JP2006515370A6 - 神経細胞死滅を治療するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制方法に関するものであって、より具体的には酸化的毒性抑制剤を投与して細胞壊死を抑制する方法及び上記酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを共に投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法に関するものである。本発明の酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される神経細胞の壊死を抑制し、ニューロトロフィンによる神経細胞の枯死又は予定死の抑制効果に影響を与えないため、上記酸化的毒性抑制剤をニューロトロフィンと共に投与すれば、脳卒中、外傷性脳脊椎の損傷による急性脳疾患、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病などの退行性脳疾患で現れる脳細胞の損傷を予防し再生を促進できる。
Description
〔技術分野〕
本発明はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法に関するものであって、より具体的には酸化的毒性抑制剤を投与して細胞壊死を抑制する方法及び酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法に関する。
本発明はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法に関するものであって、より具体的には酸化的毒性抑制剤を投与して細胞壊死を抑制する方法及び酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法に関する。
〔背景技術〕
中枢神経及び末梢神経は標的細胞から分泌される神経成長因子であるニューロトロフィン(neurotrophin)の持続的な供給によって生存する (Levi−Montalcini,1987,EMBO J.,6,1145−1154;Barde,1994,Prog.Clin.Biol.Res.,390,45−56)。ニューロトロフィンの作用はチロシンキナーゼ活性を有したニューロトロフィン受容体親和度が高いTrkA、TrkBまたはTrkCと結合することによって始まる(Patapoutian and Reichardt,2001,Curr.Opin.Neurobiol.,11,272−280;Kaplan and Miller,2000,Curr.Opin.Neurobiol.,10,381−391)。Trkチロシンキナーゼは、小脳顆粒、皮質、海馬、交感神経及び感覚神経のような多様な神経の生存に重要な役割を果たす小さいGTP−結合蛋白質であるRas、PI−3K及びPLCγを活性化させる(Borasio et al.,1993,J.Cell.Biol.,121,665−672;Stephens et al.,1994,Neuron,12,691−705;Yao and Cooper,1995,Science.,267,2003−2006;Nobes et al.,1996,Neuroscience.,70,1067−1079;Nonomura et al.,1996,Brain Res Dev Brain Res.,97,42−50;Alcantara et al.,1997,J Neurosci .,17(10),3623−3633;Hetman et al.,1999,J Biol Chem.,274,22569−22580;Atwal et al.,2000,Neuron.,27,265−227)。
中枢神経及び末梢神経は標的細胞から分泌される神経成長因子であるニューロトロフィン(neurotrophin)の持続的な供給によって生存する (Levi−Montalcini,1987,EMBO J.,6,1145−1154;Barde,1994,Prog.Clin.Biol.Res.,390,45−56)。ニューロトロフィンの作用はチロシンキナーゼ活性を有したニューロトロフィン受容体親和度が高いTrkA、TrkBまたはTrkCと結合することによって始まる(Patapoutian and Reichardt,2001,Curr.Opin.Neurobiol.,11,272−280;Kaplan and Miller,2000,Curr.Opin.Neurobiol.,10,381−391)。Trkチロシンキナーゼは、小脳顆粒、皮質、海馬、交感神経及び感覚神経のような多様な神経の生存に重要な役割を果たす小さいGTP−結合蛋白質であるRas、PI−3K及びPLCγを活性化させる(Borasio et al.,1993,J.Cell.Biol.,121,665−672;Stephens et al.,1994,Neuron,12,691−705;Yao and Cooper,1995,Science.,267,2003−2006;Nobes et al.,1996,Neuroscience.,70,1067−1079;Nonomura et al.,1996,Brain Res Dev Brain Res.,97,42−50;Alcantara et al.,1997,J Neurosci .,17(10),3623−3633;Hetman et al.,1999,J Biol Chem.,274,22569−22580;Atwal et al.,2000,Neuron.,27,265−227)。
ニューロトロフィンは正常的な神経系の分化過程の間、細胞の枯死(apoptosis)または予定死(programmed cell death)を制御して神経細胞の生存を増進させる(Barde,1994,Prog.Clin.Biol.Res.,390,45−56;Deshmukh and Johnson,1997, Mol.Pharmacol.,51,897−906)。ニューロトロフィンの神経細胞保護効果は多様な形態の神経系脳疾患のモデルにおいて証明されている。例えば、ニューロトロフィンは生体内軸索切断術の実験による前脳基底のコリン性神経細胞、網膜神経節神経細胞、脊髓感覚及び運動神経細胞の退化を抑制すると報告された(Hefti,1986,J.Neurosci .,6,2155−2162;Yan et al.,1993,J.Neurobiol.,24,1555−1577;Mey and Thanos,1993,Brain Res.,602,304−317;Morse et al.,1993,J.Neurosci .,13,4146−4156;Cohen et al.,1994,J.Neurobiol.,25,953−959;Friedman et al.,1995,J.Neurosci .,15,1044−1056)。神経成長因子(NGF)、脳−由来神経性因子(Brain−derived neurotrophic factor,以下「BDNF」と称す)及びニューロトロフィン(neurotrophin、以下「NT」と称す)−3、NT−4/5は低酸素性−虚血性損傷による神経の枯死を減少させることができて(Shigeno et al.,1991,J.Neurosci .,11,2914−2919;Beck et al.,1994,J.Cereb.Blood.Flow Metab.,14,689−692;Chan et al.,1996,Neurochem.Res.,21,763−767)、BDNFは、1−メチル−4−フェニル−1、2、3、6−テトラハイドロピリジン(1−methyl−4−phenyl−1,2,3,6−tetrahydropyridine)及び6−ヒドロキシドーパミン(6−hydroxy dopamine)からドーパミン性神経を保護する(Spina et al.,1992,J.Neurochem.,59,99−106;Frim et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,5104−5108)。上記研究からニューロトロフィンが低酸素性−虚血及び多様な退行性脳神経系疾患を治療するに用いられるということがわかる。
上記で見たようにニューロトロフィンの作用である神経細胞枯死の抑制効果を用いて神経退行性疾病を治療しようとする努力が進んでいる。しかし、上記の神経細胞枯死の抑制効果を有したニューロトロフィンを脳疾患の治療に応用するに制限を与える研究結果が報告されている。例えば、BDNF、NT−3またはNT−4/5は虚血性神経細胞の損傷を悪化させるが、これはN−メチル−D−アスパルテート(NMDA)グルタメート受容体を通じたCa2+の流入及び一酸化窒素(NO)の生産増加がメカニズムとして提示されており(Fernandez−Sanchez and Novelli,1993,FEBS Lett.,335,124−131;Koh et al.,1995,Science,268,573−575;Samdani et al.,1997,J.Neurosci .,17,4633−4641),BDNF、NGF 及びNT−4/5は酸化的毒性と亜鉛による神経細胞の壊死を著しく増加させることが明かになった(Gwag et al.,1995,Neuroreport,7,93−96;Park et al.,1998,Neuroreport,9,687−690;Won et al.,2000,Neurobiol Dis,7,251−259)。
最近本発明者らは、ニューロトロフィンが状況によって神経細胞の損傷を悪化させることはもちろん、培養した細胞はもちろん実験ねずみにおいて直接的に神経細胞の壊死を誘導することを確認した(Kim et al.,2002,J Cell Biol,159,821−831)。従って、このようなニューロトロフィンの予想外の毒性作用は最近ニューロトロフィンが神経病症、ルーゲリック病などの臨床実験で使用が中断される状況と関連があると予想された(Apfel et al.,2001,Clin.Chem.Lab.Med.,39(4),351−61)。
ここで、本発明者らはニューロトロフィンの直接的な毒性作用のメカニズムを明らかにし、毒性作用を選択的に防止できる抑制剤を探ることによってニューロトロフィンの脳疾患に対する治療効果を極大化できる補完薬物を確保して本発明を完成した。
〔発明の概要〕
本発明の目的は、酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法及び酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法を提供することである。
本発明の目的は、酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法及び酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明は酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法を提供する。
また、本発明は酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法を提供する。
また、本発明はテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有するニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を提供する。
また、本発明はテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体及びニューロトロフィンを有効成分として含有する細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤を提供する。
〔発明の実施のための最良の形態〕
明細書内に統合されており明細書の一部を構成する添付図面は発明の現在の望ましい実施例を例示して、次の望ましい実施例の詳細な説明と共に本発明の原理を説明する。
