つの実施形態において、プラズモンナノレンズは、走査プローブデバイスの一部であるカンチレバーの自由端に組み込まれ得、そして走査プローブデバイス（例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）または走査近距離場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ））での走査の間、ナノレンズとサンプルとの間の距離を制御するカンチレバー先端の機能を同時に実施し得る。走査プローブ分光デバイスのカンチレバーに組み込まれたプラズモンナノレンズの考えられる実施の１つが、図３に提示される。

図３は、プラズモンナノレンズが走査プローブ分光デバイスのカンチレバーの自由端に組み込まれ得る方法、およびサンプルの走査の間、プラズモンナノレンズがナノレンズとサンプルとの間の距離を制御するカンチレバー先端の機能を同時に実施し得る方法を例示する。カンチレバー１６０は、光窓２５０を形成する不透明材料部２６０および光学的透明部１７０を有する複合材料から調製され、入射円偏光をナノレンズ１８０と相互作用させ、そして局在化プラズマ（ＬＰ）およびギャップモード（ＧＭ）を効率的に励起させる。

（Ｄ．サンプル含有基板の調製）
装置中の基板または支持体は、表面の近くで電磁場を増強するように設計され、そしてプラズモン共鳴材料（例えば、銀、金、またはアルミニウム）の薄膜でコーティングされる。膜の厚さは、好ましくは、２５〜２００ｎｍの間（例えば、５０ｎｍ）である。適切な基板（例えば、ガラス基板）は、公知の方法（例えば、真空蒸着またはｒｆスパッタリング技術）により金属膜でコーティングされ得る。例示的な基板コーティングおよびこの基板コーティングの製造方法は、「光化学センサーおよび製造方法」についての米国特許第５，６１１，９８８号に開示される。この特許は、本明細書中で参考として援用され、この中のＶ．Ｍａｔｙｕｓｈｉｎの参考文献もまた、本明細書中で参考として援用される。

例えば、１００ｎｍ〜２．５ｍｍの長さを有するＤＮＡ鎖が、図１の８２で示されるように、基板上に位置される。鎖間の距離は、２００〜３００ミクロンの範囲であるべきであり、そしてカンチレバーアレイの隣接するカンチレバー間の距離と対応するべきである。好ましい距離は２５０ミクロンであり、この距離は、２５０ミクロンのピッチに対応し、このピッチは、光ファイバーリボン適用での標準的なピッチである。

図４は、本発明の装置および方法で使用される例示的なチップまたは基板８０を示す。ここで示されるように、例えば、ゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡサンプルは、２．５ｍｍ（５Ｍｂａｓｅ）までの長さを有する一本鎖ＤＮＡフラグメントの形態をとる。２１０で示されるような鎖は、プラズモン共鳴光学増強特性を有するスライド８０の表面に配置される。これらは、規則正しい、アドレス可能な様式で配置される。ＤＮＡ鎖の各末端は、右／左のバーコード２２０ａおよび２２０ｂ上の相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）オリゴヌクレオチドに付着される。鎖間の距離は、２００〜３００ミクロンの範囲であるべきであり、そしてカンチレバーアレイの隣接するカンチレバー間の距離に対応するべきである。好ましい距離は、２５０ミクロンであり、この距離は、２５０ミクロンのピッチに対応し、このピッチは、標準的な光ファイバーリボンにおけるピッチに対応する。

線状ポリマーサンプル（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核のアナログ、ポリペプチド、線状炭水化物など）を伸長および配向する方法は公知である。例えば、サンプルポリマー（例えば、ＤＮＡ）の反対端は、ミクロスフィア（例えば、ラテックスまたはガラスビーズ）に共有結合され得、そしてこのビーズは、次いで、適切な程度の伸長、および好ましくは過剰な伸長が達成されるまで、パルス化レーザー分子ピンセットにより操作される。このアプローチは図４に例示され、図４は、ＤＮＡ鎖２１０の反対端に結合されたミクロスフィア２９０ａ、２９０ｂを示す。各スフィアは、このスフィアを操作して鎖を基板表面上の配置のために伸長および配向するためのレーザービーム（例えば、ビーム３００ａ、３００ｂ）により「捕獲」される。一旦この配置が達成されると、鎖の末端領域は、基板のバーコード領域に結合された相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズにより基板に固定される。ミクロスフィアをレーザービームで捕獲および操作するための方法は、例えば、米国特許第５，６２０，８５７号および米国特許出願２００４０００１３７１に記載され、これらの両方は、本明細書中で参考として援用される。

