JP2006515370A

JP2006515370A - ニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死の抑制方法

Info

Publication number: JP2006515370A
Application number: JP2006500641A
Authority: JP
Inventors: ジュクァク，ビョン; ファヨン，ソン; キム，ソン−ヒー; ジュンウォン，ソック
Original assignee: Neurotech Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Neurotech Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2003-01-20
Filing date: 2004-01-20
Publication date: 2006-05-25
Also published as: WO2004064844A1; EP1592429A4; EP1592429A1; WO2004064844A9; CN1738627A; KR20040066639A; US20060135600A1; US7608585B2; KR100522188B1; CA2518888A1; AU2004206187A1

Abstract

本発明はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制方法に関するものであって、より具体的には酸化的毒性抑制剤を投与して細胞壊死を抑制する方法及び上記酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを共に投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法に関するものである。本発明の酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される神経細胞の壊死を抑制し、ニューロトロフィンによる神経細胞の枯死又は予定死の抑制効果に影響を与えないため、上記酸化的毒性抑制剤をニューロトロフィンと共に投与すれば、脳卒中、外傷性脳脊椎の損傷による急性脳疾患、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病などの退行性脳疾患で現れる脳細胞の損傷を予防し再生を促進できる。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法に関するものであって、より具体的には酸化的毒性抑制剤を投与して細胞壊死を抑制する方法及び酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法に関する。

〔背景技術〕
中枢神経及び末梢神経は標的細胞から分泌される神経成長因子であるニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）の持続的な供給によって生存する（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，１９８７，ＥＭＢＯＪ．，６，１１４５−１１５４；Ｂａｒｄｅ，１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３９０，４５−５６）。ニューロトロフィンの作用はチロシンキナーゼ活性を有したニューロトロフィン受容体親和度が高いＴｒｋＡ、ＴｒｋＢまたはＴｒｋＣと結合することによって始まる（ＰａｔａｐｏｕｔｉａｎａｎｄＲｅｉｃｈａｒｄｔ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１１，２７２−２８０；ＫａｐｌａｎａｎｄＭｉｌｌｅｒ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１０，３８１−３９１）。Ｔｒｋチロシンキナーゼは、小脳顆粒、皮質、海馬、交感神経及び感覚神経のような多様な神経の生存に重要な役割を果たす小さいＧＴＰ−結合蛋白質であるＲａｓ、ＰＩ−３Ｋ及びＰＬＣγを活性化させる（Ｂｏｒａｓｉｏｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２１，６６５−６７２；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｅｔａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ，１２，６９１−７０５；ＹａｏａｎｄＣｏｏｐｅｒ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２６７，２００３−２００６；Ｎｏｂｅｓｅｔａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．，７０，１０６７−１０７９；Ｎｏｎｏｍｕｒａｅｔａｌ．，１９９６，ＢｒａｉｎＲｅｓＤｅｖＢｒａｉｎＲｅｓ．，９７，４２−５０；Ａｌｃａｎｔａｒａｅｔａｌ．，１９９７，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．，１７（１０），３６２３−３６３３；Ｈｅｔｍａｎｅｔａｌ．，１９９９，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２７４，２２５６９−２２５８０；Ａｔｗａｌｅｔａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｎ．，２７，２６５−２２７）。

ニューロトロフィンは正常的な神経系の分化過程の間、細胞の枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）または予定死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ）を制御して神経細胞の生存を増進させる（Ｂａｒｄｅ，１９９４，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３９０，４５−５６；ＤｅｓｈｍｕｋｈａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５１，８９７−９０６）。ニューロトロフィンの神経細胞保護効果は多様な形態の神経系脳疾患のモデルにおいて証明されている。例えば、ニューロトロフィンは生体内軸索切断術の実験による前脳基底のコリン性神経細胞、網膜神経節神経細胞、脊髓感覚及び運動神経細胞の退化を抑制すると報告された（Ｈｅｆｔｉ，１９８６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，６，２１５５−２１６２；Ｙａｎｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２４，１５５５−１５７７；ＭｅｙａｎｄＴｈａｎｏｓ，１９９３，ＢｒａｉｎＲｅｓ．，６０２，３０４−３１７；Ｍｏｒｓｅｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３，４１４６−４１５６；Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２５，９５３−９５９；Ｆｒｉｅｄｍａｎｅｔａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５，１０４４−１０５６）。神経成長因子（ＮＧＦ）、脳−由来神経性因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，以下「ＢＤＮＦ」と称す）及びニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ、以下「ＮＴ」と称す）−３、ＮＴ−４／５は低酸素性−虚血性損傷による神経の枯死を減少させることができて（Ｓｈｉｇｅｎｏｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１１，２９１４−２９１９；Ｂｅｃｋｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ．ＦｌｏｗＭｅｔａｂ．，１４，６８９−６９２；Ｃｈａｎｅｔａｌ．，１９９６，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２１，７６３−７６７）、ＢＤＮＦは、１−メチル−４−フェニル−１、２、３、６−テトラハイドロピリジン（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）及び６−ヒドロキシドーパミン（６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ）からドーパミン性神経を保護する（Ｓｐｉｎａｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５９，９９−１０６；Ｆｒｉｍｅｔａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，５１０４−５１０８）。上記研究からニューロトロフィンが低酸素性−虚血及び多様な退行性脳神経系疾患を治療するに用いられるということがわかる。

上記で見たようにニューロトロフィンの作用である神経細胞枯死の抑制効果を用いて神経退行性疾病を治療しようとする努力が進んでいる。しかし、上記の神経細胞枯死の抑制効果を有したニューロトロフィンを脳疾患の治療に応用するに制限を与える研究結果が報告されている。例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５は虚血性神経細胞の損傷を悪化させるが、これはＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）グルタメート受容体を通じたＣａ^２＋の流入及び一酸化窒素（ＮＯ）の生産増加がメカニズムとして提示されており（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ＳａｎｃｈｅｚａｎｄＮｏｖｅｌｌｉ，１９９３，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，３３５，１２４−１３１；Ｋｏｈｅｔａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，５７３−５７５；Ｓａｍｄａｎｉｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，４６３３−４６４１），ＢＤＮＦ、ＮＧＦ及びＮＴ−４／５は酸化的毒性と亜鉛による神経細胞の壊死を著しく増加させることが明かになった（Ｇｗａｇｅｔａｌ．，１９９５，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，７，９３−９６；Ｐａｒｋｅｔａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，９，６８７−６９０；Ｗｏｎｅｔａｌ．，２０００，ＮｅｕｒｏｂｉｏｌＤｉｓ，７，２５１−２５９）。

最近本発明者らは、ニューロトロフィンが状況によって神経細胞の損傷を悪化させることはもちろん、培養した細胞はもちろん実験ねずみにおいて直接的に神経細胞の壊死を誘導することを確認した（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２００２，ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ，１５９，８２１−８３１）。従って、このようなニューロトロフィンの予想外の毒性作用は最近ニューロトロフィンが神経病症、ルーゲリック病などの臨床実験で使用が中断される状況と関連があると予想された（Ａｐｆｅｌｅｔａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，３９（４），３５１−６１）。

ここで、本発明者らはニューロトロフィンの直接的な毒性作用のメカニズムを明らかにし、毒性作用を選択的に防止できる抑制剤を探ることによってニューロトロフィンの脳疾患に対する治療効果を極大化できる補完薬物を確保して本発明を完成した。

〔発明の概要〕
本発明の目的は、酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法及び酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法を提供することである。

上記目的を達成するために、本発明は酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法を提供する。

また、本発明は酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを投与して細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制する方法を提供する。

また、本発明はテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有するニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を提供する。

また、本発明はテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体及びニューロトロフィンを有効成分として含有する細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤を提供する。

〔発明の実施のための最良の形態〕
明細書内に統合されており明細書の一部を構成する添付図面は発明の現在の望ましい実施例を例示して、次の望ましい実施例の詳細な説明と共に本発明の原理を説明する。

