JP5208369B2 - 神経細胞の死滅または神経機能の障害を治療するための薬学製剤及び併用療法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞死を抑制する方法に関するものであって、より具体的には、神経細胞の死滅と関連した疾患の中で、細胞枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と細胞壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）とを同時に抑制して、細胞保護の効果、生存増進の効果及び脳機能の増進の効果を向上させる薬学製剤及び併用療法に関する。

神経細胞の死滅は、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、ハンチントン病などの退行性脳疾患、脳卒中などの脳血管疾患、急性脳及び脊髓損傷はもちろん主要眼疾患である緑内障、黄斑部変性及び糖尿病性網膜症の主な病理現象であり、神経細胞の死滅とともに致命的な脳機能、脊髓機能または眼機能の損傷に繋がるため、これを有効に防止する薬物に対する開発が活発に進んでいる（Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９;Ｌｅｗｅｎ ｅｔ ａｌ., ２０００; Ｄａｎｙｓｚ ｅｔ ａｌ．，２００１; ａｎｄ Ｂｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

脳及び眼疾患における神経細胞の死滅は細胞壊死が主要機転であり、活性酸素と興奮性毒性とが神経細胞の壊死の主媒介体として働くことが明らかになっている（Ｂｅａｌ，１９９６;Ｄｕｇａｎ ＆ Ｃｈｏｉ，１９９４）。活性酸素は自由基の生成が増加するか細胞内の自由基除去機転の障害によって発生し、生成された活性酸素は細胞の機能と生存に必須的な蛋白質、脂質、核酸などの酸化を誘導して細胞の死滅を誘導するようになる。グルタメートは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパテート（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ；ＮＭＤＡ）グルタメート受容体の活性を通じて遅い興奮性神経伝達と、カイネート（ｋａｉｎａｔｅ）、 アルファ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（α−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉｓｏｘａｚｏｌｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＭＰＡ）グルタメート受容体の活性を通じた速い興奮性神経伝達とを媒介する中枢神経系の興奮性神経伝達物質である。グルタメート受容体は過度に興奮されれば神経細胞の死滅を誘導し、これを興奮性毒性と言う。興奮性毒性及び活性酸素による神経細胞の死滅は細胞質の膨脹、初期段階の細胞膜破壊を伴う壊死形態であると報告されている。

興奮性毒性及び酸化毒性により媒介される神経細胞の死滅がアルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲリック病、ハンチントン病、緑内障、黄斑部変性などの死後脳及び眼組織、そして動物モデルにおいて報告されており（Ｒａｏ ＆ Ｗｅｉｓｓ，２００３; Ｗａｌｄｍｅｉｅｒ，２００３; Ｍｅｌｄｒｕｍ，２０００）、また、ミトコンドリア異常、酸化促進物質の生成及びＤＮＡ、脂質、蛋白質の酸化が脳疾患及び眼疾患の動物モデル及び患者で観察されると知られている（Ｍｅｃｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００３; Ｄａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３; Ｂｅａｌ，１９９５ ＆ ２００１; Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２; Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２; Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

グルタメート受容体の拮抗剤及び抗酸化剤の投与は、ルーゲリック病（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００; Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、アルツハイマー性痴呆（Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４; Ｍｉｇｕｅｌ−Ｈｉｄａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２） 、脳卒中（Ｈｏｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６; Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ., １９８８） 、ハンチントン病（Ａｎｄｒｅａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１; Ｂｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、脊髓損傷（Ｆａｄｅｎ ＆ ｓａｌｚｍａｎ １９９２;Ｆａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、パーキンソン病（Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９; Ｒａｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２）などのような脳疾患、緑内障（Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ., ２００２; Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ., １９９９）、糖尿病性網膜症（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００５; Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ., ２００２）及び黄斑部変性（Ｒｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ., ２００４）などのような眼疾患において、神経細胞の死滅と病理現象を減少させると報告されている。

また、抗酸化剤は、上記疾患の治療剤として開発するために臨床研究が進んでいる（Ｇｉｌｇｕｎ−Ｓｈｅｒｋｉ ｅｔ ａｌ., ２００２）。しかし、ビタミンＥ、アセチル−Ｌ−カルニチンのような抗酸化剤は、アルツハイマー性痴呆及びパーキンソン病では治療効果を示さなかった（Ｈｕｄｓｏｎ ＆ Ｔａｂｅｔ，２００３; Ｔｈａｌ ｅｔ ａｌ., ２００３; Ｌｕｃｈｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ., ２００３; Ｍｏｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ., １９９６）。脳疾患治療剤としての臨床開発において、抗酸化剤は低い効果（ｌｏｗ ｐｏｔｅｎｃｙ）及び血液脳関門（ＢＢＢ，ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）の透過率が障害要因となっている（Ｇｉｌｇｕｎ−Ｓｈｅｒｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２; Ｍｏｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

グルタメート受容体の拮抗剤も上記疾患の治療剤として開発が進んでおり、グルタメート受容体の拮抗剤を投与すれば虚血性脳卒中を含んだ多様な動物モデルで神経細胞の死滅を抑制すると知られた。このようなグルタメート受容体の拮抗剤は、狭い治療指数（ｎａｒｒｏｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）とタイムウィンドー（ｔｉｍｅ ｗｉｎｄｏｗ）とが脳卒中などの脳疾患治療剤として開発するのに深刻な障害要因となっている（Ｌａｂｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ., ２００４; Ｈｏｙｔｅ ｅｔ ａｌ., ２００４; Ｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ ＆ Ｔｕｒｓｋｉ, ２００２）。このように、抗酸化剤及びグルタメート受容体の拮抗剤のような細胞壊死抑制剤の治療剤の開発に当たってこのような問題点は解決されなければならない。

予定死または枯死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が脳疾患において神経細胞の死滅に関与するという証拠が提示されている。枯死は、細胞質と核の収縮、核染色質の凝縮、核膜の破壊、核酸の規則的分解及び自殺遺伝子と蛋白質の活性により徐々に進まれる細胞死滅の類型である（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ., １９７２; Ｇｗａｇ ｅｔ ａｌ., １９９５; Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ., ２０００）。

最近、細胞枯死を抑制するニューロトロフィンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞壊死を増加させると報告された（Ｇｗａｇ ＆ Ｋｉｍ，２００３; Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５; Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００; Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）。このような事実は、細胞枯死と壊死とが互いに異なる経路で進まれる可能性を提示することである。

特に、ＴＵＮＥＬ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞、ヌクレオソーム間の核酸分解、Ｂａｘのような細胞枯死促進蛋白質の発現及び代表的な自殺蛋白質として１４種のシステイン−アスパテートプロテアーゼ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ， ｃａｓｐａｓｅｓ）の活性が、脳卒中（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４; Ｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２; Ｃｈｏｉ，１９９６）、パーキンソン病（Ｈａｒｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００; Ｔａｔｔｏｎ，２０００; Ｔｕｒｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００１; Ｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２００１）、ルーゲリック病（Ｗｏｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００４; Ｍａｒｔｉｎ，１９９９; Ｍｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６; Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０００; Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ., ２０００）、アルツハイマー性痴呆（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５; Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７）及び脊髓損傷（Ｅｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８; Ｆｉｓｋｕｍ，２０００）などのような脳疾患の損傷された脳部位で観察されると報告されている。

脳疾患における神経細胞の枯死を防止する薬物の開発が活発に進んでいるが、特にカスパーゼ抑制剤（Ｈｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０００; Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ニューロトロフィック因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）（Ｇｗａｇ ＆ Ｋｉｍ，２００３; Ｌｅｗｉｎ ＆ Ｂａｒｄｅ，１９９６）及びＣＥＰ−１３４７とＣＥＰ−１１００４のようなｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）抑制剤（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４; Ｓａｐｏｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）などが開発されて前臨床及び初期臨床段階に進入している。しかし、これらのペプチド、ニューロトロフィン及びＪＮＫ抑制剤の脳及び眼疾患の治療剤としての開発に脳血管障壁の透過率及び安定性が問題となった。

一方、リチウムは原子番号３番の単純な軽金属であり、約２００年前発見され、約５０年前豪州の精神科医師であったＪｏｈｎ Ｃａｄｅが躁うつ病患者に初めて用いた以来、過去５０年間躁うつ病及び反復性躁うつ病の急性期だけでなく、再発防止のために広範囲に用いられてきた（Ｇｏｏｄｗｉｎ ａｎｄ Ｊａｍｉｓｏｎ，１９９０）。最近、興味深くもリチウムの神経細胞の保護効果に対する報告が増えている。例えば、リチウムはセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、スタウスポリン（ｓｔａｕｓｐｏｒｉｎｅ）、アミロイドベータ及びカリウム欠乏による神経細胞の枯死は抑制できたが（Ｂｉｊｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０００; Ｃｅｎｔｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８; Ｄ’Ｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ., １９９４; Ｇｈｒｉｂｉ ｅｔ ａｌ., ２００３）、細胞壊死は抑制できなかった。しかし、リチウムの神経細胞の保護作用は抗枯死効果に限定される可能性が高いが、その証拠としてリチウムは自殺遺伝子であるＢａｘとｐ５３の減少を抑制し、生存遺伝子であるＢｃｌ２の発現を増加させ、ニューロトロフィンのようにホスホイノシチド（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ）３−キナーゼとホスホリパーゼＣγの活性を通じて神経細胞の枯死を抑制するということである（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００３）。