関連アプローチでは、ポリマー鎖の末端は、磁気ビーズ、または固体支持体と磁気ビーズとに共有結合され、そして適切な程度の伸長および鎖配向が達成されるまで、磁場がビーズに適用される。より一般的には、例えば、米国特許第６，３４２，３５３号（これは、本明細書中で参考として援用される）に開示されるように、鎖の反対端は、一対の相対的に移動する支持体に結合され得、そして所望の程度の伸長および配向が生じるまで、この支持体の位置が定められ得る。

狭いマイクロチャンネルで電気泳動により荷電ポリマー鎖を線状構造に引っ張る方法は、公知である。

一旦ポリマー鎖が、基板への付着のために伸長および配向されると、多くの適切な固定方法のうちの任意の方法によりサンプル分子は基板に固定される。上述のように、この基板には、サンプルＤＮＡ鎖の末端領域における配列にハイブリダイズし得る末端領域のオリゴヌクレオチドが提供され得る。上記鎖が、鎖末端に共有結合された粒子を操作することにより伸長される場合、上記基板は、鎖を伸長状態にして粒子を基板に固定するための化学基または磁気構造を含み得る。金表面用の１つの一般的な化学付着の化学は、サンプル鎖の末端領域に共有的に担持されるチオール試薬である。

より一般的には、ＤＮＡ分子が固定されることになる基板表面の調製のための手順は、ＤＮＡハイブリダイズ検出法（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｒａｂｅを参照のこと）の分野の当業者に公知である。

（Ｅ．走査法および検出法）
上で示されたように、本発明の装置および方法の重要な用途は、核酸サンプル（例えば、染色体または全ゲノムＤＮＡ）の配列決定においてである。この節には、この特定の用途を参照して上記装置の操作および本発明の方法を記載し、これと同じ操作および方法は、任意のサンプル中の化学基の試験に適用されることが理解される。

最も単純には、上記方法は、基板上の規定された検出領域に局在化している単一分子または類似分子集合の１つ以上の化学基を調べるために使用される。この用途において、例えば、片持ち梁の自由端に保持された単一のナノレンズは、例えば、１０〜４０ミクロン未満の距離範囲で、顕著な増強ラマンスペクトル特性の最大増強が観察されるまで、サンプルに向かって動かされる。あるいは、ナノレンズがサンプル表面に向かっておよびサンプル表面から離れて交互に動かされる場合にこのスペクトル特性は記録され得、サンプルの時間可変（ｔｉｍｅ−ｖａｒｉａｎｔ）スペクトルをもたらす。０．１〜１０ｎｍの間の範囲のナノレンズ振動は、例えば、時間可変スペクトルを作製することに使用され得る。

より一般的には、サンプル中の化学基の同一性を調べるための本発明の方法は、サンプルが支持される鏡表面を有する基板にサンプルを最初に付着させる工程を包含し、この鏡表面は、プラズモン共鳴金属から形成される。光ビームは、上記の型のナノレンズに方向付けられ、ナノレンズと基板との間のギャップが３０ｎｍ以下である場合、ナノレンズと基板表面上の直面する検出領域との間の空間に近距離場電磁ギャップモードを生じる。次いで、上記レンズアセンブリは、ナノレンズと基板表面との間の４０ｎｍ未満の開きで、基板表面に向かうかまたは基板表面から離れて動かされ、検出領域のサンプルから生じたラマン分光シグナルを増強する電磁ギャップモードを生成する。検出領域のサンプルから放出または散乱された光は、検出器で受け取られ、そしてギャップモード増強ラマンスペクトルに変換され、これによって、検出領域におけるサンプルの化学基が同定され得る。

