CN1738627A - 神经营养因子诱导坏死的抑制方法 - Google Patents

神经营养因子诱导坏死的抑制方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1738627A
CN1738627A CNA2004800024852A CN200480002485A CN1738627A CN 1738627 A CN1738627 A CN 1738627A CN A2004800024852 A CNA2004800024852 A CN A2004800024852A CN 200480002485 A CN200480002485 A CN 200480002485A CN 1738627 A CN1738627 A CN 1738627A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bdnf
neurotrophin
neuronal death
induced
neurotrophic factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800024852A
Other languages
English (en)
Inventor
郭秉周
尹性和
金宣希
元硕骏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Niu Luote
Original Assignee
Niu Luote
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Niu Luote filed Critical Niu Luote
Publication of CN1738627A publication Critical patent/CN1738627A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A61K31/355—Tocopherols, e.g. vitamin E
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof
    • A61K31/606—Salicylic acid; Derivatives thereof having amino groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Abstract

本发明公开了一种抑制由神经营养因子诱导产生坏死的方法，更特别的是通过氧化应激抑制剂给药来抑制坏死的方法，以及通过氧化应激抑制剂和神经营养因子给药同时抑制坏死和凋亡的方法。本发明中的氧化应激抑制剂可以抑制由神经营养因子诱导产生的神经细胞坏死。此外，通过氧化应激抑制剂和神经营养因子给药，本方法可以用于保护神经细胞免受与阿耳茨海默病、帕金森氏病和退行性脑病有关疾病的破坏以及促进神经细胞的再生。

Description

神经营养因子诱导坏死的抑制方法
技术领域
本发明涉及预防由神经营养因子诱导神经元坏死的药理学组合物，更特别地是，涉及通过抗氧化剂预防神经营养因子诱导神经元死亡以及通过神经营养因子与抗氧化剂的协同效应来增强神经元存活的促进作用的方法。
技术背景
中枢和外周神经元的存活在很大程度上依赖于与从它们的靶细胞释放出的神经营养因子的接触(Levi-Montalcini，1987，EMBO J.，6，1145-1154；Barde，1994，Prog.Clin.Biol.Res.，390，45-56)。神经营养因子的神经营养效果是通过与具有酪氨酸激酶活性、高亲和性神经营养因子受体TrkA、TrkB或TrkC的结合启动的(Patapoutian and Reichardt，2001，Curr.Opin.Neurobiol.，11，272-280；Kaplan and Miller，2000，Curr.Opin.Neurobiol.，10，381-391)。该Trk酪氨酸激酶可激活在小脑颗粒神经元、皮层神经元、海马神经元、交感神经元和感觉神经元的多种神经元存活中起重要作用的小GTP-结合蛋白Ras、PI-3K和PLC(Borasio et al.，1993，J.Cell.Biol.，121，665-672；Stephens et al.，1994，Neuron，12，691-705；Yaoand Cooper，1995，Science.，267，2003-2006；Nobes et al.，1996，Neuroscience.，70，1067-1079；Nonomura et al.，1996，Brain Res Dev BrainRes.，97，42-50；Alcantara et al.，1997，J Neurosci.，17(10)，3623-3633；Hetman et al.，1999，J Biol Chem.，274，22569-22580；Atwal et al.，2000，Neuron.，27，265-227)。
神经营养因子通过干扰正常发育过程中的程序性细胞死亡或凋亡来增强神经元的存活(Barde，1994，Prog.Clin.Biol.Res.，390，45-56；Deshmukh and Johnson，1997，Mol.Pharmacol.，51，897-906)。神经营养因子的神经保护作用可在遭受病理性伤害的中枢神经元中观察到。例如，通过体内的轴索显微外科术，神经营养因子可以改善基底前脑胆碱能神经元，视网膜脑神经节神经元以及脊椎感觉和运动神经元的退行性改变(Hefti，1986，J.Neurosci.，6，2155-2162；Yan et al.，1993，.Neurobiol.，24，1555-1577；Mey and Thanos，1993，Brain Res.，602，304-317；Morse et al.，1993，J.Neurosci.，13，4146-4156；Cohen et al.，1994，J.Neurobiol.，25，953-959；Friedman et al.，1995，J.Neurosci.，15，1044-1056)。神经生长因子(NGF)，脑源神经营养因子(BDNF)和神经营养因子(NT)-4/5可以减少缺氧-缺血性损伤后的神经元死亡(Hefti，1986，J.Neurosci.，6，2155-2162；Yanet al.，1993，J.Neurobiol.，24，1555-1577；Mey and Thanos，1993，Brain Res.，602，304-317；Morse et al.，1993，J.Neurosci.，13，4146-4156；Cohen et al.，1994，J.Neurobiol.，25，953-959；Friedman et al.，1995，J.Neurosci.，15，1044-1056)。BDNF可保护多巴胺能神经元使之免于1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶和6-羟基多巴胺的影响(Spina et al.，1992，J.Neurochem.，59，99-106；Frim et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，5104-5108)。
以上发现显示神经营养因子对于缺氧-缺血性和各种神经退行性疾病的治疗潜力。然而神经营养因子的有益效果会被神经营养因子可加重某些类型的神经元损伤这一观点所抵消。BDNF、NT-3或NT-4/5可能通过增加Ca2+内流和通过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)谷氨酸受体产生的NO(一氧化氮)使神经元对氧和葡萄糖剥夺高度易感(Femandez-Sanchezand Novelli，1993，FEBS Lett.，335，124-131；Koh et al.，1995，Science，268，573-575；Samdani et al.，1997，J.Neurosci.，17，4633-4641)。在皮层细胞培养中，BDNF、NGF和NT-4/5可加强由氧化应激或锌诱导的神经元细胞坏死(Gwag et al.，1995，Neuroreport，7，93-96；Park et al.，1998，Neuroreport，9，687-690；Won et al.，2000，Neurobiol Dis，7，251-259)。