従って、本発明が解決しようとする技術的課題は、細胞壊死と細胞枯死とを同時に抑制することによって細胞の保護効果及び脳機能の増進効果を向上させ得るという仮説に基づいて、神経細胞の壊死及び枯死を同時に抑制するだけでなく二種類の薬物が相互補完的に作用してシナジー効果を発揮することによって、神経細胞の死滅を治療または予防するのにさらに有効な複合剤である薬学製剤及び併用療法を提供することである。

上記技術的課題を達成するために、本発明は、（ａ）細胞壊死抑制剤、及び（ｂ）リチウムまたはリチウムの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする薬学製剤またはキットを提供する。

また、本発明は、上記薬学製剤またはキットが神経細胞死滅の治療または予防用であることを特徴とする薬学製剤またはキットを提供し、さらに、本発明は、上記薬学製剤が神経細胞の死滅と関連した脳疾患または眼疾患の治療または予防用であることを特徴とする薬学製剤またはキットを提供する。

さらに、本発明は、上記脳疾患が、ルーゲリック病、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、外傷性脳損傷及び外傷性脊髄損傷から構成された群より選択された何れか一つであることを特徴とする薬学製剤またはキットを提供し、また上記眼疾患が緑内障、老人性黄斑変性及び糖尿病性網膜症から構成された群より選択された何れか一つであることを特徴とする薬学製剤またはキットを提供する。

さらに、本発明は、上記細胞壊死抑制剤が下記化学式１で表されるベンジルアミノサリチル酸誘導体とこれの薬学的に許容可能な塩、及び下記化学式２で表されるテトラフルオロベンジル誘導体とこれの薬学的に許容可能な塩、から構成された群より選択された何れか一つ以上であることを特徴とする薬学製剤またはキットを提供する：

上記化学式１において、
Ｘは、ＣＯ、ＳＯ_２または（ＣＨ_２）ｎ（ｎは１ないし５の常数）であり、
Ｒ_１は、水素、アルキルまたはアルカノイル（ａｌｋａｎｏｙｌ）であり、
Ｒ_２は、水素またはアルキルであり、
Ｒ_３は、水素またはアセチルであり、
Ｒ_４は、非置換フェニルまたはニトロ、ハロゲン、ハロアルキル及び炭素数１ないし５のアルコキシから構成された群より選択された何れか一つ以上に置換されたフェニルである；

上記化学式２において、
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、各々水素またはハロゲンであり、
Ｒ_４は、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロゲンに置換されたアルコキシ、アルカノイルオキシまたはニトロであり、
Ｒ_５は、カルボキシ酸、炭素数１ないし４のアルキル基を有したエステル、カルボキシアミド、スルホン酸、ハロゲンまたはニトロである。

本発明は、また、（ａ）薬学的に有効な量の細胞壊死抑制剤及び（ｂ）薬学的に有効な量のリチウムまたはこれの塩を併用することを特徴とする神経細胞の死滅の治療または予防方法を提供する。

さらに、本発明は、上記方法が脳疾患を治療または予防するためのものであることを特徴とする神経細胞の死滅の治療または予防方法を提供し、さらに、上記脳疾患が、ルーゲリック病、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、外傷性脳損傷及び外傷性脊髄損傷から構成された群より選択された何れか一つであることを特徴とする神経細胞の死滅の治療または予防方法を提供する。

さらに、本発明は、上記方法が眼疾患を治療または予防するためのものであることを特徴とする神経細胞の死滅の治療または予防方法を提供し、さらに、上記眼疾患が、緑内障、老人性黄斑変性及び糖尿病性網膜症から構成された群より選択された何れか一つであることを特徴とする神経細胞の死滅の治療または予防方法を提供する。

本発明は、また、細胞壊死抑制剤が上記化学式１で表されるベンジルアミノサリチル酸誘導体及びこれの薬学的に許容可能な塩、及び上記化学式２で示されるテトラフルオロベンジル誘導体及びこれの薬学的に許容可能な塩、から構成された群より選択された何れか一つ以上であることを特徴とする神経細胞の死滅の治療または予防方法を提供する。

以下、本発明の神経細胞の死滅を治療または予防するための複合剤及び併用療法についてより具体的に説明する。

本発明は、細胞壊死抑制剤は活性酸素を含む様々な原因に基づいた神経細胞の壊死は抑制できるが枯死による神経細胞の死滅は抑制できず、リチウムは神経細胞の枯死は抑制できるが活性酸素による神経細胞の壊死は抑制できないという事実と、このような細胞壊死抑制剤とリチウムとを同時に投与すれば神経細胞の死滅と関連したいろんな疾患、特に脳及び眼疾患における細胞死滅制御の効果、脳機能の改善効果及び生存延長の効果がさらに増進されるという驚くべき事実に基づく。

従って、本発明は、細胞壊死抑制剤及びリチウムを含むことを特徴とする神経細胞の死滅を治療または予防するための薬学製剤またはキットを提供する。また、本発明は、このような薬学製剤またはキットを用いるか、細胞壊死抑制剤とリチウムのうち一種類の成分が薬効を発揮する水準に服用した個体の体内に存在する間、他の一種類の成分を投与して二種類の成分が体内でシナジー効果を発揮するようにする神経細胞の死滅の治療または予防方法を提供する。

前述したように、細胞壊死抑制剤を投与して活性酸素を含む様々な原因による神経細胞の壊死を抑制し、同時にリチウムを投与して神経細胞の枯死を抑制すれば神経細胞の死滅を総合的に治療または予防できるだけでなく、上記二種類の薬物が相互補完的に作用して神経細胞の死滅と関連した疾患の治療または予防効果がシンナー的に向上される長所がある。

即ち、リチウムは神経細胞の枯死は抑制するが、神経細胞の死滅は防止しない。しかし、リチウムと共に細胞壊死抑制剤を投与すれば、リチウムにより細胞枯死が抑制され同時に細胞壊死抑制剤により活性酸素を含む様々な原因による神経細胞の壊死が抑制され、このとき細胞壊死抑制剤はリチウムによる細胞枯死の抑制には影響を及ぼさない。従って、リチウム及び細胞壊死抑制剤を共に処理すれば活性酸素による神経細胞の壊死及び枯死を同時に抑制させ得る。即ち、本発明のように、細胞壊死抑制剤及びリチウムを共に投与すれば活性酸素による神経細胞の壊死及び細胞枯死と関連した疾患、例えば、ルーゲリック病、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷などの脳疾患と、緑内障、糖尿病性網膜症、老人性黄斑変性などの眼疾患と、を有効に治療または予防できる。但し、本発明の薬学製剤またはキットと本発明による併用療法は、神経細胞の死滅と関連したいかなる疾患にも適用可能であり、前述したルーゲリック病、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、緑内障、糖尿病性網膜症などに本発明の適用範囲が限定されるのではない。

従って、本発明による薬学製剤またはキットは細胞壊死抑制剤を含み、より望ましくは、本発明は、本発明者らが以前開発した細胞壊死抑制剤とリチウムまたはリチウム塩を併用する場合、目的とするシナジー効果がより卓越であるという驚くべき事実に基づく。

本発明者は、大脳皮質細胞における神経細胞の保護効果及び脳疾患の動物モデルにおいて興奮性毒性、酸化的毒性及び亜鉛毒性により誘導される神経細胞の壊死を抑制する非常に有効な神経細胞保護剤を開発したことがあり（米国特許第６，９６４，９８２号、第６，５７３，４０２号及び第６，９２７，３０３号参照）、従って、このような神経細胞保護剤がリチウムと併用される場合、神経細胞の死滅を防止するのにさらに有用である。

従って、より望ましくは、本発明の薬学製剤またはキットは細胞壊死抑制剤として下記化学式１で表されるベンジルアミノサリチル酸誘導体及びこれの薬学的に許容可能な塩と、下記化学式２で表されるテトラフルオロベンジル誘導体及びこれの薬学的に許容可能な塩と、から構成された群より選択された何れか一つ以上を含む。

上記化学式１において、
Ｘは、ＣＯ、ＳＯ_２または（ＣＨ_２）ｎ（ｎは１ないし５の常数）であり、
Ｒ_１は、水素、アルキルまたはアルカノイルであり、
Ｒ_２は、水素またはアルキルであり、
Ｒ_３は、水素またはアセチルであり、
Ｒ_４は、非置換フェニルまたはニトロ、ハロゲン、ハロアルキル及び炭素数１ないし５のアルコキシから構成された群より選択された何れか一つ以上に置換されたフェニルである；

上記化学式２において、
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、各々水素またはハロゲンであり、
Ｒ_４は、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロゲンに置換されたアルコキシ、アルカノイルオキシまたはニトロであり、
Ｒ_５は、カルボキシ酸、炭素数１ないし４のアルキル基を有したエステル、カルボキシアミド、スルホン酸、ハロゲンまたはニトロである。

上記化学式１または２において、アルキルは炭素数１ないし４のアルキルであることが望ましく、炭素数１または２のアルキルであることがさらに望ましい。具体的に、上記アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、２次−ブチル及び３次−ブチル基が望ましいが、これに限定されるのではない。アルコキシは、炭素数１ないし４のアルコキシであることが望ましく、炭素数１または２であるアルコキシであることがさらに望ましい。具体的に、上記アルコキシとしては、メトキシ、エトキシ及びプロトキシが望ましいが、これに限定されるのではない。ハロゲンは、フッ素、塩素、ブロム及びヨードであることが望ましいが、これに限定されるのではない。アルカノイルオキシ（ａｌｋａｎｏｙｌｏｘｙ）は、炭素数２ないし１０のアルカノイルオキシであることが望ましく、炭素数３または５であることがさらに望ましい。具体的に、上記アルカノイルオキシとしては、エタノイルオキシ、プロパノイルオキシ及びシクロヘキサンカルボニルオキシが望ましいが、これに限定されるのではない。

