JP2005525308A - 経口インスリン療法 - Google Patents

Abstract

インスリン並びに血流への治療有効量のインスリン輸送を促進し及びインスリン反復投与に関連した血管疾患の発生をより低くする送達物質を含有する、糖尿病治療を目的とした患者へ経口投与のための医薬剤形が明らかにされる。更に糖尿病治療のために、治療有効量で患者の胃腸管からのインスリンの吸収を促進する適当な送達物質と一緒の、インスリンの患者への経口投与による、インスリンの慢性投薬に関連した疾患の望ましくない発生を減弱する方法が明らかにされている。

Description

発明の技術分野
本発明は、血流への、治療的タンパク質の治療有効量の経口送達に関する。本発明は更に、治療様式の一部としての、活性物質としてのタンパク質の経口投与に関する。本発明は更に、糖尿病の治療のための治療有効量のインスリンの経口投与に関する。本発明は更に、糖尿病治療のための血流への治療有効量のインスリン輸送を促進する経口投与のための送達物質及びインスリンの組成物に関する。本発明は更に、経口投与のためのインスリンを含有する組成物の調製法を提供する。

本発明は更に、インスリン療法に関連している血管系に対する有害作用を低下する方法に関する。より詳細に述べると、本発明は、全身性高インスリン血症に関連した疾患の発生を低下する方法に関する。本発明は、更に糖尿病へ慢性ベースで(chronic basis)投与可能である経口医薬用量、ひとつにはそのような結果を達成するものにも関する。

発明の背景
タンパク質、炭水化物及び他の生物学的分子(「生物学的巨大分子」)は、科学及び技術の多種多様な領域における用途が増加していることが認められる。例えばタンパク質は、医薬品、ワクチン及び獣医用製品の分野における活性物質として利用されている。残念なことに、生物学的巨大分子の医薬組成物中の活性物質としての使用は、その活性物質が必要とされる場所への通路の天然障壁の存在により、厳しく制限されることが多い。このような障壁は、皮膚、脂質二重層、粘膜、厳しいpH条件及び消化酵素を含む。

活性物質の経口送達は、安全性及び簡便性の観点から並びに経口送達はインスリン送達の生理的様式を模写するので、特に望ましい投与経路である。加えて経口送達は、反復投与用バイアルよりもより正確な投薬を提供し、及びしばしば反復皮下注射に付随する不快感を最小化又はなくすことができる。
生物学的巨大分子をうまく経口送達するには多くの障害がある。例えば生物学的巨大分子は大きく、及び天然には両親媒性である。より重要なことは、生物学的巨大分子の活性のあるコンホメーションは、温度、酸化剤、pH、凍結、振盪及び剪断応力などの、様々な環境因子に対して感受性があることがある。創薬のための生物学的巨大分子を活性物質として含む経口送達システムを計画する上で、これらの複雑な構造及び安定性の要因が考慮されなければならない。

加えて一般に、生物学的巨大分子が患者へ投与され及びその天然の生物学的機能を発揮することが予想されるような医学的及び治療的適用に関して、送達ビヒクルは、特定の患者又は疾患プロセスの必要性と合致した速度で、活性分子を放出することができなければならない。

ある特定の生物学的巨大分子であるホルモンインスリンは、膵臓による、より詳細に述べると膵臓組織の主な型であるβ細胞(ランゲルハンス島)によるその放出を通じて、血液グルコースレベルの正常な調節に寄与する。インスリン分泌は、正常な対象において、絶食時及び摂食時の両方において血液中のグルコースの安定した濃度を提供する調節されプロセスである。糖尿病は、膵臓が、グルコースレベルを制御可能なレベルでインスリンを放出しない病態である。糖尿病は、ふたつの型に分類される。第一の型は、インスリン依存性で及び通常若年者に出現する糖尿病である。膵島細胞は主に自己免疫破壊によりインスリン産生を停止し、患者は、失われたホルモンを自己注射しなければならない。これらの1型糖尿病患者は、全糖尿病患者においては少数である(全糖尿病集団の最大10％)。第二の糖尿病型(2型)は、インスリン非依存型糖尿病であり、これはインスリン抵抗性及び不充分なインスリン分泌の組合せにより引き起こされる。これは西欧において最も一般的な糖尿病型である。米国を含む世界各国の成人人口の8％近くが、2型糖尿病を有し、これらの患者の約30％が、膵臓消耗に付随し、生涯を通じていつの時点かでインスリンを使用する必要があるであろう。

糖尿病は、米国における第六の死因であり、1997年には、193,000名を超える患者が死亡している。しかし糖尿病は、最終的には心臓血管疾患のような、他の原因で説明される実質的に多くの死亡の原因となっているので、この数は過小評価されている。糖尿病の合併症は、集団の死亡率の主な原因である。例えば糖尿病性網膜症は、20歳から74歳の成人の失明の主要原因であり、及び糖尿病性腎疾患は、腎疾患の最終病期の全ての新規症例の40％を説明している。糖尿病は、米国における四肢切断の第一の原因である。心臓疾患及び卒中は、糖尿病の成人において、糖尿病でない成人よりも2〜4倍の頻度で発生する。糖尿病は、妊娠時には特別な問題点を引き起こし、及び先天性奇形の割合は、糖尿病女性の子供は5倍高い。

真性糖尿病の主な死因は、長期間の微小-及び巨大-血管の疾患である。心臓血管疾患は、II型糖尿病患者の死亡の最大80％に寄与している。例えば、Kirpichnikovら、Trends Endocrinol Metab、12: 225-30 (2001)；Garciaら、Diabetes、23: 105-11 (1974)；Haffnerら、N Engl J Med、339: 229-34 (1998)；Sowers、Arch Intern Med、158: 617-21 (1998)；Khaw, K. T.ら、Bmj、322: 15-8 (2001)を参照のこと。糖尿病は、冠動脈疾患のリスクが、2〜4倍高く、卒中又は心筋梗塞の生存患者のそれと等しい。例えば、Haffnerら、N Engl J Med、339: 229-34 (1998)；Sowers、Arch Intern Med、158: 617-21 (1998)を参照のこと。この高血圧性心筋症の増加と一緒にされた冠動脈疾患のリスク増大は、うっ血性心不全のリスク増大を明示する。Strattonら、Bmj、321: 405-12 (2000)；Shindler, D. M.ら、Am J Cardiol、77: 1017-20 (1996)。これらの血管合併症は、ニューロパシー、網膜症及び末梢血管疾患につながる。Kirpichnikovら、Trends Endocrinol Metab、12: 225-30 (2001)参照。糖尿病患者におけるこのような血管疾患の有病率を低下する糖尿病治療が、必要である。

糖尿病の慢性合併症に対する厳密な血糖管理の有益な作用は、臨床診療において広範に受入れられている。しかし最近になってやっと、上昇した血液グルコースレベルは、糖尿病の長期合併症の直接的原因であることが確固として確立された。Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)及びUniteed Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS)は両方共、できる限り正常値に近いレベルでの血液グルコースの管理は、糖尿病性網膜症、ネフロパシー、ニューロパシー、及び微小血管疾患の発症を防止及び遅延することを示した。II型糖尿病の薬物療法は、経口剤が失敗するならば、及びそのような場合には、経口糖尿病治療薬及びインスリンからなる。I型糖尿病のインスリン療法は必須であり、及び内因性インスリン欠乏を外因性インスリン供給で代替することが意図されている。インスリンは、胃腸管から吸収されないタンパク質性薬物(MW約6000Da)であるので、通常これは、皮下注射により非経口投与される。

更に増加しつつある糖尿病集団への、有用な形での、生物学的に利用可能な未修飾のヒトインスリン提供の問題点は、ほぼ100年間、医師及び科学者を悩ませている。この小タンパク質の安定性及び生物学的送達の問題点のいくつかを解決するために、多くの試みが成されている。ほとんどの糖尿病患者は、毎日の皮下注射によりインスリンを自己投与している。しかし不便さ、患者の受容性不良、服薬遵守及び食後の必要量に食後のインスリンアベイラビリティを合致することの困難さのような、毎日の反復注射の限界は、インスリン療法の欠点としてよく知られているものの一部である。

糖尿病の慢性合併症に関する厳密な血糖管理の有益な作用を明らかにする試験にもかかわらず、医師は、特に本疾患の早期において、攻撃的(aggressive)インスリン療法を特に続行せず、並びにこのことは、臨床診療において広く受入れられている。厳密な血糖管理を達成するまだ解決されていない挑戦は、ひとつには、インスリン投与の利用可能な皮下経路及び低血糖症の恐れという欠点によるものである。先に示した毎日の反復注射の実践上の限界に加え、通常利用可能なインスリン投与の皮下経路の欠点は、一般に糖尿病に随伴した慢性合併症の多くに関連した不適切な血糖管理を生じている。上昇したインスリンの全身レベルは、増大したグルコース取込み、グリコーゲン合成、解糖、脂肪酸合成及びトリグリセロール合成につながり、これはより多くのグルコースの活用をもたらす重要な遺伝子の発現につながっている。

インスリン送達の分野において、反復投与が患者の生涯を通じて基本的に毎日必要である場合、生理的臨床的活性及び安定性を変更せず、並びに注射を必要としないために、タンパク質三次構造を維持するインスリン組成物を作出することが望ましいであろう。経口投与可能な、例えば適当な濃度で胃腸管から吸収されるインスリン組成物を提供することも望ましく、その結果インスリンは、経口投与後に生物学的に利用可能であり生体活性がある。経口吸収は、門脈循環への直接送達を可能にする。

注射を必要としないインスリンを提供する方法は、薬物送達における目標である。胃腸管におけるインスリン吸収は、その大きいサイズ及び酵素分解により妨げられている。インスリンのような薬物(これは通常、例えば、胃腸管からの不充分な吸収のために、経口投与可能でない)の経口医薬製剤を作成することは望ましく、この製剤は、望ましい治療作用を提供するのに十分な吸収及び薬物動態／薬力学特性を提供するであろう。

インスリンは、生物学的巨大分子の効果的経口薬物送達システムをデザインする際に、当該技術分野において直面している問題点を例証している。インスリンの薬効(medicinal)特性は、多くの技術により容易に変更することができるが、その生理化学特性及び酵素消化の受け易さは、商業的に実行可能な経口又は代わりの送達システムのデザインを不可能にしている。
従って患者が、それ自身、血管疾患のリスク(これは通常、先に考察したような慢性インスリン治療に関連している)を増加し得る、全身性高インスリン血症に曝されないような、インスリンを必要とする患者へのインスリン投与法が必要である。別の表現をすると、血管合併症及び他の有害な作用の発生を減少するために全身性高血糖症の欠点を伴わずに、糖尿病を治療する組成物及び方法を提供することが望ましい。

発明の概要
例えば、その製剤は治療に有効である薬物の胃腸管からの不充分な吸収のために、経口投与可能とみなされない薬物の有用な経口医薬製剤を提供することは、本発明のひとつの目的である。
更に治療に有効である経口投与のためのインスリンの有用な医薬製剤を提供することは、本発明のひとつの目的である。
更に、例えば薬物の胃腸管からの不充分な吸収のために、経口投与可能とみなされない薬物と共に経口投与することができる送達物質を提供し、その結果インスリンのような薬物が、胃腸管から適量吸収され、望ましい治療的作用を提供することは、本発明のひとつの目的である。

経口投与のための送達物質及びインスリンを含有する組成物を提供することも、本発明の目的である。
糖尿病治療のため、耐糖能障害治療のため、グルコースホメオスタシスを達成する目的のため、初期糖尿病治療のため、後期糖尿病治療のため、及び／又はI型糖尿病患者について代替として利用するために、血流への治療有効量のインスリン輸送を促進する経口投与のための送達物質及びインスリンの組成物を提供することは、本発明の目的である。
経口投与のためのインスリン及び送達物質を含有する組成物を調製する方法を提供し、望ましい治療的作用を提供する経口的に投与可能な単位用量を生じることは、本発明の目的である。

単独では吸収不良などにより経口的に投与可能とみなされない薬物の経口単位剤形の調製を促進する量で利用することができる送達物質(複数)を提供し、望ましい治療的作用を提供する経口的に投与可能な単位用量を生じることは、本発明の目的である。
従来のインスリン療法の慢性全身性高インスリン血症に関連した病態のリスクを低下することは、本発明の目的である。
糖尿病における非経口インスリン療法により引き起こされた慢性全身性高インスリン血症に関連した血管疾患の発生を低下する方法を提供することは、別の本発明の目的である。
糖尿病における非経口インスリン療法により引き起こされた慢性全身性高インスリン血症に関連した血管疾患の発症時を遅延することは、別の本発明の目的である。
糖尿病における非経口インスリン療法により引き起こされた慢性全身性高インスリン血症に関連した血管疾患の重症度を低下することは、本発明の別の目的である。

高インスリン血症状態に対する門脈以外の血管の曝露を低下することは、本発明の別の目的である。
インスリン治療に対する反応を生じる複合した一連の全身プロセスを減弱することも、本発明の別の目的である。
糖尿病の治療に有効な治療を提供すると同時に、全身血液インスリン濃度を低下することができる方法及び医薬製剤を提供することは、本発明の別の目的である。
真性糖尿病に関連した血管合併症及び結果的状態(例えば、網膜症、ニューロパシー、ネフロパシーなど)の事例及び重症度の低下を補助することができる方法及び医薬製剤を提供することは、本発明の更なる目的である。

インスリン治療の間のインスリンに対する全身の血管系の曝露を低下することは、本発明の更なる目的である。
ニューロパシー、網膜症、末梢血管疾患、心臓合併症及び脳血管合併症につながる、糖尿病におけるインスリン療法に関連した巨大-及び微小-血管合併症の発生及び／又は重症度を低下することは、本発明の更なる目的である。

前述の目的及び他の目的に従い、本発明は、ひとつには、ヒト糖尿病患者における血液グルコース濃度の低下を、それらの患者における皮下インスリン注射と同等に達成する未修飾インスリンの用量を含有すると同時に、皮下注射により得られた末梢血インスリン濃度と比較して、急性、亜急性及び慢性の状態で末梢血循環のインスリンのより低い(例えば、20％又はそれよりも多く)総用量を提供する経口固形剤形に関する。
本発明は更に、ひとつには、ヒト糖尿病患者への経口投与後に血液グルコースの治療に有効な低下を達成し、及び生理的(門脈／末梢)勾配を維持する未修飾インスリンの用量を含有し、並びにある態様においては、約2.5:1〜約6:1、及び好ましくは約4:1〜約5:1の門脈インスリン濃度の末梢血インスリン濃度に対する比を提供する経口固形剤形にも関する。

本発明は更に、ひとつには、ヒト糖尿病患者への経口投与後の血液グルコースの治療に有効な低下を達成する未修飾インスリンの用量を含有する経口剤形、該患者への経口投与後約0.25〜約1.5時間の時点でインスリンt_maxを提供する経口固形剤形、該剤形の経口投与後約2時間以内に生じる該インスリン用量により引き起こされる血液グルコース濃度の少なくとも約80％の低下にも関する。
本発明は更に、ひとつには、治療有効量の未修飾インスリンを含有する経口剤形に関し、該剤形は、ヒト糖尿病患者への食前経口投与時に、該患者における食後の平均血漿グルコース濃度が、該患者における平均ベースライン(絶食時)血漿グルコース濃度(十分なインスリンが不足)と比べ、経口投与後最初の1時間で低下されることを引き起こす。

本発明は更に、ひとつには、治療有効量の未修飾インスリンを含有する経口剤形に関し、食事が、該患者により、該剤形の経口投与の約1時間半以内に摂取される場合、該経口剤形は食前経口投与時に、該患者における平均ベースライン(絶食時)血漿グルコース濃度と比べ、経口投与後の最初の1時間に約40％を超えて変動しない(及びより好ましくは30％を超えない)平均血漿グルコース濃度を提供する。
前述の本発明の経口剤形の好ましい態様において、経口剤形は固形であり、及び好ましくは、ゼラチンカプセル剤内に組込まれて又は錠剤に含まれて提供される。
ある好ましい態様において、剤形に含まれる未修飾インスリンの用量は、一般に認められた変換係数26.11単位/mgを基に、約50単位〜約600単位(約2〜約23mg)、好ましくは約100単位(3.8mg)〜約450単位(15.3mg)インスリンであり、及び最も好ましくは約150単位(5.75mg)〜約300単位(11.5mg)である。

ある好ましい態様において、本発明の剤形は、経口投与後約0.1〜約1.5時間、及びより好ましくは約0.25〜約0.5時間で、インスリンt_maxを提供する。ある好ましい態様において、インスリンt_maxは、組成物の経口投与後約100分未満で生じ、好ましくは約45分未満、より好ましくは約40分未満で、及び更により好ましくは組成物の経口投与後約22分で生じる。ある好ましい態様において、組成物は、経口投与後約 0.25〜約1.5時間、より好ましくは約0.75〜約1.0時間に、グルコース低下のt_maxを提供する。ある好ましい態様において、グルコース低下のt_maxは、組成物の経口投与後好ましくは約120分未満、より好ましくは約80分未満、及び最も好ましくは約45分未満で生じる。
本発明のある好ましい態様において、これらの剤形は、インスリンの門脈循環(胃粘膜を通じた吸収により)への送達を開始し、約30分以内にピークレベルに到達する。

前述の剤形のある態様において、送達物質が存在しないならば、未修飾インスリンの用量は、望ましい作用を提供するために経口的に投与される場合、胃腸管から適切に吸収されることはない。ある好ましい態様において、送達物質が存在しないならば、インスリン用量は、望ましい治療的作用を提供するためにヒト患者へ経口的に投与された場合、十分には吸収されないが、該用量は、別の投与経路で該患者に投与される場合には、望ましい治療的作用を提供する。このような態様において本発明は、更に未修飾インスリンの用量を、該インスリンの吸収を促進し、その結果該インスリン用量の治療有効量がヒト糖尿病患者の胃腸管から吸収されるのに有効な量の医薬として許容できる送達物質と共に含有する経口剤形を示す。

ある好ましい態様において、医薬組成物は、該送達物質を約1mg〜約800mg、好ましくは約50〜約600、より好ましくは約100〜約400、最も好ましくは約200含有する。ある態様において、該組成物は、ピーク血漿送達物質濃度C_maxが約1,000〜約150,000ng/ml、及びt_maxが経口投与後約0.25〜約1.5時間、及びより好ましくは約0.25〜約0.75時間、最も好ましくは0.5時間を提供する。

本発明の目的のために、好ましい送達物質は、化学命名法により、4-[(4-クロロ, 2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]酪酸と同定される。ある好ましい態様において、この送達物質はナトリウム塩であり、好ましくは一ナトリウム塩である。あるいは、同じ化合物は、別の命名法により、N-(4-クロロサリチロイル)-4-アミノ酪酸一ナトリウム、又は短縮名「4-CNAB」と同定される。
本発明は更に、ひとつには、先に及び更に本願明細書の項として説明された剤形の1種又は複数の単位用量を投与することを含む、ヒトにおける糖尿病治療法に関する。
本発明は更に、ひとつには、慢性ベースでの、先に及び更に本願明細書の項として説明された剤形の1種又は複数の単位用量を投与することを含む、ヒトにおける耐糖能障害、グルコースホメオスタシス達成、糖尿病初期病期、及び糖尿病後期病期の治療法に関する。