最近，本发明人发现神经营养因子可直接诱导皮层细胞培养和成年大鼠中神经元细胞坏死以及诱导对某些神经元损伤的强化作用(Kim et al.，2002，J Cell Biol，159，821-831)。据此，神经营养因子的意外神经毒性似乎解释了对神经性疼痛和肌萎缩性侧索硬化临床试验的失败(Apfel et al.，2001，Clin.Chem.Lab.Med.，39(4)，351-61)。
因此，发明人描述了神经营养因子毒性作用的发生机理，研究了预防神经营养因子毒性的药物，通过使用抗氧化剂开发了优化神经营养因子治疗效果的方法以完成本发明。
发明内容
本发明提供了通过抗氧化剂给药预防神经营养因子诱导神经元细胞坏死的方法，以及提供了通过神经营养因子和抗氧化剂同时给药预防神经元凋亡和坏死的方法。
本发明提供了通过抗氧化剂给药预防神经营养因子诱导神经元细胞坏死的方法。
本发明提供了通过神经营养因子和抗氧化剂同时给药同时预防神经元凋亡和坏死的方法。
本发明提供了通过四氟苄基(tetrafluorobenzyl)衍生物给药预防神经营养因子诱导神经元细胞坏死的方法。
本发明提供了通过神经营养因子和四氟苄基衍生物同时给药预防神经元凋亡和坏死的方法。
附图的简要说明
结合附图，从以下的详细描述中，可以对本发明的以上或其它的目的、特征和其它优点有更清楚的理解。
图1所示为在皮层细胞培养中神经营养因子诱导神经元坏死的曲线图。
A：用BDNF处理；B：用NT-3处理；C：用NT-4/5处理。
图2所示为纹状体内注射盐水或BDNF 2天后，苏木精-伊红(H&E)对大脑切片中神经元坏死的染色图。
A：纹状体内注射盐水后，经H&E染色的大脑切片明视野显微照相图；
B：纹状体内注射BDNF后，经H&E染色的大脑切片明视野显微照相图；
C：如图所示为盐水或BDNF注射后，H&E染色的大脑切片中退行性神经元的定量分析。
图3所示假洗或暴露于BDNF后32小时皮层神经元的显微照片，
A：假洗的相差显微照片；
B：BDNF的相差显微照片；
C：假洗的电子显微照片；
D：BDNF的电子显微照片。
图4所示为BDNF诱导神经元的死亡形式，从将皮层细胞培养物暴露于BDNF后32小时，假洗组和对照组中，退行性神经元被定义为正常、坏死(见以上描述)或凋亡。
图5所示为持续地暴露于单独的BDNF、或暴露于BDNF和抗-BDNF封闭抗体、BDNF和trolox、或BDNF和CHX(放线菌酮)之后，通过对皮层神经元流出到洗浴培养液(bathing medium)中的LDH对神经元死亡进行分析的图。
图6所示为在指定的时间通过检测氧化的DCDHF-DA(DCF)的荧光强度对假洗或BDNF的皮层神经元暴露的ROS水平进行分析的图。
图7所示为将皮层细胞培养物暴露于假洗或单独100ng/ml BDNF，或在CHX或trolox存在时暴露于100ng/ml BDNF 32h后在皮层神经元中DCF荧光定量的图。
图8所示为在指定时间暴露于BDNF时在皮层细胞培养物中NADPH氧化酶和GAPDH mRNA表达的RT-PCR分析图。
图9所示为在指定时间暴露于BDNF时在皮层细胞培养物中NADPH氧化酶和GAPDH mRNA表达的mRNA水平定量图。
图10所示为在指定时间暴露于BDNF之后在皮层细胞培养物中NADPH氧化酶和肌动蛋白(actin)表达的western印记分析图。
图11所示为假洗和BDNF暴露后经过免疫标记的皮层细胞培养物的荧光显微照片；
A：假洗，使用与FITC连接的抗p47-phox或抗-山羊IgG进行免疫标记；
B：假洗，使用得克萨斯红(Texas red)连接的NeuN或抗-山羊IgG进行免疫标记；
C：用BDNF处理，使用与FITC连接的抗p47-phox或抗-山羊IgG进行免疫标记；
D：用BDNF处理，使用与得克萨斯红连接的NeuN或抗-山羊IgG进行免疫标记。
图12所示为假洗和BDNF之后经过荧光标记的皮层细胞培养物的荧光显微照片。
A：假洗，使用使用与FITC连接的抗p67-phox或抗-山羊IgG进行免疫标记；
B：假洗，使用与得克萨斯红连接的NeuN或抗-山羊IgG进行免疫标记；
C：用BDNF处理，使用使用与FITC连接的抗p67-phox或抗-山羊IgG进行免疫标记；
D：用BDNF处理，使用与得克萨斯红连接的NeuN或抗-山羊IgG进行免疫标记。
图13所示为在指定时间利用抗p47-phox和抗p67-phox抗体对从暴露于BDNF的皮层细胞培养物中获得胞质体组分(C)和膜组分(M)进行western印记分析的图。
图14所示为通过检测在指定时间暴露于假洗或BDNF并在DPI有无时的皮层培养物中细胞色素c的还原水平来对过氧化物产生进行分析的图。
图15所示为假洗、BDNF或加入DPI的BDNF后皮层神经元中氧化的Het和DCF的荧光显微照片。
A：暴露于假操作后皮层神经元中的氧化的氢乙啡啶(hydroethydine)(HEt)；
B：暴露于BDNF后皮层神经元中的氧化的氢乙啡啶(HEt)；
C：暴露于加入DPI的BDNF后皮层神经元中的氧化的氢乙啡啶(HEt)；
D：暴露于假操作后皮层神经元中的氧化DCF；
E：暴露于BDNF后皮层神经元中的氧化DCF；
F：暴露于加入DPI的BDNF后皮层神经元中的氧化DCF。
图16所示为通过对暴露于BDNF，BDNF+DPI，BDNF+AEBSF或BDNF+2-羟基-TTBA后皮层神经元中进入洗浴培养液中的LDH外流的检测对神经元死亡进行分析的图。
图17所示为暴露于无血清、单独或有BDNF存在、加入的DPI的BDNF、DPI、加入trolox的BDNF或trolox后，在富含神经元的皮层细胞培养物中对神经元凋亡进行分析的图。
本发明的详细描述
以下是本发明的详细描述：
本发明提供了通过给予具有阻断氧化应激的药物来预防神经营养因子诱导产生坏死的方法。
本发明中的抗氧化剂可选自NADPH氧化酶抑制剂、维生素E、维生素E类似物或四氟苄基衍生物。NADPH氧化酶抑制剂可选自二亚苯基碘(diphenylene iodonium)(DPI)或4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)。维生素E类似物是trolox，一种维生素E的膜透过性形式。四氟苄基衍生物可选自BAS(5-苄基氨基水杨酸)、TBAS(5-(4-三氟甲基苄基)氨基水杨酸)、NBAS(5-(4-硝基苄基)氨基水杨酸)、CBAS(5-(4-氯苄基)氨基水杨酸)、MBAS(5-(4-甲氧苄基)氨基水杨酸)、FBAS(5-(4-氟苄基)水杨酸)、及2-羟基-TTBA(2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4三氟甲基-苄基氨基)-安息香酸。
本发明中的神经营养因子可选自神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)和NT-4/5，更优选BNDF。
BNDF通过诱导NADPH氧化酶的表达和活化以及随后产生的具有反应活性氧类(ROS)引起神经元细胞坏死。
DPI或AEBSF的给药可以通过抑制NADPH氧化酶和ROS的产生预防BDNF诱导的神经元细胞坏死。维生素E或其类似物trolox可以通过阻断ROS的产生来预防BDNF诱导的神经元死亡。四氟苄基衍生物BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羟基-TTBA可以作为抗氧化剂(WO 01/79153)来封阻自由基神经毒性，这些抗氧化剂可以预防BDNF诱导的神经元死亡。
因此，本发明中的抗氧化剂能够预防神经营养因子诱导的神经元细胞坏死。
本发明提供了采用神经营养因子和抗氧化剂共同给药预防神经元凋亡和坏死的方法。
本发明中的抗氧化剂选自NADPH氧化酶抑制剂、维生素E、维生素E类似物或四氟苄基衍生物。NADPH氧化酶抑制剂选自DPI或AEBSF。优选的维生素E类似物是trolox，一种维生素E的膜透过性形式。四氟苄基衍生物选自BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羟基-TTBA。
本发明中的神经营养因子选自脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)和NT-4/5，更优选BDNF。
尽管神经营养因子可以通过阻止凋亡来提升神经元的存活，但也有可能通过ROS的产生引起神经元坏死。后者可以通过抗氧化剂给药得以阻止。有意思的是，抗氧化剂共同给药极大地提升通过阻止神经营养因子的促坏死(pro-necrotic)作用以提高神经元存活的效果。
