JP2006296719A

JP2006296719A - 培養容器

Info

Publication number: JP2006296719A
Application number: JP2005122213A
Authority: JP
Inventors: Koka Rin; 孔華林; Yoshiaki Shiba; 良昭芝
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2006-11-02

Abstract

【課題】培養途中や培養終了後に、生体組織補填体を培養容器から取り出す際に、細胞に損傷を与えることなく生体組織補填体を取り出す。
【解決手段】培地を貯留可能な培養容器本体２と、該培養容器本体２の内面のうち、少なくとも培地内に浸漬される生体組織補填材が配置される内面を着脱可能に覆うシート状の生体適合性材料からなる被覆部材５とを備え、該被覆部材５に、該被覆部材５を厚さ方向に貫通する複数の貫通孔８ａが設けられている培養容器１を提供する。
【選択図】図１

Description

この発明は、培養容器に関し、特に、生体適合性材料からなる生体組織補填材に細胞を付着させた生体組織補填体を製造する際に使用する培養容器に関するものである。

従来、生体組織補填体を製造するには、シャーレ状の培養容器内に貯留した培地内に、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）等の生体適合性の生体組織補填材に、間葉系幹細胞等の細胞を付着させた状態で投入し、所定の培養条件下に配することで、細胞を生体組織補填材上で成長させることとしていた（例えば、特許文献１参照。）。

特許文献１の方法は、骨髄液から採取したごく微量の間葉系幹細胞を培養して増殖させる第１のステップから、増殖した間葉系幹細胞を生体組織補填材に付着させて培養する第２のステップへの移行の際に、間葉系幹細胞に損傷を与えないようにして、効率的に生体組織補填体を製造することができる。
特開２００４−８９６２６号公報

しかしながら、特許文献１においては、製造された生体組織補填体を培養容器から取り出すことについては何ら言及していない。
通常、このような培養容器内の固形物を取り出すには、スプーンなどにより取り出す必要がある。しかし、スプーンなどによって取り出す場合には、注意深く行わなければ、スプーンが生体組織補填体の表面の細胞に接触する際に細胞に損傷を与えてしまう不都合が考えられる。また、培養容器内において生体組織補填体を製造している場合、複数の生体組織補填体の細胞どうしが接続している場合もあり、スプーンで取り扱う際に細胞を切断してしまう不都合もある。さらに、培地交換、生体組織補填体の洗浄および移植を行う場合、こうした操作が煩雑であり、また、生体組織補填体に雑菌汚染（コンタミネーション）をもたらす恐れもある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養途中や培養終了後に、生体組織補填体を培養容器から取り出す際に、細胞に損傷を与えることなく生体組織補填体を取り出すことができる培養容器を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、培地を貯留可能な培養容器本体と、該培養容器本体の内面のうち、少なくとも前記培地内に浸漬される生体組織補填材が配置される内面を着脱可能に覆うシート状の生体適合性材料からなる被覆部材とを備え、該被覆部材に、該被覆部材を厚さ方向に貫通する複数の貫通孔が設けられている培養容器を提供する。

本発明によれば、培養容器本体内の内面を覆う被覆部材上に生体組織補填材を配置し、該生体組織補填材に細胞を播種して培養することにより生体組織補填体が製造される。製造された生体組織補填体を培養容器から取り出す際には、被覆部材を把持して持ち上げることにより、該被覆部材とともに生体組織補填体が培養容器から取り出される。この場合に、製造された生体組織補填体に直接触れることがないので、生体組織補填体の細胞が損傷することを防止できる。また、被覆部材には貫通孔が設けられているので、該貫通孔を介して培地が流れ、培養容器に貯留されている培地内から生体組織補填体をスムーズに取り出すことができるとともに、コンタミネーションのリスクを低減できる。

上記発明においては、前記被覆部材に、該被覆部材が前記培養容器本体の内面に沿って配置されたときに、培地の外部に露出する把持部が設けられている培養容器を提供する。
このように構成することで、培養容器本体内に貯留されている培地内から生体組織補填体を取り出す際には、培地の外部に露出している把持部を把持して取り扱うことにより、容易に取り出すことができる。この場合に、把持部を把持する取り出し具が培地に接触することを防止でき、培地の汚染を防止できる。