明細書内に統合されており明細書の一部を構成する添付図面は発明の現在の望ましい実施例を例示して、次の望ましい実施例の詳細な説明と共に本発明の原理を説明する。
図1は、皮質神経細胞の培養において神経因子を持続的に処理して神経細胞の壊死を引き起こしたことを表したグラフである。A:BDNF処理、B:NT−3処理及びC:NT−4/5処理。図2は、生理食塩水及びBDNFを注入した後2日後に脳を切断してヘマトキシリン及びエオジン(H&E)で染色して神経細胞壊死を確認したものである。A:生理食塩水注入後H&Eで染色した写真、B:BDNF注入後H&Eで染色した写真及びC:生理食塩水及びBDNF注入後H&Eで染色した写真から分析したグラフ。図3は、皮質神経細胞を同時に洗浄及びBDNFを処理した後32時間が経って顕微鏡を通じて見た写真である。A:同時に洗浄し位相差顕微鏡で見た写真、B:BDNF処理し位相差顕微鏡で見た写真、C:同時に洗浄し電子顕微鏡で見た写真及びD:BDNF処理し電子顕微鏡で見た写真。図4は、皮質神経細胞にBDNFを32時間持続的に処理した後対照群とBDNFを処理した群を、正常、細胞壊死及び細胞枯死の群に分類してBDNFによって誘導される神経細胞の死滅の形態を分析したグラフである。図5は、皮質神経細胞に、BDNF、抗−BDNF抑制抗体、トロロックスまたはCHX(cycloheximide)を各々処理し、培地に排出されるLDHを測定して神経細胞壊死を分析したグラフである。図6は、皮質神経細胞を洗浄して培養したりBDNFを処理して培養した後酸化されたDCDHF−DA(DCF)の蛍光強度を測定して神経のROS水準を分析して表したグラフである。図7は、皮質神経細胞を洗浄して、培養、BDNF単独処理、BDNF及びCHX処理またはBDNF及びトロロックスを処理して皮質神経細胞にあるDCFを定量化したグラフである。図8は、BDNFを時間毎に処理した皮質神経細胞でNADPHオキシダーゼ及びGAPDH mRNAをRT−PCRを行い電気泳動した写真である。図9は、BDNFを時間毎に処理した皮質神経細胞でNADPHオキシダーゼ及びGAPDH mRNAをRT−PCRを行い電気泳動した写真からNADPHオキシダーゼのmRNA水準を定量化したグラフである。図10は、皮質神経細胞にBDNFを時間毎に処理した後NADPHオキシダーゼの構成因子及びアクチン(actin)をウエスタンブロットで分析した図である。図11は、皮質神経細胞を洗浄及びBDNF処理して培養した後免疫標識した蛍光顕微鏡写真である。A:洗浄、FITCが結合された抗−羊IgG及び抗−p47−phoxで免疫標識、B:洗浄、テキサスレッドが結合された抗−羊IgG及び抗−NeuNで免疫標識、C:BDNF処理、FITCが結合された抗−羊IgG及び抗−p47−phoxで免疫標識及びD:BDNF処理、テキサスレッドが結合された抗−羊IgG及び抗−NeuNで免疫標識。図12は、皮質神経細胞を洗浄及びBDNF処理して培養した後免疫標識した蛍光顕微鏡写真である。A:洗浄、FITCが結合された抗−羊IgG及び抗−p67−phoxで免疫標識、B:洗浄、テキサスレッドが結合された抗−羊IgG及び抗−NeuNで免疫標識、C:BDNF処理、FITCが結合された抗−羊IgG及び抗−p67−phoxで免疫標識及びD:BDNF処理、テキサスレッドが結合された抗−羊IgG及び抗−NeuNで免疫標識。図13は、皮質神経細胞にBDNFを時間毎に処理して培養した後細胞質の分画(C)及び細胞質膜の分画(M)を分離して抗−p47−phox抗体及び抗−p67−phox抗体を用いてウエスタンブロットを行った写真である。図14は、皮質神経細胞を洗浄、BDNF処理及びBDNF及びDPI処理して培養した後各時間毎に皮質神経細胞でシトクロムcの減少を測定して過酸化物の生成を分析したグラフである。図15は、皮質神経細胞を洗浄、BDNF処理またはDPI処理して過酸化物を測定した蛍光顕微鏡写真である。A:洗浄した皮質神経細胞の酸化されたハイドロエチジン(HEt)、B:BDNFを処理した皮質神経細胞の酸化されたHEt、C:BDNF及びDPIを処理した皮質神経細胞の酸化されたHEt、D:洗浄した皮質神経細胞の酸化されたDCF、E:BDNFを処理した皮質神経細胞の酸化されたDCF及びF:BDNF及びDPIを処理した皮質神経細胞の酸化されたDCF。図16は、皮質神経細胞に、BDNF、BDNF+DPI、BDNF+AEBSFまたはBDNF+2−ヒドロキシ−TTBAを処理して培養した後培養培地に排出されるLDHを測定して神経細胞壊死を分析したグラフである。図17は、血清を除去した神経−過多皮質神経細胞に、無添加、BDNF、BDNF+DPI、DPI、BDNF+トロロックスまたはトロロックスを処理して生存する神経の数を数えて神経細胞枯死を分析したグラフである。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法を提供する。
本発明の酸化的毒性(oxidative stress)抑制剤は、NADPHオキシダーゼの阻害剤(NADPH oxidase inhibitor)、ビタミンEとその誘導体及びテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸(tetrafluorobenzylaminosalicylic acid)誘導体からなる群より選択されるのが望ましい。上記でNADPHオキシダーゼの阻害剤は、ジフェニレンヨードニウム(DPI)及び4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライド(AEBSF)からなる群より選択される一つ以上であることが望ましく、ビタミンEの誘導体はトロロックス(trolox)であることが望ましくて、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、BAS(5−benzylaminosalicylic acid),TBAS(5−(4−trifluoromethylbenzyl) aminosalicylic acid),NBAS(5−(4−nitrobenzyl)aminosalicylic acid),CBAS(5−(4−chlorobenzyl)aminosalicylic acid),MBAS(5−(4−methoxybenzyl)aminosalicylic acid),FBAS(5−(4−fluorobenxyl)aminosalicylic acid)及び2−hydroxy−TTBA(2−Hydroxy−5−(2,3,5,6−tetrafluoro−4−trifluoromethyl− benzylamino)−benzoic acid、以下「2−ヒドロキシ−TTBA」と称す)からなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。
本発明のニューロトロフィン(neurotrophin)は、NGF(nerve growth factor)、BDNF(brain derived−neurotrophic factor)、ニューロトロフィン(NT)−3、またはNT−4/5であることが望ましくて、BDNFであることがさらに望ましい。
BDNFは、NADPHのオキシダーゼの発現を増加させ、このため細胞内に活性酸素(reactive oxygen species、以下「ROS」と略称する)を過量生成して神経細胞の壊死を誘導する。
NADPHオキシダーゼの阻害剤であるジフェニレンヨードニウム(DPI)または4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライド(AEBSF)を処理すると、BDNFによって誘導されるNADPHオキシダーゼの活性を抑制してROSの生成を減少させ、細胞壊死を抑制して、ビタミンEまたはその誘導体であるトロロックスを処理すると抗酸化作用によってBDNFによって誘導された細胞壊死を抑制する。また、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体であるBAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−ヒドロキシ−TTBAは抗酸化作用をする物質であって酸化的毒性を抑制して細胞壊死を抑制する(国際特許公開:WO01/79153号)。
従って、本発明の酸化的毒性抑制剤を投与するとニューロトロフィンによって誘導された細胞壊死を抑制することができる。
また、本発明は酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法を提供する。
本発明の酸化的毒性抑制剤は、NADPHオキシダーゼの阻害剤、ビタミンE誘導体及びテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体からなる群より選択されるのが望ましい。上記でNADPHオキシダーゼの阻害剤は、ジフェニレンヨードニウム(DPI)及び4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライド(AEBSF)からなる群より選択される一つ以上であることが望ましく、ビタミンEの誘導体はトロロックスであることが望ましくて、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−ヒドロキシ−TTBAからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。
本発明のニューロトロフィンは、NGF、BDNF、ニューロトロフィン(NT)−3、またはNT−4/5であることが望ましくて、BDNFであることがさらに望ましい。
BDNFは細胞枯死を抑制するが同時に細胞壊死をも引き起こす。しかし、BDNFと共に酸化的毒性抑制剤を投与すると、BDNFによって細胞枯死が抑制され同時に酸化的毒性抑制剤によって細胞壊死が抑制される。このとき酸化的毒性抑制剤はBDNFによる細胞枯死の抑制には影響を及ぼさない。従って、BDNF及び酸化的毒性抑制剤を共に処理すると細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制することができる。
即ち、本発明の酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンを投与すると細胞壊死及び細胞枯死と関連する疾患である虚血性脳卒中(Holtzman et al.,1996,Ann.Neurol.,39(1),114−122;Ferrer et al.,2001,Acta neuropathol.(Berl.),101(3),229−38)、退行性脊椎損傷(Jin et al.,2002,Exp.Neurol.,177(1),265−75)、アルツハイマー性痴呆(Siegel and Chauhan,2000,Brain Res.Brain Res.Rev.,33,2−3)、パーキンソン病(Bradford et al.,1999,adv.Neruol.80,19025)、ルーゲリック病(Louvel et al.,1997,TRENDS.Pharmacol.Sci.,18(6),196−203)、神経病症(Apfel,1999,Brain Pathol,9(2),393−413)、ハンチントン病(Perez−Navarro et al.,2000,J.Neurochem.,75(5),2190−9)、緑内障(KO et al.,2000,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,41(10),2967−71)及び網膜剥離(Lewis et al.,1999,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,40(7),1530−1544) などで薬理効果を奏することができる。
また、本発明はテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有するニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を提供する。