因此，神经营养因子和抗氧化剂共同给药可以应用于预防缺氧-缺血性损伤(Holtzman et al.，1996，Ann.Neurol.，39(1)，114-122；Ferrer et al.，2001，Acta neuropathol.(Berl.)，101(3)，229-38)、慢性脊髓损伤(Jin et al.，2002，Exp.Neurol.，177(1)，265-75)、阿耳茨海默病(Siegel and Chauhan，2000，Brain Res.Brain Res.Rev.，33，2-3)、帕金森氏病(Bradford et al.，1999，Adv.Neruol.80，19025)、ALS(Louvel et al.，1997，Trends.Pharmacol.Sci.，18(6)，196-203)、亨廷顿氏舞蹈病(Perez-Navarro et al.，2000，J.Neurochem.，75(5)，2190-9)、青光眼(Ko et al.，2000，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，41(10)，2967-71)或视网膜脱落(Lewis et al.，1999，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，40(7)，1530-1544)中的凋亡和坏死。
本发明提供预防神经营养因子诱导的神经元细胞坏死的抑制剂，并因此通过四氟苄基衍生物给药提高神经营养因子的存活作用。
含有四氟苄基衍生物作为有效组分的药物可以用于预防神经营养因子诱导的ROS产生以及神经元细胞坏死。本发明中的四氟苄基衍生物选自BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羟基-TTBA。
本发明中的神经营养因子选自脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)和NT-4/5，更优选BDNF。
本发明中的组合物可以通过口服给药、静脉注射或非口服给药方式进行治疗，以及通过诸如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、灭菌溶液、悬浮液或直肠给药栓剂的多种形式进行治疗。所述组合物中的主要有效成分能够采用药物载体制成固体片剂，该载体例如诸如玉米糊精，乳糖，蔗糖，山梨醇，滑石，硬脂酸，硬脂酸镁，磷酸钙(decalcium phosphate)或树胶常用的片剂成分，以及其它的药物稀释溶液。本发明中具有药物组合物的片剂或丸剂，可使用适合的产业中的公知包被方法等制备易化形式给药的缓释剂型。例如，片剂或丸剂可由内部和外部给药成分组成。片剂或丸剂的内部给药成分可通过外部给药成分包裹来制备。制造用于口服给药或注射的本发明组合物的液体形式包括溶液，适合口味的糖浆，水溶性悬浮液，水不溶性悬浮液，由诸如棉花油、芝麻油、椰子油或花生油等可食性油制成的乳浊液，酏剂以及类似的药物载体。黄芪胶、阿拉伯树胶、褐藻酸钠盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或诸如明胶等合成或天然的树胶可在制备水溶性悬浮液时用作适合添加剂进行分散和悬浮。
对神经退行性改变的治疗所采用药物治疗的量可通过诸如疾病、年龄、性别、体重以及患者的疾病程度等一些相关因素来确定。
以下将对本发明的实施方案进行详述。
然而，方案中所描述的实施例仅是本发明中的代表，其还可以包括更多的例子。
实施例1 原代皮层细胞培养
从17天龄胎鼠大脑制备大鼠皮层细胞培养物，并如前所述(Noh andGwag，1997)，将新皮质机械性磨碎。将分离的细胞接种于6-孔板和24-孔板(每板大约3块皮质)，或接种于玻璃底面的35mm培养皿以用于ROS成像。接种培养基由添加了5％马血清、5％胎牛血清、21mM葡萄糖，26.5mM碳酸氢钠和2mM L-谷氨酰胺的Eagle’s极限必须培养基(MEM，Earle’s盐，不合补充的谷氨酰胺)组成。
对于神经元-神经胶质的混合培养物，在DIV5-7，当神经胶质细胞在神经元下方生长至融合时，加入10μM胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara C)终止非神经元细胞的过度生长。两天后，用缺乏胎儿血清的接种培养基进行培养，每周更换培养基两次。将培养物放置于维持37℃，湿润的5％ CO2培养箱中。对于富含神经元的培养物(＞95％)，如前所述(Gwag et al.，1997)，在体外培养2-3天(DIV 2-3)时，2.5μM的Ara C被加入到培养物中。
实施例2 细胞死亡的诱导和分析
为了检测神经营养因子是否会诱导神经元坏死，通过检测释放到洗浴培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平来对BDNF诱导的神经元死亡进行分析。
用不含血清的MS(添加了26.5mM碳酸氢钠和21mM葡萄糖的MEM)冲洗混合的皮层细胞培养物(DIV12-14)，然后将其暴露于不同NGF，BDNF或NT-3浓度的无血清MS中。通过检测释放到洗浴培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平来对神经元细胞死亡进行分析。通过相对假洗对照(定义为0％)或者持续暴露于500μM NMDA 24hr(定义为100％)后释放LDH的平均值对神经元死亡百分比进行标准化处理。后者在24小时内能够产生全部神经元的死亡。对无血清的实验，富含神经元的培养物(DIV 7)被放置于如所述的(Gwag et al.，1995)含有1μM MK-801的无血清MS中。24和48小时后，通过台盼蓝染色排除方法计数活存神经元来对神经元死亡进行分析。
在持续暴露于不同浓度(10，30或100ng/ml)的BDNF或NT-3达36-48小时的情况下，皮层细胞培养物中发生广泛的神经元死亡(图1A)。在暴露于BDNF或NT-3后48小时之内可以观察到神经元几乎全部死亡(图1)。神经元死亡通过测量洗浴培养基中的LDH的外流来进行评估的，平均值±SEM(n＝16培养孔/每个条件下)。*为P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls检验，与相关对照(假洗对照)相比较具有显著性差异。
所以，发现诸如BDNF、NT-3和NT-4/5的神经营养因子都能引发细胞坏死。
实施例3 大鼠大脑的BDNF纹状体内注射
为了确认BDNF诱导的神经元坏死，使用水合三氯乙醛(400mg/ml)对体重250-300g的Sprague-Dawley成年雄性大鼠进行腹腔内麻醉。将动物放置在Kopf立体固定器上，以下列坐标在纹状体中进行1g/l BDNF(溶解于0.9％氯化钠(盐水))，或单独的盐水注射：前囟点嘴侧1.0mm，中线侧方3.0mm以及硬脑膜表面腹侧5.0mm。对每一次注射，都使用10ulHamilton注射器用10分钟注射5ul体积。在拔出注射器和伤口闭合之前允许有3分钟时间。这些大鼠在2天后实施安乐死。将动物进行麻醉，然后用磷酸缓冲液(PBS)和3％多聚甲醛进行穿心灌注。将大脑立即取出，后固定，并在切片机(TPI，Inc.，MO)上进行切片(8μm)。将收集包括注射位置的切片并用苏木精和伊红(H&E)进行染色。如前所述对损伤区域进行分析(Won et al.，2000)。对每只动物损伤分析包括含有针迹和随染色强度降低的最严重损伤区域事件等的六张连续切片。
使用电脑辅助影像分析系统(SigmaScan，CA/TINA 2.0，KAIST，Daejeon，Korea)来对H&E染色的纹状体切片进行扫描分析。在纹状体内注射BDNF 2天后成年大鼠大脑的纹状体区域观察到NT的神经毒性作用(图2)。
实施例4 透射电子显微镜观察
为了确定BDNF诱导的神经元细胞死亡形式，我们在相差或透射电子显微镜下对假洗或持续暴露于100ng/ml BFNF 32小时后的神经元进行了观察。
将培养物在Karnovskys固定液(1％多聚甲醛，2％戊二醛，2mM氯化钙，100mM二甲砷酸盐缓冲液，pH7.4)中固定2小时，用二甲砷酸盐缓冲液冲洗，并用1％四氧化锇和1.5％亚铁氰化钾后固定1小时。细胞随后用0.5％乙酸双氧铀进行整体(en bloc)染色，乙醇梯度进行脱水，并包埋于Poly/Bed 812树脂中(Pelco，CA)。使用Reichert Jung Ultracut S(Leica，Cambridge，UK)对细胞进行切片。乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，使用Zeiss EM 902A对细胞进行观察和照相。