上記発明においては、前記被覆部材が網状部材からなることが好ましい。
このように構成することで、製造された生体組織補填体を容易に培養容器本体から取り出すことができ、また、取り出しの際に培地を培養容器本体内に残すことができる被覆部材を簡易に構成することができる。

上記発明においては、前記把持部が、前記被覆部材の一部により構成されていることとしてもよい。
このように構成することで、被覆部材の一部を培地の外側に露出するまでのばすことで、被覆部材を簡易に構成できる。

また、上記発明においては、前記被覆部材が、該被覆部材を培養温度以下の所定温度以下で培養容器本体内面から剥離させる温度応答性処理により培養容器本体内面に接着されていることとしてもよい。
このように構成することで、培養中には被覆部材が培養容器本体内面に接着した状態に維持されて、その上で生体組織補填体が製造され、培養後に、所定温度以下に冷却することで、温度応答性処理の作用によって被覆部材が培養容器本体内面から剥離する。被覆部材が剥離すると、被覆部材上において製造された生体組織補填体も培養容器本体から離れるので、生体組織補填体を損傷することなくそのまま剥離部材とともに培養容器本体内に取り出すことができる。

また、上記発明においては、前記被覆部材が、培養温度で容器本体内面に沿って配置され、所定温度以下で容器本体から取り出し可能な大きさに収縮する形状記憶合金からなることとしてもよい。
このように構成することで、同様にして、生体組織補填体を損傷することなくそのまま剥離部材とともに培養容器本体内に取り出すことができる。

また、上記発明においては、前記培養容器本体の開口部を密封する蓋体と、該蓋体を前記開口部に着脱可能に取り付ける締結手段とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、締結手段により蓋体を培養容器本体の開口部に締結することにより、培養容器本体内部を密封することができる。したがって、この状態で培養容器を搬送容器とすることができ、内部に貯留した搬送液等を外部に漏らすことなく生体組織補填体を搬送することが可能となる。

また、上記発明においては、前記蓋体に、前記開口部に取り付けられた状態で、培養容器内外に気体の流通を許容するフィルタが備えられていることとしてもよい。
このように構成することで、蓋体で開口部を閉鎖された培養容器本体をそのままインキュベータに投入することができ、蓋体のフィルタを介して、酸素や二酸化炭素等の必要な気体の培養容器本体内への供給が可能となる一方、微生物等の侵入を防止することができる。

本発明によれば、培養途中や培養終了後に、生体組織補填体を培養容器から取り出す際に、細胞に損傷を与えることなく生体組織補填体を取り出すことができるという効果を奏する。これにより、培地交換、生体組織補填体の洗浄および移植などの操作を簡易に行うことができ、コンタミネーションのリスクを大幅に低減できる。

以下、本発明の第１の実施形態に係る培養容器について、図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係る培養容器１は、培養容器本体２と、該培養容器本体２の開口部３を開閉する蓋体４と、培養容器本体２の内部に取り出し可能に収容される被覆部材５とを備えている。

培養容器本体２は、略有底円筒状に形成され、その上部に開口部３を有するとともに、上部外面に、前記蓋体４を締結する雄ネジ６が形成されている。これにより、培養容器本体２は、所定の培地を貯留して底面近傍で細胞を培養することができるようになっている。

前記蓋体４は、培養容器本体２の雄ネジ６に締結される雌ネジ（図示略）を有するとともに、培養容器本体２の開口部３を密封するように取り付けられたときに、培養容器本体２内外への気体Ｇの流通を可能とするフィルタ７を備えている。これにより、培養容器本体２の外部から酸素や二酸化炭素等の必要な気体Ｇを取り入れることができる一方、微生物や塵埃等の不必要な物質の培養容器本体２内部への侵入を禁止することができるようになっている。

