JP2006501217A - 新規キナーゼ阻害剤としての３−ピロリル−ピリドピラゾールおよび３−ピロリル−インダゾール - Google Patents

Abstract

式Ｉ：
【化１２２】

［式中，Ｘ，Ｒ₁−Ｒ₇およびＲ₉は本明細書において定義されるとおりである］
の化合物は，蛋白質キナーゼの調節剤として有用であり，および細胞増殖阻害剤としての活性を有する。

Description

発明の背景
以下は，背景情報としてのみ提供され，本発明に対する従来技術であると認めるものではない。

蛋白質キナーゼ（"ＰＫ"）は，蛋白質のチロシン，セリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシ基のリン酸化を触媒する酵素である。この外観上は単純な活性の結果は圧倒的である。細胞成長，分化および増殖，すなわち，細胞生命のほぼすべての観点が種々の仕方でＰＫ活性に依存する。さらに，異常なＰＫ活性は，比較的生命を脅かさない疾患（例えば乾癬）から，非常に悪性の疾患（例えば神経膠細胞腫（脳癌））までの範囲の疾患の宿主と関連づけられてきた。

ＰＫは，慣用的に２種類に分類することができる：蛋白質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）。

セリン／トレオニンキナーゼもしくはＳＴＫは，ＣＴＫと同様に，主として細胞内にあるが，ＳＴＫタイプのレセプターキナーゼは少ない。ＳＴＫはもっとも一般的なサイトゾルキナーゼである。すなわち，細胞質オルガネラおよび細胞骨格以外の，細胞質のその部分でその機能を行うキナーゼである。サイトゾルは，細胞の中間代謝および生合成活性のほとんどが生ずる細胞中の領域である。例えば，蛋白質がリボソーム上で合成されるのはサイトゾル内である。現在のところ，４つのグループのＳＴＫがある；Ｓｔｅ（ステライル２０，ステライル１１およびステライル７）；ｃａｍｋ（カルモジュリン制御キナーゼおよび関連するキナーゼ）；ＡＧＣ（蛋白質キナーゼＡ，蛋白質キナーゼＧおよび蛋白質キナーゼＣ）およびＣＭＧＣ（ｃｄｋ，ｍａｐキナーゼ，グリコゲンシンセターゼキナーゼおよびｃｌｋ）。ステライル２０キナーゼにはＰＡＫおよびＣＺが含まれる。

ＰＴＫ活性の主な観点の１つは，成長因子レセプターに対するその関与である。成長因子レセプターは細胞表面蛋白質である。成長因子リガンドが結合すると，成長因子レセプターは活性型に変換され，これが細胞膜の内表面上の蛋白質と相互作用する。この相互作用は，レセプターおよび他の蛋白質のチロシン残基のリン酸化を引き起こし，細胞内部で種々の細胞質シグナリング分子との複合体を形成する。次にこれらの複合体は多くの細胞性応答，例えば，細胞分裂（増殖），細胞分化，細胞成長，細胞外微細環境への代謝的効果の発現等を行う。さらに詳しい議論については，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏｎ，９：３０３−３９１，１９９２（本明細書において完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。

ＰＴＫ活性を有する成長因子レセプターはレセプターチロシンキナーゼ（"ＲＴＫ"）として知られている。これらは，多様な生物学的活性を有する貫膜レセプターの大きなファミリーを含む。現在のところ，ＲＴＫの少なくとも１９個の異なるサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの例は，"ＨＥＲ"ＲＴＫと称されるサブファミリーであり，これにはＥＧＦＲ（上皮成長因子レセプター），ＨＥＲ２，ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。これらのＲＴＫは，細胞外グリコシル化リガンド結合ドメイン，貫膜ドメインおよび蛋白質上のチロシン残基をリン酸化しうる細胞内細胞質触媒ドメインから構成される。

別のＲＴＫサブファミリーは，インスリンレセプター（ＩＲ），インスリン様成長因子Ｉレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリンレセプター関連レセプター（ＩＲＲ）を含む。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒはインスリン，ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと相互作用して，２つの完全に細胞外のグリコシル化されたαサブユニットと，細胞膜を横断しチロシンキナーゼドメインを含有する２つのβサブユニットのヘテロ４量体を形成する。

第３のＲＴＫサブファミリーは，血小板由来成長因子レセプター（"ＰＤＧＦＲ"）群と称され，これにはＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，ｃ−ｋｉｔおよびｃ−ｆｍｓが含まれる。これらのレセプターは，可変数のイムノグロビン様ループからなるグリコシル化された細胞外ドメイン，およびチロシンキナーゼドメインが関連のないアミノ酸配列により分断されている細胞内ドメインから構成される。

別の群は，そのＰＤＧＦＲサブファミリーとの類似性のため，しばしばＰＤＧＦＲサブファミリーに包摂される，胎児肝キナーゼ（"ｆｌｋ"）レセプターサブファミリーである。この群は，キナーゼ挿入ドメイン−レセプター胎児肝キナーゼ−１（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１），ｆｌｋ−１Ｒ，ｆｌｋ−４およびｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｆｌｔ−１）からなると考えられている。

チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーの別のメンバーは，繊維芽細胞成長因子（"ＦＧＦ"）レセプターサブグループである。この群は，４つのレセプター，ＦＧＦＲ１−４，および７つのリガンド，ＦＧＦ１−７から構成される。まだあまり明確にされていないが，レセプターは，可変数のイムノグロビン様ループを含有するグリコシル化された細胞外ドメイン，およびチロシンキナーゼ配列が関係のないアミノ酸配列の領域により分断されている細胞内ドメインから構成されるようである。

チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーのさらに別のメンバーは血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ"）レセプターサブグループである。ＶＥＧＦは，ＰＤＧＦに類似する二量体の糖蛋白質であるが，異なる生物学的機能およびインビボでの標的細胞特異性を有する。特に，ＶＥＧＦは，現在，脈管形成および新脈管形成において必須の役割を果たすと考えられている。

チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーのさらに別のメンバーはＭＥＴであり，これはしばしばｃ−Ｍｅｔと称される。ｃ−Ｍｅｔは，原発性腫瘍成長および転移に役割を果たしていると考えられている。

既知のＲＴＫサブファミリーのより完全なリストは，Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９（１９９４）（本明細書において完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。

ＲＴＫに加え，"非レセプターチロシンキナーゼ"または"細胞性チロシンキナーゼと称される，完全に細胞内のＰＴＫのファミリーが存在する。本明細書においては"ＣＴＫ"と略されるこの後者の定義を用いる。ＣＴＫは細胞外および貫膜ドメインを含有しない。現在のところ，１１個のサブファミリー（Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，Ｚａｐ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐｓ，Ｆａｋ，ＪａｋおよびＡｃｋ）の２４個を越えるＣＴＫが同定されている。Ｓｒｃサブファミリーは，これまでのところ，ＣＴＫのもっとも大きい群であるようであり，Ｓｒｃ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，ＦｇｒおよびＹｒｋを含む。ＣＴＫのより詳細な議論については，Ｂｏｌｅｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２０２３−２０３１（１９９３）（本明細書において完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。

ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫはすべて，病原性状態，特に癌を含む状態の宿主であることが示唆されてきた。ＰＴＫと関連づけられてきた他の病原性状態には，限定されないが，乾癬，肝硬変，糖尿病，動脈硬化，新脈管形成，再狭窄，眼性疾患，慢性関節リウマチおよび他の炎症性疾患，自己免疫疾患等の免疫疾患，アテローム性動脈硬化等の心臓血管疾患，および種々の腎臓疾患が含まれる。

癌に関しては，腫瘍の発達を推進する過剰な細胞増殖を説明する主要な仮説の２つは，ＰＫにより制御されることが知られている機能に関連する。すなわち，悪性細胞成長は細胞分裂および／または分化を調節するメカニズムの故障に起因することが示唆されている。多数のプロトオンコジンの蛋白質産物は，細胞成長および分化を制御するシグナル伝達経路に関与することが示されている。これらのプロトオンコジンの蛋白質産物には，上で議論した，細胞外成長因子，貫膜成長因子ＰＴＫレセプター（ＲＴＫ），細胞質ＰＴＫ（ＣＴＫ）およびサイトゾルＳＴＫが含まれる。

ＰＫに関連する細胞活性と広範な種類のヒト疾患との間の見かけ上の連結の観点から，ＰＫ活性を調節する方法を同定しようとする試みに多大な努力が払われていることは驚くべきことではない。これらのいくつかには，実際の細胞プロセスに関与する分子を模倣する大きな分子を用いるバイオミメティック方法が含まれる（例えば，変異体リガンド（米国特許４，９６６，８４９）；可溶性レセプターおよび抗体（ＷＯ９４／１０２０２，Ｋｅｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：１０７０５−１０７０９（１９９４），Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：８４１−８４４（１９９３））；ＲＮＡリガンド（Ｊｅｌｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１０４５０−５６）；Ｔａｋａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ，４：３５８Ａ（１９９３）；Ｋｉｎｓｅｌｌａ， ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９：５６−６２（１９９２）；Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓ．，１５２：４４８−５７）およびチロシンキナーゼ阻害剤（ＷＯ９４／０３４２７；ＷＯ９２／２１６６０；ＷＯ９１／１５４９５；ＷＯ９４／１４８０８；米国特許５，３３０，９９２；Ｍａｒｉａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：２２６８（１９９４））。

上述に加え，ＰＫ阻害剤として作用する小分子を同定する試みがなされている。例えば，ビス単環，二環およびヘテロ環アリール化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２），ビニレンアザインドール誘導体（ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８）および１−シクロプロピル−４−ピリジルキノロン類（米国特許５，３３０，９９２）が，チロシンキナーゼ阻害剤として記載されている。スチリル化合物（米国特許５，２１７，９９９），スチリル置換ピリジル化合物（米国特許５，３０２，６０６），キナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６６２６６Ａ１），セレナインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４２７），三環ポリヒドロキシル化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０）およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５）はすべて，癌の治療において有用なＰＴＫ阻害剤として記載されている。

最近，Ｒｅｉｃｈら（ＷＯ０１／５３２６８）は，インダゾール化合物を製造し，これは細胞増殖を媒介し阻害するのに有用であることが示された。ここに開示される化合物は，蛋白質キナーゼ活性のメディエータとしての活性を有することが知られている。

同様に，Ｃｏｘら（ＷＯ０１／４７９２２）は，蛋白質キナーゼ阻害剤として有用なアザインダゾール化合物を開示する。Ｋａｎｉａら（ＷＯ０１／０２３６９）もまた，蛋白質キナーゼの阻害剤として有用なインドール置換基を有するインダゾール化合物を開示する。Ｏｅら（ＪＰ０１１９０６８１）は，抗腫瘍剤および免疫促進剤としてのピラゾロ［３，４−ｂ］−ピリジンを開示する。

従来技術の化合物は，蛋白質キナーゼを媒介することにより細胞増殖性疾患を治療するのに有用なピロール置換ピリドピラゾール化合物を提供していない。

発明の概要
ＰＫ調節能力を示し，異常なＰＫ活性に関連する疾患に対して有益な効果を有する，新規ピロール−置換ピリドピラゾール化合物およびピロール置換インダゾール化合物のファミリーが発見された。この化合物のファミリーが，レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）およびセリン／トレオニン蛋白質キナーゼ（ＳＴＫ）の触媒活性を調節することが示された。

ＳＴＫ，例えば，限定されないが，ＰＡＫおよびＺＣ１の触媒活性は，例えば，ピロール置換ピリドピラゾール化合物により調節することができ，特にＰＡＫを調節することができる。そのような化合物は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび／またはＳＴＫの触媒活性に影響を与えることにより，それらの蛋白質により伝達されるシグナルを妨害することができる。

化学
１つの観点においては，本発明は，次の化学構造（式Ｉ）：

［式中，ＸはＮまたはＣＲ₈であり；
Ｒ₁およびＲ₉は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，アリールスルホニル，アルキルスルホニル，またはＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’，ＳＯ₂ＲおよびＣ（Ｏ）Ｒ’または生理学的条件下で加水分解可能な成分からなる群より選択されるプロドラッグ基であり；
Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＨＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’または（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され，ここで，前記アルキル，アリールまたはヘテロアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，ヒドロキシ，カルボン酸，アミノまたはヘテロ脂環式でさらに置換されていてもよく；
Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈は，独立して，Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＲＲ’，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’，トリハロメチルまたは（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され；
ｎは０−３であり；
ｍは０−３であり；および
ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキル，ヘテロアリールまたはアリールであり，ここで，アルキルまたはアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ”）₂，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ”，（ＣＨ₂）_nＯＲ”，（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ”，アルコキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アミノカルボニル，ヘテロ脂環式環，アリール，アルキル，アルコキシ，−ＣＺ_3,−ＯＣＺ₃，アリールオキシ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく；
Ｒ”はＨ，アルキルまたはアリールであり；
Ｚはハロゲンであり；
あるいは，ＮＲＲ’は，５−７員のヘテロ脂環式環，５−６員のヘテロアリール環を表してもよく，ここで，ヘテロ脂環式環はＮ，ＯまたはＳを含んでいてもよく，ＮＲＲ’のまわりに形成される環状構造は，アルキル，ハロアルキル，アルコキシ，ヒドロキシおよびハロからなる群より選択される成分で置換されていてもよく；
ここで，Ｒ₄はピロール環の２位または３位のいずれかに結合しており，かつピラゾール環は２位または３位に結合しており，Ｒ₄とピラゾール環との両方は同じ位置には結合しておらず；
ただし，（１）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₉，Ｒ₅，Ｒ₇およびＲ₈が水素であり，ＸがＣＲ₈であるとき，Ｒ₆は，ピリジル，ＮＯ₂，またはＮＨ₂ではなく，および（２）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈が水素であり，ＸがＣＲ₈であるとき，Ｒ₉はフェニルではない］
を有する化合物に関する。

別の観点においては，本発明は，以下の化学構造（式Ｉ）：

［式中，ＸはＮまたはＣＲ₈であり；
Ｒ₁およびＲ₉は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，アリールスルホニル，アルキルスルホニル，またはＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’，ＳＯ₂ＲおよびＣ（Ｏ）Ｒ’または生理学的条件下で加水分解可能な成分からなる群より選択されるプロドラッグ基であり；
Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＨＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’または（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され，ここで，前記アルキル，アリールまたはヘテロアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，ヒドロキシ，カルボン酸，アミノまたはヘテロ脂環式でさらに置換されていてもよく；
Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈は，独立して，Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＲＲ’，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’，トリハロメチルまたは（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され；
ｎは０−３であり；
ｍは０−３であり；および
ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキル，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式またはアリールであり，ここで，アルキルまたはアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ”）₂，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ”，（ＣＨ₂）_nＯＲ”，（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ”，アルコキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アミノカルボニル，ヘテロ脂環式環，アリール，アルキル，アルコキシ，−ＣＺ_3,−ＯＣＺ₃，アリールオキシ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく；
Ｒ”は，Ｈ，アルキルまたはアリールであり；
Ｚはハロゲンであり；
あるいは，ＮＲＲ’は，５−７員のヘテロ脂環式環，５−６員のヘテロアリール環を表してもよく，ここで，ヘテロ脂環式環はＮ，ＯまたはＳを含んでいてもよく，ＮＲＲ’のまわりに形成される環状構造は，アルキル，ハロアルキル，アルコキシ，ヒドロキシおよびハロからなる群より選択される成分で置換されていてもよく；
ここで，Ｒ₄はピロール環の２位または３位のいずれかに結合しており，かつピラゾール環は２位または３位に結合しており，Ｒ₄とピラゾール環との両方は同じ位置には結合しておらず；
ただし，（１）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₉，Ｒ₅，Ｒ₇およびＲ₈が水素であり，ＸがＣＲ₈であるとき，Ｒ₆は，ピリジル，ＮＯ₂，またはＮＨ₂ではなく，および（２）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈が水素であり，ＸがＣＲ₈；であるとき，Ｒ₉はフェニルではない］
を有する化合物に関する。

本発明の好ましい態様はまた，蛋白質キナーゼ活性に伴う異常な状態を治療する方法に関し，この方法は，治療を必要とする患者に，有効量の式ＩまたはＩＩ（式ＩＩは以下に記載される）の化合物を投与することを含む。

本発明の好ましい態様はさらに，式ＩまたはＩＩの化合物および薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。

本発明の好ましい態様は，蛋白質キナーゼ活性に伴う細胞増殖，分化またはアポトーシスを治療する方法に関し，この方法は，治療を必要とする患者に有効量の式ＩまたはＩＩの化合物を投与することを含む。

本発明の好ましい態様はまた，蛋白質キナーゼシグナル伝達を阻害する方法に関し，この方法は，阻害を必要とする患者に有効量の式ＩまたはＩＩの化合物を投与することを含む。

最後に，本発明の好ましい態様は，蛋白質キナーゼシグナル伝達を活性化する方法に関し，この方法は，活性化を必要とする患者に有効量の式ＩまたはＩＩの化合物を投与することを含む。

化合物−好ましい構造的特徴
本発明の１つの態様は，ＸがＣＲ₈である，式（Ｉ）の化合物である。別の態様は，ＸがＮである式（Ｉ）の化合物である。好ましい態様は，Ｒ₂およびＲ₃が，独立して，ハロゲン，ＮＯ₂，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，および（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’からなる群より選択される式（Ｉ）の化合物である。別の好ましい態様は，Ｒ₆がＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，トリハロメチルおよびＮＯ₂からなる群より選択される式（Ｉ）の化合物である。さらに別の好ましい態様は，Ｒ₅がハロゲン，アミノまたはヘテロ脂環式環である式（Ｉ）の化合物である。さらに別の好ましい態様は，Ｒ₁およびＲ₉が，Ｈ，アルキル，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’またはＳＯ₂Ｒからなる群より選択される式（Ｉ）の化合物である。さらに別の態様は，Ｒ₃が，ハロゲン，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，および（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’からなる群より選択される式（Ｉ）の化合物である。さらに別の態様は，Ｒ₆がＮＨＣ（Ｏ）ＲおよびＮＯ₂からなる群より選択される式（Ｉ）の化合物である。

本発明の好ましい観点は，式ＩＩの化合物に関する：

Ｒ₁およびＲ₉は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，アリールスルホニル，アルキルスルホニル，またはＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’，ＳＯ₂ＲおよびＣ（Ｏ）Ｒ’または生理学的条件下で加水分解可能な成分からなる群より選択されるプロドラッグ基であり；
Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＨＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’または（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され，ここで前記アルキル，アリールまたはヘテロアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，ヒドロキシ，カルボン酸，アミノまたはヘテロ脂環式でさらに置換されていてもよく；
Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈は，独立して，Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＲＲ’，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’，トリハロメチルまたは（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され；
ｎは０−３であり；
ｍは０−３であり；および
ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキル，ヘテロアリールまたはアリールであり，ここでアルキルまたはアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ”）₂，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ”，（ＣＨ₂）_nＯＲ”，（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ”，アルコキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アミノカルボニル，ヘテロ脂環式環，アリール，アルキル，アルコキシ，−ＣＺ_3,−ＯＣＺ₃，アリールオキシ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく；
Ｒ”は，Ｈ，アルキルまたはアリールであり；および
Ｚはハロゲンであり；
あるいは，ＮＲＲ’は，５−７員のヘテロ脂環式環，５−６員のヘテロアリール環を表してもよく，ここで，ヘテロ脂環式環はＮ，ＯまたはＳを含んでいてもよく，ＮＲＲ’のまわりに形成される環状構造は，アルキル，ハロアルキル，アルコキシ，ヒドロキシおよびハロからなる群より選択される成分で置換されていてもよい。

本明細書に記載される化合物は，例示のためのみであり，いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。

さらに，本明細書において示される式はまた，そのような化合物がキラル中心においてＲまたはＳコンフィギュレーションをとりうる立体異性を示すかもしれない。すなわち，本発明はまた，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび／またはＳＴＫ活性を調節する能力を有するすべての立体異性体，その対応するエナンチオマー（ｄ−およびｌ−または（＋）および（−）異性体）およびそのジアステレオマー，およびこれらの混合物を包含し，特定の１つの立体異性体に限定されない。

表１は，本発明の好ましい化合物の化学構造を示す。

第２の観点においては，本発明は，１またはそれ以上の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩，および薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物に関する。

生化学
本発明の別の観点は，ＰＫを本発明の化合物またはその生理学的に許容しうる塩と接触させることによりＰＫの触媒活性を調節する方法に関する。

本発明のさらに別の観点においては，本発明の化合物を用いるＰＫの触媒活性の調節はインビトロまたはインビボで行うことができる。

本発明のさらに別の観点においては，その触媒活性が本発明の化合物により調節される蛋白質キナーゼは，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ，細胞チロシンキナーゼおよびセリン−トレオニンキナーゼからなる群より選択される。

本発明の１つの観点においては，その触媒活性が本発明の化合物により調節されるレセプターチロシン蛋白質キナーゼは，Ｃ−Ｋｉｔ，Ｃ−ｆｍｓ，Ｆｌｋ−１Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，ＦＧＦＲ−１Ｒ，ＦＧＦＲ−２Ｒ，ＦＧＦＲ−３Ｒ，ＦＧＦＲ−４Ｒ，ＭＥＴ，ＤＤＲ−１およびＤＤＲ−２からなる群より都合よく選択される。

さらに，本発明の１つの観点においては，その触媒活性が本発明の化合物により調節される細胞チロシンキナーゼは，Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅｓ／Ｆｐｓ，Ｆａｋ，Ｊａｋ，Ａｃｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，ＦｇｒおよびＹｒｋからなる群より都合よく選択される。

本発明の別の観点においては，その触媒活性が本発明の化合物により調節されるセリン−トレオニン蛋白質キナーゼは，ＰＡＫ，ＺＣ，ＣＤＫ２，Ｒａｆ，ＮＥＫおよびＢＵＢ１からなる群より都合よく選択される。

本発明の別の観点は，治療上有効量の式１の化合物またはその塩を生物に投与することを含む，生物において蛋白質キナーゼ関連疾患を治療または予防する方法に関する。

本発明の１つの観点においては，上述の蛋白質キナーゼ関連疾患は，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ関連疾患，細胞チロシンキナーゼ疾患およびセリン−トレオニンキナーゼ関連疾患からなる群より選択される。

本発明のさらに別の観点においては，上述の蛋白質キナーゼ関連疾患は，Ｓｔｅ２０関連疾患，Ｍｅｔ関連疾患，ＰＤＧＦＲ関連疾患，ＩＧＦＲ関連疾患およびｆｌｋ関連疾患からなる群より選択される。

上述の蛋白質キナーゼ関連疾患には，限定ではなく例として，癌，例えば，肺癌，ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌），小細胞肺癌，骨癌，膵臓癌，皮膚癌，頭頚部の癌，皮膚または眼内黒色腫，子宮癌，卵巣癌，直腸癌，肛門領域の癌，胃癌，結腸癌，乳癌，婦人科腫瘍（例えば，子宮肉腫，ファローピウス管の癌腫，子宮内膜の癌腫，子宮頸部の癌腫，膣の癌腫または外陰部の癌腫），ホジキン病，食道の癌，小腸の癌，内分泌系の癌（例えば，甲状腺，上皮小体または副腎の癌），軟組織の肉腫，尿道の癌，陰茎の癌，前立腺癌，慢性または急性の白血病，小児固形癌，リンパ球性リンパ腫，膀胱の癌，腎臓または尿管の癌（例えば，腎臓細胞癌腫，腎盤の癌腫），小児悪性腫瘍，中枢神経系の新生物（例えば，原発性ＣＮＳリンパ腫，脊椎腫瘍，脳幹神経膠腫または下垂体腺腫），バレット食道（前悪性症候群），新生物皮膚疾病，乾癬，ポリープ状真菌症および良性前立腺肥大，糖尿病関連疾病，例えば，糖尿病性網膜症，網膜虚血および網膜新生血管形成，肝硬変，心臓血管疾病，例えば，アテローム性動脈硬化症，免疫学的疾病，例えば自己免疫疾病（例えば，ＡＩＤＳおよび狼瘡）および腎臓疾病が含まれる。特定の態様においては，疾患は，膵臓癌，乳癌，肺癌，喉頭癌，卵巣癌，子宮癌，皮膚癌，前立腺癌，腎臓癌，結腸癌および精巣癌である。原発性癌に加え，本発明の化合物は，転移の治療にも有用でありうる。

上述の蛋白質キナーゼ関連疾患が，糖尿病，過増殖性疾患，腎臓の過増殖性疾患，フォン・ヒッペル−リンダウ症候群，再狭窄，線維症，乾癬，変形性関節症，慢性関節リウマチ，炎症性疾患および新脈管形成からなる群より選択される疾患を含むことも，本発明の別の観点である。

本発明の１つの観点においては，本発明の化合物を投与することにより治療または予防する蛋白質キナーゼ関連疾患は，ＰＡＫまたはＺＣ関連疾患である。

蛋白質キナーゼ関連疾患を治療または予防する生物がヒトであることも本発明の別の観点である。

本発明の１つの観点においては，前記蛋白質キナーゼを発現する細胞を式１の化合物またはその塩と接触させ，次にその効果について前記細胞をモニターすることにより，蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する化学化合物を同定することができる。

本発明のさらに別の観点においては，上述の効果は，細胞表現型の変化または無変化，前記蛋白質キナーゼの触媒活性の変化または無変化，または前記蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの相互作用の変化または無変化から選択される。

本発明の１つの観点においては，上述した疾病および疾患の治療のために，本明細書に記載される化合物またはその塩を他の化学療法剤と組み合わせることができる。例えば，本発明の化合物または塩は，アルキル化剤，例えば，フルオロウラシル（５−ＦＵ）単独で，またはさらにロイコボリンと組み合わせて；または，他のアルキル化剤，例えば，限定されないが，他のピリミジン類似体，例えば，ＵＦＴ，カペシタビン，ゲムシタビンおよびシタラビン，アルキルスルホネート，例えばブルスファン（慢性顆粒球性白血病の治療に用いられる），イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン類，例えばベンゾデパ，カルボコン，メツレデパおよびウレデパ；エチレンイミン類およびメチルメラミン類，例えばアルトレタミン，トリエチレンメラミン，トリエチレンホスホルアミド，トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン，およびナイトロジェンマスタード類，例えばクロラムブシル（慢性リンパ性白血病，原発性マクログロブリン血症および非ホジキンリンパ腫の治療において用いられる），シクロホスファミド（ホジキン病，多発性骨髄腫，神経芽細胞腫，乳癌，卵巣癌，肺癌，ウイルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治療において用いられる），エストラムスチン，イフォスファミド，ノベムブリチン，プレドニムスチンおよびウラシルマスタード（原発性血小板増加症，非ホジキンリンパ腫，ホジキン病および卵巣癌用）；およびトリアジン類，例えばダカルバジン（軟組織肉腫用）と組み合わせることができる。

同様に，本発明の化合物または塩はまた，他の抗代謝化学療法剤，例えば，限定されないが，葉酸類似体（例えば，メトトレキセート（急性リンパ性白血病，絨毛癌腫，菌状息肉腫，乳癌，頭頸部癌および肺癌，骨形成性肉腫の治療に用いられる）およびプテロプテリン），プリン類似体，例えばメルカプトプリンおよびチオグアニン（急性顆粒球性白血病，急性リンパ性白血病および慢性顆粒球性白血病の治療に用いられる）と組み合わせて用いることができる。

本発明の化合物または塩はまた，抗腫瘍剤，例えば，限定されないが，カンプトサル（イリノテカンＨＣｌ；米国特許４，６０４，４６３）との組み合わせにおいて有効であることが予測される。

本発明の化合物または塩はまた，薬剤，例えば，限定されないが，アロマシン（エキソメスタン；米国特許４，８０８，６１６および４，９０４，６５０）との組み合わせにおいて有効であることが予測される。