上記で見たように酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する。従って、酸化的毒性抑制剤であるテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を用いてニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を製造することができる。本発明のテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体は、BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−ヒドロキシ−TTBAからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。本発明のニューロトロフィンは、NGF、BDNF、ニューロトロフィン(NT)−3、またはNT−4/5であることが望ましくて、BDNFであることがさらに望ましい。
テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有する薬学的組成物は、臨床投与の際に経口または非経口で投与が可能であり一般的な医薬品製剤の形態で用いられ得る。テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有する薬学的組成物は、実際臨床投与の際に経口及び非経口のいろいろな剤型で投与され得るが、製剤化する場合には通常用いる、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれて、このような固形製剤は一つ以上のテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート(calcium carbonate)、スクロース(sucrose)またはラクトース(lactose)、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレートタルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、通常用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール(propyleneglycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられ得る。座剤の基剤としては、ウィテップソル(witepsol)、マクロゴール、ツイン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂 、グリセロゼラチンなどが用いられ得る。
また、本発明はテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体及びニューロトロフィンを有効成分として含有する細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤を提供する。
酸化的毒性抑制剤であるテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制し、ニューロトロフィンは細胞枯死を抑制して、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体はニューロトロフィンによって抑制された細胞枯死に影響を及ばなさないため、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体及びニューロトロフィンを有効成分として含有する細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤を製造できる。
テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−ヒドロキシ−TTBAからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。
本発明のニューロトロフィンは、NGF、BDNF、ニューロトロフィン(NT)−3、またはNT−4/5であることが望ましくて、BDNFであることがさらに望ましい。
本発明の細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤は細胞壊死及び細胞枯死と関連する疾患である虚血性脳卒中、退行性脊椎損傷、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、神経病症、ハンチングトン病、緑内障または網膜剥離に薬理効果を奏することができる。
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。
<実施例1> 一次皮質神経細胞の培養
本発明者らは、ニューロトロフィンによる神経毒性を確認するため白鼠の大脳皮質神経細胞を培養した。妊娠後17日になった白鼠の胎児の脳から分離した大脳皮質神経細胞をイーグルス最小構成培地(MEM)、5%馬血清(horse serum)、5% 子牛の胎児血清(fetal calf serum)、21mM グルコース、26.5mM 重炭酸及び2mM L−グルタミンを含有する培地(Gibco BRL)を用いて培養した。
本発明者らは、ニューロトロフィンによる神経毒性を確認するため白鼠の大脳皮質神経細胞を培養した。妊娠後17日になった白鼠の胎児の脳から分離した大脳皮質神経細胞をイーグルス最小構成培地(MEM)、5%馬血清(horse serum)、5% 子牛の胎児血清(fetal calf serum)、21mM グルコース、26.5mM 重炭酸及び2mM L−グルタミンを含有する培地(Gibco BRL)を用いて培養した。
神経細胞−神経膠細胞の混合培養のために、試験官内で培養してから5ないし7日(days in vitro(DIV)5−7)に、10μM シトシンアラビノシド(cytosine arabinoside、Ara C)を添加して非−神経細胞の過剰成長を中止させた。2日後、馬血清を添加しなかった培地に換えた。細胞は37℃に維持され、5%のCO2に維持される培養器で培養した。一方、純粋神経細胞(>95%)の培養のために、Gwagの方法(Gwag et al.,1997,Neuroscience,77,393−401)によって培養してから2ないし3日(DIV 2ないし3)に2.5μM シトシンアラビノシドを添加して培養した。
<実施例2> ニューロトロフィンの持続処理による細胞壊死の誘導及び分析
本発明者らは、ニューロトロフィンが細胞壊死を誘導するか否かを観察するために、皮質神経細胞にニューロトロフィンを処理して細胞培養液に分泌される乳酸脱水素酵素 (lactate dehydrogenase、以下「LDH」と称す)の水準を分析して細胞壊死を分析した。
本発明者らは、ニューロトロフィンが細胞壊死を誘導するか否かを観察するために、皮質神経細胞にニューロトロフィンを処理して細胞培養液に分泌される乳酸脱水素酵素 (lactate dehydrogenase、以下「LDH」と称す)の水準を分析して細胞壊死を分析した。
上記実施例1の方法で混合培養した大脳皮質神経細胞(DIV 12ないし14)に10,30または100ng/mlの脳誘導神経栄養因子(brain−derived neurotrophic factor、以下「BDNF」)またはニューロトロフィン(neurotrophin、以下「NT」と称す)−3を添加して培養した。培養培地に分泌されるLDHの水準を定量することによって神経細胞壊死を分析した。神経細胞壊死の百分率は対照群(0%と表記)または24時間500μMのN−メチル−D−アスパルテート(N−methyl−D−aspartate,NMDA)を添加して24時間以内に完璧な神経細胞壊死をした群(100%と表記)によって平均LDH値で定量化した。
その結果、BDNF、NT−3、またはNT−4/5を36時間ないし48時間持続的に処理して培養した際には広範囲な神経細胞壊死が起こり、BDNF、NT−3またはNT−4/5を48時間処理した際に完全な神経細胞壊死が起こった(図1のA、図1のB、図1のC)。{平均±SEM(各条件当り培養ウェルの数、n=16)、*比較対照群(同時に洗浄した対照群)と比べて相当な差があるものであり、スチューデント-ニューマン-クルーズテスト(Student−Neuman−Keuls test)を通じてP<0.05の有意性を見せた。
従って、ニューロトロフィンであるBDNF、NT−3またはNT−4/5は細胞壊死を誘導することがわかる。
<実施例3> BDNFの線条体内注入による細胞壊死の分析
本発明者らはBDNFによる細胞壊死を確認するためにねずみ脳の線条体にBDNFを注入した。具体的に、250ないし300gの重さを持つ雄白鼠を麻醉した後5μl 生理食塩水及び生理食塩水に溶かした5μg BDNFを2日間線条体内注入した(線条体内注入位置:ドアの方から前庭に1.0mm、測位から中央に3.0mm、硬膜表面から腹側に5.0mm)。注入後2日後に脳を切断して400mg/ml クロラールハイドレート(chloral hydrate)を腹腔内注入して麻醉させた後、燐酸−緩衝生理食塩水(PBS)、続いて3% パラホルムアルデヒドを心臓透過で貫流させた。すぐ脳を除去して固定した後、マイクロトーム(TPI社)を用いて8μm厚さで切断した。注入部位を含む切断切片を集めてヘマトキシリン及びエオジン(Hematoxylin and Eosin、以下「H&E」と称す)を用いて染色した。病変部位はウォンの方法(Won et al.,2000,Neurobiol.Disease.,7,251−259)によって分析した。注射針が通過した位置及び染色様相において神経細胞の死滅が起こった損傷部位を含む6個の段階的な切断切片を観察した。H&Eで染色した脳組織切片はコンピュータ映像分析機器(シグマスキャン社)を用いて分析した。
本発明者らはBDNFによる細胞壊死を確認するためにねずみ脳の線条体にBDNFを注入した。具体的に、250ないし300gの重さを持つ雄白鼠を麻醉した後5μl 生理食塩水及び生理食塩水に溶かした5μg BDNFを2日間線条体内注入した(線条体内注入位置:ドアの方から前庭に1.0mm、測位から中央に3.0mm、硬膜表面から腹側に5.0mm)。注入後2日後に脳を切断して400mg/ml クロラールハイドレート(chloral hydrate)を腹腔内注入して麻醉させた後、燐酸−緩衝生理食塩水(PBS)、続いて3% パラホルムアルデヒドを心臓透過で貫流させた。すぐ脳を除去して固定した後、マイクロトーム(TPI社)を用いて8μm厚さで切断した。注入部位を含む切断切片を集めてヘマトキシリン及びエオジン(Hematoxylin and Eosin、以下「H&E」と称す)を用いて染色した。病変部位はウォンの方法(Won et al.,2000,Neurobiol.Disease.,7,251−259)によって分析した。注射針が通過した位置及び染色様相において神経細胞の死滅が起こった損傷部位を含む6個の段階的な切断切片を観察した。H&Eで染色した脳組織切片はコンピュータ映像分析機器(シグマスキャン社)を用いて分析した。
その結果、BDNFを注入したねずみの脳神経組織で神経細胞の死滅が起ったことを確認することができ、このような損傷が起こった部位の面積を測定して分析した結果、BDNFを注入したねずみの病変組織は生理食塩水のみ注入したねずみの病変組織よりさらに大きい細胞壊死を示した(図2)。
<実施例4> BDNF処理した皮質神経細胞の細胞壊死観察
本発明者らは、BDNF処理による神経細胞壊死の様相を確認するために、100ng/ml BDNFを32時間持続的に処理した大脳皮質神経細胞及びBDNFを処理しなかった対照群を位相差顕微鏡及び透過電子顕微鏡を用いて観察した。
本発明者らは、BDNF処理による神経細胞壊死の様相を確認するために、100ng/ml BDNFを32時間持続的に処理した大脳皮質神経細胞及びBDNFを処理しなかった対照群を位相差顕微鏡及び透過電子顕微鏡を用いて観察した。