前述したように、上記望ましい細胞壊死抑制剤はナノモル（ｎａｎｏｍｏｌａｒ）濃度で様々な原因に起因した神経細胞の死滅を完全に抑制し、脳卒中、脊髄損傷、ルーゲリック病、パーキンソン病などの動物モデルで神経細胞の死滅防止効果が検証された、強力な神経細胞の壊死の抑制効果を示す化合物であるため非常に効果的であり（米国特許第６，９６４，９８２号、第６，５７３，４０２号及び第６，９２７，３０３号参照）、このような細胞壊死抑制剤がリチウムまたはリチウム塩と併用される場合、神経細胞の死滅をより有効に抑制できるためさらに望ましい。

上記細胞壊死抑制剤の毒性、神経細胞の保護効果などの治療効率、リチウムとの併用効率などを考慮すれば、上記ベンジルアミノサリチル酸誘導体としては、５−ベンジルアミノサリチル酸（ＢＡＳ）、５−（４−ニトロベンジル）アミノサリチル酸（ＮＢＡＳ）、５−（４−クロロベンジル）アミノサリチル酸（ＣＢＡＳ）、５−（４−トリフルオロメチルベンジル）アミノサリチル酸（ＴＢＡＳ）、５−（４−フルオロベンジル）アミノサリチル酸（ＦＢＡＳ）、５−（４−メトキシベンジル）アミノサリチル酸（ＭＢＡＳ）、５−（４−ペンタフルオロベンジル）アミノサリチル酸（ＰＢＡＳ）、５−（４−ニトロベンジル）アミノ−２−ヒドロキシエチルベンゾエート、５−（４−ニトロベンジル）−Ｎ−アセチルアミノ−２−ヒドロキシエチルベンゾエート、５−（４−ニトロベンジル）−Ｎ−アセチルアミノ−２−アセトキシエチルベンゾエート、５−（４−ニトロベンゾイル）アミノサリチル酸、５−（４−ニトロベンゼンスルホニル）アミノサリチル酸、５−（４−ニトロフェネチル）アミノサリチル酸、５−[２−（４−ニトロフェニル）−エチル]アミノサリチル酸（ＮＰＡＡ）、５−[３−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−プロピル]アミノサリチル酸（ＮＰＰＡＡ）、２−ヒドロキシ−５−（２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）エチルアミノ]−安息香酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡ）及びこれらの薬学的に許容可能な塩から構成された群より選択された何れか一つ以上であることが望ましく、５−ベンジルアミノサリチル酸、５−（４−トリフルオロメチルベンジル）アミノサリチル酸、５−（４−ニトロベンジル）アミノサリチル酸、５−（４−クロロベンジル）アミノサリチル酸、５−（４−メトキシベンジル）アミノサリチル酸、５−（４−フルオロベンジル）アミノサリチル酸、５−（４−ペンタフルオロベンジル）アミノサリチル酸、２−ヒドロキシ−５−（２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）エチルアミノ）−安息香酸及びこれらの薬学的に許容可能な塩から構成された群より選択された何れか一つ以上であることがさらに望ましい。

また、上記テトラフルオロベンジル誘導体としては、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ）、２−ニトロ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−クロロ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−ブロモ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−メチルベンジルアミノ）−安息香酸、２−メチル−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−メトキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−２−トリフルオロメトキシ安息香酸、２−ニトロ−４−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）フェノール、２−クロロ−４−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）フェノール、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）ベンズアミド、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）ベンゼンスルホン酸、メチル２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸塩、２−エタノイルオキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸、２−プロパノイルオキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸、２−シクロヘキサンカルボニルオキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸及びこれらの薬学的に許容可能な塩から構成された群より選択された何れか一つ以上であることが望ましく、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸またはこれの薬学的に許容可能な塩であることがさらに望ましい。

本発明の「薬学的に許容可能な塩」とは、毒性がないか少ない酸または塩基で製造された塩を言う。本発明の化合物が相対的に酸性である場合、塩基（ｂａｓｅ）付加塩は十分な量の所望の塩基と適当な非活性（ｉｎｅｒｔ）溶媒によりその化合物の中性形態を接触して得ることができる。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまたは有機アミノからなる塩を含むが、これに限定されるのではない。本発明の化合物が相対的に塩基性である場合、酸（ａｃｉｄ）付加塩は十分な量の所望の酸と適当な非活性によりその化合物の中性形態を接触して得ることができる。薬学的に許容可能な酸付加塩は、プロピオン酸、イソブチル酸、シュウ酸、りんご酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、 スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、塩酸、ブロム酸、窒酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ）、燐酸、一水素燐酸、二水素燐酸、硫酸、一水素硫酸、ヨード化水素、亞りん酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ａｃｉｄ）などで形成された塩を含むが、これに限定されるのではない。また、アルジネート（ａｒｇｉｎａｔｅ）のようなアミノ酸の塩及びグルクロニック（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ）またはガラクツノリック（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ）酸のような有機酸の類似体を含むが、これに限定されるのではない。

本発明の一部化合物は水化物形態を含んで溶媒化された形態だけでなく非−溶媒化された（ｕｎｓｏｌｖａｔｅｄ）形態で存在する場合もある。本発明の一部化合物は結晶形または無定形の形態で存在することもでき、このような全ての物理的形態は本発明の範囲に含まれる。また、本発明の一部化合物は光学中心である非対称炭素原子または二重結合を有することができるためラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性質体などが存在することができて、これらも本発明の範囲に含まれる。

本発明の薬学製剤またはキットは、リチウムまたはこれの薬学的に許容可能な塩を含む。リチウム塩としては、リチウムカーボネート、リチウムクロライド、リチウムブロマイド、リチウムアセテート、リチウムシトレート、リチウムサクシネート（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、リチウムアセチルサリシレート、リチウムベンゾエート、リチウムビタルトレート、リチウムニトレート、リチウムセレネート（ｓｅｌｅｎａｔｅ）、リチウムサルフェート、リチウムアスパテート、リチウムグルコネート及びリチウムテオネート（ｔｈｅｏｎａｔｅ）が用いられ得るが、これに限定されるのではない。

また、本発明の薬学製剤またはキットは細胞壊死抑制剤のリチウム塩を含むことができ、より望ましくは、上記化学式１で表されるベンジルアミノサリチル酸誘導体のリチウム塩または上記化学式２で表されるテトラフルオロベンジル誘導体のリチウム塩を含むことができる。

本発明は、また、細胞壊死抑制剤、リチウム及び薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤を含む薬剤学的組成物を提供する。本発明の細胞壊死抑制剤及びリチウムは単独で或いは適宜の運搬体、賦形剤などと共に混合して投与されることができ、そのような投与剤形は単回投与または反復投与剤形であり得る。

本発明の薬学製剤は固形製剤または液状製剤であり得、固形製剤は散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されるのではない。固形製剤には、賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩解剤、滑澤剤、充填剤などが含まれ得るが、これに限定されるのではない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、油剤などがあるが、これに限定されるのではなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。

本発明の薬学製剤またはキットは、治療すべき疾患及び個体の状態により経口剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔注射、静脈注射、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、皮下注射、インプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、トランスサーマル剤、トピカル剤などで投与され得るが、これに限定されるのではない。投与経路によって通常的に使用され非毒性である、薬剤学的に許容される運搬体、添加剤、賦形剤を含む適当な投与ユニット剤形で製剤化され得る。一定時間薬物を持続的に放出できるデポー（ｄｅｐｏｔ）剤形も本発明の範囲に含まれる。

上記言及された神経細胞の死滅と関連した疾患、特に脳疾患または眼疾患の治療のための使用において、本発明の細胞壊死抑制剤は、毎日約０.１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｇ／ｋｇが投与され得、約０.５ｍｇ／ｋｇないし約１０ｇ／ｋｇの１日投与容量が望ましい。本発明のリチウムは、毎日約１ｍｇ／ｋｇないし約２０００ｍｇ／ｋｇが投与され得、約２０ｍｇ／ｋｇないし約６００ｍｇ／ｋｇの１日投与容量が望ましい。しかし、上記投与量は患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性、使用された化合物などによって多様である。必要によって便利性のために１日の総投与量が分けられ一日間数回に分けて投与され得る。

本明細書で使用されるときに、細胞壊死抑制剤とリチウムとの「併用」は、これらの化合物を同時または順次投与することを意味する。より具体的に、一方の薬物の個体内の作用部位での濃度が治療的に有効な濃度であるとき、他の薬物が投与されることも本発明の併用範囲に含まれる。但し、本発明の細胞壊死抑制剤及びリチウムは一つの薬剤学的組成物または薬学製剤にともに含まれることが患者の順応度及び相互作用の面で望ましい。

以下、本発明をより具体的に説明するために下記実施例などを挙げて説明する。しかし、本発明による実施例は種々のほかの形態に変形されることができ、本発明の範囲が以下で詳述する実施例に限定されるものとして解釈されてはいけない。本発明の実施例は、本発明の具体的な理解を助けるために例示的に提供されるものである。