図１は、皮質神経細胞の培養において神経因子を持続的に処理して神経細胞の壊死を引き起こしたことを表したグラフである。Ａ：ＢＤＮＦ処理、Ｂ：ＮＴ−３処理及びＣ：ＮＴ−４／５処理。図２は、生理食塩水及びＢＤＮＦを注入した後２日後に脳を切断してヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して神経細胞壊死を確認したものである。Ａ：生理食塩水注入後Ｈ＆Ｅで染色した写真、Ｂ：ＢＤＮＦ注入後Ｈ＆Ｅで染色した写真及びＣ：生理食塩水及びＢＤＮＦ注入後Ｈ＆Ｅで染色した写真から分析したグラフ。図３は、皮質神経細胞を同時に洗浄及びＢＤＮＦを処理した後３２時間が経って顕微鏡を通じて見た写真である。Ａ：同時に洗浄し位相差顕微鏡で見た写真、Ｂ：ＢＤＮＦ処理し位相差顕微鏡で見た写真、Ｃ：同時に洗浄し電子顕微鏡で見た写真及びＤ：ＢＤＮＦ処理し電子顕微鏡で見た写真。図４は、皮質神経細胞にＢＤＮＦを３２時間持続的に処理した後対照群とＢＤＮＦを処理した群を、正常、細胞壊死及び細胞枯死の群に分類してＢＤＮＦによって誘導される神経細胞の死滅の形態を分析したグラフである。図５は、皮質神経細胞に、ＢＤＮＦ、抗−ＢＤＮＦ抑制抗体、トロロックスまたはＣＨＸ（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を各々処理し、培地に排出されるＬＤＨを測定して神経細胞壊死を分析したグラフである。図６は、皮質神経細胞を洗浄して培養したりＢＤＮＦを処理して培養した後酸化されたＤＣＤＨＦ−ＤＡ（ＤＣＦ）の蛍光強度を測定して神経のＲＯＳ水準を分析して表したグラフである。図７は、皮質神経細胞を洗浄して、培養、ＢＤＮＦ単独処理、ＢＤＮＦ及びＣＨＸ処理またはＢＤＮＦ及びトロロックスを処理して皮質神経細胞にあるＤＣＦを定量化したグラフである。図８は、ＢＤＮＦを時間毎に処理した皮質神経細胞でＮＡＤＰＨオキシダーゼ及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを行い電気泳動した写真である。図９は、ＢＤＮＦを時間毎に処理した皮質神経細胞でＮＡＤＰＨオキシダーゼ及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを行い電気泳動した写真からＮＡＤＰＨオキシダーゼのｍＲＮＡ水準を定量化したグラフである。図１０は、皮質神経細胞にＢＤＮＦを時間毎に処理した後ＮＡＤＰＨオキシダーゼの構成因子及びアクチン（ａｃｔｉｎ）をウエスタンブロットで分析した図である。図１１は、皮質神経細胞を洗浄及びＢＤＮＦ処理して培養した後免疫標識した蛍光顕微鏡写真である。Ａ：洗浄、ＦＩＴＣが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ｐ４７−ｐｈｏｘで免疫標識、Ｂ：洗浄、テキサスレッドが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ＮｅｕＮで免疫標識、Ｃ：ＢＤＮＦ処理、ＦＩＴＣが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ｐ４７−ｐｈｏｘで免疫標識及びＤ：ＢＤＮＦ処理、テキサスレッドが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ＮｅｕＮで免疫標識。図１２は、皮質神経細胞を洗浄及びＢＤＮＦ処理して培養した後免疫標識した蛍光顕微鏡写真である。Ａ：洗浄、ＦＩＴＣが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ｐ６７−ｐｈｏｘで免疫標識、Ｂ：洗浄、テキサスレッドが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ＮｅｕＮで免疫標識、Ｃ：ＢＤＮＦ処理、ＦＩＴＣが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ｐ６７−ｐｈｏｘで免疫標識及びＤ：ＢＤＮＦ処理、テキサスレッドが結合された抗−羊ＩｇＧ及び抗−ＮｅｕＮで免疫標識。図１３は、皮質神経細胞にＢＤＮＦを時間毎に処理して培養した後細胞質の分画（Ｃ）及び細胞質膜の分画（Ｍ）を分離して抗−ｐ４７−ｐｈｏｘ抗体及び抗−ｐ６７−ｐｈｏｘ抗体を用いてウエスタンブロットを行った写真である。図１４は、皮質神経細胞を洗浄、ＢＤＮＦ処理及びＢＤＮＦ及びＤＰＩ処理して培養した後各時間毎に皮質神経細胞でシトクロムｃの減少を測定して過酸化物の生成を分析したグラフである。図１５は、皮質神経細胞を洗浄、ＢＤＮＦ処理またはＤＰＩ処理して過酸化物を測定した蛍光顕微鏡写真である。Ａ：洗浄した皮質神経細胞の酸化されたハイドロエチジン（ＨＥｔ）、Ｂ：ＢＤＮＦを処理した皮質神経細胞の酸化されたＨＥｔ、Ｃ：ＢＤＮＦ及びＤＰＩを処理した皮質神経細胞の酸化されたＨＥｔ、Ｄ：洗浄した皮質神経細胞の酸化されたＤＣＦ、Ｅ：ＢＤＮＦを処理した皮質神経細胞の酸化されたＤＣＦ及びＦ：ＢＤＮＦ及びＤＰＩを処理した皮質神経細胞の酸化されたＤＣＦ。図１６は、皮質神経細胞に、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ＋ＤＰＩ、ＢＤＮＦ＋ＡＥＢＳＦまたはＢＤＮＦ＋２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡを処理して培養した後培養培地に排出されるＬＤＨを測定して神経細胞壊死を分析したグラフである。図１７は、血清を除去した神経−過多皮質神経細胞に、無添加、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ＋ＤＰＩ、ＤＰＩ、ＢＤＮＦ＋トロロックスまたはトロロックスを処理して生存する神経の数を数えて神経細胞枯死を分析したグラフである。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明は酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する方法を提供する。

本発明の酸化的毒性（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ）抑制剤は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤（ＮＡＤＰＨｏｘｉｄａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ビタミンＥとその誘導体及びテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸（ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ）誘導体からなる群より選択されるのが望ましい。上記でＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤は、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）及び４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）からなる群より選択される一つ以上であることが望ましく、ビタミンＥの誘導体はトロロックス（ｔｒｏｌｏｘ）であることが望ましくて、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、ＢＡＳ（５−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＴＢＡＳ（５−（４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＮＢＡＳ（５−（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＣＢＡＳ（５−（４−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＭＢＡＳ（５−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＦＢＡＳ（５−（４−ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｘｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ）及び２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−５−（２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ− ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ）−ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ、以下「２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡ」と称す）からなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。

本発明のニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）は、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎｄｅｒｉｖｅｄ−ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、またはＮＴ−４／５であることが望ましくて、ＢＤＮＦであることがさらに望ましい。

ＢＤＮＦは、ＮＡＤＰＨのオキシダーゼの発現を増加させ、このため細胞内に活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ、以下「ＲＯＳ」と略称する）を過量生成して神経細胞の壊死を誘導する。

ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤であるジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）または４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）を処理すると、ＢＤＮＦによって誘導されるＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性を抑制してＲＯＳの生成を減少させ、細胞壊死を抑制して、ビタミンＥまたはその誘導体であるトロロックスを処理すると抗酸化作用によってＢＤＮＦによって誘導された細胞壊死を抑制する。また、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体であるＢＡＳ、ＴＢＡＳ、ＮＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＦＢＡＳ及び２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡは抗酸化作用をする物質であって酸化的毒性を抑制して細胞壊死を抑制する（国際特許公開：ＷＯ０１／７９１５３号）。