さらに，本発明の化合物または塩は，天然産物化学療法剤，例えば，限定されないが，ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン（乳癌および精巣癌に用いられる），ビンクリスチン，ビンデシン），エピポドフィロトキシン類（例えばエトポシド，テニポシド（両方とも精巣癌およびカポジ肉腫の治療に用いられる）），抗生物質化学療法剤（例えばダウノルビシン，ドキソルビシン，エピルビシン，マイトマイシン（胃癌，子宮頸癌，結腸癌，乳癌，膀胱癌および膵臓癌に用いられる），ダクチノマイシン，テモゾロミド，プリカマイシン，ブレオマイシン（皮膚癌，食道癌および尿生殖器管癌に用いられる）および酵素的化学療法剤，例えばＬ−アスパラギナーゼと組み合わせて用いることができる。

上述に加えて，本発明の化合物または塩は，白金配位錯体（例えばシスプラチン），置換尿素（例えばヒドロキシウレア），メチルヒドラジン誘導体（例えばプロカルバジン），副腎皮質抑制剤（例えばミトーテン，アミノグルテチミド），ならびにホルモンおよびアンタゴニスト，例えばアドレノコルチコステロイド（例えばプレドニゾン），プロゲスチン（例えばヒドロキシプロゲステロンカプロネート），エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール），抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）およびアンドロゲン（例えばテストステロンプロピオネート），およびアロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール）と組み合わせて用いることができる。

最後に，本発明の化合物の組み合わせは，ミトザントロンまたはパクリタキセルとの組み合わせにおいて，固形腫瘍癌または白血病，例えば，限定されないが，急性骨髄性（非リンパ球）白血病の治療に特に有効であることが予測される。

上述の方法は，有糸分裂阻害剤，アルキル化剤，代謝拮抗物質，細胞サイクル阻害剤，酵素，トポイソメラーゼ阻害剤，生物学的応答調節剤，抗ホルモン剤，抗新脈管形成剤，例えばＭＭＰ−２，ＭＭＰ−９およびＣＯＸ−２阻害剤，および抗アンドロゲンからなる群より選択される化学療法剤との組み合わせにおいて実施することができる。

有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例としては，Ｖｉｏｘｘ（登録商標），ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（アレコキシブ），バルデコキシブ，パラコキシブ，ロフェコキシブ，およびＣｏｘ１８９が挙げられる。有用なマトリクスメタロプロテアーゼ阻害剤は，ＷＯ９６／３３１７２（１９９６年１０月２４日公開），ＷＯ９６／２７５８３（１９９６年３月７日公開），欧州特許出願９７３０４９７１．１（１９９７年７月８日出願），欧州特許出願９９３０８６１７．２（１９９９年１０月２９日出願），ＷＯ９８／０７６９７（１９９８年２月２６日公開），ＷＯ９８／０３５１６（１９９８年１月２９日公開），ＷＯ９８／３４９１８（１９９８年８月１３日公開），ＷＯ９８／３４９１５（１９９８年８月１３日公開），ＷＯ９８／３３７６８（１９９８年８月６日公開），ＷＯ９８／３０５６６（１９９８年７月１６日公開），欧州特許公開６０６，０４６（１９９４年７月１３日公開），欧州特許公開９３１，７８８（１９９９年７月２８日公開），ＷＯ９０／０５７１９（１９９０年５月３１日公開），ＷＯ９９／５２９１０（１９９９年１０月２１日公開），ＷＯ９９／５２８８９（１９９９年１０月２１日公開），ＷＯ９９／２９６６７（１９９９年６月１７日公開），ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１１３（１９９８年７月２１日出願），欧州特許出願９９３０２２３２．１（１９９９年３月２５日出願），英国特許出願９９１２９６１．１（１９９９年６月３日出願），米国特許仮出願６０／１４８，４６４（１９９９年８月１２日出願），米国特許５，８６３，９４９（１９９９年１月２６日発行），米国特許５，８６１，５１０（１９９９年１月１９日発行），および欧州特許公開７８０，３８６（１９９７年６月２５日公開）（これらはすべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。好ましいＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９阻害剤は，ＭＭＰ−１を阻害する活性をほとんどまたは全く有しないものである。より好ましいものは，他のマトリクス−メタロプロテアーゼ（すなわち，ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−３，ＭＭＰ４，ＭＭＰ−５，ＭＭＰ−６，ＭＭＰ−７，ＭＭＰ−８，ＭＭＰ−１０，ＭＭＰ−１１，ＭＭＰ−１２，およびＭＭＰ−１３）に対してＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するものである。

本発明において有用なＭＭＰ阻害剤のいくつかの特定の例は，ＡＧ−３３４０，ＲＯ３２−３５５５，ＲＳ１３−０８３０，および以下の一覧に記載される化合物である：３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロペンチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−オキソ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．ｌ］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；４−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロブチル）−アミノ］プロピオン酸；４−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；（Ｒ）３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［（４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−１−メチル−エチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（４−ヒドロキシカルバモイル−テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−アミノ］−プロピオン酸；３−オキソ−３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−エンド−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．ｌ］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；および（Ｒ）３−［４−（４−フルオロフェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−フラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；および前記化合物の薬学的に許容しうる塩および溶媒和物。

他の抗新脈管形成剤，例えば，他のＣＯＸ−ＩＩ阻害剤および他のＭＭＰ阻害剤もまた本発明において用いることができる。

式（Ｉ）の化合物はまた，シグナル伝達阻害剤，例えば，ＥＧＦＲ（表皮成長因子レセプター）応答を阻害することができる薬剤，例えば，ＥＧＦＲ抗体，ＥＧＦ抗体，およびＥＧＦＲ阻害剤である分子；ＶＥＧＦ（欠陥内皮細胞成長因子）阻害剤；およびｅｒｂＢ２レセプター阻害剤，例えばｅｒｂＢ２レセプターに結合する有機分子または抗体，例えば，ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）とともに用いることができる。ＥＧＦＲ阻害剤は，例えば，ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開），ＷＯ９８／１４４５１（１９９８年４月９日公開），ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開），および米国特許５，７４７，４９８（１９９８年５月５日発行）に記載されており，そのような物質を本明細書に記載されるように本発明において用いることができる。

ＥＧＦＲ阻害剤としては，限定されないが，モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ２２Ｍａｂ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ），化合物ＺＤ−１８３９（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ），ＢＩＢＸ−１３８２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ），ＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ），およびＯＬＸ−１０３（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ），ＶＲＣＴＣ−３１０（Ｖｅｎｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＥＧＦ融合トキシン（Ｓｅｒａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）が挙げられる。

これらのおよび他のＥＧＦＲ阻害剤を本発明において用いることができる。

ＶＥＧＦ阻害剤もまた，式（１）の化合物と組み合わせることができる。ＶＥＧＦ阻害剤は，例えば，ＷＯ９９／２４４４０（１９９９年５月２０日公開），ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７（１９９９年５月３日出願），ＷＯ９５／２１６１３（１９９５年８月１７日公開），ＷＯ９９／６１４２２（１９９９年１２月２日公開），米国特許５，８３４，５０４（１９９８年１１月１０日発行），ＷＯ０１／６０８１４，ＷＯ９８／５０３５６（１１月１２日公開１９９８年），米国特許５，８８３，１１３（１９９９年３月１６日発行），米国特許５，８８６，０２０（１９９９年３月２３日発行），米国特許５，７９２，７８３（１９９８年８月１１日発行），ＷＯ９９／１０３４９（１９９９年３月４日公開），ＷＯ９７／３２８５６（１９９７年９月１２日公開），ＷＯ９７／２２５９６（１９９７年６月２６日公開），ＷＯ９８／５４０９３（１９９８年１２月３日公開），ＷＯ９８／０２４３８（１９９８年１月２２日公開），ＷＯ９９／１６７５５（１９９９年４月８日公開），およびＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）（これらはすべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。本発明において有用ないくつかの特定のＶＥＧＦ阻害剤の他の例は，ＩＭ８６２（Ｃｙｔｒａｎ Ｉｎｃ．，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｗａｓｈ．，ＵＳＡ）；抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）；およびアンジオザイム，Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）およびＣｈｉｒｏｎ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）からの合成リボザイムである。これらのおよび他のＶＥＧＦ阻害剤は，本明細書に記載されるように，本発明において用いることができる。

さらに，ＥｒｂＢ２レセプター阻害剤，例えば，ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ ｐｌｃ），およびモノクローナル抗体ＡＲ−２０９（Ａｒｏｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡ）および２Ｂ−１（Ｃｈｉｒｏｎ）を，式（１）の化合物と組み合わせることができる。例えば，ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開），ＷＯ９９／３５１４６（１９９９年７月１５日公開），ＷＯ９９／３５１３２（１９９９年７月１５日公開），ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開），ＷＯ９７／１３７６０（１９９７年４月１７日公開），ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開），米国特許５，５８７，４５８（１９９６年１２月２４日発行），および米国特許５，８７７，３０５（１９９９年３月２日発行）（これらはすべてその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に示されているものが挙げられる。本発明において有用なＥｒｂＢ２レセプター阻害剤はまた，米国特許仮出願６０／１１７，３４１（１９９９年１月２７日出願），および米国特許仮出願６０／１１７，３４６（１９９９年１月２７日出願）（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。ｅｒｂＢ２レセプター阻害剤化合物および上述のＰＣＴ出願，米国特許，および米国特許仮出願に記載される物質，ならびにｅｒｂＢ２レセプターを阻害する他の化合物を，本発明にしたがって，式（Ｉ）の化合物とともに用いることができる。

式（Ｉ）の化合物はまた，癌の治療に有用な他の薬剤，例えば，限定されないが，抗腫瘍免疫応答を増強しうる薬剤，例えば，ＣＴＬＡ４（細胞毒性リンパ球抗原４）抗体，およびＣＴＬＡ４をブロックすることができる他の薬剤；および抗増殖剤，例えば他のファルネシル蛋白質トランスフェラーゼ阻害剤，例えば，米国特許６，２５８，８２４Ｂ１の"背景"の節に引用されている文献に記載されているファルネシル蛋白質トランスフェラーゼ阻害剤とともに用いることができる。本発明において用いることができる特定のＣＴＬＡ４抗体としては，米国特許仮出願６０／１１３，６４７（１９９８年１２月２３日出願）（その全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるものが挙げられるが，他のＣＴＬＡ４抗体も本発明において用いることができる。

上述の方法はまた，放射線療法と組み合わせて実施することができ，ここで，式（Ｉ）の化合物の量は，放射線療法と組み合わせて上述の疾病の治療に有効な量である。

放射線療法を施す手法は当該技術分野において知られており，これらの手法を本明細書に記載される組み合わせ療法において用いることができる。この組み合わせ療法における本発明の化合物の投与は，本明細書に記載されるように決定することができる。

本発明の別の観点は，異常なＭｅｔキナーゼ活性により媒介される疾病の治療において有用な医薬品の製造における，式（Ｉ）の化合物の使用に関する。

発明の詳細な説明
定義
ピリドピラゾールとは，次の構造：

を化学構造の一部として有する分子を表す。

インダゾールとは，次の構造：

を化学構造の一部として有する分子を表す。

ピロールとは，化学構造：

を有する分子を表す。

"薬学的に許容しうる塩"または"その薬学的に許容しうる塩"とは，遊離塩基の生物学的効力および特性を保持しており，無機または有機酸，例えば，塩酸，臭化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，サリチル酸，酢酸，ベンゼンスルホン酸（ベシレート），安息香酸，カンファースルホン酸，クエン酸，フマル酸，グルコン酸，グルタミン酸，イセチオン酸，乳酸，マレイン酸，リンゴ酸，マンデル酸，粘液酸，パモン酸，パントテン酸，コハク酸，酒石酸などとの反応により得られる塩を表す。

"医薬組成物"とは，本明細書に記載される化合物またはその生理学的に許容しうる塩の１またはそれ以上と，他の化学成分，例えば，生理学的に許容しうる担体および賦形剤との混合物を表す。医薬組成物の目的は，化合物の生物への投与を容易にすることである。

本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる担体"とは，生物に有意な刺激を引き起こさず，投与された化合物の生物学的活性および特性を排除しない担体または希釈剤を表す。

"賦形剤"とは，医薬組成物に添加して化合物の投与をさらに容易にする不活性物質を表す。賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖および各種のデンプン，セルロース誘導体（微結晶セルロースを含む），ゼラチン，植物油，ポリエチレングリコール，希釈剤，顆粒化剤，潤滑剤，結合剤，崩壊剤等が含まれる。

"アルキル"とは，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖基，分枝鎖または環状基を含む。好ましくは，アルキル基は，１−２０個の炭素原子を有する（本明細書において数値範囲，例えば"１−２０"と記載される場合，これはその基（この場合はアルキル基）が，１個の炭素原子，２個の炭素原子，３個の炭素原子，以下同様に，２０個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する）。より好ましくは，アルキルは１−１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキルである。最も好ましくは，アルキルは１−４個の炭素原子を有する低級アルキルである。アルキル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロゲン，−ヒドロキシ，−ＣＯＲ’，−ＣＯＯＲ’，ＯＣＯＲ’，−ＣＯＮＲＲ’，−ＲＮＣＯＲ’，−ＮＲＲ’，−ＣＮ，−ＮＯ₂，−ＣＺ₃，ＳＲ’，−ＳＯＲ’，−ＳＯ₂Ｒ’，−ＳＯ₂ＯＲ’，−ＳＯ₂ＮＲＲ’，チオカルボニル，−ＲＮＳＯ₂Ｒ’，パーフルオロアルキル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，シリル，アンモニウム，低級アルキル，低級アルケニル，低級アルキニル，シクロアルキル，複素環，ヘテロアリールおよびアリールから独立して選択される１またはそれ以上の基である。ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキル，またはアリールであり，ここで，アルキルまたはアリールは，ハロゲン，（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ”）₂，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ”，（ＣＨ₂）_nＯＲ”，（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ”，アルコキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アミノカルボニル，ヘテロ脂環式環，アリール，アルコキシ，−ＯＣＺ₃，アリールオキシ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよい。Ｒ”は，Ｈ，アルキルまたはアリールである。

"アルケニル"とは，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する脂肪族炭化水素を表し，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖基，分枝鎖または環状基を含む。好ましくは，アルケニル基は，２−２０個の炭素原子を有する（本明細書において数値範囲，例えば"２−２０"と記載される場合，これはその基（この場合はアルケニル基）が，２個の炭素原子，３個の炭素原子，以下同様に，２０個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する）。より好ましくは，アルケニルは２−１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルケニルである。最も好ましくは，アルケニルは２−６個の炭素原子を有する低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロゲン，−ヒドロキシ，−ＣＯＲ’，−ＣＯＯＲ’，ＯＣＯＲ’，−ＣＯＮＲＲ’，−ＲＮＣＯＲ’，ＮＲＲ’，−ＣＮ，−ＮＯ₂，−ＣＺ₃，−ＳＲ，−ＳＯＲ’，−ＳＯ₂Ｒ’，−ＳＯ₂ＯＲ’，−ＳＯ₂ＮＲＲ’，チオカルボニル，−ＲＮＳＯ₂Ｒ’，パーフルオロアルキル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，シリル，アンモニウム，低級アルキル，低級アルケニル，低級アルキニル，シクロアルキル，複素環，ヘテロアリールおよびアリールから独立して選択される１またはそれ以上の置換基である。ＲおよびＲ’は本明細書で定義されるとおりである。

"アルキニル"とは，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する脂肪族炭化水素を表し，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖基，分枝鎖または環状基を含む。好ましくは，アルキニル基は，２−２０個の炭素原子を有する（本明細書において数値範囲，例えば"２−２０"と記載される場合，これはその基（この場合はアルキニル基）が，２個の炭素原子，３個の炭素原子，以下同様に，２０個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する）。より好ましくは，これは２−１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキニルである。最も好ましくは，これは２−６個の炭素原子を有する低級アルキニルである。アルキニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロゲン，−ヒドロキシ，−ＣＯＲ’，−ＣＯＯＲ’，ＯＣＯＲ’，−ＣＯＮＲＲ’，−ＲＮＣＯＲ’，−ＮＲＲ’，−ＣＮ，ＮＯ₂，−ＣＺ₃，−ＳＲ’，−ＳＯＲ’，−ＳＯ₂Ｒ’，−ＳＯ₂ＯＲ’，−ＳＯ₂ＮＲＲ’，チオカルボニル，−ＲＮＳＯ₂Ｒ’，パーフルオロアルキル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，シリル，アンモニウム，低級アルキル，低級アルケニル，低級アルキニル，シクロアルキル，複素環，ヘテロアリールおよびアリールから独立して選択される１またはそれ以上の基である。ＲおよびＲ’は本明細書で定義されるとおりである。

"シクロアルキル"基とは，環の１またはそれ以上が完全に共役したπ電子系を有しない，全炭素単環または縮合多環（すなわち，隣接する炭素原子の対を共有する環）基を表す。シクロアルキル基の例としては，限定されないが，シクロプロパン，シクロブタン，シクロペンタン，シクロペンテン，シクロヘキサン，アダマンタン，シクロヘキサジエン，シクロヘプタンおよび，シクロヘプタトリエンが挙げられる。シクロアルキル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロゲン，−ヒドロキシ，−ＣＯＲ’，−ＣＯＯＲ’，ＯＣＯＲ’，−ＣＯＮＲＲ’，−ＲＮＣＯＲ’，−ＮＲＲ’，−ＣＮ，−ＮＯ₂，−ＣＺ₃，−ＳＲ’，−ＳＯＲ’，−ＳＯ₂Ｒ’，−ＳＯ₂ＯＲ’，−ＳＯ₂ＮＲＲ’，チオカルボニル，−ＲＮＳＯ₂Ｒ’，パーフルオロアルキル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，シリル，アンモニウム，低級アルキル，低級アルケニル，低級アルキニル，シクロアルキル，複素環，ヘテロアリールおよびアリールから独立して選択される１またはそれ以上の基である。ＲおよびＲ’は本明細書で定義されるとおりである。

"アリール"基とは，完全に共役したπ電子系を有する，全炭素単環または縮合多環（すなわち，隣接する炭素原子原子の対を共有する環）基を表す。アリール基の例としては，限定されないが，フェニル，ナフタレニルおよびアントラセニルが挙げられる。アリール基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロゲン，−ヒドロキシ，−ＣＯＲ’，−ＣＯＯＲ’，ＯＣＯＲ’，−ＣＯＮＲＲ’，−ＲＮＣＯＲ’，−ＮＲＲ’，−ＣＮ，−ＮＯ₂，−ＣＺ₃，−ＳＲ’，−ＳＯＲ’，−ＳＯ₂Ｒ’，−ＳＯ₂ＯＲ’，−ＳＯ₂ＮＲＲ’，チオカルボニル，−ＲＮＳＯ₂Ｒ’，パーフルオロアルキル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，シリル，アンモニウム，低級アルキル，低級アルケニル，低級アルキニル，シクロアルキル，複素環，ヘテロアリールおよびアリールから選択される１またはそれ以上の基である。ＲおよびＲ’は本明細書で定義されるとおりである。

本明細書において用いる場合，"ヘテロアリール"基とは，環中に窒素，酸素およびイオウからなる群より選択される１またはそれ以上の原子を有し，さらに，完全に共役したπ電子系を有する，単環または縮合環（すなわち，隣接する原子の対を共有する環）基を表す。ヘテロアリール基の例としては，限定されないが，ピロール，フラン，チオフェン，イミダゾール，オキサゾール，チアゾール，ピラゾール，ピリジン，ピリミジン，キノリン，イソキノリン，プリンおよびカルバゾールが挙げられる。ヘテロアリール基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロゲン，−ヒドロキシ，−ＣＯＲ’，−ＣＯＯＲ’，ＯＣＯＲ’，−ＣＯＮＲＲ’，−ＲＮＣＯＲ’，−ＮＲＲ’，−ＣＮ，−ＮＯ₂，−ＣＺ₃，ＳＲ’，−ＳＯＲ’，−ＳＯ₂Ｒ’，−ＳＯ₂ＯＲ’，−ＳＯ₂ＮＲＲ’，チオカルボニル，−ＲＮＳＯ₂Ｒ’，パーフルオロアルキル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，シリル，アンモニウム，低級アルキル，低級アルケニル，低級アルキニル，シクロアルキル，複素環，ヘテロアリールおよびアリール（Ｚはハロゲンである）から選択される１またはそれ以上の基である。ＲおよびＲ’は本明細書で定義されるとおりである。

”ヘテロ脂環式環”または“ヘテロ脂環”基とは，環中に窒素，酸素およびイオウからなる群より選択される１またはそれ以上の原子を有する単環または縮合環を表す。環はさらに１またはそれ以上の二重結合を有していてもよい。しかし，環は完全に共役したパイ電子系を有しない。ヘテロ脂環式環は置換されていても置換されていなくてもよい。ヘテロ脂環式環は，１またはそれ以上のオキソ基を含んでいてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ハロゲン，ヒドロキシ，−ＣＯＲ’，−ＣＯＯＲ’，ＯＣＯＲ’，−ＣＯＮＲＲ’，−ＲＮＣＯＲ’，−ＮＲＲ’，−ＣＮ，−ＮＯ₂，−ＣＺ₃，ＳＲ’，−ＳＯＲ’，−ＳＯ₂Ｒ’，−ＳＯ₂ＯＲ’，−ＳＯ₂ＮＲＲ’，チオカルボニル，−ＲＮＳＯ₂Ｒ’，パーフルオロアルキル，Ｏ−カルバミル，Ｎ−カルバミル，Ｏ−チオカルバミル，Ｎ−チオカルバミル，シリル，アンモニウム，低級アルキル，低級アルケニル，低級アルキニル，シクロアルキル，複素環，ヘテロアリールおよびアリールから選択される１またはそれ以上の基である。ＲおよびＲ’は本明細書で定義されるとおりである。

Ｚは，フッ素，塩素，臭素およびヨウ素からなる群より選択されるハロゲン基を表す。

"ヒドロキシ"基とは，−ＯＨ基を表す。

"アルコキシ"基とは，−Ｏ−アルキルおよび−Ｏ−シクロアルキル基（本明細書で定義されるとおりである）の両方を表す。

“アルコキシカルボニル”とは，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲを表す。

“アミノカルボニル”とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＲＲ’を表す。

“アリールオキシカルボニル”とは，−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アリールを表す。

"アリールオキシ"基とは，−Ｏ−アリールおよび−Ｏ−ヘテロアリール基（本明細書で定義されるとおりである）の両方を表す。

“アリールスルホニル”基とは，−Ｓ（Ｏ）ｎ−アリールを表し，ｎは０−２である。

“アルキルスルホニル”基とは，−Ｓ（Ｏ）ｎ−アルキルを表し，ｎは０−２である。

"ヘテロアリールオキシ"基とは，ヘテロアリール−Ｏ−基を表し，ヘテロアリールは本明細書で定義されるとおりである。

"ヘテロ脂環式オキシ"基とは，ヘテロ脂環式−Ｏ−基を表し，ヘテロ脂環式は本明細書で定義されるとおりである。

"カルボニル"基とは，−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒを表す。

"アルデヒド"基とは，Ｒが水素であるカルボニル基を表す。

"チオカルボニル"基とは，−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ基を表す。

"トリハロメタンカルボニル"基とは，Ｚ₃Ｃ−Ｃ（Ｏ）−基を表す。

"Ｃ−カルボキシル"基，とは，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ基を表す。

"Ｏ−カルボキシル"基とは，Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−基を表す。

"カルボン酸"基とは，Ｒが水素であるＣ−カルボキシル基を表す。

"ハロ"基とは，フッ素，塩素，臭素またはヨウ素を表す。

"トリハロメチル"基とは，−ＣＺ₃基を表す。

"トリハロメタンスルホニル"基とは，Ｚ₃ＣＳ（Ｏ）₂基を表す。

"トリハロメタンスルホンアミド"基とは，Ｚ₃ＣＳ（Ｏ）₂ＮＲ−基を表す。

"スルフィニル"基とは，−Ｓ（Ｏ）−Ｒ基を表す。

"スルホニル"基とは，−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ基を表す。

"Ｓ−スルホンアミド"基とは，−Ｓ（Ｏ）₂ＮＲＲ’基を表す。

"Ｎ−スルホンアミド"基とは，−ＮＲ−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ基を表す。

"Ｏ−カルバミル"基とは，−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ’基を表す。

"Ｎ−カルバミル"基とは，ＲＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ’基を表す。

"Ｏ−チオカルバミル"基とは，−ＯＣ（Ｓ）ＮＲＲ’基を表す。

"Ｎ−チオカルバミル"基とは，ＲＯＣ（Ｓ）ＮＲ’−基を表す。

"アミノ"基とは，−ＮＨ₂または−ＮＲＲ’基を表す。

"Ｃ−アミド"基とは，−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’基を表す。

"Ｎ−アミド"基とは，Ｒ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ−基を表す。

"ニトロ"基とは，−ＮＯ₂基を表す。

"シアノ"基とは，−Ｃ≡Ｎ基を表す。

"シリル"基とは，−Ｓｉ（Ｒ）₃基を表す。

"ホスホニル"基とは，Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）₂基を表す。

Ｒ₁−Ｒ₉，Ｒ，Ｒ’およびＲ”の定義は本明細書において定義される。

同じ分子式を有するが，その原子の結合の種類または順序またはその原子の空間の配置が異なる化合物は，"異性体"と称される。その原子の空間の配置が異なる異性体は，"立体異性体"と称される。互いに鏡像ではない立体異性体は，"ジアステレオマー"と称され，互いに重ね合わせられない鏡像であるものは"エナンチオマー"と称される。化合物が不斉中心を有する場合，例えば，これが４つの異なる基と結合している場合，１対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは，その不斉中心の絶対コンフィギュレーションにより特徴づけることができ，ＣａｈｎおよびＰｒｅｌｏｇのＲ−およびＳ−の順序規則により，または分子が偏光平面のまわりに回転して，右旋性または左旋性として（すなわち，それぞれ（＋）または（−）−異性体として）示されることにより記述される。キラル化合物は個々のエナンチオマーとして，またはそれらの混合物として存在しうる。同じ割合のエナンチオマーを含む混合物は"ラセミ混合物"と称される。

本発明の化合物は，１またはそれ以上の不斉中心を有するかもしれない。したがって，そのような化合物は，個々の（Ｒ）−または（Ｓ）−立体異性体として，またはそれらの混合物として製造することができる。例えば，式（Ｉ）の化合物のＲ⁶置換基が２−ヒドロキシエチルである場合，ヒドロキシ基が結合している炭素は不斉中心であり，したがって，式（Ｉ）の化合物は（Ｒ）−または（Ｓ）−立体異性体として存在しうる。特に記載しない限り，本明細書および特許請求の範囲における特定の化合物の記述または命名は，個々のエナンチオマーおよびその混合物（ラセミまたはそれ以外）の両方を含むことが意図される。立体異性体の立体化学の決定および分離の方法は当該技術分野においてよく知られている（"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，第４版，Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２の第４節の考察を参照）。

式（Ｉ）の化合物が，生物，例えばヒトの体内の酵素により代謝され，蛋白質キナーゼの活性を調節しうる代謝産物が生成されることが企図される。そのような代謝産物も本発明の範囲内である。

本明細書において用いる場合，"ＰＫ"とは，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レセプターまたは"細胞"チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）を表す。

"方法"とは，所与の作業を遂行するための様式，手段，技術，および手順を表し，限定されないが，化学，薬理学，生物学，生化学，および医学的技術の従業者には周知の，あるいは該従業者によって既知の様式，手段，技術，および手順から容易に開発される様式，手段，技術，および手順を含む。

本明細書において用いる場合，"調節"または"調節する"との用語は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が変化することを表す。特に，調節するとはＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が活性化されることを表し，好ましくは，ＲＴＫ，ＣＴＫまたはＳＴＫが暴露される化合物または塩の濃度に依存してＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が活性化または阻害され，またはより好ましくは，ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫの触媒活性が阻害されることを表す。