サンプルが、サンプル分子の線状部分に沿って配置した複数の基を含む場合、連続的塩基の基の同定のための核サンプルの場合のように、ナノレンズが基板に対して動かされるにつれて、丁度記載された手順が引き続いて各塩基に適用される。この動きは、静止した基板に対するカンチレバー移動または静止したナノレンズに対する基板台の動きにより行われ得る。上記のように、ナノレンズは、各連続的位置で配置されているので、このナノレンズは次いで、サンプルに向かって動かされるかもしくはサンプルから離れて動かされ、最適な検出距離を見出すか、または時間可変スペクトルを生成する。このレンズおよびサンプルの塩基は、種々の位置合わせ技術の１つにより登録が維持され得る。例えば、「コントロール」ナノレンズは、基板上に乗せられた既知配列ＤＮＡサンプル中の検出塩基を記録し得た。１つ以上の未知配列サンプルと一緒にこの配列を記録することにより、レンズと基板との間の相対移動が、サンプルと連続的ＤＮＡ塩基との間の登録を保存するために作用することを上記装置は確認し得る。あるいは、装置中の片持ち梁の１つは、カンチレバーデバイスのアレイがＤＮＡ鎖に沿って動かされるにつれてコントロールＤＮＡ鎖の各塩基上のチップの移動を検出するための、走査原子間力顕微鏡の先端であり得る。

より通常の用途において、図１の装置の８２に例示されるように、複数のナノレンズによる同時の読み取りのために、複数の線状サンプル鎖（例えば、ＤＮＡ鎖）は、単一の基板上に整列される。図５ａおよび図５ｂは、基板３１０上に乗せられた複数の伸張して整列されたＤＮＡ鎖（例えば、鎖２１０）の読み取りに適用される場合のこの操作を例示する。この図は、その自由端にナノレンズ１８０を保有する片持ち梁１６０から構成される単一のレンズアセンブリを示すが、上記装置は、基板上の整列された鎖の各々に対して１つずつレンズアセンブリのアレイを備えると理解される。

レンズアセンブリの群が基板に沿って動かされる際に、各レンズアセンブリは、垂直的に（基板に向かう方向で）調整され、スペクトルのシグナルを最適化する。図５ｂに見られるように、この垂直的運動は、（例えば、１８５におけるＰＲＰにより形成された）レンズとプラズモン共鳴表面（３１０に示される）との間の近距離場電磁モードの集中により生じたギャップモードを配置するのに効果的である。

各鎖の化学基（塩基）の増強ラマンスペクトルは、マルチチャンネルラマン分光器を使用して断続的に測定され、そしてデジタル記録を用いて２次元ＩＣＣＤアレイによりデジタル化される。ラマン分光計からのシグナルは、さらなる分析のためにコンピュータメモリに保存される。この最終結果は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの塩基配列の形式で得られる。走査手順の過程で、ナノレンズ付きの先端は、分光学的および組織分布的の両方で、ＤＮＡ鎖中の各塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を検出する。

ＳＥＲＳスペクトルは、各塩基について断続的に記録され、これは、その塩基に特徴的なその独特の増強スペクトル特性によりＤＮＡ鎖中の各特定塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）を同定することを可能にし、ＤＮＡ分子の個々のフラグメントの直接的新規配列決定を可能にする。プラズモン共鳴基板上で得られたＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣのＳＥＲＳスペクトルは、異なる塩基を同定し得る特有のスペクトルを与えることが公知である。本発明は、レンズと基板との間の小さなギャップにおける励起場に焦点を当てることにより、およびラマンシグナルのギャップモード増強を開発することにより、ＤＮＡの個々の塩基を同定し得、従って、直接的な塩基１つずつのＤＮＡ読み取りを可能にする。

アレイで使用され得るファイバーオプティック付きの先端を備えるカンチレバーの数は、本質的には限定されない；しかし、最も大きなヒト染色体（約２億６千３百万の塩基を含むヒト第１染色体）を一度で走査配列決定するために、上記装置は、約１００のレンズアセンブリを必要とし、約２．５〜３．０Ｍｂａｓｅのフラグメントを各々読み出す。０．０１秒のサンプリング時間を仮定すると、上記装置は、約１０時間未満の走査時間でこの染色体の配列を完全に読み出す。このデバイスを実際に使用して、１塩基当たり０．０１〜１秒のサンプリング速度で、アレイ中の数百までのチャンネル（１つのチャンネル当たり１本のＤＮＡ鎖）を平行に実行することが可能である。

