KR20180068494A

KR20180068494A - 운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료를 위한 카바메이트 화합물의 용도

Info

Publication number: KR20180068494A
Application number: KR1020160170228A
Authority: KR
Inventors: 신혜원; 황선관
Original assignee: 에스케이바이오팜 주식회사
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-06-22

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 카바메이트 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여함으로써 운동신경세포 질환을 예방, 경감 또는 치료하는 목적으로 사용하는 용도에 관한 것이다.
[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R₁, R₂,A₁ 및 A₂는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.

Description

운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료를 위한 카바메이트 화합물의 용도{USE OF CARBAMATE COMPOUND FOR THE PREVETION, ALLEVIATION, AND TREATMENT OF MOTOR NEURON DISEASE}

본 발명은 하기 화학식 1의 카바메이트 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여함으로써 운동신경세포 질환을 예방, 경감 또는 치료하는 목적으로 사용하는 용도에 관한 것이다.

[화학식 1]

운동신경세포 질환(Motor neuron diseases)에는, 상부(primary) 운동신경세포 및 하부(secondary) 운동신경세포가 모두 손상된 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis(ALS), 루게릭병), 하부 운동신경세포만 손상된 척추 근위축증(spinal muscle atrophy(SMA)), 진행성 연수마비(progressive bulbar palsy), 원발성 측색 경화증(primary lateral sclerosis(PLS)), 선천성근형성부전증(arthrogryposis multiplex congenita(AMC)) 등이 포함된다.

ALS는 대뇌와 척수의 운동신경세포에 영향을 주는 진행성의 퇴행성 질환이며, 궁극적으로는 사망을 초래하는 치명적인 질환이다. 이 질환에서는 상부 운동신경세포 및 하부 운동신경세포의 퇴화 및 사멸로 인해 근육을 조절하는 능력이 점차 저하, 마비되며, 이로 인해 결국은 언어능력, 음식섭취능력, 운동능력이 상실되고 호흡장애가 나타난다. 증상 발생 후 꾸준한 속도로 진행하여 3~4년이 지나면 침상에 국한되어 호흡기에 의존하는 상태가 되거나 사망에 이르게 된다.

임상양상의 다양성과 병의 빠른 경과는 ALS를 초기에 진단하는 것을 어렵게 만들고 생존기간 예측이나 적절한 치료 시작시점 판단도 힘들게 한다. 유병률은 10만 명당 2-3명 정도이고, 40 ~ 70세에 주로 발병하며, 일생 동안의 발병위험도는 여자의 경우 400분의 1, 남자의 경우 350분의 1 정도로 보고되어 있다. 대다수 환자는 산발성(sporadic)이며, 10% 가량은 가족력이 있어 유전적인 원인을 가지는 것으로 보고되고 있다. 유전적인 원인으로 ALS 질환을 일으키는 유전자 중 발병 비율이 가장 높은 것은 가장 먼저 발견된 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 1(superoxide dismutase 1, SOD1)로 알려져 있다. SOD1 유전자는 21번 염색체에 위치하고 있으며, 이 유전자 변이를 이용한 형질변환 동물이 만들어져서 질환의 생리기전 및 신약개발 등에 대한 연구에 이용되고 있다. 그 외 발견된 유전자들로는 angiogenin, ataxin-2, optineurin, profiling 1, ubiquilin-2, valosin containing protein (VCP) 및 VAMP-associated protein type B (VAPB) 등이 알려져 있다(ALS association (www.alsa.org); Human Molecular Genetics, 2007, Vol. 16, No. 19 2359-2365; Clin Ther. 2015 Mar 1;37(3):668-80; Korean Med Assoc 2015 February; 58(2): 131-138)

ALS의 정확한 발병 원인기전은 아직 분명치 않은 상태이며, 다양한 원인과 다양한 기전에 의해 운동신경세포가 사멸하는 최종의 공통 결과가 발생하리라고 본다. 구체적인 기전으로 언급되는 것들로 산화 스트레스, 글루타메이트 독성, 미토콘드리아 기능부전, 염증, 세포자멸사 등이 대표적이다(대한신경근육질환학회; Korean Med Assoc 2015 February; 58(2): 131-138)