本明細書において用いる場合，"触媒活性"との用語は，ＲＴＫおよび／またはＣＴＫの直接的または間接的な影響下におけるチロシンのリン酸化の速度，またはＳＴＫの直接的または間接的な影響下におけるセリンおよびトレオニンのリン酸化の速度を表す。

本明細書において用いる場合，"接触させる"との用語は，本発明の化合物と標的ＰＫとを，当該化合物がＰＫの触媒活性を直接に，すなわちキナーゼ自体と相互作用することによるか，または間接に，すなわち当該キナーゼの触媒活性が依存している別の分子と相互作用することにより，影響することが可能な様式で一緒に合わせることを表す。このような"接触させる"ことは，インビトロで，すなわち試験管，ペトリ皿等において行うことができる。試験管内では，接触させることは，化合物と目的とするＰＫのみが関与してもよく，あるいは全細胞が関与してもよい。細胞は培養皿中で維持または成長させ，その環境において化合物と接触させることができる。この文脈においては，特定の化合物がＰＫ関連疾患に影響を及ぼす能力，すなわち当該化合物のＩＣ₅₀（以下に定義される）を，より複雑な生体を用いてのインビボでの使用を試みる前に測定することが可能である。生体の外の細胞については，ＰＫを当該化合物と接触させるための多様な方法が存在し，かつ当業者には周知であり，例えば，限定されないが，直接の細胞マイクロインジェクションおよび多数の貫膜担体技術を含む。

"インビトロ"とは，人工的環境，例えば，限定されないが，試験管または培養培地中で行われる手順を表す。当業者は，例えば，単離されたＰＫをインビトロ環境中で調節剤と接触させることができることを理解するであろう。あるいは，単離された細胞をインビトロ環境中で調節剤と接触させることができる。

本明細書において用いる場合，"インビボ"とは，生きている生物，例えば，限定されないが，マウス，ラット，ウサギ，有蹄動物，ウシ，ウマ，ブタ，イヌ，ネコ，霊長類，またはヒトの中で行われる手順を表す。

本明細書において用いる場合，"ＰＫ関連疾患"，"ＰＫ推進性疾患"，および"異常なＰＫ活性"とは，すべて不適切な，すなわち不完全な，あるいはより一般的には過剰な，ＰＫ触媒活性によって特徴づけられる状態を表し，ここで特定のＰＫはＲＴＫ，ＣＴＫ，またはＳＴＫでありうる。不適切な触媒活性は；（１）正常にはＰＫを発現しない細胞におけるＰＫの発現，（２）望ましくない細胞増殖，分化および／または成長に導くＰＫ発現の増加，または（３）細胞増殖，分化および／または成長の望ましくない減少に導くＰＫ発現の減少，のいずれかの結果として生じることができる。ＰＫの過剰な活性は，細胞増殖，分化および／または成長と相関しうる，特定のＰＫをコードしている遺伝子の増幅またはあるレベルのＰＫ活性の産生を表す（すなわち，ＰＫのレベルが増加すると，細胞性障害による１またはそれ以上の症状の激しさが増す）。低い活性は，もちろんその逆であり，ＰＫ活性のレベルが低下すると，細胞性障害による１またはそれ以上の症状の激しさが増加する。

本明細書において用いる場合，"予防する"，"予防すること"および"予防"との用語は，生物が最初の場所でＰＫ関連疾患を獲得することを遮る方法を表す。

本明細書において用いる場合，"治療する"，"治療すること"および"治療"との用語は，ＰＫにより媒介される細胞疾患および／またはそれに伴う症状を軽減または排除する方法を表す。特に癌に関しては，これらの用語は単に，癌に罹患した個体の予測生存率が増加するか，または疾病の１またはそれ以上の症状が軽減することを意味する。

"生物"との用語は，少なくとも１つの細胞からなる任意の生きているものを表す。生きている生物は，１つの真核生物細胞程度の単純なものであってもよく，ヒトを含む哺乳動物等の複雑なものであってもよい。特に好ましい観点においては，哺乳動物はヒトである。

本明細書において用いる場合，"治療上有効量"との用語は，治療される疾患の１またはそれ以上の症状をある程度緩和するであろう，投与される化合物の量を表す。癌の治療に関しては，治療上有効量は，（１）腫瘍の大きさを減少させる，（２）腫瘍の転移を阻害する（すなわち速度をある程度減じる，好ましくは停止する），（３）腫瘍の成長をある程度阻害する（すなわち速度をある程度減じる，好ましくは停止する），および／または（４）癌に関連した１またはそれ以上の症状をある程度緩和する（または，好ましくは除去する）という効果を有する量を表す。

"モニターする"とは，化合物を特定のＰＫを発現する細胞と接触させる影響を観察または検出することを意味する。観察されるまたは検出される影響は，細胞表現型の変化，ＰＫの触媒活性，またはＰＫと天然の結合パートナーとの相互作用の変化でありうる。そのような影響を観察または検出する手法は当該技術分野においてよく知られている。例えば，ＰＫの触媒活性は，標的分子のリン酸化の速度または量を決定することにより観察することができる。

"細胞表現型"とは，細胞もしくは組織の外観または細胞もしくは組織の生物学的機能を表す。細胞表現型の例は，限定されないが，細胞サイズ，細胞成長，細胞増殖，細胞分化，細胞生存，アポトーシス，および栄養の取り込みおよび利用である。そのような細胞表現型の特徴は，当該技術分野においてよく知られる手法により容易に測定することができる。

"天然の結合パートナー"とは，細胞内で特定のＰＫに結合するポリペプチドを表す。天然の結合パートナーは，ＰＫ媒介性シグナル伝達プロセスにおいてシグナルを伝播する役割を果たすことができる。天然の結合パートナーとＰＫとの相互作用の変化は，ＰＫ／天然の結合パートナー複合体の濃度の増加または減少として，およびその結果，ＰＫがシグナル伝達を媒介する能力の観察可能な変化として現れることができる。

本明細書において用いる場合，"投与する"または"投与"とは，本発明の化合物または塩，または本発明の化合物または塩を含む医薬組成物を，ＰＫ関連疾患の予防または治療の目的で生物にデリバリーすることを表す。

"医薬組成物"とは，本明細書に記載される１またはそれ以上の化合物またはその薬学的に許容しうる塩またはプロドラッグと，他の化学成分，例えば，薬学的に許容しうる賦形剤との混合物を表す。医薬組成物の目的は，化合物の生物への投与を容易にすることである。

"薬学的に許容しうる賦形剤"とは，医薬組成物に添加して化合物の投与をさらに容易にする不活性物質を表す。賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖および各種のデンプン，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。

"薬学的に許容しうる塩"とは，親化合物の生物学的効力および特性を保持している塩を表す。そのような塩には，以下のものが含まれる：（１）親化合物の遊離塩基を，例えば塩酸，臭化水素酸，硝酸，リン酸，硫酸，および過塩素酸等の無機酸と，または酢酸，シュウ酸，（Ｄ）または（Ｌ）リンゴ酸，マレイン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，サリチル酸，酒石酸，クエン酸，コハク酸またはマロン酸等の有機酸と，好ましくは，塩酸または（Ｌ）−リンゴ酸と反応させることにより得られる酸付加塩；または（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが，金属イオン，例えば，アルカリ金属イオン，アルカリ土類金属イオン，またはアルミニウムイオンで置き換えられるか，または有機塩基，例えばエタノールアミン，ジエタノールアミン，トリエタノールアミン，トロメタミン，Ｎ−メチルグルカミン等と配位することにより形成される塩。

式（Ｉ）の化合物はまたプロドラッグとしても作用することができる。"プロドラッグ"とは，インビボで親薬剤に変換される薬剤を表す。プロドラッグは，場合により，親薬剤より投与が容易であるかもしれないため，しばしば有用である。例えば，プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であるが，親薬剤はそうではない。プロドラッグはまた，親薬剤よりも医薬組成物中で改良された溶解性を有するかもしれない。プロドラッグの例は，限定されないが，エステル（"プロドラッグ"），カルバメートまたは尿素として投与される，本発明の化合物であろう。好ましいプロドラッグ基としては，限定されないが，Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’，ＳＯ₂ＲおよびＣ（Ｏ）Ｒ’，または生理学的条件下で加水分解可能な成分が含まれる。

適応症
その触媒活性が本発明の化合物により調節されるＰＫには，蛋白質チロシンキナーゼが含まれ，これには２つのタイプがある：レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）および細胞性チロシンキナーゼ（ＣＴＫ），およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）である。ＲＴＫに媒介されるシグナル伝達は，特定の成長因子（リガンド）との細胞外相互作用により開始され，次にレセプターが二量化し，固有の蛋白質チロシンキナーゼ活性が過渡的に刺激され，リン酸化する。このことにより，内部シグナル伝達分子用の結合部位が形成され，種々の細胞質シグナリング分子との複合体の形成につながり，これは，適切な細胞応答（例えば，細胞分裂，細胞外微小環境に及ぼす代謝的効果等）を促進する。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：３０３−３９１を参照。

成長因子レセプターのチロシンリン酸化部位がシグナリング分子のＳＨ２（ｓｒｃホモロジー）ドメインの高親和性結合部位として機能することが示されている（Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：４１３−４２３，Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２７７７−２７８５），Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ７２：７６７−７７８，およびＫｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：６６８−６７８）。ＲＴＫと会合するいくつかの細胞内基質蛋白質が同定されている。それらは二つの主要なグループに分けられる：（１）触媒ドメインを有する基質，および（２）そのようなドメインを欠くが，アダプターとして働き，触媒活性のある分子と会合する。Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８。レセプターとその基質のＳＨ２ドメインとの間の相互作用の特異性は，リン酸化されたチロシン残基を直接取囲んでいるアミノ酸残基によって決定される。ＳＨ２ドメインと，特定のレセプターのホスホチロシン残基を取り囲んでいるアミノ酸配列との間の結合親和性の差異は，それらの基質リン酸化のプロファイルに見られる差異と一致している。Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８。これらの知見は，各々のＲＴＫの機能が，その発現パターンならびにリガンド利用可能性によるのみならず，特定のレセプターによって活性化される下流の一連のシグナル伝達経路によっても決定されることを示唆している。したがって，リン酸化は特異的な成長因子レセプター，ならびに分化因子レセプターによってリクルートされる，シグナリング経路の選択性を決定する重要な段階を提供する。

ＳＴＫは，本来細胞質ゾル性であり，しばしばＰＴＫ事象についての下流方向の応答として，細胞内部の生化学に影響を及ぼす。ＳＴＫは，細胞増殖に導くＤＮＡ合成とそれに続く細胞分裂とを開始する，シグナリング過程に関与することが示唆されている。

したがって，ＰＫシグナル伝達は，種々の応答の中で特に，細胞増殖，分化，成長，および代謝をもたらす。異常な細胞増殖は，癌腫，肉腫，神経膠芽細胞腫，および血管腫等の新生物，白血病，乾癬，動脈硬化症，関節炎，および糖尿病性網膜炎，および制御されない新脈管形成および／または脈管形成に関連する他の疾患を含む，広い範囲の疾患および疾病という結果をもたらしうる。

本発明の化合物，特にインビボで本発明の化合物から生成する化合物がＰＫを阻害するメカニズムについての正確な理解は，本発明の実施のためには必要ではない。しかしながら，本発明においてはいかなる特定のメカニズムまたは理論にも束縛されるものではないが，化合物はＰＫの触媒領域のアミノ酸と相互作用すると考えられている。

別の観点においては，本発明は，治療上有効量の本発明の化合物またはその塩を生物に投与することによりＰＫ関連疾患を治療または予防する方法に関する。

ＰＫ関連疾患の治療または予防の目的で本発明の化合物またはその塩を含む医薬組成物を生物に投与することもまた本発明の１つの観点である。

したがって，本発明は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび／またはＳＴＫの酵素活性に影響を与え，このことによりそのような蛋白質により伝達されるシグナルを妨害することによりＰＫシグナル伝達を調節する化合物に関する。より詳細には，本発明は，多くの種類の固形腫瘍，例えば，限定されないが，癌腫，肉腫，例えばカポジ肉腫，赤芽球腫，神経膠芽細胞腫，髄膜腫，星状細胞腫，黒色腫および筋原細胞腫を治癒するための治療方法として，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび／またはＳＴＫに媒介されるシグナル伝達経路を調節する化合物に関する。非固形腫瘍癌，例えば白血病の治療又は予防もまた本発明により企図される。適応症には，限定されないが，脳癌，膀胱癌，卵巣癌，胃癌，膵臓癌，結腸癌，血液癌，肺癌および骨癌が含まれる。

本明細書に記載される化合物がその予防，治療および研究に有用であろう，不適切なＰＫ活性に関連する疾患のタイプのさらなる例には，限定されないが，細胞増殖性疾患，繊維性疾患，代謝性疾患および感染性疾病が含まれる。

本発明により予防，治療またはさらに研究することができる細胞増殖性疾患には，癌，血管増殖性疾患およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。

血管増殖性疾患とは，異常な脈管形成（血管の形成）および新脈管形成（血管の拡散）に関連する疾患を表す。脈管形成および新脈管形成は胚発生，黄体形成，創傷治癒，および臓器再生等の種々の正常な生理学的過程において重要な役割を果たすが，それらはまた腫瘍を生かしておくために必要な新しい毛細血管をそれらが形成させる癌の発生においても中枢的な役割を演じる。血管増殖疾患の他の例は，新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎，および糖尿病性網膜炎のように，網膜内の新しい毛細血管が硝子体に侵入し，出血させ，さらに失明を引起す眼性疾患を含む。

正常な脈管形成および新脈管形成は，種々の生理学的プロセス，例えば，胚発生，創傷治癒，臓器再生等の種々の生理学的過程，および排卵期の黄体における濾胞形成と妊娠後の胎盤の成長等の女性の生殖過程において重要な役割を果たしている（Ｆｏｌｋｍａｎ＆Ｓｈｉｎｇ，１９９２，Ｊ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ．，２６７（１６）：１０９３１−１０９３４）。制御されない脈管形成および／または新脈管形成は，糖尿病等の疾病ならびに成長が血管形成に依存する悪性固形腫瘍に関連づけられてきた（Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ＆Ｓｏｋｅｒ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３（１０）：６９９−７０２；Ｆｏｌｋｈａｍ，１９９１，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２：４−６；Ｗｅｉｄｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２４：１−５）。

逆に，再狭窄などの，血管の収縮，狭窄，または閉鎖に関連した疾患にも関与することが示唆されており，本発明の方法により治療または予防することができる。

繊維性疾患とは，細胞外マトリックスの異常な形成を表す。繊維性疾患の例には，肝硬変およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。肝硬変は，肝臓瘢痕の形成を引き起こす細胞外マトリックスの組成の増加を特徴とする。肝臓瘢痕を引き起こす細胞外マトリックスの増加はまた，肝炎ウイルス等のウイルス感染に起因する。脂肪細胞は，肝硬変において主要な役割を果たすようである。示唆されている他の繊維性疾患には，アテローム性動脈硬化症が含まれる。

メサンギウム細胞増殖疾患とは，メサンギウム細胞の異常な増殖により引き起こされる疾患を表す。メサンギウム増殖疾患には，種々のヒト腎臓疾病，例えば，糸球体腎炎，糖尿病性ネフロパシー，悪性腎硬化症，ならびに血栓性細小血管症候群，移植拒絶，および糸球体症が含まれる。ＲＴＫ ＰＤＧＦ−Ｒは，メサンギウム細胞増殖の維持に関与することが示唆されている（Ｆｌｏｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４３：４７Ｓ−５４Ｓ）。

ＳＴＫは，特に乳癌を含む多くの型の癌に関与することが示唆されている（Ｃａｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４：５７１−７７（１９９３））。

異常なＰＫ活性と疾病との関連性は，癌に限られない。例えば，ＲＴＫは，疾病，例えば，乾癬，糖尿病，子宮内膜症，新脈管形成，じゅく状斑の発達，アルツハイマー疾病，フォン・ヒッペル−リンダウ症候群，表皮過増殖および神経変性性疾病，加齢性黄斑変性および血管腫と関連づけられている。例えば，ＥＧＦＲは，角膜および皮膚の創傷治癒における関与が示唆されている。タイプＩＩ糖尿病においてインスリン−ＲおよびＩＧＦ−１Ｒの欠陥が示されている。特定のＲＴＫとその治療適応症との間のより完全な相関はＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＤＮ＆Ｐ７：３３４−３３９に記載されている。

先に記載されているように，ＲＴＫのみならず，ＣＴＫ，例えば，限定されないが，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｐｓ，ｙｅｓ，ｆｙｎ，ｌｙｎ，ｌｃｋ，ｂｌｋ，ｈｃｋ，ｆｇｒおよびｙｒｋ（Ｂｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，６：３４０３−３４０９により概説）もまた，増殖および代謝性シグナル伝達経路に関与しており，したがって，本発明にかかる多くのＰＴＫ媒介性疾患に関与することが予測され，このことが実際に示されている。例えば，変異したｓｒｃ（ｖ−ｓｒｃ）は，トリにおいて発癌蛋白質（ｐｐ６０^v-src）であることが示されている。さらに，その細胞性ホモログであるプロトオンコジンｐｐ６０^c-srcは，多くのレセプターの発癌シグナルを伝達する。腫瘍におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は，悪性細胞に特徴的であるが正常細胞では見られないｐｐ６０^c-srcの構成的活性化につながる。一方，ｃ−ｓｒｃの発現に欠陥を有するマウスは大理石骨病的表現型を示し，このことは，ｃ−ｓｒｃが破骨細胞機能において鍵となるよう関与していること，および関連する疾患に関与している可能性を示唆する。

ＳＴＫは，炎症，自己免疫疾患，免疫応答，および過増殖疾患，例えば再狭窄，繊維症，乾癬，変形性関節症および慢性関節リウマチと関連づけられている。

ＰＫはまた，胚着床における関与も示唆されている。すなわち，本発明の化合物は，そのような胚着床を防止する有効な方法を提供することができ，したがって，産児調節剤として有用であろう。

最後に，現在，ＲＴＫおよびＣＴＫの両方とも過剰免疫疾患に関与していることが疑われている。

上で議論される蛋白質キナーゼの１またはそれ以上の触媒活性を調節する化学化合物を同定する方法は本発明の別の観点である。該方法は，所望の蛋白質キナーゼを発現する細胞を本発明の化合物（またはその塩）と接触させ，化合物が及ぼす影響について細胞をモニターすることを含む。影響は，裸眼または装置を使用して観察可能な細胞表現型の変化または無変化でありうる。モニターされる細胞表現型の変化または無変化は，例えば，限定されないが，細胞内における蛋白質キナーゼの触媒活性の変化または無変化，または蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの相互作用の変化または無変化でありうる。

医薬組成物および使用
本発明の化合物またはその生理学的に許容しうる塩は，そのままでヒト患者に，または，上述の物質が適当な担体または賦形剤と混合されている医薬組成物中で投与することができる。薬剤の処方および投与の手法は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，"Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．，の最新版に見いだすことができる。

投与経路
適当な投与経路には，限定されないが，経口，直腸内，経粘膜，または腸内投与，または筋肉内，皮膚上，非経口，皮下，経皮，骨髄内，鞘内，直接心室内，静脈内，硝子体内，腹腔内，鼻腔内，筋肉内，硬膜内，呼吸器内，鼻吸入または眼内注射が含まれる。好ましい投与経路は経口および非経口である。

あるいは，化合物は，全身的方法ではなく局所に，例えば化合物を固形癌内に直接，しばしばデポ剤または持続放出処方中で注射することにより投与してもよい。

さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。

組成／処方
本発明の医薬組成物は，当該技術分野においてよく知られる方法，例えば，慣用の混合，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，凍結乾燥法またはスプレー乾燥により製造することができる。

本発明の方法において用いるための医薬組成物は，薬学の任意の方法を用いて製造することができるが，すべての方法は，活性成分を１またはそれ以上の必要な成分を構成する担体と組み合わせる工程を含む。特に，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性化合物を薬剤として使用することができる製剤に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法で処方することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。

投与形態には，錠剤，トローチ，分散剤，懸濁液，溶液，カプセル，パッチ，シロップ，エリキシル，ゲル，粉体，マグマ剤，菱形剤，軟膏，クリーム，ペースト，膏剤，ローション，ディスク，坐剤，鼻腔または経口スプレイ，エアロゾル等が含まれる。

注射用には，本発明の化合物を水性溶液，好ましくは生理学的に適合性の緩衝液中で処方することができ，このような緩衝液は低濃度の界面活性剤または共溶媒を含んでいても含まなくてもよく，あるいは生理学的食塩水緩衝液中で処方することができる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。

経口投与のためには，活性化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより化合物を処方することができる。そのような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤，丸薬，トローチ剤，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として処方することを可能とする。経口で使用するための医薬製剤は，固体賦形剤を用いて，得られた混合物を任意にすりつぶし，所望の場合には適当な助剤を加えた後に，顆粒の混合物を加工して，錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適当な賦形剤には，特に，ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸等の崩壊剤を加えてもよい。その塩，例えばアルギン酸ナトリウムを用いてもよい。

糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のためには，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加してもよい。

経口で使用することができる医薬組成物は，ゼラチンから作成されるプッシュフィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよびステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン，液体ポリエチレングリコールクレモフォア，カプマル，中鎖または長鎖モノ−，ジ−またはトリ−グリセリド等の適当な液体中に溶解または懸濁することができる。これらの処方にはさらに安定剤を添加してもよい。

吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，加圧されたパックまたはネブライザーおよび適当な噴射剤，例えば，限定されないが，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，または二酸化炭素を用いて，エアーゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブにより調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するためのゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトースまたはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。

化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性または水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることができ，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の製剤物質を含んでいてもよい。

非経口投与用の医薬組成物は，活性化合物の水溶性の形態，例えば，限定さないが，塩の水性溶液を含む。さらに，活性化合物の懸濁液は，親油性ベヒクル中に製造することができる。適切な親油性ベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等の物質を含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいてもよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤および／または薬剤を含んでいてもよい。

あるいは，活性成分は粉体の形態であって，適当なベヒクル，例えば滅菌された発熱物質を含まない滅菌水を用いて，使用前に構成することができる。

化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。

上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によるか，または筋肉内注射により投与することができる。本発明の化合物は，この投与経路用に，適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば許容される油剤中の乳濁液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体として，処方することができる。

本発明の疎水性化合物のための薬学的担体の非限定的例は，ベンジルアルコール，非極性界面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系，例えばＶＰＤ共溶媒系である。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコール，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０（登録商標），および６５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液中に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，それ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，そのような共溶媒系の比率は，その溶解性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，共溶媒成分の種類も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面活性剤をポリソルベート８０（登録商標）の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖または多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。

あるいは，疎水性の医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソームおよび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。

さらに，化合物は，持続放出系，例えば治療用薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用いて輸送することができる。種々の持続放出材料が確立されており，当業者にはよく知られている。持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１００日を越える期間，化合物を放出する。治療用薬剤の化学的性質および生物学的安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。

本明細書に記載される医薬組成物は，適当な固体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖，デンプン，セルロース誘導体，ゼラチン，およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。

本発明のＰＫ調節化合物の多くは，本発明の化合物が負にまたは正に荷電した種を形成する，生理学的に許容しうる塩として提供することができる。化合物が正に荷電した成分を形成する塩の例には，限定されないが，四級アンモニウム（本明細書において定義される），四級アンモニウム基の窒素原子を適切な酸と反応させた本発明の選択された化合物の窒素である塩，例えば，塩酸，硫酸，炭酸，乳酸，酒石酸，マレイン酸，コハク酸の塩が含まれる。本発明の化合物が負に荷電した種を形成している塩には，限定されないが，化合物中のカルボン酸基を適当な塩基（例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ），水酸化カリウム（ＫＯＨ），水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）₂）等）と反応させることにより形成されるナトリウム，カリウム，カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。

投与量
本発明において使用するのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図される目的，例えば，ＰＫ活性の調節またはＰＫ関連疾患の治療または予防を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。

より詳細には，治療上有効量とは，疾病の症状を予防，緩和または改善するのに，または治療している被験者の生存を長くするのに有効な化合物の量を意味する。

治療上有効量の決定は，特に本明細書において提供される詳細な開示に鑑みて，十分に当業者の能力の範囲内である。

本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な量または用量は，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。次に，動物モデルにおいて，培養細胞において決定されたＩＣ₅₀（すなわちＰＫ活性の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するような用量を処方することができる。次にそのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。

本明細書に記載される化合物の毒性および治療有効性は，培養細胞または実験動物における標準的な薬理学的方法により，例えば対象化合物についてＩＣ₅₀およびＬＤ₅₀（いずれも本明細書において議論される）を決定することにより，決定することができる。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究から得られるデータは，ヒトにおいて用いるためのある範囲の投与量を処方するために用いることができる。投与量は，用いる投与形態および用いる投与経路により様々でありうる。正確な処方，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮して選択することができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。

投与量および間隔は，個々に，活性成分がキナーゼ調節効果を維持するのに十分な血漿レベルを与えるよう調節することができる。このような血漿レベルは最小有効濃度（ＭＥＣ）と称される。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例えば，本明細書に記載されるアッセイを用いて，キナーゼの５０−９０％の阻害を達成するのに必要な濃度から見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は，個々の特性および投与経路に依存するであろう。ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて血漿濃度を決定することができる。

投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。現在のところ，式（Ｉ）の化合物の治療上有効量は，１日あたり約２５ｍｇ／ｍ²から１５０ｍｇ／ｍ²の範囲内である。さらに好ましくは，２５ｍｇ／ｍ²から１０００ｍｇ／ｍ²の範囲内である。

局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度とは関係ないであろう。当該技術分野において知られる他の方法を用いて，正確な投与量および間隔を決定することができる。

投与される組成物の量は，もちろん，治療中の患者，苦痛の激しさ，投与方法，および担当医師の判断等に依存するであろう。

包装
組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置，例えばＦＤＡに認可されたキット中で提供することができる。パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されていてもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，使用，または販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添付されていてもよく，その注意書はヒトまたは獣医学的投与用の化合物の形状の当該機関による承認を反映するものである。そのような注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学的担体中に処方された，本発明の化合物を含む組成物もまた製造され，適当な容器内に配置され，さらに指示された状態の治療のためにラベルを付すことができる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。

化合物の合成
本発明の化合物は，化学の技術分野においてよく知られる手法を用いて容易に合成することができる。当業者には，本発明の化合物を形成するためには他の合成経路が利用可能であり，以下の記載は例示としてのみ提供され，限定ではないことが理解されるであろう。

以下の本発明の代表的化合物の合成は，例示としてのみ示されるものであり，合成方法に関しても，またはその合成が例示される化合物に関しても，本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

当業者には，有機合成の既知の一般的原理および本明細書の開示に基づいて，特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または精神から離れることなく，以下の合成に対して適当な変更および改変を加えることができることが明らかであろう。

ＨＰＬＣデータは，Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍＩＤｘ７．５ｃｍ）を用いて，１０％アセトニトリル／水，０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）から９０％アセトニトリル／水（溶媒Ｂ）まで流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで運転するようプログラムしたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒシリーズ２００ポンプで得た。溶媒Ａで０．１分後，溶媒Ｂへの５分間の直線プログラムを走らせ，次に溶媒Ｂで３分間，次に再び溶媒Ａ（２分間）。検出は，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒダイオードアレイ検出器を用い，２１５および２８０ｎｍで記録した。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ装置を用いて３００ＭＨｚで記録した。

一般的合成方法
以下の一般的方法論を用いて本発明の化合物を製造することができる。

上に示される経路において，塩化アルミニウム，塩化スズ（ＩＶ）またはトリフルオロスルホン酸の存在下で，ピロール環のアシル化により中間体ジアリールケトンＡまたはＢが形成される（工程ａ）。反応は一般に０℃−１００℃で，溶媒としてベンゼンまたはジクロロメタン中で行う。工程ｂにおいては，０℃におけるアシル化またはスルホン化により，アシル化またはスルホン化された中間体Ｃが得られる。ＡまたはＣを，メタノール，エタノール，またはトルエン中で，２０℃−１５０℃の温度でヒドラジンまたは置換ヒドラジンで環付加反応を行うと（工程ｃ），３−ピロリル−ピリドピラゾールおよび３−ピロリル−インダゾールＤが得られる。