従って、本発明の酸化的毒性抑制剤を投与するとニューロトロフィンによって誘導された細胞壊死を抑制することができる。

本発明の酸化的毒性抑制剤は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤、ビタミンＥ誘導体及びテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体からなる群より選択されるのが望ましい。上記でＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤は、ジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）及び４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）からなる群より選択される一つ以上であることが望ましく、ビタミンＥの誘導体はトロロックスであることが望ましくて、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、ＢＡＳ、ＴＢＡＳ、ＮＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＦＢＡＳ及び２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。

本発明のニューロトロフィンは、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、またはＮＴ−４／５であることが望ましくて、ＢＤＮＦであることがさらに望ましい。

ＢＤＮＦは細胞枯死を抑制するが同時に細胞壊死をも引き起こす。しかし、ＢＤＮＦと共に酸化的毒性抑制剤を投与すると、ＢＤＮＦによって細胞枯死が抑制され同時に酸化的毒性抑制剤によって細胞壊死が抑制される。このとき酸化的毒性抑制剤はＢＤＮＦによる細胞枯死の抑制には影響を及ぼさない。従って、ＢＤＮＦ及び酸化的毒性抑制剤を共に処理すると細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制することができる。

即ち、本発明の酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンを投与すると細胞壊死及び細胞枯死と関連する疾患である虚血性脳卒中（Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９６，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３９（１），１１４−１２２；Ｆｅｒｒｅｒｅｔａｌ．，２００１，Ａｃｔａｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ．），１０１（３），２２９−３８）、退行性脊椎損傷（Ｊｉｎｅｔａｌ．，２００２，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１７７（１），２６５−７５）、アルツハイマー性痴呆（ＳｉｅｇｅｌａｎｄＣｈａｕｈａｎ，２０００，ＢｒａｉｎＲｅｓ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｒｅｖ．，３３，２−３）、パーキンソン病（Ｂｒａｄｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９９，ａｄｖ．Ｎｅｒｕｏｌ．８０，１９０２５）、ルーゲリック病（Ｌｏｕｖｅｌｅｔａｌ．，１９９７，ＴＲＥＮＤＳ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１８（６），１９６−２０３）、神経病症（Ａｐｆｅｌ，１９９９，ＢｒａｉｎＰａｔｈｏｌ，９（２），３９３−４１３）、ハンチントン病（Ｐｅｒｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏｅｔａｌ．，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７５（５），２１９０−９）、緑内障（ＫＯｅｔａｌ．，２０００，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４１（１０），２９６７−７１）及び網膜剥離（Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．，１９９９，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４０（７），１５３０−１５４４）などで薬理効果を奏することができる。

上記で見たように酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制する。従って、酸化的毒性抑制剤であるテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を用いてニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死抑制剤を製造することができる。本発明のテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体は、ＢＡＳ、ＴＢＡＳ、ＮＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＦＢＡＳ及び２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。本発明のニューロトロフィンは、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、またはＮＴ−４／５であることが望ましくて、ＢＤＮＦであることがさらに望ましい。

テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有する薬学的組成物は、臨床投与の際に経口または非経口で投与が可能であり一般的な医薬品製剤の形態で用いられ得る。テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体を有効成分として含有する薬学的組成物は、実際臨床投与の際に経口及び非経口のいろいろな剤型で投与され得るが、製剤化する場合には通常用いる、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれて、このような固形製剤は一つ以上のテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレートタルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、通常用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられ得る。座剤の基剤としては、ウィテップソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられ得る。

酸化的毒性抑制剤であるテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制し、ニューロトロフィンは細胞枯死を抑制して、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体はニューロトロフィンによって抑制された細胞枯死に影響を及ばなさないため、テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体及びニューロトロフィンを有効成分として含有する細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤を製造できる。

テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸の誘導体は、ＢＡＳ、ＴＢＡＳ、ＮＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＦＢＡＳ及び２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡからなる群より選択される一つ以上であることが望ましい。

本発明の細胞壊死及び細胞枯死の同時抑制剤は細胞壊死及び細胞枯死と関連する疾患である虚血性脳卒中、退行性脊椎損傷、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、神経病症、ハンチングトン病、緑内障または網膜剥離に薬理効果を奏することができる。

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。

但し、下記実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。

＜実施例１＞一次皮質神経細胞の培養
本発明者らは、ニューロトロフィンによる神経毒性を確認するため白鼠の大脳皮質神経細胞を培養した。妊娠後１７日になった白鼠の胎児の脳から分離した大脳皮質神経細胞をイーグルス最小構成培地（ＭＥＭ）、５％馬血清（ｈｏｒｓｅｓｅｒｕｍ）、５％子牛の胎児血清（ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ）、２１ｍＭグルコース、２６．５ｍＭ重炭酸及び２ｍＭＬ−グルタミンを含有する培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて培養した。

神経細胞−神経膠細胞の混合培養のために、試験官内で培養してから５ないし７日（ｄａｙｓｉｎｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ）５−７）に、１０μＭシトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ、ＡｒａＣ）を添加して非−神経細胞の過剰成長を中止させた。２日後、馬血清を添加しなかった培地に換えた。細胞は３７℃に維持され、５％のＣＯ_２に維持される培養器で培養した。一方、純粋神経細胞（＞９５％）の培養のために、Ｇｗａｇの方法（Ｇｗａｇｅｔａｌ．，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７７，３９３−４０１）によって培養してから２ないし３日（ＤＩＶ２ないし３）に２．５μＭシトシンアラビノシドを添加して培養した。

＜実施例２＞ニューロトロフィンの持続処理による細胞壊死の誘導及び分析
本発明者らは、ニューロトロフィンが細胞壊死を誘導するか否かを観察するために、皮質神経細胞にニューロトロフィンを処理して細胞培養液に分泌される乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、以下「ＬＤＨ」と称す）の水準を分析して細胞壊死を分析した。

上記実施例１の方法で混合培養した大脳皮質神経細胞（ＤＩＶ１２ないし１４）に１０，３０または１００ｎｇ／ｍｌの脳誘導神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ、以下「ＢＤＮＦ」）またはニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ、以下「ＮＴ」と称す）−３を添加して培養した。培養培地に分泌されるＬＤＨの水準を定量することによって神経細胞壊死を分析した。神経細胞壊死の百分率は対照群（０％と表記）または２４時間５００μＭのＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ，ＮＭＤＡ）を添加して２４時間以内に完璧な神経細胞壊死をした群（１００％と表記）によって平均ＬＤＨ値で定量化した。

その結果、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、またはＮＴ−４／５を３６時間ないし４８時間持続的に処理して培養した際には広範囲な神経細胞壊死が起こり、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５を４８時間処理した際に完全な神経細胞壊死が起こった（図１のＡ、図１のＢ、図１のＣ）。{平均±ＳＥＭ（各条件当り培養ウェルの数、ｎ＝１６）、＊比較対照群（同時に洗浄した対照群）と比べて相当な差があるものであり、スチューデント-ニューマン-クルーズテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓｔｅｓｔ）を通じてＰ＜０．０５の有意性を見せた。

従って、ニューロトロフィンであるＢＤＮＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５は細胞壊死を誘導することがわかる。