아직까지 운동신경세포 질환의 완치나 진행을 멈출 수 있는 근본적인 치료 방법은 없는 실정이며, 많은 연구로 인하여 생존기간을 일부 연장시키거나 삶의 질을 높일 수 있는 치료방법들이 제시되었을 뿐이다. 신경보호효과를 보이는 약물 복용, 호흡보조기 사용, 위루술(gastrostomy) 시행, 다학제적 접근을 통한 치료 등이 그것이다. 미국 식품의약국에서 ALS에서의 치료효과를 공인받은 약물은 릴루졸(riluzole)이 유일하며, 그 약효 수준은 생존기간을 수개월 연장시키는 정도이다. ALS는 치명적인 신경퇴행성 질환으로 환자뿐만 아니라 가족, 간병인 등에게 미치는 영향이 크다. 따라서 새로운 치료제에 대한 요구가 매우 높은 질환이라고 할 수 있다(Clin Ther. 2015 Mar 1;37(3):668-80; Korean Med Assoc 2015 February; 58(2): 131-138).

본 발명은 운동신경세포 질환을 예방, 경감 또는 치료하기 위한 방법을 제공하고자 하는 것이다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 카바메이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료에서 사용하기 위한 용도를 제공하고자 하는 것이다:

[화학식 1]

본 발명은 치료적 유효량의 하기 화학식 1의 카바메이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 포함하는, 운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료용 약제를 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C₁-C₈ 알킬, C₁-C₈ 할로알킬, C₁-C₈ 티오알콕시 및 C₁-C₈ 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,

A₁ 및 A₂에서 어느 하나는 CH이며, 다른 하나는 N이다.

또한, 본 발명은 치료적 유효량의 상기 화학식 1의 카바메이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 포함하고, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하는, 운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 카바메이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 치료적 유효량으로 치료 대상에게 투여하는 것을 포함하여, 운동신경세포 질환을 예방, 경감 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 카바메이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물의, 운동신경세포 질환을 예방, 경감 또는 치료하거나, 이와 관련된 징후를 개선하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화학식 1에서 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 C₁-C₈ 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

일 구체예에서, C₁-C₈ 할로알킬은 퍼플루오로알킬이다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 화학식 1의 카바메이트 화합물은 하기 화학식 2의 카르밤산 (R)-1-(2-클로로페닐)-2-테트라졸-2-일)에틸 에스테르이다:

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2의 카바메이트 화합물의 제조는 당업계에서 화합물 합성에 관한 통상의 지식을 가진 자라면, 공지의 화합물들 또는 이로부터 용이하게 제조할 수 있는 화합물들을 사용하여 제조할 수 있다. 특히, 상기 화학식 1 화합물의 제조 방법은 국제공개특허 WO 2006/112685 A1, WO 2010/150946 A1 및 WO 2011/046380 A2에 상세히 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로서 인용된다. 화학식 1 화합물은 상기 문헌에 기재된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있으나, 이는 하나의 예시적인 방법들을 제시하는 것에 지나지 않으며, 필요에 따라 단위 조작의 순서 등이 선택적으로 바뀔 수 있는 것으로서, 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

상기 화학식 1의 카바메이트 화합물은 운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 운동신경세포 질환은 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis(ALS)), 척추 근위축증(spinal muscle atrophy(SMA)), 진행성 연수마비(progressive bulbar palsy), 원발성 측색 경화증(primary lateral sclerosis(PLS)), 선천성 근형성 부전증(arthrogryposis multiplex congenita(AMC)), 진행성 근위축증(progressive muscular atrophy), 의사 연수마비(pseudobulbar palsy) 및 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia)로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에 따르면, ALS는 산발성(sporadic) 병인이거나, 또는 가족력을 가지는 유전성 병인일 수 있다. 또한 ALS는 SOD1, angiogenin, ataxin-2, optineurin, profiling 1, ubiquilin-2, valosin containing protein (VCP) and VAMP-associated protein type B (VAPB) 유전자로 인하여 유발된 것일 수 있다. 또한 이 질환에서 운동신경세포의 퇴화, 사멸 과정에는 신경세포의 지속적인 흥분성 유지에 기인한 세포독성이 주요 기전 중 한가지로 연관되어 있다(Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener. 2016 Jun 1:1-9; Sci Rep. 2016 Apr 15;6:24515).