実施例１
３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

塩化２−クロロニコチノイル（３．４ｇ，２０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を，０℃でジクロロメタン（１００ｍＬ）中の塩化アルミニウム（２．７ｇ，２０ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の溶液に加え，次にジクロロメタン（２０ｍＬ）中の２，４−ジメチルピロール（２．９ｇ，３０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。次に，混合物を室温で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をａシリカゲルカラムで精製して，２．９ｇ（６２％）の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノンを得た。

エタノール（２ｍＬ）中の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（２４０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（０．７ｍＬ）の混合物を１００−１１０℃で一晩加熱した。反応液を濃縮し，シリカゲルカラムで精製して，９７ｍｇ（４６％）の標題化合物を淡黄色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．４７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．６７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５０（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄｄ，１Ｈ），５．７３（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ₃），２．２０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ２１３［Ｍ⁺＋１］

実施例２
３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の塩化２−クロロニコチノイル（１当量）の溶液を，ジクロロメタン（８ｍＬ）中のピロール（１．５当量）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）および塩化アルミニウム（３．５ｇ，１当量）の混合物に０℃でゆっくり加えた。混合物を０℃で１０分間，および室温で３０分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，２．２７ｇの（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノンを得た。

エタノール（１５ｍＬ）中の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（１ｇ，４．８ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）の混合物を一晩加熱還流した。反応液を濃縮し，残渣をジクロロメタン中で破砕して未反応出発物質を除去した。固体を濾過し，水で洗浄し，乾燥して，７２０ｍｇ（８１％）の標題化合物を淡黄色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．４５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．４５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｄｄ，１Ｈ），８．５０（ｄｄ，１Ｈ），７．２１（ｄｄ，１Ｈ），６．８７（ｍ，１Ｈ），６．７７（ｍ，１Ｈ），６．１８（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ１８５［Ｍ⁺＋１］

実施例３
３−（５−モルホリン−４−イルメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ベンジルクロロギ酸（１５０ｍｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を，ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン（１２０ｍｇ）（実施例２より）およびトリエチルアミン（３滴）の混合物に加えた。室温で１時間撹拌した後，反応液を濃縮し，シリカゲルカラムで精製して，３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−１−カルボン酸ベンジルエステルを得た。次にこれをジ−モルホリンメタン（３００ｍｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ），ＴＨＦ（２ｍＬ），水（０．２ｍＬ）および酢酸（２滴）と混合した。混合物を９０℃で２０時間加熱した。反応液を濃縮し，シリカゲルカラムで精製して，３０ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．４４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．２４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５０（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｍ，１Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），３．５４（ｍ，４Ｈ），３．４８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂），２．３７（ｍ，４Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２８２［Ｍ−１］

実施例４
３−（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（２１０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（２００ｍｇ）の混合物を室温で一晩撹拌した。さらにＮＢＳ（５８ｍｇ）を加え，反応が完了するまでさらに５時間撹拌を続けた。反応液を濃縮し，残渣をシリカゲルカラムで精製して，３７０ｍｇの（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−（２−クロロ−フェニル）−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．６５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５４（ｄｄ，１Ｈ），８．０１（ｄｄ，Ｊ＝２＆８Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），６．６３（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２８３［Ｍ−１］
エタノール（７ｍＬ）中の（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−（２−クロロ−フェニル）−メタノン（２５０ｍｇ）およびヒドラジン水和物（６滴）の混合物を９０−１００℃で一晩加熱した。反応液を濃縮し，残渣を水で洗浄し，エタノールから再結晶して，７８ｍｇの標題化合物を灰白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．８０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５３（ｓ，１Ｈ），８．５１（ｍ，１Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２６１［Ｍ−１］

実施例５
３−（３−フェニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

塩化アルミニウム（１．３３ｇ，１０ｍｍｏｌ）を，ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の３−フェニル−１Ｈ−ピロール（１．３５ｇ，９．４ｍｍｏｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２：２６５０（１９９７）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるようにして製造）および塩化２−クロロニコチノイル（１．６５ｇ，９．４ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で加えた。混合物を０℃で３０分間，および室温で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブライン，２ＮＮａＯＨ，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，０．６８２ｇ（２６％）の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（３−フェニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ９．７５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．１４（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｄｄ，Ｊ＝２＆８Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．０４（ｍ，５Ｈ），６．８１（ｍ，１Ｈ），６．３６（ｔ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２８３［Ｍ⁺＋１］

エタノール（６ｍＬ）中の上述からの（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（３−フェニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（１５０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）の混合物を９０℃で２４時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣をＤＣＭ中で破砕し，濾過して，７７ｍｇ（５６％）の標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．３８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．４１（ｄｄ，１Ｈ），７．２７（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｍ，３Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），６．９４（ｔ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．３７（ｔ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２６１［Ｍ⁺＋１］

実施例６
３−［４−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

塩化アルミニウム（１．４ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）を，ＤＣＭ（５５ｍＬ）中の３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール（２ｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６２：２６５０（１９９７）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるようにして製造）および塩化２−クロロニコチノイル（１．８ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で加えた。混合物を０℃で３０分間，および室温で１．５時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブライン，２ＮＮａＯＨ，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，１６８ｍｇの（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−［４−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ １２．６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５３（ｄｄ，Ｊ＝２＆５Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄｄ，Ｊ＝２＆８Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄｄ，１Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．３１（ｄｄ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３５１［Ｍ⁺＋１］

エタノール（７ｍＬ）中の，上述からの（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−［４−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メタノン（１５０ｍｇ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）の混合物を９０−１００℃で一晩加熱した。反応液を濃縮し，残渣を水で洗浄し，乾燥し，酢酸エチル−ヘキサンの混合物中で破砕して，７１ｍｇの標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．５５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．７５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｄｄ，１Ｈ），８．４９（ｄｄ，１Ｈ），７．５３（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｄｄ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３２９［Ｍ⁺＋１］

実施例７
３−［３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

塩化アルミニウム（１．４ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）を，ＤＣＭ（５５ｍＬ）中の３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール（２ｇ，ＪＯＣ，６２，１９９７，２６５０にしたがって製造）および塩化２−クロロニコチノイル（１．８ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で加えた。混合物を０℃で３０分間，および室温で１．５時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブライン，２ＮＮａＯＨ，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，１６０ｍｇの（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−［３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２０（ｄｄ，１Ｈ），７．６０（ｄｄ，Ｊ＝２＆８Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｔ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），７．１３（ｄｄ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，１Ｈ），６．２０（ｔ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３５１［Ｍ⁺＋１］

エタノール（８ｍＬ）中の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−［３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メタノン（１６０ｍｇ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）の混合物を９０−１００℃で２４時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣をシリカゲルカラムで精製して，３０ｍｇの標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．５４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．５５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３９（ｄｄ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄｄ，１Ｈ），７．２９（ｄｄ，１Ｈ），６．９８（ｔ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，１Ｈ），６．１５（ｔ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３２９［Ｍ⁺＋１］

実施例８
（２，６−ジフルオロ−フェニル）−［５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−イル］−メタノン

塩化アルミニウム（６５０ｍｇ，４．９ｍｍｏｌ）を，ジクロロエタン（１５ｍＬ）中の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（６００ｍｇ，３ｍｍｏｌ）（実施例２より）および塩化２−クロロニコチノイル（１．２ｇ，６．８ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。混合物を９０−１００℃で２時間加熱した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブライン，１ＮＮａＯＨ（１０ｍＬ）で洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，３４０ｍｇの（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−［４−（２，６−ジフルオロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メタノンを得た。

エタノール（４ｍＬ）中の（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−［４−（２，６−ジフルオロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−メタノン（２００ｍｇ）およびヒドラジン水和物（８滴）の混合物を９０−１００℃で３０時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣をシリカゲルカラムで精製して，７３ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｍ，２Ｈ），７．５９（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｔ，１Ｈ），７．２２−７．２４（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３２５［Ｍ⁺＋１］

実施例９
６−クロロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

塩化オキサリル（２Ｍ溶液，２０ｍＬ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を，ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の２，６−ジクロロニコチン酸（６．２ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．５ｍＬ）の混合物に室温で加えた。室温で２時間撹拌した後，反応液を濃縮して，塩化２，６−ジクロロ−ニコチノイルを得た（直接次の工程で用いた）。

ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の塩化スズ（ＩＶ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を，ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中のピロール（４ｇ）および塩化２，６−ジクロロ−ニコチノイル（６ｇ）の混合物に０℃で滴加した。次に混合物を室温で３０分間撹拌した。反応液を水で希釈し，水（２００ｍＬ），２ＮＮａＯＨ（５０ｍＬ）およびブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，１．８ｇの（２，６−ジクロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノンおよび３８０ｍｇの（２，６−ジクロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−３−イル）−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．２９（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０６（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｍ，１Ｈ），６．６２（ｍ，１Ｈ），６．２５（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２３９［Ｍ−１］

エタノール（７０ｍＬ）中の（２，６−ジクロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（１．８ｇ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）の混合物を９０℃で２０時間加熱した。反応液を４０ｍＬに濃縮し，水（５ｍＬ）で希釈し，冷却した。沈殿物を回収し，乾燥して，０．８４ｇの標題化合物を得た。
ＭＳｍ／ｚ２１９［Ｍ⁺＋１］

実施例１０
６−クロロ−３−（１Ｈ−ピロール−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の塩化チタン（ＩＶ）を，ＤＣＭ（１５０ｍＬ）中のピロール（４ｇ）および塩化２，６−ジクロロ−ニコチノイル（６ｇ）の混合物に０℃で滴加した。次に混合物を室温で３０分間撹拌した。反応液を水で希釈し，水（２００ｍＬ），２ＮＮａＯＨ（５０ｍＬ）およびブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，１．８ｇの（２，６−ジクロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノンおよび３８０ｍｇの（２，６−ジクロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−３−イル）−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１１．７４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｍ，１Ｈ），６．９２（ｍ，１Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２３９［Ｍ−１］

エタノール（１０ｍＬ）中の（２，６−ジクロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−３−イル）−メタノン（３００ｍｇ）およびヒドラジン水和物（０．２ｍＬ）の混合物を９０℃で２０時間加熱した。反応液を６ｍＬに濃縮し，水（２ｍＬ）で希釈し，冷却した。沈殿物を回収し，乾燥して，１６０ｍｇの標題化合物を得た。
ＭＳｍ／ｚ２１９［Ｍ⁺＋１］

実施例１１
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル

エタノール（３．２ｍＬ，５４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（５４ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を，テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１５ｍＬ）中のピロール−３−カルボン酸（５００ｍｇ，４．５ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１１ｇ，５．４ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の混合物に加えた。６０℃で１０時間加熱した後，反応液を冷却した。沈殿物を濾別し，酢酸エチルで洗浄し，合わせた濾液を濃縮し，シリカゲルカラムで精製して，５００ｍｇ（８１％）の１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステルを無色油状物として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１１．４０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．３７（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｓ，１Ｈ），６．３８（ｓ，１Ｈ），４．１３（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．２２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）
Ｍｓｍ／ｚ１３８［Ｍ−１］

ベンゼン（１ｍＬ）中の塩化２−クロロニコチノイル（４９３ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）の溶液をベンゼン（３ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（３９０ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）の混合物に加え，次に塩化スズ（ＩＶ）（０．５ｍＬ）を滴加した。混合物を室温で窒素下で一晩撹拌した。反応液を２ＮＨＣｌで処理し，酢酸エチルで抽出した。合わせた酢酸エチルを洗浄し，乾燥し，濃縮して，３９０ｍｇ（５０％）の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステルを白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．９２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５７（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｍ，１Ｈ），６．７８（ｓ，１Ｈ），４．１６（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．２１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２７９［Ｍ⁺＋１］

エタノール（５０ｍＬ）中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（１．２ｇ，４．３２ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（６．２７ｍＬ）の混合物を８０℃で２４時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣を１ＮＨＣｌでｐＨ７に中和し，酢酸エチルで抽出した。合わせた酢酸エチルを乾燥し，濃縮し，シリカゲルカラムで精製して，標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ １３．７０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．１６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），４．２（ｑ，２Ｈ），１．２８（ｔ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２５７［Ｍ⁺＋１］

実施例１２
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸

５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（２００ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）（実施例１１より）および１０％ＮａＯＨ（１０ｍＬ）の混合物を室温で１時間，４０℃で２時間および室温で一晩撹拌した。反応液を濃ＨＣｌでｐＨ６−７に調節した。沈殿物を真空濾過により回収し，水で洗浄し，乾燥して，１４０ｍｇ（７９％）の標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．１６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．８４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），８．５２（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｍ，１Ｈ），７．２３（ｍ，１Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２２７［Ｍ⁺＋１］

実施例１３
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド

トリエチルアミン（０．０７３ｍＬ）を，アセトニトリル（１ｍＬ）およびＤＭＦ（１ｍＬ）中の５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１００ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）（実施例１２より）および４−（２−アミノエチル）モルホリン（６２．８ｍｇ，１．１当量）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の混合物に加えた。混合物を氷浴中で冷却し，これにジエチルシアノホスホネート（８６ｍｇ，１．２当量）を加えた。混合物をゆっくり室温まで暖め，一晩撹拌した。反応液をＤＣＭで希釈し，ＮａＨＣＯ₃および水で洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．５９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．８２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５４（ｍ，１Ｈ），８．４７（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．３５（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｍ，１Ｈ），７．１９（ｓ，１Ｈ），３．５６（ｍ，４Ｈ），２．８７（ｓ，２Ｈ），２．７１（ｓ，２Ｈ），２．４１（ｍ，４Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３４１［Ｍ⁺＋１］

実施例１４
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸アミド

アセトニトリル（６ｍＬ）中の５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（８０ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）（実施例１１より）およびフルオロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（９２．７ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の混合物に，０℃でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５４．２８ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温まで暖め，１時間撹拌した。次に混合物を氷浴で冷却し，アンモニアガスを充填した。室温で一晩撹拌した後，反応液を濃縮し，水で希釈し，ＤＣＭで抽出した。有機層を濃縮し，ＤＣＭ中で破砕して，標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．５８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．８０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｍ，１Ｈ），８．４８（ｄ，１Ｈ），７．３６（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），２．８６（ｓ，２Ｈ，ＮＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ２２８［Ｍ⁺＋１］

実施例１５
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸ベンジルアミド

ＤＭＦ（１ｍＬ）中の５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（５０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）（実施例１１より），ｐ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）（７４ｍｇ，２．５当量），１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸（ＥＤＡＣＨＣｌ）（１０５ｍｇ，２．５当量），ベンジルアミン（９４ｍｇ，４当量）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．５ｍＬ）の混合物を４０℃で一晩加熱した。反応液を濃縮し，残渣をシリカゲルカラムで精製して，４０ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ８．４−８．５５（ｍ，３Ｈ），７．３９（ｍ，１Ｈ），７．２−７．３（ｍ，６Ｈ），４．４３（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）

実施例１６
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸イソブチル−アミド

５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１００ｍｇ，０．４４ｍｍｏｌ）（実施例１１より）および塩化チオニル（２Ｍ，ＤＣＭ中，５ｍＬ）の混合物を２時間加熱還流した。反応液を濃縮し，次に残渣をＤＣＭ中のイソブチルアミン（過剰）とともに室温で２時間撹拌した。反応液をＤＣＭで希釈し，水で洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．５７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｍ，１Ｈ），８．４８（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｍ，１Ｈ），７．３５（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），３．０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂），１．７８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），０．８７（Ｊ＝６Ｈｚ，６Ｈ，２ｘＣＨ₃）

実施例１７
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド

クロロスルホン酸（６．６ｍＬ，１００ｍＬ）を，（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（実施例２より，２．０６ｇ，１０ｍｍｏｌ）に０℃で滴加した。０℃で２４時間撹拌した後，反応液を氷水にゆっくり注加した。沈殿物を真空濾過により回収し，水で洗浄し，乾燥して，２．９ｇ（９５％）の塩化５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホニルを白色固体として得た。

ＤＣＭ（５ｍＬ）中の塩化５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホニル（５００ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）の溶液に，４−（２−アミノエチル）モルホリン（４２７ｍｇ，３．２８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．５ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌した。反応液をＤＣＭで抽出し，合わせたＤＣＭを水およびブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，４５０ｍｇ（６９％）の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミドを白色固体として得た。

エタノール（５ｍＬ）中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド（１００ｍｇ）およびヒドラジン水和物（過剰）の混合物を８０℃で４８時間加熱した。反応液を濃縮し，水で希釈し，１ＮＨＣｌで酸性にしてｐＨ２とし，ＤＣＭで抽出した。水層をＮａＨＣＯ₃でｐＨ７に調節し，沈殿物を真空濾過により回収し，水で洗浄して，標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｍ，１Ｈ），８．４８（ｄ，１Ｈ），７．３２（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），３．４８（ｍ，４Ｈ），２．９（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｍ，４Ｈ）

実施例１８
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸ベンジルアミド

ＤＣＭ（５ｍＬ）中の塩化５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホニル（５００ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）（実施例１７より），ベンジルアミン（３５１．５ｍｇ，３．２８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１ｍＬ）の混合物を室温で４時間撹拌した。反応液をＤＣＭで希釈し，水で洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸ベンジルアミドを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．９８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６（ｍ，１Ｈ），８．１５（ｍ，１Ｈ），７．８（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），７．６５（ｓ，１Ｈ），７．６（ｍ，１Ｈ），７．２２（ｍ，５Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂）

エタノール（１０ｍＬ）中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸ベンジルアミド（１００ｍｇ），ヒドラジン水和物（過剰）の混合物を８０℃で４８時間加熱した。反応液を濃縮し，水と混合し，沈殿物を濾別し，濾液を希ＨＣｌ，水で洗浄し，乾燥し，濃縮して，標題化合物を淡黄色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｍ，１Ｈ），８．４６（ｄ，１Ｈ），７．６２（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），７．２５（ｍ，７Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂）

実施例１９
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸カルバモイルメチル−アミド

５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１００ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）（実施例１１より）および塩化チオニル（０．２Ｍ，ＤＣＭ中，１０ｍＬ）の混合物を２時間加熱還流した。反応液を濃縮し，残渣をＤＣＭに溶解し，これにグリシンアミド塩酸（２４２ｍｇ，２．１９ｍｍｏｌ）を，次にＴＥＡを加えた。次に混合物をＴＬＣにより反応が完了するまで室温で撹拌した。反応液を水で希釈し，ＤＣＭで抽出した。合わせたＤＣＭを濃縮し，シリカゲルカラムで精製して，標題化合物を得た。
ＭＳｍ／ｚ２８４［Ｍ⁺＋１］

実施例２０
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸フェネチル−アミド

ＤＭＦ（１ｍＬ）中の５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（５０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）（実施例１１より），ＨＯＢｔ（７４ｍｇ，２．５当量），ＥＤＡＣ（１０５ｍｇ，２．５当量），フェネチルアミン（１０６ｍｇ，４当量）およびＴＥＡ（０．５ｍＬ）の混合物を４０℃で一晩加熱した。反応液を濃縮し，シリカゲルカラムで精製して，標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．８１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｍ，１Ｈ），８．４６（ｍ，１Ｈ），７．９８（ｍ，１Ｈ），７．８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．１８−７．３４（ｍ，７Ｈ），３．４（ｍ，２Ｈ），３．０（ｍ，２Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３３２［Ｍ⁺＋１］

実施例２１
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸フェニルアミド

塩化チオニル（０．２Ｍ，ＤＣＭ中，１０ｍＬ）を，５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（１００ｍｇ）（実施例１１より）に加え，混合物を４時間加熱還流した。反応液を濃縮し，ＤＣＭで希釈し，アニリン（過剰），ＤＭＡＰ（触媒量）およびトリエチルアミンと混合した。室温で一晩撹拌した後，反応を水でクエンチし，ＤＣＭで抽出し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．０２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．６（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｍ，２Ｈ），７．７７（ｄ，２Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．３（ｍ，３Ｈ），７．０４（ｔ，１Ｈ，ＮＨ）

実施例２２
５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール

塩化アルミニウム（２．６ｇ，２０ｍｍｏｌ）を，ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の塩化２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル（５ｇ，２０ｍｍｏｌ）およびピロール（４ｇ，３０ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で加えた。混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブライン，水，ＮａＨＣＯ₃で洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，１．５ｇ（３０％）の（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノンを得た。

トルエン（２０ｍＬ）およびＤＭＦ（３ｍＬ）中の（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（６００ｍｇ）およびヒドラジン水和物（０．５ｍＬ）の混合物を１２０℃で２時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣を水で洗浄し，再結晶して，０．４２ｇ（７７％）の標題化合物を橙色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．５７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．８９（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ），８．２０（ｄｄ，Ｊ＝２＆９Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｍ，１Ｈ），６．８１（ｍ，１Ｈ），６．２２（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２２７［Ｍ−１］

実施例２３
３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルアミン

５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（３７ｍｇ）（実施例２２より）を，エタノール（５ｍＬ）中５％Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を用いて２時間水素化した。反応液を濾過し，濾液を濃縮して，２０ｍｇの標題化合物を得た。
ＭＳｍ／ｚ１９９［Ｍ⁺＋１］

実施例２４
Ｎ−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−イソニコチンアミド

２，２−ジメチル−プロピオン酸５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−イルエステル（３７０ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）（実施例２８より）を，エタノール（３５ｍＬ）中１０％Ｐｄ／Ｃを用いて室温で２時間水素化した。反応液を濾過し，濾液を濃縮して，２，２−ジメチル−プロピオン酸５−アミノ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−イルエステルを得た。

２，２−ジメチル−プロピオン酸５−アミノ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−イルエステル（０．３８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ中で０℃で塩化イソニコチノイル（０．４ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびトリエチルアミンとカップリングさせて，１２０ｍｇの標題化合物を淡黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３０４［Ｍ⁺＋１］

実施例２５
３−クロロ−Ｎ−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−ベンズアミド

２，２−ジメチル−プロピオン酸５−アミノ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−イルエステル（０．３８ｍｍｏｌ）（実施例２８より）をＤＣＭ中で０℃で塩化３−クロロ−ベンゾイル（０．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミンとカップリングさせて，４１ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３３７［Ｍ⁺＋１］

実施例２６
４−メトキシ−Ｎ−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−ベンズアミド

２，２−ジメチル−プロピオン酸５−アミノ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−イルエステル（０．３８ｍｍｏｌ）（実施例２５より）をＤＣＭ中で０℃で塩化４−メトキシ−ベンゾイル（０．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミンとカップリングさせて，１３０ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３３３［Ｍ⁺＋１］

実施例２７
１−メチル−５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール

トルエン（２ｍＬ）および１−メチル−２−ピロリジノン（１ｍＬ）中の（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（１１０ｍｇ）（実施例２２より）およびメチルヒドラジン（３滴）の混合物を１００−１２０℃で２時間加熱した。反応液を濃縮し，酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し，ブラインで洗浄し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，１４５ｍｇの標題化合物を黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ２４１［Ｍ−１］

実施例２８
５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル

酢酸エチル−ＤＣＭ中の５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール（４００ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ），ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（０．５ｇ）およびトリエチルアミン（０．２ｍＬ）の混合物を室温で一晩撹拌した。反応液をブラインで洗浄し，濃縮し，酢酸エチル−ヘキサン中で破砕して，４５０ｍｇの２，２−ジメチル−プロピオン酸５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−イルエステルを黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３２７［Ｍ−１］

実施例２９
３−（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール

ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（６００ｍｇ，２．４ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびＮＢＳ（５０４ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）の混合物を室温で一晩撹拌した。反応液を濃縮し，酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し，１ＮＮａＯＨ，ブラインで洗浄し，濃縮した。残渣を再結晶して，３１０ｍｇ（３９％）の（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．７０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３５（ｍ，２Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｍ，１Ｈ），６．７４（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３２９［Ｍ−１］

トルエン（６ｍＬ）および１−メチル−２−ピロリジノン（１．５ｍＬ）中の（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−メタノン（４００ｍｇ）およびヒドラジン水和物（０．４ｍＬ）の混合物を１１０℃で１時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣をＤＣＭ中１０％酢酸エチル中で破砕して，２１０ｍｇの標題化合物を橙色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．９２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．９２（ｄ，１Ｈ），８．２１（ｄｄ，Ｊ＝２＆９Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３０７［Ｍ−１］

実施例３０
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸

ベンゼン（１０ｍＬ）中の塩化スズ（ＩＶ）（３．７２ｇ，５ｍｍｏｌ）の溶液を，乾燥ベンゼン（１２ｍＬ）中の塩化２−クロロニコチノイル（２．０２ｇ，１１ｍｍｏｌ）および１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステル（０．７３ｇ；以下に説明するようにして製造）の混合物に０℃で滴加した。反応液をゆっくり室温まで暖まらせ，４時間撹拌した。反応液を濃縮し，残渣を酢酸エチルに溶解し，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮して，１．５３ｇの５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステルを褐色固体として得た。

１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステルは以下のようにして製造した：ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（１０ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の溶液に，塩化オキサリル（１０ｍｍｏｌ）および３滴のＤＭＦを０℃で加えた。溶液を０℃でで３０分間撹拌して，塩化１Ｈ−ピロール−２−カルボニルを形成した。エタノールを加え，混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を濃縮して，１−カルボン酸エチルエステルを得た。

エタノール中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステル（０．５ｇ）およびヒドラジン水和物（０．７ｇ）の混合物を８０℃で２４時間加熱した。得られた沈殿物を真空濾過により回収し，水で洗浄し，乾燥して，８０ｍｇの標題化合物を得た。
ＭＳｍ／ｚ２２７［Ｍ−１］

実施例３１
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステル

エタノール中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステル（０．５ｇ）（実施例３０より）およびヒドラジン水和物（０．７ｇ）の混合物を８０℃で２４時間加熱した。沈殿物を濾別し，濾液を濃縮して，１５６ｍｇの標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．１０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｓ，１Ｈ），８．４８（ｄ，１Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），６．８（ｓ，１Ｈ），４．２２（ｑ，２Ｈ），１．２８（ｔ，３Ｈ）

実施例３２
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルアミド

１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（１ｇ，９ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）のＤＣＭ（１５ｍＬ）中の溶液に，塩化オキサリル（１．１ｍＬ）およびＤＭＦ（３滴）を加えた。混合物を室温で撹拌して，塩化１Ｈ−ピロール−２−カルボニルを得た。次にメチルアミン（３０ｍｍｏｌ）を酸塩化物に加え，混合物を室温で撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブライン（２ｘ），ＮａＨＣＯ₃で洗浄し，乾燥し，濃縮して，１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルアミドを得た。

ベンゼン（１５ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルアミド（４３０ｍｇ，３．５ｍｍｏｌ）および塩化２−クロロニコチノイル（０．６ｇ，３．４ｍｍｏｌ）の混合物に，０℃でベンゼン（５ｍＬ）中の塩化スズ（ＩＶ）（１．６ｇ）の溶液を滴加した。混合物を室温までゆっくり暖め，４時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，水，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮して，３２０ｍｇ（３５％）の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルアミドを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．４２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．７６（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），７．９８（ｄ，１Ｈ），７．５２（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｓ，１Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），２．７６（ｄ，３Ｈ，ＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ２６２［Ｍ−１］

エタノール（２０ｍＬ）中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルアミド（３２０ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（２ｍＬ）の混合物を８０℃で４８時間加熱した。沈殿物を真空濾過により回収し，エタノールおよび水で洗浄し，乾燥して，８０ｍｇ（２７％）の標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．５１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５４（ｄ，１Ｈ），８．４９（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），７．２３（ｍ，１Ｈ），６．８１（ｍ，２Ｈ），２．７６（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２４０［Ｍ−１］