＜実施例３＞ＢＤＮＦの線条体内注入による細胞壊死の分析
本発明者らはＢＤＮＦによる細胞壊死を確認するためにねずみ脳の線条体にＢＤＮＦを注入した。具体的に、２５０ないし３００ｇの重さを持つ雄白鼠を麻醉した後５μｌ生理食塩水及び生理食塩水に溶かした５μｇＢＤＮＦを２日間線条体内注入した（線条体内注入位置：ドアの方から前庭に１．０ｍｍ、測位から中央に３．０ｍｍ、硬膜表面から腹側に５．０ｍｍ）。注入後２日後に脳を切断して４００ｍｇ／ｍｌクロラールハイドレート（ｃｈｌｏｒａｌｈｙｄｒａｔｅ）を腹腔内注入して麻醉させた後、燐酸−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、続いて３％パラホルムアルデヒドを心臓透過で貫流させた。すぐ脳を除去して固定した後、マイクロトーム（ＴＰＩ社）を用いて８μｍ厚さで切断した。注入部位を含む切断切片を集めてヘマトキシリン及びエオジン（ＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄＥｏｓｉｎ、以下「Ｈ＆Ｅ」と称す）を用いて染色した。病変部位はウォンの方法（Ｗｏｎｅｔａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓｅａｓｅ．，７，２５１−２５９）によって分析した。注射針が通過した位置及び染色様相において神経細胞の死滅が起こった損傷部位を含む６個の段階的な切断切片を観察した。Ｈ＆Ｅで染色した脳組織切片はコンピュータ映像分析機器（シグマスキャン社）を用いて分析した。

その結果、ＢＤＮＦを注入したねずみの脳神経組織で神経細胞の死滅が起ったことを確認することができ、このような損傷が起こった部位の面積を測定して分析した結果、ＢＤＮＦを注入したねずみの病変組織は生理食塩水のみ注入したねずみの病変組織よりさらに大きい細胞壊死を示した（図２）。

＜実施例４＞ＢＤＮＦ処理した皮質神経細胞の細胞壊死観察
本発明者らは、ＢＤＮＦ処理による神経細胞壊死の様相を確認するために、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦを３２時間持続的に処理した大脳皮質神経細胞及びＢＤＮＦを処理しなかった対照群を位相差顕微鏡及び透過電子顕微鏡を用いて観察した。

透過電子顕微鏡を用いた観察は、細胞培養液をカルノフスキー（Ｋａｒｎｏｖｓｋｙｓ）固定溶液（１％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、２％グルタアルデヒド（ｇｌｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）、２ｍＭカルシウムクロライド（ｃａｌｃｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）及び１００ｍＭカコジル酸緩衝液（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅｂｕｆｆｅｒ）ｐＨ７．４）に２時間固定させ、カコジル酸緩衝液で洗浄した後、１％四酸化オスミウム（ｏｓｍｉｕｍｔｅｔｒｏｘｉｄｅ）及び１．５％フェロシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ）で１時間後−固定した。上記固定された細胞は０．５％ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）で全体的に染色し、段階的な濃度のアルコールで脱水させ、ポリ／ベッド８１２レジン（Ｐｏｌｙ／Ｂｅｄ８１２ｒｅｓｉｎ）（ペルコ社）で封埋した。上記封埋された細胞はライヘルトジョンウルトラカットＳ（ＲｅｉｃｈｅｒｔＪｕｎｇＵｌｔｒａｃｕｔＳ）（レイカ社）を用いて切断した。上記切断された細胞をウラニルアセテート及びリードシトレート（ｌｅａｄｃｉｔｒａｔｅ）で染色して、透過電子顕微鏡を用いて細胞を観察しジェイスＥＭ９０２Ａ（ＺｅｉｓｓＥＭ９０２Ａ）を用いて写真を撮った。

位相差顕微鏡を通じて観察した結果、ＢＤＮＦの処理によって神経細胞の膨脹が起こり（図３のＡ及びＢ）、透過電子顕微鏡で観察した結果ＢＤＮＦの処理によって細胞壊死の形態で核染色質が散漫に凝縮され、核膜の損傷は起こらなかったが、細胞質膜が破裂されることがわかる（図３のＣ及びＤ）。また、透過電子顕微鏡を通じた観察で対照群及びＢＤＮＦを処理した神経細胞において正常、細胞壊死または細胞枯死（細胞質が収縮し、核膜が細胞質膜より先に破裂）の所見が見えた退行した神経を分類した結果、ＢＤＮＦによって細胞壊死が誘導されることがわかる（図４）。

＜実施例５＞ＢＤＮＦの皮質細胞への処理によるＲＯＳの生成分析
活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ、以下「ＲＯＳ」と称す）が増加すると細胞壊死が誘導されると広く知られており、本発明者らはＢＤＮＦを処理して誘導された細胞壊死がＲＯＳの生産が増加されて起こったものであるか確認しようとした。

１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び１μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、以下「ＣＨＸ」と称す）、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び１００μＭトロロックス（ｔｒｏｌｏｘ）を処理して培養した皮質神経細胞（ＤＩＶ１２ないし１５）に１０μＭジクロロジハイドロフルオレセインジアセテート（ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ、以下「ＤＣＤＨＦ−ＤＡ」と称す）または５μＭハイドロエチジウム（ｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ、以下「ＨＥｔ」と称す）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ）を含む２％プルロニックＦ−１２７が添加されたＨＥＰＥＳ−緩衝塩調節溶液（ＨＣＳＳ）（１２０ｍｍＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１．６ｍＭＭｇＣｌ_２、２．３ｍＭＣａＣｌ_２、１５ｍＭグルコース、２０ｍＭＨＥＰＥＳ及び１０ｍＭＮａＯＨ）を添加した。上記細胞は３７℃で２０分間培養し、ＨＣＳＳ緩衝溶液で３回洗浄した。１００Ｗゼノンランプ及び濾過器（酸化されたＤＣＤＨＦのためのもの；励起＝４８８ｎｍ、放出=５１０ｎｍ、ＨＥｔのためのもの；励起=５４６ｎｍ、放出=５９０ｎｍ）を含んでいるニコンジアフォト反転顕微鏡（ＮｉｋｏｎＤｉａｐｈｏｔｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で酸化されたＤＣＤＨＦの蛍光信号を室温で観察した。蛍光映像はクァンチセル７００システム（ＱｕａｎｔｉＣｅｌｌ７００ｓｙｓｔｅｍ）（ＡｐｐｌｉｅｄＩｍａｇｉｎｇ、イギリス）を用いて分析した。

その結果、ＢＤＮＦの処理によってＲＯＳの生産が増加し、ＢＤＮＦと共に蛋白質合成阻害剤であるＣＨＸまたはビタミンＥ誘導体であるトロロックスを処理することによってＢＤＮＦによって増加したＲＯＳの生産が減少することがわかった（図６、図７）。{平均±ＳＥＭ（各条件当り任意に選択された神経細胞の数、ｎ＝３０ないし３５）、＊；ＢＤＮＦを処理しなかった対照群と相当な差があるものであり、＃；ＢＤＮＦ比較対照群（ＢＤＮＦのみ処理した対照群）と相当な差があるものであって、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてＰ＜０．０５で大きい差を見せる結果}
従って、ＢＤＮＦは、前−酸化剤蛋白質の合成を通じてＲＯＳを生産することがわかる。

＜実施例６＞ＢＤＮＦによって誘導されるＲＯＳの生成を遮断した細胞壊死抑制分析
本発明者らは、ＢＤＮＦによって誘導される神経細胞壊死の作用メカニズムを確認するために、皮質神経細胞（ＤＩＶ１２ないし１５）に１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ単独、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び１００μｇ／ｍｌ抗−ＢＤＮＦ抑制抗体、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び１００μＭトロロックス、または１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び１μｇ／ｍｌＣＨＸを各々処理し、３６時間後培養培地に排出されるＬＤＨを測定して神経細胞壊死を分析した。

その結果、ＢＤＮＦの処理によって誘導された細胞壊死で増加されたＬＤＨの分泌は抗−ＢＤＮＦ遮断抗体の投入によって完璧に遮断されて、蛋白質合成阻害剤であるＣＨＸ及び抗酸化剤であるトロロックスの処理によってＢＤＮＦによって誘導された細胞壊死を完璧に遮断した（図５）。{平均±ＳＥＭ（各条件当り培養ウェルの数、ｎ＝１６）、＊；比較対照群（ＢＤＮＦのみを処理した対照群）と相当な差があるものであり、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP＜０．０５で大きい差を見せる結果}
従って、ＢＤＮＦによって誘導された細胞壊死はＲＯＳを生成する酸化的ストレス過程を抑制することによって遮断されることがわかる。