本発明は、神経細胞の壊死は抑制するが神経細胞の枯死は抑制しない細胞壊死抑制剤と、神経細胞の枯死は抑制するが神経細胞の壊死は抑制しないリチウムとを共に含む薬学製剤またはキットとこれらを用いる併用療法を提供する。このような薬学製剤などは活性酸素などの様々な原因による神経細胞の死滅及び細胞の枯死を同時に抑制できるだけでなく相互補完的に作用してシナジー効果を示すことができる。

＜実施例１＞ 神経細胞と神経膠細胞との混合培養
神経細胞(ｎｅｕｒｏｎ)と神経膠細胞(ｇｌｉａ)の混合培養のために妊娠１４〜１６日目(Ｅ１４-１６)のマウス胎児から大脳皮質(ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ)を分離、回収してガラス(パスツール)ピペットを用いて組織を単一細胞に分離した後(ｔｒｉｔｕｒａｔｉｏｎ)、ポリ−Ｄ−リジンとラミニンでコーテイングされた２４ウェルプレート(Ｆａｌｃｏｎ，Ｐｒｉｍａｒｉａ)に約２×１０^５／ウェル密度で細胞を分株して５％ＣＯ_２と３７℃に維持される培養器に入れた。分株培養液としては、２ｍＭ グルタミン、２１ｍＭ グルコース、２６．５ｍＭ 重炭酸塩、５％ ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び５％ ウマ血清が補充されたＭＥＭ(Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ)を用いた。

分株後７〜８日目(７〜８ｄａｙｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ：ＤＩＶ７−８)に神経膠細胞(ｇｌｉａ)の繁殖を抑制するため、１０μＭ ＡＲa−Ｃ(ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ)を処理して、分株後１１〜１５日目に下記実施例に記載される薬物処理をした。神経細胞の死滅を定量するために細胞外に遊離される乳酸脱水素酵素(ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ)の量を測定し、５００μＭ ＮＭＤＡを２４時間持続的に投与して１００％ 神経細胞の死滅が誘導されたときに遊離されるＬＤＨの量に比べて神経細胞の死滅を百分率に換算した[Ｋｏｈ ＆ Ｃｈｏｉ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０:８３〜９０(１９８７)]。

＜実施例２＞ ビタミンＥ、トロロクッス（ｔｒｏｌｏｘ）、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡ、ＢＡＳ、ＮＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＦＢＡＳ、ＰＢＡＳ、ＮＰＡＡ、ＮＰＰＡＡ及びＴＢＡＳの酸化的毒性による細胞死滅の抑制効果
実施例１で製造されたニューロン−神経膠細胞の混合培養からＤＩＶ １１〜１５日目の培養細胞に酸化的毒性による神経細胞の死滅を誘導するために５０μＭ ＦｅＣｌ_２（Ｆｅｎｔｏｎ反応によりＯＨ・の生成を促進する）或いは１０ｍＭ ＤＬ−ブチオニン（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ）−[Ｓ，Ｒ]−スルホキシミン（ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）（ＢＳＯ、グルタチオン欠乏誘導物質）で処理した。ＤＩＶ １１〜１５日目の培養細胞に、５０μＭ ＦｅＣｌ_２或いは１０ｍＭ ＢＳＯを単独で、また５０μＭ ＦｅＣｌ_２或いは１０ｍＭ ＢＳＯに０.１〜３０μＭの２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ、０.０１〜３μＭの２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡまたは３〜３００μＭのビタミンＥを同時に添加した。投与２４時間後に細胞外に遊離されるＬＤＨの活性を測定して神経細胞の死滅を定量した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ，Ｎ＝８培養ウェル／実験群）。＊は、アノバ(ＡＮＯＶＡ)及びスチューデント−ニューマン−クルーズテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ)を用いた場合において、対照群（ＦｅＣｌ_２単独またはＢＳＯ単独）に比べてｐ＜０.０５の有意差があることを示す。２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ或いは２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡは０.３ｕＭで完璧に酸化毒性による神経細胞の死滅を抑制した（図１ａ及び１ｂ）。ビタミンＥは、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ或いは２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡより高濃度で酸化的毒性による細胞死滅を抑制した。これは２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ或いは２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡが酸化的毒性に対する強力な細胞保護薬物であることが分かる。数々の細胞壊死抑制剤の細胞保護効果を酸化的毒性による細胞死滅を５０％抑制する濃度、ＩＣ５０値を求めて、その結果を下記表１に示した。表１の結果は、ＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＦＢＡＳ、ＴＢＡＳ、ＰＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＮＰＡＡ、ＮＰＰＡＡ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ及び２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡがビタミンＥに比べて強力な細胞保護薬物であることを示す。

しかし、細胞枯死を抑制する濃度である５ｍＭ リチウム（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００３）をＦｅＣｌ_２或いはＢＳＯと同時に添加する場合、酸化的毒性による神経細胞の死滅に対する保護効果は観察できなかった（図１ｃ）。図１ｃは、培養された大脳皮質神経細胞に、５０μＭ ＦｅＣｌ_２または１０ｍＭ ＢＳＯを単独で、また５０μＭ ＦｅＣｌ_２または１０ｍＭ ＢＳＯに５ｍＭ リチウムを同時に添加し、２４時間後に細胞外に遊離されるＬＤＨの活性を測定して神経細胞の死滅を定量した結果である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ, Ｎ＝９〜１２培養ウェル／実験群）。

＜実施例３＞ リチウムによる神経細胞の枯死の抑制効果
実施例１で製造されたニューロン−神経膠細胞の混合培養から分株後１１〜１５日目（ＤＩＶ１１〜１５）の培養細胞を細胞枯死を誘導するために、２０μＭ シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）Ａ（ＣｓＡ）またはカリキュリン（ｃａｌｉｃｕｌｉｎ）Ａ（Ｃａｌ Ａ）を単独で、また２０μＭ ＣｓＡまたはＣａｌ Ａに３〜３０ｍＭのリチウムを同時に添加した。投与２４時間後に細胞外に遊離されるＬＤＨの活性を測定して神経細胞の死滅を定量した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ, Ｎ＝１２培養ウェル／実験群）。＊は、アノバ(ＡＮＯＶＡ)及びスチューデント−ニューマン−クルーズテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）を用いた場合において、対照群（Ｃａｌ Ａ或いはＣｓＡ）に比べてｐ＜０.０５の有意差があることを示す。実験した結果、リチウムは容量によってＣａｌ Ａ 或いはＣｓＡによる細胞枯死を減少させる効果を示した（図２ａ）。リチウムの代わりに１００uＭ ビタミンＥ、１００uＭ ２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ或いは１００uＭ ２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡを用いた実験において、上記ビタミンＥ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ或いは２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡはＣｓＡによる神経細胞の死滅を抑制することができなかった（図２ｂ）。これはリチウムと、ＢＡＳ、ＣＢＡＳ、ＦＢＡＳ、ＴＢＡＳ、ＰＢＡＳ、ＭＢＡＳ、ＮＰＡＡ、ＮＰＰＡＡ、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡなどの細胞壊死抑制剤とは、細胞枯死と酸化的毒性とによる細胞壊死をそれぞれ選択的に抑制できるということを証明する結果である。

＜実施例４−１＞ 年齢によるＡＬＳ動物モデル（Ｇ９３Ａ ｍｉｃｅ）における酸化的毒性
ＡＬＳ疾患が進みながら発生する活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、以下「ＲＯＳ」と称する）の程度を運動神経が死滅し運動上の障害が生じる以前のＡＬＳ動物モデル（Ｔｇ（＋）, Ｇ９３Ａ ｍｉｃｅ）と、同じ年齢の普通のマウス（Ｔｇ（−）、Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）とを比較評価した。酸化的毒性を観察するためにニトロチロシン（Ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）免疫染色法を用いて８週齢のＧ９３Ａ マウスと同じ年齢の普通のマウスとの腰髄部位の運動神経細胞のニトロチロシンの蛍光強度を観察した。また、他の酸化毒性測定技法で酸化されたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓの蛍光強度の程度をニトロチロシン免疫染色法を用いて８週齢の動物の組織を観察した（図３a）。これはＡＬＳ動物モデルの運動神経細胞で自由ラジカルの生成と蛋白質酸化の蓄積が伴うことを示すことであり、腰髄部位の運動神経細胞外の他の細胞では観察されない。生後４週齢後から２週間隔でＧ９３Ａ マウスと同じ年齢の普通のマウスとの腰髄部位の運動神経細胞での蛍光強度を観察したとき、Ｇ９３Ａ マウスは普通のマウスよりニトロチロシン蛍光強度が既に４週から普通のマウスより３倍も高く、８週齢でその差が４倍以上であり最も有意な値として年齢別頂点に達することを示した。Ｇ９３Ａ マウスが１４週齢に至ってはニトロチロシン免疫反応の強度の差は減少した（図３ｂ）。また、運動神経細胞の死滅の程度をＧ９３Ａ マウスを年齢毎に観察したとき、既に８週から弱く運動神経細胞の数が減り始め動物が死ぬ直前まで次第に減少することが観察された（図３ｃ）。