実施例３３
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の塩化１Ｈ−ピロール−２−カルボニル（１．３ｇ，１０ｍｍｏｌ）（実施例３０より）の溶液に，３−フルオロアニリン（１．２ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５ｍＬ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応液をＮａＯＨ，水，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮して，７５０ｍｇ（３７％）の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミドを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ９．５０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．５８（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），７．０２（ｓ，１Ｈ），６．８２（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），６．７２（ｓ，１Ｈ），６．３２（ｓ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２０３［Ｍ−１］

ベンゼン（１５ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（１．５６ｇ，７．６ｍｍｏｌ）および塩化２−クロロニコチノイル（１．９２５ｇ，１０．９ｍｍｏｌ）の溶液に，０℃で乾燥ベンゼン（５ｍＬ）中の塩化スズ（ＩＶ）（３．５ｇ）の溶液を滴加した。混合物を室温までゆっくり暖まらせ，４時間撹拌した。反応液にＮａＯＨ（１００ｍＬ）を加え，酢酸エチルで抽出し，ブライン（２ｘ）で洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，４７７ｍｇ（１８％）の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミドを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．７８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．３６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５８（ｍ，１Ｈ），８．０６（ｄ，１Ｈ），７．７２（ｄ，１Ｈ），７．５８（ｍ，１Ｈ），７．４６（ｄｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，１Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９２（ｄｔ，１Ｈ），６．６５（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３４２［Ｍ−１］

エタノール（３０ｍＬ）中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（４７７ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（２ｍＬ）の混合物を８０℃で２４時間加熱した。沈殿物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，２００ｍｇ（４５％）の標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１３．８３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．９８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．１４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｄ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），７．３６（ｍ，１Ｈ），７．２７（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），６．９１（ｍ，２Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３２２［Ｍ−１］

実施例３４
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（（Ｓ）−１−フェニル−エチル）−アミド

ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の塩化１Ｈ−ピロール−２−カルボニル（１．３ｇ，１０ｍｍｏｌ）（実施例３０より）の溶液に，（Ｓ）−１−フェニル−エチルアミン（１．４ｇ，１１．５５ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を，次にトリエチルアミン（１．５ｍＬ）を加えた。反応液を室温で一晩撹拌した。反応液を１ＮＮａＯＨ，水，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮して，８６７ｍｇ（４０％）の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（（Ｓ）−１−フェニル−エチル）−アミドを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ９．３２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．３６（ｍ，５Ｈ），６．９（ｓ，１Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），６．２２（ｍ，１Ｈ），６．０２（ｂｒｄ，１Ｈ，ＮＨ），５．２８（ｍ，１Ｈ），１．５８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ２１３［Ｍ−１］

乾燥ベンゼン（１０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（（Ｓ）−１−フェニル−エチル）−アミド（８００ｍｇ，３．７ｍｍｏｌ）および塩化２−クロロニコチノイル（９５ｍｇ，５．４ｍｍｏｌ）の溶液に，０℃でベンゼン（５ｍＬ）中の塩化スズ（ＩＶ）（１．７５ｇ）の溶液を滴加した。混合物をゆっくり室温まで暖め，一晩撹拌した。反応液を濃縮し，酢酸エチルで希釈し，水，１ＮＮａＯＨ，ブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，４５８ｍｇ（３５％）の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（（Ｓ）−１−フェニル−エチル）−アミドを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１０．３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６４（ｍ，１Ｈ），８．５４（ｍ，１Ｈ），７．７８（ｄｄ，１Ｈ），７．４４（ｍ１Ｈ），７．３６（ｍ，５Ｈ），６．５５（ｍ，１Ｈ），６．２（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），５．３２（ｍ，１Ｈ），１．６２（ｄ，３Ｈ，ＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ３５２［Ｍ−１］

エタノール（２０ｍＬ）中の５−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（（Ｓ）−１−フェニル−エチル）−アミド（４５０ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（２ｍＬ）の混合物を８０℃で２４時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣を水中で破砕した。沈殿物を真空濾過により回収し，水およびＤＣＭで洗浄して，８０ｍｇ（１９％）の標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．７６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｍ，３Ｈ），７．３３（ｍ，４Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｍ，２Ｈ），５．０５（ｍ，１Ｈ），１．４７（ｄ，３Ｈ，ＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ３３０［Ｍ−１］

実施例３５
４−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル

乾燥ベンゼン（１０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（２ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）（１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸から実施例３０と同じ方法を用いてから合成）および塩化２−クロロニコチノイル（４．４ｍｇ，２５ｍｍｏｌ）の混合物に，０℃で乾燥ベンゼン（５ｍＬ）中の塩化スズ（ＩＶ）（０．７ｇ）の溶液を滴加した。混合物を室温までゆっくり暖まらせ，一晩撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し，ブラインで洗浄し，濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製して，４０２ｍｇ（１０％）の４−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステルを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．８５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．４７（ｄｄ，１Ｈ），７．８３（ｄｄ，１Ｈ），７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），７．３８（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．０６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２７７［Ｍ−１］

エタノール（１０ｍＬ）中の４−（２−クロロ−ピリジン−３−カルボニル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（１７０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）およびヒドラジン水和物（０．８ｇ）の混合物を８０℃で２４時間加熱した。反応液を濃縮し，残渣を再結晶して，２５ｍｇ（１６％）の標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．３６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．４２（ｄ，１Ｈ），７．８８８（ｄ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．１（ｍ，２Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），４．０（ｑ，２Ｈ），０．９４（ｔ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２５５［Ｍ−１］

実施例３６
６−モルホリン−４−イル−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

エタノール（１ｍＬ）中の６−クロロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４，ｂ］−ピリジン（実施例９）（１００ｍｇ）の溶液にモルホリン（１ｍＬ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を加えた。混合物を１２時間還流した。濃縮した後，残渣をＤＣＭで抽出し，水，ブラインで洗浄し，乾燥し，シリカカラムで精製して，標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．７５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．２５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．１５（ｄ，１Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ），６．７７（ｄ，１Ｈ），６．６２（ｓ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），３．７１（ｍ，４Ｈ），３．５４（ｍ，４Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２６８［Ｍ−１］

実施例３７
６−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

６−クロロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４，ｂ］−ピリジン（実施例９）およびＮ−メチルピペラジン，実施例３６と同じ方法を用いた。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１０．６８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．３７（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０３（ｄ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ），６．６５（ｄ，１Ｈ），６．３３（ｓ，１Ｈ），３．７２（ｍ，４Ｈ），２．５５（ｍ，４Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ₃）

実施例３８
５−（６−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸ベンジルアミド

塩化５−（６−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ−［３，４，ｂ］−ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホニルおよびベンジルアミンから実施例１８の方法を用いてカップリングして得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．９３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），７．６５（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．３５（ｄ，２Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．０（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３８６［Ｍ−１］

実施例３９
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−メトキシ−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８，５６（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄ，１Ｈ），７．５５（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．２７（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｄ，２Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），６．８２（ｄ，２Ｈ），３．９６（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂），３．６５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ３８２［Ｍ−１］

実施例４０
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸２，４−ジクロロ−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄ，１Ｈ），７．７８（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．５０（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｍ，１Ｈ），７．３（ｍ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，１Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），４．０６（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）

実施例４１
５−［５−（２，６−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
白色固体
ＭＳｍ／ｚ５１１［Ｍ＋１］

実施例４２
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−クロロ−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．７０（ｂｒｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．３２（ｍ，４Ｈ），７．３０（ｄ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，１Ｈ），６．９６（ｄ，１Ｈ），４．０２（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３８８［Ｍ−１］

実施例４３
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（ビフェニル−４−イルメチル）−アミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５４（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄ，１Ｈ），７．７（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．５８（ｄ，４Ｈ），７．３８（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２５（ｄｄ，１Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），４．０８（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ４２８［Ｍ−１］

実施例４４
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸２，６−ジフルオロ−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
ＭＳｍ／ｚ３８８［Ｍ−１］

実施例４５
ベンジル−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル］−アミン

この化合物は，実施例３６に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ９．３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９６（ｄ，１Ｈ），７．３５（ｍ，５Ｈ），６．９（ｓ，１Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．３２（ｍ，２Ｈ），５．１（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．６３（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ２８８［Ｍ−１］

実施例４６
３−（４−ニトロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，実施例２に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．８８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．７８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６５（ｄ，１Ｈ），８．５７（ｍ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２２８［Ｍ−１］

実施例４７
５−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

ＭＳｍ／ｚ３８６［Ｍ−１］
５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（２５０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）（５−（２−クロロ−５−ニトロベンジル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸から実施例３２に記載される方法を適用した方法を用いて製造），ヒドラジン水和物（０．３ｍＬ），トルエン（５ｍＬ）および１−メチル−ピロリン−２−オン（０．４ｍＬ）の混合物を１２０℃で１．５時間加熱した。反応液を濃縮し，水と混合し，濾過した。固体を洗浄して，２００ｍｇの標題化合物を黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３６４［Ｍ−１］

実施例４８
５−（１−メチル−５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（２５０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）（実施例４７），メチルヒドラジン（４滴），トルエン（０．６ｍＬ）および１−メチル−ピロリン−２−オン（０．２ｍＬ）の混合物を１２０℃で２時間加熱した。反応液を濃縮し，ＤＣＭおよびヘキサン中で破砕して，５５ｍｇの標題化合物を黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３７８［Ｍ−１］

実施例４９
４−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

４−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（１５０ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）（実施例４７），ヒドラジン水和物（０．２ｍＬ），トルエン（５ｍＬ）および１−メチル−ピロリン−２−オン（０．３ｍＬ）の混合物を１２０℃で１．５時間加熱した。反応液を濃縮し，水と混合し，濾過した。固体を洗浄して，１２５ｍｇの標題化合物を黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３６４［Ｍ−１］

実施例５０
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸３−クロロ−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５４（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄ，１Ｈ），７．７２（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．１２（ｍ，６Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３８６［Ｍ−１］

実施例５１
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸［１−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−アミド

この化合物は，実施例２に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ），７．７４（ｄ，１Ｈ），７．２（ｍ，６Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），４．４（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｄ，３Ｈ，ＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ４０２［Ｍ＋１］

実施例５２
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−トリフルオロメチル−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｍ，１Ｈ），８．４６（ｄ，１Ｈ），７．８（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．６４（ｄ，２Ｈ），７．５２（ｄ，２Ｈ），７．３２（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ４２０［Ｍ−１］

実施例５３
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸ヒドラジド

この化合物は，実施例３０に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．５５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５２（ｓ，１Ｈ），７．２３（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），６．８（ｓ，１Ｈ），４．３８（ｂｒｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ２４１［Ｍ−１］

実施例５４
５−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

ベンゼン（１０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（９３０ｍｇ，４．６ｍｍｏｌ）（実施例４７）および塩化２，４−ジフルオロ−ベンゾイル（１．３ｇ，７．４ｍｍｏｌ）の混合物に，室温で，塩化スズ（ＩＶ）（１．５ｍＬ）の溶液を加えた。室温で一晩撹拌し，通常の後処理を行った後，残渣をシリカゲルカラムで精製して，１８０ｍｇの５−（２，４−ジフルオロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミドを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．６２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．３２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７２（ｍ，１Ｈ），７．７（ｄｄ，１Ｈ），７．４２（ｍ，３Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），７．０３（ｄｄ，１Ｈ），６．９４（ｍ，１Ｈ），６．７３（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３４５［Ｍ＋１］

５−（２，４−ジフルオロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（５２ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ），ヒドラジン水和物（５滴），１−メチル−ピロリン−２−オン（０．３ｍＬ）およびトルエン（０．８ｍＬ）の混合物を１３０℃で１．５時間加熱した。反応液を後し，ＤＣＭおよびヘキサン中で破砕して，４１ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３３７［Ｍ−１］

実施例５５
５−（５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

ベンゼン（１０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（１ｇ，４．９ｍｍｏｌ）および塩化２−フルオロ−４−トリフルオロメチル−ベンゾイル（１．３ｇ，５．７ｍｍｏｌ）（実施例４７）の混合物に，室温で塩化スズ（ＩＶ）（１．２ｍＬ）の溶液を加えた。室温で一晩撹拌し，通常の後処理を行った後，残渣をシリカゲルカラムで精製して，５−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミドおよび４−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（ＭＳｍ／ｚ３９３［Ｍ−１］）を得た。

５−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド，ヒドラジン水和物，１−メチル−ピロリン−２−オンおよびトルエンの混合物を１２０℃で２時間加熱した。反応液を濃縮し，水と混合し，濾過した。固体を洗浄して，標題化合物を得た。
ＭＳｍ／ｚ３８７［Ｍ−１］

実施例５６
４−（５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

４−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（４５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）（実施例５５），ヒドラジン水和物（５滴），１−メチル−ピロリン−２−オン（０．３ｍＬ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびトルエン（０．８ｍＬ）の混合物を１３０℃で１．５時間加熱した。反応液を濃縮し，水と混合し，濾過した。固体を洗浄して，３７ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３８７［Ｍ−１］

実施例５７
４−（１−メチル−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

４−（２−フルオロ−５−トリフルオロメチル−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（４５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）（実施例５５），メチルヒドラジン（５滴），１−メチル−ピロリン−２−オン（０．３ｍＬ）およびトルエン（０．７ｍＬ）の混合物を１３０℃で１．５時間加熱した。反応液を濃縮し，水と混合し，濾過した。固体を洗浄して，５０ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ４０１［Ｍ−１］

実施例５８
５−（４−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

ベンゼン（１０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（１ｇ，４．９ｍｍｏｌ）（実施例５５）および塩化２，６−ジフルオロ−ベンゾイル（１．５ｇ，８．８ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の混合物に，室温で塩化スズ（ＩＶ）（１ｍＬ，２．２６ｇ，８．６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。室温で一晩撹拌した後，反応液を水および酢酸エチルで希釈した。有機層を２ＮＮａＯＨで洗浄し，乾燥し，シリカゲルカラムで精製して，２０５ｍｇの５−（２，６−ジフルオロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミドを白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３４３［Ｍ−１］

５−（２，６−ジフルオロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（６９ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），ヒドラジン水和物（５滴），１−メチル−ピロリン−２−オン（０．３ｍＬ）およびトルエン（０．７ｍＬ）の混合物を１３０℃で１．５時間加熱した。反応液を濃縮し，水と混合し，濾過した。固体を洗浄して，５０ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３３７［Ｍ−１］

実施例５９
５−（６−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

ベンゼン（１０ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（１ｇ，４．９ｍｍｏｌ）（実施例５５）および塩化２−クロロ−４−ニトロ−ベンゾイル（１．５ｇ，６．８ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の混合物に室温で，塩化スズ（ＩＶ）（１．４ｍＬ）の溶液を加えた。室温で５時間撹拌し，通常の後処理を行った後，残渣をシリカゲルカラムで精製して，１３５ｍｇの５−（２−クロロ−４−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミドを白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１２．８２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．３６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．４３（ｄ，１Ｈ），８．２９（ｄｄ，１Ｈ），７．８５（ｄ，１Ｈ），７．７１（ｄｔ，１Ｈ），７．４７（ｍ，１Ｈ），７．４（ｍ，１Ｈ），７．０３（ｄｄ，１Ｈ），６．９４（ｍ，１Ｈ），６．６４（ｄｄ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３８６［Ｍ−１］

５−（２−クロロ−４−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド（３０ｍｇ），ヒドラジン水和物（３滴），１−メチル−ピロリン−２−オン（０．３ｍＬ）およびトルエン（０．７ｍＬ）の混合物を１２０℃で３時間加熱した。反応液を濃縮し，ＤＣＭ−ヘキサン中で破砕し，濾過して，１１ｍｇの標題化合物を淡黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３６４［Ｍ−１］

実施例６０
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−フルオロ−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５８（ｄｄ，１Ｈ），８．４８（ｄｄ，１Ｈ），７．６８（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．３（ｍ，４Ｈ），７．１０（ｔ，２Ｈ），６．９８（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３７０［Ｍ−１］

実施例６１
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−ジメチルアミノ−ベンジルアミド

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．２０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄｄ，１Ｈ），８．４４（ｄｄ，１Ｈ），７．４２（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．２８（ｄｄ，１Ｈ），７．２６（ｄｄ，１Ｈ），７．０６（ｄ，２Ｈ），６．９３（ｍ，１Ｈ），６．６（ｄ，２Ｈ），３．９０（ｄ，２Ｈ，ＣＨ₂），２．７８（ｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ３９５［Ｍ−１］

実施例６２
１−［５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホニル］−ピペリジン−３−オール

この化合物は，実施例１８に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４３（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｍ，２Ｈ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ），４．９（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｍ，１Ｈ），３．４（ｍ，２Ｈ），２．３（ｍ，１Ｈ），２．１（ｍ，１Ｈ），１．７（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｍ，１Ｈ），１．０６（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３４６［Ｍ−１］

実施例６３
５−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−ヒドロキシ−フェニル）−アミド

ＴｉＣｌ₄（５ｍＬ）を０℃でベンゼン（５ｍＬ）中の１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステル（１２ｇ，４６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。室温で２日間撹拌した後，反応液を酢酸エチルで希釈し，２ＮＮａＯＨ，ブラインで洗浄し，乾燥して，５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステルを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．０５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３７（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄ，１Ｈ），７．８８（ｄ，１Ｈ），６．８４（ｍ，１Ｈ），６．６７（ｍ，１Ｈ），４．２７（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３２１［Ｍ−１］

５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステルを加水分解して，５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸を得た。

塩化オキサリルを用いて室温で１時間，５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（２００ｍｇ）を塩化５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボニルに変換した。次にこれを２−モルホリン−４−イル−エチルアミンおよびＴＥＡと室温で１時間縮合させて，１２０ｍｇの５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミドを得た。

５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド（５０ｍｇ），ヒドラジン水和物（５滴），１−メチル−ピロリン−２−オン（０．４ｍＬ），トルエン（１．５ｍＬ）およびエタノール（０．３ｍＬ）の混合物を１３０℃で１時間加熱した。反応液を冷却し，得られた沈殿物を真空濾過により回収して，２７．８ｍｇの標題化合物を黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３８３［Ｍ−１］，

実施例６４
５−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド

塩化オキサリルを用いて，室温で１時間，５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（２００ｍｇ）（実施例６３）を塩化５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボニルに変換した。次にこれを３−アミノ−フェノール（１７０ｍｇ，１．７当量）およびＴＥＡと室温で１．５時間縮合させて，１３５ｍｇの５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−ヒドロキシ−フェニル）−アミドを得た。

５−（２−クロロ−５−ニトロ−ベンゾイル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−ヒドロキシ−フェニル）−アミド（５０ｍｇ），ヒドラジン水和物（５滴），１−メチル−ピロリン−２−オン（０．４ｍＬ）およびトルエン（１．５ｍＬ）の混合物を１３０℃で１時間加熱した。反応液を冷却し，得られた固体を真空濾過により回収して，４５ｍｇの標題化合物を黄色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３６２［Ｍ−１］

実施例６５
５−（５−メタンスルホニル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド

クリーム色固体
この化合物は，実施例６３に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．１２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．１６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ），７．７６（ｍ，１Ｈ），７．５（ｄ，１Ｈ），７．３７（ｍ，１Ｈ），７．１９（ｍ，１Ｈ），６．９（ｍ，２Ｈ），３．２７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ₃）
ＭＳｍ／ｚ３９９［Ｍ＋１］

実施例６６
３−（１−ベンゼンスルホニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ジクロロエタン（１５ｍＬ）中の塩化２−クロロ−ニコチノイル（１．１７ｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）および１−ベンゼンスルホニル−１Ｈ−ピロール（１ｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液に，塩化アルミニウム（１．１ｇ）を加えた。室温で１時間撹拌した後，反応液を酢酸エチルで希釈し，水，塩基およびブラインで洗浄し，乾燥し，精製して，８２０ｍｇの（１−ベンゼンスルホニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−メタノンを得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ８．４８（ｍ，１Ｈ），８．０９（ｄ，２Ｈ），７．９５（ｍ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｍ，２Ｈ），７．３（ｍ，１Ｈ），６．６１（ｍ，１Ｈ），６．３７（ｍ，１Ｈ）

エタノール（３．５ｍＬ）中の（１−ベンゼンスルホニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−メタノン（１５０ｍｇ）およびヒドラジン水和物（０．１５ｍＬ）の混合物を９０℃で一晩加熱した。反応液を濃縮し，酢酸エチルで希釈し，塩基および水で洗浄し，乾燥し，濃縮して，７５ｍｇの標題化合物を白色固体として得た。
ＭＳｍ／ｚ３２５［Ｍ＋１］

実施例６７
３−［４−（４−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

クロロスルホン酸（ｄ１．７５３）（６．６ｍｌ，０．１ｍｏｌ）を，０(Ｃで（２−クロロ−ピリジン−３−イル）−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−メタノン（２．０６ｇ，１０ｍｍｏｌ）（実施例２）に滴加した。次に撹拌した混合物を０(Ｃで２４時間放置し，その後，これを氷水中に注意深く注いだ。白色沈殿物を濾過し，水で洗浄した。これを乾燥して，２．９ｇ（９５％収率）の白色固体，塩化５−［（２−クロロピリジン−３−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−３−スルホニルを得た。

塩化５−［（２−クロロピリジン−３−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−３−スルホニル（５００ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ），Ｎａ₂ＳＯ₃（４１３ｍｇ，３．２８ｍｍｏｌ），Ｎａ₂ＨＰＯ₄（２３３ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を４ｍＬの水中で混合し，６０℃で一晩（１６時間）加熱した。最初のクリーム状の懸濁液は透明になり，次に濁った。アセトン（４ｍＬ）中の臭化４−クロロベンジル（３３７ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）の溶液を反応溶液に撹拌しながら滴加した。混合物を６０℃で４時間撹拌し，次に室温まで冷却した。４ｍＬの水でクエンチし，さらに１時間撹拌した。濾過し，水およびアセトンで洗浄して，生成物，｛４−［（４−クロロベンジル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝（２−クロロピリジン−３−イル）メタノンを白色固体６４６ｍｇ（９０％収率）として得た。

｛４−［（４−クロロベンジル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝（２−クロロピリジン−３−イル）メタノン（２８０ｍｇ，０．７１１ｍｍｏｌ）および３５９ｍｇのヒドラジン一水和物（７．１１ｍｍｏｌ）を４ｍＬのエタノール中で混合した。混合物を８０℃で一晩（１６時間）撹拌し，次に室温に冷却した。水を加え，濾過した。追加の水およびメタノールで洗浄して，生成物を回収し，乾燥して，２５０ｍｇ（９５％ｙｉｅｌｄ）の標題化合物を得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｄ，１Ｈ），８．４６（ｄｄ，１Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ），７．２６（ｍ，１Ｈ），７．２３（ｄ，２Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），４．６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３７３［Ｍ＋１］

実施例６８
３−［４−（４−フルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化４−フルオロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．３８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５６（ｄ，１Ｈ），８．４６（ｄｄ，１Ｈ），７．３７（ｍ，３Ｈ），７．２６（ｍ，３Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３５７［Ｍ＋１］

実施例６９
３−［４−（４−トリフルオロメトキシ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化４−トリフルオロメトキシベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５８（ｄ，１Ｈ），８．４６（ｄｄ，１Ｈ），７．３７（ｍ，３Ｈ），７．２５（ｍ，３Ｈ），６．９（ｓ，１Ｈ），４．６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ４２３［Ｍ＋１］

実施例７０
３−［４−（４−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化４−ニトロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５８（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），８．２（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｍ，２Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３８４［Ｍ＋１］

実施例７１
３−［４−（２−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化２−クロロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，３Ｈ），７．３（ｍ，２Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），６．９（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３７３［Ｍ＋１］

実施例７２
３−［４−（３−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化３−クロロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．３５（ｍ，４Ｈ），７．２（ｍ，２Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３７３［Ｍ＋１］

実施例７３
３−［４−（ビフェニル−２−イルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化２−フェニルベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．３８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，１１Ｈ），６．６（ｓ，１Ｈ），４．５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ４１５［Ｍ＋１］

実施例７４
３−［４−（３−トリフルオロメトキシ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化３−トリフルオロメトキシベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．３５（ｍ，３Ｈ），７．２（ｍ，２Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ４２３［Ｍ＋１］

実施例７５
３−［４−（２，６−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化２，６−ジフルオロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｍ，２Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３７５［Ｍ＋１］

実施例７６
３−［４−（３，４−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化３，４−ジフルオロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．３５（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），７．１５（ｍ，１Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３７５［Ｍ＋１］

実施例７７
３−｛４−［３−（４−フルオロ−フェノキシ）−フェニルメタンスルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化４−フルオロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４（ｄｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，２Ｈ），７．２（ｍ，２Ｈ），６．９（ｍ，４Ｈ），６．８（ｍ，２Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ４４９［Ｍ＋１］

実施例７８
３−［４−（ピリジン−４−イルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，４−（ブロモメチル）ピリジンを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４（ｍ，３Ｈ），７．２（ｍ，４Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂）
ＭＳｍ／ｚ３４０［Ｍ＋１］

実施例７９
３−［４−（３−メトキシ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化３−メトキシベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．３（ｍ，１Ｈ），７．２（ｍ，２Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），６．８（ｍ，２Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３６９［Ｍ＋１］

実施例８０
３−（４−ｍ−トルイルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化３−メチルベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．５（ｍ，１Ｈ），７．２（ｍ，５Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），４．６（ｓ，２Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３５３［Ｍ＋１］

実施例８１
３−［４−（３，５−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化３，５−ジフルオロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５５（ｄ，１Ｈ），８．４５（ｄｄ，１Ｈ），７．２（ｍ，３Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｍ，２Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３７５［Ｍ＋１］

実施例８２
３−［４−（２，６−ジメチル−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化２，６−ジメチルベンジルを用いて実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
ＭＳｍ／ｚ３６７［Ｍ＋１］

実施例８３
３−［４−（３−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化３−ニトロベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
ＭＳｍ／ｚ３８４［Ｍ＋１］

実施例８４
３−［４−（４−トリフルオロメチル−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

この化合物は，臭化４−トリフルオロメチルベンジルを用いて，実施例６７に記載される方法から適応させた方法を用いて作成した。
ＭＳｍ／ｚ４０７［Ｍ＋１］

実施例８５
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸，４−クロロベンジルアミド

ＤＭＦ（１ｍＬ）中の５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（５０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ），ＨＯＢｔ（７４ｍｇ，２．５当量）．ＥＤＡＣ・ＨＣｌ（１０５ｍｇ，２．５当量），４−クロロベンジルアミン（４当量）およびＴＥＡ（０．５ｍＬ）の混合物を４０°Ｃで一晩加熱した。反応液を濃縮し，残渣をシリカゲルカラムで精製して，標題化合物を白色固体として得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６（ｓ，１Ｈ），１１．９（ｓ，１Ｈ），８．４−８．５５（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），４．４３（ｄ，２Ｈ，ＣＨ）
ＭＳｍ／ｚ３５２［Ｍ＋１］

５−アリールピロールピリドピラゾール用の一般的スキーム

２−ヒドロキシピリジン３−カルボン酸１およびＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（１当量）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で混合した。混合物を１３０℃で２時間加熱し，濃縮し，ジクロロメタン（ＤＣＭ）および酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で洗浄して，化合物２を得た。クロロベンゼン／ＤＭＦ中の化合物２の懸濁液を塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ₃）で処理し，２時間還流して，化合物３を形成した。濃縮した後，粗化合物３を直接用いてピロールをアシル化して，化合物４を得た。ボロン酸またはボロン酸エステルを用いて化合物４のスズキカップリングを行った。適当なボロン酸またはエステルを電子レンジ処理（１４０℃，５分間）または加温（８０℃一晩）し，次にヒドラジンを用いて結晶化して，５−アリールピロールピリドピラゾール６を得た。