＜実施例７＞ＢＤＮＦを処理した皮質細胞での標的遺伝子分析
＜７−１＞ｃＤＮＡマイクロアレイ分析を通じたＢＤＮＦの標的遺伝子分析
本発明者はＢＤＮＦを処理した皮質細胞で発現される遺伝子及び遺伝子の発現の変化を見るためにｃＤＮＡマイクロアレイ分析を行った。

ＢＤＮＦを８時間添加して培養した皮質神経細胞（ＤＩＶ１２）からＲＮＡｚｏｌＢ（テルテスト社）を用いて全体ＲＮＡを分離した。上記分離した全体ＲＮＡ１μｇを[α−^３３Ｐ]ｄＡＴＰで放射性標識してｃＤＮＡを合成しねずみ遺伝子濾紙（ｒａｔｇｅｎｅｆｉｌｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｓ）（リサーチジェネティックス社）に４２℃で１２ないし１８時間混成反応させた。上記混成反応された濾紙は２×サリンソジウムシトレート（ｓａｌｉｎｅｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）緩衝液及び１％ソジウムドデシルサルフェート（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）で５０℃で２０分間洗浄して、０．５×食塩水ナトリウムシトレート及び１％ナトリウムドデシルサルフェートで室温で１５分間洗浄した後、プラスチックラップで包み、ホスホイメージカセット（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒｃａｓｓｅｔｔｅ）に露出させた。遺伝子濾紙を露出した後、混成された形態はマイクロアレイ分析ソフトウェア（Ｐａｔｈｗａｙｓ^ＴＭ４−ｕｎｉｖｅｒｓａｌｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ）（インビトロゼン社）を用いて分析した。

その結果、ＢＤＮＦの標的遺伝子は大部分、分化、細胞内移入、代謝及びニューロトロフィンの神経毒性作用を反映する信号伝達において重要な役割をする遺伝子であることが明かになりこれらのうち酸化的毒性に関与する遺伝子としてＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ｏｘｉｄａｓｅ）の発現が増加することがわかるが、この遺伝子は細胞内に活性酸素の先駆物質を作り出すことと知られている。

＜７−２＞逆伝写−酵素連鎖重合反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を通じたＢＤＮＦ標的遺伝子の確認
本発明者らは上記実施例＜７−１＞のｃＤＮＡ発現マイクロアレイからＢＤＮＦ−敏感性遺伝子で示された遺伝子として、酸素から過酸化物を生産する前−酸化剤酵素であるＮＡＤＰＨオキシダーゼの小単位であるｐ２２−ｐｈｏｘ（ｐ２２−ｐｈｏｘ）及びｇｐ９１−ｐｈｏｘ（ｇｐ９１−ｐｈｏｘ）からなるシトクロムｂ_５５８を確認するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。

ＢＤＮＦを皮質神経細胞に処理した後時間毎にサンプルを採取して全体ＲＮＡを分離しｃＤＮＡを製造するために１μｇの全体ＲＮＡを反応混合液（各々２．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．５単位ＲＮａｓｉｎ、１００ｎｇオリゴｄＴプライマー）及び２００単位ＭＭＬＶ逆伝写酵素を用いて３７℃で１時間反応させた。上記の反応液は９２℃で１０分間反応させて４℃に移した。逆伝写されたｃＤＮＡは公知の方法（宝酒造社）によってＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応の順序は次のようである。順に、ＤＮＡの変性、プライマー結合、長さ延長；ｐ４７−ｐｈｏｘ：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒で２８回、ｐ２２−ｐｈｏｘ（マイクロアレイで行ったシトクロムｂ_５５８と相同性がある）及びｇｐ９１−ｐｈｏｘ：９４℃で４５秒、６０℃で６０秒、７２℃から１２０秒で３３回、ＧＡＰＤＨ：９４℃で３５秒、５５℃で４５秒、７２℃で９０秒で２５回。上記のＰＣＲ遂行のとき用いたプライマーは下記の配列番号の塩基配列からなる。ｐ２２−ｐｈｏｘ：配列番号１及び配列番号２、ｐ４７−ｐｈｏｘ：配列番号３及び配列番号４、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ：配列番号５及び配列番号６、ＧＡＰＤＨ：配列番号７及び配列番号８。上記過程を経たＰＣＲ産物は１．２％アガロスゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）を用いて視覚化した。ｍＲＮＡの相対的な量はＬＡＳ−１０００（富士フォトフィルム社）を用いて測定し、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの水準に比べて定量化した。上記ＲＴ−ＰＣＲで発現の変化が確認された遺伝子のＰＣＲが正確に遂行されたか否かを確認するためにＤＮＡ塩基配列分析をした。ＤＮＡ塩基配列分析はパーキン−エルマーアップライドバイオシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に入っているビッグダイターミネータケミストリー（ＢＩｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いてＤＮＡ配列分析器（ＡＢＩＰＲＩＳＭ^ＴＭ３７７ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ポスターシティー社）で行った。

その結果、ＢＤＮＦを処理した後２時間以内にｐ２２−ｐｈｏｘ及びｇｐ９１−ｐｈｏｘのｍＲＮＡの水準が増加し、４時間以後に最高に増加し、以後１２時間まで持続された。ｐ４７−ｐｈｏｘ小単位のｍＲＮＡ水準はＢＤＮＦの添加以後３０分からだんだん増加した（図８、図９）。

従って、ＢＤＮＦはＮＡＤＰＨのオキシダーゼの発現を増加させるということがわかる。

＜７−３＞ウエスタンブロットを通じたＢＤＮＦ標的蛋白質の分析
本発明者らは、上記実施例＜７−２＞を通じてＢＤＮＦの標的遺伝子として判明されたＮＡＤＰＨオキシダーゼの構成遺伝子が蛋白質にも発現されるか否か確認するためにウエスタンブロットを行った。

１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦを時間毎に処理して培養された皮質神経細胞は溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ）、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍｌペップスタインＡ（ｐｅｐｓｔａｉｎＡ）及び１００μｇ／ｍｌロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ））を用いて溶解させた。２５μｇの蛋白質を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ）に電気泳動し、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した。上記のブロット（蛋白質が含まれた膜）を２．５％牛血清アルブミンに入れて１時間反応させ、１：１０００割合で希釈した羊多クローン一次抗体、抗−ｇｐ９１−ｐｈｏｘ、抗−ｐ６７−ｐｈｏｘまたは抗−ｐ４７−ｐｈｏｘ抗体（サンタクルーズ社）で反応させ、バイオティーン化された抗−羊二次抗体で反応させた。免疫反応性はベクタスタインＡＢＣキット（ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣｋｉｔ）（ベクトルラボラトリ社）及び発色反応器（ｌｕｍｉｎａｌｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＥＣＬ）（イントロン社）を用いて確認した。免疫反応が示された信号はＬＡＳ−１０００システム（富士フォトフィルム社）を用いて定量的濃度を分析した。

その結果、皮質神経細胞でＢＤＮＦを添加して培養した後１６ないし３２時間ＮＡＤＰＨオキシダーゼの小単位の構成因子であるｇｐ９１−ｐｈｏｘ、ｐ４７−ｐｈｏｘ及びｐ６７−ｐｈｏｘ蛋白質発現が増加した（図１０）。

従って、ＢＤＮＦによってＮＡＤＰＨオキシダーゼの遺伝子が発現され、蛋白質に合成されることがわかる。

＜７−４＞免疫細胞化学分析を通じたＢＤＮＦ標的遺伝子ＮＡＤＰＨのオキシダーゼの発現分析
本発明者らは、上記実施例＜７−２＞及び＜７−３＞を通じてＢＤＮＦによって発現が増加したＮＡＤＰＨのオキシダーゼの発現を細胞で観察するために免疫細胞化学分析を実施した。