より一般的には、サンプル中の化学基の同一性を調べるための本発明の方法は、サンプルが支持される鏡表面を有する基板にサンプルを最初に付着させる工程を包含し、そしてこの鏡表面はプラズモン共鳴金属から形成される。光ビームは、上記の型のナノレンズに方向付けられ、ナノレンズと基板との間のギャップが４ｎｍ以下である場合、ナノレンズと基板表面上の直面する検出領域との間の空間に近距離場電磁ギャップモードを生成する。次いで、レンズ（ｌｅｒｎｓ）アセンブリは、ナノレンズと基板表面の間の４０ｎｍ未満の開きで、基板表面に向かって動かされるか、または基板表面から離れて動かされ、検出領域中のサンプルにより生じたラマン分光シグナルを増強する電磁ギャップモードを生成する。検出領域におけるサンプルから放出または散乱された光は、検出器により受け取られ、そしてギャップモード増強ラマンスペクトルに変換され、これにより、検出領域におけるサンプルの化学基が同定され得る。

本発明で達成され得るラマンスペクトル増幅の程度は、図６〜図８から理解され得る。これらの図において、電磁場強度Ｅは、システムをモデリングし、そして積分方程式近似を使用した近距離場近似でＭａｘｗｅｌｌ式を解くことにより計算された。図６ａは、３つの粒子のレンズについてのｅＶの関数としてのＥの変動を示す。レンズの中央領域での場分布は、図６Ｃに示される。図６ｂは、図６Ｃのｙ軸（線ｘ＝０に沿う）に沿った場強度のプロットである。理解されるように、場強度増幅は、ｙ＝０．５の点（図６ｃにおいて、上の粒子の近く）で約１，４００の最大値（入射光を超える増幅）に到達する。

類似の一連のプロットが、図７ａ〜７ｃに見られるが、図７ｃの場分布図から見られるように、この図ではレンズが４つの対称性粒子から構築されるている。図７ｂは、ｙ座標が下から上に変化する場合の線ｘ＝０に沿ったＥの対称的な分布を示す。プロットが、−１，−１と＋１，＋１との間の対角線に沿って構築される場合、図８に見られるプロットが達成され、中心から離れた粒子間近くの点でほぼ３０００の増幅を示す。

一般的な機構に従って、ラマン増強は電磁機構であり、ここで、ラマンシグナルはＥ^４に比例し（Ｍ．Ｍｏｓｋｏｖｉｔｓ，Ｒｅｖ．Ｍｏｄ．Ｐｈｙｓ．ｖ．５７，ｐ．７８３，１９８５）、ここでＥは、分子領域における場の局所的増強である。場増幅定数が５００の場合、ラマンシグナル増強は、５００^４＝６．２５×１０^１０であり、これは、文献に報告されたものよりも有意により高い。この増強を得るためには、サンプル分子は、複数の粒子のナノレンズの中央に存在するべきである。しかし、上記分子がまたプラズモン共鳴表面に近い場合、場増強は、３，０００程に高くなり得、８．１×１０^１５までのラマンシグナル増強を与え、単一の分子の化学基が検出されることを可能にする。

本発明は、特定の実施形態および適用に関して記載されたが、種々の変更および改変が本発明から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