実施例８６
５−（２−フェノキシフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ９．６（ｓ，１Ｈ），８．８（ｓ，１Ｈ），８．５（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，１Ｈ），７．３（ｍ，２Ｈ），７．１７（ｄ，１Ｈ），７．０５（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｍ，３Ｈ），６．６５（ｄ，１Ｈ），６．３５（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３５２［Ｍ＋］

実施例８７
５−（４−メトキシフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ９．５７（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ），７．５６（ｄ，２Ｈ），７．０５（ｄ，２Ｈ），６．９８（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｍ，１Ｈ），６．３８（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２９１［Ｍ＋１］

実施例８８
５−フェニル−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１０．０（ｓ，１Ｈ），８．８１（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，２Ｈ），７．５２（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），７．０（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｓ，１Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ２６１［Ｍ＋１］

実施例８９
５−（３−ニトロフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ９．３３（ｓ，１Ｈ），８．８５（ｓ，１Ｈ），８．５２（ｍ，２Ｈ），８．２９（ｍ，１Ｈ），７．９９（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｍ，１Ｈ），６．８８（ｍ，１Ｈ），６．４１（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３０６［Ｍ＋１］

実施例９０
５−（４−フェノキシフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ９．８（ｓ，１Ｈ），８．８８（ｓ，１Ｈ），８．５１（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｍ，３Ｈ），７．１７（ｍ，２Ｈ），７．０６（ｄ，１Ｈ），６．９３（ｓ，１Ｈ），６．４５（ｄ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３５３［Ｍ＋１］

実施例９１
５−（１，１’−ビフェニル−４−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ３３７［Ｍ＋１］

実施例９２
５−（１，１’−ビフェニル−３−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ３３７［Ｍ＋１］

実施例９３
５−（１，１’−ビフェニル−２−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ３３７［Ｍ＋１］

実施例９４
３−｛４−［（３−クロロ−４−フルオロベンジル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

実施例６７と同じ方法を用いた。
ＭＳｍ／ｚ３９１［Ｍ＋１］

実施例９５
３−（４−｛［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）ベンジル］スルホニル｝−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

実施例６７と同じ方法を用いた。
ＭＳｍ／ｚ４２５［Ｍ＋１］

実施例９６
５−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ３１３［Ｍ＋１］

実施例９７
５−［２−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

２−ベンジルオキシベンゼンボロン酸を用いるスズキカップリングにより得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．４６（ｓ，１Ｈ），１１．４１（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｄ，１Ｈ），８．５６（ｄ，１Ｈ），７．４９（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，３Ｈ），７．３８（ｍ，４Ｈ），７．１０（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｄ，１Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．１６（ｄ，１Ｈ），５．１４（ｓ，２Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３６７［Ｍ＋１］

実施例９８
５−ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン−４−イル−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

４−ジベンゾフランボロン酸を用いるスズキカップリングにより得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．６７（ｓ，１Ｈ），１１．４５（ｓ，１Ｈ），９．０７（ｄ，１Ｈ），８．８９（ｄ，１Ｈ），８．２４（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｍ，１Ｈ），７．７６（ｄ，１Ｈ），７．５６（ｍ，３Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．２１（ｍ，１Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３５１［Ｍ＋１］

実施例９９
３−（４−｛［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］スルホニル｝−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ３７９［Ｍ＋１］

実施例１００
３−｛４−［（４−フェニルピペラジン−１−イル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ），１２．４５（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），７．１６（ｍ，３Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９１（ｍ，２Ｈ），６．７４（ｍ，１Ｈ），３．２１（ｔ，４Ｈ），３．０２（ｔ，４Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ４０９［Ｍ＋１］

実施例１０１
３−｛４−［（４−ピリジン−２−イルピペラジン−１−イル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ４１０［Ｍ＋１］

実施例１０２
５−［３−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

３−ベンジルオキシベンゼンボロン酸を用いるスズキカップリングにより得た。
¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．５６（ｓ，１Ｈ），１１．４５（ｓ，１Ｈ），８．８（ｄ，１Ｈ），８．６（ｄ，１Ｈ），７．４９（ｍ，５Ｈ），７．４０（ｍ，３Ｈ），７．１５（ｍ，１Ｈ），６．８８（ｍ，２Ｈ），６．２０（ｍ，１Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ３６７［Ｍ＋１］

実施例１０３
５−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

４−ベンジルオキシベンゼンボロン酸を用いるスズキカップリングにより得た。
ＭＳｍ／ｚ３６７［Ｍ＋１］

実施例１０４
５−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ３４０［Ｍ＋１］

実施例１０５
３−｛４−［３−クロロ−４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−フェニルメタンスルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ５０２［Ｍ＋１］

実施例１０６
２−［４−（４−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−２−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−ピロール−１−イル］−Ｎ−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アセトアミド

実施例１０７
５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（４−クロロ−ベンジル）−（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ），１２．４５（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｄ，１Ｈ），７．４０（ｓ，４Ｈ），７．２６（ｍ，１Ｈ），７．１（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｓ，２Ｈ），３．０６（ｔ，２Ｈ），２．２７（ｍ，６Ｈ），０．８（ｔ，６Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ４８７［Ｍ＋１］

実施例１０８
５−（４’−クロロ−１，１’−ビフェニル−３−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

ＭＳｍ／ｚ３７１［Ｍ＋１］

実施例１０９
Ｎ−（４−クロロベンジル）−４，５−ジメチル−２−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド

実施例２と同じ方法を用いて得た。Ｎ−（４−クロロベンジル）−４，５−ジメチル−２−ピロール−３−カルボキサミドはＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．（１９７５），（４０），３４８７にしたがって製造した。
ＭＳｍ／ｚ３８０［Ｍ＋１］

実施例１１０
３−｛１−（２−モルホリン−４−イルエチル）−４−［（４−ニトロベンジル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１３．８６（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｍ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），８．１７（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），４．８２（ｓ，２Ｈ），４．４７（ｔ，２Ｈ），３．３７（ｔ，４Ｈ），２．４８（ｔ，２Ｈ），２．２７（ｔ，４Ｈ）
ＭＳｍ／ｚ４９７［Ｍ＋１］

生物学的評価
任意の一連の化合物において，ある範囲の生物学的活性が観察されるであろうことは理解されるであろう。以下のアッセイを用いて，最適な程度の所望の活性を示す化合物を選択することができる。

ＰＡＫ４キナーゼ活性
本発明は，生化学に基づく細胞溶解物アッセイおよび放射性方法を用いて，ＰＡＫ４による全ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質およびＧＥＦ−Ｈ１由来ペプチドのリン酸化の変化をモニターし，記録し，検出する。細胞アッセイにおいては，ＧＥＦ−Ｈ１に対するリン酸特異的抗体を用いて，細胞溶解物調製物中のリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の存在を検出する。ＧＥＦ−Ｈ１に特異的な抗体は，多数の手法のいずれを用いて生成してもよい。例えば，抗体はウサギで生成することができる。Ｎｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２３（３）：３９１−６，１９７３を参照。特定の蛋白質にユニークまたは特異的であるエピトープに対する抗体を生じさせることができる。例えば，ＰＡＫ４について先に示されているようにして，ＫＬＨ−コンジュゲート化ペプチドＣＳＧＤＲＲＲＡＧＰＥＫＲＰＫＳＳに対する抗体を生じさせることができる。Ｈａｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５５（３）：３７５−８７，１９８２を参照。

ＥＬＩＳＡを用いる全細胞中のＰＡＫ４キナーゼ活性の測定
ＧＥＦ−Ｈ１ＳのＰＡＫ４依存性リン酸化のレベルは，以下のプロトコルにしたがって，リン酸特異的抗体のＧＥＦ−Ｈ１Ｓへの結合をモニターすることにより決定することができる。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエルプレート，Ｃａｔ．＃２５８０５−９６）をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの抗ＨＡモノクローナル抗体でウエルあたり１００μｌの最終容量を用いて予めコーティングし，４℃で一晩保存した。次に，コーティングバッファを除去し，ブロッキングバッファ（２％ＢＳＡ，ＴＢＳＴ中）で置き換え，次にプレート全体を室温で６０分間振盪した。

次に，組織培養プレートをポリ−Ｌ−リジンでウエルあたり５０μｌを用いてコーティングし，次に３７で３０分間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳですすぎ，過剰の液体を吸引し，使用前に完全に乾燥させた。乾燥したのち，ＴＲ−２９３−ＫＤＧ細胞を，各ウエルに１００μｌ容量のＤＭＥＭおよび１０％Ｃｌｏｎｔｅｃｈ認可ＦＢＳ中で２ｘ１０⁺⁴細胞／ウエルで播種し，室温で少なくとも２時間インキュベートした。この時点で，培地を除去し，１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを補充した１００μｌの低血清培地（ＤＭＥＭ，０．２％ＢＳＡおよび１％Ｃｌｏｎｔｅｃｈ認可ＦＢＳ）で置き換えた。ネガティブ対照ウエルはドキシサイクリンで処理しなかった。

翌日，候補物質を０．２％ＢＳＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含む溶液中で必要に応じて希釈した。候補物質は，まず１００％ＤＭＳＯ中に物質の１０ｍＭ保存溶液を調製することにより希釈した。次にこの溶液５μｌを１５μｌのＤＭＳＯに加えて，２．５ｍＭ（５０Ｘ濃度）溶液を調製した。次に，この最終溶液の６μｌをポリプロピレンプレートのウエルに移し，これに３００μｌの培地を加えた。次に，細胞を覆う培地を除去することにより，ウエル中の１００μｌの溶液を細胞を含む各ウエルに加え，候補物質の希釈物を含む溶液を穏やかに加えた。

次に，１錠の“コンプリートミニ”プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を１０ｍｌの水，２００μｌのβ−グリセロリン酸（最終濃度，１Ｍ），１００μｌのＮａＦ（最終濃度，１Ｍ），および１０μｌのＮａ₃ＶＯ₄（最終濃度，１Ｍ）に加えることによりＨＮＴＧ^plus溶液を新たに調製し，氷上に保存した。希釈した候補物質とともに細胞を３時間インキュベートした後，培地を除去し，プレートを氷上に移した。次に細胞を含む各ウエルに１００μｌの新たなＨＮＴＧ^plus溶液を加え，冷室で１０分間振盪した。この間，ＥＬＩＳＡプレートからＢＳＡをピペットで除き，ＴＢＳＴで２回洗浄した。

次に組織培養プレートから５０μｌの細胞溶解物をＥＬＩＳＡプレートの洗浄したウエルに移し，室温で６０分間振盪した。次に，細胞溶解物を除去し，ＥＬＩＳＡプレートのウエルをＴＢＳＴで３回洗浄した。次に，１００μｌの新たに希釈した抗ｐＧＥＦ抗体（１：５０００）をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに移し，室温で６０分間振盪した。抗体溶液を除去し，ウエルをＴＢＳＴで４回洗浄した。次に，１００μｌの新たに希釈したＨＲＰ−ＧａＲ（１：１０，０００）をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに加え，室温で４５分間振盪した。次にこの溶液を除去し，ウエルをＴＢＳＴで４回，次にＰＢＳで１回洗浄した。次に，ＡＢＴＳ溶液をプレートに１００μｌ／ウエルで加えた。次に，ＥＬＩＳＡプレートを室温でインキュベートし，１０−２０分間振盪した。

その後，ＥＬＩＳＡプレートをＴｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダー上に置き，測定フィルタ４０５ｎｍ，参照フィルタ６２０ｎｍを用いて測定値を記録した。

シンチレーションプロキシミティーアッセイを用いるヒトＰＡＫ４のインビトロキナーゼ活性の測定
シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）を用いて，ＰＡＫ４の蛋白質セリン／トレオニンキナーゼ活性をインビトロで分析した。用いたプロトコルは，１０μｌの阻害剤溶液をフレキシプレート（Ｗａｌｌａｃ９６ウエルポリエチレンテレフタレート（“フレキシ”）プレート，Ｃａｔ．＃１４５０−４０１）の各ウエルに加えることを含み，ポジティブおよびネガティブ対照については１０μｌの５％ＤＭＳＯを用いた。

ＰＡＫ４酵素を経験的に決定した濃度でフレキシプレートのウエルに加えた。ＰＡＫ４酵素はＢＬ２１細胞から精製した。この実験のとき，ウエルに加えたＰＡＫ４キナーゼ酵素の濃度は２０μｌの容量中，０．１μｇ／ウエルであった。濃度は酵素調製物によって様々であろう。したがって，当業者には，特定のキナーゼ調製物について，酵素調製物を滴定し，直線的なキナーゼ活性の経時変化を決定する方法がわかるであろう。ネガティブ対照ウエルには２０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡをを加えた。基質はＰＡＫ酵素によりリン酸化されることが知られているＰＡＫ４ペプチドであり，以下の構造からなるものであった：
ビオチン−ＬＣ−ＬＣ−ＲＲＫＳＬＶＧ（ｐＴ）ＰＹＷＭＡＰＥ（配列番号１９）

ＰＡＫ４ペプチドの８番目のアミノ酸であるトレオニンはホスホトレオニンであり，全ペプチドを最終濃度５ｍｇ／ｍｌで水に溶解し，１００μｌのアリコートで必要となるまで−８０℃で保存した。しかし，本発明においては，基質としてＰＡＫキナーゼ（例えばＰＡＫ４）によりリン酸化されるか，またはリン酸化されると考えられるすべてのペプチドをＰＡＫ４ペプチドの代わりに使用しうることが企図される。例えば，配列番号３および４で表されるＧＥＦ−Ｈ１ＳペプチドをＰＡＫ４基質として用いることができる。

ＰＡＫ４キナーゼ活性用には２．５Ｘキナーゼバッファを用いた。これは，ウエルあたり５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，３７５ｍＭ ＫＣｌおよび２．５ｍＭ ＮａＦの作業濃度を含んでいた。典型的には，約４．５枚のプレートの反応には１０ｍｌのキナーゼバッファで十分である。候補物質およびＡＴＰを加えた後のこれらの成分の最終濃度は，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１５０ｍＭ ＫＣｌおよび１．０ｍＭ ＮａＦであった。

キナーゼ反応を開始させるためには，２０μｌのＰＡＫ４ビオチン化ペプチド／ＡＴＰ溶液をプレートのウエルに加え，室温で３０分間振盪せずにインキュベートし，反応遮蔽の後に置いた。ペプチド／ＡＴＰ溶液は，１．４μＭの作業濃度（すなわちウエルあたりの濃度）のコールド（すなわち放射活性を有しない）ＡＴＰ，０．１μｇ／ウエルのＰａｋｔｉｄｅおよび０．３３μＣｉ／ウエルの放射性標識γ³³Ｐ−ＡＴＰ（ＮＥＮ Ｅａｓｙ−Ｔｉｄｅ，Ｃａｔ．＃ＮＥＧ６０２Ｈ）を含む。３０分後，２００μｌの停止溶液を各ウエルに加え，プレートを少なくとも１５分間放置した。“停止”溶液は，ウエルあたり，ＰＢＳバッファ溶液中の５０μＭ ＡＴＰ（未標識），５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．５ｍｇのＳＰＡビーズの作業濃度を含んでいた。マグネシウムまたはカルシウムを含まないＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）は，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｃａｔ．＃１４１９０−１４４）から入手した。ビーズはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ，Ｃａｔ．＃ＮＩＦ１０７７）から入手した。ビーズをマグネシウムまたはカルシウムを含まないＰＢＳ中で２０ｍｇ／ｍｌの保存濃度で再構成し，４℃で保存した。

次にプレートを２３００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離し，次にＴｒｉｌｕｘプレートリーダーに移して，放射活性を測定し記録した。

アッセイ方法
以下のインビトロアッセイを用いて，活性のレベルおよび本発明の種々の化合物が１またはそれ以上のＰＫに及ぼす影響を決定することができる。任意のＰＫについて，当該技術分野においてよく知られる手法を用いて同じように同様のアッセイを設計することができる。

本明細書に記載されるアッセイのいくつかは，ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントサンドイッチアッセイ）フォーマットで行う（Ｖｏｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．，１９８０，"Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，"Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｄｅｄ．，Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．３５９−３７１）。一般的方法は以下のとおりである：試験キナーゼを発現する（天然にまたは組換え的に）細胞に化合物を導入し，選択された時間が経過した後，試験キナーゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリガンドを加える。細胞を溶解させ，溶解物を酵素的リン酸化反応の基質を認識する特定の抗体で予め被覆したＥＬＩＳＡプレートのウエルに移す。細胞溶解物の非基質成分を洗い流し，リン酸化された残基を特異的に認識する抗体で基質のリン酸化の量を検出し，試験化合物と接触していない対照細胞と比較する。

特定のＰＫについてのＥＬＩＳＡ実験を実施するための現在好ましいプロトコルを以下に記載する。しかし，他のＲＴＫ，ならびにＣＴＫおよびＳＴＫに対する化合物の活性を決定するためにこれらのプロトコルを適合させることは，十分に当業者の技術の範囲内である。本明細書に記載される他のアッセイは試験キナーゼの活性化に応答して生成されたＤＮＡの量を測定するものであり，これは増殖性応答の一般的尺度である。このアッセイの一般的方法は以下のとおりである：試験キナーゼを発現する（天然にまたは組換え的に）細胞に化合物を導入し，選択された時間が経過した後，試験キナーゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリガンドを加える。少なくとも一夜インキュベートした後，ＤＮＡ標識試薬，例えば５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）またはＨ³−チミジンを加える。抗ＢｒｄＵ抗体を用いて，または放射活性を測定することにより標識ＤＮＡの量を検出し，試験化合物と接触していない対照細胞と比較する。

ＧＳＴ−ＦＬＫ−１バイオアッセイ
このアッセイは，ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）ペプチドにおけるＧＳＴ−Ｆｌｋ１のチロシンキナーゼ活性を分析する。

材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮｏ．２５８０５−９６）
２．ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）４：１，凍結乾燥物（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ０２７５）。滅菌ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＢＳ緩衝液：１Ｌにつき，０．２ｇＫＨ₂ＰＯ₄，１．１５ｇＮａ₂ＨＰＯ₄，０．２ｇＫＣｌおよび８ｇＮａＣｌを約９００ｍｌのｄＨ₂Ｏ中で混合する。すべての試薬が溶解したとき，ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。ｄＨ₂Ｏで総容量を１Ｌとする。
４．ＰＢＳＴ緩衝液：１ＬのＰＢＳ緩衝液に１．０ｍｌＴｗｅｅｎ２０を加える。
５．ＴＢＢ−ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１．２１ｇＴＲＩＳ，８．７７ｇＮａＣｌ，１ｍｌＴＷＥＥＮ−２０を約９００ｍｌのｄＨ₂Ｏ中で混合する。ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。１０ｇＢＳＡを加え，撹拌して溶解させる。ｄＨ₂Ｏで総容量を１Ｌとする。濾過して粒子状物質を除去する。
６．１％ＢＳＡ，ＰＢＳ中：１０ｇＢＳＡを約９９０ｍｌのＰＢＳ緩衝液に加え，撹拌して溶解させる。ＰＢＳ緩衝液で総容量を１Ｌに調節し，濾過して，粒子状物質を除去する。
７．５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５
８．ｓｆ９組換えバキュロウイルストランスフォーメーションから精製したＧＳＴ−Ｆｌｋｌ ｃｄ（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）。
９．４％ＤＭＳＯ，ｄＨ₂Ｏ中
１０．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ₂Ｏ中
１１．４０ｍＭ ＭｎＣｌ₂
１２．キナーゼ希釈緩衝液（ＫＤＢ）：１０ｍｌ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），１ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ，４０μｌの１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび０．４ｍｌの５％ＢＳＡ（ｄＨ₂Ｏ中）を８８．５６ｍｌのｄＨ₂Ｏ中で混合する。
１３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２
１４．ＥＤＴＡ：１４．１２ｇエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を約７０ｍｌｄＨ₂Ｏに混合する。ＥＤＴＡが溶解するまで１０ＮＮａＯＨを加える。ｐＨを８．０に調節する。ｄＨ₂Ｏで総容量を１００ｍｌに調節する。
１５．一次および二次抗体希釈緩衝液：１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液中５％ＢＳＡを８９．５ｍｌのＴＢＳＴと混合する。
１６．抗ホスホチロシンウサギポリクローナル抗血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート
１８．ＡＢＳＴ溶液：約９００ｍｌのｄＨ₂Ｏに，１９．２１ｇのクエン酸および３５．４９ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄を加える。リン酸でｐＨを４．０に調節する。２，２’−アジノビス（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−硫酸を加える（ＡＢＴＳ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−１８８８）。約３０分間放置し，濾過する。
１９．３０％過酸化水素
２０．ＡＢＳＴ／Ｈ₂Ｏ₂：３μｌのＨ₂Ｏ₂を１５ｍｌのＡＢＳＴ溶液に加える。
２１．０．２ＭＨＣｌ

方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌのＰＢＳ中の２μｇのポリＥＹペプチド／ウエルで被覆する。室温で２時間または４℃で一夜放置する。蒸発を防止するためにプレートをカバーする。
２．プレートを逆さにすることにより未結合液体をウエルから除去する。ＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を除去する。
３．１００μｌの１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
４．工程２を繰り返す。
５．ウエルを５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５，１５０μｌ／ウエル）に浸漬する。
６．試験化合物を９６−ウエルポリプロピレンプレート中でｄＨ₂Ｏ／４％ＤＭＳＯで所望の最終アッセイ濃度の４倍に希釈する。
７．２５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに加える。対照ウエルには，２５μｌのｄＨ₂Ｏ／４％ＤＭＳＯを加える。
８．ＧＳＴ−Ｆｌｋ１をＫＤＢで０．００５μｇ（５ｎｇ）／ウエルに希釈する。
９．５０μｌの希釈酵素を各ウエルに加える。
１０．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。
１１．２５μｌの４０ｍＭＭｎＣｌ₂および４ｘＡＴＰ（２μＭ）をすべてのウエルに加える。（各ウエル中，１００μｌの最終容量，０．５μＭのＡＴＰ最終濃度）
１２．振盪しながら室温で１５分間インキュベートする。
１３．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡを各ウエルに加えることにより反応を停止する。
１４．ＴＢＳＴで３回洗浄し，プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。
１５．抗体希釈緩衝液中で１：１０，０００に希釈した抗ホスホチロシン抗血清を１００μｌ／ウエルで加える。振盪しながら室温で９０分間インキュベートする。
１６．工程１４と同様に洗浄する。
１７．１００μｌ／ウエルのヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート（抗体希釈緩衝液中１：６，０００）を加える。振盪しながら室温で９０分間インキュベートする。
１８．工程１４と同様に洗浄する。
１９．１００μｌの室温ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。
２０．振盪しながら室温で１５−３０分間インキュベートする。
２１．必要ならば，１００μｌの０．２ＭＨＣｌを各ウエルに加えることにより反応を停止する。
２２．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭで結果を読む。

ＰＹＫ２バイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいて，ＨＡエピトープタグ付け全長ｐｙｋ２（ＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ）のインビトロキナーゼ活性を測定する。

材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート
２．１２ＣＡ５モノクローナル抗ＨＡ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ）
４．ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌにつき，８．７６６ｇＮａＣｌ，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を約９００ｍｌｄＨ₂Ｏ中で混合する。ｐＨを７．２に調節し，容量を１Ｌとする。
５．ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１００ｇ１０％ＢＳＡ，１２．１ｇ１００ｍＭＴＲＩＳ，５８．４４ｇ１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＬの１％ＴＷＥＥＮ２０を混合する。
６．ｓｆ９細胞溶解物からのＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．４％ＤＭＳＯ，ＭｉｌｌｉＱｕｅＨ₂Ｏ中
８．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ₂Ｏ中
９．１ＭＭｎＣｌ₂
１０．１ＭＭｇＣｌ₂
１１．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）
１２．１０Ｘキナーゼ緩衝液リン酸化：５．０ｍｌ１ＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），０．２ｍｌ１ＭＭｎＣｌ₂，１．０ｍｌ１ＭＭｇＣｌ₂，１．０ｍｌ１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２．８ｍｌｄＨ₂Ｏ中で混合する。使用直前に０．１ｍｌ１ＭＤＴＴを加える。
１３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１４．５００ｍＭＥＤＴＡ，ｄＨ₂Ｏ中
１５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳおよび１ｍＬ１０％Ｔｗｅｅｎ−２０を８８ｍＬＴＢＳ中で混合する。
１６．ＨＲＰ−コンジュゲート化抗ＰｔｙｒＰＹ９９），Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈＣａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−７０２０
１７．ＡＢＴＳ，Ｍｏｓｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢＳＴ−２０００
１８．１０％ＳＤＳ

方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇ／ウエルの１２ＣＡ５抗ＨＡ抗体で被覆する。４℃で一夜保存する。
２．プレートを逆さにすることにより未結合ＨＡ抗体をウエルから除去する。プレートをｄＨ₂Ｏで洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を除去する。
３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
４．プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄する。
５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（１．５μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。
６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で１時間振盪する。
７．工程４と同様に洗浄する。
８．５０μｌの２Ｘキナーゼ緩衝液を捕捉ｐｙｋ２−ＨＡを含むＥＬＩＳＡプレートに加える。
９．２５μｌの４％ＤＭＳＯ中４００μＭ試験化合物を各ウエルに加える。対照ウエルには４％ＤＭＳＯのみを用いる。
１０．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。
１１．２５μｌの２０ｐＭＡＴＰをすべてのウエルに加える。振盪しながら１０分間インキュベートする。
１２．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）をすべてのウエルに加えることにより反応を停止する。
１３．工程４と同様に洗浄する。
１４．１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗Ｐｔｙｒ（１：６０００に希釈，抗体希釈緩衝液中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１５．プレートをＴＢＳＴで３回，ＰＢＳで１回洗浄する。
１６．１００μｌのＡＢＳＴ溶液を各ウエルに加える。
１７．必要ならば，２０μｌの１０％ＳＤＳを各ウエルに加えることにより発色反応を停止する。
１８．ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでプレートを読む。

ＦＧＦＲ１バイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイでＦＧＦ１−Ｒのインビトロキナーゼ活性を測定する。

材料および試薬：
１．Ｃｏｓｔａｒ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃３３６９）
２．ポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ０２７５）
３．ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ）
４．５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液溶液
５．ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）
６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．キナーゼ希釈緩衝液：５００μｌの１ＭＨｅｐｅｓ（ＧＩＢＣＯ），２０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，１０μｌの１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０μｌの５ＭＮａＣｌを混合する。
８．１０ｍＭＡＴＰ
９．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ₂リン酸化ミックス：２０μｌのＡＴＰ，４００μｌの１ＭＭｎＣｌ₂および９．５６ｍｌのｄＨ₂Ｏを混合する。
１０．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２）
１１．０．５ＭＥＤＴＡ
１２．０．０５％ＴＢＳＴ
５００μｌのＴＷＥＥＮを１リットルのＴＢＳに加える。
１３．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１４．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，カタログ＃ＡＬＩ０４０４）
１５．ＡＢＴＳ溶液
１６．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液

方法：
１．Ｃｏｓｔａｒ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ウエルの１００μｌＰＢＳ中ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）で被覆する。４℃で一夜保存する。
２．被覆したプレートをＰＢＳで１回洗浄する。
３．１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
４．プレートをＰＢＳで２回，次に５０ｍＭＨｅｐｅｓで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
５．２５μｌの０．４ｍＭ試験化合物（４％ＤＭＳＯ中），または４％ＤＭＳＯ単独（対照）をプレートに加える。
６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１を希釈緩衝液（５ｎｇナーゼ／５０μｌＫＤＢ／ウエル）で希釈する。
７．５０μｌの希釈キナーゼを各ウエルに加える。
８．２５μｌ／ウエルの新たに調製したＡＴＰ／Ｍｎ＋＋（０．４ｍｌ１ＭＭｎＣｌ₂，４０μｌ１０ｍＭＡＴＰ，９．５６ｍｌｄＨ₂Ｏ，新たに調製）を加えることによりキナーゼ反応を開始する
９．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることにより反応を停止する。
１０．プレートを新たなＴＢＳＴで４回洗浄する。
１１．抗体希釈緩衝液を作成する：５０ｍｌにつき，５ｍｌの５％ＢＳＡ，２５０μｌの５％ミルクおよび５０μｌの１００ｍＭバナジン酸ナトリウムを混合し，０．０５％ＴＢＳＴで最終容量とする。
１２．１００μｌ／ウエルの抗ホスホチロシン（１：１００００希釈，ＡＤＢ中）を加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１３．工程１０と同様に洗浄する。
１４．１００μｌ／ウエルのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（１：６０００希釈，ＡＤＢ中）を加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１５．工程１０と同様に洗浄し，次にＰＢＳで洗浄して泡および過剰のＴＷＥＥＮを除去する。
１６．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。
１７．振盪しながら１０−２０分間インキュベートする。泡を除去する。
１８．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００Ｅｌｉｓａリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。

ＥＧＦＲバイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＥＧＦＲのインビトロキナーゼ活性を測定する。

材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート
２．ＳＵＭＯ１モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
３．ＰＢＳ
４．ＴＢＳＴ緩衝液
５．ブロッキング緩衝液：１００ｍｌにつき，５．０ｇカーネーション（登録商標）インスタント無脂ミルクを１００ｍｌＰＢＳと混合する。
６．Ａ４３１細胞溶解物（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．ＴＢＳ緩衝液：
８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ：１Ｌにつき，１．５１４ｇＴＲＩＳ，２．１９２ｇＮａＣｌおよび２５ｍｌＤＭＳＯを混合し，ｄＨ₂Ｏで総容量１リットルとする。
９．ＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸，ウマ筋肉，ＳｉｇｍａＣａｔ．Ｎｏ．Ａ−５３９４），１．０ｍＭ溶液，ｄＨ₂Ｏ中。この試薬は，使用直前に作成し氷上に保持しなければならない。
１０．１．０ｍＭＭｎＣｌ₂
１１．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ₂リン酸化ミックス：１０ｍｌを作成するには，３００μｌの１ｍＭＡＴＰ，５００μｌのＭｎＣｌ₂および９．２ｍｌのｄＨ₂Ｏを混合する。使用直前に調製し，氷上に保持する。
１２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１３．ＥＤＴＡ
１４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＣａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４）
１６．ＡＢＴＳ
１７．３０％過酸化水素
１８．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂
１９．０．２ＭＨＣｌ

方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇのＳＵＭ０１で被覆する。４℃で一夜保存する。
２．プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合ＳＵＭＯ１をウエルから除去する。ｄＨ₂Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を除去する。
３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および泡を除去する。
５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（７μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。
６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で１時間振盪する。
７．プレートを上述の４と同様に洗浄する。
８．１２０μｌのＴＢＳを捕捉ＥＧＦＲを含むＥＬＩＳＡプレートに加える。
９．試験化合物をＴＢＳ中に１：１０で希釈し，ウエル中に入れる。
１０．１３．５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに入れる。対照ウエルには１０％ＤＭＳＯ中１３．５μｌのＴＢＳを加える。
１１．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１２．１５μｌのリン酸化ミックスを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに加える。最終ウエル容量は約１５０μｌであり，各ウエル中３μＭＡＴＰ／５ｍＭＭｎＣｌ₂の最終濃度となるはずである。振盪しながら５分間インキュベートする。
１３．振盪しながら１６．５μｌのＥＤＴＡ溶液を加えることにより反応を停止させる。さらに１分間振盪する。
１４．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。
１５．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（１：３０００希釈，ＴＢＳＴ中）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。
１６．上述の４と同様に洗浄する。
１７．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（１：２０００希釈，ＴＢＳＴ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１８．上述の４と同様に洗浄する。
１９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。
２０．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。泡を除去する。
２１．必要ならば，１００μｌの０．２ＭＨＣｌ／ウエルを加えることにより反応を停止させる。
２２．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む：試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭ。

ＰＤＧＦＲバイオアッセイ
このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＰＤＧＦＲのインビトロキナーゼ活性を測定する。

材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート
２．２８Ｄ４Ｃ１０モノクローナル抗ＰＤＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
３．ＰＢＳ
４．ＴＢＳＴ緩衝液
５．ブロッキング緩衝液（ＥＧＦＲバイオアッセイと同じ）
６．ＰＤＧＦＲ−発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
７．ＴＢＳ緩衝液
８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ
９．ＡＴＰ
１０．ＭｎＣｌ₂
１１．キナーゼ緩衝液リン酸化ミックス：１０ｍｌにつき，２５０μｌ１ＭＴＲＩＳ，２００μｌ５ＭＮａＣｌ，１００μｌ１ＭＭｎＣｌ₂および５０μｌ１００ｍＭＴｒｉｔｏｎＸ−１００を十分なｄＨ₂Ｏ中で混合して，１０ｍｌとする。
１２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１３．ＥＤＴＡ
１４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＣａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４）
１６．ＡＢＴＳ
１７．過酸化水素，３０％溶液
１８．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂
１９．０．２ＭＨＣｌ

方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌのＰＢＳ中０．５μｇ２８Ｄ４Ｃ１０で被覆し，４℃で一夜保存する。
２．プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合２８Ｄ４Ｃ１０をウエルから除去する。ｄＨ₂Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。
３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および泡を除去する。
５．溶解物をＨＮＴＧ中で希釈する（１０μｇ溶解物／１００μｌＨＮＴＧ）
６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。
７．プレートを工程４に記載されるように洗浄する。
８．８０μｌの作業キナーゼ緩衝液ミックスを捕捉ＰＤＧＦＲを含むＥＬＩＳＡプレートに加える。
９．試験化合物を９６−ウエルポリプロピレンプレート中でＴＢＳ中で１：１０に希釈する。
１０．１０μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエルには，１０μｌのＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１１．１０μｌのＡＴＰを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに直接加える（最終ウエル容量は約１００μｌであり，各ウエルは２０μＭＡＴＰであるはずである）。振盪しながら３０分間インキュベートする。
１２．１０μｌのＥＤＴＡ溶液を各ウエルに加えることにより反応を停止する。
１３．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。
１４．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（１：３０００希釈，ＴＢＳＴ中）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。
１５．工程４と同様に洗浄する。
１６．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（１：２０００希釈，ＴＢＳＴ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１７．工程４と同様に洗浄する。
１８．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。
１９．振盪しながら１０−３０分間インキュベートする。泡を除去する。
２０．必要ならば，１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えることにより反応を停止させる。
２１．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。

細胞性ＨＥＲ−２キナーゼアッセイ
このアッセイを用いて，全細胞におけるＨＥＲ−２キナーゼ活性をＥＬＩＳＡフォーマットで測定する。

材料および試薬：
１．ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１１９６５−０９２）
２．ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯカタログ＃１６０００−０４４），水浴中で５６℃で３０分間熱不活性化する。
３．トリプシン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５２００−０５６）
４．Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５０３０−０８１）
５．ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１５６３０−０８０）
６．成長培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，５５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍｌＨＥＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合する。
７．血清飢餓培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，２．５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍｌＨＥＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合する。
８．ＰＢＳ
９．平底９６−ウエル組織培養マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃２５８６０）
１０．１５ｃｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃０８７５７１４８）
１１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート
１２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート
１３．Ｃｏｓｔａｒトランスファーカートリッジ，Ｔｒａｎｓｔａｒ９６（Ｃｏｓｔａｒカタログ＃７６１０）用
１４．ＳＵＭＯ１：モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
１５．ＴＢＳＴ緩衝液
１６．ブロッキング緩衝液：５％カーネーション（登録商標）インスタントミルク，ＰＢＳ中
１７．ＥＧＦリガンド：ＥＧＦ−２０１，Ｓｈｉｎｋｏ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｊａｐａｎ．。粉体を１００μｌの１０ｍＭＨＣｌに懸濁する。１００μｌの１０ｍＭＮａＯＨを加える。８００μｌのＰＢＳを加え，エッペンドルフチューブに移し，使用するまで−２０℃で保存する。
１８．ＨＮＴＧ溶解緩衝液：保存５ＸＨＮＴＧ用には，２３．８３ｇＨｅｐｅｓ，４３．８３ｇＮａＣｌ，５００ｍｌグリセロールおよび１００ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００および十分なｄＨ₂Ｏを混合して１Ｌの溶液とする。１ＸＨＮＴＧ＊用には，２ｍｌＨＮＴＧ，１００Ｌ０．１ＭＮａ₃ＶＯ₄，２５０μｌ０．２ＭＮａ₄Ｐ₂Ｏ₇および１００μｌＥＤＴＡを混合する。
１９．ＥＤＴＡ
２０．Ｎａ₃ＶＯ₄．保存溶液を作成するためには，１．８４ｇＮａ₃ＶＯ₄を９０ｍｌｄＨ₂Ｏと混合する。ｐＨを１０に調節する。電子レンジで１分間沸騰させる（溶液は透明になる）。室温に冷却する。ｐＨを１０に調節する。ｐＨが１０で安定するまで加熱／冷却のサイクルを繰り返す。
２１．２００ｍＭＮａ₄Ｐ₂Ｏ₇
２２．ホスホチロシン特異的ウサギポリクローナル抗血清（抗Ｐｔｙｒ抗体，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
２３．アフィニティー精製抗血清，ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体，ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅカタログ＃ＡＬＩ０４０４）
２４．ＡＢＴＳ溶液
２５．３０％過酸化水素溶液
２６．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂
２７．０．２ＭＨＣｌ

方法：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１．０μｇ／ウエルのＳＵＭ０１で被覆する。最終容量１００μｌ／ウエル。４℃で一夜保存する。
２．使用の日に，被覆緩衝液を除去し，プレートをｄＨ₂Ｏで３回，ＴＢＳＴ緩衝液で１回洗浄する。このアッセイにおいては，特に記載しない限り，すべての洗浄はこのように行う。
３．１００μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。使用直前にプレートを洗浄する。
４．このアッセイにはＥＧＦｒ／ＨＥＲ−２キメラ／３Ｔ３−Ｃ７細胞株を用いる。
５．８０−９０％コンフルエントの皿を選択する。トリプシン処理により細胞を回収し，１０００ｒｐｍで室温で５分間遠心分離する。
６．細胞を血清飢餓培地に懸濁し，トリパンブルーで計数する。９０％より高い生存度が必要である。細胞を血清飢餓培地に２，５００細胞／ウエルの密度で，９０μｌ／ウエルで９６ウエルマイクロタイタープレートに播種する。播種した細胞を３７℃，５％ＣＯ₂で一夜インキュベートする。
７．播種の２日後にアッセイを開始する。
８．試験化合物を４％ＤＭＳＯに溶解する。次に試料をプレート上で直接血清飢餓ＤＭＥＭでさらに希釈する。典型的には，この希釈は１：１０またはそれより高い。次にすべてのウエルを細胞プレートにさらに１：１０希釈して加える（１０μｌの試料および培地を９０μｌの血清飢餓培地に加える。最終ＤＭＳＯ濃度は１％以下でなければならない。標準的連続希釈を用いてもよい。
９．５％ＣＯ₂，３７℃で２時間インキュベートする。
１０．保存ＥＧＦ（１６．５μＭ）を暖めたＤＭＥＭで１５０ｎＭに希釈することによりＥＧＦリガンドを調製する。
１１．１００μｌ／ウエルに十分な量のＨＮＴＧ＊を新たに調製する。氷上に置く。
１２．試験化合物とともに２時間インキュベートした後，調製したＥＧＦリガンドを細胞に５０μｌ／ウエルで加える。最終濃度は５０ｎＭである。陽性対照ウエルには同量のＥＧＦを加える。陰性対照にはＥＧＦを加えない。３７℃で１０分間インキュベートする。
１３．試験化合物，ＥＧＦ，およびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで１回洗浄する。
１４．ＨＮＴＧ＊を細胞に１００μｌ／ウエルで移す。氷上に５分間置く。この間にブロッキング緩衝液をＥＬＩＳＡプレートから除去し，洗浄する。
１５．細胞をマイクロピペッターでプレートから掻き取り，ＨＮＴＧ＊溶解緩衝液を繰り返し吸引分配することにより細胞材料をホモジナイズする。溶解物を，被覆しブロッキングし洗浄したＥＬＩＳＡプレートに移す。
１６．振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１７．溶解物を除去し，洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体（１：３０００，ＴＢＳＴ中）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。
１８．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
１９．抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，洗浄する。新たに希釈したＢＩＯＳＯＵＲＣＥ抗体をＥＬＩＳＡプレートに加える（１：８０００，ＴＢＳＴ中，１００μｌ／ウエル）。
２０．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。
２１．ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ抗体を除去し，洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。
２２．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。泡を除去する。
２３．１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えて反応を停止する。
２４．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタセット４１０ｎＭおよび参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。

ＣＤＫ２／サイクリンＡアッセイ
このアッセイを用いて，シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）におけるヒトｃｄｋ２／サイクリンＡのインビトロセリン／トレオニンキナーゼ活性を測定する。

材料および試薬：
１．Ｗａｌｌａｃ９６−ウエルポリエチレンテレフタレート（ｆｌｅｘｉ）プレート（Ｗａｌｌａｃカタログ＃１４５０−４０１）
２．Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｒｅｄｉｖｕｅ［γ³³Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＡＨ９９６８）
３．Ａｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＲＰＮＱ０００７）。ビーズはＰＢＳ中でマグネシウムまたはカルシウムなしで２０ｍｇ／ｍｌで再構成しなければならない。
４．Ｓｆ９細胞から精製した活性化ｃｄｋ２／サイクリンＡ酵素複合体（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
５．ビオチニル化ペプチド基質（Ｄｅｂｔｉｄｅ）．ペプチドビオチン−Ｘ−ＰＫＴＰＫＫＡＫＫＬをｄＨ₂Ｏに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解する。
６．２０％ＤＭＳＯ，ｄＨ₂Ｏ中
７．キナーゼ緩衝液：１０ｍｌにつき，９．１ｍｌのｄＨ₂Ｏ，０．５ｍｌのＴＲＩＳ（ｐＨ７．４），０．２ｍｌの１ＭＭｇＣｌ₂，０．２ｍｌの１０％ＮＰ４０を混合し，使用直前に０．０２ｍｌの１ＭＤＴＴを新たに加える。
８．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ₂Ｏ中
９．１ＭＴｒｉｓ，ＨＣｌでｐＨを７．４に調節する。
１０．１ＭＭｇＣｌ₂
１１．１ＭＤＴＴ
１２．ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１４１９０−１４４）
１３．０．５ＭＥＤＴＡ
１４．停止溶液：１０ｍｌにつき，９．２５ｍｌのＰＢＳ，０．０５ｍｌの１０ｍＭＡＴＰ，０．１ｍｌの０．５ＭＥＤＴＡ，０．１ｍｌの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００および１．５ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌＳＰＡビーズを混合する。

方法：
１．試験化合物の溶液を５％ＤＭＳＯ中に所望の最終濃度の４倍で調製する。１０μｌを各ウエルに加える。陽性および陰性対照については，ウエル中１０μｌの２０％ＤＭＳＯのみを用いる。
２．ペプチド基質（ｄｅｂ−ｔｉｄｅ）をｄＨ₂Ｏで１：２５０に希釈して，最終濃度０．０２ｍｇ／ｍｌとする。
３．２４μｌの０．１ｍＭＡＴＰを２４μＣｉγ³³Ｐ−ＡＴＰおよび十分量のｄＨ₂Ｏと混合して６００μｌとする。
４．希釈ペプチドおよびＡＴＰ溶液を１：１で混合する（６００μｌ＋６００μｌ／プレート）。１０μｌのこの溶液を各ウエルに加える。
５．５μｌのｃｄｋ２／ｃｙｃｌｉｎＡ溶液を２．１ｍｌの２ｘキナーゼ緩衝液（プレートあたり）中に希釈する。２０μｌ／ウエルの酵素を加える。陰性対照には，２０μｌの２ｘキナーゼ緩衝液を加え，酵素を加えない。
６．プレート振盪器で軽く混合し，６０分間インキュベートする。
７．２００μｌ／ウエルの停止溶液を加える。
８．少なくとも１０分間放置する。
９．プレートを約２３００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離する。
１０．Ｔｒｉｌｕｘリーダーでプレートを計数する。

ＭＥＴトランスリン酸化アッセイ
このアッセイを用いて，基質のｍｅｔトランスリン酸化のアゴニスト／アンタゴニストを同定する手段として，ポリ（グルタミン酸：チロシン（４：１））基質のホスホチロシンレベルを測定する。

材料および試薬：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート，Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃２５８０５−９６
２．ポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）４：１，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ；Ｐ０２７５
３．ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ
４．５０ｍＭＨＥＰＥＳ
５．ブロッキング緩衝液：２５ｇのウシ血清アルブミン，ＳｉｇｍａＣａｔ．ＮｏＡ−７８８８，を５００ｍｌＰＢＳに溶解し，４μｍフィルターを通して濾過する。
６．Ｍｅｔキナーゼドメインを含む精製ＧＳＴ融合蛋白質，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ
７．ＴＢＳＴ緩衝液
８．１０％水性（ＭｉｌｌｉＱｕｅＨ₂Ｏ）ＤＭＳＯ
９．１０ｍＭ水性（ｄＨ₂Ｏ）アデノシン−５’−三リン酸，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−５３９４
１０．２Ｘキナーゼ希釈緩衝液：１００ｍｌにつき，１０ｍＬ１ＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，０．４ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，０．２ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムおよび１ｍＬ５Ｍ塩化ナトリウムを８８．４ｍＬｄＨ₂Ｏ中で混合する。
１１．４ＸＡＴＰ反応混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１Ｍ塩化マンガンおよび０．０２ｍＬ０．１ＭＡＴＰを９．５６ｍＬｄＨ₂Ｏ中で混合する。
１２．４Ｘ陰性対照混合物：１０ｍＬにつき，０．４ｍＬ１Ｍ塩化マンガンを９．６ｍＬｄＨ₂Ｏ中に混合する。
１３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃Ｓ−７２０９２
１４．５００ｍＭＥＤＴＡ
１５．抗体希釈緩衝液：１００ｍＬにつき，１０ｍＬ５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，０．５ｍＬ５％カーネーション（登録商標）インスタントミルク，ＰＢＳ中，および０．１ｍＬ０．１Ｍオルトバナジン酸ナトリウムを８８．４ｍＬＴＢＳＴ中で混合する。
１６．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体，Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ
１７．ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ
１８．ＡＢＴＳ溶液：１Ｌにつき，１９．２１ｇクエン酸，３５．４９ｇＮａ₂ＨＰＯ₄および５００ｍｇＡＢＴＳを十分なｄＨ₂Ｏ中で混合し，１Ｌとする。
１９．ＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂：１５ｍＬＡＢＳＴ溶液と２μｌＨ₂Ｏ₂を使用の５分前に混合する。
２０．０．２ＭＨＣｌ

方法：
１．ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中２μｇのポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）で被覆し，４℃で一夜保存する。
２．プレートを１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳで６０分間ブロッキングする。
３．プレートをＰＢＳで２回，次に，５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液，ｐＨ７．４で１回洗浄する。
４．５０μｌの希釈キナーゼをすべてのウエルに加える。
（精製キナーゼはキナーゼ希釈緩衝液中で希釈する。最終濃度は１０ｎｇ／ウエルとなるはずである）。
５．２５μｌの試験化合物（４％，ＤＭＳＯ中）または対照にはＤＭＳＯ単独（４％，ｄＨ₂Ｏ中）をプレートに加える。
６．キナーゼ／化合物混合物を１５分間インキュベートする。
７．２５μｌの４０ｍＭＭｎＣｌ₂を陰性対照ウエルに加える。
８．２５μｌのＡＴＰ／ＭｎＣｌ₂混合物を他のすべてのウエル（陰性対照を除く）に加える。５分間インキュベートする。
９．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。
１０．プレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。
１１．抗体希釈緩衝液中で１：１０，０００に希釈した１００μｌのウサギポリクローナル抗Ｐｔｙｒを各ウエルに加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１２．プレートをＴＢＳＴで３回洗浄する。
１３．ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＨＲＰコンジュゲート化抗ウサギ抗体を抗体．希釈緩衝液中に１：６，０００で希釈する。１００μｌ／ウエルを加え，振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
１４．プレートをＰＢＳで１回洗浄する。
１５．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ₂Ｏ₂溶液を各ウエルに加える。
１６．必要ならば，１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えることにより発色反応を停止させる。
１７．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでプレートを読む。

ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
以下のアッセイは，選択されたレセプターを発現するよう遺伝子工学的に改変された細胞を使用して，ＤＮＡ中へのＢｒｄＵ取り込みを決定することにより，リガンド−誘導性ＤＮＡ合成の活性に及ぼす目的化合物の影響を評価する。

以下の材料，試薬および方法は，以下のＢｒｄＵ取り込みアッセイのそれぞれについて一般的である。特定のアッセイにおける変更は特に記載される。
一般的材料および試薬：
１．適当なリガンド
２．工学的に改変した適当な細胞
３．ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）
４．ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）
５．抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：マウスモノクローナル抗体，ペルオキシダーゼとコンジュゲート化（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）
６．ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，即使用可，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）
７．ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４
８．アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），画分Ｖ粉体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）

一般的方法：
１．細胞を８０００細胞／ウエルで，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ，ＤＭＥＭ中で９６ウエルプレートに播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ₂で一夜インキュベートする。
２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。
３．第３日に，適当なリガンドおよび試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには無血清ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡのみを加える。陽性対照細胞にはリガンドを加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに９６ウエルプレート中で調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。
４．リガンド活性化の１８時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：１００，ＤＭＥＭ中，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とともに１．５時間インキュベートする。
５．標識試薬とともにインキュベートした後，デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で４５分間インキュベートする。
６．デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことによりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ミルク（５％脱水ミルク，ＰＢＳ中，２００μｌ／ウエル）をブロッキング溶液としてを加え，プレートをプレート振盪器で室温で３０分間インキュベートする。
７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：２００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ，５０μｌ／ウエル）を加え，プレートをプレート振盪器で室温で９０分間インキュベートする。
８．デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートを除去し，プレートを逆さにし，ペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥する。
９．ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２０分間，発色が光学的検出に十分となるまでインキュベートする。
１０．試料の吸収をＤｙｎａｔｅｃｈＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍで測定する（"デュアル波長"モード，参照波長として４９０ｎｍでフィルターを読む）。

ＥＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７
その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。

ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−２−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ２／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−２キナーゼドメイン）
その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。

ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−４−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ４／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−４キナーゼドメイン）
その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。

ＰＤＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．ヒトＰＤＧＦＢ／Ｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７
その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。

ＦＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．ヒトＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳＡ）
２．３Ｔ３ｃ７／ＥＧＦｒ
その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。

ＨＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ
材料および試薬：
１．組換えヒトＨＧＦ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２４９−ＨＧ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）
２．ＢｘＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６８７）
その他の材料および試薬および方法は上述の通りである。

方法：
１．細胞をＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中で９６ウエルプレートに９０００細胞／ウエルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ₂中で一夜インキュベートする
２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に１００μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。
３．第３日に，リガンド（１μｇ／ｍｌでＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ中で調製；最終ＨＧＦ濃度２００ｎｇ／ｍｌ）および試験化合物を含有する２５μｌを細胞に加える。陰性対照ウエルには２５μｌの無血清ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡのみを加える。陽性対照細胞にはリガンド（ＨＧＦ）を加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，９６ウエルプレートで，リガンドを含む無血清ＲＰＭＩ中でその最終濃度の５倍で調製し，一連の希釈を作成して７種類の試験濃度とする。典型的には，試験化合物の最高最終濃度は１００μＭであり，１：３希釈を用いる（すなわち，最終試験化合物濃度範囲は０．１３７−１００μＭである）。
４．リガンド活性化の１８時間後，１２．５μｌの希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：１００，ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ）を各ウエルに加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度は１０ｐＭ）とともに１時間インキュベートする。
５．一般的方法と同じ。
６．一般的方法と同じ。
７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：１００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートを室温でプレート振盪器で９０分間インキュベートする。
８．一般的方法と同じ。
９．一般的方法と同じ。
１０．一般的方法と同じ。

ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ
このアッセイを用いて，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＦＧＦ−Ｒ，ＶＥＧＦ，ａＦＧＦまたはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然に発現されている）に対する化合物の活性を測定する。

第０日
１． ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞，（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；カタログＮｏ．１７３０ＣＲＬ）を洗浄し，トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．１４１９０−０２９から入手）で２回，約１ｍｌ／１０ｃｍ²組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログＮｏ．Ｃ−１５４４）中で０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリプシンは，０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログＮｏ．２５２００−０４９）を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約１ｍｌ／２５−３０ｃｍ²組織培養フラスコで３７℃で約５分間トリプシン処理する。細胞をフラスコからはがした後，等量のアッセイ培地を加え，５０ｍｌ滅菌遠心分離管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ．０５−５３９−６）に移す。
２． ５０ｍｌ滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより，細胞を約３５ｍｌのアッセイ培地で洗浄し，約２００ｇで１０分間遠心分離し，上清を吸引し，３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄し，細胞を約１ｍｌ／組織培養フラスコ１５ｃｍ²のアッセイ培地に再懸濁する。アッセイ培地は，Ｆ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．２１１２７−０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細胞を計数し，アッセイ培地を細胞に加えて０．８−１．０ｘ１０⁵細胞／ｍｌの濃度とする。
３． 細胞を９６ウエル平底プレートに１００μｌ／ウエルまたは０．８−１．０ｘ１０⁴細胞／ウエルで加える；３７℃，５％ＣＯ₂で約２４時間インキュベートする。

第１日
１． 試験化合物の２倍滴定を別々の９６ウエルプレート中に作成する。一般に，５０μＭから０μＭまで。上述の第０日，工程２と同じアッセイ培地を用いる。滴定は，９０μｌ／ウエルの試験化合物を２００μＭ（４Ｘ最終ウエル濃度）で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保存液濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるため，２００μＭの薬剤濃度は２％ＤＭＳＯを含む。
したがって，ＤＭＳＯ濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために，アッセイ培地中（Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）２％ＤＭＳＯとした希釈剤を，試験化合物滴定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに６０μｌ／ウエルで加える。カラムの最上ウエル中の１２０μｌの２００μＭ試験化合物希釈物から６０μｌを採取し，カラムの第２のウエル中の６０μｌと混合する。このウエルから６０μｌを採取し，カラム中の第３のウエル中の６０μｌと混合し，２倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から２番目のウエルが混合されたとき，このウエル中の１２０μｌの６０μｌを採取し，これを廃棄する。最後のウエルには薬剤非含有対照として６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈物を加える。以下のアッセイの，滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な９つのカラムを作成する：（１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，から入手，カタログＮｏ．１００−２００，（２）内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）（酸性線維芽細胞成長因子またはａＦＧＦとしても知られる）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手，カタログＮｏ．１４３９６００）；または（３）ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地対照。ＥＣＧＦはヘパリンナトリウムを有する調製物として得た。
２． ５０μｌ／ウエルの試験化合物希釈物を，第０日からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞０．８−１．０ｘ１０⁴細胞／１００μｌ／ウエルを含む９６ウエルアッセイプレートに移し，３７^oＣ，５％ＣＯ₂で約２時間インキュベートする。
３． 三重に，８０μｇ／ｍｌＶＥＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌＥＣＧＦ，または各試験化合物の条件に対する培地対照を５０μｌ／ウエルで加える。試験化合物については，成長因子濃度は所望の最終濃度の４倍である。第０日，工程２からのアッセイ培地を用いて，成長因子の濃度を調節する。３７℃，５％ＣＯ₂で約２４時間インキュベートする。各ウエルに５０μｌの試験化合物希釈物，５０μｌの成長因子または培地，および１００μｌの細胞を加え，総量２００μｌ／ウエルとする。すなわち，すべてをウエルに加えたとき，４倍濃度の試験化合物および成長因子は１倍となる。