对在经过BDNF处理的皮层培养物中退行性神经元的超显微结构分析显示出细胞浆细胞器的膨胀，与核膜相比较早期的质膜塌陷以及核染色质的散在凝集(图3和图4)。选择对照和BDNF处理的神经元在透射电子显微镜下进行观察，并将退行性神经元定义为正常，坏死或凋亡(细胞浆皱缩，核膜破裂而质膜完整)，说明BDNF会诱导神经元坏死。
实施例5 BDNF在皮层神经元中产生ROS
许多研究都暗示升高的反应活性氧类(ROS)会诱导神经元坏死，我们检测了BDNF诱导的神经元坏死是否会产生ROS。
向生长在玻璃底面培养皿的皮层细胞培养物(DIV 12-15)中加入10uM二氯二氢醋酸荧光素(DCDHF-DA)或5mM氢乙啡啶(hydroethidium)(Molecular Probes，Eugene，OR)和加入2％Pluronic F-127溶于含有(mM单位)120NaCl，5KCl，1.6MgCl2，2.3CaCl2，15葡萄糖，20HEPES，及10NaOH的HEPES-缓冲对照盐水(HCSS)缓冲液。将培养物在37℃孵育20分钟后用HCSS缓冲液冲洗三遍。在室温下用配备有100W氙灯和滤光片(对氧化DCDHF而言，激发波长＝488nm，发射波长＝510nm；对氢乙啡啶而言，激发波长＝546nm，发射波长＝590nm)的Nikon Diaphot倒置显微镜观察氧化DCDHF的荧光信号。使用QuantiCell 700系统对荧光图像进行分析(Applied Imaging，UK)。
在皮层神经元暴露于BDNF 16小时的情况下，DCF的荧光强度有所增加(图6)。神经元内的ROS水平([ROS]i)在24-32小时后进一步增加。同时加入放线菌酮和trolox可以预防BDNF诱导的[ROS]i产生(图7)。
所以，BDNF有可能通过促氧化蛋白(pro-oxidant)的合成产生ROS。
实施例6 RDNF诱导的神经元坏死机理
为了确定BDNF诱导的神经元坏死机理，皮层细胞培养物(DIV12-15)被持续的暴露于单独的100ng/ml BDNF，或100ng/ml BDNF与100μg/ml抗BDNF封闭抗体、100μM trolox、或1μg/ml放线菌酮一同36小时后，通过测量洗浴培养基中的LDH外流量对神经元死亡进行分析。抗BDNF封闭抗体的同时给药完全封阻了BDNF的神经毒性。
有意思的是，BDNF诱导的神经元细胞坏死也可以通过添加放线菌酮、一种蛋白合成抑制剂，以及trolox、一种维生素E的亲脂性类似物，来阻断(图5)。{平均值±SEM(n＝每个条件16培养孔)。*，P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls检验，与相关对照组(单独进行BDNF处理)相比较具有显著性差异。}
所以，对具有反应活性的氧类(ROS)产生的阻断伴随对BDNF诱导的神经元坏死的神经保护性作用。
实施例7 BDNF处理后在大鼠皮层细胞培养物中表达的基因(7-1)cDNA微阵列分析
我们利用cDNA微阵列分析在皮层细胞培养物中筛选BDNF活化的促-氧化剂靶基因。
使用RNA zol B(Tel-Test INC.，Friendswood，TX)从皮层细胞培养物中提取总RNA。使用大约1μg总RNA来合成由[α-33P]dATP标记的cDNA，其与大鼠基因滤膜(Research Genetics，Huntsville，AL)在42℃杂交12-18小时。在2×柠檬酸钠盐水(SSC)和1％十二烷基磺酸钠(SDS)的溶液中50℃洗膜20分钟，在0.5×SSC和1％SDS中室温15分钟，随后塑料膜包裹起来并置于磷成像暗盒中。基因滤膜经过曝光后，使用PathwayTM4通用微阵列分析软件(Invitrogen，Netherlands)对杂交模式进行分析。
微阵列分析显示在暴露于BDNF 8小时的皮层细胞培养物中有多个基因被调节(表1)。BDNF的靶基因在有可能反应神经营养因子神经营养作用的分化、胞吞、代谢和信号转导中具有最主要的作用。在BDNF敏感基因中，因为其构成NADPH氧化酶的p22-phox和gp91-phox亚基、一种从氧中产生过氧化物的促-氧化酶，细胞色素b558被选为NT神经毒性作用的一个候选基因。
(7-2)反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
因为其构成NADPH氧化酶的p22-phox和gp91-phox亚基、一种从氧中产生过氧化物的促-氧化酶，通过RT-PCR实验来验证来源于cDNA表达微阵列的BDNF敏感基因、细胞色素b558。
将总RNA(每份1μg)在含有dNTP(每份2.5mM)，RNasin(0.5单位)，寡聚dT引物(100ng)和MMLV反转录酶(200单位)的反应混合物中在37℃孵育1小时。样品在92℃中孵育10分钟后转移到4℃。根据制造商(TakaraShuzo Co.，Japan)的步骤依次(变性-退火-延伸)按下列条件：对p47-phox而言，94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒(28个循环)；对p22-phox(与在微阵列中的细胞色素b558同源)和gp91-phox而言，94℃45秒，60℃60秒，72℃120秒(33个循环)；对GAPDH而言，94℃35秒，55℃45秒，72℃90秒(25个循环)进行PCR反应。所采用的引物序列如下(5’-3’)：对p22-phox而言，GAATTCCGATGGGGCAGATCGAGTGGGCCA(正向)和GGATCCCGTCACACGACCTCATCTGTCACT(反向)；对p47-phox而言，CAGCCAGCACTATGTGTACA(正向)和GAACTCGTAGATCTCGGTGAA(反向)；对gp91-phox而言，GAATTCCGATGGGGAACTGGGCTGTGAATG(正向)和GGATCCCGTTAGAAGTTTTCCTTGTTGAAA(反向)；对GAPDH而言，TCCATGACAACTTTGGCATCGTGG(正向)和GTTGCTGTTGAAGTCACAGGAGAC(反向)。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳并在溴化乙锭存在下可见。针对GAPDH mRNA水平进行标准化，使用LAS-1000系统(Fuji Photofilm Co.，Japan)对mRNA的相对量进行度量。使用来自于Perkin Elmer Applied Biosystems的Big DyeTerminator Chemistry在ABI PRISMTM 377 DNA测序仪(Foster City，CA)上进行DNA测序。
反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析表明在BDNF处理后2小时内p22-phox和gp91-phox的mRNA水平有上升。两种mRNA水平在随后的4小时上升到最大，并持续在接下来的12小时。在BDNF给药后30分钟，p47-phox亚基的mRNA水平也在逐渐上升(图8和图9)。
所以，BDNF表现出可以增加NADPH氧化酶的表达。
(7-3)Western blot分析
使用提供的针对gp91-phox、p47-phox和p67-phox的抗体通过Western印记实验对NADPH氧化酶亚基的蛋白水平进行分析。
在含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1％Nonidet P-40、150mM氯化钠、0.5％脱氧胆酸、0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)、10mg/ml pepstain A和100mg/ml亮肽酶素(leupeptin)的裂解缓冲液中对皮层细胞培养物进行裂解。将细胞裂解物在12,000g离心10分钟，大约25μg蛋白被用来在12％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并转移到硝酸纤维素膜上。将印记在2.5％牛血清白蛋白中孵育1小时，与含有抗-gp91-phox、抗-p67-phox和抗-p47-phox抗体(1∶1000，Santa Cruz，SantaCruz，CA)的山羊多克隆第一抗体孵育，然后再与生物素偶联的抗-山羊第二抗体进行反应。使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratory，Burlingame，CA，USA)对免疫反应进行检测，并使用发光氨以获得增强的化学发光(Intron，Korea)。使用LAS-1000系统(Fuji Photofilm Co.，Japan)通过定量光密度测定法对信号进行分析。