상기 화학식 1의 카바메이트 화합물은 신경세포의 흥분성 유지를 억제하는 능력를 통해 퇴화 및 사멸이 진행되는 운동신경세포 질환에 적용될 수 있다.

상기 화학식 I 화합물의 운동신경세포 질환에 대한 효능은 공지의 모델을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 화학식 I 화합물은 ALS의 원인 유전자 중 대표적인 SOD1 유전자 변이를 이용한 형질변환 모델 중, SOD1 변이 유전자가 과다발현된 제브라 피쉬에서 평가하여 유의적인 운동신경 보호효능을 보임으로써, 운동신경세포 질환에서의 예방 또는 치료 용도 사용 가능성을 확인할 수 있다. SOD1 변이 유전자(SOD1 G93A)가 과발현된 제브라피쉬 배아에서는 운동신경세포의 퇴화 및 사멸 과정의 특징인 축색돌기의 길이 감소, 가지(branch) 수 증가 및 형태학적 변화가 관찰됨이 보고되었다 (Human Molecular Genetics, 2007, Vol. 16, No. 19 2359-2365).

상기 질환의 예방, 경감 또는 치료를 위한 화학식 1의 카바메이트 화합물의 투여량은 통상적으로 질환의 중증도, 치료 대상의 체중 및 대사 상태에 따라 달라질 것이다. 개개의 환자에 대한 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 상기한 약리학적 효과, 즉 치료 효과를 달성하는데 충분한 양을 의미한다. 화학식 1 화합물의 치료적 유효량은 인간에게 투여 시 1일 1회 투여 기준 50 내지 500 mg, 바람직하게는 50 내지 400 mg, 더 바람직하게는 50 내지 300mg, 더 바람직하게는 50 내지 200 mg이다.

본 발명의 화합물은 경구, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하 또는 직장 투여와 같이, 치료제의 투여에 사용되는 통상적인 방법으로 투여할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약제 또는 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 카바메이트 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함할 수 있다.

상기 화학식 1의 카바메이트 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염에는, 예를 들어, 독립적으로, 아세테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 비타르트레이트, 칼슘아세테이트, 캄실레이트, 카르보네이트, 시트레이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜로일아르사닐레이트, 헥실레조르시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로겐카르보네이트, 하이드록시나프토에이트, 요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 말레이트, 말리에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸니트레이트, 메틸설페이트, 무케이트, 납실레이트, 니트레이트, 파모에이트 (엠보네이트), 판토테네이트, 포스페이트/디포스페이트, 폴리갈락트유로네이트. 살리실레이트, 스테아레이트, 서브아세테이트, 석시네이트 또는 헤미-석시네이트, 설페이트 또는 헤미-설페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 옥살레이트(oxalate) 또는 헤미-타르트레이트, 테오클레이트, 트리에티오다이드, 벤자틴, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루민, 프로카인, 알루미늄, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연 등이 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약제 또는 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 질내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 일 구체예에 따른 약제학적 조성물은 나정으로, 또는 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 투여되는 경로는 치료 대상의 일반적인 조건 및 연령, 치료 조건의 성질 및 선택되는 활성 성분에 따라 달라질 수 있다