１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦを処理して３２時間培養した皮質神経細胞（ＤＩＶ１２ないし１４）は４％パラホルムアルデヒドロで３０分間固定化し、１０％馬血清で１時間反応し、神経細胞の指標として用いられるＮｅｕＮに対する鼠単一クローン抗体（１：４００希釈、ケミコン社）及びｐ４７−ｐｈｏｘまたはｐ６７−ｐｈｏｘに対する山羊多クローン抗体（１：２００希釈、サンタクローズ社）で両方−免疫標識して２ないし４時間反応させた。上記反応された細胞はフルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で結合された抗−羊ＩｇＧ（１：２００希釈、オガトンテクニカ社）及びテキサスレッド（Ｔｅｘａｓｒｅｄ）で結合された抗−鼠ＩｇＧ（１：２００希釈、ベクトルレバラトリ社）を用いて１ないし２時間反応させた。上記染色された細胞で蛍光を帯びた映像を集めてリアル−１４^TMプレシジョンデジタルカメラ（Ｒｅａｌ−１４^TMｐｒｅｃｉｓｉｏｎｄｉｇｉｔａｌｃａｍｅｒａ）（アポジーインストルメント社）及びイメージプロプラスプラグイン（ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓＰｌｕｇ−ｉｎ）（シルバースプリング社）を装着した蛍光顕微鏡（ジェイス社）を用いて分析した。

その結果、皮質神経細胞にＢＤＮＦを処理して３２時間培養した神経細胞は対照群に比べてｐ４７−ｐｈｏｘ及びｐ６７−ｐｈｏｘの信号がかなり増加し、これは神経細胞を表すＮｅｕＮのある細胞のみで増加したことから神経細胞から蛋白質発現が増加したことがわかる（図１１、図１２）。

＜７−５＞ＢＤＮＦを処理した細胞内部の分画によるＮＡＤＰＨのオキシダーゼの発現分析
本発明者らは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化は細胞質のｐ４７−ｐｈｏｘ及びｐ６７−ｐｈｏｘの小単位を細胞質膜に移動させることと関連があるため（Ｃｌａｒｋｅｔａｌ．，１９８９，Ｔｒａｎｓ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ．，１０２，２２４−２３０）、ＢＤＮＦを処理した皮質神経細胞の細胞質及び細胞質膜の分画を用いてＮＡＤＰＨオキシダーゼが活性化されたかを確認しようとした。

培養した大脳皮質神経細胞（ＤＩＶ１２）に１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦを時間毎に処理した後冷たいＰＢＳで洗浄し、等張液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＰＭＳＦ、１００μｇ／ｍｌロイペプチン及び１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡ）に懸濁して溶解させた。細胞質及び細胞質膜の分画を分離するために、上記溶解液をホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）（コンテ社）を用いて均質化し、９、０００ｇで１０分間遠心分離し、上等液を１００、０００ｇで１時間遠心分離した。遠心分離後、ペレットを５０μl溶解緩衝液で懸濁して細胞質膜の分画を収得し、上等液から細胞質分画を収得した。

上記方法で収得した細胞質及び細胞質膜の分画から蛋白質を分離してｐ４７−ｐｈｏｘ及びｐ６７−ｐｈｏｘの抗体を用いて上記実施例＜７−４＞で提示した方法でウエスタンブロットを行った。

その結果、皮質神経細胞の細胞質分画ではｐ４７−ｐｈｏｘ及びｐ６７−ｐｈｏｘ蛋白質水準は減少したが、上記皮質神経細胞の細胞質膜分画ではｐ４７−ｐｈｏｘ及びｐ６７−ｐｈｏｘ蛋白質が増加した（図１３）。

従って、ＢＤＮＦを処理すれば細胞質膜でＮＡＤＰＨのオキシダーゼの発現が増加して、細胞内に活性酸素種の発生が増加して酸化的毒性が起こることがわかる。

＜実施例８＞ＢＤＮＦを処理した細胞でのＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性測定
本発明者らは、ＢＤＮＦを処理した細胞で発現が増加したＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性が増加するかを分析するために、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性によって生成される過酸化生成物を測定した。

過酸化生成物はシトクロムｃの減少を測定して定量力学分析をすることによって測定した（ＭａｙｏａｎｄＣｕｒｎｕｔｔｅ．，１９９０，ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙｍｏｌ．，１８６、５６７−５７５）。未処理、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦまたは１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び３ｎＭジフェニレンヨードニウム（ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｉｏｄｏｎｉｕｍ、以下「ＤＰＩ」と称す）を処理して培養した後、各時間毎に皮質神経細胞をＰＢＳに懸濁し、反応混合液（０．９ｍＭＣａＣｌ_２、０．５ｍＭＭｇＣｌ_２及び７．５ｍｍグルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ））、７５μＭシトクロムｃ（シグマ社）及び６０μｇ／ｍｌスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ、ＳＯＤ）（シグマ社）を添加して３７℃で３分間反応させた。サーモマックスマイクロプレート判読機（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）及びＳＯＦＴＭＡＸＶｅｒｓｉｏｎ２．０２ソフトウェア（モルキュラデバイス社）を用いて５５０ｎｍの波長でシトクロムｃの吸光度を測定して過酸化生成物を確認した。

その結果、ＢＤＮＦを処理した後時間が経るにつれて過酸化物の生産が増加し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの抑制剤であるＤＰＩを処理した際過酸化物が生成されない様相を見せた（図１４）。{平均±ＳＥＭ（各条件当りウェルの数、ｎ＝１２）。＊；比較対照群（洗浄した対照群）と相当な差があるもので、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP＜０．０５で大きい差を見せる結果}
従って、ＢＤＮＦによってＮＡＤＰＨオキシダーゼが活性化されこれによって過酸化物が生成されるが、これはＮＡＤＰＨオキシダーゼの抑制剤によって遮断されることがわかる。

＜実施例９＞ＮＡＤＰＨオキシダーゼによるＲＯＳ生成の確認
ＮＡＤＰＨオキシダーゼによってＲＯＳが生成されると報告されたので、本発明者らはＢＤＮＦを処理して活性化されたＮＡＤＰＨオキシダーゼによってＲＯＳが生成されるかを確かめようとした。

皮質神経細胞を洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦを処理し、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び３ｎＭＤＰＩを処理して３２時間培養した後、上記実施例５の方法によってＨＥｔ及びＤＣＤＨＦが各々エチジウム及びＤＣＦに酸化されるのを測定することによって、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性を通じたＲＯＳ生成能力を測定した。

その結果、ＢＤＮＦを処理した細胞ではＨＥｔ及びＤＣＦの発現が全て増加し、ＢＤＮＦ及びＮＡＤＰＨオキシダーゼの抑制剤であるＤＰＩを処理すると上記ＨＥｔ及びＤＣＦの生成が全て抑制された（図１５）。

従って、ＢＤＮＦはＮＡＤＰＨオキシダーゼを媒介とした過酸化物の生産を通じて皮質神経で酸化的ストレスを生産することがわかる。

＜実施例１０＞ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤処理によるＢＤＮＦによって誘導される細胞壊死の抑制
本発明者らは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤がＢＤＮＦによって誘導される神経細胞壊死を抑制するか否かを確かめようとした。

皮質神経細胞に、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び３ｎＭＤＰＩ、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び１０μＭＡＥＢＳＦ（４−（２−ａｍｏｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（以下「ＡＥＢＳＦ」と称す）または１μＭ２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−５−（２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ）−ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ、以下「２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡ」と称す）を処理して３６時間培養した後培養培地に排出されるＬＤＨを測定して神経細胞壊死を分析した。

その結果、皮質神経細胞にＢＤＮＦのみを処理したときより、３ないし１０ｎＭＤＰＩ、１０ないし３０μＭＡＥＢＳＦ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤）、または１μＭ２−ヒドロキシ−ＴＴＢＡをＢＤＮＦと同時に処理した場合、神経細胞の壊死が抑制された（図１６）。{平均±ＳＥＭ（各条件当りウェルの数、ｎ＝１６）。＊；比較対照群（ＢＤＮＦのみ処理した対照群）と相当な差があるもので、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP＜０．０５で大きい差を見せる結果}。