将皮层细胞培养物暴露于BDNF 16-32小时后，NADPH氧化酶亚基gp91-phox、p47-phox和p67-phox的蛋白水平升高(图10)。
所以，表明BDNF可以表达NADPH氧化酶的蛋白水平。
(7-4)免疫细胞化学
使用免疫细胞化学用来鉴定在含有神经元和神经胶质的皮层培养物中哪个种类的细胞表达NADPH氧化酶。
使用4％多聚甲醛对生长于玻璃底面培养皿上的皮层细胞培养物(DIV12-14)固定30分钟，在10％马血清中孵育1小时，使用抗NeuN的小鼠单克隆抗体(1∶400稀释，Chemicon，Temecula，CA)和抗p47-phox或p67-phox的山羊多克隆抗体(1∶200稀释，Santa Cruz，Santa Cruz，CA)进行双免疫标记2-4小时。随后将培养物与异硫氰酸荧光素-连接的抗-山羊IgG(1∶200稀释，Organon Teknika Corp.，NC)和德克萨斯红-连接的抗小鼠IgG(1∶200，Vector Laboratory，Burlingame，CA)反应1-2小时。使用配备有Real-14TM精密数码相机(Apogee Instrument，Tucson，AZ)和ImagePro Plus插件(Silver Spring，MD)的荧光显微镜(Zeiss，Germany)对荧光图像进行采集和分析。
经过假洗处理后在皮层神经元而不是星形细胞中稍微地观察到p47-phox或p67-phox抗体的免疫反应性。在将皮层细胞培养物暴露于BDNF后32小时，只有神经元中的p47-phox和p67-phox信号升高(图11和图12)。
(7-5)亚细胞分部分离
NADPH氧化酶的活化涉及细胞溶质p47-phox和p67-phox亚基向质膜上的转移((Clark et al.，1989，Trans.Assoc.Am.Physicians.，102，224-230)。我们通过分离细胞溶质和细胞膜组分检测了BDNF的处理是否会活化NADPH氧化酶。
用冰预冷的PBS冲洗皮层细胞培养物并将其重悬于含有10mMHEPES，pH8.0，250mM蔗糖，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM二硫苏糖醇(DTT)，2mM PMSF，100μg/ml亮肽酶素和10μg/ml胃蛋白酶抑制剂A的等渗缓冲液中。为了分离细胞溶质和细胞膜组分，将裂解物用匀浆器匀浆(KONTE，Vineland，New jersey)，9,000g离心10分钟，再将上清液在100,000g离心1小时。
用50μl裂解缓冲液重悬沉淀以获得细胞膜组分同时从上清液中获得胞质组分。如实施例7-4所示，使用提供的gp91-phox、p47-phox和p67-phox抗体进行western印记试验来对NADPH氧化酶亚基的蛋白水平进行分析。
在暴露于BDNF 16-32小时的皮层细胞培养物中p47-phox和p67-phox的水平在胞质组分中降低而在细胞膜组分中升高(图13)，说明BDNF诱导的NADPH氧化酶活化处理在细胞膜组分中升高，通过ROS的产生在皮层神经元中诱导了氧化应激。
实施例8  BDNF处理的皮层细胞培养物中NADPH氧化酶活性的检测
我们检测了NADPH氧化酶活化是否有助于BDNF诱导的神经元死亡。
采用基于细胞色素c还原(Mayo and Curnutte，1990)的定量动态分析对过氧化物生成进行检测。将皮层细胞培养物用PBS重悬，并在含有0.9mM氯化钙，0.5mM氯化镁，7.5mM葡萄糖，75μM细胞色素c(Sigma，St.Louis，MO)和60μg/ml超氧化物岐化酶(Sigma，St.Louis，MO)的反应混合物中37℃孵育3分钟。通过使用Thermomax microplate reader和SOFTMAX Version 2.02软件(Molecular Devices Corp.，Menlo Park，CA)在550nm检测细胞色素c的吸光度来确定过氧化物的产量。
3-10nM DPI或10-30μM 4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)的NADPH氧化酶抑制剂的共同给药在将皮层细胞培养物暴露于BDNF 36小时后显著性地减少神经元细胞体的膨胀和神经元死亡(图14)。
所以，NADPH氧化酶选择性抑制剂存在时，NADPH氧化酶介导的过氧化物产生降低。
实施例9 通过NADPH氧化酶活化BDNF产生ROS
NADPH氧化酶最早是在吞噬细胞中通过对氧的一个电子的还原作为过氧化物产生酶被发现的。我们实验了通过NADPH氧化酶活化BDNF是否会产生ROS的检测。
通过NADPH氧化酶活化的过氧化物产生，是皮层神经元暴露于假操作、100ng/ml BDNF或100ng/ml BDNF加上3nM DPI后32小时通过检测HEt和DCDHF分别至乙啡啶和DCF的氧化来进行分析(图15)。BDNF的处理导致Het和DCDHF氧化增加，DPI完全封阻了BDNF-诱导的过氧化物产生(图15)。
所以，通过NADPH氧化酶介导的过氧化物产生BDNF在皮层神经元中产生了氧化应激。
实施例10  NADPH氧化酶介导的BDNF神经毒性的活化
我们检测了NADPH氧化酶的活化是否有助于BDNF诱导的神经元死亡。
将皮层细胞培养物(DIV12-15)单独暴露于100ng/ml BDNF或暴露于100ng/ml BDNF与NADPH氧化酶抑制剂3-10nM DPI、10-30mM 4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)或1mM 2-羟基-TTBA((2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基氨基)-苯甲酸)一起的情况下。通过检测36小时后外流到洗浴培养基中的LDH对神经元死亡进行分析。
3nM DPI，10mM AEBSF或1mM 2-羟基-TTBA的共同给药在将皮层培养细胞暴露于BDNF 36小时后显著的减低了神经元坏死(图16)。平均值±SEM(每个条件下n＝16培养孔)。*，为P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls检验，与相关对照(单独BDNF)相比较具有显著性差异。
所以，BDNF的神经营养效果通过NADPH抑制剂或抗氧化剂对氧化应激的阻断得到了增强。
实施例11  NT的抗凋亡作用
有报道认为BDNF可以防止神经元凋亡。如前所述，我们检测了诸如NADPH氧化酶抑制剂或抗氧化剂对BDN F作用的阻断是否会影响BDNF诱导的神经元坏死。
将富含神经元的皮层细胞培养物(DIV 7)去除血清，单独(无血清)或在100ng/ml BDNF，100ng/ml BDNF添加3nM DPI，3nM DPI，100ng/mlBDNF添加100μM trolox或100μM trolox存在的情况下，24或48小时后对活的神经元进行计数来对神经元死亡进行评估。
无论DPI还是trolox都不能单独地降低去除血清诱导的神经元凋亡。在含有DPI和trolox的情况下BDNF的抗-凋亡作用并不敏感。有意思的是，去除血清后48小时内BDNF的保护性效果消失了。同时添加DPI或trolox能够减弱BDNF引起的延迟神经元死亡(图17)。平均值±SEM(n＝从4个培养孔中随机选出的16个视野/每个条件下)。*，P＜0.05，使用方差分析和Student-Newman-Keuls检验，与相关对照(单独去除血清)相比较具有显著性差异。
BDNF给药可以预防神经元凋亡，而对BDNF延长时间的暴露产生神经元细胞坏死而不会阻断BDNF的抗凋亡作用。
以上结果表明BDNF诱导的NADPH氧化酶的活化和表达能够引起氧化性神经元坏死，以及NT的神经营养作用可在对促-坏死作用进行阻断情况下达到最高。抗氧化剂或其神经营养因子对具体疾病应用如下所述。
以下描述的应用实施例是本发明实施例的一部分。本发明不仅限于这些应用实施例。
应用实施例1 阿耳茨海默病(AD)