図１は、本発明の１つの実施形態に従って、構築された装置における構成要素の配置を示す。 図２ａは、本発明の１つの実施形態に従って構築され、６個の粒子のナノレンズを有するナノレンズ上に円偏光ビームを方向付けることにより近距離場電磁ギャップモードをもたらす電磁現象を例示する。 図２ｂは、２〜６個のＰＲＰから形成されるナノレンズを示す。 図３ａは、斜視図で、本発明に従って、統合されたナノレンズを有する片持ち梁の端部領域を示す。 図３ｂは、断面図で、本発明に従って、統合されたナノレンズを有する片持ち梁の端部領域を示す。 図４は、その上面に固定された伸長したＤＮＡ鎖の列を有する基板を示す。 図５ａは、斜視図で、伸長したＤＮＡサンプル中の連続的な個々の塩基を検出するための本発明で開発された光学現象を例示する。 図５ｂは、断面図で、伸長したＤＮＡサンプル中の連続的な個々の塩基を検出するための本発明で開発された光学現象を例示する。 図６ａは、３つのエッジの星状銀ナノレンズの数値的シミュレーションの結果を示す。図６ａは、２．４５ｅＶでのプラズモン共鳴に対応する、ナノレンズの中心での場振幅の周波数依存性を示す。 図６ｂは、３つのエッジの星状銀ナノレンズの数値的シミュレーションの結果を示す。図６ｂは、ｙ軸に沿った場分布を示す。 図６ｃは、３つのエッジの星状銀ナノレンズの数値的シミュレーションの結果を示す。図６ｃは、上から見られるような場分布のトポグラフィー図を示す。 図７ａは、図６ａのようなものであるが、４つのエッジの星状銀ナノレンズの数値的シミュレーションの結果を示す。 図７ｂは、図６ｂのようなものであるが、４つのエッジの星状銀ナノレンズの数値的シミュレーションの結果を示す。 図７ｃは、図６ｃのようなものであるが、４つのエッジの星状銀ナノレンズの数値的シミュレーションの結果を示す。 図８は、４つのエッジの星状ナノレンズでのｘ軸に沿った場の分布を示し、これは、ＰＲＰの表面近くで３０００の最大振幅を示す。

Claims (18)