従って、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの抑制剤はＢＤＮＦによって誘導される細胞壊死を抑制するので、ＢＤＮＦによる細胞壊死はＮＡＤＰＨオキシダーゼによって媒介されることがわかる。

＜実施例１１＞ＢＤＮＦによる細胞枯死の抑制に及ぼす影響
本発明者らは、ＢＤＮＦが細胞枯死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を抑制すると知られており、ＢＤＮＦの作用を抑制できる抑制剤を用いてＢＤＮＦによって誘導される細胞枯死の抑制にも影響を与えるかを観察することにした。

純粋培養した大脳皮質神経細胞に血清（ｓｅｒｕｍ）を除去した後１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び３ｎＭＤＰＩ、３ｎＭＤＰＩ、１００ｎｇ／ｍｌＢＤＮＦ及び１００μＭトロロックスまたは１００μＭトロロックスを処理して、神経細胞枯死が抑制されるかを確認するために、２４ないし４８時間に生存する神経の数を数えて細胞枯死を分析した。血清を除去した状態での実験をするために、純粋培養神経細胞（ＤＩＶ７）を血清がなく、ＭＥＭに２１ｍＭグルコース、２６．５ｍＭ重炭酸と１μＭＭＫ−８０１を入れた培地（Ｇｗａｇｅｔａｌ．，１９９５，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，７，９３−９６）で培養した。

その結果、ＢＤＮＦは２４時間では神経細胞の枯死を有効に抑制したが４８では神経細胞の枯死を抑制することができず細胞膨張を伴った神経細胞の壊死様相を示した。また、ＤＰＩまたはトロロックスそのものでは血清除去で誘導された神経細胞枯死を抑制できなかった。なお、ＢＤＮＦを処理することによって起こる神経細胞枯死の抑制は、ＤＰＩまたはトロロックスを同時に共に処理することによって２４時間と４８時間で有効に抑制された（図１７）。{平均±ＳＥＭ（各条件当り４個のウェルから任意に選択した部位の数、ｎ＝１６）．＊；比較対照群（血清を除去した対照群）と相当な差があるもので、スチューデント-ニューマン-クルーズテストを通じてP＜０．０５で大きい差を見せる結果}。
従って、ＢＤＮＦは細胞枯死を有効に抑制するが時間が経るにつれて細胞の壊死を誘導し、ＢＤＮＦが起こす細胞枯死を調節するメカニズムは独立的に起こることがわかる。上記結果からＮＡＤＰＨオキシダーゼの発現と活性を通じてＢＤＮＦによる細胞の壊死が誘導されることがわかる。また、ＢＤＮＦの抑制剤はＢＤＮＦによる細胞枯死の抑制に影響を与えないながらもＢＤＮＦによる細胞壊死の誘導を抑制できることがわかる。

以上で観察したように、本発明の酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導された細胞壊死を抑制し、酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンとを同時に処理すれば細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制させることができて細胞壊死及び細胞枯死と関連した疾患の予防に有用に用いられ得ることがわかる。

以下、本発明の酸化的毒性抑制剤及びニューロトロフィンが適用され得る具体的な疾患に対して説明する。

＜適用例１＞アルツハイマー（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓＥ：ＡＤ）
アルツハイマーは大脳皮質及び海馬にあるグルタミン性ニューロン（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓ）と前脳基底にあるコリン性神経細胞（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓ）の壊死を伴い、神経細胞外のアミロイドプラーク（ａｍｙｌｏｉｄｐｌａｑｕｅ）と神経細胞内の神経繊維の絡み合い（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅｓ）とが共通的な現象として見られる。ニューロトロフィンであるＮＧＦはコリン性神経細胞の生存と機能を増進させることが明かになり、アルツハイマーの治療剤として提示されている（Ｈｅｆｔｉ，１９９４，ＪＮｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２５，１４１８−１４３５）。しかし、過度な量の活性酸素による脂質過酸化（ｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、蛋白質カルボニル（ｐｒｏｔｅｉｎｃａｒｂｏｎｙｌｓ）、窒化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、蛋白質の酸化的交差結合（oｘｉｄａｔｉｖｅｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ）などがアルツハイマー病で増加していると知られている（Ｖｉｔｅｋｅｔａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，４７６６−４７７０；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９９５，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８，１７２−１７６，Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９９６，Ｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，２８，４１−４８，Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４，９８６６−９８６８；Ｍｏｎｔｉｎｅｅｔａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５，２０２−２１０）。亜鉛はアルツハイマー病患者の脳（ａｍｙｇｄａｌａ，ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，ｉｎｆｅｒｉｏｒｐａｒｉｅｔａｌｌｏｂｕｌｅ，ｓｕｐｅｒｉｏｒａｎｄｍｉｄｄｌｅｔｅｍｐｏｒａｌｇｙｒｉ）で増加しており、主にアミロイドプラークの中心と周辺でさらに多く観察された（Ｌｏｖｅｌｌｅｔａｌ．，１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１５８，４７−５２）。従って、酸化的毒性及び亜鉛毒性による神経細胞壊死の防御効果を示す本発明による化合物はニューロトロフィンと共にアルツハイマー病の治療剤として用いられ得る。

＜適用例２＞パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）
パーキンソン病は黒質に存在するドーパミン神経細胞の壊死が伴って、伸展、筋肉硬直、運動緩徐、非正常的姿勢、運動不能などの多様な症状を表す退行性神経系疾患である。神経細胞壊死の主要原因として酸化的毒性が提示されているが、脂質過酸化（ｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、ＤＮＡ酸化（ＤＮＡｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、蛋白質カルボニル及びニトロチロシン（ｐｒｏｔｅｉｎｃａｒｂｏｎｙｌ，ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）の増加が黒質で発見される。また、パーキンソン病の動物モデルで細胞枯死の証拠が報告され（ＴａｔｔｏｎａｎｄＫｉｓｈ，１９９７，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７７，１０３７−１０４８；Ｈｅｅｔａｌ．，２０００，ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ，８５８，１６３−１６６；ｔｕｒｍｅｌｅｔａｌ．，２００１，ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１６，１８５−１８９）ニューロトロフィンであるＢＤＮＦやＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）がパーキンソン病の細胞枯死を選択的に抑制して神経細胞を保護すると報告されたので（Ｂｒａｄｆｏｒｄｅｔａｌ．，１９９９，Ａｄｖ．Ｎｅｒｕｒｏｌ．，８０，１９−２５；Ｌｅｖｉｖｉｅｒｅｔａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５，７８１０−７８２０；Ｏｌｓｏｎ，１９９６，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２，４００−４０１；Ｇａｓｈｅｔａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８０，２５２−２５５）本発明で記述したニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤はパーキンソン病の治療に非常に有効に用いられ得る。

＜適用例３＞ルーゲリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）
筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）は、主に脊髓神経の下位運動ニューロン（ｌｏｗｅｒｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎ）から始まって次第に上位運動ニューロン（ｕｐｐｅｒｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎ）へと進んで、大脳皮質、脳幹、脊髓の運動神経細胞の損傷を伴い、筋萎縮、呼吸筋力の弱化及び繊維束性攣縮が特徴的に現れ、症状が初めて観察されてから２〜５年内に死亡する。特に、遺伝的筋萎縮性側索硬化症病患者で染色体２１番（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２１）に位置するスーパーオキシドラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌ）を除去してくれるＳＯＤ−１遺伝子で変異が観察されて酸化的毒性が現れて患者の脳で相和的毒性の指標である蛋白質カルボニル群が増加していると報告された（Ｂｏｗｌｉｎｇｅｔａｌ．，１９９３、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６１、２３２２−２３２５）。最近ニューロトロフィンの一種であるＢＤＮＦをルーゲリックを治療するための臨床実験に適用した結果、治療効果を観察できなかったが（Ａｐｆｅｌｅｔａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，３９（４），３５１−５）、ＢＤＮＦ自体による酸化的毒性の結果とも関連があると推測される。したがって、酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを用いればルーゲリック病をさらに有効に治療できる。