その結果、Ｇ９３Ａ マウスモデルにおいて、運動神経細胞が死ぬ以前から酸化的毒性は運動神経細胞にのみ特異的に敏感に反応し、これは運動神経細胞が死んで行くのに一つの役割を果たしており、普通のマウスに比べてＡＬＳ動物モデルが酸化的毒性にさらに敏感であるという事実を推論することができる。

＜実施例４−２＞ ＡＬＳ動物モデル（Ｇ９３Ａ ｍｉｃｅ）における運動神経細胞のＦａｓ−関連蛋白質の発現と枯死の機転の観察
Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ（ＦａｓＬ）−関連枯死を通じた神経細胞の死滅はアルツハイマー痴呆やパーキンソン病のような退行性神経疾患で既に観察されたことがある（Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ., ２００１，Ｓｕ ｅｔ ａｌ, ２００３; Ｈａｒｔｍａｎ ｅｔ ａｌ., ２００２）。

これはＧ９３Ａ マウスにおけるＦａｓＬ−関連枯死を通じた運動神経細胞の消失を可能にする証拠となる。従って、本発明者はＧ９３Ａ マウスと普通のマウスとが８週齢、１２週齢、１６週齢であるときウェスタンブロットを通じてＦａｓＬの受容体であるＦａｓ蛋白質とその下のアダプターの役割を果たすＦＡＤＤ蛋白質の発現程度と、ＦａｓとＦＡＤＤの免疫沈澱法を通じた相互親和力を用いて活性化を観察した。１２週齢から蛋白質発現と活性程度の差が普通のマウスに比べてＧ９３Ａ マウスで強い水準を示した（図４ａ）。また、機転の最高の段階として抗−Ｆａｓ抗体を用いて免疫標識法を確認したとき、発現位置が腰髄の運動神経細胞に位置するということが分かった（図４ｂ）。次の段階として、カスパーゼ−８とカスパーゼ−３の活性化をウェスタンブロットを用いて観察した結果、同様に１２週に普通のマウスに比べてＧ９３ＡＷＮＬで活性化を大きく示した（図４ｃ）。また、機転の最後の段階で活性化された抗−カスパーゼ−３抗体を用いた免疫染色を行ったときに発現位置が運動神経細胞であることを確認した（図４ｄ）。

その結果、１２週のＧ９３Ａ マウスの運動神経細胞内のＦａｓ，ＦＡＤＤ，カスパーゼ−８そしてカスパーゼ−３を通じた機転による神経細胞の枯死が進んでいることを観察し、これは運動神経細胞が殆ど死んでいる１６週齢ではこのような特徴がなくなっていることも分かった。

＜実施例４−３＞ ２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウムとの複合投与による大脳皮質の細胞培養及びＡＬＳ動物モデル（Ｇ９３Ａ ｍｉｃｅ）における細胞壊死と細胞枯死に対する保護効果
本発明者らは酸化毒性による神経細胞の壊死と神経細胞の枯死を各々選択的に抑制する薬物を投与したとき、神経細胞の保護効果が相乗作用をするかどうかに対して追加実験を通じて観察した。実施例１で製造されたニューロン−神経膠細胞の混合培養からＤＩＶ１１〜１５目の培養細胞に３０uＭ Ｆｅ^２＋と１０ｍＭ ＢＳＯ（グルタチオン欠乏誘導物質）を添加して酸化毒性を誘導した。その後、２４時間が過ぎれば神経細胞は壊死による死に至る。このとき、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡを１μＭを添加すれば酸化毒性による神経細胞の消失は完璧に抑制されその効果はビタミンＥの２２０倍以上高い。同じ方法で、抗精神性薬物として用いられ神経細胞の枯死を選択的に保護すると報告された（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００３; Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００２）リチウム（Ｌｉ^＋）を添加したところ酸化的毒性に対する効果は全くないことが確認された（図５ａ）。図５ａは、培養された大脳皮質神経細胞に３０μＭ ＦｅＣｌ_２または１０ｍＭ ＢＳＯを単独で、また ＦｅＣｌ_２またはＢＳＯに１μＭ ２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡまたはビタミンＥを同時に添加し、添加２４時間後に細胞外に遊離されるＬＤＨの活性を測定して神経細胞の死滅を定量した結果である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ, Ｎ＝１２培養ウェル／実験群）。図５ａにおいて、 ＊は、アノバ(ＡＮＯＶＡ)及びスチューデント−ニューマン−クルーズテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）を用いた場合において、対照群（ＦｅＣｌ_２及びＢＳＯ単独）に比べてｐ＜０.０５の有意差があることを示す。

純粋神経細胞が殆どである大脳皮質の培養後血清を除去して神経細胞の枯死を誘導し、５ｍＭのリチウム（Ｌｉ^＋）を添加したところ、カスパーゼ抑制剤であるｚＶＡＤｆｍｋだけ神経細胞の枯死は完璧に抑制された。しかし、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡを添加したときには、神経細胞の枯死が全く防止できなかった（図５ｂ）。リチウム（Ｌｉ^＋）によってＦａｓ関連機転の活性も減少するか否かを確認するために純粋神経細胞の培養後８時間血清除去をした後、各々の薬物を処理してＦａｓとＦＡＤＤを用いた免疫沈澱法で活性化を測定した。Ｆａｓ関連機転は２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡによって保護されず、リチウムによって有効に保護された（図５ｃ）。その結果、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウム（Ｌｉ^＋）の神経細胞の死滅を抑制する経路は互いに異なるということが推論できた。図５ｂは、純粋培養した大脳皮質の神経細胞から血清を除去した後単独または１００μＭ ｚＶＡＤｆｍｋ、１μＭ ２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ及び５ｍＭ リチウムを処理し、神経細胞の枯死が抑制されるかどうかを確認するために２４時間後にトリパンブルー染色法を用いて、生存している神経細胞の数を数え神経細胞の死滅の程度を分析した結果である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ, Ｎ＝４ 培養ウェル／実験群）。＊は、アノバ(ＡＮＯＶＡ)及びスチューデント−ニューマン−クルーズテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）を用いた場合において、対照群（ＦｅＣｌ_２及びＢＳＯ単独）に比べてｐ＜０.０５の有意差があることを示す。図５ｃは、同じサンプルでＦａｓとＦＡＤＤ抗体を用いて免疫沈澱法を行った写真である。

Ｇ９３Ｇマウスと年齢及び性（ｓｅｘ）が一致する普通のマウスとが８週齢になったときから１０週齢になるまでの２週間、薬物を胃まで直接投与する方法である経口注入方法を通じて２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ （３０ｍｇ／ｋｇ/d）を注入し、その対照実験群には同じ注入方法で生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）を投与した。１０週齢になったときサンプルの腰髄部分を修得して上記実施例４−１で提示された方法のように、抗−ニトロチロシン抗体を用いた免疫染色法と酸化されたＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓ蛍光の強度を観察したとき、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡを投与したＧ９３Ａ マウスの運動神経細胞において酸化的毒性が普通のマウスほど減少したことを確認した（図５ｄ及び５ｅ）。図５ｄにおいて、ａは１０週齢の普通のマウス（Ｔｇ（−））、ｂは２週間生理食塩水（０.９％ ＮａＣｌ）を投与したマウスであり、ｃは２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡを食餌として供給したＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））の脊髓の腰髄部位の組織にニトロチロシンで免疫染色した写真と蛍光強度を定量化したグラフである（ｍｅａｎ±ＳＥＭ, Ｎ＝３ マウス/実験群、各々５ｓｅｃｔｉｏｎ/マウス）。上図において、矢印は運動ニューロンである。図５ｅは、図５ｄと同じサンプルに対し酸化されたＭＴ ｒｅｄ ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓの蛍光強度を測定したグラフである。ｐ＜０.０５は、アノバ(ＡＮＯＶＡ)及びスチューデント−ニューマン−クルーズテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔ）を用いた場合において、対照群に比べてｐ＜０.０５の有意差があることを示す。

Ｇ９３Ａ マウスと年齢及び性が一致する普通のマウスとが８週齢になったときから１２週齢になるまでの４週間、薬物を胃まで直接投与する方法である経口注入方法を通じてリチウムカーボネート（２００ｍｇ／ｋｇ）を注入し、対照実験群には同じ注入方法で生理食塩水（０。９％ ＮａＣｌ）を投与した。上記実施例４−２と同じく各マのマウスの腰髄部位のみを集めて抗−Ｆａｓ、抗−ＦＡＤＤ、抗−活性化カスパーゼ−８及び抗−活性化カスパーゼ−３抗体を用いたウェスタンブロットを行った（図５ｆ）。ＡＬＳ発病時点である１２週齢に発現程度が顕著に増加した蛋白質は２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡにより部分的な減少を示したが、リチウムによっては完璧に保護されることを確認した。

＜実施例４−４＞ ＡＬＳ動物モデル（Ｇ９３Ａ ｍｉｃｅ）における２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウムとの混用を通じた相乗作用による運動遂行能力の向上と生存率の増加
図６ａ〜図６ｄは、マウスを１３匹ずつ５グループに分けて８週齢になったときから餌に、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）、０.２％ リチウムカーボネート、または同時に２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）と０.２％ リチウムカーボネートとを混用した薬物を添加して各マウスらが死ぬまでの行動実験を一週間に二回ずつ実行した結果である（ｍｅａｎ±ＳＥＭ, Ｎ＝１３／実験群）。図６ａ〜図６ｄにおいては、＊は対照群に比べてｐ＜０.０５の有意差があることを示すものであり、＃は２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ及びリチウムの複合投与群と２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（或いはリチウム）投与群との間にｐ＜０.０５の有意差があることを示す。