前記被覆部材５は、培養容器本体２の底面全体を被覆可能な寸法を有する網状部８と、該網状部８に接続され、該網状部８が培養容器本体２の底面を被覆する位置に配置されたときに、培養容器本体２の高さ方向に延びる把持部９とを備えている。把持部９の長さは、培養容器本体２のほぼ全長にわたる長さ寸法となっている。

網状部８は、使用する生体組織補填材（図２参照）１０、例えば、β−ＴＣＰ多孔体ブロックあるいは顆粒の寸法よりも小さい網目を有している。これにより、網状部８に載置される生体組織補填材１０を下方に落とさないように支持することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る培養容器１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器１を用いて生体組織補填体を製造するには、図２（ａ）に示されるように、被覆部材５の網状部８には、例えば、β−ＴＣＰ多孔体ブロックからなる生体組織補填材１０を載せる。そして、例えば、間葉系幹細胞等の細胞を播種して、培養容器本体２内に所定の液位まで培地１１を加える。これにより、生体組織補填体の培養準備が完了する。

このようにして、被覆部材５の網状部８に載置した細胞を播種した生体組織補填材１０を培養容器本体２内の培地１１内に浸漬した状態で、培養容器本体２の上部に設けられている雄ネジ６に蓋体４の雌ネジを締結することにより、蓋体４により培養容器本体２の開口部３を密封状態に閉塞することができる。そして、このようにして密封された培養容器１をＣＯ_２インキュベータ内に収容し、所定の培養条件、例えば、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ_２濃度５％に設定する。

本実施形態に係る培養容器１の蓋体４には、フィルタ７が設けられているので、ＣＯ_２インキュベータ内の気体Ｇ、例えば、酸素や二酸化炭素が、フィルタ７を介して自由に培養容器本体２内に流入することができる一方、微生物や塵埃等はフィルタ７によって遮断され培養容器本体２内に流入することが阻止される。これにより、培養中における培養容器本体２内の雰囲気を適正な状態に維持し、生体組織補填材１０を足場とした間葉系幹細胞の健全な成長を促すことができる。したがって、生体組織補填材１０上の間葉系幹細胞を増殖させあるいは骨芽細胞に分化させることができる。

また、培養工程が進行し、培養容器本体２内の培地１１を交換する際には、図２（ｂ）に示されるように、操作者は、ピンセットなどで把持部９を把持して網状部８を培地１１内から引き上げる。網状部８は、複数の貫通孔８ａを有しているので、網状部８の上方の培地１１を貫通孔８ａを介して下方に流動させる。したがって、操作者は、培地１１の抵抗なく網状部８を培地１１内から引き上げることができる。

このとき、網状部８の網目は、生体組織補填体１０′よりも小さく設定されているので、網目から生体組織補填体１０′が培地１１内に落下することが防止される。したがって、培地１１内において培養していた全ての生体組織補填体１０′を培地１１内から引き上げることができ、培養容器本体２内の培地１１を容易に交換することが可能となる。また、この場合においても、操作者の手が培地１１に触れることが防止され、また、細胞に触れることも防止されるので、細胞を健全な状態に維持することができる。

このようにして培地１１を交換した後には、培養容器本体２内に貯留した新たな培地１１内に、上記と同様にして網状部８に搭載した生体組織補填体１０′を浸漬し、培養を継続する。そして、培養終了後に、生体組織補填体１０′を回収する際においても、製造された生体組織補填体１０′を直接取り扱うことなく、把持部９によって網状部８を操作するだけで回収できる。したがって、製造された生体組織補填体１０′に損傷を与えることなく、健全な状態の生体組織補填体１０′を回収することができる。

また、回収した生体組織補填体１０′を培養施設から医療機関に搬送する場合には、図２（ａ）に示される培養容器１のフィルタ７付きの蓋体４に代えて、フィルタ７を有しない蓋体（図示略）により培養容器本体２の開口部３を密封することが好ましい。培養容器本体２内には培地１１に代えて搬送液を貯留する。被覆部材５を操作して網状部８上に乗せた生体組織補填体１０′をそのまま搬送液内に沈め、培養容器本体２の開口部３を蓋体によって密封することで、搬送時に搬送液が外部に漏れないように保持しつつ、生体組織補填体１０′を搬送することができる。