本発明は、経口投与された場合には望ましい治療的作用を提供するのに十分には吸収されないが、別の経路で投与された場合には望ましい治療的作用を提供する活性物質(すなわち、インスリン)で、哺乳類を経口的に治療する方法であり、該活性物質を、胃腸管からのインスリンの吸収を促進する送達物質と共に経口投与することを含み、1種又は複数の前述の更なる特徴を有する方法にも関連している。

本発明は更に、未修飾インスリンの治療に有効な経口投与可能な単位用量を提供する方法であり、未修飾インスリン約2〜約23mgを、該インスリンのヒト糖尿病患者の胃腸管からの吸収を促進する医薬として許容できる送達物質約100〜約600mgと一緒にすること、及び該単位用量をヒト糖尿病患者経口投与し治療的作用を提供することを含む方法に関連している。好ましい態様において、単位用量の総質量は約102mg〜約800mgである。

本発明は、ひとつには、投与量の未修飾インスリンを胃腸管からの投与量のインスリンの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を、ヒト糖尿病患者へ慢性ベースで経口投与し、インスリン皮下注射により達成された血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下の全身の血液インスリン濃度と比べて低下された血液グルコース及び血漿インスリン濃度の治療に有効な低下を提供することを含む、ヒト糖尿病患者を治療する方法にも関する。

本発明は、インスリンの慢性投与に関連した1種又は複数の病態の発生及び／又は重症度を低下する方法であり、未修飾インスリンの投与量及び該未修飾インスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質の有効量を含有する治療に有効な投与量の(好ましくは固形)医薬組成物を慢性ベースで経口投与することによりヒト糖尿病患者を治療し、結果的に該医薬組成物が、ヒト糖尿病患者集団において平均血液グルコース濃度の同等の管理を達成するのに有効量のインスリンの慢性皮下投与により提供される平均全身血液インスリン濃度と比べて慢性ベースで低下される糖尿病患者において、平均血液グルコース濃度及び全身血液インスリン濃度の治療的効果的管理を提供することを含む方法にも関する。

本発明は更に、糖尿病を治療し及びインスリンの慢性投薬に関連した全身性高インスリン血症の発生を低下する方法であり、投与量のインスリン及び投与量のインスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質を慢性ベースで糖尿病患者へ経口投与し、ヒト糖尿病患者集団において同等の低下及び／又は管理を達成するのに有効量のインスリン皮下注射により提供された平均全身血液インスリン濃度と比べて低下した糖尿病患者における血液グルコース及び平均全身血液インスリン濃度の治療に有効な低下及び／又は管理を提供することを含む方法に関する。
皮下インスリンが投与された患者から得たインスリン濃度平均値の決定は、当業者に周知である。

下記の用語は、本出願を通じ、以下に定義されたように使用される：
糖尿病患者--糖尿病型に罹患したヒトを意味する。
IGT--耐糖能障害を意味する。
糖尿病--特に別記しない限りは、1型及び2型糖尿病を包含するとみなす。
生物学的巨大分子--タンパク質及びポリペプチドのような生物学的高分子。本出願を目的とし、生物学的巨大分子は巨大分子とも称される。
送達物質--治療的物質の経口送達において有用な担体化合物又は担体分子を意味する。「送達物質」は、「担体」と互換的に使用することができる。
インスリンの治療有効量--投薬期間中、絶食状態又は摂食状態で有効のいずれかで、ヒト糖尿病患者の血液グルコース濃度の臨床的に有意な管理を達成するのに十分な、本発明の経口剤形に含有されたインスリン量。
送達物質の有効量--治療有効量の薬物の胃腸管からの吸収を促進する送達物質の量。

有機溶媒--液体ポリマー及びそれらの混合物を含む、非-水性を起源とするいずれかの溶媒。本発明に適した有機溶媒は以下を含む：アセトン、メチルアルコール、メチルイソブチルケトン、クロロホルム、1-プロパノール、イソプロパノール、2-プロパノール、アセトニトリル、1-ブタノール、2-ブタノール、エチルアルコール、シクロヘキサン、ジオキサン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、ジクロロエタン、ヘキサン、イソオクタン、塩化メチレン、tert-ブチルアルコール、トルエン、四塩化炭素、又はそれらの組合せ。
ペプチド--中間の分子量に対する小さいポリペプチド、通常2個又はそれよりも多いアミノ酸残基であり、必ずしもではないがより大きいタンパク質の断片を表わすことが多い。
タンパク質--炭素、水素、酸素、窒素及び通常は硫黄を含み、ペプチド連結により結合されたアミノ酸鎖で構成された、複雑な高度の高分子。本出願におけるタンパク質は、糖タンパク質、抗体、非-酵素タンパク質、酵素、ホルモン及びペプチドを意味する。タンパク質の分子量の範囲は、1000ダルトンのペプチドから、600〜1000キロダルトンの糖タンパク質まで含む。
再構成--組成物の溶解又は適当な緩衝液もしくは医薬組成物中の組成物。

単位剤形--ヒト及び動物対象に適し、及び当該技術分野において公知であるように個別に包装された、物理的に孤立したユニットを意味する。本発明の目的のために、治療有効量のインスリンを含有する本発明の剤形は、治療的作用を達成するために1個又は複数の単位用量(例えば、錠剤、カプセル剤)を含み得ることが企図されている。
未修飾インスリン--米国特許第6,309,633号に開示されたもののようなオリゴマーと複合しない、及び／又は、米国特許第5,359,030号；第5,438,040号；及び／又は第5,681,811号に開示されたもののように両親媒性の修飾が施されていない、医薬として許容できる方法で又は医薬として許容できる給源から調製された、インスリンを意味する。

本願明細書に使用される語句「同等の治療に有効な低下」とは、インスリン投与の第一の方法(例えば、患者(複数)におけるインスリンの経口投与による)により達成された血液グルコース濃度の最大低下は、同じ患者(複数)又は血液グルコースレベルの同じ低下を必要とする別の患者における第二の方法(例えば、皮下注射)による投与後の血液グルコース濃度の最大低下から、20％を超えない、好ましくは10％を超えない及び更により好ましくは5％を超えない差であることを意味する。
本願明細書において使用される用語「AUC」は、完全な投薬期間、例えば24-時間期間にわたり、台形公式により計算された、血漿濃度-時間曲線の下面積を意味する。
本願明細書において使用される用語「C_max」は、投薬期間内に到達される薬物の最高血漿濃度である。
本願明細書において使用される用語「t_max」は、薬物の血漿濃度が投薬期間内にC_maxに到達する剤形の投与後に経過した期間である。

用語「反復投与量」は、ヒト患者が、その組成物の投薬期間に、薬物組成物の投与量を少なくとも2回受け取ることを意味する。
用語「単回投与量」は、ヒト患者が、薬物組成物の単回投与量を受取り、並びに薬物血漿濃度が安定状態に到達しないことを意味する。
特に「単回投与量」又は「安定状態」と記さない限りは、本願明細書に開示され及び特許請求された薬物動態パラメータは、単回投与量及び安定状態の両方を包含している。
用語「平均」は、薬物動態値(例えば、平均t_max)の前に記された場合は、特記しない限りは、その薬物動態値の相加平均値を意味する。

本願明細書において使用される用語「生物学的利用率」は、薬物又は物質が吸収又はさもなければ体の治療部位で利用可能になる程度又は比(％)を意味する。これは、下記式により計算される：
相対生物学的利用率(％)＝(SC投与量／経口投与量)×(AUC_INS経口／AUC_INS SC)×100
本願明細書において使用される用語「生体効力」は、薬物又は物質が、体の治療部位に対し有効である程度又は比(％)を意味する。これは、下記式により計算される：
相対生体効力(％)＝(SC投与量／経口投与量)×(AUC_GIR経口／AUC_GIR SC)×100

本願明細書において使用される用語「F_rel」は、投与量補正した経口インスリンAUCの、投与量補正したSCインスリンAUCとの比較により計算したインスリンの相対生物学的利用率を意味する。
K_elは、対数濃度、対、時間曲線の最終直線部分の線形回帰により計算された最終相消失速度定数である。
本願明細書において使用される用語「AUC_(0-x)」は、投与後0時からx時までの線形台形総和を用いる、血漿濃度-時間曲線下面積を意味する。
本願明細書において使用される用語「AUC_(0-t)」は、投与後0時からt時までの線形台形総和を用いる、血漿濃度-時間曲線下面積を意味し、ここでtは最終測定可能な濃度(C_t)の時点である。
本願明細書において使用される用語「AUC_(0-inf)」は、0時から無限大までの血漿濃度-時間曲線下面積を意味し、AUC_(0-inf)＝AUC_(0-t)＋C_t/K_elである。

本願明細書において使用される用語「AUC_%Extrap」は、外挿により得られた総AUC_(0-inf)の百分率を意味する。
本願明細書において使用される用語「AUEC_(0-x)」は、投与後0時からx時の濃度までの線形台形総和を用いて計算された、作用-時間曲線下面積を意味する。
本願明細書において使用される用語「AUEC_(0-t)」は、投与後0時からt時の濃度までの線形台形総和を用いて計算された、作用-時間曲線下面積を意味し、ここでtは、最後の測定可能な作用(E)の時点である。
本願明細書において使用される用語「AURC_(0-x)」は、投与後0時からx時の濃度までの線形台形総和を用いて計算された、反応-時間曲線下面積を意味する(ベースライン減算したAUEC)。
本願明細書において使用される用語「AURC(0-t)」は、投与後時間0時からt時の濃度までの線形台形総和を用いて計算された、反応-時間曲線下面積を意味し(ベースライン減算したAUEC)、ここでtは、最後の測定可能な反応(R)の時点である。

本願明細書において使用される用語「C^b」は、低血糖症のための介入前に観察された最大血漿インスリン濃度を意味する。
本願明細書において使用される用語「CL/F」は、投与量／AUC_(0-inf)として計算された、見かけの全身のクリアランスを意味する。
本願明細書において使用される用語「E^b」は、低血糖症の介入前に観察された最大作用(ベースライン減算した)を意味する。
本願明細書において使用される用語「E_max」は、観察された最大作用(ベースライン減算した)を意味する。

本願明細書において使用される用語「MRT」は、血漿濃度-時間曲線(AUMC)の最初の瞬間の下面積及び血漿濃度-時間曲線下面積の比(AUMC)/AUC_(0-inf)として計算される平均滞留時間を意味する。
本願明細書において使用される用語「R_max」は、観察された最大反応(総反応)、すなわち、最小グルコース濃度を意味する。
本願明細書において使用される用語「R^b」は、低血糖症介入前に観察された最大反応(総反応)を意味する。
本願明細書において使用される用語「t^b」は、低血糖症介入前にインスリン/グルコース血漿濃度に到達する時間を意味する。
本願明細書において使用される用語「t^c」は、低血糖症介入前にベースラインからのグルコース濃度変化に達する時間を意味する。

本願明細書において使用される用語「t_Rmax」は、最大反応に達する時間を意味する。
本願明細書において使用される用語「t_Emax」は、最大作用の時間(内挿せずに得られた)を意味する。
本願明細書において使用される用語「t_1/2」は、ln(2)/K_elとして計算された最終相半減期を意味する。
本願明細書において使用される用語「V_d/F」は、(CL/F)/K_elとして計算された見かけの分布容積を意味する。

本願明細書において使用される用語「ある(a、an、the)」は、特に文脈が明確に指摘しない限りは、複数の意味を含む。従って例えば、「ある(a)分子]は、そのような分子の1種又は複数を含み、「ある(a)試薬]は、そのような試薬の1種又は複数を含み、「ある(an)抗体]の表現は、そのような抗体の1種又は複数を含み、並びに「ある(the)方法]の表現は、本願明細書に説明された方法を修飾又は代替することができる当業者に公知の同等の工程及び方法を含む。

特に定義しない限りは、本願明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本願明細書に説明されたものと類似した又は同等のあらゆる方法、組成物、試薬、細胞を、本発明の実践又は試験において使用することができ、好ましい方法及び材料は、本願明細書に説明されている。本願明細書において言及された全ての刊行物は、参考文献がそれと共に引用された具体的情報を説明及び明らかにするために、全ての図面、グラフ、等式、例証図、及び描画を含み、本願明細書に組入れられている。

先に考察した刊行物は、本出願の出願日前に明らかになったものについてのみ提供される。本発明は、先行する発明によるそのような開示よりも日付が早く権利が付与されないことを承認するものとして構成されてはいない。本説明を通じ、示された好ましい態様及び実施例は、本発明を制限するものよりも、むしろ例示するものとしてみなされるべきである。

詳細な説明
高インスリン血症(上昇したインスリンの血液濃度)は、通常の送達の生理的経路と一致しない場所(及び方式)でのインスリンの投与により引き起こされる。正常な健常者において、インスリンは、膵臓から門脈へ放出され、これはインスリンを肝臓へと移動する。肝臓は、門脈循環から受け取るインスリンの大部分を利用する。グルコースは、ヒトにおけるインスリン分泌の主な刺激である。グルコースは、促進輸送によりβ細胞に進入し、次にグルコキナーゼによりリン酸化される。グルコキナーゼの発現は、主にグルコース代謝の調節に関与した細胞及び組織、例えば肝臓及び膵臓のβ細胞に限定されている。糖質がリン酸化及び引き続きの解糖を受ける能力は、それらがインスリン放出を刺激する能力に密に相関している。遊離モノマーとしての血中のインスリン循環、及びその分布容積は、細胞外液の容量に近似している。正常な健常者において、絶食状態下で、門脈血液中のインスリン濃度は、例えば約2〜4ng/mlであるのに対し、インスリンの全身(末梢)濃度は、例えば約0.5ng/mlであり、これは例えば5:1の比に置換えられる。

インスリンは、非経口的に、通常皮下注射により投与される。インスリンを皮下注射で受け取っている糖尿病患者において、この比は、約0.75:1に変化する。従ってこのような糖尿病患者において、肝臓は、血液グルコースを適切に制御するのに必要な濃度のインスリンを受け取らない。

インスリン経口投与により、門脈及び全身循環中の正常インスリンレベルを模倣することは、当該技術分野においてまだ解決されていない目標である。本発明により、ヒト糖尿病患者における門脈(未修飾の)インスリン濃度の全身(未修飾の)インスリン濃度に対する比の近似を、通常の健常者において得られる値に近づける。本発明の経口剤形の慢性投与は、皮下的に投与されたインスリンの同等の有効量で得られるものよりも、長期に渡るより高い門脈インスリン濃度及びより低い全身インスリン濃度を生じる(すなわち、これは、血液グルコースレベルの同様の制御を提供する)。本発明により、高インスリン血症のより低いレベルが得られ、例えば全身インスリン濃度は、同等の作用のインスリン皮下投与と比べ、少なくとも約20％より低い。本発明に従うインスリン経口投与によるインスリンレベルの一過性のピークは、血管疾患に関連しているとは考えられない。

典型的には、インスリンは、恐らくそのサイズ及び酵素分解の可能性のために、胃腸管を通じ相当程度には吸収されない。本発明は、一般に当業者に経口経路により投与可能であるとは考えられていない、インスリンのような活性物質の経口送達の送達物質として有用である、医薬組成物を提供する。このような組成物は、経口投与された場合に、生体利用可能で及び胃腸粘膜を通じ吸収可能なインスリンの作成を利用する。

正常な健常ヒト対象において、インスリン分泌は、対象が食事を摂ったかどうか(すなわち、絶食状態及び摂食状態)に関わりなく、安定したグルコース血液濃度を提供する厳密に調節されたプロセスである。インスリンは、膵ランゲルハンス島のβ細胞により分泌され、及び以下の3種の基本的作用を有する：グルコース代謝速度の増強；減少された血液グルコース濃度；及び、組織における増加されたグリコーゲン貯蔵。真性糖尿病は、インスリン抵抗性及び膵β細胞の「脱落(burn out)」の両欠損から生じる。インスリンは、体の多くの細胞、特に骨格筋及び脂肪組織の細胞の膜を通じたグルコース輸送を促進(及び割合を増加)する。非常に基本的意味で、肝臓は、以下のように、グルコース代謝において重要な役割を果たし：過剰なインスリン、過剰なグルコース、又は両方の存在下で、肝臓は大量のグルコースを血液から取込み；並びに、インスリン非存在下又は血液グルコース濃度が非常に低く低下した場合、肝臓は、グルコースを血液へと戻す。従って肝臓は、高値上昇から又は低値降下から血液グルコース濃度を維持することにより、重要な血液グルコース緩衝機構として作用する。グルコースの存在が惹起された場合(例えば、固形食摂取後)、インスリン分泌は二相性であり：第一相は、1〜2分後にピークに達し及び短命であるのに対し、分泌第二相は、遅れて始まるがより長い持続期間を有する。従って、血液グルコース濃度がベースレベル(例えば、100mg/100mlの血液)を上回って上昇するように、インスリン分泌は、通常ヒト対象において、急激に上昇し、及びインスリン分泌の停止も急激であり、血液グルコース濃度が絶食レベルに低下した後数分以内に生じる。インスリン放出が増加したグルコースレベルにより刺激される正確な機序は、完全には理解されていないが、グルコースの膵β細胞への進入及びその代謝は必要である。

糖尿病のインスリン治療は、典型的には、患者が正常な糖代謝を有するのに十分なインスリンを投与するような様式で実現される。例えば、糖尿病患者は、約24時間作用維持する、長期作用性インスリンのひとつの単回投与量を毎日皮下的に投与することができる。例えば5〜6時間の作用持続期間を有する標準インスリンの追加量を、食事時など、患者の血液グルコースレベルを高く上昇する傾向がある時に、日に数回皮下的に投与することができる。
本発明の経口インスリン製剤は、投与の容易さ、無痛投与、及び改善された患者の服薬遵守の可能性の点で、現在当該技術分野において公式(state)である皮下投与されたインスリンに勝る有利な結果を提供する。本発明の経口インスリン製剤の投与により、膵臓によるインスリン分泌の第一(初期)相時に生じるインスリンの血液レベルを、刺激することができる。インスリン分泌の第一相は、短期間ではあるが、代謝事象(食事)を前向きに肝臓が点火することにおいて重要な役割を有する。皮下投与されたインスリンは門脈循環を受けないので、この結果は、皮下投与されたインスリンでは不可能である。

従って、本発明のある好ましい態様において、本発明の経口インスリン製剤は、食事時に、好ましくは固形食摂取の少し前(例えば、約0.5時間前)に患者へ投与することができ、その結果インスリンレベルは、食事時にピークに達する。ある好ましい態様の更なる利点は、比較的短期作用性インスリン(例えば、添付の実施例において報告された臨床試験において投与されるカプセル剤調製に使用されるインスリンなど(Eli Lilly社のヒト標準インスリン(Humulin(登録商標)R))の投与は、更に本発明の経口インスリン製剤の経口投与後、約4時間以内に(及び好ましくは約3時間又はそれ未満)に、血液インスリンレベルのベースラインレベルへの回復を生じるであろう。例えば、本発明の経口インスリン製剤によるヒト糖尿病患者の治療により得られたより低いC-ペプチドレベルにより、本発明の経口製剤及び方法は、β細胞-節約(sparing)であるとみなすことができる。