AD的病理性特征为大脑皮层和海马结构中谷氨酸能(glutamaergic)神经元的退行性改变以及在基底前脑中胆碱能神经元的退行性改变，淀粉样蛋白斑的细胞外沉积，和细胞内神经原纤维缠结。神经营养因子(例如神经生长因子[NGF])能够促进诸如基底前脑中胆碱能神经元的AD中易受损伤的中枢神经系统[CNS]神经元亚群的活存和表型，表明该分子能够用于治疗神经退行性改变相关的人类疾病(Hefti，1994，J Neurobiol.，25，1418-1435)。在AD中，已有关于脂过氧化、8-羟脱氧鸟苷、蛋白羰基、硝化作用或由过量自由基产生导致的蛋白氧化交联的产生的报道，说明氧化应激在AD神经元死亡中起到成因作用[Vitek et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：4766-4770(1994)；Smith et al.，Trends.Neurosci.，18：172-176(1995)，Mol.Chem.Neuropathol.，28：41-48(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，94：9866-9868(1997)；Montine et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55：202-210(1996)]。事实上，抗氧化剂的治疗效果在AD患者中已进行了深入的调查。Zn2+在AD患者大脑(杏仁核、海马、顶下小叶和颞回中部)中，主要在淀粉样蛋白斑的中心或周围的积累，并且诱导β淀粉样蛋白的聚集[Lovell et al.，J.Neurol.Sci.，158：47-52(1998)]。所以，本发明中具有对氧化应激和Zn2+毒性具有保护效果的化合物能够作为AD的治疗药物使用。
应用实施例2 帕金森氏病(PD)
PD是一种由于黑质中多巴胺能神经元的选择性死亡而表现为运动功能紊乱的神经退行性改变疾病。在PD患者中，氧化应激已被证明作为神经元细胞死亡的一个主要机理，已有产生脂过氧化反应、8-羟脱氧鸟苷、蛋白羰基或硝化作用的报导，说明氧化应激在PD神经元死亡中是重要的原因(Tatton and Kish，1997，Neuroscience，77，1037-1048；He et al.，2000，Brain Research，858，163-166；Turmel et al.，2001，Mov.Disord.，16，185-189)。许多体内研究证明帕金森氏黑质凋亡发生的一些证据，以及诸如BDNF或GDNF(神经胶质细胞来源的神经营养因子)的神经营养因子也可在体内预防多巴胺能神经元的死亡(Bradford et al.，1999，Adv.Nerurol.，80，19-25；Levivier et al.，1995，J.Neurosci.，15，7810-7820；Olson，1996，Nat.Med.，2，400-401；Gash et al.，1996，Nature，380，252-255)。
所以，本发明中具有NT神经营养作用和抗氧化剂作用的化合物能够作为PD的治疗药物使用。
应用实施例3 肌萎缩性侧索硬化
肌萎缩性侧索硬化(ALS)是一种成年发作的神经学病症，其特征在于在临床发作2-5年内选择性的下肢和/或上肢运动神经元退行性改变并导致进行性无力，骨骼肌萎缩和最终的瘫痪和死亡。常染色体显性的家族性ALS(FALS)在编码Cu/Zn过氧化物岐化酶(SOD1)的基因上具有点突变，与对照患者相比较，蛋白羰基成分，一种氧化破坏的标记在SALS患者中增加(Bowling et al.，1993，J.Neurochem.，61，2322-2325)。最近，在肌萎缩性侧索硬化中的BDNF的临床试验并没有表现出有益的效果(Apfel et al.，2001，Clin.Chem.Lab.Med.，39(4)，351-61)。这种不理想的效果可能归因于神经营养因子导致的氧化性神经元死亡。所以，可以采用神经营养因子和抗氧化剂同时给药能够应用于有效治疗ALS。
应用实施例4 缺氧-缺血性损伤
当局部血栓、血栓颗粒或血管破裂中断血液流向大脑的时候会发生中风。在缺氧缺血性中，细胞膜的去极化引发神经元和神经胶质中过量的Ca2+内流，反映出随后在线粒体中Ca2+的积累([Ca2+]m)。线粒体中过量的Ca2+导致自由基的产生。细胞中积累的ROS会随机地攻击DNA、脂类和蛋白质；因此它们有助于形成缺氧-缺血性神经元坏死。ROS和RNS的药理学或遗传学干涉可对缺氧-缺血性神经元坏死具有神经保护作用(Holtzman et al.，1996，Ann.Neurol.，39(1)，114-122；Ferrer et al.，2001，Actaneuropathol.(Berl.)，101(3)，229-38；Hall et al.，1990，Stroke，21，11183-11187)。由于在发生神经元死亡过程的缺氧缺血性大脑区域中，观察到了DNA梯状带、TUNEL阳性神经元和染色质浓缩现象；所以凋亡以及坏死被认为是缺氧缺血性神经元死亡其它形式。因此，神经营养因子和抗氧化剂的同时给药能够用于有效治疗缺氧-缺血性损伤。
应用实施例5 慢性脊髓损伤
对脊髓的创伤损伤可以导致组织破坏，部分原因是启动反应性生物化学改变。众多研究为脂过氧化反应、Ca2+内流和在脊髓损伤中的细胞膜破裂提供了相当多的支持(Brown and Hall，1992，J.Am.Vet.Med.Assoc.，200，1849-1859；Springer et al.，1997，J.Neurochem.，68，2469-2476；Juurlink andPaterson，1998，J.Spinal cord Med.，21，309-334)，近来的证据提供出诸如谷氨酸兴奋性中毒、Ca2+过载和氧化应激的神经元坏死也会引起第二次损伤，特异性的Caspase 3酶抑制剂可在大脑创伤模型中明显地降低神经元凋亡(Zhang et al.，1990，J.Neurochem.，59，733-739)。所以，神经营养因子和抗氧化剂的同时给药能够用于有效治疗慢性脊髓损伤。
应用实施例6 亨廷顿氏舞蹈病(HD)
纹状体凸出神经元在HD中极其易感形成凋亡，氧化应激有助于纹状体凸出的凋亡，神经营养因子是支持神经元存活，维持它们的功能和保护它们免受不同种类的侵害的蛋白。最近的报道指出移植诸如GDNF或BDNF等神经营养因子分泌细胞系，可以在亨廷顿氏舞蹈病的大鼠模型中保护纹状体凸出神经元(Perez-Navarro et al.，2000，J.Neurochem.，75(5)，2190-9)。所以，本发明中的与神经营养因子和抗氧化剂的同时给药显示神经保护作用的化合物能够作为HD的有效治疗药物使用。
应用实施例7 青光眼或视网膜脱落
青光眼是一种慢性的、渐进性的通常导致失明的视神经病。升高的眼内压(IOP)是青光眼形成过程中最重要的危险因素。与在不同的物种中证实的一样凋亡导致了青光眼视网膜神经节细胞(RGC)的死亡。降低IOP一直是青光眼的最重要治疗方法。最近的研究表明，在动物模型中自由基清除剂、神经营养因子以及其他生长因子可以促进RGC的存活并且控制由升高IOP诱导的损伤(Ko et al.，2000，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，41(10)，2967-71)。最近的证据表明BDNF可以通过维持光受体细胞的存活、降低在Muller细胞中的神经胶质化作用和有可能通过促进外部片断再生在再附着后的视网膜恢复中起到辅助作用(Lewiset al.，1999，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，40(7)，1530-1544)。所以，神经营养因子和抗氧化剂的同时给药能够用于有效地治疗青光眼和视网膜脱落。
实用性
应用于本发明中的抗氧化剂能够阻断神经营养因子诱导的神经元坏死而不影响神经营养因子的抗凋亡作用，抗氧化剂和神经营养因子的共同给药能够在诸如中风、外伤的急性脑疾病以及诸如阿耳茨海默病和帕金森氏病神经退行性改变疾病中用于预防神经元损伤和促进再生。

Claims (13)

1.通过抗氧化剂给药预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法。
2.如权利要求1中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中神经营养因子与所述抗氧化剂同时给药。