＜適用例４＞虚血性脳卒中（Ｈｙｐｏｘｉｃ−ｉｓｃｈｅｍｉｃｉｎｊｕｒｙ）
脳卒中は脳の血液循環障害（血栓症、塞栓症、狹窄症）によって一定な量で供給される葡萄糖及び酸素が乏しいことによって起こる疾患であって、損傷を受けた脳による身体機能調節の損失によって、麻痺症状、言語及び認知機能の障害が発生する。脳卒中が起こった後細胞膜の脱極性（ｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）によって細胞内にカルシウムが流入されると、これがまたミトコンドリアに流入されて呼吸体系（ｒｅｐｉｒａｔｏｒｙｃｈａｉｎ）が損傷され活性酸素の生成が増加して細胞内に活性酸素が過量積もるようになる。生成された活性酸素は、細胞膜脂質の破壊、遺伝子の損傷、蛋白質変性などを誘導して神経細胞の壊死が起こり、これに対して抗酸化剤は虚血性神経細胞の壊死を抑制する効果がある（Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，１９９６，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３９（１），１１４−１２２；Ｆｅｒｒｅｒｅｔａｌ．，２００１，Ａｃｔａｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ．），１０１（３），２２９−３８；Ｈａｌｌｅｔａｌ．，１９９０，Ｓｔｒｏｋｅ，２１，１１１８３−１１１８７）。また、これ以外にも脳卒中後虚血部位（ｉｓｃｈｅｍｉｃａｒｅａ）の半陰影地域（ｐｅｎｕｍｂｒａｚｏｎｅ）でＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）とＴＵＮＥＬ染色のような細胞枯死の特徴も観察されることから細胞の枯死と壊死とが同時に起こることがわかる。従って、本発明のニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤が脳卒中を効率的に予防、治療できる。

＜適用例５＞退行性脊椎損傷（Ｃｈｒｏｎｉｃｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ）
脊椎の損傷は下半身麻痺と四肢麻痺を起こして損傷部位から遠い距離にある部位まで神経細胞の壊死が観察されるが、これに対する治療剤や治療法が開発されていない実情である。脊椎損傷にはＣａ^２＋の流入、細胞膜の崩壊、酸化的毒性による脂質の過酸化が観察されると報告され（ＢｒｏｗｎａｎｄＨａｌｌ，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２００，１８４９−１８５９；Ｓｐｒｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６８，２４６９−２４７６；ＪｕｕｒｌｉｎｋａｎｄＰａｔｅｒｓｏｎ，１９９８，Ｊ．ＳｐｉｎａｌｃｏｒｄＭｅｄ．，２１，３０９−３３４）、最近には細胞の壊死が２次損傷に関与するという証拠が提示されており、細胞壊死に関与する酵素であるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）に対する抑制剤が神経細胞の壊死を減少させると報告された（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５９，７３３−７３９）。従って、ニューロトロフィンの神経保護作用と、酸化的毒性抑制剤が有したニューロトロフィンの短所を補完する役割を通じて退行性脊椎損傷の治療に有効に用いられ得る（Ｊｉｎｅｔａｌ．，２００２，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１７７（１），２６５−７５）。

＜適用例６＞ハンチングトン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）
ハンチングトン病は線状プロジェクションニューロン（ｓｔｒｉａｔａｌｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｎｅｕｒｏｎ）が選択的に枯死する退行性脳疾患であって、神経細胞枯死に活性酸素が関与し、ニューロトロフィンの生成を誘導したり外部からニューロトロフィンを投与することによって病の進行を抑制できると知られている。最近は、ＧＤＮＦやＢＤＮＦなどのようなニューロトロフィンを生成するように遺伝的に造作された神経細胞を線状ニューロンに注入した場合、ハンチングトン病動物モデルの神経細胞枯死を減少させるという研究結果もある（Ｐｅｒｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏｅｔａｌ．，２０００，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７５（５），２１９０−９）。従って、ニューロトロフィンを酸化的毒性抑制剤と共に投与するとハンチングトン病の治療及び予防に有効に用いられ得ることがわかる。

＜適用例７＞緑内障（Ｇｌａｕｃｏｍａ）及び網膜退化（Ｒｅｎａｌｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ）
網膜退化の主要原因としては、虚血による退化と神経栄養因子の欠乏による網膜神経細胞の退化があり、退化のメカニズムは複合的に現れる。虚血による網膜神経細胞の枯死の過程は、眼圧の増加（緑内障、Ｇｌａｕｃｏｍａ）によって網膜への血流が塞がれたり減少するようになり、虚血状態になって自由ラジカルの生成によって網膜神経細胞は枯死するようになる（Ｋｏｅｔａｌ．，２０００，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４１（１０），２９６７−７１）。視神経切断による網膜退化動物モデルがあるが、これはニューロトロフィンの欠乏と細胞枯死のモデルとして知られている。上記モデルは網膜神経節細胞の退化を誘導するが、退化過程はゆっくり起こり視神経切断後１４日後に約８０％以上の神経節細胞が退化されると知られており、視神経切断による神経細胞の退化はニューロトロフィンの欠乏によって神経節細胞の反応が消えることによって起ころと報告された（Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．，１９９９，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４０（７），１５３０−１５４４）。従って、このような視神経細胞の枯死を防止するためには、ニューロトロフィンと酸化的毒性抑制剤を複合的に処理することが治療に非常に効果的であろうと期待される。

〔産業上の利用可能性〕
本発明の酸化的毒性抑制剤はニューロトロフィンによって誘導される細胞壊死を抑制し、ニューロトロフィンによる細胞枯死の抑制を遮断しなくて、ニューロトロフィンと共に処理する場合、細胞壊死及び細胞枯死を同時に抑制することができ、虚血性脳卒中、退行性脊椎損傷、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、ハンチングトン病、緑内障、及び網膜剥離などの神経疾患を治療または予防するのに有用に用いられ得る。

Claims

酸化的毒性抑制剤を投与してニューロトロフィンによって誘導される細胞死滅を抑制する方法。
上記の方法は酸化的毒性抑制剤とニューロトロフィンとを共に投与することを特徴とする請求項１に記載の細胞死滅を抑制する方法。
上記ニューロトロフィンは、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン−３及びＮＴ−４／５からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
上記ニューロトロフィンはＢＤＮＦであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
上記酸化的毒性抑制剤は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤、ビタミンＥまたはその誘導体及びテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
上記ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤はジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）及び４−（２−アミノエチル）−ベンゼルスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
上記ビタミンＥの誘導体はトロロックスであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
上記テトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体は、ＢＡＳ（５−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＴＢＡＳ（５−（４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＮＢＡＳ（５−（４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＣＢＡＳ（５−（４−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＭＢＡＳ（５−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ），ＦＢＡＳ（５−（４−ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｘｙｌ）ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ）及び２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−５−（２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ− ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ）−ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）からなる群より選択される一つ以上であるであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
上記方法は、虚血性脳卒中、退行性脊椎損傷、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、ハンチングトン病、緑内障または網膜剥離の治療または予防に用いることを特徴とする請求項２に記載の方法。
上記細胞死滅は細胞壊死及び／または細胞枯死であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の方法。
ＢＡＳ、ＴＢＡＳ、ＮＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＦＢＡＳ及び２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡからなるテトラフルオロベンジルアミノサリチル酸誘導体から選択された一つ以上を有効成分として含有するニューロトロフィンによって誘導された細胞死滅抑制剤。
上記抑制剤は、有効成分のニューロトロフィンをさらに含有することを特徴とする請求項１１に記載の細胞死滅抑制剤。
上記細胞死滅は、細胞壊死及び／または細胞枯死であることを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載の細胞死滅抑制剤。