本発明は、インスリン及びインスリン投与に有用な医薬組成物の投与法を提供し、その結果インスリンは、生体利用可能及び胃腸管から吸収可能であり、並びに通常インスリン慢性投薬に関連した血管疾患の発生が減弱される。本発明の送達物質は、インスリンが、胃粘膜を通じ経口的に吸収可能であることができる。本発明の医薬組成物の経口投与後、この送達物質は、胃腸管の粘膜障壁を通過し、血流に吸収され、そこで対象の血漿中に検出することができる。血漿中で測定した血流中の送達物質レベルは、投与量-依存型である。この送達物質は、それと共に(同じ剤形中、又はそれと同時に)、又は連続して(送達物質及びインスリンの両方が、例えば胃のような同じ位置で同時に両方を提供する期間内に投与される限りは、いずれかの順番で)投与されたインスリンの吸収を促進する。以下に明らかにされたように、インスリンの経口投与は、特に本願明細書に明らかにされた送達物質を使用する場合、従来のインスリン投薬、すなわち皮下投与に関連している血管及び他の病態の発生を効果的に低下する。

本発明の好ましい医薬組成物は、当業者に理解されるように、適当な医薬担体又は賦形剤中にインスリン及び送達物質の組合せを含有する。この医薬組成物の送達の手段は、例えば、対象への投与に適した、カプセル剤、圧縮錠剤、丸剤、液剤、容易に再構成するための凍結乾燥した散剤又は懸濁剤である。
本発明の医薬組成物及び方法は、簡便性、許容性及び患者の服薬遵守に加え、多くの利点を提供する。胃腸管で吸収されたインスリンは、門脈へ放出され及び肝臓へ直接運ばれるので、膵臓により分泌されたインスリンの生理を模倣している。門脈循環への吸収は、インスリン分泌を調節する末梢-門脈インスリン勾配を維持する。本発明は、高レベルの全身インスリンを有することなく、低い血液グルコースを達成することができる経口インスリン送達のための医薬組成物及び方法を含む。

好ましくは、この医薬組成物は、活性物質としてインスリンを含む。本願明細書において使用される「インスリン」は、様々な給源からのインスリンを意味する。天然のインスリン及び構造的に類似した生体活性同等物(短期作用性を含むインスリンアナログ及び延長された作用を伴うアナログ)を使用することができる。本発明において有用なインスリンは、哺乳類の様々な種から単離することができる。例えば、ウシ又はブタ膵臓から抽出された動物インスリン調製物を、使用することができる。インスリンアナログ、それらの誘導体及び生体同等物等も、本発明において使用することができる。天然の給源から単離されたインスリンに加え、本発明は、ペプチド合成のようなタンパク質化学技術を用い、化学的に合成されたインスリンを使用することができる。インスリンのアナログも、本発明に適している。

本発明において使用されるインスリンは、これを天然の給源から単離することにより、又はペプチド合成を用いこれを化学的に合成することより、又は細菌又は真核生物細胞において組換えインスリンを生成するための分子生物学の技術を使用することにより、得ることができる。インスリンのアナログも本発明により提供される。他の哺乳類種由来のインスリンも、本発明において使用することができるインスリンの生理型は、結晶及び／又は非晶質固形型を含むことができる。加えて、溶解したインスリンを使用することができる。インスリン合成型を含むが、これらに限定されるものではない別の適当なインスリン型は、米国特許第4,421,685号、第5,474,978号、及び第5,534,488号に開示されており、これらはその全体が本願明細書に参照として組入れられている。

本発明の医薬組成物及び方法において有用な最も好ましいインスリンは、ヒト組換えインスリンである。ヒト組換えインスリンは、当該技術分野において周知の遺伝子操作技術を用いて調製することができる。組換えインスリンは、細菌又は真核生物細胞において生成することができる。ヒト組換えインスリンの機能的同等物は、本発明において有用である。組換えヒトインスリンは、様々な商業的供給業者から得ることができる。例えば、インスリン(亜鉛、ヒト組換え)は、Calbiochem社(サンディエゴ、CA)から購入することができる。あるいは、ヒト結晶性組換えインスリン亜鉛：プロインスリン由来(組換えDNA起源)USP品質は、Eli Lilly社(インディアナポリス、IN)から得ることができる。インスリンアナログ(Insulin Lispro、Insulin Aspart、Insulin Glargine、Insulin Detemirを含むが、これらに限定されるものではない)を含むインスリンのこのような型は全て、本願明細書及び添付された「特許請求の範囲」の目的のために考えられ、用語「インスリン」により包含されていると考えられる。
本発明は、ヒトにおけるインスリン経口投与のための薬物として、組換えヒトインスリン亜鉛及び送達物質の組成物を提供する。

より更なる本発明の態様において、活性物質は、インスリンではないが、代わりに本発明における使用に適した生物学的性質の活性物質であり、これはタンパク質；ポリペプチド；ペプチド；ホルモン；多糖、及び特にムコ多糖の混合物；糖質；脂質；他の有機化合物；並びに、特にそれ自身は胃-腸粘膜を通過しない(又は、これは投与された投与量の一部のみが通過する)及び／又は胃腸管内の酸及び酵素により化学切断を受け易い化合物；又は、いずれかのそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。更に生物学的特徴の活性物質の例は、下記のもの、それらの合成、天然又は組換え給源を含むが、これらに限定されるものではない：成長ホルモン、これはヒト成長ホルモン(hGH)、組換えヒト成長ホルモン(rhGH)、ウシ成長ホルモン、及びブタ成長ホルモンを含む；成長ホルモン-放出ホルモン；α、β及びγを含む、インターフェロン；インターロイキン-1；インターロイキン-2；ブタ、ウシ、ヒト、及びヒト組換えを含む、インスリン、任意に、ナトリウム、亜鉛、カルシウム及びアンモニウムを含む対イオンを有する；IGF-1を含む、インスリン-様増殖因子；未分画ヘパリン、ヘパリノイド、デルマタン、コンドロイチン、低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン及び極超低分子量ヘパリンを含む、ヘパリン；サケ、ウナギ、ブタ及びヒトを含む、カルシトニン；エリスロポイエチン；心房性ナトリウム利尿因子；抗原；モノクローナル抗体；ソマトスタチン；プロテアーゼインヒビター；副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン；オキシトシン；黄体形成ホルモン-放出-ホルモン；卵胞刺激ホルモン；グルコセレブロシダーゼ；トロンボポイエチン；フィルグラスチム；プロスタグランジン；シクロスポリン；バソプレッシン；クロモリンナトリウム(クロモグリケートナトリウム又は二ナトリウム)；バンコマイシン；デスフェリオキサミン(DFO)；その断片を含む、副甲状腺ホルモン(PTH)；抗真菌剤を含む、抗菌剤；ビタミン；これらの化合物のアナログ、断片、擬態もしくはポリエチレングリコール(PEG)-修飾した誘導体；又は、それらの組合せ。

本発明のひとつの態様において、タンパク質活性物質は、10,000ダルトンと等しいかそれ未満である分子量を有する。本発明の別の態様において、タンパク質活性物質は、分子量約6,000ダルトンを有する。本発明の別の態様において、タンパク質活性物質は、10,000ダルトンと等しい又はそれよりも大きい分子量を有する。本発明の別の態様に従い、タンパク質活性物質は、20,000ダルトンと等しいか又はより大きい分子量を有する。更なる態様において、タンパク質活性物質は、30,000ダルトンと等しいか又はより大きい分子量を有する。別の態様に従い、タンパク質活性物質は、40,000ダルトンと等しいか又はより大きい分子量を有する。別の態様に従い、タンパク質活性物質は、50,000ダルトンと等しいか又はより大きい分子量を有する。

血流へのインスリン進入は、血漿グルコースレベルの低下を生じる。従って、インスリンの経口吸収は、本組成物経口投与後の対象の血糖に対する作用を観察により証明することができる。本発明の好ましい態様において、本発明の経口剤形は、インスリンの経口送達を促進し、及びインスリンが血流に吸収された後、本組成物は、経口投与後約20〜約60分で、治療した患者において血液グルコースの最大減少を生じる。別の本発明の態様において、この医薬組成物は、治療した患者において、経口投与後約30〜約50分に、血液グルコースの最大減少を生じる。より詳細に述べると、本医薬組成物は、経口投与後約40分で、治療した患者において、血液グルコースの最大減少を生じる。

胃腸管への進入後血流に吸収されたインスリンにより生じた血液グルコース減少の大きさは、インスリン投与量により変動する。本発明のある態様において、ヒト糖尿病患者は、経口投与後1時間以内に、少なくとも10％の血液グルコースの最大減少を示す。別の態様において、ヒト糖尿病患者は、経口投与後1時間以内に、少なくとも20％の血液グルコースの最大減少を示し、あるいは、経口投与後1時間以内に、少なくとも30％の血液グルコースの最大減少を示す。

血液グルコースの正常レベルは、一日を通じて及び最後の食事からの時間に関連して、若干変動する。本発明のひとつの目的は、24-時間の日周期を通じて正常レベルに近い血液グルコースの達成を促進する、インスリンの経口組成物を提供することである。好ましい本発明の態様において、医薬組成物は、絶食時血液グルコース濃度が約90〜約110mg/dlを達成するのに有効量で、活性物質としてインスリン又はインスリンアナログ及び送達物質を含有する。別の本発明の好ましい態様において、医薬組成物は、絶食時血液グルコース濃度が約95〜約105mg/dlを達成するのに有効量、より好ましくは対象が絶食時血液グルコース濃度約100mg/dlを示すのに有効量で、活性物質としてインスリン又はインスリンアナログ及び送達物質を含有する。

食事を摂った後の時点で、血液グルコース濃度は、摂取した食物に由来した糖質の消化及び血流への吸収に反応して上昇する。本発明は、非常に高レベルの血液グルコースが達成及び／又は維持されることを防止又は制御するインスリンの経口組成物を提供する。より詳細に述べると、本発明は、食事を摂った後、すなわち食後に、正常レベルの血液グルコースの達成を促進する組成物を提供する。本発明の好ましい態様において、医薬組成物は、活性物質としてのインスリン及び送達物質を、食後の血液グルコース濃度約130〜約170mg/dlを達成するのに有効な量で含有する。別の好ましい本発明の態様において、医薬組成物は、活性物質としてのインスリン又はインスリンアナログ及び送達物質を、食後の血液グルコース濃度約140〜約160mg/dlを達成するのに有効量、より好ましくは対象が絶食時血液グルコース濃度約160mg/dl未満を示すのに有効量で含有する。

本発明は、活性物質としてインスリン又はインスリンアナログ及び送達物質を、食前(食事を摂る前)の血液グルコース濃度約95〜約125mg/dlを達成するのに有効量で含有する、経口投与のための医薬組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、活性物質としてインスリン又はインスリンアナログ及び送達物質を、食前血液グルコース濃度約100〜約120mg/dlを達成するのに有効量で含有する、経口投与のための医薬組成物を提供する。
本発明は、活性物質としてインスリン及び送達物質を、午後の期間中正常範囲内の血液グルコース濃度約70〜約120mg/dlを達成するのに有効量で含有する、経口投与のための医薬組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、活性物質としてインスリン又はインスリンアナログ及び送達物質を、午後3時の血液グルコース濃度約80〜約120mg/dlを達成するのに有効量で含有する。

ある好ましい態様において、方法及び医薬組成物は、米国特許仮出願第60/346,746号及び第60/347,312号に開示された薬物動態パラメータを提供し、この各々の開示は本願明細書に参照として組入れられている。
インスリン治療作用が必要な対象の血流へのインスリンの適当な送達に必要な送達物質の量は、下記の1種又は複数に応じて変動し得る：特定の送達物質の化学構造；インスリン及び送達物質の相互作用の性質及び程度；単位用量の性質、すなわち、固形、液体、錠剤、カプセル剤、懸濁剤；胃腸管内の送達物質の濃度、対象の摂食状態、対象の食事療法、対象の健康状態、及び送達物質のインスリンに対する比。

好ましい態様において、本発明の経口剤形は、インスリン及び送達物質、例えばEmisphere Technologies社により発見された新規化合物であるN-(4-クロロサリチロイル)-4-アミノ酪酸一ナトリウム(4-CNAB)の混合物、又はインスリン及びこの送達物質を個別に含むものである。
更なる本発明の態様において、本願明細書に説明された経口剤形は、糖尿病、耐糖能障害の治療、又はグルコースホメオスタシスを達成するために、本願明細書に説明されたように追加療法と併用して経口投与され、該追加療法は、例えば、スルホニル尿素、ビグアニド、α-グルコシダーゼ、異なる経路(例えば、非経口インスリン)で送達されるインスリンのような、追加の薬物、及び／又はインスリン増感剤を含む。

本発明の更なる態様において、本願明細書に説明された経口剤形は、低血糖症事象の尤度を低下し、これは主に下記のふたつの理由による：(a)例え高インスリン血症下であっても、肝臓のグルコース取込みは変わらないので、肝臓をインスリン過剰とすることができない。末梢組織とは異なり、肝臓は、内因性インスリン生成のみを弱め、追加のグルコースを隔離しない(sequester)；並びに、(b)短いピークのインスリン(例えば、添付された実施例に示されたような)は、例えインスリンが高い末梢レベルに達したとしても、そのピークは急勾配で下落する。
インスリンの吸収作用は、経口治療後のC-ペプチド濃度の低下を観察することにより、本発明の医薬組成物で治療されたヒト患者において明示される。例えば本発明のひとつの態様において、医薬組成物は、活性物質としてインスリン、及びインスリンの経口送達を促進するための送達物質として化合物4-CNABを含有し、並びにインスリンが血流に吸収された後、この組成物は、経口投与後約80〜約120分で、治療した患者においてC-ペプチド濃度の最大減少を生じる。より詳細に述べると、この組成物は、例えば、治療した患者におけるC-ペプチド濃度の最大減少は経口投与後約90〜約110分であるような、投与後C-ペプチド濃度減少を生じる。

インスリンの吸収は、治療後のインスリン血漿レベルをモニタリングすることにより、本発明の医薬組成物で治療された対象において検出することができる。活性物質が血流中でピークに達するのに要する時間(t_max)は、下記のような多くの要因により左右されることがある：単位用量の性質、すなわち、固形、液体、錠剤、カプセル剤、懸濁剤；胃腸管中の活性物質及び送達物質の濃度；対象の摂食状態；対象の食事療法；対象の健康状態、及び活性物質の送達物質に対する比。医薬組成物が、送達物質として化合物4-CNAB及び活性物質としてインスリンを含有する本発明の好ましい態様において、この組成物は、ピーク血漿インスリン濃度を、経口投与後約0.1〜約1時間で提供する。別の態様において、組成物は、ピーク血漿インスリン濃度を、経口投与後約0.2〜約0.6時間で提供する。好ましい態様において、組成物は、ピーク血漿インスリン濃度を、経口投与後約0.3〜約0.4時間で提供する。別の態様において、組成物は、ピーク血漿インスリン濃度を、経口投与後約1時間以内に提供する。本発明のある好ましい態様において、医薬組成物は、活性物質としてインスリン及びインスリンの経口送達を促進するための送達物質として化合物4-CNABを含有し、並びにインスリンが血流に吸収された後、治療した患者における血漿インスリンレベルは、経口投与後約20分でピークに達し、第二のピークは約105分である。

好ましい態様において、本発明の組成物は、活性物質(例えば、インスリン)及び活性物質を、胃粘膜を通じ経口吸収可能にするために利用される送達物質を含有する。従って本発明は、胃腸管システムを通じて及び活性物質がその必要な生物学的役割を発揮することができる血流へそのような生体分子の輸送を促進する送達物質を提供することにより、巨大分子の経口吸収の問題点を解決する。本発明の結果として、有効な経口薬物送達法は、現在非経口的に投与されている薬物の経口生物学的利用率及び吸収を増加するように提供される。

別の好ましい態様において、本発明において使用される送達物質は、下記の構造を有する：

(式中、Xは、1個又は複数の水素、ハロゲン、ヒドロキシル又はC₁-C₃アルコキシであり、及びRは、置換又は未置換のC₁-C₃アルキレン、置換又は未置換のC₁-C₃アルケニレンである。)。

ある好ましい態様において、本発明の送達物質は、好ましくは下記の構造を有する：

(式中、Xはハロゲンであり、及びRは、置換又は未置換のC₁-C₃アルキレン、置換又は未置換のC₁-C₃アルケニレンである。)。

本発明の好ましい態様において、医薬組成物は、Xが塩素であり及びRがC₃アルキレンである送達物質を含む。別の本発明の好ましい態様において、医薬組成物は、インスリンの経口送達のための送達物質として化合物4-[(4-クロロ,2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]酪酸、好ましくはそれらの一ナトリウム塩を含有する。
この送達物質は、カルボン酸又はそれらの塩の形であることができる。適当な塩は、有機及び無機の塩、例えばナトリウム、カリウム及びリチウムなどのアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム又はバリウムなどのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；塩基性アミノ酸、例えばリシン又はアルギニン；及び有機アミン、例えばジメチルアミン又はピリジンを含むが、これらに限定されるものではない。好ましい塩は、ナトリウム塩である。これらの塩は、一ナトリウム塩及び二ナトリウム塩のような、一価又は多価の塩であることができる。これらの塩は、エタノール溶媒和物を含む、溶媒和物、及び水和物であっても良い。

本発明において使用することができる別の適当な送達物質は、米国特許5,650,386号、第5,773,647号、第5,776,888号、第5,804,688号、第5,866,536号、第5,876,710号、第5,879,681号、第5,939,381号、第5,955,503号、第5,965,121号、第5,989,539号、第5,990,166号、第6,001,347号、第6,051,561号、第6,060,513号、第6,090,958号、第6,100,298号、第5,766,633号、第5,643,957号、第5,863,944号、第6,071,510号及び第6,358,504号に開示されており、これらの各開示は本願明細書に参照として組入れられている。追加の適当な送達物質は、国際公開公報第01/34114号、第01/21073号、第01/41985号、第01/32130号、第01/32596号、第01/44199号、第01/51454号、第01/25704号、第01/25679号、第00/50386号、第02/02509号、第00/47188号、第00/07979号、第00/06534号、第98/25589号、第02/19969号、第00/59863号、第95/28838号、第02/20466号及び第02/19969号、並びに国際特許出願第PCT/US02/06610号及び第PCT/US02/06295号に開示されており、これらの各開示は本願明細書に参照として組入れられている。