3.如权利要求1或2中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述神经营养因子选自神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3和NT-4/5。
4.如权利要求1或2中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述神经营养因子是BDNF。
5.如权利要求1或2中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述抗氧化剂选自NADPH氧化酶抑制剂、维生素E、维生素E类似物和四氟苄基衍生物。
6.如权利要求5所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述NADPH氧化酶抑制剂选自二亚苯碘(DPI)和4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)中的至少一种。
7.如权利要求5中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述维生素E类似物是trolox。
8.如权利要求5中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述的四氟苄基衍生物选自BAS(5-苄基氨基水杨酸)、TBAS(5-(4-三氟甲基苄基)氨基水杨酸)、NBAS(5-(4-硝基苄基)氨基水杨酸)、CBAS(5-(4-氯苄基)氨基水杨酸)、MBAS(5-(4-甲氧苄基)氨基水杨酸)、FBAS(5-(4-氟苄基)水杨酸)及2-羟基-TTBA(2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4三氟甲基-苄基氨基)-安息香酸。
9.如权利要求2中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述方法用于预防或治疗缺氧-缺血性损伤、慢性脊髓损伤、阿耳茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈病、青光眼或视网膜脱落。
10.如权利要求1或2中所述的预防神经营养因子诱导的神经元死亡的方法，其中所述的神经元死亡是神经元凋亡和/或坏死。
11.神经营养因子诱导的神经元死亡的抑制剂，其特征在于所述抑制剂包含选自四氟苄基衍生物中的至少一种，所述衍生物包括作为有效组分的BAS、TBAS、NBAS、CBAS、MBAS、FBAS和2-羟基-TTB。
12.如权利要求11中所述的神经营养因子诱导的神经元死亡的抑制剂，还含有作为有效组分的神经营养因子。
13.如权利要求11或12中所述的神经营养因子诱导的神经元死亡的抑制剂，其中所述的神经元死亡是神经元凋亡和/或坏死。
CNA2004800024852A 2003-01-20 2004-01-20 神经营养因子诱导坏死的抑制方法 Pending CN1738627A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2003-0003765A KR100522188B1 (ko) 2003-01-20 2003-01-20 뉴로트로핀에 의해 유도되는 세포괴사 억제 방법
KR1020030003765 2003-01-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1738627A true CN1738627A (zh) 2006-02-22

Family

ID=36081148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800024852A Pending CN1738627A (zh) 2003-01-20 2004-01-20 神经营养因子诱导坏死的抑制方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7608585B2 (zh)
EP (1) EP1592429A4 (zh)
JP (1) JP2006515370A (zh)
KR (1) KR100522188B1 (zh)
CN (1) CN1738627A (zh)
AU (1) AU2004206187A1 (zh)
CA (1) CA2518888A1 (zh)
WO (1) WO2004064844A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102316863A (zh) * 2009-02-09 2012-01-11 纽若泰克制药株式会社 5-苄基氨基水杨酸衍生物或其盐的医药用途
CN110257392A (zh) * 2019-06-28 2019-09-20 西安医学院 转录后水平低氧调控基因、应用及其调控方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8241622B2 (en) 2001-07-13 2012-08-14 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors with intravector heterologous terminal palindromic sequences
CN101041626B (zh) * 2002-06-19 2010-08-25 艾克尔制药公司 四氟苄基衍生物及含有其成分的药物组合物
WO2006126825A1 (en) * 2005-05-23 2006-11-30 Choongwae Pharma Corporation Composition comprising tetrafluorobenzyl derivatives or salts of thereof for injection
RU2413715C2 (ru) 2005-05-25 2011-03-10 Чунгвей Фарма Корпорейшн Способ получения замещенных тетрафторбензиланилиновых соединений и их фармацевтически приемлемых солей
JP5208369B2 (ja) * 2005-08-24 2013-06-12 ニューロテック ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド 神経細胞の死滅または神経機能の障害を治療するための薬学製剤及び併用療法
AU2006332728A1 (en) 2005-12-30 2007-07-12 University Of Iowa Research Foundation Method of identifying compounds useful to treat neuronal degenerative diseases
WO2007076875A2 (en) * 2006-01-06 2007-07-12 Aarhus Universitet Compounds acting on the serotonin transporter
KR100852962B1 (ko) * 2007-11-12 2008-08-20 주식회사 뉴로테크 2-하이드록시-5-페닐알킬아미노벤조산 유도체 및 이의 염의제조방법
ES2633691T3 (es) * 2009-04-06 2017-09-22 Neurotech Pharmaceuticals Co., Ltd. Composición farmacéutica para tratar o prevenir lesiones por quemaduras
WO2017139381A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
MA43735A (fr) 2016-03-07 2018-11-28 Univ Iowa Res Found Expression médiée par aav utilisant un promoteur et un activateur synthétiques
MX2020005029A (es) * 2017-11-15 2020-08-13 Univ Vanderbilt Metodos y composiciones para el mejoramiento de la funcion lisosomal y tratamiento de enfermedad neurodegenerativa.