図７ａと７ｂは、マウスを１３匹ずつ５グループに分けて８週齢になったときから餌に、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）、０.２％ リチウムカーボネート、または同時に２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）と０.２％ リチウムカーボネートとを混用した薬物を添加して供給して実験し、図７ｃと７ｄは、マウスを４匹ずつ５グループに分けて８週齢になったときから１６週齢まで各々同一種類の餌を供給して実験した結果である。＊は対照群に比べてｐ＜０.０１の有意差があることを示すものであり、＃は２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ及びリチウムの複合投与群と２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ （或いはリチウム）投与群との間にｐ＜０.０１の有意差があることを示す。

Ｇ９３Ａ マウスの体重は１８週齢になったとき普通のマウスに比べて５８％まで減量された。２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡやリチウム（Ｌｉ^＋）を１２週から経口投与したとき各々の薬物によって４１％、そして５３％の体重減少を見せた。しかし、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウム（Ｌｉ^＋）薬物を同時に投与後１８週齢になったときに、正常マウスに比べて３２％まで減少され薬物を処理しなかったものに比べてかなり体重減少を抑制した（図６ａ）。 Ｇ９３Ａ マウスは２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡやリチウム（Ｌｉ＋）を投与したとき薬物を投与したマウスに比べて１１週齢から１８週齢まで種々の行動遂行能力が向上した（図６ｂ〜図６ｄ）。ＰａＧＥテストを通じた欠損とＲｏｔａｒｏｄテストを通じた欠損を用いた発病時点（Ｏｎｓｅｔ）と死亡率（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）とを各グループ当たり１３匹に対して測定した。伸筋伝導反射（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅｆｌｅｘ）、全般的運動力、行動の調和において２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡやリチウム（Ｌｉ＋）を各々供給したときに薬物が供給されなかったグループに比べて全般的に行動能力が向上したことを確認した。また、ＰａＧＥを通じた発病時点を観察したとき、薬物を供給しなかったグループは１０４日、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡのみを供給したグループは１１４.１日、リチウム（Ｌｉ＋）のみを供給したグループは１１３.３日で、各々の薬物を処理したときに発病時点が遅延されることを確認した。２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウムを長期投与したとき、Ｇ９３Ａ マウスにおける発病時点と生存率の延長効果をまとめて下記表２に示し、各グループ当たり１３匹で実験した。

上記表２と図７ａに示したように、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウムとを同時に供給したＧ９３Ａ マウスはＰａＧＥテストを通じた発病時点が１２７.６日でかなり延長されたことが確認された。Ｒｏｔａｒｏｄテストを通じた発病時点は、薬物が供給されなかったグループは９８.７日、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡのみ供給したグループは１１２.３日、リチウムのみ供給したグループは１１４.７日、二種類の薬物を複合投与したグループは１２１.５日であって、各々の一種類の薬物のみ供給したときより二種類の薬物を供給したときに相乗作用を見せた。生存能力は薬物を供給しなかったグループが１２５.３日、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡのみ供給したグループは１４３.８日、リチウムのみ供給したグループは１３７.２日、二種類の薬物を複合投与したグループは１５２.１日であって生存能力も二種類の薬物を混用して供給したときにさらに延長されることが確認できた（表２、図７ｂ）。最後に、腰髄に位置した運動神経細胞の保護効果をクレシルバイオレット染色法を用いて動物が１６週になったときに比較実験を施した。薬物を供給されなかったＧ９３Ａ マウスにおける運動神経細胞は７４％まで減少し、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡやリチウムを各々供給したときに５７％及び５８％の減少率を見せ、二種類の薬物を複合投与したときに普通のマウスより１７％の減少率を見せ、運動神経細胞の死滅の程度を遅延させる効果もやはり二種類の薬物を複合投与したときに上昇することが確認された。

以下、本発明に対する理解を助けるために本発明の薬学製剤またはキットが適用され得る具体的な疾患に対して説明する。しかし、下記の適用例は本発明の理解を助けるために提供されるものであって本発明の範囲を限定するのではなく、前述したように後述する具体的病名以外の神経細胞の死滅と関連した疾患にも本発明の薬学製剤及びキットは有効である。

＜適用例１＞ ルーゲリック病（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｒ Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ; ＡＬＳ）
ルーゲリック病（Ｌｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ Ｄｉｓｅａｓｅ）は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ:ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または運動ニューロン疾患（ＭＮＤ : ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）などと呼ばれる病気であって、運動神経細胞の退行性変化による漸次的な損傷がこの疾患の特徴である。ルーゲリック病における選択的な運動神経死滅の原因に対して様々な仮説が立てられた。

第一、興奮性神経毒性がＡＬＳにおける細胞死滅の過程に関与すると知られている。ＡＬＳ患者は神経膠細胞にあるグルタメート輸送蛋白質が減少されており、イオン性グルタメート受容体のアゴニストをマウスの脊椎に注入すればＡＬＳ患者に類似な病理学的変化を示すと報告されている（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ., １９９５; Ｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ ｅｔ ａｌ., １９９６）。第二、興奮性神経毒性以外にも酸化的毒性がＡＬＳで神経細胞の死滅に関与するという証拠が集まれている。ＳＯＤ−１遺伝子変異の最近の発見は、遺伝的ルーゲリック病における酸化的毒性の重要性を刺激した（Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ Ｗ，２０００）。しかも、この患者の脳から酸化的毒性の指標である蛋白質カルボニル群及びニトロチロシンの増加が報告された（Ａｂｅ Ｋ ｅｔ ａｌ., １９９５; Ｓｈａｗ ＰＪ ｅｔ ａｌ., １９９５）。第三、最近ルーゲリック病モデルにおける運動神経の死滅は細胞枯死と連関しているという論文が多く報告されており、細胞枯死の重要性を証明している（Ｓａｔｈａｓｉｖａｍ ｅｔ ａｌ., ２００１）。

従って、本発明の薬学製剤またはキットを用いるか細胞壊死抑制剤とリチウムとを併用すればルーゲリック病をさらに有効に治療できる。

＜適用例２＞ アルツハイマー性痴呆（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ； ＡＤ）
アルツハイマー性痴呆は、痴呆の原因のうち最も多い形態である。病理組織学的には、神経纖維の多発性病変（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）、アミロイドプラーク（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅ）と深刻な神経細胞の死滅などがアルツハイマー性痴呆の特徴である。最近アルツハイマー性痴呆で観察される神経細胞の死滅が酸化的ストレスと連関しているという論文が多く報告されている。

第一、自由ラジカルの生成を刺激できるメタル基（Ｆｅ、Ａｌ、そしてＨｇ）の増加、第二、脂質過酸化の増加、第三、蛋白質及びＤＮＡの酸化などがアルツハイマー病で増加していると知られている（Ｏｌａｎｏｗ ＣＷ ｅｔ ａｌ., １９９４; Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ Ｗ．Ｒ．１９９７）。また、ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤であるメマンチンは痴呆モデルにおいて学習及び記憶能力の改善効果を示し、痴呆治療剤として市販されることによって、痴呆において興奮性毒性が関与するということを間接的に示している（Ｍｉｎｋｅｖｉｃｉｅｎｅ Ｒ ｅｔ ａｌ., ２００４）。アルツハイマー性痴呆でカスパーゼ−３とカスパーゼ−９の活性による枯死が観察されることによって、細胞枯死の可能性も最近多く提起されている（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ., ２００５; Ｃｈｏｎｇ ＺＺ ｅｔ ａｌ., ２００５）。

従って、細胞壊死に対する神経細胞の保護効果を示す本発明による細胞壊死抑制剤は、細胞枯死に対する神経細胞の保護効果を示すリチウムとともにアルツハイマー性痴呆治療剤として用いられることができて、このような二種類の薬物を併用すれば治療効果を向上させ得る。

＜適用例３＞ パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
パーキンソン病は黒質に存在するドーパミン神経細胞の死滅が伴って、振顫、筋肉硬直、運動緩徐、非正常的姿勢、運動不能などの多様な症状を示す退行性神経系疾患である。

神経細胞の壊死の主要原因として酸化的毒性が提示されているが、脂質過酸化（Ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、ＤＮＡ酸化（ＤＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、蛋白質カルボニル及びニトロチロシン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｂｏｎｙｌ、ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）の増加が黒質で発見されると報告された（Ｓｒｉｒａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ., １９９７; Ｗｕ ＤＣ ｅｔ ａｌ., ２００３）。そして、数々のＮＭＤＡ受容体の拮抗剤はパーキンソン病の動物モデルにおいてドーパミン神経細胞の死滅を抑制した（Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ ｅ ａｎｄ Ｂｅａｌ ＭＦ, １９９３）。また、パーキンソン病の動物モデルから細胞枯死の証拠が（例えば、カスパーゼの発現及び活性）報告された（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａ ｅｔ ａｌ., ２０００ ａｎｄ ２００１）。

従って、細胞枯死を選択的に抑制して神経細胞を保護する本発明のリチウムと細胞壊死抑制剤とを含有する薬学製剤またはキットはパーキンソン病の治療に非常に有効に用いられ得る。