本発明の送達物質化合物の塩は、当該技術分野において公知の方法により調製することができる。例えば、ナトリウム塩は、この送達物質化合物をエタノールに溶解し、及び水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより調製することができる。
本願明細書に説明された化合物は、アミノ酸に由来することができ、並びに本説明及び国際公開公報第96/30036号、第97/36480号、第98/34632号及び第00/07979号、並びに米国特許第5,643,957号及び第5,650,386号に説明されている方法を基に、当業者に公知の方法によりアミノ酸から容易に調製することができ、これらの各開示は、本願明細書に参照として組入れられている。例えば、この化合物は、アミノ酸中に存在する遊離アミノ基と反応しアミドを生成する適当なアシル化剤又はアミン修飾剤の、単独のアミノ酸との反応により調製することができる。当業者に公知であるように、保護基を使用し、望ましくない副反応を避けることができる。

この送達物質は、国際特許出願第PCT/US01/21073号の方法により調製することもでき、その開示は本願明細書に参照として組入れられている。
この送達物質は、国際公開公報第00/46182号の方法に従う、適当なサリチルアミドのアルキル化により調製することもでき、その開示は本願明細書に参照として組入れられている。サリチルアミドは、サリチル酸から、硫酸及びアンモニアとの反応によりエステルを介して、調製することができる。

加えて、これらの化合物の1種又は複数を含有するポリアミノ酸及びペプチドを使用することができる。アミノ酸は、少なくとも1個の遊離アミン基を有するカルボン酸であり、及び天然及び合成のアミノ酸を含む。ポリアミノ酸は、ペプチド(ペプチド結合により結合した2個又はそれよりも多いアミノ酸)であるか、又は例えばエステル又は無水物結合などで連結することができる他の基により形成された結合により連結された2個又はそれよりも多いアミノ酸のいずれかである。ペプチドは、2個のアミノ酸を伴うジペプチドから、数百個のアミノ酸を伴うポリペプチドまで変動することができる。

この送達物質化合物は、再結晶によるか、又は単独のもしくは縦列につながれた、1種又は複数の固形クロマトグラフィー支持体上での分別により、精製することができる。適当な再結晶溶媒系は、エタノール、水、ヘプタン、酢酸エチル、アセトニトリル、メタノール及びテトラヒドロフラン並びにそれらの混合物を含むが、これらに限定されるものではない。分別は、アルミナのような適当なクロマトグラフィー支持体上で、移動相としてメタノール／n-プロパノール混合物を用い；移動相としてトリフルオロ酢酸/アセトニトリル混合物を使用する、逆相クロマトグラフィー；並びに、移動相として水又は適当な緩衝液を使用する、イオン交換クロマトグラフィーで行うことができる。アニオン交換クロマトグラフィーを行う場合は、好ましくは0〜500mM塩化ナトリウム勾配が使用される。

本発明の医薬組成物の経口投与後、送達物質は、胃腸管の粘膜障壁を通過し、血流へ吸収され、そこでこれは、対象の血漿中で検出することができる。血漿中で測定された血流中の送達物質レベルは、投与量-依存型である。この送達物質は、それと共に(同じ剤形中、もしくはそれと同時のいずれか)、又は連続して(送達物質及び薬物の両方が、例えば胃のような同じ位置に、同一時間の両方で、期間内に投与される限りは、いずれかの順番で)投与された薬物(活性物質)の吸収を促進する。
本発明のある好ましい態様において、経口投与後に達成された送達物質のピーク血漿濃度(C_max)は、好ましくは経口投与後に約10〜約250,000ng/ml、好ましくは約100〜約125,000であり、及び好ましくは送達物質のピーク血漿濃度は、経口投与後約1,000〜約50,000ng/mlである。より好ましくは、本発明の送達物質のピーク血漿濃度は、経口投与後約5,000〜約15,000ng/mlである。

送達物質が血流中でピークに達する時間(t_max)は、下記のような多くの要因により左右され得る：単位用量の特徴、すなわち、固形、液体、錠剤、カプセル剤、懸濁剤；胃腸管内での送達物質の濃度；対象の食事の状態；対象の食事療法；対象の健康状態、及び送達物質の活性物質に対する比。本発明の送達物質は、即時放出型剤形で経口投与された場合に、胃腸管から迅速に吸収され、好ましいピーク血漿濃度は、経口投与後約0.1〜約8時間で、及び好ましくは経口投与後約0.1〜約3時間提供される。
好ましい態様において、送達物質のt_maxは、経口投与後約0.3〜約1.5時間で生じる。ある態様において、送達物質は、経口投与後約2時間以内にt_maxに到達し、最も好ましくは経口投与後約1時間以内に到達する。

活性物質の、その活性物質による治療作用を必要としている対象の血流への適切な送達に必要な送達物質の量は、下記の1種又は複数に応じて変動することができる：活性物質の化学的性質；特定の送達物質の化学構造；活性物質及び送達物質に関する相互作用の性質及び程度；単位用量の特徴、すなわち、固形、液体、錠剤、カプセル剤、懸濁剤；胃腸管内での送達物質の濃度；対象の食事の状態；対象の食事療法；対象の健康状態、及び送達物質の活性物質に対する比。本発明のある好ましい態様において、医薬組成物にとって好ましい送達物質の量は、約1mg〜約2,000mgの送達物質、より好ましくは約1mg〜約800mgの該送達物質、より好ましくは約50mg〜約700mgの該送達物質、更により好ましくは約70mg〜約700mgの該送達物質、更により好ましくは約100〜約600mgである。

好ましくは、この送達物質は、4-CNABである。特定の活性物質を送達するのに必要な送達物質の量は変動し、及び望ましい治療作用を生じるのに必要な活性物質の量も変動するので、活性物質の送達物質に対する比は、様々な活性物質/送達物質組合せについて変動することができる。経口医薬組成物が活性物質としてインスリンを含み、及び送達物質が化合物4-CNABであるような本発明のある好ましい態様において、医薬組成物中に含まれた送達物質の量は、該送達物質の約100mg〜約600mgであることができる。
ある好ましい本発明の態様において、医薬組成物は、活性物質としてインスリンを含み、及び送達物質が4-CNABの一ナトリウム塩であり、インスリン[単位]の送達物質[mg]に対する比は、10:1[単位/mg]〜1:10[単位/mg]の範囲であり、好ましくはインスリン[単位]の送達物質[mg]に対する比は、5:1[単位/mg]〜0.5:1[単位/mg]の範囲である。

単回投与における好ましいインスリン投与量は、約5〜約1000インスリン単位USPであり、好ましくは約50〜約400、より好ましくは約150〜約400、更により好ましくは約150〜約300単位である。
最適なインスリンの送達物質に対する比は、送達物質に応じて変動することができる。インスリンの送達物質に対する比の最適化は、当業者の知識の範囲内である。
医薬組成物が送達物質として化合物4-CNAB及び活性物質としてインスリンを含有する本発明の好ましい態様において、この組成物は、ピーク血漿送達物質濃度を経口投与後約0.1〜約3時間以内に提供する。医薬組成物が送達物質として化合物4-CNAB及び活性物質としてインスリンを含有するある好ましい態様において、送達物質のピーク血漿濃度は、約8,000〜約37,000ng/mlに達する。

4-CNABがインスリンの胃腸吸収を促進する機序は、まだ完全には解明されていない。現在の作業仮説(working hypothesis)は、4-CNABは、非共有的にインスリンと相互作用し、吸収にとってより好ましい生理化学的特性を生じるというものである。この作業仮説は、単に説明を目的に提供されており、いかなる意味においても、本発明又は添付された「特許請求の範囲」を制限することは意図していない。
本発明の好ましい態様は、インスリン慢性投薬に関連した血管疾患の発生を低下する方法を提供する。好ましい態様の方法は、ヒト糖尿病患者を、慢性ベースで、インスリンの胃腸管からの吸収(すなわち、生物学的利用性)を促進する経口及び送達物質又はそれらの医薬として許容できる塩で治療することを含む。

この送達物質は、投与前に1種又は複数のこのような物質を、活性物質(例えば、未修飾インスリン)と混合することにより、直接使用することができる。送達物質及び活性物質は、乾燥粉末型で混合又は共に湿式顆粒で一緒にすることができる。この混合物に、他の医薬として許容できる賦形剤を添加することができる。次に混合物は、単位用量の活性物質及び送達物質を含有するよう、打錠するか、又はゼラチンカプセル剤に入れることができる。あるいは、送達物質/活性物質混合物は、経口液剤又は懸濁剤として調製することができる。送達物質及び活性物質は、投与前に一緒に混合する必要はなく、その結果、ある態様において、活性物質の単位用量(他の医薬として許容できる賦形剤を伴う又は伴わない)は、本発明の送達物質を伴わずに経口投与することができ、並びに送達物質は、活性物質の前、後又は同時に、個別に(医薬として許容できる賦形剤を伴う又は伴わずに)経口投与される。

ある好ましい態様において、本発明の経口剤形は、固形である。乾燥散剤型中の未修飾インスリンは安定しており、及びある好ましい態様において、簡単に送達物質と望ましい比で混合することができる。次に乾燥散剤混合物は、任意の医薬賦形剤を伴い又は伴わずに、ゼラチンカプセル剤中に充填することができる。あるいは、乾燥散剤型中の未修飾インスリンは、送達物質と共に、任意の医薬賦形剤を伴い混合することができ、及び混合物は、当業者に公知の標準の打錠法に従い、打錠することができる。

本発明は、例えばインスリンによる糖尿病治療のような、本来生体利用可能でない活性物質により、ヒト糖尿病患者を治療する方法も提供する。より詳細に述べると、本発明は、医薬組成物の経口剤形でヒトを治療する方法を提供し、ここで医薬組成物は以下を含む：第一に、活性物質又はそれらの医薬として許容できる塩、これは水溶液中に溶解又は懸濁される場合は、経口的に生体利用可能ではなく、ここでこの活性物質は、別の手段(例えば、皮下注射により)で投与した場合には、対象へ治療作用を提供する；並びに、第二に、有効量の送達物質又はそれらの医薬として許容できる塩、これは活性物質を経口的に吸収させる(例えば、生物学的に利用可能とする)。ある態様において、本方法は、下記の工程を含む：第一に、活性物質(例えば、インスリン)を、該送達物質と接触させ、その後この医薬組成物を経口的に投与すること。あるいは、この方法は、in-vivoにおいて(例えば、胃内)インスリン及び送達物質が互いに接触するような方法で、インスリン及び送達物質を投与することを含み、その結果送達物質は、胃粘膜を通したインスリンの吸収を促進することができる。

本発明の剤形は、最初に活性物質及び送達物質を、ひとつの溶液又は個別の溶液へ溶解することにより作成することができる。溶媒は、好ましくは水溶液であるが、送達物質の可溶化に必要である場合には、有機溶媒又は水性有機溶媒の混合物を使用することができる。2種の溶液が使用される場合は、活性物質又は送達物質のいずれかの正確な量を提供するために互いに必要な割合を、併用することができ、並びに得られた溶液は、凍結乾燥又は同等の手段により乾燥することができる。本発明のひとつの態様において、経口剤形は、乾燥し、経口投与前に再水和することができる。

投与混合物を、投与直前の、送達物質の水溶液の、インスリンのような活性成分の水溶液との混合により調製することができる。あるいは、製造プロセス時に、送達物質及び生物学的もしくは化学的活性成分と混合することができる。この溶液は、任意にリン酸緩衝塩、クエン酸、酢酸、ゼラチン及びアカシアゴムのような添加剤を含むことができる。
安定化のための添加剤は、送達物質溶液に混入することができる。一部の薬物により、このような添加剤の存在は、溶液中のこの物質の安定性及び分散性を増進する。安定化のための添加剤は、約0.1〜5％(W/V)の範囲、好ましくは約0.5％(W/V)の濃度で利用することができる。適当な、しかし限定的でない安定化のための添加剤の例は、アカシアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、カルボン酸及びそれらの塩、並びにポリリシンを含む。好ましい安定化のための添加剤は、アカシアゴム、ゼラチン及びメチルセルロースである。

例えばインスリンのような活性物質の量は、特定の活性物質の目的を達成するための有効量である。組成物中の量は、治療に有効な投与量、すなわち薬理学的又は生物学的有効量である。しかしこの量は、組成物がカプセル剤、錠剤又は液剤のような単位剤形において使用される場合には、薬理学的又は生物学的有効量未満であることができ、その理由は単位剤形は、送達物質/生物学的又は化学的活性物質の組成物を多く(multiplicity)含有することができるか、又は分割された薬理学的又は生物学的有効量を含有することができるからである。その後総有効量は、全部で、生物学的又は薬理学的活性物質の、薬理学的又は生物学的又は化学的活性量を含有する、累積単位において投与することができる。

使用される活性物質、特にインスリンの総量を当業者は決定することができる。しかし、驚くべきことに、一部の生物学的又は化学的活性物質により、現在明らかにされた送達物質が極めて有効な送達を提供することがわかっている。
本発明の組成物中の送達物質の量は、送達有効量であり、及び当業者に公知の方法により、いずれか特定の送達物質/活性物質の組合せについて決定することができる。

活性物質、例えばインスリン及び送達物質、例えば4-CNABの混合物又はこの活性物質及び送達物質を個別に含む本発明の経口剤形は、医薬賦形剤のような、当業者に公知の追加の物質を含有することができる。いずれかの賦形剤又は成分は、医薬成分又は賦形剤を含有する。このような医薬賦形剤は、例えば下記を含む：酸性化剤(酢酸、氷酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、希塩酸、リンゴ酸、硝酸、リン酸、希リン酸、硫酸、酒石酸)；エアロゾル噴射剤(ブタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、イソブタン、プロパン、トリクロロモノフルオロメタン)；排気剤(Air displacement)(二酸化炭素、窒素)；アルコール変性剤(安息香酸デナトニウム、メチルイソブチルケトン、オクタ酢酸スクロース)；アルカリ化剤(強アンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トロラミン)；

凝結防止剤(流動促進剤参照)；消泡剤(ジメチコン、シメチコン)；抗菌保存剤(塩化ベンザルコニウム、塩化ベンザルコニウム溶液、塩化ベンゼルトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、デヒドロ酢酸、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、チモール)；酸化防止剤(アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、ホルムアルデヒドスルホン酸ナトリウム、メタ亜流酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、二酸化イオウ、トコフェロール、トコフェロール賦形剤)；緩衝剤(酢酸、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、クエン酸カリウム、メタリン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム溶液、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム)；カプセル用滑沢剤(錠剤及びカプセル剤滑沢剤参照)；

キレート剤(エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸及び塩、エデト酸)；コーティング剤(カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ゼラチン、医薬用うわぐすり、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、フタル酸ポリ酢酸ビニル、セラック、ショ糖、二酸化チタン、カルナウバろう、微晶質ワックス、ゼイン)；着色剤(カラメル、赤色、黄色、黒色又は配合物、酸化第二鉄)；錯体形成剤(エチレンジアミン四酢酸及び塩(EDTA)、エデト酸、ゲンチジン酸エタノールアミド、硫酸オキシキノリン)；乾燥剤(塩酸カルシウム、硫酸カルシウム、二酸化ケイ素)；乳化剤及び／又は可溶化剤(アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン(添加剤)、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノ-及びジ-グリセリド、モノエタノールアミン(添加剤)、オレイン酸(添加剤)、オレイルアルコール(安定化剤)、ポロキサマー、ステアリン酸ポリオキシエチレン50、ポリオキシル35ひまし油、ポリオキシル40水素化ひまし油、ポリオキシル10オレイルエーテル、ポリオキシル20セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、プロピレングリコール二酢酸、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、乳化ワックス)；

濾過助剤(粉末化したセルロース、精製したケイ質土)；芳香及び香料(アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸一ナトリウム、オレンジ花油、ペパーミント、ペパーミント油、ペパーミント酒精、バラ油、強バラ水、チモール、トルーバルサムチンキ、、バニラ、バニラチンキ、バニリン)；流動促進剤及び／又は亀裂防止剤(ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、タルク)；湿潤剤(グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール)；可塑化剤(ひまし油、ジアセチル化されたモノグリセリド、フタル酸ジエチル、グリセリン、モノ-及びジ-アセチル化されたモノグリセリド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、クエン酸トリエチル)；ポリマー(例えば、酢酸セルロース、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、アクリル酸ポリマー及びコポリマー)；溶媒(アセトン、アルコール、希アルコール、アミレン水和物、安息香酸ベンジル、ブチルアルコール、四塩化炭素、クロロホルム、コーン油、綿実油、酢酸エチル、グリセリン、ヘキシレングリコール、イソプロピルアルコール、メチルアルコール、塩化メチレン、メチルイソブチルケトン、鉱油、ピーナッツ油、ポリエチレングリコール、プロピレンカーボネート、プロピレングリコール、ゴマ油、注射用水、注射用滅菌水、灌流用滅菌水、精製水)；

吸着剤(粉末化されたセルロース、チャコール、精製ケイ質土)；二酸化炭素吸収剤(水酸化バリウム石灰、ソーダ石灰)；硬化剤(水素化ひまし油、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、硬化油(hard fat)、パラフィン、ポリエチレン賦形剤、ステアリルアルコール、乳化ワックス、白ろう、黄ろう)；懸濁剤及び／又は増粘剤(アカシア、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、マグマベントナイト、カルボマー934p、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム12、カラゲニン、微晶質及びカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアールガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マグネシウムアルミニウムシリケート、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンガム)；

甘味剤(アスパルテーム、デキストレート、デキストロース、賦形剤デキストロース、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、溶液ソルビトール、ショ糖、圧縮糖(compressible sugar)、粉糖、シロップ)；錠剤結合剤(アカシア、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微晶質セルロース、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアールガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチセルロース、ポリエチレンオキシド、ポビドン、プレゼラチン化したデンプン(pregelatinized starch)、シロップ)；錠剤及び／又はカプセル剤希釈剤(炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、三塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微晶質セルロース、粉末セルロース、デキストレート、デキストリン、デキストロース賦形剤、フルクトース、カオリン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、デンプン、プレゼラチン化したデンプン、ショ糖、圧縮糖、粉糖)；錠剤崩壊剤(アルギン酸、微晶質セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コルスポビドン、ポラクリン(polacrilin)カリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、デンプン、プレゼラチン化したデンプン)；

錠剤及び／又はカプセル剤滑沢剤(ステアリン酸カルシウム、ベヘン酸グリセリン、ステアリン酸マグネシウム、軽鉱油、ポリエチレングリコール、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、精製したステアリン酸、タルク、水素化された植物油、ステアリン酸亜鉛)；張性剤(tonicity agent)(デキストロース、グリセリン、マンニトール、塩化カリウム、塩化ナトリウム)；ビヒクル：香味及び／又は甘味(芳香エリキシル、化合物ベンズアルデヒドエリキシル、イソ-アルコール性エリキシル、ペパーミント水、ソルビトール溶液、シロップ、トルバルサムシロップ)；ビヒクル：油性(アーモンド油、コーン油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、鉱油、軽鉱油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、オリーブ油、ピーナッツ油、タデ油、ゴマ油、大豆油、スクアラン)；ビヒクル：固形担体(球状糖(sugar sphere))；