본 발명의 일 구체예에 따른 약제 또는 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 약제학적 조성물은 한 번 또는 여러 번의 투여량으로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 하루 1회 내지 4회로 나누어 투여될 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 약제학적 조성물은 화학식 1의 화합물을 50 내지 500mg, 바람직하게는 50 내지 400mg, 더 바람직하게는 50 내지 300mg, 더 바람직하게는 50 내지 200mg 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약제 또는 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약제학적 조성물은 좌약, 스프레이, 연고, 크림, 젤, 흡입제 또는 피부 패치의 형태로 투여될 수 있다. 또한 상기 약제학적 조성물은 포유동물 투여용, 더 바람직하게는 인간 투여용으로 제조될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며, 부형제, 항산화제, 완충액, 정균제, 분산제, 흡착제, 계면활성제, 결합제, 방부제, 붕해제, 감미제, 향미제, 활택제, 방출조절제, 습윤제, 안정화제, 현탁화제 및 윤활제에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 적절한 부형제(filler)로는, 당(예컨대, 덱스트로스, 수크로스, 말토스 및 락토스), 전분(예컨대, 옥수수 전분), 당-알코올(예컨대, 만니톨, 솔비톨, 말티톨, 에리스리톨 및 자일리톨), 전분 가수분해물(starch hydrolysates)(예컨대, 덱스트린 및 말토덱스트린), 셀롤로스 또는 셀룰로스 유도체 (예컨대, 미세결정질 셀룰로스) 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 적절한 결합제(binder)로는, 포비돈, 코포비돈, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 젤라틴, 검류, 수크로스, 전분 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 적절한 방부제(preservative)로는, 벤조산, 소듐 벤조에이트, 벤질 알콜, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 클로르부톨, 갈레이트, 하이드록시벤조에이트, EDTA 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 적절한 붕해제(disintegrant)로는, 전분 글리콜레이트 소듐염(sodium starch glycolate), 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 가교된 카르복시메틸셀룰로스, 전분, 미세결정질 셀룰로스 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 적절한 감미제로는 수크랄로스, 사카린, 소듐 또는 포타슘 또는 칼슘 사카린, 아세설팜 포타슘 또는 소듐 시클라메이트, 만니톨, 프럭토스, 수크로스, 말토스 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 적절한 활택제(glidant)로는 실리카, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 탈크 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 적절한 윤활제(lubricant)로는, 장쇄 지방산 및 그 염, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트 및 스테아르산, 탈크, 글리세라이드 왁스 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 "예방하다(prevent)", "예방하는(preventing)" 및 "예방(prevention)"은 질병에 걸릴 가능성을 감소시키거나 가능성을 제거하는 것이다.

본 명세서에 사용된 용어 "경감시키다(alleviate)", "경감시키는(alleviating)" 및 "경감(alleviation)"은 질병 및/또는 이의 수반되는 증상을 모두 또는 일부 완화시키는 것이다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)" 및 "치료(treatment)"는 질병 및/또는 이의 수반되는 증상을 모두 또는 일부 제거하는 것이다.

본 명세서에 사용된 용어 "대상"은 치료, 관찰 또는 실험의 객체가 되는 동물, 바람직하게는 포유동물(예컨대, 영장류(primates)(예를 들어, 사람), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 쥐, 마우스 등), 가장 바람직하게는 사람을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 모색되며, 치료될 질환 또는 장애의 징후를 경감시킴을 포함하는, 조직계, 동물 또는 사람에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 화합물 또는 약제학적 제제의 양을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 특정량으로 포함하는 생성물 및 특정량의 특정 성분의 배합물로부터 직접 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포함한다.

본 발명에 따른 약제 및 약제학적 조성물은 운동신경세포 질환, 특히 ALS를 효율적으로 치료 및 예방할 수 있다.

도 1은 정상 제브라피쉬 배아, 사람 SOD1 변이 유전자(SOD1 G93A)가 과발현된 질환모델(이하에서 "질환모델"이라 한다) 제브라피쉬 배아, 수정 후 9시간(9 hpf)부터 72시간(72 hpf)까지 63시간동안 제조예에서 제조된 카르밤산 (R)-1-(2-클로로페닐)-2-테트라졸-2-일)에틸 에스테르(이하에서 "시험 화합물"이라 한다)를 50, 100, 150 μM 농도로 각각 처리한 질환모델 배아의 운동신경의 축색돌기를 촬영한 결과물을 보여주며, 촬영은 수정 후 72시간(72 hpf)에 이루어졌다.
도 2는 수정 후 9시간(9 hpf)부터 72시간(72 hpf)까지 63시간동안 질환모델 제브라피쉬 배아에 시험 화합물을 50, 100, 150 μM 농도로 각각 처리한 후 운동신경 축색돌기의 길이를 정상 제브라피쉬 배아, 약물이 처리되지 않은 질환모델 제브라피쉬 배아와 비교한 결과이다.
도 3은 수정 후 9시간(9 hpf)부터 72시간(72 hpf)까지 63시간동안 질환모델 제브라피쉬 배아에시험 화합물을 50, 100, 150 μM 농도로 각각 처리한 후 운동신경 가지(branch)의 개수를 정상 제브라피쉬 배아, 약물이 처리되지 않은 질환모델 제브라피쉬 배아와 비교한 결과이다.