透過電子顕微鏡を用いた観察は、細胞培養液をカルノフスキー(Karnovskys)固定溶液(1% パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)、2% グルタアルデヒド(glutaldehyde)、2mM カルシウムクロライド(calcium chloride)及び100mM カコジル酸緩衝液(cacodylate buffer)pH7.4)に2時間固定させ、カコジル酸緩衝液で洗浄した後、1% 四酸化オスミウム(osmium tetroxide)及び1.5% フェロシアン化カリウム(potassium ferrocyanide)で1時間後−固定した。上記固定された細胞は0.5% ウラニルアセテート(uranyl acetate)で全体的に染色し、段階的な濃度のアルコールで脱水させ、ポリ/ベッド812レジン(Poly/Bed 812 resin)(ペルコ社)で封埋した。上記封埋された細胞はライヘルトジョンウルトラカットS(Reichert Jung Ultracut S)(レイカ社)を用いて切断した。上記切断された細胞をウラニルアセテート及びリードシトレート(lead citrate)で染色して、透過電子顕微鏡を用いて細胞を観察しジェイスEM 902A(Zeiss EM 902A)を用いて写真を撮った。
位相差顕微鏡を通じて観察した結果、BDNFの処理によって神経細胞の膨脹が起こり(図3のA及びB)、透過電子顕微鏡で観察した結果BDNFの処理によって細胞壊死の形態で核染色質が散漫に凝縮され、核膜の損傷は起こらなかったが、細胞質膜が破裂されることがわかる(図3のC及びD)。また、透過電子顕微鏡を通じた観察で対照群及びBDNFを処理した神経細胞において正常、細胞壊死または細胞枯死(細胞質が収縮し、核膜が細胞質膜より先に破裂)の所見が見えた退行した神経を分類した結果、BDNFによって細胞壊死が誘導されることがわかる(図4)。
<実施例5> BDNFの皮質細胞への処理によるROSの生成分析
活性酸素種(reactive oxygen species、以下「ROS」と称す)が増加すると細胞壊死が誘導されると広く知られており、本発明者らはBDNFを処理して誘導された細胞壊死がROSの生産が増加されて起こったものであるか確認しようとした。
活性酸素種(reactive oxygen species、以下「ROS」と称す)が増加すると細胞壊死が誘導されると広く知られており、本発明者らはBDNFを処理して誘導された細胞壊死がROSの生産が増加されて起こったものであるか確認しようとした。
100ng/ml BDNF、100ng/ml BDNF及び1μg/ml シクロヘキシミド(cycloheximide、以下「CHX」と称す)、100ng/ml BDNF及び100μM トロロックス(trolox)を処理して培養した皮質神経細胞(DIV 12ないし15)に10μM ジクロロジハイドロフルオレセインジアセテート(dichlorodihydro fluorescein diacetate、以下「DCDHF−DA」と称す)または5μM ハイドロエチジウム(hydroethidium、以下「HEt」と称す)(Molecular Probe)を含む2% プルロニック F−127が添加されたHEPES−緩衝塩調節溶液(HCSS)(120mm NaCl、5mM KCl、1.6mM MgCl2、2.3mM CaCl2、15mM グルコース、20mM HEPES及び10mM NaOH)を添加した。上記細胞は37℃で20分間培養し、HCSS緩衝溶液で3回洗浄した。100Wゼノンランプ及び濾過器(酸化されたDCDHFのためのもの;励起=488nm、放出=510nm、HEtのためのもの;励起=546nm、放出=590nm)を含んでいるニコンジアフォト反転顕微鏡(Nikon Diaphot inverted microscope)で酸化されたDCDHFの蛍光信号を室温で観察した。蛍光映像はクァンチセル700システム(QuantiCell 700 system)(Applied Imaging、イギリス)を用いて分析した。
その結果、BDNFの処理によってROSの生産が増加し、BDNFと共に蛋白質合成阻害剤であるCHXまたはビタミンE誘導体であるトロロックスを処理することによってBDNFによって増加したROSの生産が減少することがわかった(図6、図7)。{平均±SEM(各条件当り任意に選択された神経細胞の数、n=30ないし35)、*;BDNFを処理しなかった対照群と相当な差があるものであり、#;BDNF比較対照群(BDNFのみ処理した対照群)と相当な差があるものであって、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP<0.05で大きい差を見せる結果}
従って、BDNFは、前−酸化剤蛋白質の合成を通じてROSを生産することがわかる。
従って、BDNFは、前−酸化剤蛋白質の合成を通じてROSを生産することがわかる。
<実施例6> BDNFによって誘導されるROSの生成を遮断した細胞壊死抑制分析
本発明者らは、BDNFによって誘導される神経細胞壊死の作用メカニズムを確認するために、皮質神経細胞(DIV 12ないし15)に100ng/ml BDNF単独、100ng/ml BDNF及び100μg/ml 抗−BDNF抑制抗体、100ng/ml BDNF及び100μM トロロックス、または100ng/ml BDNF及び1μg/ml CHXを各々処理し、36時間後培養培地に排出されるLDHを測定して神経細胞壊死を分析した。
本発明者らは、BDNFによって誘導される神経細胞壊死の作用メカニズムを確認するために、皮質神経細胞(DIV 12ないし15)に100ng/ml BDNF単独、100ng/ml BDNF及び100μg/ml 抗−BDNF抑制抗体、100ng/ml BDNF及び100μM トロロックス、または100ng/ml BDNF及び1μg/ml CHXを各々処理し、36時間後培養培地に排出されるLDHを測定して神経細胞壊死を分析した。
その結果、BDNFの処理によって誘導された細胞壊死で増加されたLDHの分泌は抗−BDNF遮断抗体の投入によって完璧に遮断されて、蛋白質合成阻害剤であるCHX及び抗酸化剤であるトロロックスの処理によってBDNFによって誘導された細胞壊死を完璧に遮断した(図5)。{平均±SEM(各条件当り培養ウェルの数、n=16)、*;比較対照群(BDNFのみを処理した対照群)と相当な差があるものであり、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP<0.05で大きい差を見せる結果}
従って、BDNFによって誘導された細胞壊死はROSを生成する酸化的ストレス過程を抑制することによって遮断されることがわかる。
従って、BDNFによって誘導された細胞壊死はROSを生成する酸化的ストレス過程を抑制することによって遮断されることがわかる。
<実施例7> BDNFを処理した皮質細胞での標的遺伝子分析
<7−1> cDNAマイクロアレイ分析を通じたBDNFの標的遺伝子分析
本発明者はBDNFを処理した皮質細胞で発現される遺伝子及び遺伝子の発現の変化を見るためにcDNAマイクロアレイ分析を行った。
<7−1> cDNAマイクロアレイ分析を通じたBDNFの標的遺伝子分析
本発明者はBDNFを処理した皮質細胞で発現される遺伝子及び遺伝子の発現の変化を見るためにcDNAマイクロアレイ分析を行った。
BDNFを8時間添加して培養した皮質神経細胞(DIV12)からRNAzol B(テルテスト社)を用いて全体RNAを分離した。上記分離した全体RNA1μgを[α−33P]dATPで放射性標識してcDNAを合成しねずみ遺伝子濾紙(rat gene filter membranes)(リサーチジェネティックス社)に42℃で12ないし18時間混成反応させた。上記混成反応された濾紙は2×サリンソジウムシトレート(saline sodium citrate)緩衝液及び1% ソジウムドデシルサルフェート(sodium dodecyl sulfate)で50℃で20分間洗浄して、0.5×食塩水ナトリウムシトレート及び1% ナトリウムドデシルサルフェートで室温で15分間洗浄した後、プラスチックラップで包み、ホスホイメージカセット(phosphorimager cassette)に露出させた。遺伝子濾紙を露出した後、混成された形態はマイクロアレイ分析ソフトウェア(PathwaysTM4−universal microarray analysis software)(インビトロゼン社)を用いて分析した。
その結果、BDNFの標的遺伝子は大部分、分化、細胞内移入、代謝及びニューロトロフィンの神経毒性作用を反映する信号伝達において重要な役割をする遺伝子であることが明かになりこれらのうち酸化的毒性に関与する遺伝子としてNADPHオキシダーゼ(oxidase)の発現が増加することがわかるが、この遺伝子は細胞内に活性酸素の先駆物質を作り出すことと知られている。
<7−2> 逆伝写−酵素連鎖重合反応(RT−PCR)を通じたBDNF標的遺伝子の確認
本発明者らは上記実施例<7−1>のcDNA発現マイクロアレイからBDNF−敏感性遺伝子で示された遺伝子として、酸素から過酸化物を生産する前−酸化剤酵素であるNADPHオキシダーゼの小単位であるp22−phox(p22−phox)及びgp91−phox(gp91−phox)からなるシトクロムb558を確認するためにRT−PCRを行った。
本発明者らは上記実施例<7−1>のcDNA発現マイクロアレイからBDNF−敏感性遺伝子で示された遺伝子として、酸素から過酸化物を生産する前−酸化剤酵素であるNADPHオキシダーゼの小単位であるp22−phox(p22−phox)及びgp91−phox(gp91−phox)からなるシトクロムb558を確認するためにRT−PCRを行った。
BDNFを皮質神経細胞に処理した後時間毎にサンプルを採取して全体RNAを分離しcDNAを製造するために1μgの全体RNAを反応混合液(各々2.5mMのdNTP、0.5単位RNasin、100ngオリゴdTプライマー)及び200単位MMLV逆伝写酵素を用いて37℃で1時間反応させた。上記の反応液は92℃で10分間反応させて4℃に移した。逆伝写されたcDNAは公知の方法(宝酒造社)によってPCRを行なった。PCR反応の順序は次のようである。順に、DNAの変性、プライマー結合、長さ延長;p47−phox:94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で60秒で28回、p22−phox(マイクロアレイで行ったシトクロムb558と相同性がある)及びgp91−phox:94℃で45秒、60℃で60秒、72℃から120秒で33回、GAPDH:94℃で35秒、55℃で45秒、72℃で90秒で25回。上記のPCR遂行のとき用いたプライマーは下記の配列番号の塩基配列からなる。p22−phox:配列番号1及び配列番号2、p47−phox:配列番号3及び配列番号4、gp91−phox:配列番号5及び配列番号6、GAPDH:配列番号7及び配列番号8。上記過程を経たPCR産物は1.2% アガロスゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド(ethidium bromide)を用いて視覚化した。mRNAの相対的な量はLAS−1000(富士フォトフィルム社)を用いて測定し、GAPDH mRNAの水準に比べて定量化した。上記RT−PCRで発現の変化が確認された遺伝子のPCRが正確に遂行されたか否かを確認するためにDNA塩基配列分析をした。DNA塩基配列分析はパーキン−エルマーアップライドバイオシステム(Perkin−Elmer Applied Biosystems)に入っているビッグダイターミネータケミストリー(BIg Dye Terminator Chemistry)を用いてDNA配列分析器(ABI PRISMTM 377 DNA sequencer、ポスターシティー社)で行った。
その結果、BDNFを処理した後2時間以内にp22−phox及びgp91−phoxのmRNAの水準が増加し、4時間以後に最高に増加し、以後12時間まで持続された。p47−phox小単位のmRNA水準はBDNFの添加以後30分からだんだん増加した(図8、図9)。
従って、BDNFはNADPHのオキシダーゼの発現を増加させるということがわかる。