ビヒクル：滅菌剤(注射用静菌水、注射用静菌塩化ナトリウム)；増粘剤(懸濁剤参照)；水噴射剤(シクロメチコン、ジメチコン、シメチコン)；並びに、湿潤及び／又は可溶化剤(塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、ドクサエートナトリウム、ノノキシノール9、ノノキシノール10、オクトキシノール9、ポロキサマー、ポリオキシル35ひまし油、ポリオキシル40、水素化ひまし油、ステアリン酸ポリオキシル50、ポリオキシル10オキシルエーテル、ポリオキシル20、セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート80、ラウリル硫酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、チロキサポール)。このリストは、本発明の経口剤形において使用することができる賦形剤の種類及び特定の賦形剤の限定を意味するものではなく、代わりに単なる例である。

インスリンの場合、経口送達は、簡便性、許容及び服薬遵守の問題を超えた利点を有することができる。胃腸管で吸収されたインスリンは、膵臓から分泌されたインスリンの生理を模倣し、その理由は両方とも、門脈に放出され及び肝臓に直接運搬されるからである。門脈循環への吸収は、インスリン分泌を調節する末梢-門脈インスリン勾配を維持している。その肝臓の初回通過において、おおまかに60％のインスリンが保持及び代謝され、これにより糖尿病関連した全身合併症の因子である末梢高インスリン血症の発生が低下される。インスリン治療及び他の経口糖尿病治療薬の心配で一般的でない合併症は、低血糖症である。

本発明は、ひとつには、インスリン吸収(例えば十二指腸から)を増強する薬物送達物質と一緒の、インスリンの慢性経口投与により、治療の効果的管理及び／又は血液グルコースの低下が達成されると同時に、例えばインスリン皮下注射による治療的効能を達成するために必要な血清インスリンレベルに比べて血液グルコース濃度の低下を達成するために必要な慢性ベースの、全身の血液インスリン濃度(血清インスリンレベル)の低下に作用する、ヒト糖尿病の治療法に関連している。

従来の皮下インスリン投薬は、インスリンの循環への進入点を自然の部位(門脈)から全身循環へシフトするが、本発明の経口投薬法は、インスリン進入部位を元の門脈へシフトする。この投薬経路の作用は2倍である。第一に、肝臓を直接標的とすることにより、グルコースのより大きい制御を達成することができる。様々な試験が、インスリンの門脈内送達が、末梢投与により得られるものよりもより低い注入速度でグルコースの同等の制御を生じ得ることを示している(Stevenson, R. W.ら、「麻酔をかけないイヌにおける門脈及び末梢循環へのインスリン注入」、Clin Endocrinol (Oxf)、8:335-47 (1978)；Stevenson, R. W.ら、「糖尿病イヌにおける門脈内及び末梢のインスリンのグルコース代謝回転及びリサイクルに対する作用」、Am J Physiol、244: E190-5 (1983)；Shishko, P. I.ら、「IDDM患者におけるインスリン注入の末梢及び門脈(臍帯血経由)経路のI. U.比較」、Diabetes、41:1042-9 (1992)。インスリンは全身循環に進入する前に初回通過代謝を受けるので、より低い血清濃度が達成される。これは次に、インスリンの非-標的組織に対する有害な作用を緩和することができる。

正常な健常者において、全身(末梢)血液インスリン濃度と比較した門脈内の血液インスリン濃度の生理的比は、約2:1よりも大きい。対照的に、インスリンのヒト糖尿病患者に対する投与は、門脈インスリン血液濃度の全身インスリン血液濃度に対するこの比を、約0.75:1にシフトすることが分かっている。本発明により、門脈循環内未修飾インスリンの全身循環に対する濃度比は、正常生理的比、例えば約2:1から約6:1に達する。

本インスリンの生理的反応のひとつの局面は、筋肉及び脂肪組織へのグルコース輸送の刺激である。高血糖症(上昇した血液グルコースレベル)及び／又は高インスリン血症は、糖尿病に関連した血管疾患の原因であることが報告されている。血管システムの障害は、微小血管合併症又は疾患(網膜症(眼の網膜に血液供給する小さい血液血管及び毛細血管の病巣)；ニューロパシー(胃腸管及び膀胱の機能の異常、更には下肢感覚の喪失につながる、自律神経機能障害)；ネフロパシー(腎臓に血液供給する小さい血液血管及び毛細血管の病巣、これは腎疾患につながる))；又は、巨大血管合併症又は疾患(例えば、心臓血管疾患；など)のような状態の隠れた理由であると考えられている。

本発明は、糖尿病治療のために、未修飾インスリンを、好ましくは治療有効量で患者の胃腸管からのインスリン吸収を促進する適当な薬物送達物質と共に含有する本発明の剤形の患者への経口投与による、全身の高インスリン血症への曝露に関連した疾患の発生を減弱及び／又は低下する方法を提供する。インスリン経口投与に有用な方法及び医薬組成物の両方が、本発明の範囲内である。
本発明の方法及び経口組成物は、インスリン慢性投薬に関連した心臓血管疾患の発生を減弱及び／又は低下することができる。本発明の組成物によるインスリン経口投与は、正常な生理的レベルよりも高いインスリンへの全身血管系の曝露を低下することにより、血管疾患に関連した合併症を低減するであろうと考えられる。肝臓を通る初回通過により、おおまかに50％のインスリンが、保持され及び代謝され、これにより末梢高インスリン血症の発生が低減する。

ある態様において、本発明は、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べて低下した血液グルコース及びピーク血清インスリン濃度の治療に有効な低下を提供するために、投与量のインスリンを、この投与量のインスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を慢性ベースで糖尿病患者へ経口投与することを含む、糖尿病の治療法を提供する。ある態様において、この方法は、慢性インスリン投与に関連した病態の発生の低下を生じることができ、この病態は、例えば、心臓血管疾患を含む。心臓血管疾患は、例えば、うっ血性心不全又は冠動脈疾患、ニューロパシー、ネフロパシー、網膜症、動脈症、アテローム性動脈硬化症、高血圧性心筋症及びそれらの組合せを含む。

一部の態様において、本発明は、インスリン及びインスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質を含有する医薬組成物の治療に有効な投与量の慢性ベースの経口投与により糖尿病患者を治療することを含む、インスリン慢性投与に関連した1種又は複数の病態の発生及び／又は重症度を低下する方法を提供し、その結果この医薬組成物は、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べて低下した血液グルコース及びピーク血清インスリン濃度の治療に有効な低下を提供する。本願明細書に説明された方法により発生及び／又は重症度が低下されるインスリンの慢性投与に関連した病態は、例えば、心臓血管疾患、例えばうっ血性心不全又は冠動脈疾患を含む。その他の病態は、例えば、ニューロパシー、ネフロパシー、網膜症、動脈症、アテローム性動脈硬化症、高血圧性心筋症及びそれらの組合せを含む。

一部の態様において、インスリン慢性投与に関連した1種又は複数の病態の発生及び／又は重症度を低下する方法は、インスリン皮下注射により患者集団において達成された血液グルコース濃度の同等の低下から生じる血管疾患に関連した遺伝子発現レベルと比較した血管疾患に関連した遺伝子の低下した発現を提供することができる。血管疾患に関連した遺伝子は、例えば、初期応答遺伝子、サイトカイン関連遺伝子、接着分子関連遺伝子、脂質過酸化関連遺伝子、血栓関連遺伝子及びそれらの組合せを含む。初期応答遺伝子は、例えば、c-myc、jun B、Egr-1、Ets-1及びそれらの組合せを含む。

一部の態様において、インスリン経口投与及び慢性ベースのインスリン経口投与に関連している本願明細書において提供された方法は、インスリン皮下注射により達成された血液グルコース濃度の同等の治療に有効な低下により生じたプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター濃度と比べ、より低いプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター濃度を得ることを提供している。これらの方法も、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度の同等の治療に有効な低下から生じる前炎症性サイトカイン濃度よりもより低い前炎症性サイトカイン濃度を得ることを提供することができる。

一部の態様において、本発明は、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べて低下した糖尿病患者の血液グルコース及びピーク血清インスリン濃度の治療に有効な低下を提供するための、投与量のインスリン及び胃腸管からの投与量のインスリンの吸収を促進する送達物質の糖尿病患者への慢性ベースの経口投与を含む、糖尿病治療並びにインスリン慢性投薬に関連した高インスリン血症の発生及び重症度を低下する方法を提供する。

一部の態様において、本発明は、薬物を第一の被験動物へ非経口的に投与すること、薬物を第二の被験動物へ経口的に投与すること、並びに第一及び第二の動物についてc-myc、c-fos、Jun B、Erg-1及びそれらの組合せからなる群より選択される初期応答遺伝子の発現を比較することを含み、ここで1種又は複数の初期応答遺伝子の発現の増加は、血管損傷の指標である、薬物の投与経路に関連した血管損傷のためのその薬物のスクリーニングの方法を提供する。一部の態様において、発現の変化を測定する工程は、遺伝子チップ解析を用いて行われ、及びmRNA発現の変化を測定を含むことができる。

一部の態様において、本発明は、糖尿病患者への慢性ベースで投与量のインスリンを胃腸管からの該インスリンの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者の血液グルコースレベルを望ましい量に低下することを含む、糖尿病への慢性インスリン投与に関連した病態又は血管疾患の発生及び／又は重症度を低下する方法を提供し、その結果インスリン治療の結果としての該糖尿病患者の血液中の循環インスリン濃度は、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べて低下する。

一部の態様において、本発明は、糖尿病患者への慢性ベースで投与量のインスリンを該インスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者の血液グルコースレベルを望ましい量に低下することを含む、糖尿病における慢性インスリン療法に関連した血管疾患の重症度の発生、又は発生及び重症度を低下する方法を提供し、その結果インスリン治療の結果としての該糖尿病患者の血液中の循環インスリン濃度は、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べて低下する。

一部の態様において、本発明は、糖尿病患者への慢性ベースで投与量のインスリンを胃腸管からの該インスリンの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者の血液グルコースレベルを望ましい量に低下することを含む、インスリン治療時のmRNAの増加に反応する複数の領域における穏やかな損傷刺激に対する反応から生じたプロセスを減弱する方法を提供し、その結果インスリン治療の結果として該糖尿病患者の血液中の循環インスリン濃度は、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べて低下する。
一部の態様において、本発明は、糖尿病患者への慢性ベースで投与量のインスリンを胃腸管からの該インスリンの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者の血液グルコースレベルを望ましい量に低下することを含む、糖尿病患者を治療する方法を提供し、その結果該経口インスリン治療の結果として該糖尿病患者の血液中の循環インスリン濃度は、正常な生理的レベルよりも実質的に高くない。

好ましい態様の詳細な説明
本発明をより良く理解するために、下記の実施例を設定した。これらの実施例は、例証のみを目的とし、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するものとしては構築されていない。

実施例1
血漿送達物質のデザイン及び効力
送達物質1-3を、それらのGI粘膜を透過する能力について調べた。各送達物質の血漿濃度は、各送達物質の透過効力の測定値として、カプセル剤に負荷した送達物質の経口投与後に、ヒト対象において測定した。表1及び2参照。

血漿送達物質濃度決定のための採血(ヘパリンナトリウム管内に2mL)は、全ての治療群の送達物質測定について、投薬前15分、並びに投薬後5、10、15、30、及び45分並びに1、1.5、2、3、4、6、8及び12時間(1治療につき14試料)で行った。
2個の18-ゲージIVラインを、投薬前に配置し；一方は血液採取、及び他方は第2及び3群の対象のための20％グルコースの可能性のある注入のため。第1群の対象のみ、カニューレ挿管した。血液試料は、採血の1時間以内に、3000rpmで15分間、温度約2℃〜8℃で遠心した。プラスチックピペットを用い、赤血球層を破壊することなく、採血管から血漿を、血液グルコース、ヒトインスリン、C-ペプチド、送達物質の各分析のためにふたつ組で、予めラベルを付けたポリプロピレン管にピペッティングした。試料は、分析まで-70℃で保存した。

示された用量を、健常なヒト志願者が摂取し、及び送達物質の血漿濃度を、経時的にモニタリングし、曲線下面積(AUC)を計算した。驚くべきことに、表2に提供されたように、Xが塩素及びnは3アルキルと等しい送達物質番号3の800mgの経口投与は、nは7アルキルと等しい送達物質1の750mg経口投与よりも、およそ13.5倍大きいヒトにおけるGI粘膜透過を生じた。同様に、送達物質番号3の800mgの経口投与は、nは9アルキルと等しい送達物質2の750mg経口投与よりも、およそ23倍大きいヒトにおけるGI粘膜透過を生じた。
同様の結果は、送達物質1-3が、サルに経口投与された場合に得られ、及び送達物質の血漿濃度を経時的にモニタリングし及びAUCを計算した。表3に提示したように、Xが塩素及びnは3アルキルと等しい送達物質番号3の300mgの経口投与は、nは7アルキルと等しい送達物質1の300mg経口投与よりも、およそ11倍大きいサルにおけるGI粘膜透過を生じた。表3参照。更に、送達物質3の300mgは、nは9アルキルと等しい送達物質2の300mg経口投与よりも、およそ6倍大きいサルにおけるGI粘膜透過を生じた。表3参照。

実施例2
送達物質1-3の送達効力の比較
次に、送達物質1-3を、送達物質用量、活性物質用量及びグルコース反応の間の関係を決定することにより、生物学的活性型でGI粘膜を超えて活性物質を効果的に輸送する能力について比較した。表4参照。活性物質の治療的用量を送達し及び治療的作用を生じるために必要な送達物質の有効量を測定した。表4参照。送達物質3について、その活性物質はインスリンであり、及びその治療的作用は、投与後1時間以内に血清グルコースを少なくとも10％だけ低下する送達物質／インスリン組合せの能力により決定した。送達物質1及び2について、この活性物質はヘパリンであり、及び治療的作用は、エミスフェア（Emisphere）により決定した。

再度、表4に示したように、Xが塩素及びnは3アルキルと等しい送達物質3は、7アルキルと等しいnを有する送達物質1よりも、生物学的活性型においてGI粘膜を超えるインスリン移行の促進がおよそ12倍効果的であった。同様に送達物質番号3は、9アルキルと等しいnを有する送達物質2よりも、生物学的活性型においてGI粘膜を超えるインスリン輸送の促進がおよそ7.5倍効果的であった。表4参照。

最も重要なことは、送達物質3のみが、生物学的活性インスリンの輸送の促進に十分に有効であり、インスリンと送達物質の合計の治療有効量の単独のカプセル剤への包装が可能であることである。

実施例3
送達物質4-CNABの調製
下記構造に相当する化合物は、以下に説明したように調製することができる：

4-クロロサリチル酸(10.0g, 0.0579mol)を、塩化メチレン約50mlが入った一首250ml丸底フラスコに加えた。攪拌を開始し、反応の残余を継続した。固形のカップリング剤1,1-カルボニルジイミダゾール(9.39g, 0.0579mol)を、少しずつフラスコに添加した。この反応液を、カップリング剤が全て添加された後、室温でおよそ20分間攪拌し、その後エチル-4-アミノ酪酸塩酸塩(9.7g , 0.0579mol)をフラスコを攪拌しながら添加した。次にトリエチルアミン(10.49ml, 0.0752mol)を追加した漏斗から滴下した。追加した漏斗は、塩化メチレンですすいだ。室温で一晩攪拌し、反応させた。

この反応液を、分液漏斗に注ぎ、2N HClで洗浄し、乳濁液を形成した。乳濁液を2日間静置し、その後ガラス濾過器のセライトを通して濾過した。濾液を、分液漏斗に戻し、層を分離した。有機層を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、これを次に濾過し、及び濾液を回転蒸発器により濃縮した。得られた固形物質を、2N NaOHで加水分解し、一晩冷蔵庫に保存し、次に加水分解を再開した。この溶液を、2N HClで酸性とし、生成された固形物を単離し、減圧下で乾燥し、メタノール／水を用い2回再結晶した。固形物を一晩かけて沈殿させ、単離及び乾燥した。この固形物を、2N NaOH中に溶解し、その試料のpHを、2N HClによりpH5とした。固形物を収集し、HPLCは単独のピークを示した。次にこれらの固形物を、メタノール／水で再結晶し、単離し、及び減圧下で乾燥し、4-(4-クロロ-2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ酪酸(C₁₁H₁₂ClNO₄；分子量257.67)4.96g(33.0％)を得た。融点は131-133℃と決定した。燃焼分析は下記の含量を明らかにした：％C：51.27(計算値)、51.27(実測値)；％H：4.69(計算値)、4.55(実測値)；％N：5.44(計算値)、5.30(実測値)。プロトンH NMR分析は下記を明らかにした：(d₆-DMSO)：d 13.0, s, 1H (COOH)；d 12.1, s, 1H (OH)；d 8.9, t, 1H (NH)；d 7.86, d, 1H (アミドに対するオルトH)；d 6.98, d, 1H (フェノールOHに対するオルトH)；d 6.96, d, 1H, (アミドに対するメタH)；d 3.33, m, 2H (NHに隣接するCH₂)；d 2.28, t, 2H (COOHに隣接するCH₂)；d 1.80, m, 2H (NHに対しβの脂肪族CH₂及びCOOHに対しβのCH₂)。

臨床試験のための4-CNAB調製
ヒト投薬のための4-CNAB(N-(4-クロロサリチロイル)-4-アミノ-酪酸一ナトリウム塩)を、出発材料4-クロロサリチル酸(Ihara Chemical Industry社、東京、日本及びAapin Chemicals社、Oxfordshire、英国から購入した)を使用し、並びにメタノール中0.14当量の硫酸及び次にメタノール中約4当量のアンモニアを使用しメチルエステル経由でアミドへ転換した以外は、国際公開公報第00/46182号の方法に従い、Regis Technologies社(Morton Grove, IL)の「医薬品の製造管理及び品質に関する基準(GMP)」条件に従い製造した。使用したアルキル化剤は、4-ブロモ酪酸エチルであった。

4-CNAB一ナトリウム塩は、下記の方法に従い、40kgスケールで製造した。4-CNAB遊離酸(500g, 1.94mol, FW=257.67)を、22Lの五首丸底フラスコに充填した。このフラスコに、オーバーヘッドスターラー、熱電対温度測定器、還流冷却器及びマントルヒーターを装着し、窒素下に配置した。試薬用アセトン(13L)を反応器に添加し、混合物を攪拌した。4-CNAB／アセトン混合物を50℃に加熱し、全ての固形物を溶解した。濁った褐色溶液が実現した。
この50℃の溶液を、温めた加圧濾過用フィルター(Whatman #1濾紙、〜5μm、面積18.5平方インチ(119cm²)が取付けられた)を通し、清浄な22L反応器へとポンプ注入し、塩化ナトリウム及び他の不溶物を除去した。濾過の最後に、圧力をフィルターを通して約20psig(6890Pa)へ低下した。透明な黄色濾液を含む反応器を、攪拌及び加熱した。50℃で反応器を熱源から取り外した。

透明な濾液に、50％水酸化ナトリウム溶液(155g, 1.94mol)をできるだけ迅速に充填しながら、激しく攪拌し続けた。(過剰な充填は、望ましくない不溶性二ナトリクム塩の生成を招くであろう。わずかに過小な充填は、この遊離酸は最終濾過工程で取り除かれるので、好ましい。)。この反応混合物は、およそ52℃に発熱した。沈殿が生成され、再度透明となる前に生成物はゲル化した。