＜適用例４＞ ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）
ハンチントン病（ＨＤ）は主に脳線条体の連合ニューロン（ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ）の死滅を伴うが、このようなＨＤの病理学的特性はＮＭＤＡ受容体のアゴニストを処理すれば類似に再現されるため、ＨＤで現れる選択的神経細胞の死滅はＮＭＤＡ受容体を媒介とすると知られている（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ., １９８６; Ｂｅａｌ ＭＦ ｅｔ ａｌ., １９８６）。

そして、ハンチントン病患者のサンプルでＴＵＮＥＬ−ｐｏｓｉｔｉｖｉｅな細胞が観察されカスパーゼ−３やカスパーゼ−９の活性及びｂｃｌ−２の増加は細胞枯死に関与すると知られている（Ｋｉｅｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ., ２００２; Ｖｉｓ ＪＣ ｅｔ ａｌ., ２００５）。また、ミトコンドリアの損傷、活性酸素の生成を初めとした酸化的毒性がＨＤにおいて神経細胞の死滅の主原因であるという証拠が集まれ、活性酸素を抑制する薬物がＨＤ治療剤として提示されている（Ｐｅｒｅｚ−Ｓｅｖｅｒｉａｎｏ Ｆ ｅｔ ａｌ., ２００３; Ｒｏｓｅｎｓｔｏｃｋ ＴＲ ｅｔ ａｌ., ２００４）。

従って、本発明によってリチウムと細胞壊死抑制剤とを共に投与すればハンチントン病を有効に治療または予防できるということが分かる。

＜適用例５＞ 虚血性脳卒中（Ｈｙｐｏｘｉｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ）
脳卒中は脳の血液循環障害（血栓症、塞栓症、狹窄症）によって起こる疾患であって、その結果神経細胞の死滅が起こるようになる。脳卒中が起これば興奮性神経伝達物質であるグルタメートが神経細胞の連接部位で蓄積されＣａ^２＋透過性グルタメート受容体の過度活性により神経細胞の死滅が速く進まれる。実際に、ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤は脳卒中の８０％を占める虚血性脳卒中による脳細胞死滅を顕著に減少させると知られている（Ｓｉｍｏｎ ＲＰ ｅｔ ａｌ., １９８４）。脳卒中が起こった後ミトコンドリア内の電子伝達系（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ）が損傷され活性酸素の生成が増加するようになる。増加した活性酸素は、細胞膜脂質の破壊、遺伝子の損傷、蛋白質変性などを誘導して神経細胞の壊死が起こり、これに対して抗酸化剤は虚血性神経細胞の壊死を抑制する効果がある（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ., １９９８）。また、これ以外にも脳卒中後虚血部位（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｒｅａ）の半陰影地域（ｐｅｎｕｍｂｒａ ｚｏｎｅ）でＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）とＴＵＮＥＬ染色のような細胞枯死の特徴も観察されることから細胞の枯死と壊死とが同時に起こることが分かる（Ｈｕ Ｘ ｅｔ ａｌ., ２００２）。

従って、本発明のリチウムと細胞壊死抑制剤との同時投与は脳卒中を効率的に予防または治療できる。

＜適用例６＞ 退行性脳及び脊髄損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）
興奮性神経毒性は外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び脊椎損傷（ＴＳＣＩ）後に現れる脳細胞の退化にも密接に関与する。ＮＭＤＡ受容体の拮抗剤はＴＢＩ及びＴＳＣＩ後に現れる神経細胞の死滅を減少させると知られている（Ｆａｄｅｎ ＡＩ ｅｔ ａｌ., １９８８; Ｏｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ., １９９７）。

酸化的毒性及び細胞枯死は外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び脊椎損傷（ＴＳＣＩ）後に現れる脳細胞の退化にも密接に関与する。脳及び脊椎の損傷は下半身麻痺と四肢麻痺を起こして損傷部位から遠くにある部位まで神経細胞の死滅が観察されるが、これに対する治療剤や治療法が開発されていない実情である。脳及び脊髄損傷にはＣａ^２＋の流入、細胞膜の崩壊、酸化的毒性による脂質の過酸化が観察されると報告され（Ｆａｄｅｎ ＡＩ ＆ Ｓａｌｚｍａｎ Ｓ, １９９２; Ｊｕｕｒｌｉｎｋ ＢＨ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＰＧ, １９９８）、最近には細胞の死滅が２次損傷に関与するという証拠が提示されており、細胞枯死に関与する酵素であるカスパーゼ抑制剤が神経細胞の枯死を減少させると報告された （Ｃｌａｒｋ ＲＳ ｅｔ ａｌ., ２０００； Ｌｉ Ｍ ｅｔ ａｌ., ２０００; Ｋｅａｎｅ ＲＷ ｅｔ ａｌ., ２００１）。

従って、本発明の細胞壊死抑制剤及びリチウムの複合剤及び併用療法は脳及び脊髓損傷の治療に有効に用いられ得る。

＜適用例７＞ 緑内障（Ｇｌａｕｃｏｍａ）、黄斑部変性 （ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）及び糖尿病性網膜症
緑内障（ｇｌａｕｃｏｍａ）の場合、眼圧の増加により網膜への血流が塞がれることによって網膜神経細胞は虚血状態になり、このとき神経伝達物質であるグルタメートが神経連接に過量分泌され興奮性毒性が起こり、最近虚血による枯死の証拠が多く発表されている。また、血液の再貫流の際に生成される活性酸素による網膜神経細胞の死滅が起こるようになると知られている（Ｏｓｂｏｒｎｅ ＮＮ ｅｔ ａｌ., １９９９; Ｔｅｍｐｅｓｔｉｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ., ２００３）。また、最近細胞壊死抑制剤（抗酸化剤及びＮＭＤＡ受容体の拮抗剤）及び細胞枯死抑制剤を緑内障の動物実験に用いて視神経細胞の死滅を抑制する結果が報告されている（Ｎｅｕｆｅｌｄ ＡＨ ｅｔ ａｌ., ２００２; Ｒｉｃｈｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ., ２００４; Ｋｉｍ ＴＷ ｅｔ ａｌ., ２００２; Ｈａｒｔｗｉｃｋ ＡＴ ｅｔ ａｌ, ２００１;）。

また、糖尿病性網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）と黄斑部変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の神経細胞の退化も活性酸素の増加、興奮性毒性及び細胞枯死が観察されるという報告が多くある （Ｌｉｅｔｈ ｅ ｅｔ ａｌ., ２０００; Ｍｏｏｒ Ｐ ｅｔ ａｌ., ２００１; Ｂａｒｂｅｒ ＡＪ., ２００３; Ｊｏｕｓｓｅｎ ＡＭ ｅｔ ａｌ., ２００３; Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ Ｆ ｅｔ ａｌ., ２００２）。

従って、このような視神経細胞の枯死及び細胞壊死を抑制するためには、本発明によるリチウムと細胞壊死抑制剤とを複合的に処理することが治療に非常に効果的であろうと期待される。

本発明は、神経細胞の壊死は抑制するが神経細胞の枯死は抑制しない細胞壊死抑制剤と、神経細胞の枯死は抑制するが神経細胞の壊死は抑制しないリチウムとを共に含む薬学製剤またはキットとこれらを用いる併用療法を提供する。このような薬学製剤などは活性酸素などの様々な原因による神経細胞の死滅及び細胞の枯死を同時に抑制できるだけでなく相互補完的に作用してシナジー効果を示すことができる。