이하에서 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐 발명의 범위가 이들에 의해서 한정되는 것은 아니다.

제조예 : 카르밤산 (R)-1-(2- 클로로페닐 )-2- 테트라졸 -2-일)에틸 에스테르의 제조

카르밤산 (R)-1-(2-클로로페닐)-2-테트라졸-2-일)에틸 에스테르(시험 화합물)를 국제공개번호 WO 2010/150946호의 제조예 50에 기재된 방법에 따라 제조하였다.

실시예 : SOD1 변이 유전자 과발현을 이용한 제브라피쉬 질환모델을 이용한 ALS 의 예방 및 치료 효능 실험

SOD1 변이 유전자(SOD1 G93A)가 과발현된 제브라피쉬 배아에서는 운동신경세포의 퇴화 및 사멸 과정의 특징인 축색돌기의 길이 감소, 가지(branch) 수 증가 및 형태학적 변화가 관찰됨이 보고되었다(Human Molecular Genetics, 2007, Vol. 16, No. 19 2359-2365).

제브라피쉬 번식 및 관리

제브라피쉬의 성체와 배아(embryo)는 28℃에서 유지, 관리되었으며, 제브라피쉬를 교배시키고 산란을 유도한 후, 배아(embryo)를 수거하여 각 실험에 이용하였다(Park, H. C. et al. J Neurosci 25: 6836-6844; Kucenas, S. et al. 2008. Nat Neurosci 11: 143-151). 운동신경세포의 축색돌기를 시각화하기 위해 dsred2 색소유전자를 발현하는 Tg(olig2:dsred2) 제브라피쉬를 이용하였으며, 제브라피쉬의 색소침착(pigmentation)을 방지하기 위해 수정 후 24시간(24hpf)에 배아 배지(embryo medium)에 0.003% (w/v) 1- phenyl-2-thiourea (PTU)가 추가되었다. 이 때 배아 배지는 증류수 1L에 NaCl 0.292 g, KCl 0.013 g, CaCl₂ 0.044 g, MgSO₄ 0.081 g를 첨가하여 제조되었으며, pH는 7.4이었다.

SOD1 변이 유전자의 과발현 유도

사람 SOD1 변이 유전자(SOD1 G93A)(Addgene ID26401) mMESSAGE mMACHINE RNA Synthesis Kit(Ambion)를 이용하여 in vitro transcription으로 mRNA를 합성한 뒤 MEGAclearTM Kit(Ambion)을 이용하여 정제하였다. 정제된 사람 SOD1 변이 유전자(SOD1 G93A) mRNA를 500 ng/μl로 희석 후, 1세포기 단계의 Tg(olig2:dsred2) 제브라피쉬 배아에 50 pg의 mRNA를 주입(microinjection)하여 과발현을 유도하여 축색돌기의 변화를 일으켰다. 이하에서는 SOD1 변이 유전자의 과발현으로 인해 축색돌기의 변화를 일으킨 배아를 '질환모델 배아'라 한다.

SOD1 변이 유전자가 과발현된 제브라피쉬 질환모델 배아에서의 약효 효능 시험

수정 후 9시간(9 hpf)부터 72시간(72 hpf)까지 50, 100, 150 μM의 시험 화합물을 각각 포함한 배아 배지에서 배아를 배양한 후, 시험 화합물이 비처리된 시험대조군과 운동신경 축색돌기 변화를 비교하였다. 동일한 실험은 2번 반복하여 확인하였다.

약효 효능 관찰

하기와 같은 5개 군의 배아들은 수정 후 72시간(72hpf)에 슬라이드(slide)에 올려 고정하고, Nikon A1si laser-scanning 공초점현미경을 이용해 촬영 후 NIS-Elements AR Analysis 4.30(Nikon) software를 이용하여 운동신경의 축색돌기를 관찰하였다. 이때 효능 평가를 위해 관찰된 표현형은 운동신경 축색돌기의 길이와, 축색돌기의 가지의 개수이다. 축색돌기의 길이와 가지(branch) 수를 측정하기 위해 각 군당 관찰된 배아의 수 및 축색돌기의 수는 아래 표 1과 같다.