塩基添加が完了し温度が一定になった後、この溶液は濁り始め、粘度が増加した。この反応液を、激しく攪拌しながら、60℃で2時間還流した。反応混合物は増粘し続け、固形塊(chunk)を形成した。このスラリーはわずかにピンク色となり、発泡し始めた。反応器含有物は、3〜4時間かけて周囲温度に冷却した。周囲温度に、30分間維持した。沈殿した固形物をフィルター漏斗上で単離した。単離した生成物を洗浄した。得られた4-CNAB一ナトリウム塩を、真空中40〜50℃で、16〜24時間乾燥し、490gを得た(1.75mol, 収率90％、FW=279.65)。

皮下注射用のインスリンは、Eli Lilly社(インディアナポリス、IN)のHUMULIN7(登録商標)R注射用インスリンであった。
4-CNABを200mg及び150インスリン単位USPを含有する全てのカプセル剤を、下記のように調製した。最初に、送達物質のみのカプセル剤及び送達物質＋インスリン組成物のカプセル剤の充填に必要な送達物質材料の総量を、4-CNABの3160gを秤量することにより調製した。次に4-CNABの3160gを、篩番号2A 050 G 037 19 136 (1270μm)を備えたQuadro comil、モデル197Sミル中で粉砕した。次に粉砕した4-CNABの1029gを、#35メッシュ篩を通した。その後、篩を通過した材料を、4クオート(3.8L)のシェルに移し、例えば、Vブレンダーを25rpmで10.2分間用いて配合した。得られた配合された材料を用い、カプセル剤を充填した。この場合、Fast Cap Capsule Fillerを、サイズ3のFast Cap Encapsulationトレイと共に使用した。空のカプセルは各々約48mgと秤量され、4-CNAB単独で205.6mgの平均充填質量で充填した。従って、送達物質のみのカプセル剤の用量は205.6mgであった。

インスリン組成物は、最初にEli Lilly社(インディアナポリス、IN)の組換えヒト結晶性インスリン亜鉛(効力26.18単位/mg)(プロインスリン由来した(組換えDNA起源)USP品質)31.8gを、適当なサイズのプラスチックバッグへ分配することにより調製した。次に、粉砕し篩にかけた4-CNABの30gの逐次添加物を、このバッグにおよそ510gが添加されるまで添加した。バッグは、各4-CNABの30gの添加後、振盪及び倒置により完全に混合した。次に532.5gの4-CNABを添加し混合するために、インスリン及び4-CNABの541.8g混合物を、Vブレンダーに移し、再度25rpmで10.2分間混合した。次に残った4-CNABを、ブレンダーに加え、全混合物を、ブレンダー内で25rpmで10.2分間混合した。最後に得られた組成物を、前述のように空のカプセルへ分配した。最終カプセル剤は、平均5.7mgのインスリン(150単位インスリンと同等)及び4-CNABの200.5mg、又はインスリン：4-CNABの比1：57.3を含んだ。最終配合物の複数の試料を、均質性を証明するためにHPLCにかけ、均質であることを認めた。

実施例4
4-CNAB及びインスリン／4-CNABの前臨床非臨床試験
インスリン及び送達物質4-CNABの組成物を含む本発明は、ラット及びサルにおける薬理学的スクリーニング、薬物動態プロファイリング、及び毒性評価を含む非臨床プログラムにおいて安全性及び毒性について評価した。一般に、4-CNAB単独及びインスリン/4-CNABに対する動物の生理的反応は同等であった。マウス、ラット及びサルにおける薬物動態試験は、4-CNABは、経口投与後に迅速に吸収され、引き続き体からクリアランスされることを示した。4-CNABは、受容体結合スクリーニングアッセイにおいて評価された一次分子標的のいずれにおいても、活性の可能性を示さなかった。4種の遺伝子毒性試験を、4-CNABで行い、陽性所見を認めなかった。14-日の経口反復用量毒性試験を基に、NOAEL(無有害作用濃度)は、スプラーグ・ドーリーラットにおいて500mg/kg、及びアカゲザルにおいて400mg/kgと推定した。

毒性試験において、4-CNAB用量400mg〜2000mgを評価した。ラット及びサルにおける14-日経口反復投与毒性試験後、推定された4-CNABの無有害作用濃度(NOAEL)は、スプラーグ・ドーリーラットにおいて500mg/kg及びアカゲザルにおいて400mg/kgであり；従って、このサルは最も感受性のある種であるように見えた。ヒトにおける4-CNABの提唱された最高用量2000mg(＜30mg/kg)は、サルのNOAELの12〜16分の1である(すなわち、NOAEL＝400mg/kg 4-CNAB単独及び15U/kgインスリンとの併用)。サルにおけるインスリンの絶対生物学的利用率は、約1％又はそれ未満であった。毒性試験において、2000mg/kgと高い4-CNAB投与量と併用した経口投与量レベル15U/kgでのインスリンに属したラットにおける知見はなかった。サルにおいて、15U/kgのインスリン投与量は、1匹のサルにおける4-CNAB投与量1200mg/kgと併用した場合の1件の高血糖エピソードに関連しており；より低い投与量と併用した15U/kgインスリンでは、作用はなかった。

ラット及びサルにおける非臨床試験は、試験した範囲にわたり、4-CNAB投与量の増加に伴う、インスリン吸収の増加を明らかにした。同様に、4-CNABの固定した経口投与量に関して、インスリン吸収は、インスリン投与量の増加に伴い増加した。経口インスリン吸収は、ラットにおいて、インスリン及び4-CNABの両方の投与量を変動し、評価した。固定した4-CNAB投与量(200mg/kg)の存在下での、インスリン投与量4.55、6.5、9.75及び13単位/kgでの投与後に、血清インスリン濃度の有意な増加が、観察された。平均ピーク血清インスリンレベルは、各々、31、44、85及び132μU/mLであった。インスリン吸収は、投与量に依存し、インスリン投与量が増加すると増加した。水溶液のインスリン単独(13単位/kg)又は4-CNAB単独(200mg/kg)の経口投与は、血清インスリンレベルの有意な増加を生じなかった。血清インスリン濃度の有意な増加は、固定したインスリン投与量(13単位/kg)の存在下で、4-CNABの投与量50、100、200及び300mg/kgの投与後にのみ認められた。平均ピーク血清インスリンレベルは、各々、9、39、103及び157μU/mLであった。インスリン吸収は、投与量に依存し、4-CNAB投与量が増加すると増加した。
前述の非臨床の情報を基に、出発インスリン投与量150インスリン単位USP(これはサルの無作用投与量15U/kgの約7分の1である)を選択した。

実施例5
4-CNABカプセル剤及びインスリン/4-CNABカプセル剤の漸増単回経口投与量の安全性及び忍容性を評価するために、単施設二重盲検無作為化プラセボ比較試験を、健常なヒト対象において行った。皮下(SC)インスリン治療群は、現存の標準治療に対する本併用治療の比較を可能にするために加え、及び経口インスリン単独治療群も、更に4-CNABの経口インスリン吸収に対する作用を評価するために含んだ。

本試験のひとつの目的は、健常対象における4-CNAB及びインスリン/4-CNABカプセル剤の単回経口投与量の安全性及び忍容性を評価することであった。本試験の別の目的は、単独の場合及びインスリン/4-CNAB併用の一部として投与された場合の4-CNABのPKを評価すること、インスリンのPK及びインスリンPKに対する増加する割合の4-CNABの作用を評価すること、並びに4-CNAB単独又はインスリン/4-CNABの単回経口投与後の血液グルコースに対する作用を評価することであった。本試験は、投与量の範囲を超えて試験される並びにSC及び経口インスリン単独治療と比較される4-CNABの経口インスリンのPK及びPDに対する作用の調査を可能にした。10単位SCインスリン、150USP単位経口インスリン単独、経口プラセボ及びSCプラセボの対照治療は、4-CNAB及びインスリン/4-CNABの忍容性、PK及び作用が効率的に評価されることを可能にした。C-ペプチドタンパク質の同時測定は、内因性インスリンとの相関関係をもたらした。投与量後6時間での摂食も、インスリン及びグルコースに対するその作用の観察をもたらした。投与される治療数、更に試験期間の短縮のために、並行群を用いた。対象及び医師の二重盲検の特徴は、最小バイアスを確実にした。

年齢18〜50歳の間の男性対象を募集し、及び全般的健常集団の代表として選択し、これはこのような試験に適していると判断された。対象が健常であること、その結果試験手法から及びインスリン/4-CNABの副作用に対して最小のリスクであることを確実にするように、選択基準(包含及び除外)を選択した。対象は、スクリーニング時に既往歴、理学的検査及び臨床検査試験を基に決定された際に、良好な健康状態であった。これらの対象は、調節されたMetropolitan Life Insurance社により発行された理想体重表1983年版に従い理想体重の許容できる偏差内(+/-15％)であった。スクリーニング時に得られた全ての臨床検査値(血液学、血清化学、及び尿検査)は、おおむね正常範囲内であった。臨床試験は、絶食状態で行い、グルコースを測定した。しかし正常範囲外の臨床検査値については、臨床試験を再度行った。これらの対象は、試験開始の14日前以降に記録された12-誘導心電図を有し、及び結果は正常な記録又は臨床的に有意な異常のない記録を有した。

各群の各治療期間内に、8名の対象は活性治療を受け、2名の対象はプラセボを受け取るように計画した。第1群において、4種の4-CNABの漸増単回投与量(400、800、1400及び2000mg)が存在し、並びに各対象はこれらの漸増投与量の全て又は漸増単回投与量の3種及びプラセボ投与量の1種を受け取った。第2群において、3種の治療(SCインスリンの10単位及びインスリン/4-CNABの2種の漸増経口投与量；150単位/200mg、100単位/600mg)が存在し、並びに各対象は、これらの治療の3種全て又はこれらの治療の2種のいずれか及び1種のプラセボ治療を受け取った。第3群において、インスリン/4-CNABの3種の漸増経口投与量(100単位/300mg、100単位/450mg及び150単位/100mg)並びにインスリン150単位の1種のSC投与量が存在する。各対象は、これらの治療の4種全て又はこれらの治療の3種のいずれか及び1種のプラセボ治療を受け取った。全ての群に関して、治療期間の間に少なくとも72時間の休薬期間が存在した。

本試験に参加した29名の志願者を、3群に分けた(第1群9名、並びに第2群及び第3群の各々10名)。無作為化は、個々の対象が、1回のみプラセボを受け取るか又は全く受け取らないように、階層化した。各群の対象2名は、プラセボを受け取った。第1群は、4-CNABカプセル剤又はプラセボの4種の漸増経口投与量を受け取り(表5参照)、各対象は4種の活性治療又は3種の活性治療及び1種のプラセボ治療を受け取った。各治療について、予め作成された無作為化コードに従い、7名の対象は活性治療を受取り、2名はプラセボを受け取った。

第2群は、インスリン/4-CNABカプセル剤又はプラセボの3種の漸増経口投与量を受け取り(表6参照)、各対象は3種の活性治療又は2種の活性治療及び1種のプラセボ治療を受け取った。各治療について、予め作成された無作為化コードに従い、8名の対象は活性治療を受取り、2名はプラセボを受け取った。

第3群は、インスリン/4-CNABカプセル剤又はプラセボの3種の経口投与量及びインスリンカプセル剤単独又はプラセボの1種の経口投与量を受け取り(表7参照)、各対象は4種の活性治療又は3種の活性治療及び1種のプラセボ治療を受け取った。各治療について、予め作成された無作為化コードに従い、8名の対象は活性治療を受取り、2名はプラセボを受け取った。

4-CNAB単独及びインスリン/4-CNABカプセル剤は、AAIPharma社(ウィルミントンNC)が調製した。カプセル剤に使用した4-CNABは、cGMP薬事監視(compliance)下で製造した。カプセル剤調製に使用したインスリンは、Eli Lilly社(インディアナポリス、IN)から入手したヒト結晶性インスリン亜鉛：プロインスリン由来(組換えDNA起源)USP品質であった。SC投薬に使用したインスリンは、Medeval社により提供された。このインスリンは、Humulin R(商標名Humulin S注射剤100単位/mL)と同等のヒト結晶性インスリン亜鉛：プロインスリン由来(組換えDNA起源)であった。プラセボカプセル剤は、Methocel E15 Premium LVが200mg充填されたサイズ3の硬ゼラチンカプセルからなる。各カプセル剤は、-10℃又はそれ以下で凍結保存し、開封前に室温に戻し(15〜30℃)、及び4時間を超えて室温に置かなかった。

カプセル剤は、水240mLと共に投与した。全ての群について、治療期間の間に少なくとも72時間の休薬期間が存在した。各投薬後、安全性データ(すなわち、生命徴候、血液グルコース、及び入手可能な4-CNAB血漿濃度)を収集し、及び次の投与量レベルへ進む前に評価した。
各試験治療期間の第1日目に、最低8時間の一晩絶食後、被験医薬品(カプセル剤又はSC投与量)が、ほぼ午前8時に投与された。カプセル剤は、直立した姿勢の対象に、水240mLと共に投与した。総投与時間は、2.5分を超えなかった。インスリン溶液又はプラセボ(生理食塩水)のSC投与量は、単回ボーラス投与として、腹壁に注射した。各治療期間は、12〜24時間持続した。
調製した活性及びプラセボ試験治療物の外見(appearance)は同一であり、従って治療物外見の盲検の維持は本試験では問題ではなかった。医薬品の投与は監視され、従って服薬遵守違反は本試験では問題ではなかった。

対象は、朝の投薬前最低8時間、投薬後6時間まで、一晩絶食し、その後各対象は、少なくとも2枚のパンを含む完全食を食した。対象には、標準の高炭水化物食及びスナックが提供された。水は、各治療の投与後1時間を除き(投薬に必要なものを除き)、自由に摂取した。対象には、キサンチン又はキサンチン関連物質、グレープフルーツ含有製品、Sevilleオレンジ及びマーマレードを、投薬前24時間及び試験期間を通じて控えるように依頼した。アセトアミノフェン(パラセタモール)以外の併用薬は、試験期間は許可せず、並びにアルコールは、投与前24時間及び臨床施設入院中は許可しなかった。非喫煙者及び1日に最大5箱まで喫煙する喫煙者を募集した。喫煙は、臨床施設入院中は許可しなかった。対象には、-1日目の48時間前から、入院期間の最後までは、激しい生理的活動及び接触スポーツは避けるように依頼した。

各群内の用量漸増は、各治療につき対象2名が、54mg/dl(3.0mmol/L)未満の血液グルコースレベルを示すまで継続した。一旦この投与量が確定されたならば、インスリン及び4-CNABの比の変更を探索する適用可能な方法を行った。選択されたインスリン投与量は、血液グルコースレベル54mg/dL(3.0mmol/L)を引き起こしたインスリン投与量よりも高くはなく、4-CNAB投与量は既に与えられたものよりも高くはなかった。
安全性評価は、理学的検査、既往歴、生命徴候、12-誘導心電図(ECG)モニタリング、臨床検査評価及び有害事象のチェックを含んだ。活性パラメータは、血液グルコース、インスリン、C-ペプチド、及び4-CNABの血漿濃度測定を含んだ。

第2群及び第3群のインスリン/4-CNAB治療に関して、血漿グルコース、インスリン及びC-ペプチド測定のために、対象の血液試料(1試料につき1滴)を、投薬前15分前、及び投薬後5、10、15、20、25、30、35、40及び50分、並びに1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、6、8及び12時間に採取した(インスリン/4-CNAB投薬群に関して1治療につき21試料)。第1群の4-CNAB単独治療について、血液グルコース測定のために、血液試料を、投薬前(-15分)、並びに投薬後30分及び2時間に採取した。インスリン単独の対照群(最低3名の対象)について、血液試料(ヘパリンナトリウム管中3mL)を、投薬前15分、並びに投薬後10、20、30、40、50分及び1、1.25、2、2.5、3及び6時間に採取した(1治療につき12試料)。グルコースのための血液試料は、Glucometer(登録商標)を用い、実時間でアッセイした。これらの測定は、低血糖症の発生の決定に使用され、そのため必要な場合は救済活動がとられた。血漿グルコース、インスリン及びC-ペプチド測定は、標準の手法に従い行った。

2本の18-ゲージIVラインを、投薬前に配置し；1本は、血液採取のため、及び他方は、低血糖症治療が必要な場合の、第2群及び第3群の対象の20％グルコース注入の可能性のためである。第1群の対象のみは、1本のカニューレ挿管した。血漿グルコース、インスリン及びC-ペプチド分析のための血液試料は、採血直後及び遠心前に、2℃〜8℃で保存した。血液試料は、試料採取の1時間以内に、3000rpmで15分間、温度2℃〜8℃で、遠心した。プラスチック製ピペットを用い、赤血球層を破壊することなく、採取管から血漿を、予めラベルを付けたポリプロピレン製チューブにピペットにより移し、-70℃で保存した。

全試験のために各対象から採取された総血液容量(試験スクリーニング及び安全性評価を含む)は、第3群の対象について625mLを超えず、第2群の対象について487mL、及び第1群の対象について380mLを超えなかった。
血漿中の4-CNAB濃度は、液体クロマトグラフィー及びLC-MS/MSとして公知である質量分析アッセイを用いて決定した。この方法は、タンパク質沈殿、それに続くHypersil BDSカラム並びにメタノール及び酢酸緩衝液からなる移動相を用いる液体クロマトグラフィーによる分離に関連している。溶離ピークは、MS/MSにより定量した。血漿中4-CNABの決定に使用した装置は、Micromass Quattro Micro MS/MS検出器を伴う、Agilent 1100モジュラーHPLCシステムで構成される。本試験を通じ、HPLC及びAR等級の化学物質及び試薬を使用した。

薬物動態及び薬力学評価
血漿グルコースは、グルコースリン酸化を触媒する試薬を正確な割合で混合するBECKMAN Synchron CXシステムを用いる指定時のエンドポイント法を基に測定した。Synchron CXは、固定された時間間隔で、340nmでの吸光スペクトルの変化を測定する。吸光度の変化は、試料中のグルコース濃度に直接比例している。
血漿C-ペプチドは、2種のモノクローナル抗体がC-ペプチド分子上の抗原決定基に対して示される直接サンドイッチ法を使用した、固相、二部位(two-site)蛍光免疫アッセイを基にした、DELFIA C-ペプチドキットを用い測定した。試薬は、標識された抗体からユーロピウムイオンを解離し、これはその試薬と蛍光キレートを形成する。その蛍光は、試料中のC-ペプチド濃度に直接比例している。