<7−3> ウエスタンブロットを通じたBDNF標的蛋白質の分析
本発明者らは、上記実施例<7−2>を通じてBDNFの標的遺伝子として判明されたNADPHオキシダーゼの構成遺伝子が蛋白質にも発現されるか否か確認するためにウエスタンブロットを行った。
本発明者らは、上記実施例<7−2>を通じてBDNFの標的遺伝子として判明されたNADPHオキシダーゼの構成遺伝子が蛋白質にも発現されるか否か確認するためにウエスタンブロットを行った。
100ng/mlBDNFを時間毎に処理して培養された皮質神経細胞は溶解緩衝液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、1% Nonidet P−40、150mM NaCl、0.5% デオキシコール酸(deoxycholic acid)、0.1% SDS、1mM フェニルメチルスルホニルフルオライド(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、10μg/mlペップスタイン A(pepstain A)及び100μg/mlロイペプチン(leupeptin))を用いて溶解させた。25μgの蛋白質を12% SDS−ポリアクリルアミドゲル(SDS−polyacrylamide gel)に電気泳動し、ニトロセルロース膜(nitrocellulose membrane)に移した。上記のブロット(蛋白質が含まれた膜)を2.5% 牛血清アルブミンに入れて1時間反応させ、1:1000割合で希釈した羊多クローン一次抗体、抗−gp91−phox、抗−p67−phoxまたは抗−p47−phox抗体(サンタクルーズ社)で反応させ、バイオティーン化された抗−羊二次抗体で反応させた。免疫反応性はベクタスタイン ABCキット(Vectastain ABC kit)(ベクトルラボラトリ社)及び発色反応器(luminal for enhanced chemiluminescence、ECL)(イントロン社)を用いて確認した。免疫反応が示された信号はLAS−1000システム(富士フォトフィルム社)を用いて定量的濃度を分析した。
その結果、皮質神経細胞でBDNFを添加して培養した後16ないし32時間NADPHオキシダーゼの小単位の構成因子であるgp91−phox、p47−phox及びp67−phox蛋白質発現が増加した(図10)。
従って、BDNFによってNADPHオキシダーゼの遺伝子が発現され、蛋白質に合成されることがわかる。
<7−4>免疫細胞化学分析を通じたBDNF標的遺伝子NADPHのオキシダーゼの発現分析
本発明者らは、上記実施例<7−2>及び<7−3>を通じてBDNFによって発現が増加したNADPHのオキシダーゼの発現を細胞で観察するために免疫細胞化学分析を実施した。
本発明者らは、上記実施例<7−2>及び<7−3>を通じてBDNFによって発現が増加したNADPHのオキシダーゼの発現を細胞で観察するために免疫細胞化学分析を実施した。
100ng/ml BDNFを処理して32時間培養した皮質神経細胞(DIV 12ないし14)は4% パラホルムアルデヒドロで30分間固定化し、10% 馬血清で1時間反応し、神経細胞の指標として用いられるNeuNに対する鼠単一クローン抗体(1:400希釈、ケミコン社)及びp47−phoxまたはp67−phoxに対する山羊多クローン抗体(1:200希釈、サンタクローズ社)で両方−免疫標識して2ないし4時間反応させた。上記反応された細胞はフルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)で結合された抗−羊IgG(1:200希釈、オガトンテクニカ社)及びテキサスレッド(Texas red)で結合された抗−鼠IgG(1:200希釈、ベクトルレバラトリ社)を用いて1ないし2時間反応させた。上記染色された細胞で蛍光を帯びた映像を集めてリアル−14TMプレシジョンデジタルカメラ(Real−14TMprecision digital camera)(アポジーインストルメント社) 及びイメージプロプラスプラグイン(ImagePro Plus Plug−in)(シルバースプリング社)を装着した蛍光顕微鏡(ジェイス社)を用いて分析した。
その結果、皮質神経細胞にBDNFを処理して32時間培養した神経細胞は対照群に比べてp47−phox及びp67−phoxの信号がかなり増加し、これは神経細胞を表すNeuNのある細胞のみで増加したことから神経細胞から蛋白質発現が増加したことがわかる(図11、図12)。
<7−5> BDNFを処理した細胞内部の分画によるNADPHのオキシダーゼの発現分析
本発明者らは、NADPHオキシダーゼの活性化は細胞質のp47−phox及びp67−phoxの小単位を細胞質膜に移動させることと関連があるため(Clark et al.,1989,Trans.Assoc.Am.Physicians.,102,224−230)、BDNFを処理した皮質神経細胞の細胞質及び細胞質膜の分画を用いてNADPHオキシダーゼが活性化されたかを確認しようとした。
本発明者らは、NADPHオキシダーゼの活性化は細胞質のp47−phox及びp67−phoxの小単位を細胞質膜に移動させることと関連があるため(Clark et al.,1989,Trans.Assoc.Am.Physicians.,102,224−230)、BDNFを処理した皮質神経細胞の細胞質及び細胞質膜の分画を用いてNADPHオキシダーゼが活性化されたかを確認しようとした。
培養した大脳皮質神経細胞(DIV12)に100ng/ml BDNFを時間毎に処理した後冷たいPBSで洗浄し、等張液(10mM HEPES(pH 8.0)、250mM スクロース(sucrose)、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT、2mM PMSF、100μg/ml ロイペプチン及び10μg/ml ペプスタチンA)に懸濁して溶解させた。細胞質及び細胞質膜の分画を分離するために、上記溶解液をホモジナイザー(homogenizer)(コンテ社)を用いて均質化し、9、000gで10分間遠心分離し、上等液を100、000gで1時間遠心分離した。遠心分離後、ペレットを50μl溶解緩衝液で懸濁して細胞質膜の分画を収得し、上等液から細胞質分画を収得した。
上記方法で収得した細胞質及び細胞質膜の分画から蛋白質を分離してp47−phox及びp67−phoxの抗体を用いて上記実施例<7−4>で提示した方法でウエスタンブロットを行った。
その結果、皮質神経細胞の細胞質分画ではp47−phox及びp67−phox蛋白質水準は減少したが、上記皮質神経細胞の細胞質膜分画ではp47−phox及びp67−phox蛋白質が増加した(図13)。
従って、BDNFを処理すれば細胞質膜でNADPHのオキシダーゼの発現が増加して、細胞内に活性酸素種の発生が増加して酸化的毒性が起こることがわかる。
<実施例8> BDNFを処理した細胞でのNADPHオキシダーゼの活性測定
本発明者らは、BDNFを処理した細胞で発現が増加したNADPHオキシダーゼの活性が増加するかを分析するために、NADPHオキシダーゼの活性によって生成される過酸化生成物を測定した。
本発明者らは、BDNFを処理した細胞で発現が増加したNADPHオキシダーゼの活性が増加するかを分析するために、NADPHオキシダーゼの活性によって生成される過酸化生成物を測定した。
過酸化生成物はシトクロムcの減少を測定して定量力学分析をすることによって測定した(Mayo and Curnutte.,1990,Method Enzymol.,186、567−575)。未処理、100ng/ml BDNFまたは100ng/mlBDNF及び3nM ジフェニレンヨードニウム(diphenylen iodonium、以下「DPI」と称す)を処理して培養した後、各時間毎に皮質神経細胞をPBSに懸濁し、反応混合液(0.9mM CaCl2、0.5mM MgCl2及び7.5mm グルコース(glucose))、75μM シトクロムc(シグマ社)及び60μg/ml スーパーオキシドジスムターゼ(superoxide dismutase、SOD)(シグマ社)を添加して37℃で3分間反応させた。サーモマックスマイクロプレート判読機(Thermomax microplate reader)及びSOFTMAX Version 2.02 ソフトウェア(モルキュラデバイス社)を用いて550nmの波長でシトクロムcの吸光度を測定して過酸化生成物を確認した。
その結果、BDNFを処理した後時間が経るにつれて過酸化物の生産が増加し、NADPHオキシダーゼの抑制剤であるDPIを処理した際過酸化物が生成されない様相を見せた(図14)。{平均±SEM(各条件当りウェルの数、n=12)。*;比較対照群(洗浄した対照群)と相当な差があるもので、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP<0.05で大きい差を見せる結果}
従って、BDNFによってNADPHオキシダーゼが活性化されこれによって過酸化物が生成されるが、これはNADPHオキシダーゼの抑制剤によって遮断されることがわかる。
従って、BDNFによってNADPHオキシダーゼが活性化されこれによって過酸化物が生成されるが、これはNADPHオキシダーゼの抑制剤によって遮断されることがわかる。
<実施例9> NADPHオキシダーゼによるROS生成の確認
NADPHオキシダーゼによってROSが生成されると報告されたので、本発明者らはBDNFを処理して活性化されたNADPHオキシダーゼによってROSが生成されるかを確かめようとした。
NADPHオキシダーゼによってROSが生成されると報告されたので、本発明者らはBDNFを処理して活性化されたNADPHオキシダーゼによってROSが生成されるかを確かめようとした。
皮質神経細胞を洗浄し、100ng/ml BDNFを処理し、100ng/ml BDNF及び3nM DPIを処理して32時間培養した後、上記実施例5の方法によってHEt及びDCDHFが各々エチジウム及びDCFに酸化されるのを測定することによって、NADPHオキシダーゼの活性を通じたROS生成能力を測定した。
その結果、BDNFを処理した細胞ではHEt及びDCFの発現が全て増加し、BDNF及びNADPHオキシダーゼの抑制剤であるDPIを処理すると上記HEt及びDCFの生成が全て抑制された(図15)。
従って、BDNFはNADPHオキシダーゼを媒介とした過酸化物の生産を通じて皮質神経で酸化的ストレスを生産することがわかる。
<実施例10> NADPHオキシダーゼの阻害剤処理によるBDNFによって誘導される細胞壊死の抑制
本発明者らは、NADPHオキシダーゼの阻害剤がBDNFによって誘導される神経細胞壊死を抑制するか否かを確かめようとした。
本発明者らは、NADPHオキシダーゼの阻害剤がBDNFによって誘導される神経細胞壊死を抑制するか否かを確かめようとした。
皮質神経細胞に、100ng/ml BDNF、100ng/ml BDNF及び3nM DPI、100ng/ml BDNF及び10μM AEBSF(4−(2−amonoethyl)−benzensulfonyl fluoride(以下「AEBSF」と称す)または1μM 2−ヒドロキシ−TTBA(2−Hydroxy−5−(2,3,5,6−tetrafluoro−4−trifluoromethyl−benzylamino)−benzoic acid、以下「2−ヒドロキシ−TTBA」と称す)を処理して36時間培養した後培養培地に排出されるLDHを測定して神経細胞壊死を分析した。
その結果、皮質神経細胞にBDNFのみを処理したときより、3ないし10nM DPI、10ないし30μM AEBSF(NADPH オキシダーゼの阻害剤)、または1μM 2−ヒドロキシ−TTBAをBDNFと同時に処理した場合、神経細胞の壊死が抑制された(図16)。{平均±SEM(各条件当りウェルの数、n=16)。*;比較対照群(BDNFのみ処理した対照群)と相当な差があるもので、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP<0.05で大きい差を見せる結果}。