図１ａ〜図１ｃは、酸化的毒性により誘導された細胞壊死に対するビタミンＥ、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡ及びリチウムの効果を示した図であって、図１ａは、ＦｅＣｌ_２により誘導された細胞壊死に対するビタミンＥ、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ）及び２−ヒドロキシ−５−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチルアミノ）−安息香酸（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡ）の効果を示した図である（●: ＦｅＣｌ_２＋２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ，○: ＦｅＣｌ_２＋２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡ，▼: ＦｅＣｌ_２＋ビタミンＥ，▽: ５０μＭ ＦｅＣｌ_２ 単独）。 図１ｂは、ＤＬ−ブチオニン（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ）−［Ｓ，Ｒ］−スルホキシミン（ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）（グルタチオン欠乏誘導物質、ＢＳＯ）による細胞壊死に対する２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡと２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡの効果を示したグラフである（●: ＢＳＯ＋２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ，○: ＢＳＯ＋２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡ，▼: １０ｍＭ ＢＳＯ 単独）。 図１ｃは、リチウムがＦｅＣｌ_２及びＢＳＯにより誘導される酸化的毒性を抑制することができないことを示すグラフである。 図２ａ及び２ｂは、細胞枯死に対するビタミンＥ、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡ及びリチウムの効果を示すグラフであって、図２ａは、リチウムがシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはカリキュリンＡ（Ｃａｌ Ａ）による細胞枯死を抑制する程度を示したグラフである（●: ２０μＭ ＣｓＡ 単独，○: ＣｓＡ＋リチウム，▼: １０ｎＭ Ｃａｌ Ａ 単独，▽: Ｃａｌ Ａ＋リチウム）。 図２ｂは、ビタミンＥ、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ及び２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＰＥＡがシクロスポリンＡによる細胞枯死を抑制する程度を示したグラフである。 図３ａ〜図３ｃは、ＡＬＳ動物モデル（Ｇ９３Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ｔｇ（＋））の脊髓の腰髄部位（ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）における酸化的毒性及び細胞死に対して分析したグラフであって、図３ａは、８週齢の普通のマウス（ａ，ｃ）或いはＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））（ｂ，ｄ）の脊髓において、腰髄部位（ｌｕｍｂａｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）にＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＣＭ−Ｈ２ＸＲＯＳ（赤色）とＮｅｕＮ（緑色）とで二重免疫染色し（下側図）、ニトロチロシン抗体で（上側図）免疫染色法を通じて観察した蛍光写真である。矢印は、運動神経細胞（ｍｏｔｏｒ ニューロン）を示す。 図３ｂは、４週齢〜１４週齢のＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））の腹側（ｖｅｎｔｒａｌ）の運動神経細胞におけるニトロチロシンの蛍光強度を分析したグラフである（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、Ｎ＝５マウス/実験群、それぞれ５ｓｅｃｔｉｏｎ／マウス）。図３ｂにおいて、＊は、インディペンデンスｔテスト（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｔ ｔｅｓｔ）を用いて対照群（普通のマウス（Ｔｇ（−））に比べてｐ＜０.０５の有意差があることを示す。 図３ｃは、Ｇ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））の脊髓における運動神経の退化を示す図であって、腰髄（ｌｕｍｂａｒ）の腹側（ｖｅｎｔｒａｌ）突起（ｈｏｒｎ）に生存している運動神経細胞の数はクレシルバイオレット（Ｃｒｅｓｙｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色法により分析した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、Ｎ＝５マウス/実験群）。 図４ａ〜図４ｄは、ＡＬＳ動物モデルにおけるＦａｓと関連した細胞枯死の経路（ｐａｔｈｗａｙ）の活性化を示す図であって、図４ａは、普通のマウス（Ｔｇ（−））とＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））との腰髄部位においてＦａｓ、ＦＡＤＤ及びアクチン（ａｃｔｉｎ）抗体を用いてウェスタンブロットを行った写真（上側図）及び同じサンプルにおいてＦａｓとＦＡＤＤ抗体を用いて免疫沈澱法を行った写真である（下側図）。 図４ｂは、１２週齢の普通のマウス（Ｔｇ（−））とＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））との脊髓において運動神経細胞をＦａｓ抗体で染色した写真である。 図４ｃは、指定された週齢で普通のマウス（Ｔｇ（−））とＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））との腰髄部位を修得して活性化カスパーゼ−８（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−８）、活性化カスパーゼ−３及びアクチンを用いてウェスタンブロットを行った写真である。 図４ｄは、１２週齢の普通のマウス（Ｔｇ（−））とＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））との脊髓において運動神経細胞を活性化カスパーゼ−３抗体で染色した写真である。 図５ａ〜図５ｆは、ＡＬＳ動物モデルの運動神経細胞の酸化的毒性及び細胞枯死に対する２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウムとの効果を示した図であって、図５ａは、３０μＭ ＦｅＣｌ_２または１０ｍＭ ＢＳＯにより誘導される酸化的毒性に対する２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡの保護効果を示したグラフである。 図５ｂは、血清除去により誘導される細胞枯死に対するリチウムの細胞保護効果を示したグラフである。 図５ｃは、血清除去により誘導されるＦａｓ／ＦＡＤＤと関連した細胞枯死の経路に対するリチウム及びｚＶＡＤの抑制効果を示したグラフである。 図５ｄは、１０週齢の普通のマウス（Ｔｇ（−））、それぞれ２週間生理食塩水（０.９％ ＮａＣｌ）及び２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡが食餌として供給されたＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））の脊髓の腰髄部位の組織にニトロチロシンで免疫染色した写真と蛍光強度を定量化したグラフである。 図５ｅは、酸化されたＭＴ ｒｅｄ ＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓの蛍光強度を測定したことを除いては図５ｄと同一の実験を施した結果である。 図５ｆは、１２週齢の普通のマウス（Ｔｇ（−））、それぞれ４週間生理食塩水（０.９％ ＮａＣｌ）、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ及びリチウムが食餌として供給されたＧ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋））の脊髓の腰髄部位の組織を、Ｆａｓ、ＦＡＤＤ、分割されたカスパーゼ−８（ｃｌｅａｖｅｄ−ｃａｓｐａｓｅ−８）及び分割された-カスパーゼ−３抗体を用いてウェスタンブロットを行った写真である。 図６ａ〜図６ｄは、ＡＬＳ動物モデルにおける２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウムとの複合投与による運動機能の相乗作用を示す図であって、図６ａは、各グループの体重を週齢毎に示す図である（●: 普通のマウス（Ｔｇ（−）ｃｏｎｔｒｏｌ），○: Ｇ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋）ｖｅｈｉｃｌｅ），▼: Ｔｇ（＋）に２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した群（Ｔｇ（＋）２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ），△: Ｔｇ（＋）に０.２％ リチウムカーボネートを投与した群（Ｔｇ（＋）リチウム），■: Ｔｇ（＋）に２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）と０.２％ リチウムカーボネートとを複合投与した群（Ｔｇ（＋）２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ＋リチウム））。 図６ｂは、伸筋伝導反射（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅｆｌｅｘ）の実験結果を各週齢毎に示す図である。 図６ｃは、四肢の筋力をテストするためのＰａＧＥ実験結果を各週齢毎に示す図である。 図６ｄは、全般的な歩行及び調和された筋肉運動を行う程度をテストするためのローターロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）の実験結果を各週齢毎に示す図である（●: Ｇ９３Ａ マウス（Ｔｇ（＋） ｖｅｈｉｃｌｅ），○: Ｔｇ（＋）に２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した群（Ｔｇ（＋） ２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ），▼: Ｔｇ（＋）に０.２％ リチウムカーボネートを投与した群（Ｔｇ（＋）リチウム），△: Ｔｇ（＋）に２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）と０.２％ リチウムカーボネートとを複合投与した群（Ｔｇ（＋）２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ＋リチウム））。 図７ａ〜図７ｄは、ＡＬＳ動物モデルで２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡとリチウムとの複合投与による発病時点、生存力または運動神経細胞退化の遅延に対する相乗作用を示す図であって、図７ａは、グループ毎に発病時点（Ｏｎｓｅｔ）を確率で計算したグラフである。 図７ｂは、グループ毎にマウスの生存率を確率で計算したグラフである。 図７ｃは、クレシルバイオレット染色法を用いて普通のマウス（ａ）と、Ｇ９３Ａ マウス（ｂ）と、８週齢〜１６週齢のＧ９３Ａ マウスに２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＴＴＢＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）及び０.２％ リチウムカーボネートを複合投与した群（ｃ）との運動神経細胞を示す図である。 図７ｄは、各グループ毎にクレシルバイオレット染色された生存している運動神経細胞の数を示すグラフである。

Claims (4)

1. 細胞壊死抑制剤、及びリチウムまたはこれの薬学的に許容可能な塩を含み、
   上記細胞壊死抑制剤は、下記化学式２で表されるテトラフルオロベンジル誘導体とこれの薬学的に許容可能な塩、から構成された群より選択された何れか一つ以上であることを特徴とする、ルーゲリック病、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、外傷性脳損傷及び外傷性脊髄損傷から構成された群より選択された何れか一つ以上の脳疾患、または、緑内障、老人性黄斑変性及び糖尿病性網膜症から構成された群より選択された何れか一つ以上の眼疾患の治療または予防用薬学製剤：
   

   

   上記化学式２において、
   Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ水素またはハロゲンであり、
   Ｒ_４は、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロゲンに置換されたアルコキシ、アルカノイルオキシまたはニトロであり、
   Ｒ_５は、カルボキシ酸、炭素数１ないし４のアルキル基を有したエステル、カルボキシアミド、スルホン酸、ハロゲンまたはニトロである。
2. 上記テトラフルオロベンジル誘導体は、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−ニトロ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−クロロ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−ブロモ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−メチルベンジルアミノ）−安息香酸、２−メチル−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、２−メトキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸、５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−２−トリフルオロメトキシ安息香酸、２−ニトロ−４−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）フェノール、２−クロロ−４−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）フェノール、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）ベンズアミド、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）ベンゼンスルホン酸、メチル２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸塩、２−エタノイルオキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸、２−プロパノイルオキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸、２−シクロヘキサンカルボニルオキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）安息香酸及びこれらの薬学的に許容可能な塩から構成された群より選択された何れか一つであることを特徴とする請求項１に記載の薬学製剤。
3. 上記テトラフルオロベンジル誘導体は、２−ヒドロキシ−５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンジルアミノ）−安息香酸またはこれの薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする請求項２に記載の薬学製剤。
4. 細胞壊死抑制剤、及びリチウムまたはこれの薬学的に許容可能な塩を含み、
   上記細胞壊死抑制剤は、下記化学式２で表されるテトラフルオロベンジル誘導体とこれの薬学的に許容可能な塩、から構成された群より選択された何れか一つ以上であることを特徴とする、ルーゲリック病、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、外傷性脳損傷及び外傷性脊髄損傷から構成された群より選択された何れか一つ以上の脳疾患、または、緑内障、老人性黄斑変性及び糖尿病性網膜症から構成された群より選択された何れか一つ以上の眼疾患の治療または予防用薬学キット：
   

   

   上記化学式２において、
   Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ水素またはハロゲンであり、
   Ｒ_４は、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、ハロゲンに置換されたアルコキシ、アルカノイルオキシまたはニトロであり、
   Ｒ_５は、カルボキシ酸、炭素数１ないし４のアルキル基を有したエステル、カルボキシアミド、スルホン酸、ハロゲンまたはニトロである。

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