4-CNAB及びインスリンの血漿濃度を基に、WinNonlin(商標)プロフェッショナル版3.2.において実行される非-コンパートメント型PK法を用い、PK分析を行った。インスリン及びC-ペプチド補正したインスリンに関するプロファイルは、インスリン治療後6時間で食事が与えられるので、最大6時間まで評価した。下記のパラメータは、4-CNABに由来した：C_max、t_max、AUC_(0-t)、AUC_(0-inf)、AUC_%Extrap、K_el、t_1/2、CL/F、Vd/F、MRT_(0-t)、MRT_(0-inf)及びF_rel。下記のパラメータは、インスリン及びC-ペプチド補正したインスリンに由来した：C_max、t_max、AUC_(0-2)、AUC_(0-6)、AUC_(0-t)、並びに低血糖症介入直前の濃度(C^b)及び対応時間(t^b)。

グルコースの血漿濃度を基に、WinNonlin(商標)プロフェッショナル版3.2.を用い、PD分析を行った。グルコース、ベースラインからのグルコースの変化、及びベースラインからのグルコース変化の割合(％)のプロファイルを、インスリン治療後6時間で食事が与えられるので、最大6時間まで評価した。下記のPDパラメータを、血漿グルコース濃度についてコンピュータ処理した：AURC_(0-2)、AURC_(0-t)(総反応)、R_max(最小値)、t_Rmax、並びに低血糖症介入直前の濃度(R^b)及び対応時間(t^b)。下記のPDパラメータを、ベースラインからの血漿グルコース濃度変化についてコンピュータ処理した：AUEC_(0-2)、AUEC_(0-t)(ベースライン差引き)、E_max(ベースライン差引き)、t_Emax(内挿なしで入手)、ベースラインからの変化の割合(％)、並びに低血糖症介入直前の濃度(E^c)及び対応時間(t^c)。
前記パラメータは、治療群別に、記述統計(平均、標準偏差(SD)、偏差の係数(CV％)、平均の標準誤差(SE)、最小値(Min)、中央値、最大値(Max)、及び標本の大きさ(N))を用いてまとめた。個々のデータは、投与量別、対象別に報告した。

インスリンのPK分析については、測定したインスリン濃度及びC-ペプチド補正したインスリン濃度の両方について行った。これは、前駆体C-ペプチドの濃度及び下記式を用いて行った：
補正したインスリン濃度＝インスリン濃度−(ベースライン比×C-ペプチド)
(式中、ベースライン比＝インスリン濃度／C-ペプチド濃度、各時点での)

同様に、グルコースのベースラインレベルを考慮するために、ベースラインからのグルコース濃度の変化の割合(％)(減少又は増加)を基に、PD分析を行い、ここでベースラインは、絶対値のみよりもむしろ、投与前濃度レベルとして採用した。ベースライン値からのグルコース濃度の変化の割合(％)も計算し、及びプロファイルを表作成しプロットした。従って、
ベースラインからのグルコース変化の割合(％)＝｛(グルコース濃度−ベースライングルコース濃度)／ベースライングルコース濃度｝×100
(式中、ベースラインからのグルコース変化＝グルコース濃度−ベースライングルコース濃度)

インスリン及びグルコースの最大変化は、投薬後最初の2時間に生じるように見えるので、追加のパラメータ、インスリン及びC-ペプチド補正したインスリンに関するAUC_(0-2)並びにグルコース及びベースラインからのグルコース変化に関するAURC_(0-2)及びAUEC_(0-2)を各々計算した。インスリンに関して、対象の大半について外挿が可能であり、従って消失半減期速度定数K_el及びその結果AUC_(0-inf)は計算できない。食事は投薬後6時間で与えられたので、AUC、AURC及びAUECは、インスリン及びグルコースの各々について、最大6時間計算し、これはインスリン及びグルコース濃度に対するインスリン/4-CNAB作用のより正確な測定をもたらした。グルコースのベースラインからの変化に関して、E_maxは、投与後最大6時間までの最大減少とした。

4-CNAB又はインスリン/4-CNAB治療を受けた対象における4-CNABの血漿濃度-時間プロファイルを、評価した。全治療の投与後のインスリン、C-ペプチド及びグルコース濃度-時間プロファイルを、第2群及び第3群の20名の対象について評価した。4-CNAB、インスリン及びC-ペプチド補正したインスリンに関する薬物動態("PK")パラメータ、並びにベースラインからのグルコース濃度変化に関する薬力学("PD")パラメータは各々、対象が低血糖症救済を必要とするか否かに関わらず、対象について計算した。低血糖症のために食物／飲料が必要な対象の濃度は、記述統計から除外した。PK及びPDパラメータは、記述統計が低血糖症のための食物／飲料による介入を必要とした8名の対象全員について提供されたSCインスリン後を除き、これらの対象について個別にまとめた。

多くの対象が、治療中に低血糖症を経験し、及び血液グルコースレベルを上昇するために、食物(チョコレート、果実又はオレンジジュース)を与えられた。これらの対象は、濃度-時間の要約統計から除外し、並びに要約的PK及びPDパラメータは、低血糖症救済を必要としなかった対象から個別に示された。低血糖症を経験したこれらの対象について、追加のパラメータ、インスリンに関するC^b及びt^b値、グルコースに関するR^b及びt^b値、並びにベースラインからのグルコース変化に関するE^c及びt^c値は、低血糖症救済直前の濃度及び時間を反映したものとして記録した。

4-CNABの薬物動態
全ての治療後の4-CNABの個別の血漿-濃度を、表とした。健常男性志願者への4-CNAB単独又はインスリン/4-CNABカプセル剤投与後の4-CNABの平均(+SD)血漿濃度/時間プロファイルは、図1(第1群)及び図2(第2群及び第3群)に示した。
4-CNAB単独の漸増経口投与後の平均4-CNAB濃度-時間プロファイル(図1)は、迅速な吸収を示し、ピーク濃度には中央値時間約0.62時間で到達した。最大濃度到達後、4-CNAB濃度は二相様式で急激に減少した。最大濃度C_max及び曝露(すなわちAUC)は、投与量増加と共に明らかに増加した。インスリン/4-CNABの併用カプセル剤が投与された場合(図2A及び2B)、4-CNAB最大レベルには、4-CNAB治療単独とほぼ同時点で到達し、及び4-CNABピーク濃度は、インスリンとの併用において4-CNAB量の増加と共に明らかに増加した。4-CNABの最高投与量を含有する100単位インスリン/600mg 4-CNABの併用治療は、最高平均ピーク濃度を生じたのに対し、150単位インスリン/100mg 4-CNABの最低投与量の投与後には、最低平均ピーク濃度が認められた。

4-CNAB単独及びインスリン/4-CNAB治療後の血漿中の4-CNABに関する各治療、t_maxに関する、平均値±SD、及び範囲(括弧)は、記述統計と共に、以下に示した。
4-CNAB単独のカプセル剤の経口投与(第1群)後の4-CNABの薬物動態パラメータは、下記表8に要約し、平均(+SD)血漿濃度/時間プロファイルを図1に示した。

値は、N=7として、平均±標準偏差として示した(中央値(範囲)で示したt_maxを除く)：但し、a=3、b=4及びc=5。
インスリンと併用した4-CNAB投与(第2群及び第3群)後の 4-CNABの薬物動態パラメータは、下記表9に要約し、第2群及び第3群の平均(+SD)血漿濃度/時間プロファイルを図2に示した。

値は、平均±標準偏差として示した(中央値(範囲)で示したt_maxを除く)。平均は8名の対象のものである。
4-CNAB単独投与後の図1の平均濃度-時間プロファイル並びにC_max及びAUC_(0-inf)の得られた値に認められるように、4-CNABのレベル(C_max)及び曝露(AUC)は、一般に4-CNAB投与量と共に増加し、C_max及びAUCの両値は、400mg及び800mg投与量について投与量-依存型で増加した。4-CNAB単独治療群において、C_maxは、投与量400mg及び2000mgについて各々、22315±11456ng/mL及び135199±86565の範囲であった。最大4-CNAB濃度の時点は、全ての投与量について一貫しており、中央値は0.50〜0.75時間の範囲であった。4-CNABの平均消失半減期値は、最終消失相の変動性及び消失速度定数の推定が困難であるために、変動可能であり、5.90〜15.3時間の範囲であった。しかし、MRT値はより一貫しており、1.4〜1.8時間の間であった。

100単位インスリン/4-CNAB及び150単位インスリン/4-CNAB併用後の図2の平均4-CNAB濃度-時間プロファイル並びに先の表9に示された4-CNABのパラメータC_max及びAUCは、4-CNAB投与量の増加に伴う4-CNAB吸収の増加を示した。100単位インスリン/300mg 4-CNAB治療を除き、一般に4-CNAB吸収は、4-CNAB投与量の増加と共に増加した。インスリン/4-CNAB併用群において、C_maxの最高値は、100単位インスリン/600mg 4-CNAB後に生じ(35790±12291ng/mL)、並びに最低値は、150単位インスリン/100mg 4-CNAB後に生じた(6195±3605ng/mL)。4-CNABの消失半減期の平均値は、併用カプセル剤についてより変動が少なく、これらの投与群間において3.2時間〜5.3時間の範囲であった。
表10は、第1群、第2群及び第3群の要約を示し(治療群の全ての対象の平均)、無査定データを基にした、送達物質4-CNABのC_max、t_max及び曲線下面積(AUC)を示した。

インスリン薬物動態
全ての治療後のインスリンの個々の血漿-濃度を表とした。治療投与後の非低血糖症対象に関する平均(+SD)血漿インスリン濃度/時間プロファイルは、図3A-C及び4A-Bに示した。
図3A、3B及び3Cは、非低血糖症対象(第2群)における、150単位/200mg(インスリン/4-CNAB)(n=5)、100単位/600mg(n=7)、10単位SCインスリン(n=8)及び経口プラセボ(n=10)治療投与後の平均(+SD)血漿インスリン濃度/時間プロファイルを示した(図3Cは、無査定データを用いるこのプロファイルを示している)。図4A及び4Bは、非低血糖症対象(第3群)における、100単位/300mg(インスリン/4-CNAB)(n=7)、100単位/450mg(n=7)、150単位/100mg(n=8)、150単位USP経口インスリン(n=8)及び経口プラセボ(n=10)治療投与後の平均(+SD)血漿インスリン濃度/時間プロファイルを示した。

非低血糖症対象における平均インスリン濃度は、投薬後0.4〜0.6時間でピークレベルに達し、その後急激に降下し、およそ1時間後にはベースラインレベルに戻った。インスリン吸収及び曝露の増加は、予想されたように、投与量の増加と共に認められた(150単位インスリン/100mg 4-CNAB治療から、150単位インスリン/200mg 4-CNAB治療への変更時)。C_max及びAUC値を基に、併用したインスリン/4-CNAB治療は、150単位の経口インスリン単独及び経口プラセボと比べ、インスリン吸収が有意に可能になったことは明らかであった。150単位インスリンが単独で投与された場合は、インスリン吸収はなかった。10単位SCインスリン後、インスリン濃度の平均プロファイルは一貫性がなく、ふたつのピーク濃度およそ300pmol/Lが、投与後ほぼ2及び4時間で生じた。
各治療に対する全対象、非低血糖症対象及び低血糖症対象に関するインスリンPKパラメータの平均値±SDを、下記表11及び12に示した。

表11において：
−値は、平均±SDとして示した(中央値(範囲)が示されたt_max以外)。
−^a最大6時間の最大濃度及びインスリン濃度の対応時間。
−^b低血糖症からの回復直前のインスリン濃度及び対応時間。
−^c 経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。
−NA＝入手不可能；2対象又はそれ未満のいずれか。

表12において：
−値は、平均±SDとして示した(中央値(範囲)が示されたt_max以外)。
−^a最大6時間の最大濃度及びインスリン濃度対応時間。
−^b低血糖症からの回復直前のインスリン濃度及び対応時間。
−^c 経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。
−NA＝入手不可能；2対象又はそれ未満のいずれか。

100単位インスリン/300mg 4-CNAB、100単位インスリン/450mg 4-CNAB及び100単位インスリン/600mg 4-CNAB投与後の非低血糖症対象における平均C_maxインスリン値は、各々、69.9±21.4pmol/L、112.4±53.1pmol/L及び120.1±64.2pmol/Lであった。ピークインスリン濃度の時間は、全てのインスリン/4-CNAB併用治療に関しておよそ0.1〜0.4時間の範囲であった。インスリン濃度は、150USP単位経口インスリン単独投与後に最低であり、これはインスリン単独が経口投与された場合には、インスリンが吸収されないことを示している。

全ての対象(非低血糖症対象及び低血糖症対象)の平均C_maxインスリン値は、大きく変動した。100単位インスリン/300mg 4-CNAB、100単位インスリン/450mg 4-CNAB及び100単位インスリン/600mg 4-CNAB投与後の平均C_max値は、各々、91.0±63.4pmol/L、152.5±123.5pmol/L、及び159.3±125.6pmol/Lであった。ピークインスリン濃度の時間の中央値は、全てのインスリン/4-CNAB併用治療に関しておよそ0.25〜0.4時間であった。
治療後の個別のC-ペプチド血漿濃度を計算した。第2群の対象への投薬後のC-ペプチド補正したインスリンの薬物動態パラメータは、下記表13にまとめた。

表13において、値は、平均±SDとして示し(中央値(範囲)が示されたt_max以外)、及び
−^a最大6時間の最大濃度及びC-ペプチド補正したインスリン濃度対応時間。
−^b低血糖症からの回復直前のC-ペプチド補正したインスリン濃度及び対応時間。
−^c 経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。
−NA＝入手不可能；2対象又はそれ未満のいずれか。

第3群の対象への投薬後の C-ペプチド補正したインスリンの薬物動態パラメータを、下記表14にまとめた：

表14において、値は、平均±SDとして示し(中央値(範囲)が示されたt_max以外)、及び
−^a最大6時間の最大濃度及びインスリン濃度の対応時間。
−^b経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。

図5は、4-CNAB単独、プラセボ及び150Uヒトインスリン単独(第1群)の経口投薬後の平均(+SD)血漿C-ペプチド濃度/時間プロファイルを示している。図6は、平均プロファイルが低血糖症対象のものであるSCインスリンを除き、非低血糖症対象(第2群)の150単位/200mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/600mg、10単位SCインスリン及び経口プラセボ治療の投与後の、平均(+SD)血漿C-ペプチド濃度/時間プロファイルを示している。図8は、非低血糖症対象(第3群)の100単位/300mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/450mg、150単位/100mg、150単位USPインスリン及び経口プラセボ治療プロファイルの投与後の、平均(+SD)血漿C-ペプチド濃度/時間プロファイルを示している。
図7は、第2群の対象に関する、治療投与後の、平均(+SD)ベースラインからのC-ペプチド濃度変化の割合(％)/時間プロファイルを示している。

全ての対象に関する150単位/200mg及び100単位/600mg治療の投与後に達成されるC-ペプチド補正したインスリンの平均C_max値は、各々、186.9±137.2pmol/L及び118.7±87.7pmol/Lであった。非低血糖症対象に関して、100単位/300mg、100単位/450mg及び100/600mgを含む治療後、C_max及びAUC_0-2値を基にしたC-ペプチド補正したインスリン曝露と4-CNABの漸増投与量に関して投与量-依存型の関係が明らかであった。インスリン曝露の増加は、150単位インスリン/100mg 4-CNAB治療から150単位インスリン/200mg 4-CNAB治療へ変更する場合にも認められた。

平均C-ペプチド濃度は、併用インスリン/4-CNAB治療の投薬後ほとんど直ちに下降し、0.5から1.0時間の間に最大下降に達した。その後濃度は、投薬後およそ2時間で、ベースラインレベルへ回復するように見えた。経口プラセボ及び150単位経口インスリン単独後、C-ペプチド濃度において、ベースラインからの変化はほとんどなかった。10単位SCインスリン後の平均プロファイルは、低血糖症を経験した対象(8名の対象中8名)に関するものであり、彼らの血液グルコースレベルを増加するために、食物/飲料が与えられた。C-ペプチドは、内因性インスリン排泄の副産物である。経口インスリン投与後、この経口インスリンは、内因性インスリンの生成を抑制し、及びこれはC-ペプチド生成の下降へとつながる。本試験において、インスリン/4-CNABの経口投与後のC-ペプチドレベルの低下、及びインスリン単独又はプラセボ投薬後のC-ペプチドレベルの混乱した(litter)変化は、ヒトインスリンの有効な吸収を明らかに明示している。

10単位のSCインスリンの投与後、8名の対象全員が、食物/飲料による低血糖症回復を必要とし、その結果併用経口インスリン/4-CNAB治療の相対生物学的利用率及び効力を計算することは不可能であった。典型的には、ピーク濃度の時間の中央値は、中央値t_max時間およそ2.00時間を示した150USP経口インスリン単独及びSCインスリンを除き、全ての治療についてほぼ0.3〜0.4時間であった。これらのデータから、150USP経口インスリンのほとんどは吸収されないことは明らかであった。インスリン/4-CNAB治療と比べ、150USP経口インスリン単独の後に吸収されたインスリンが存在しないことは、経口送達物質4-CNABのヒトインスリンの経口吸収に対する有効性を示している。

100単位インスリンを含有するインスリン/4-CNAB併用治療について、C_max及びAUC_0-2値を基にしたC-ペプチド補正したインスリンの吸収及び曝露と4-CNABの漸増投与量に関して投与量-依存型の関係が明らかであった。インスリン吸収及び曝露の増加は、予想されたように、150単位インスリン投与量についても認められた(150単位インスリン/100mg 4-CNAB治療から、150単位インスリン/200mg 4-CNAB治療へ変更する場合)。C_max及びAUC値を基に、併用インスリン/4-CNAB治療は、150単位経口インスリン単独及び経口プラセボと比べ、有意なインスリン吸収が可能であることは明らかであった。

前記データを基に、下記薬物動態の結論を引き出すことができる：
−4-CNABへの曝露は、4-CNAB単独の漸増投与量により増大する。
−4-CNABへの曝露は、100単位インスリン/300mg 4-CNAB治療を除き、併用インスリン/4-CNAB治療における4-CNABの漸増投与量と共に増大するように見える。
−C-ペプチド補正したインスリンへの曝露は、治療の一部としての4-CNABの割合の増加と共に増加した。
−150単位経口インスリン単独の経口投与後、インスリンの吸収はなかった。
−インスリンの経口吸収は、150単位インスリン/200mg 4-CNAB及び100単位インスリン/600mg 4-CNABを含有する併用治療の投与後に最大であった。

薬力学の結果
図9A及び9Bは、非低血糖症対象(第2群)における、150単位/200mg(インスリン/4-CNAB)(n=5)、100単位/600mg(n=7)、10単位SCインスリン(n=8)及び経口プラセボ(n=10)治療の投与後の、平均(+SD)グルコース濃度/時間プロファイルを示している。図10A及び10Bは、非低血糖症対象(第3群)における、100単位/300mg(インスリン/4-CNAB)(n=7)、100単位/450mg(n=7)、150単位/100mg(n=8)、150単位USP経口インスリン(n=8)及び経口プラセボ(n=10)治療の投与後の、平均(+SD)グルコース濃度/時間プロファイルを示している。