従って、NADPHオキシダーゼの抑制剤はBDNFによって誘導される細胞壊死を抑制するので、BDNFによる細胞壊死はNADPHオキシダーゼによって媒介されることがわかる。
<実施例11> BDNFによる細胞枯死の抑制に及ぼす影響
本発明者らは、BDNFが細胞枯死(necrosis)を抑制すると知られており、BDNFの作用を抑制できる抑制剤を用いてBDNFによって誘導される細胞枯死の抑制にも影響を与えるかを観察することにした。
本発明者らは、BDNFが細胞枯死(necrosis)を抑制すると知られており、BDNFの作用を抑制できる抑制剤を用いてBDNFによって誘導される細胞枯死の抑制にも影響を与えるかを観察することにした。
純粋培養した大脳皮質神経細胞に血清(serum)を除去した後100ng/ml BDNF、100ng/ml BDNF及び3nM DPI、3nM DPI、100ng/ml BDNF及び100μM トロロックスまたは100μM トロロックスを処理して、神経細胞枯死が抑制されるかを確認するために、24ないし48時間に生存する神経の数を数えて細胞枯死を分析した。血清を除去した状態での実験をするために、純粋培養神経細胞(DIV7)を血清がなく、MEMに21mM グルコース、26.5mM 重炭酸と1μM MK−801を入れた培地(Gwag et al.,1995,Neuroreport,7,93−96)で培養した。
その結果、BDNFは24時間では神経細胞の枯死を有効に抑制したが48では神経細胞の枯死を抑制することができず細胞膨張を伴った神経細胞の壊死様相を示した。また、DPIまたはトロロックスそのものでは血清除去で誘導された神経細胞枯死を抑制できなかった。なお、BDNFを処理することによって起こる神経細胞枯死の抑制は、DPIまたはトロロックスを同時に共に処理することによって24時間と48時間で有効に抑制された(図17)。{平均±SEM(各条件当り4個のウェルから任意に選択した部位の数、n=16).* ;比較対照群(血清を除去した対照群)と相当な差があるもので、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP<0.05で大きい差を見せる結果}。
従って、BDNFは細胞枯死を有効に抑制するが時間が経るにつれて細胞の壊死を誘導し、BDNFが起こす細胞枯死を調節するメカニズムは独立的に起こることがわかる。上記結果からNADPHオキシダーゼの発現と活性を通じてBDNFによる細胞の壊死が誘導されることがわかる。また、BDNFの抑制剤はBDNFによる細胞枯死の抑制に影響を与えないながらもBDNFによる細胞壊死の誘導を抑制できることがわかる。
従って、BDNFは細胞枯死を有効に抑制するが時間が経るにつれて細胞の壊死を誘導し、BDNFが起こす細胞枯死を調節するメカニズムは独立的に起こることがわかる。上記結果からNADPHオキシダーゼの発現と活性を通じてBDNFによる細胞の壊死が誘導されることがわかる。また、BDNFの抑制剤はBDNFによる細胞枯死の抑制に影響を与えないながらもBDNFによる細胞壊死の誘導を抑制できることがわかる。
以上で観察したように、本発明の酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導された細胞壊死を抑制し、酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンとを同時に処理すれば細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制させることができて細胞壊死及び細胞枯死と関連した疾患の予防に有用に用いられ得ることがわかる。
以下、本発明の酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンが適用され得る具体的な疾患に対して説明する。
<適用例1> アルツハイマー(Alzheimer’s diseasE:AD)
アルツハイマーは大脳皮質及び海馬にあるグルタミン性ニューロン(glutamatergic neurons)と前脳基底にあるコリン性神経細胞(cholinergic neurons)の壊死を伴い、神経細胞外のアミロイドプラーク(amyloid plaque)と神経細胞内の神経繊維の絡み合い(neurofibrillary tangles)とが共通的な現象として見られる。ニューロトロフィンであるNGFはコリン性神経細胞の生存と機能を増進させることが明かになり、アルツハイマーの治療剤として提示されている(Hefti,1994,J Neurobiol.,25,1418−1435)。しかし、過度な量の活性酸素による脂質過酸化(lipid peroxidation)、8−ヒドロキシデオキシグアノシン(8−hydroxy deoxyguanosine)、蛋白質カルボニル(protein carbonyls)、窒化(nitration)、蛋白質の酸化的交差結合(oxidative crosslinking of proteins)などがアルツハイマー病で増加していると知られている(Vitek et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,4766−4770;Smith et al.,1995,Trends.Neurosci .,18,172−176,Smith et al.,1996,Mol.Chem.Neuropathol.,28,41−48,Smith et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94,9866−9868;Montine et al.,1996,J.Neuropathol.Exp.Neurol.,55,202−210)。亜鉛はアルツハイマー病患者の脳(amygdala,hippocampus,inferior parietal lobule,superior and middle temporal gyri)で増加しており、主にアミロイドプラークの中心と周辺でさらに多く観察された(Lovell et al.,1998、J.Neurol.Sci.,158,47−52)。従って、酸化的毒性及び亜鉛毒性による神経細胞壊死の防御効果を示す本発明による化合物はニューロトロフィンと共にアルツハイマー病の治療剤として用いられ得る。
アルツハイマーは大脳皮質及び海馬にあるグルタミン性ニューロン(glutamatergic neurons)と前脳基底にあるコリン性神経細胞(cholinergic neurons)の壊死を伴い、神経細胞外のアミロイドプラーク(amyloid plaque)と神経細胞内の神経繊維の絡み合い(neurofibrillary tangles)とが共通的な現象として見られる。ニューロトロフィンであるNGFはコリン性神経細胞の生存と機能を増進させることが明かになり、アルツハイマーの治療剤として提示されている(Hefti,1994,J Neurobiol.,25,1418−1435)。しかし、過度な量の活性酸素による脂質過酸化(lipid peroxidation)、8−ヒドロキシデオキシグアノシン(8−hydroxy deoxyguanosine)、蛋白質カルボニル(protein carbonyls)、窒化(nitration)、蛋白質の酸化的交差結合(oxidative crosslinking of proteins)などがアルツハイマー病で増加していると知られている(Vitek et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,4766−4770;Smith et al.,1995,Trends.Neurosci .,18,172−176,Smith et al.,1996,Mol.Chem.Neuropathol.,28,41−48,Smith et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94,9866−9868;Montine et al.,1996,J.Neuropathol.Exp.Neurol.,55,202−210)。亜鉛はアルツハイマー病患者の脳(amygdala,hippocampus,inferior parietal lobule,superior and middle temporal gyri)で増加しており、主にアミロイドプラークの中心と周辺でさらに多く観察された(Lovell et al.,1998、J.Neurol.Sci.,158,47−52)。従って、酸化的毒性及び亜鉛毒性による神経細胞壊死の防御効果を示す本発明による化合物はニューロトロフィンと共にアルツハイマー病の治療剤として用いられ得る。
<適用例2> パーキンソン病(Parkinson’s disease)
パーキンソン病は黒質に存在するドーパミン神経細胞の壊死が伴って、伸展、筋肉硬直、運動緩徐、非正常的姿勢、運動不能などの多様な症状を表す退行性神経系疾患である。神経細胞壊死の主要原因として酸化的毒性が提示されているが、脂質過酸化(lipid peroxidation)、DNA酸化(DNA oxidation)、蛋白質カルボニル及びニトロチロシン(protein carbonyl,nitrotyrosine)の増加が黒質で発見される。また、パーキンソン病の動物モデルで細胞枯死の証拠が報告され(Tatton and Kish,1997,Neuroscience,77,1037−1048;He et al.,2000,Brain Research,858,163−166;turmel et al.,2001,mov.Disord.,16,185−189) ニューロトロフィンであるBDNFやGDNF(Glial cell−derived neurotrophic factor)がパーキンソン病の細胞枯死を選択的に抑制して神経細胞を保護すると報告されたので(Bradford et al.,1999,Adv.Nerurol.,80,19−25;Levivier et al.,1995,J.Neurosci .,15,7810−7820;Olson,1996,Nat.Med.,2,400−401;Gash et al.,1996,Nature,380,252−255) 本発明で記述したニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤はパーキンソン病の治療に非常に有効に用いられ得る。
パーキンソン病は黒質に存在するドーパミン神経細胞の壊死が伴って、伸展、筋肉硬直、運動緩徐、非正常的姿勢、運動不能などの多様な症状を表す退行性神経系疾患である。神経細胞壊死の主要原因として酸化的毒性が提示されているが、脂質過酸化(lipid peroxidation)、DNA酸化(DNA oxidation)、蛋白質カルボニル及びニトロチロシン(protein carbonyl,nitrotyrosine)の増加が黒質で発見される。また、パーキンソン病の動物モデルで細胞枯死の証拠が報告され(Tatton and Kish,1997,Neuroscience,77,1037−1048;He et al.,2000,Brain Research,858,163−166;turmel et al.,2001,mov.Disord.,16,185−189) ニューロトロフィンであるBDNFやGDNF(Glial cell−derived neurotrophic factor)がパーキンソン病の細胞枯死を選択的に抑制して神経細胞を保護すると報告されたので(Bradford et al.,1999,Adv.Nerurol.,80,19−25;Levivier et al.,1995,J.Neurosci .,15,7810−7820;Olson,1996,Nat.Med.,2,400−401;Gash et al.,1996,Nature,380,252−255) 本発明で記述したニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤はパーキンソン病の治療に非常に有効に用いられ得る。
<適用例3> ルーゲリック病(Amyotrophic lateral sclerosis)
筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)は、主に脊髓神経の下位運動ニューロン(lower motor neuron)から始まって次第に上位運動ニューロン(upper motor neuron)へと進んで、大脳皮質、脳幹、脊髓の運動神経細胞の損傷を伴い、筋萎縮、呼吸筋力の弱化及び繊維束性攣縮が特徴的に現れ、症状が初めて観察されてから2〜5年内に死亡する。特に、遺伝的筋萎縮性側索硬化症病患者で染色体21番(chromosome 21)に位置するスーパーオキシドラジカル(superoxide radical)を除去してくれるSOD−1遺伝子で変異が観察されて酸化的毒性が現れて患者の脳で相和的毒性の指標である蛋白質カルボニル群が増加していると報告された(Bowling et al.,1993、J.Neurochem.,61、2322−2325)。最近ニューロトロフィンの一種であるBDNFをルーゲリックを治療するための臨床実験に適用した結果、治療効果を観察できなかったが(Apfel et al.,2001,Clin.Chem.Lab.Med.,39(4),351−5)、BDNF自体による酸化的毒性の結果とも関連があると推測される。したがって、酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを用いればルーゲリック病をさらに有効に治療できる。
筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)は、主に脊髓神経の下位運動ニューロン(lower motor neuron)から始まって次第に上位運動ニューロン(upper motor neuron)へと進んで、大脳皮質、脳幹、脊髓の運動神経細胞の損傷を伴い、筋萎縮、呼吸筋力の弱化及び繊維束性攣縮が特徴的に現れ、症状が初めて観察されてから2〜5年内に死亡する。特に、遺伝的筋萎縮性側索硬化症病患者で染色体21番(chromosome 21)に位置するスーパーオキシドラジカル(superoxide radical)を除去してくれるSOD−1遺伝子で変異が観察されて酸化的毒性が現れて患者の脳で相和的毒性の指標である蛋白質カルボニル群が増加していると報告された(Bowling et al.,1993、J.Neurochem.,61、2322−2325)。最近ニューロトロフィンの一種であるBDNFをルーゲリックを治療するための臨床実験に適用した結果、治療効果を観察できなかったが(Apfel et al.,2001,Clin.Chem.Lab.Med.,39(4),351−5)、BDNF自体による酸化的毒性の結果とも関連があると推測される。したがって、酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを用いればルーゲリック病をさらに有効に治療できる。
<適用例4> 虚血性脳卒中(Hypoxic−ischemic injury)
脳卒中は脳の血液循環障害(血栓症、塞栓症、狹窄症)によって一定な量で供給される葡萄糖及び酸素が乏しいことによって起こる疾患であって、損傷を受けた脳による身体機能調節の損失によって、麻痺症状、言語及び認知機能の障害が発生する。脳卒中が起こった後細胞膜の脱極性(membrane depolarization)によって細胞内にカルシウムが流入されると、これがまたミトコンドリアに流入されて呼吸体系(repiratory chain)が損傷され活性酸素の生成が増加して細胞内に活性酸素が過量積もるようになる。生成された活性酸素は、細胞膜脂質の破壊、遺伝子の損傷、蛋白質変性などを誘導して神経細胞の壊死が起こり、これに対して抗酸化剤は虚血性神経細胞の壊死を抑制する効果がある(Holtzman et al.,1996,Ann.Neurol.,39(1),114−122;Ferrer et al.,2001,Acta neuropathol.(Berl.),101(3),229−38;Hall et al.,1990,Stroke,21,11183−11187)。また、これ以外にも脳卒中後虚血部位(ischemic area)の半陰影地域(penumbra zone)でDNAラダー(ladder)とTUNEL染色のような細胞枯死の特徴も観察されることから細胞の枯死と壊死とが同時に起こることがわかる。従って、本発明のニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤が脳卒中を効率的に予防、治療できる。
脳卒中は脳の血液循環障害(血栓症、塞栓症、狹窄症)によって一定な量で供給される葡萄糖及び酸素が乏しいことによって起こる疾患であって、損傷を受けた脳による身体機能調節の損失によって、麻痺症状、言語及び認知機能の障害が発生する。脳卒中が起こった後細胞膜の脱極性(membrane depolarization)によって細胞内にカルシウムが流入されると、これがまたミトコンドリアに流入されて呼吸体系(repiratory chain)が損傷され活性酸素の生成が増加して細胞内に活性酸素が過量積もるようになる。生成された活性酸素は、細胞膜脂質の破壊、遺伝子の損傷、蛋白質変性などを誘導して神経細胞の壊死が起こり、これに対して抗酸化剤は虚血性神経細胞の壊死を抑制する効果がある(Holtzman et al.,1996,Ann.Neurol.,39(1),114−122;Ferrer et al.,2001,Acta neuropathol.(Berl.),101(3),229−38;Hall et al.,1990,Stroke,21,11183−11187)。また、これ以外にも脳卒中後虚血部位(ischemic area)の半陰影地域(penumbra zone)でDNAラダー(ladder)とTUNEL染色のような細胞枯死の特徴も観察されることから細胞の枯死と壊死とが同時に起こることがわかる。従って、本発明のニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤が脳卒中を効率的に予防、治療できる。
<適用例5> 退行性脊椎損傷(Chronic spinal cord injury)
脊椎の損傷は下半身麻痺と四肢麻痺を起こして損傷部位から遠い距離にある部位まで神経細胞の壊死が観察されるが、これに対する治療剤や治療法が開発されていない実情である。脊椎損傷にはCa2+の流入、細胞膜の崩壊、酸化的毒性による脂質の過酸化が観察されると報告され(Brown and Hall,1992,J.Am.Vet.Med.Assoc.,200,1849−1859;Springer et al.,1997,J.Neurochem.,68,2469−2476;Juurlink and Paterson,1998,J.Spinal cord Med.,21,309−334)、最近には細胞の壊死が2次損傷に関与するという証拠が提示されており、細胞壊死に関与する酵素であるカスパーゼ(caspase)に対する抑制剤が神経細胞の壊死を減少させると報告された(Zhang et al.,1990,J.Neurochem.,59,733−739)。従って、ニューロトロフィンの神経保護作用と、酸化的毒性抑制剤が有したニューロトロフィンの短所を補完する役割を通じて退行性脊椎損傷の治療に有効に用いられ得る(Jin et al.,2002,Exp.Neurol.,177(1),265−75)。
脊椎の損傷は下半身麻痺と四肢麻痺を起こして損傷部位から遠い距離にある部位まで神経細胞の壊死が観察されるが、これに対する治療剤や治療法が開発されていない実情である。脊椎損傷にはCa2+の流入、細胞膜の崩壊、酸化的毒性による脂質の過酸化が観察されると報告され(Brown and Hall,1992,J.Am.Vet.Med.Assoc.,200,1849−1859;Springer et al.,1997,J.Neurochem.,68,2469−2476;Juurlink and Paterson,1998,J.Spinal cord Med.,21,309−334)、最近には細胞の壊死が2次損傷に関与するという証拠が提示されており、細胞壊死に関与する酵素であるカスパーゼ(caspase)に対する抑制剤が神経細胞の壊死を減少させると報告された(Zhang et al.,1990,J.Neurochem.,59,733−739)。従って、ニューロトロフィンの神経保護作用と、酸化的毒性抑制剤が有したニューロトロフィンの短所を補完する役割を通じて退行性脊椎損傷の治療に有効に用いられ得る(Jin et al.,2002,Exp.Neurol.,177(1),265−75)。
<適用例6> ハンチングトン病(Huntington ’s disease)
ハンチングトン病は線状プロジェクションニューロン(striatal projection neuron)が選択的に枯死する退行性脳疾患であって、神経細胞枯死に活性酸素が関与し、ニューロトロフィンの生成を誘導したり外部からニューロトロフィンを投与することによって病の進行を抑制できると知られている。最近は、GDNFやBDNFなどのようなニューロトロフィンを生成するように遺伝的に造作された神経細胞を線状ニューロンに注入した場合、ハンチングトン病動物モデルの神経細胞枯死を減少させるという研究結果もある(Perez−Navarro et al.,2000,J.Neurochem.,75(5),2190−9)。従って、ニューロトロフィンを酸化的毒性抑制剤と共に投与するとハンチングトン病の治療及び予防に有効に用いられ得ることがわかる。
ハンチングトン病は線状プロジェクションニューロン(striatal projection neuron)が選択的に枯死する退行性脳疾患であって、神経細胞枯死に活性酸素が関与し、ニューロトロフィンの生成を誘導したり外部からニューロトロフィンを投与することによって病の進行を抑制できると知られている。最近は、GDNFやBDNFなどのようなニューロトロフィンを生成するように遺伝的に造作された神経細胞を線状ニューロンに注入した場合、ハンチングトン病動物モデルの神経細胞枯死を減少させるという研究結果もある(Perez−Navarro et al.,2000,J.Neurochem.,75(5),2190−9)。従って、ニューロトロフィンを酸化的毒性抑制剤と共に投与するとハンチングトン病の治療及び予防に有効に用いられ得ることがわかる。
<適用例7> 緑内障(Glaucoma)及び網膜退化(Renal detachment)
網膜退化の主要原因としては、虚血による退化と神経栄養因子の欠乏による網膜神経細胞の退化があり、退化のメカニズムは複合的に現れる。虚血による網膜神経細胞の枯死の過程は、眼圧の増加(緑内障、Glaucoma)によって網膜への血流が塞がれたり減少するようになり、虚血状態になって自由ラジカルの生成によって網膜神経細胞は枯死するようになる(Ko et al.,2000,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,41(10),2967−71)。視神経切断による網膜退化動物モデルがあるが、これはニューロトロフィンの欠乏と細胞枯死のモデルとして知られている。上記モデルは網膜神経節細胞の退化を誘導するが、退化過程はゆっくり起こり視神経切断後14日後に約80%以上の神経節細胞が退化されると知られており、視神経切断による神経細胞の退化はニューロトロフィンの欠乏によって神経節細胞の反応が消えることによって起ころと報告された(Lewis et al.,1999,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,40(7),1530−1544)。従って、このような視神経細胞の枯死を防止するためには、ニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤を複合的に処理することが治療に非常に効果的であろうと期待される。