第２日
１． ³Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログＮｏ．ＴＲＫ−６８６）を１μＣｉ／ウエル（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウエル）で加え，３７℃，５％ＣＯ₂で約２４時間インキュベートする。ＲＰＭＩはＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手する，カタログＮｏ．１１８７５−０５１
第３日
１． プレートを−２０℃で一夜凍結する。
第４日
１． プレートを融解し，９６ウエルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６（登録商標））でフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログＮｏ．１２０５−４０１）上に回収する；Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）液体シンチレーション計数機で計数する。

インビボ動物モデル
異種移植片動物モデル
ヒト腫瘍が無胸腺マウス（例えば，Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）中で異種移植片として成長する能力は，ヒト腫瘍の治療に対する生物学的応答を研究するのに有用なインビボモデルを提供する。ヒト腫瘍の無胸腺マウスへの最初の成功的な異種移植（Ｒｙｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｖｌｓｅｎ，１９６９，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０）以来，多くの異なるヒト腫瘍細胞株（例えば，乳房，肺，尿生殖器，胃腸，頭頸部，神経膠芽細胞腫，骨，および悪性黒色腫）が移植され，ヌードマウス中での成長に成功してきた。以下のアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の活性，特異性および効果のレベルを決定することができる。３種類の一般的アッセイ，すなわち細胞／触媒，細胞／生物学的およびインビボアッセイが化合物の評価に有用である。細胞／触媒アッセイの目的は，ＴＫが細胞中の既知の基質上のチロシンをリン酸化する能力に及ぼす化合物の影響を判定することである。細胞／生物学的アッセイの目的は，細胞中でＴＫにより刺激される生物学的応答に及ぼす化合物の影響を判定することである。インビボアッセイの目的は，特定の疾患，例えば癌の動物モデルにおける化合物の影響を判定することである。

皮下異種移植片実験に適した細胞株としては，ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３８），Ｃ６細胞（神経膠腫，ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１０７），Ａ３７５細胞（黒色腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９），Ａ４３１細胞（類表皮癌腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５），Ｃａｌｕ６細胞（肺，ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ５６），ＰＣ３細胞（前立腺，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５），ＳＫＯＶ３ＴＰ５細胞，およびＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦ−１Ｒまたは任意の他の試験キナーゼを過剰発現するように遺伝子工学処理されたおよびＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞が挙げられる。以下のプロトコルを用いて異種移植片実験を行うことができる。

２−６週齢の雌無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手する。すべての動物は，クリーンルーム条件下で，滅菌ケージ（Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍａｙｗｏｏｄ，ＮＪ）でＳａｎｉ Ｃｈｉｐｓ（Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を用いて維持する。動物には，滅菌齧歯類食および水を任意に与える。

細胞株は，適当な培地（例えば，ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，Ｈａｍ'ｓＦ１０，またはＨａｍ'ｓＦ１２プラス５％−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭグルタミン（ＧＬＮ））中で成長させる。すべての細胞培養培地，グルタミン，およびウシ胎児血清は，特に断らない限り，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入する。すべての細胞は，９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ₂の湿潤環境下で３７℃で成長させる。すべての細胞株は，週に２回，定期的に継代し，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）により判定して，マイコプラズマについては陰性である。

細胞は，コンフルエント，またはそれに近い状態で，０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで回収し，４５０ｘｇで１０分間ペレット化する。ペレットを滅菌ＰＢＳまたは培地（ＦＢＳなし）中に懸濁して特定の濃度とし，細胞をマウス（１群あたり，８−１０匹のマウス，２−１０ｘ１０⁶細胞／動物）の後側腹部内に移植する。腫瘍成長は，ベニエカリパスを用いて３−６週間にわたり測定する。腫瘍体積は，とくに記載のないかぎり，長さｘ幅ｘ高さの積として計算する。Ｐ値は，スチューデントｔ−テストを用いて計算する。５０−１００μｌの賦形剤（ＤＭＳＯ，またはＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）中の試験化合物は，通常は移植後の第１日から初めて，異なる濃度でＩＰ注入により輸送することができる。

腫瘍侵襲モデル
以下の腫瘍侵襲モデルが開発されており，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターを選択的に阻害すると同定された化合物の治療的価値および有効性を評価するために用いることができる。

方法
８週齢のヌードマウス（雌）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｉｎｃ．）を実験動物として用いる。腫瘍細胞の移植は，層流フード内で行うことができる。麻酔用に，キシラジン／ケタミンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシラジン）を腹膜内に投与する。中線切開を行って，腹腔を露出して（約１．５ｃｍの長さ），容量１００μｌの培地中の１０⁷個の腫瘍細胞を注入する。細胞は，膵臓の十二指腸葉または結腸の漿膜下に注入する。腹膜および筋肉を６−０絹連続縫糸により縫合し，皮膚は創傷クリップを用いて縫合する。動物は毎日観察する。

分析
動物の全体的所見により２−６週間後，マウスを殺し，局所腫瘍の種々の臓器（肺，肝臓，脳，胃，脾臓，心臓，筋肉）への転移を調べ，分析する（腫瘍サイズ，侵襲の程度，免疫化学，およびインサイチオハイブリダイゼーション測定等）。

ＭＴＴ増殖アッセイ
ＭＯ７Ｅ細胞を血清飢餓とし，リン酸化実験について記載されるようにして化合物で前処理する。細胞を１００μｌＲＰＭＩ＋１０％血清中で４Ｘ１０⁵細胞／ウエルで９６ウエルディッシュに播種する。ｒｈ−ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え，プレートを４８時間インキュベートする。４８時間後，１０μｌの５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を加え，４時間インキュベートする。酸性イソプロパノール（イソプロパノール中０．０４ＮＨＣｌを１００μｌ）を加え，波長５５０ｎｍで光学密度を測定する。

アポトーシスアッセイ
ＭＯ７Ｅ細胞は，＋／−ＳＣＦおよび＋／−化合物で１０％ＦＢＳ中で，ｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびｒｈ−ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）とともにインキュベートする。サンプルは，２４および４８時間にアッセイする。活性化カスパーゼ−３を測定するためには，サンプルをＰＢＳで洗浄し，氷冷７０％エタノールで透過性とする。次に細胞をＰＥコンジュゲート化ポリクローナルウサギ抗活性化カスパーゼ−３で染色し，ＦＡＣＳにより分析する。切断されたＰＡＲＰを測定するためには，サンプルを溶解し，抗ＰＡＲＰ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析する。

ポリ−グルタミン酸チロシン基質リン酸化アッセイを用いるＧＳＴ−キナーゼバイオアッセイ：
以下の方法は，ＧＳＴ−Ａｂｌキナーゼ活性の阻害剤のスクリーニングにおいて用いるためのバイオアッセイを説明する。このアッセイは，ＧＳＴ−Ｌｙｎ，ＧＳＴ−ＬＣＫ，およびＧＳＴ−ＤＤＲ１キナーゼ活性の阻害剤のスクリーニング用に改変することができる。

ＧＳＴ−Ａｂｌバイオアッセイ
１．プレートを１００μｌの２０μｇ／ｍｌポリＧｌｕ．Ｔｙｒ（Ｓｉｇｍａ＃Ｐ０２７５）／ＰＢＳで４℃で一晩または室温で２時間コーティングする。
２．プレートを逆さにすることによりウエルから液体を除去し。ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮで１回洗浄し，プレートをペーパータオル上でたたいて過剰の液体を除去する。
３．１５０μｌの１％ＢＳＡ／ＴＢＳで室温で３０分間ブロッキングする。
４．プレートをＴＢＳ−ＴＷＥＥＮで１回洗浄し，１５０μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４に浸しておく。
５．試験化合物（２ｍＭ／ＤＭＳＯ）をｄＨ₂Ｏによる希釈のためのＣｏｓｔａｒプレートに５μｌ／ウエルで加え，反応プレートに移す。
６．１２０μｌの蒸留水を希釈プレート中の５μｌの各化合物に加え，必要な希釈系列を作成し，次に２５μｌ／ウエルのこの溶液を反応プレートに加える。このことにより，元の溶液がＤＭＳＯ中２ｍＭであれば，反応液中の最終的な最大濃度は２０μＭとなる。
７．ＧＳＴ−Ａｂｌを２ｘキナーゼバッファで１：１０，０００に希釈する。
５枚のプレート用には，以下のようにして２５ｍＬ溶液を調製する：
２５ｍＬ２ｘキナーゼバッファ
５０μｌの１．０ＭＤＴＴ（−２０℃で凍結保存）
２．５μｌのＧＳＴ−Ａｂｌ（−８０℃で凍結保存）
各ウエルに５０μｌを加える。
８．ネガティブ対照ウエルに２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加える。
９．１０ｍＭＡＴＰをＨ₂Ｏで希釈する。５枚のプレート用に，以下の用にして１２．５ｍＬを用意する：
１０μｌの１０ｍＭＡＴＰ
１２．４９ｍＬの蒸留水
各ウエルに２５μｌを加える（最終ＡＴＰ濃度は２μＭである）。
１０．プレート振盪器で室温で５分間インキュベートする。２５μｌの０．５ｍＭＥＤＴＡを加えて反応を停止させる。
１１．ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮで４回洗浄する（Ｗａｓｈ＃１プログラム）。
１２．１００μｌのＰＹ９９ＨＲＰ（１：５，０００／ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ）を加え，プレート振盪器で室温で１時間インキュベートする。
１３．プレートをＴＢＳ−ＴＷＥＥＮで４回（Ｗａｓｈ＃１プログラム），蒸留水で１回洗浄する。
１４．１００μｌのＭｏｓｓ安定化ＡＢＴＳを用いてプレートを発色させ，２０μｌの１０％ＳＤＳ／ウエルを用いて停止させる。

ＧＳＴ−Ｌｙｎバイオアッセイ
ＧＳＴ−Ｌｙｎのアッセイ条件は，ＧＳＴ−Ａｂｌの代わりにＧＳＴ−Ｌｙｎを用いる点以外は，Ａｂｌについて上述したものと同じである。アッセイにおいて用いる最終ＡＴＰ濃度は４．０マイクロモルに調節する。

ＧＳＴ−ＬＣＫバイオアッセイ
ＧＳＴ−ＬＣＫのアッセイ条件は，基質としてポリグルタミン酸−チロシンの代わりにポリリジン−チロシンを用い，ＧＳＴ−Ａｂｌの代わりにＧＳＴ−ＬＣＫを用いる点以外は，Ａｂｌについて上述したものと同じである。アッセイで用いる最終ＡＴＰ濃度は，２．０マイクロモルに調節する。

ＧＳＴ−ＤＤＲ１バイオアッセイ
ＧＳＴ−ＤＤＲ１のアッセイ条件は，ＧＳＴ−ＤＤＲ１の代わりにＧＳＴ−Ａｂｌを用いる点以外は，ＧＳＴ−Ａｂｌバイオアッセイについて上述したものと同じである。最終ＡＴＰ濃度を６００マイクロモルに調節する。

ＺＣ１シンチレーションプロキシミティーアッセイ
シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）を用いて，ＺＣ１の蛋白質セリン／トレオニンキナーゼ活性をインビボで分析して，均一アッセイにおいてＺＣ１の阻害剤をスクリーニングする。以下に記載するアッセイは，ＺＣ１阻害剤のハイスループットスクリーニングに適合可能である。

材料および溶液：
１．Ｗａｌｌａｃ９６ウエルポリエチレンテレフタレート（ｆｌｅｘｉ）プレート（Ｗａｌｌａｃカタログ＃１４５０−４０１）
２．ＮＥＮＥａｓｙ−Ｔｉｄｅ［γ³³Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮカタログ＃ＮＥＧ６０２Ｈ）
３．Ａｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＮＩＦ１０７）−マグネシウムまたはカルシウムを含まないＰＢＳ中でビーズを５０ｍｇ／ｍＬで再構成する。再構成したビーズを４℃で保存する（最適な計数を達成するためには，アッセイ中のすべてのビオチン化分子を結合するために，過剰量のストレプトアビジンＳＰＡビーズが存在することが重要である）。Ｓｆ９細胞から精製した活性化ＺＣ１酵素−最終濃度３００ｎｇ／ウエル。
４．ペプチド基質＃９０２Ｂ（ビオチン−ＫＲＴＬＲＲＫＲＴＬＲＲＫＲＴＬＲＲ）−最終濃度０．５μＭ／ウエル（２ＸＫｍ）

方法:
１．阻害剤の溶液を，５％ＤＭＳＯ中所望の最終濃度の５ｘで調製する。ｆｌｅｘｉ ｐｌａｔｅの各ウエルに１０μＬを加える。正対照および負対照用には，１０μＬの５％ＤＭＳＯを加える。
２．上述のようにしてＡＴＰミックスを調製する（１枚のアッセイプレート用に２．１ｍｌのＡＴＰミックスで十分である）。２０μＬをすべてのウエルに加える。
３．ネガティブ対照ウエルに２０μＬの５Ｍ ＥＤＴＡを加える。
４．２．５Ｘキナーゼバッファ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，１２．５ｍＭ ＭｎＣｌ₂，５００ｍＭ ＮａＣｌ，および１ｍＭ ＤＴＴ）中に酵素溶液を調製する。最終酵素濃度は０．３０μｇ／ウエル（例えば，保存溶液が０．５ｍｇ／ｍＬであれば，１０ｍＬのキナーゼ緩衝液に３０２μＬのＺＣ１酵素を加える）であろう。２０μＬ／ウエルを加えて反応を開始させる。
５．キナーゼ反応を室温で６０分間進行させる。
６．各ウエルに，０．０５ｍＭＡＴＰ，５ｍＭＥＤＴＡ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎｘ−１００，および５ｍｇ／ｍｌのＡｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ（Ｃａｔ＃ＮＩＦ１０７７）をＰＢＳ中に含む２００μＬの停止溶液を加える。１５分間インキュベートする。
７．プレートを２３００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離する。
８．ＴｒｉｌｕｘリーダーでＳＰＡフレキシプレートプロトコルを用いてプレートを計数する（クエンチカーブを含む）。

追加のアッセイ
本発明の化合物を評価するために用いることができる追加のアッセイには，限定されないが，ｂｉｏ−ｆｌｋ−１アッセイ，全細胞におけるＥＧＦレセプター−ＨＥＲ２キメラレセプターアッセイ，およびｒａｆのリン酸化機能を測定するアッセイが含まれる。これらのアッセイのそれぞれのプロトコルは，Ｐｅｎｇらの米国特許６，１３０，２３８（図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に見出すことができる。

細胞毒性の測定
治療用化合物は，細胞毒性効果を示すよりもレセプターチロシンキナーゼ活性においてより強力でなければならない。化合物の有効性および細胞毒性の尺度は，治療指数，すなわち，ＩＣ₅₀／ＬＤ₅₀を決定することにより得ることができる。ＩＣ₅₀（５０％の阻害を達成するのに必要な用量）は，本明細書に記載されるもの等の標準的な手法を用いて測定することができる。ＬＤ₅₀（５０％の毒性をもたらす用量）もまた，放出されるＬＤＨの量を測定することにより（Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：３１３，Ｄｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎｎ−Ｍａｔｔｈｅｓ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１５：６１），または動物モデルにおける致死用量を測定することにより，標準的な手法により測定することができる（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３）。より大きい治療指数を有する化合物が望ましい。治療指数は，２より高くあるべきであり，好ましくは少なくとも１０，より好ましくは少なくとも５０である。

血漿安定性試験：
本発明の好ましい態様の化合物の血漿安定性試験は，化合物をブランクの血漿で３７℃でスパイクすることにより行った。化合物濃度は約１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬである。１００μＬの血漿サンプルを種々の時点で取り出し，すみやかに酸性アセトニトリル中に加え，次に濾過し，水中５０％アセトニトリルに０．７％ギ酸を含む混合物で希釈した。残存化合物の量はＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。

Claims (15)

1. 式Ｉ：
   

   

   ［式中，
   Ｘは，ＮまたはＣＲ₈であり；
   Ｒ₁およびＲ₉は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，アリールスルホニル，アルキルスルホニル，またはＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’，ＳＯ₂ＲおよびＣ（Ｏ）Ｒ’または生理学的条件下で加水分解しうる成分からなる群より選択されるプロドラッグ基であり；
   Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＨＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’または（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され，前記アルキル，アリールまたはヘテロアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，ヒドロキシ，カルボン酸，アミノまたはヘテロ脂環式でさらに置換されていてもよく；
   Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈は，独立して，Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＲＲ’，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’，トリハロメチルまたは（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され；
   ｎは０−３であり；
   ｍは０−３であり；
   ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキル，ヘテロアリールまたはアリールであり，アルキルまたはアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ”）₂，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ”，（ＣＨ₂）_nＯＲ”，（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ”，アルコキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アミノカルボニル，ヘテロ脂環式環，アリール，アルキル，アルコキシ，−ＣＺ_3,−ＯＣＺ₃，アリールオキシ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく；
   Ｒ”は，Ｈ，アルキルまたはアリールであり；
   Ｚはハロゲンであり；
   あるいは，ＲおよびＲ’は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員のヘテロ脂環式環または５−６員のヘテロアリール環を形成してもよく，ここで，ヘテロ脂環式環は，前記ヘテロ脂環式またはヘテロアリール環中にＮ，ＯまたはＳ原子を含んでいてもよく，および前記ヘテロ脂環式またはヘテロアリール環は，アルキル，ハロアルキル，アルコキシ，ヒドロキシおよびハロからなる群より選択される成分で置換されていてもよく；
   ただし，Ｒ₄はピロール環の２位または３位のいずれかに結合しており，かつピラゾール環は２位または３位に結合しており，ただしＲ₄とピラゾール環の両方は同じ位置には結合しておらず；および
   （１）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₉，Ｒ₅，Ｒ₇およびＲ₈が水素であり，ＸがＣＲ₈であるとき，Ｒ₆はピリジル，ＮＯ₂，またはＮＨ₂ではなく，（２）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈が水素でありＸがＣＲ₈であるとき，Ｒ₉はフェニルではない］
   の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
2. 式Ｉ：
   

   

   ［式中，
   ＸはＮまたはＣＲ₈であり；
   Ｒ₁およびＲ₉は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，アリールスルホニル，アルキルスルホニル，または，Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’，ＳＯ₂ＲおよびＣ（Ｏ）Ｒ’または生理学的条件下で加水分解可能な成分からなる群より選択されるプロドラッグ基であり；
   Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＨＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’または（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され，前記アルキル，アリールまたはヘテロアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，ヒドロキシ，カルボン酸，アミノまたはヘテロ脂環式でさらに置換されていてもよく；
   Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈は，独立して，Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＲＲ’，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’，トリハロメチルまたは（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され；
   ｎは０−３であり；
   ｍは０−３であり；
   ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキル，ヘテロアリール，ヘテロ脂環式またはアリールであり，アルキルまたはアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ”）₂，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ”，（ＣＨ₂）_nＯＲ”，（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ”，アルコキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アミノカルボニル，ヘテロ脂環式環，アリール，アルキル，アルコキシ，−ＣＺ_3,−ＯＣＺ₃，アリールオキシ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく；
   Ｒ”はＨ，アルキルまたはアリールであり；
   Ｚはハロゲンであり；
   あるいは，ＲおよびＲ’は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員のヘテロ脂環式環または５−６員のヘテロアリール環を形成し，ここで，ヘテロ脂環式環は前記ヘテロ脂環式またはヘテロアリール環中にＮ，ＯまたはＳ原子を含んでいてもよく，前記ヘテロ脂環式またはヘテロアリール環は，アルキル，ハロアルキル，アルコキシ，ヒドロキシおよびハロからなる群より選択される成分で置換されていてもよく；
   ただし，Ｒ₄はピロール環の２位または３位のいずれかに結合しており，かつピラゾール環は２位または３位に結合しており，Ｒ₄とピラゾール環との両方は同じ位置には結合しておらず；および
   （１）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₉，Ｒ₅，Ｒ₇およびＲ₈が水素であり，ＸがＣＲ₈であるとき，Ｒ₆は，ピリジル，ＮＯ₂，またはＮＨ₂ではなく，および（２）Ｒ₁−Ｒ₄，Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈が水素であり，ＸがＣＲ₈であるとき，Ｒ₉はフェニルではない］
   の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
3. ＸがＣＲ₈である，請求項１または２に記載の化合物。
4. ＸがＮである，請求項３記載の化合物。
5. Ｒ₂およびＲ₃が，独立して，ハロゲン，ＮＯ₂，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，および（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’からなる群より選択される，請求項４記載の化合物。
6. Ｒ₆が，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，トリハロメチルおよびＮＯ₂からなる群より選択される，請求項５記載の化合物。
7. Ｒ₅が，ハロゲン，アミノまたはヘテロ脂環式環である，請求項６記載の化合物。
8. Ｒ₁およびＲ₉が，Ｈ，アルキル，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’またはＳＯ₂Ｒからなる群より選択される，請求項７記載の化合物。
9. Ｒ₃が，ハロゲン，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，および（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’からなる群より選択される，請求項１または２に記載の化合物。
10. Ｒ₆が，ＮＨＣ（Ｏ）ＲおよびＮＯ₂からなる群より選択される，請求項１または２に記載の化合物。
11. 式ＩＩ：
    

    

    ［式中，
    Ｒ₁およびＲ₉は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，アリールスルホニル，アルキルスルホニル，またはＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）ＯＲ’，ＳＯ₂ＲおよびＣ（Ｏ）Ｒ’または生理学的条件下で加水分解可能な成分からなる群より選択されるプロドラッグ基であり；
    Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄は，独立して，Ｈ，アルキル，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＨＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂Ｎ（Ｒ）（ＣＨ₂）_nＲ’，Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’または（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され，ここで，前記アルキル，アリールまたはヘテロアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，ヒドロキシ，カルボン酸，アミノまたはヘテロ脂環式でさらに置換されていてもよく；
    Ｒ₅，Ｒ₆，Ｒ₇およびＲ₈は，独立して，Ｈ，アルキル，アルコキシ，アリール，アリールオキシ，ヘテロアリール，ハロゲン，シアノ，ＮＯ₂，ＮＲＲ’，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ₂）_mＳＯ₂（ＣＨ₂）_nＲ，（ＣＨ₂）_nＳＯ₂ＮＲＲ’，ＮＨＳＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ’，（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＮＲＲ’，ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ，（ＣＨ₂）_nＮＲＲ’，（ＣＨ₂）_nＯＲ’，トリハロメチルまたは（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ’からなる群より選択され；
    ｎは０−３であり；
    ｍは０−３であり；
    ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキル，ヘテロアリールまたはアリールであり，ここで，アルキルまたはアリールは，ハロゲン，ＮＯ₂，（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ”）₂，（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｒ”，（ＣＨ₂）_nＯＲ”，（ＣＨ₂）_nＯＣ（Ｏ）Ｒ”，アルコキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アミノカルボニル，ヘテロ脂環式環，アリール，アルキル，アルコキシ，−ＣＺ_3,−ＯＣＺ₃，アリールオキシ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはヘテロアリールでさらに置換されていてもよく；
    Ｒ”は，Ｈ，アルキルまたはアリールであり；および
    Ｚはハロゲンであり；
    あるいは，ＲおよびＲ’は，これらが結合している窒素と一緒になって，５−７員のヘテロ脂環式環または５−６員のヘテロアリール環を形成し，ここで，ヘテロ脂環式環は前記ヘテロ脂環式またはヘテロアリール環中にＮ，ＯまたはＳ原子を含んでいてもよく，および，前記ヘテロ脂環式またはヘテロアリール環は，アルキル，ハロアルキル，アルコキシ，ヒドロキシおよびハロからなる群より選択される成分で置換されていてもよい］
    の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
12. ３−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−（５−モルホリン−４−イルメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−（３−フェニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    （２，６−ジフルオロ−フェニル）−［５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−イル］−メタノン；
    ６−クロロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ６−クロロ−３−（１Ｈ−ピロール−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸イソブチル−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸カルバモイルメチル−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸フェネチル−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸フェニルアミド；
    ５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール；
    ３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イルアミン；
    Ｎ−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−イソニコチンアミド；
    ３−クロロ−Ｎ−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−ベンズアミド；
    ４−メトキシ−Ｎ−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−ベンズアミド；
    １−メチル−５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール；
    ５−ニトロ−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−インダゾール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；
    ３−（４−ブロモ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸エチルエステル；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（（Ｓ）−１−フェニル−エチル）−アミド；
    ４−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；
    ６−モルホリン−４−イル−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ６−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（６−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−メトキシ−ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸２，４−ジクロロ−ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−クロロ−ベンジルアミド；
    ５−［５−（２，６−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（ビフェニル−４−イルメチル）−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸２，６−ジフルオロ−ベンジルアミド；
    ベンジル−［３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル］−アミン；
    ３−（４−ニトロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（１−メチル−５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ４−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸３−クロロ−ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸［１−（４−クロロ−フェニル）−エチル］−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−トリフルオロメチル−ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸ヒドラジド；
    ５−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ４−（５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ４−（１−メチル−５−トリフルオロメチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（４−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（６−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−フルオロ−ベンジルアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸４−ジメチルアミノ−ベンジルアミド；
    １−［５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホニル］−ピペリジン−３−オール；
    ５−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−ヒドロキシ−フェニル）−アミド；
    ５−（５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アミド；
    ５−（５−メタンスルホニル−１Ｈ−インダゾール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（３−フルオロ−フェニル）−アミド；
    ３−（１−ベンゼンスルホニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（４−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（４−フルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（４−トリフルオロメトキシ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（４−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（２−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（３−クロロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（ビフェニル−２−イルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（３−トリフルオロメトキシ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（２，６−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（３，４−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−｛４−［３−（４−フルオロ−フェノキシ）−フェニルメタンスルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（ピリジン−４−イルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（３−メトキシ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−（４−ｍ−トルイルメタンスルホニル−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（３，５−ジフルオロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（２，６−ジメチル−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（３−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−［４−（４−トリフルオロメチル−フェニルメタンスルホニル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸，４−クロロベンジルアミド；
    ５−（２−フェノキシフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（４−メトキシフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−フェニル−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（３−ニトロフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（４−フェノキシフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（１，１’−ビフェニル−４−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（１，１’−ビフェニル−３−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（１，１’−ビフェニル−２−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−｛４−［（３−クロロ−４−フルオロベンジル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−（４−｛［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）ベンジル］スルホニル｝−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−［２−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン−４−イル−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−（４−｛［（５−クロロチエン−２−イル）メチル］スルホニル｝−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−｛４−［（４−フェニルピペラジン−１−イル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−｛４−［（４−ピリジン−２−イルピペラジン−１−イル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−［３−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ５−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ３−｛４−［３−クロロ−４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−フェニルメタンスルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    ２−［４−（４−ニトロ−フェニルメタンスルホニル）−２−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−ピロール−１−イル］−Ｎ−（２−モルホリン−４−イル−エチル）−アセトアミド；
    ５−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−スルホン酸（４−クロロ−ベンジル）−（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミド；
    ５−（４’−クロロ−１，１’−ビフェニル−３−イル）−３−（１Ｈ−ピロール−２−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    Ｎ−（４−クロロベンジル）−４，５−ジメチル−２−（１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボキサミド；および
    ３−｛１−（２−モルホリン−４−イルエチル）−４−［（４−ニトロベンジル）スルホニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン；
    からなる群より選択される，請求項２記載の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
13. 請求項１，２，１０，または１２のいずれかに記載の化合物および薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
14. 生物において蛋白質キナーゼ関連疾患を治療または予防する方法であって，請求項１，２，１０，または１２のいずれかに記載の化合物または塩および薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む治療上有効量の医薬組成物を前記生物に投与することを含む方法。
15. 前記蛋白質キナーゼ関連疾患が，星状細胞腫，カポジ肉腫，神経膠芽細胞腫，肺癌，膀胱癌，頭部癌，頚部癌，黒色腫，卵巣癌，前立腺癌，乳癌，小細胞肺癌，神経膠腫，結腸直腸癌，尿生殖器癌および胃腸癌からなる群より選択される癌である，請求項１４記載の方法。