그 결과는 표 2, 도 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.

통계 방법: 측정된 값을 평균±표준편차로 표시하였으며, 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 이용하여 p<0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.

질환모델 제브라피쉬 배아에서는 정상 제브라피쉬 배아 대비 축색돌기 길이의 감소와 축색돌기 가지(branch) 수의 변화가 발생함이 확인되었다(도 1, 도 2, 도 3). 축색돌기 길이의 측정 결과, 시험 화합물은 150 μM 농도 처리시 질환 모델에서 감소된 축색돌기의 길이를 유의적으로 증가시켰다(도 1, 도 2). 또한 시험 화합물은100 μM, 150 μM 농도 처리시 질환모델에서 증가된 축색돌기 가지의 수를 유의적으로 감소시켰다(도 1, 도 3). 그 구체적인 결과값은 아래 표 2와 같다.

상기의 결과들로부터, 화학식 1 화합물(시험 화합물)이 운동신경세포 질환에서 나타나는 신경세포의 퇴화 및 사멸과정을 억제하는 효능을 보여줌으로써, 운동신경세포 질환의 예방 및 치료를 위한 약물로 사용될 수 있음이 확인되었다.

Claims

치료적 유효량의 하기 화학식 1의 카바메이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 포함하는, 운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료용 약제:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C₁-C₈ 알킬, C₁-C₈ 할로알킬, C₁-C₈ 티오알콕시 및 C₁-C₈ 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
A₁ 및 A₂에서 어느 하나는 CH이며, 다른 하나는 N이다.
제1항에 있어서, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 C₁-C₈ 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 카바메이트 화합물이 하기 화학식 2의 카르밤산 (R)-1-(2-클로로페닐)-2-테트라졸-2-일)에틸 에스테르인 약제:
[화학식 2]
제1항에 있어서, 근위축성 측색 경화증의 예방, 경감 또는 치료에 사용되는 약제.
제1항에 있어서, 운동신경세포 질환이 근위축성 측색 경화증, 척추 근위축증, 진행성 연수마비, 원발성 측색 경화증, 선천성 근형성 부전증, 진행성 근위축증, 의사 연수마비 및 전두측두엽 치매로부터 선택되는 하나 이상인 약제.
제1항에 있어서, 운동신경세포 질환이 산발성 병인인 약제.
제1항에 있어서, 운동신경세포 질환이 가족력을 가지는 유전성 병인인 약제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 포유 동물 투여용으로 제조된 것인 약제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 50 내지 500mg의 화학식 1의 카바메이트 화합물을 포함하는 약제.
치료적 유효량의 하기 화학식 1의 카바메이트 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 수화물을 포함하고, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하는, 운동신경세포 질환의 예방, 경감 또는 치료용 약제학적 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C₁-C₈ 알킬, C₁-C₈ 할로알킬, C₁-C₈ 티오알콕시 및 C₁-C₈ 알콕시로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
A₁ 및 A₂에서 어느 하나는 CH이며, 다른 하나는 N이다.
제10항에 있어서, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐 및 C₁-C₈ 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 화학식 1의 카바메이트 화합물이 하기 화학식 2의 카르밤산 (R)-1-(2-클로로페닐)-2-테트라졸-2-일)에틸 에스테르인 약제학적 조성물:
[화학식 2]
제10항에 있어서, 근위축성 측색 경화증의 예방, 경감 또는 치료에 사용되는 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 운동신경세포 질환이 근위축성 측색 경화증, 척추 근위축증, 진행성 연수마비, 원발성 측색 경화증, 선천성근형성부전증, 진행성 근위축증, 의사 연수마비 및 전두측두엽치매로부터 선택되는 하나 이상인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 운동신경세포 질환이 산발성 병인인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 운동신경세포 질환이 가족력을 가지는 유전성 병인인 약제학적 조성물.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 포유 동물 투여용으로 제조된 것인 약제학적 조성물.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 50 내지 500mg의 화학식 1의 카바메이트 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.