なお、本実施形態に係る培養容器１においては、ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体からなる生体組織補填材１０を用いる場合について説明したが、顆粒状の生体組織補填材１０に細胞を播種した生体組織補填体１０′を培養する場合に適用してもよい。この場合、網状部８の網目をさらに細かく設定することにより対応できる。

また、本実施形態においては、被覆部材５として網状部８を有するものを例示したが、これに代えて、培養容器本体２の底面全体を覆うシート状に形成し、生体組織補填体１０′を落下させることなく、培地１１の流通を容易にする複数の貫通孔を設けることにしてもよい。
また、培地１１の液面より上方に露出する把持部９を設けることとしたが、これに代えて、網状部８を直接取り扱うこととすれば、把持部９を設けなくてもよい。

次に、本発明の第２の実施形態に係る培養容器２０について、図３〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器２０は、培養方法としてローラボトル法を用いる場合の培養容器２０であって、略有底円筒状の培養容器本体２１と、培養容器本体２１内部に配置される被覆部材２２と、培養容器本体２１の開口部２３を開閉する蓋体２４とを備えている。

培養容器本体２１は、図４（ａ）に示されるように、生体組織補填材２５を配置して培養する円筒状の内面を備えている。また、培養容器本体２１は、前記蓋体２４を締結する雄ネジ２６を備え、該雄ネジ２６に蓋体２４の雌ネジを締結することにより、開口部２３を密封状態に閉塞することができるようになっている。

前記被覆部材２２は、生体適合性の樹脂材料、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等により構成された薄膜状に形成され、図示しない複数の貫通孔を備えている。
被覆部材２２は、前記培養容器本体２１の内面全体を被覆し、温度応答性処理によって培養容器本体２１内面に接着されている。また、被覆部材２２は、培養容器本体２１の開口部２３の内面まで被覆している。

温度応答性処理は、例えば、温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定することにより行われる。温度応答性処理された領域は、３２℃を境界温度として、それ以上では弱い疎水性を呈するが、境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈することになる。したがって、例えば、３７℃で培養した後に３２℃以下に冷却することにより、培養容器本体２１内面を高い親水性を呈するように変化させ、容易に被覆部材２２を剥離させることができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る培養容器２０の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る培養容器２０を用いて生体組織補填体２５を製造するには、図４に示されるように、培養容器本体２１内に球体状のβ−ＴＣＰ多孔体ブロックあるいは顆粒からなる生体組織補填材２５と、例えば、間葉系幹細胞等の細胞を投入し、それに培地２７を所定量加える。

生体組織補填材２５は、培養容器本体２１の円筒状の内面全体にわたって１列に敷き詰められる程度の量を投入する。そして、培養容器本体２１を、図４（ａ）に示されるように、その中心軸線が略水平となるように配置し、その中心軸線回りに所定の速度で回転させる。培地２７の量は、培養容器本体２１の回転途中の各時点において、最下位に配されている生体組織補填材２５が培地２７内に浸漬される程度の量でよい。

これにより、球体状の生体組織補填材２５が培地２７の表面張力によって培養容器本体２１の円筒状内面に付着し、培養容器本体２１の回転に伴って移動させられる。培養容器本体２１内に投入された球体状の生体組織補填材２５は、培養容器本体２１の回転とともに、順次培養容器本体２１の内面に付着していき、最終的に、図４（ｂ）に示されるように、内面全体を埋め尽くすように、１層に敷き詰められることになる。

この状態で、さらに培養容器本体２１を回転させることにより、内面に付着している生体組織補填材２５が、回転に伴って順次、培養容器本体２１内に貯留している培地２７に浸漬されるようになる。培養容器本体２１内の培地２７は、生体組織補填材２５の直径よりも深い最大深さとなる程度に貯留されており、生体組織補填材２５は培地２７内に完全に没するように浸漬される。
そして、このようにして培養容器本体２１を所定時間にわたって回転させ続けることにより、細胞は生体組織補填材２５を足場として接着し、成長させられることになる。