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5762922A (en) * 1994-01-31 1998-06-09 Ludwig Institute For Cancer Research Antioxidants and intracellular gluthathione raising agents for therapeutic treatments
AU1926595A (en) * 1994-02-22 1995-09-04 Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture, The Pharmaceutical formulations of ciliary neurotrophic factor
JP3854154B2 (ja) * 2000-04-19 2006-12-06 ニューロテック カンパニー リミテッド 中枢神経系の急性及び慢性的損傷に起因した神経変性を防止するための化合物、組成物及び方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102316863A (zh) * 2009-02-09 2012-01-11 纽若泰克制药株式会社 5-苄基氨基水杨酸衍生物或其盐的医药用途
CN110257392A (zh) * 2019-06-28 2019-09-20 西安医学院 转录后水平低氧调控基因、应用及其调控方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1592429A1 (en) 2005-11-09
US20060135600A1 (en) 2006-06-22
AU2004206187A1 (en) 2004-08-05
KR20040066639A (ko) 2004-07-27
EP1592429A4 (en) 2007-01-10
WO2004064844A9 (en) 2005-08-25
WO2004064844A1 (en) 2004-08-05
KR100522188B1 (ko) 2005-10-18
JP2006515370A (ja) 2006-05-25
US7608585B2 (en) 2009-10-27
CA2518888A1 (en) 2004-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230330063A1 (en) Combination product for the treatment of neurological and/or psychiatric disorders
CN1738627A (zh) 神经营养因子诱导坏死的抑制方法
Bassil et al. Insulin, IGF-1 and GLP-1 signaling in neurodegenerative disorders: targets for disease modification?
JP5616631B2 (ja) 細胞機能を変化させるための方法および組成物
Hungs et al. Hypocretin/orexin, sleep and narcolepsy
JP4753683B2 (ja) 細胞機能を変化させるための方法および組成物
Plosker et al. Cerebrolysin: a review of its use in dementia
CN101048156A (zh) 用于治疗青光眼性视网膜病变及眼病的JunN端激酶抑制剂
Doze et al. α1A-and α1B-adrenergic receptors differentially modulate antidepressant-like behavior in the mouse
Bak et al. Antioxidant effect of human placenta hydrolysate against oxidative stress on muscle atrophy
WO2011004620A1 (ja) 細胞保護剤
WO2015140799A1 (en) Methods for improving cognitive function via modulation of quinone reductase 2
Sun et al. L-serine treatment may improve neurorestoration of rats after permanent focal cerebral ischemia potentially through improvement of neurorepair
Yang et al. Targeting iodothyronine deiodinases locally in the retina is a therapeutic strategy for retinal degeneration
Ma et al. Sigma ligands as potent inhibitors of Aβ and AβOs in neurons and promising therapeutic agents of Alzheimer's disease
JP2006515370A6 (ja) 神経細胞死滅を治療するための方法及び組成物
US8901094B2 (en) Use of nucleic acid sequences for the treatment of epilepsy
EP2255825A2 (en) Composition for preventing or treating brain diseases
Hanington et al. Analysis of leukemia inhibitory factor and leukemia inhibitory factor receptor in embryonic and adult zebrafish (Danio rerio)
US20160113931A1 (en) Method of treating and/or preventing neurodegenerative diseases
Yao et al. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase protects against hippocampal neuronal injuries by increasing neuropeptide Y expression in temporal lobe epilepsy mice
Yu et al. TrkA pathway (s) are involves in the regulation of TRPM2 and TRPM7 expression in the substantia nigra of the Parkinson’s disease rat model induced by 6-hydroxydopamine
Tasleem et al. Neuroprotective efficacy of melatonin in the pathophysiology of neurodegenerative disorders
JP2023160809A (ja) 自閉症スペクトラム障害および同様に落ち着きのなさ、興奮性、睡眠障害、および潜在的な常同症を伴う他の神経行動障害の治療における使用のためのｎ－パルミトイルエタノールアミドおよびメラトニン
Xiong et al. The signal pathway of melatonin mediates the monochromatic light-induced T-lymphocyte apoptosis in chicken thymus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1083686

Country of ref document: HK

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1083686

Country of ref document: HK