1. 表面に付着されたサンプル中の化学基の同一性を調べるための装置であって、該装置は、以下：
   該サンプルが支持されている鏡表面を有する基板であって、そして該鏡表面は、プラズモン共鳴金属から形成されている、基板、
   光ビーム源、
   チップ領域およびナノレンズを有するレンズアセンブリであって、該ナノレンズは、該チップ領域上に配置された１つ以上のプラズモン共鳴粒子から構成され、そして該プラズモン共鳴粒子は、光ビームがナノレンズを通って方向付けられる場合、該ナノレンズと該基板表面上の直面する検出領域との間の空間中の、４０ｎｍ以下である、該ナノレンズと基板との間のギャップに近距離場電磁ギャップモードを生じるように該チップ領域上に配置される、レンズアセンブリ、
   ４０ｎｍ未満のギャップで、該基板表面に向けてかつ該基板表面から離して該レンズアセンブリを動かすための焦点合わせ機構であって、該検出領域における該サンプルにより生じたラマン分光シグナルを増強する電磁ギャップモードを生じる、焦点合わせ機構；
   該検出領域における該サンプルから放出または散乱された光を受け取るための、かつ受け取った光をギャップモード増強ラマンスペクトルに変換するための検出器であって、これによって、該検出領域における該サンプルの化学基が同定され得る、検出器、ならびに
   該基板に対してレンズアセンブリを移動させるための移動機構であって、該レンズアセンブリを該基板の異なる検出領域上に位置させる、移動機構、
   を備える、装置。
2. 請求項１に記載の装置であって、ここで前記アセンブリ中の前記ナノレンズは、前記基板表面の平面に対して垂直である中心軸について対称に配置された少なくとも前記３つのプラズモン共鳴粒子を備え、各粒子は、その最も大きい寸法が２００ｎｍ未満であり、そして任意の対の粒子間の距離は、実質的に光ビームの波長未満である、装置。
3. 前記粒子が、球状である、請求項２に記載の装置。
4. 前記粒子が、楕円体であり、そしてこれらの主軸が前記中心軸を交差する方向に置かれるように配置されている、請求項２に記載の装置。
5. 前記光源が、偏光面が前記中心軸に対して垂直である円偏光のビームを生じる、請求項２に記載の装置。
6. 前記レンズアセンブリが、その自由端にチップ領域を有する片持ち梁を備える、請求項１に記載の装置。
7. 前記焦点合わせ機構が、前記ビームに作動的に結合された圧電ドライバーを備える、請求項６に記載の装置。
8. 前記焦点合わせ機構が、前記ナノレンズを前記基板表面より０．１ｎｍと５ｎｍとの間の選択された距離に持っていくように作動的である、請求項７に記載の装置。
9. 前記移動機構が、圧電ドライブを備える、請求項１に記載の装置。
10. 核酸鎖の化学基塩基を調べることにより、該核酸の線状鎖を配列決定することに使用するための、請求項１に記載の装置であって、該鎖の各塩基を連続して調査および同定するために、前記基板が、該核酸鎖を伸長した線状状態に保持するための分子アンカーを備え、そして前記移動機構が、前記レンズアセンブリを該鎖の長さに沿って動かすように作動可能である、装置。
11. 複数の実質的に線状のサンプルを同時に調べるための請求項１０に記載の装置であって、該装置は、複数の線状に整列されたカンチレバーレンズアセンブリを備え、前記基板表面に向かいかつ前記基板表面から離れる該カンチレバーレンズアセンブリの位置の各々は、各レンズアセンブリに関連する対応する焦点合わせ機構により個々に制御され得、そして各カンチレバーレンズアセンブリは、単一の移動機構により一体として移動される、装置。
12. 核酸鎖の化学基の塩基を調べることにより、該核酸の複数の線状鎖の配列決定することに使用するための、請求項１１に記載の装置であって、該鎖の各塩基を連続して調査および同定するために、前記基板は、該核酸鎖の各々を伸長した線状状態に保持するための分子アンカーを備え、そして前記移動機構が、該鎖の長さに沿ってレンズアセンブリを動かすように作動可能である、装置。
13. サンプル中の化学基の同一性を調べるための方法であって、該方法は、以下：
    該サンプルを、該サンプルが支持される鏡表面を有する基板に付着させる工程であって、該基板が、プラズモン共鳴金属から形成されている、工程、
    光ビームを、チップ領域およびナノレンズを有するレンズアセンブリ中の該ナノレンズに方向付ける工程であって、該ナノレンズは、該チップ領域上に配置され、そして該チップ領域上に配置された１つ以上のプラズモン共鳴粒子から構成され、該ナノレンズと基板との間のギャップが３０ｎｍ以下である場合、近距離場電磁ギャップモードを該ナノレンズと該基板表面上の直面する検出領域との間の空間に生じる、工程、
    該ナノレンズと基板表面との間の３０ｎｍ未満の開きで、該レンズアセンブリを該基板表面に向けるかまたは該基板表面から離して動かす工程であって、該検出領域における該サンプルにより生じたラマン分光シグナルを増強する電磁ギャップモードを生じる、工程；
    該検出領域の該サンプルから放出または散乱される光を受け取る工程、ならびに
    該受け取った光をギャップモード増強ラマンスペクトルに変換する工程であって、これにより、該検出領域における該サンプルの化学基が同定され得る、工程、
    を包含する、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記動かす工程が、前記ナノレンズを前記基板表面より０．１ｎｍと５ｎｍとの間の選択されたギャップ距離に持っていくように実施される、方法。
15. 請求項１３に記載の方法であって、前記方向付ける工程が、前記光ビームを、前記基板表面の平面に対して垂直である中心軸について対称に配置された少なくとも前記３つのプラズモン共鳴粒子から構成されるナノレンズに方向付ける工程を包含し、各粒子は、その最も大きな寸法が２００ｎｍ未満であり、そして任意の対の粒子間の距離が、実質的に光ビームの波長より短い、方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記方向付ける工程が、前記レンズに、その偏光面が前記中心軸に対して垂直である円偏光のビームを方向付ける工程を包含する、方法。
17. 核酸の線状鎖を配列決定することに使用するための請求項１５に記載の方法であって、前記付着させる工程が、該鎖を線状に伸長させる工程、および該鎖の反対の端部を前記基板に固定する工程を包含し、そして該方法がさらに、前記基板上の前記サンプルに対して前記レンズアセンブリを移動し、該ナノレンズを該鎖中の連続的な化学基の塩基に隣接して位置させる工程を包含する、方法。
18. 核酸サンプルの複数の線状鎖を配列決定することに使用するための請求項１７に記載の方法であって、前記付着させる工程が、該サンプルを複数の平行鎖で固定する工程を包含し、そして前記移動させる工程が、前記基板上の前記サンプルに対して前記レンズアセンブリを移動し、該ナノレンズを該鎖の各々中の連続的な化学基の塩基に隣接して位置させる工程を包含する、方法。

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