所定の培養時間の経過後に、細胞が十分に成長した生体組織補填体２５′が製造された後には、温度を３２℃以下に冷却する。これにより、温度応答性処理が急激に親水性を呈するように変化し、図５に示されるように、培養容器本体２１の内面から被覆部材２２が剥離させられる。

被覆部材２２は培養容器本体２１の開口部２３内面まで延びているので、開口部２３近傍に配されている被覆部材２２の端部を把持して引き出すことにより、培養容器本体２１の内面から剥離させた被覆部材２２ごと、製造された生体組織補填体２５′を培養容器本体２１内から取り出して回収することができる。この際に、操作者は、被覆部材２２の端部をピンセットなどで把持して引き出すだけで、生体組織補填体２５′に直接接触することがなく、生体組織補填体２５′が損傷を受けたり、塵埃等により汚染されたりする不都合の発生を未然に防止することができる。

なお、本実施形態においては、被覆部材２２として薄膜状の生体適合性の樹脂材料を温度応答性処理により培養容器本体２１内面に接着させ、生体組織補填体２５′の回収時に培養容器本体２１内面から剥離させることとしたが、これに代えて、培地２７の交換時においても剥離させることにしてもよい。

また、樹脂材料に代えて、形状記憶合金からなる網状部材によって被覆部材２２を構成することとしてもよい。この場合には、約３７℃の培養温度においては被覆部材２２が培養容器本体２１内面に密着するように膨張し、それより低い所定の温度において培養容器本体２１の開口部２３から取り出し可能な寸法まで収縮するように構成すればよい。

本発明の第１の実施形態に係る培養容器を示す、蓋体を開いた状態の斜視図である。図１の培養容器を用いた（ａ）培養工程および（ｂ）回収工程をそれぞれ示す縦断面図である。本発明の第２の実施形態に係る培養容器を示す縦断面図である。図３の培養容器を用いた培養工程を示す（ａ）縦断面図および（ｂ）横断面図である。図３の培養容器を用いて培養された生体組織補填体の回収工程を示す縦断面図である。

符号の説明

Ｇ気体
１，２０培養容器
２，２１培養容器本体
３，２３開口部
４，２４蓋体
５，２２被覆部材
６，２６雄ネジ（締結手段）
７フィルタ
８網状部（網状部材）
８ａ貫通孔
９把持部
１０，２５生体組織補填材
１１，２６培地

Claims

培地を貯留可能な培養容器本体と、
該培養容器本体の内面のうち、少なくとも前記培地内に浸漬される生体組織補填材が配置される内面を着脱可能に覆うシート状の生体適合性材料からなる被覆部材とを備え、
該被覆部材に、該被覆部材を厚さ方向に貫通する複数の貫通孔が設けられている培養容器。
前記被覆部材に、該被覆部材が、前記培養容器本体の内面に沿って配置されたときに、培地の外部に露出する把持部が設けられている培養容器。
前記被覆部材が網状部材からなる請求項１または請求項２に記載の培養容器。
前記把持部が、前記被覆部材の一部により構成されている請求項２または請求項３に記載の培養容器。
前記被覆部材が、該被覆部材を培養温度以下の所定温度以下で培養容器本体内面から剥離させる温度応答性処理により培養容器本体内面に接着されている請求項１から請求項４のいずれかに記載の培養容器。
前記被覆部材が、培養温度で容器本体内面に沿って配置され、所定温度以下で培養容器本体から取り出し可能な大きさに収縮する形状記憶合金からなる請求項１から請求項４のいずれかに記載の培養容器。
前記培養容器本体の開口部を密封する蓋体と、
該蓋体を前記開口部に着脱可能に取り付ける締結手段とを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の培養容器。
前記蓋体に、前記開口部に取り付けられた状態で、培養容器本体内外に気体の流通を許容するフィルタが備えられている請求項７に記載の培養容器。