網膜退化の主要原因としては、虚血による退化と神経栄養因子の欠乏による網膜神経細胞の退化があり、退化のメカニズムは複合的に現れる。虚血による網膜神経細胞の枯死の過程は、眼圧の増加(緑内障、Glaucoma)によって網膜への血流が塞がれたり減少するようになり、虚血状態になって自由ラジカルの生成によって網膜神経細胞は枯死するようになる(Ko et al.,2000,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,41(10),2967−71)。視神経切断による網膜退化動物モデルがあるが、これはニューロトロフィンの欠乏と細胞枯死のモデルとして知られている。上記モデルは網膜神経節細胞の退化を誘導するが、退化過程はゆっくり起こり視神経切断後14日後に約80%以上の神経節細胞が退化されると知られており、視神経切断による神経細胞の退化はニューロトロフィンの欠乏によって神経節細胞の反応が消えることによって起ころと報告された(Lewis et al.,1999,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,40(7),1530−1544)。従って、このような視神経細胞の枯死を防止するためには、ニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤を複合的に処理することが治療に非常に効果的であろうと期待される。
〔産業上の利用可能性〕
本発明の酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制し、ニューロトロフィンによる細胞枯死の抑制を遮断しなくて、ニューロトロフィンと共に処理する場合、細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制することができ、虚血性脳卒中、退行性脊椎損傷、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、ハンチングトン病、緑内障、及び網膜剥離などの神経疾患を治療または予防するのに有用に用いられ得る。
本発明の酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制し、ニューロトロフィンによる細胞枯死の抑制を遮断しなくて、ニューロトロフィンと共に処理する場合、細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制することができ、虚血性脳卒中、退行性脊椎損傷、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、ハンチングトン病、緑内障、及び網膜剥離などの神経疾患を治療または予防するのに有用に用いられ得る。
また、本発明はベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有するニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を提供する。
また、本発明はベンジルアミノサリチル酸誘導体及びニューロトロフィンを有効成分として含有する細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤を提供する。
本発明の酸化的毒性(oxidative stress)抑制剤は、NADPHオキシダーゼの阻害剤(NADPH oxidase inhibitor)、ビタミンEとその誘導体及びベンジルアミノサリチル酸(benzylaminosalicylic acid)誘導体からなる群より選択されるのが望ましい。上記でNADPHオキシダーゼの阻害剤は、ジフェニレンヨードニウム(DPI)及び4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライド(AEBSF)からなる群より選択される一つ以上であることが望ましく、ビタミンEの誘導体はトロロックス(trolox)であることが望ましくて、ベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、BAS(5−benzylaminosalicylic acid),TBAS(5−(4−trifluoromethylbenzyl) aminosalicylic acid),NBAS(5−(4−nitrobenzyl)aminosalicylic acid),CBAS(5−(4−chlorobenzyl)aminosalicylic acid),MBAS(5−(4−methoxybenzyl)aminosalicylic acid),FBAS(5−(4−fluorobenxyl)aminosalicylic acid)及び2−hydroxy−TTBA(2−Hydroxy−5−(2,3,5,6−tetrafluoro−4−trifluoromethyl− benzylamino)−benzoic acid、以下「2−ヒドロキシ−TTBA」と称す)からなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。
本発明のニューロトロフィン(neurotrophin)は、NGF(nerve growth factor)、BDNF(brain derived−neurotrophic factor)、ニューロトロフィン(NT)−3、またはニューロトロフィン(NT)−4/5であることが望ましくて、BDNFであることがさらに望ましい。
NADPHオキシダーゼの阻害剤であるジフェニレンヨードニウム(DPI)または4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライド(AEBSF)を処理すると、BDNFによって誘導されるNADPHオキシダーゼの活性を抑制してROSの生成を減少させ、細胞壊死を抑制して、ビタミンEまたはその誘導体であるトロロックスを処理すると抗酸化作用によってBDNFによって誘導された細胞壊死を抑制する。また、ベンジルアミノサリチル酸誘導体であるBAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−ヒドロキシ−TTBAは抗酸化作用をする物質であって酸化的毒性を抑制して細胞壊死を抑制する(国際特許公開:WO01/79153号)。
本発明の酸化的毒性抑制剤は、NADPHオキシダーゼの阻害剤、ビタミンE誘導体及びベンジルアミノサリチル酸誘導体からなる群より選択されるのが望ましい。上記でNADPHオキシダーゼの阻害剤は、ジフェニレンヨードニウム(DPI)及び4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニルフルオライド(AEBSF)からなる群より選択される一つ以上であることが望ましく、ビタミンEの誘導体はトロロックスであることが望ましくて、ベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−ヒドロキシ−TTBAからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。
また、本発明はベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有するニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を提供する。
上記で見たように酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する。従って、酸化的毒性抑制剤であるベンジルアミノサリチル酸誘導体を用いてニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を製造することができる。本発明のベンジルアミノサリチル酸誘導体は、BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−ヒドロキシ−TTBAからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。本発明のニューロトロフィンは、NGF、BDNF、ニューロトロフィン(NT)−3、またはNT−4/5であることが望ましくて、BDNFであることがさらに望ましい。
Claims (13)
- 酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞死滅を抑制する方法。
- 上記の方法は酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを共に投与することを特徴とする請求項1に記載の細胞死滅を抑制する方法。
- 上記ニューロトロフィンは、NGF、BDNF、ニューロトロフィン−3及びNT−4/5からなる群より選択されることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の方法。
- 上記ニューロトロフィンはBDNFであることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の方法。
- 上記酸化的毒性抑制剤は、NADPHオキシダーゼの阻害剤、ビタミンEまたはその誘導体及びテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体からなる群より選択されることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の方法。
- 上記NADPHオキシダーゼの阻害剤はジフェニレンヨードニウム(DPI)及び4−(2−アミノエチル)−ベンゼルスルホニルフルオライド(AEBSF)からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 上記ビタミンEの誘導体はトロロックスであることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 上記テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体は、BAS(5−benzylaminosalicylic acid),TBAS(5−(4−trifluoromethylbenzyl) aminosalicylic acid),NBAS(5−(4−nitrobenzyl) aminosalicylic acid),CBAS(5−(4−chlorobenzyl) aminosalicylic acid),MBAS(5−(4−methoxybenzyl) aminosalicylic acid),FBAS(5−(4−fluorobenxyl) aminosalicylic acid)及び2−hydroxy−TTBA(2−Hydroxy−5−(2,3,5,6−tetrafluoro−4−trifluoromethyl− benzylamino)−benzoic acid)からなる群より選択される一つ以上であるであることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 上記方法は、虚血性脳卒中、退行性脊椎損傷、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、ハンチングトン病、緑内障または網膜剥離の治療または予防に用いることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 上記細胞死滅は細胞壊死及び/または細胞枯死であることを特徴とする 請求項1または請求項2に記載の方法。
- BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS及び2−hydroxy−TTBAからなるテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体から選択された一つ以上を有効成分として含有するニューロトロフィンによって誘導された細胞死滅抑制剤。
- 上記抑制剤は、有効成分のニューロトロフィンをさらに含有することを特徴とする請求項11に記載の細胞死滅抑制剤。
- 上記細胞死滅は、細胞壊死及び/または細胞枯死であることを特徴とする請求項11または請求項12に記載の細胞死滅抑制剤。
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