平均グルコース濃度は、併用インスリン/4-CNAB治療の投薬後およそ0.2時間で下降し始め、併用インスリン/4-CNAB治療のRmaxは、投薬後0.5〜1.0時間の間に認められた。その後濃度は、投薬のおよそ2時間後には、ベースラインレベルへ戻るように見えた。経口プラセボ及び150単位経口インスリン単独の後、グルコース濃度にはわずかな変化のみが存在し、このことは、インスリンがほとんど吸収されないことを示している。インスリン10SC単位後の平均プロファイルは、低血糖症を経験した対象(8名の対象中8名)のものであり、彼らの血液グルコースレベルを上昇するために、食物/飲料を与えた。

低血糖症及び非低血糖症対象に関する全ての治療後の個々のグルコースのPDパラメータは、記述統計と共に列記した。個々のベースラインからの血漿グルコース濃度の変化を表とし、及び個々のベースラインからのグルコース濃度の変化/時間プロファイルを作成した。各治療についての全ての対象、非低血糖症対象及び低血糖症対象に関するグルコースPDパラメータの平均値±SDは、下記表15及び16に示し、及びプロファイルは図9A-B及び10A-Bに示した。

表15において、値は、平均±SDとして示し(中央値(範囲)が示されたt_max以外)、及び
−^a最大6時間の最大濃度及び血中グルコース濃度の対応時間は投与後。
−^b低血糖症から回復する直前のグルコース濃度及び対応する時間。
−^c経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。
−NA＝入手不可能；2対象又はそれ未満のいずれか。

表16において、値は、平均±SDとして示し(中央値(範囲)が示されたt_max以外)、及び
−^a投与後最大6時間の最大濃度及び血漿インスリン濃度の対応時間。
−^b経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。
−^c値は、6時間の採血スケジュールに関するAURC_(0-t)に対応。

併用インスリン/4-CNAB治療の後、血漿グルコース濃度は、およそ0.75時間まで急激に下降し、その後徐々に増加し、投与後約2.00時間でベースラインレベルを回復した。前述のプロファイルから、インスリン/4-CNAB併用に関するベースラインからの最大グルコース濃度変化は150単位インスリン/200mg 4-CNAB後に生じた。次に大きいグルコースに対する作用を有する治療は、100単位/600mg 4-CNAB治療であるように見えた。これらの知見は、これらふたつの治療後に達成されたC-ペプチド補正したインスリンレベルのピーク濃度とよく相関していた(表12参照)。SCインスリン10単位を受け取った対象は、グルコース濃度の最大の下降を経験し、結果的にこれは低血糖症反応につながり、食物/飲料摂取を伴う介入により回復した。

低血糖症及び非低血糖症対象のための全ての治療後のベースラインからのグルコース変化の割合(％)の個々のPDパラメータを表とし、並びに個々のベースラインからのグルコース濃度の変化の割合(％)-時間プロファイルを、記述統計と共に作成した。治療第2群及び第3群の全ての対象、非低血糖症対象及び低血糖症対象のベースラインPKパラメータからのグルコース変化の平均値±SDを、下記表17及び18に示した。治療投与後の非低血糖症対象に関するベースラインからのグルコース濃度の変化の割合(％)の平均(+SD)/時間プロファイルは、平均プロファイルが低血糖症対象に関するものであるSCインスリン以外は、図11A-11C(第2群)(図11Cは無査定のデータを用いこのプロファイルを示している)及び図12(第3群)に示されている。加えて、投与後最大6時間のベースラインからの最大の変化の割合(％)の平均も、下記のこれらの表に示した。

表17において、値は、平均±SDとして示し(中央値(範囲)が示されたt_max以外)、及び
−^a投与後最大6時間のベースラインからの最大変化及び対応時間＝(グルコース濃度-ベースライン濃度)。
−^b最大6時間のベースラインからの最大％変化＝(グルコース濃度-ベースライン濃度)／ベースライン濃度＊100。
−^c低血糖症から回復する直前のベースラインからのグルコース濃度変化及び対応する時間。
−^d経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。
−NA＝入手不可能；2対象又はそれ未満のいずれか。

表18において：
−^a投与後最大6時間のベースラインからの最大変化及び対応時間＝(グルコース濃度-ベースライン濃度)。
−^b最大6時間のベースラインからの最大％変化＝(グルコース濃度-ベースライン濃度)／ベースライン濃度。
−^c経口プラセボ値は、第2群及び第3群について一緒にした。
−^d値は、6時間の試料採取スケジュールについてのAUEC_(0-t)に相当。

下記表19は、無査定のデータを基にした第2群及び第3群におけるインスリン及び4-CNAB併用の作用の比較を示す。

非低血糖症対象において、E_maxを基にしたグルコースのベースラインからの最大の変化は、150単位/200mgによりもたらされ、それに100単位/600mg及び100単位/450mg治療が続き、各々、値-1.0±0.7mmol/L、-0.9±0.5mmol/L及び-0.8±0.3mmol/Lを示した。インスリンのベースラインからの最大グルコース変化に対する作用は、4-CNABの投与量及びC-ペプチド補正したインスリンの血漿濃度の増加に伴い、増加するように見え、これは100単位インスリン/300mg 4-CNAB及び100単位インスリン/600mg 4-CNAB 治療について、各々、-0.3±1.0mmol/L及び-0.9±0.5mmol/Lの範囲である。概して、増加するインスリン/4-CNAB投与量及びC-ペプチド補正した血漿インスリン濃度と、ベースラインからの血漿グルコース最大％低下の間には、良好な相関関係が存在する。

血漿グルコース濃度の最大％低下は、150単位/200mg治療の経口投薬後に達成され、それに100単位/450mg及び100単位/600mg治療が続き、各々、最大％低下値の-28.64±17.80％、-16.98±8.28％及び-15.92±7.30％を生じた。これらの治療に関して、同様のAUEC_(0-2)値が認められ、全ておよそ-0.4mmol.h/Lであり、更に同様のt_Emax中央値時間はおよそ0.6時間であった。グルコース濃度のベースラインからの最大％低下は、4-CNABの投与量の増加と共に増大し、値は100単位インスリン/300mg 4-CNAB及び100単位インスリン/600mg 4-CNAB治療について、各々、-12.6及び-16.1％の範囲であった。

同様の良好な相関関係が、最大グルコース変化の割合(％)(ベースラインからの低下)とインスリン/4-CNAB投与量及びC-ペプチド補正したインスリン濃度の間に存在した。グルコースレベルの最大変化の割合(％)(下降)は、低血糖症回復が必要とされた10単位SCインスリンを受け取った対象において(-39.82±8.26％)(E_max：-2.28±0.5mmol/L)、及び150単位/200mg経口投与量を受け取った対象(-28.64±17.80％)において生じた。

前記データを基に、下記の薬力学的結論を引き出すことができる：
−インスリンのベースラインからの最大グルコース濃度変化の平均に対する作用(E_max)は、併用治療の一部として4-CNAB投与量が増加するにつれて増加するように見える。
−一般に、ベースラインからのグルコース濃度変化の増加及びベースラインからのグルコース濃度変化の割合(％)は、インスリン/4-CNAB投与量及びC-ペプチド補正したインスリン濃度の増加と共に認められた。
−ベースラインからの最大グルコース濃度変化の平均(E_max)を基に、100単位インスリン/600mg 4-CNAB及び150単位インスリン/200mg 4-CNABは、経口プラセボ及び150単位経口インスリン単独と比べ、より大きいPD反応を示すように見え、このことはインスリン送達におけるこの送達物質の有効性を示している。
−グルコースレベルの低下における経口インスリン/4-CNAB併用のいずれかの作用も、SCインスリンについて認められたものよりも少なかった。

考察及び全般的結論
本試験において、死亡例及び重篤な有害作用例はなかった。全ての対象は、スクリーニングを通過し、及び本試験を完了し、治験薬に関連した理由で本試験を脱落したものはなかった。生命徴候、ECG、臨床検査パラメータ(血液グルコース以外)及び理学的検査により評価された臨床的に有意な異常な結果はなかった。治療後に42件の治験薬に関連していると考えられた有害作用(AE)が存在した。

4-CNAB単独の経口投与は、忍容性は良好であった。4-CNAB単独後の安全性プロファイルは、非常に少ないAEを伴い、非常に良好であった。ほとんどの治療-関連したAEは、150単位インスリン/200mg 4-CNAB後(n=7)及び100単位インスリン/450mg 4-CNAB(n=6)後に報告され、加えて10単位SCインスリン後に16種の事象が報告された。全ての治療関連した42種のAE中の41種は、重症度が軽度であると分類された。試験期間に報告された最も一般的な治療-緊急性のあるAEは、低血糖症(26)、頭痛(12)及びめまい(5)であった。低血糖症の26種のエピソードの間に、対象は、20症例で救済治療を必要とし、すなわち20症例においてはそれらの血液グルコースを上昇するために、食物/飲料を必要とした。これらの中の12例は10単位SCインスリン後であり、3例は150単位インスリン/200mg 4-CNAB後であった。

4-CNABへの曝露は、単独で投与した場合には、4-CNAB投与量の増加と共に増加するように見える。4-CNAB単独の経口投与は、ヒト対象における血漿グルコースレベルに対する有意な作用を有さなかった。C-ペプチド補正した血漿インスリンは、4-CNAB投与量の増加と共に増加し、これはヒトインスリンの効果的経口送達及び吸収を示している。

平均4-CNABピーク血漿濃度及びAUCは、100単位インスリン/300mg 4-CNAB治療を除き、単独で又はインスリン/4-CNAB治療の一部のいずれかとして与えられた場合に、4-CNAB投与量の増加と共に増加するように見える。最大4-CNAB濃度の中央値(約0.6時間)は、4-CNAB単独及び併用インスリン/4-CNAB治療として与えられる場合と類似している。4-CNABの半減期は、単独で与えられる場合は高度に変動するが、インスリンと共に与えられる場合は半減期値は約4時間でより一貫している。半減期の変動性は、最終消失相の変動及び消失速度定数推定の難しさに起因していた。しかし、MRT値は、より一貫しており、全ての治療に関して1.4〜1.8時間の範囲である。

C_max及びAUC_(0-2)を基にしたインスリンの経口吸収及び曝露は、4-CNAB投与量の増加と共に増加し、これは4-CNABレベルの増加に伴うインスリンの効果的吸収を示している。インスリン/4-CNAB治療後のインスリンの吸収及び曝露は、150USP経口インスリン単独が与えられた場合よりも、明らかに大きい。平均最大血漿グルコース％低下を基に、治療100単位インスリン/600mg 4-CNAB及び150単位インスリン/200mg 4-CNABは、経口プラセボ又は150単位経口インスリン単独と比べ、より大きいPD反応を発揮するように見え、これは、インスリン送達及びその後の作用発生における送達物質の有効性を示している。

平均C-ペプチド補正したインスリンC_maxは、100単位インスリン/300mg 4-CNAB、100単位インスリン/600mg 4-CNAB、及び150単位インスリン/200mg 4-CNABの投与量について、各々、45.1±33.5pmol/L、95.0±61.0pmol/L、及び97.5±75.8pmol/Lの範囲である。残念ながら、8名の対象は全員、10単位SCインスリンの後、低血糖症のために食物による救済を必要としたので、SC投薬と比べたインスリン/4-CNAB治療のインスリン相対生物学的利用率の正確な測定を得ることは困難であった。

平均E_max及びAUEC_(0-2)の増加は、インスリン/4-CNAB治療の一部としての4-CNABレベルの増加、並びにC-ペプチド補正したインスリンの血漿濃度の増加と共に認められた。ベースラインからの平均最大グルコース％低下は、100単位インスリン/300mg 4-CNAB及び100単位インスリン/600mg 4-CNAB治療について、各々、-12.64±9.7％及び-14.47±4.6％の範囲であった。AUEC_(0-2)の値は、100単位インスリン/300mg 4-CNAB及び100単位インスリン/600 mg 4-CNAB治療について、各々、-0.31±0.41mmol.h/L及び-0.49±0.59の範囲であった。

従って、インスリンのベースラインからの最大血漿グルコース濃度変化の平均(E_max)に対する作用は、4-CNAB投与量の増加と共に増加し、並びに全ての併用治療について、経口インスリン単独及びプラセボよりも有意に大きく、このことはこの送達物質のインスリン送達における有効性を示している。概して、経口インスリンのベースラインからの血漿グルコース濃度変化及びベースラインからの変化の割合(％)に対する作用の増大は、インスリン/4-CNAB投与量の増加と共に認められた。

実施例6
2型糖尿病患者における経口インスリン、対、皮下(Sc)標準インスリンの薬力学特性及び薬物動態特性の比較
経口インスリン処方剤とSC標準インスリンの薬力学(PD)及び薬物動態(PK)の特性をグルコースクランプ技法を用い比較するため、並びに主な標的集団における経口インスリンの代謝作用に関する第一印象を得るために、単施設オープンラベル無作為化活性対照3-期間クロスオーバー試験を、2型糖尿病の患者10名について行った。
グルコースクランプ技法は、SC標準インスリンと比較し、経口適用されたインスリンの時間-作用プロファイルを比較するために利用した。この方法は、頻回の血液グルコース試料値からの負のフィードバックを利用し、指定された一定の血液グルコースレベルを維持するためにグルコース注入を調節する。従って、グルコース注入速度は、投与されたインスリンの薬力学的作用の測定値となる。

本試験の主要目的は、経口インスリンカプセル処方剤のふたつの投与量(2個のカプセル剤中の300Uインスリン/400mg 4-CNAB、及び1個のカプセル剤中の150Uインスリン/200mg 4-CNAB)のPK及びPD作用を、15U皮下(SC)注射された標準インスリンのそれと比較することである。2種の経口処方剤、対、SC注射の相対生物学的利用率及び生体効力を決定し、選択されたPD及びPKパラメータに関する対象間の変動性を調べた。

1年以上、米国糖尿病学会(ADA)(1998 Diabetes care、21: S5-S19)に定義されたような2型真性糖尿病である年齢35〜70歳の男性対象が、選択された。本試験に包含された対象は、BMI＜36kg/m²を有し、安定した血糖管理(HbA_1C＜11％)を有し、各試験投薬日前24時間はあらゆる経口低血糖症治療薬を服用せず、来院1回目前の少なくとも4週間はあらゆる治験薬を服用せず、入院の72時間前から及び試験期間中は激しい身体活動を控え、並びにプロトコールにより必要とされる臨床試験施設に拘束された。対象は、体重を一定に保った(+/-2kg)。
来院1回目に、対象は、絶食状態(少なくとも12時間はカロリーを摂取しない)で診療所を訪問した。対象の身長、体重、ボディマス指数(BMI)、生命徴候及び病歴を記録し、理学試験を行った。心電図(ECG)に加えその施設(local)のスクリーニング臨床試験を、全ての対象に行った。

与えられた経口治療は、インスリン/4-CNAB(N-(4-クロロサリチロイル)-4-アミノ酪酸一ナトリウム塩(4-CNAB))であった。カプセル剤調製に使用したインスリンは、Eli Lilly社(インディアナポリス、IN)から入手したヒト結晶性インスリン亜鉛：プロインスリン由来(組換えDNA起源)USP品質であった。各インスリン/4-CNABカプセル剤は、150インスリン単位USP及び200mg 4-CNABを含有し、及びAAI Pharma社(ウィルミントン、NC)が調製した。錠剤2錠を、300U経口インスリン/400mg 4-CNAB治療を受け取る対象に与えた。
インスリン/4-CNABカプセル剤は、各々40錠のカプセル剤及びポリエステルコイルを含むHDPE瓶に入れ提供した。各瓶は、ヒートインダクションシール及び子供が空けられないキャップを有し、-10℃又はそれ以下で凍結保存した。投薬日に、適当な数のカプセル剤を、冷凍庫から取り出し、室温(15〜30℃)で約1時間放置した。カプセル剤は、分配の4時間以内に使用し、未開封の瓶は、4時間より長くは室温に放置しなかった。
SC注射は、Profil社により提供された1.5-mLカートリッジ-100単位/mLで供給された、U-100ヒト標準インスリン(Eli Lilly社のHumulin(登録商標)R)、投与量15Uであった。このインスリンは、温度範囲5〜8℃で冷蔵庫に保存した。

来院2回目に、各対象は、ふたつの可能性のある治療系列のひとつに無作為化された。各対象は、グルコースクランプ手法の期間に、これらふたつの治療のひとつを受けた：300U経口インスリン/400mg 4-CNAB(カプセル剤2個)の経口治療(治療A)、又は15U標準SCインスリンの1回のSC治療(治療B)。
来院3回目、これらの対象は、それらの無作為化系列に従い、別治療A又はB、すなわち自身が来院2回目に受けなかったものを、グルコースクランプ手法と共に受けた。来院3回目の終了時までに両治療を受けた対象のみが、完了したと見なされた。最終試験(来院4回目)は、来院3回目以降行い、好ましくはグルコースクランプ手法直後に完了したが、来院3回目以降14日を超えることはなかった。

対象は全員、第三治療日(来院5回目)に参加し、この時対象は、150U経口インスリン/200mg 4-CNAB(カプセル剤1個)の単回投与である別の経口治療(治療C)を受け取った。10名の患者中8名が治療Cを受け取った。「二回目」の最終医療試験(来院6回目)を、来院5回目以降に行い、好ましくはグルコースクランプ手法直後に完了したが、来院5回目以降14日を超えることはなかった。
各系列の本治療の割当てを、下記表21に示す：

SCインスリン投与量15Uは、典型的2型糖尿病患者のための範囲内に収まるように選択した。このSC投与量と同等であると推定される経口投与量150Uインスリン(200mg 4-CNABとの併用)は、先行する治験を基に、SC投与量と比べ10倍スケールアップした。経口投与量300Uインスリン(400mg 4-CNABと併用)は、SC投与量と比べ20倍スケールアップした。
これら3種の治療は、単回投与量の投与であるので、患者数を低く保ち及びデータの変動を少なくするためには、クロスオーバーデザインが最も適している。15U標準インスリンのSC注射は、一般的標準療法であり、従って対照として使用した。2種の経口インスリン投与量は、PK及びPDパラメータの投与量依存を明らかにし、及び肝グルコース生成に対する抑制作用が、減量された経口投与量150Uでも認められるかどうかを調べるために選択した。

全ての治療期間は、少なくとも12時間の一晩絶食後、朝に開始した。投与は、グルコースクランプによる血液グルコースを6時間安定化した後行った。対象は、直立姿勢で、経口インスリンカプセル剤を、水200mLと共に服用した。SCインスリン投与に関して、29ゲージ針を、臍からおよそ10cmの、腹壁の左下方四分円内の持ち上げた皮膚へ垂直に挿入した。経口インスリン投与に関して、カプセル剤は、水200mLと共に、直立姿勢の患者へ投与した。総投与時間は、2.5分を超えることはなかった。対象は、治験薬服用後4時間は、直立姿勢を保った。

各試験来院の期間は、薬物投与投与後、グルコースクランプ技法を用い、安定化された個人の血液グルコース濃度が維持された。グルコースクランプ技法[DeFronzoら、Glucose Clamp Technique: A Method of Quantifying Insulin Secretion and Resistance、Am. J. Physiol.、237:E214-E223 (1979)]を用い、経口適用されたインスリンをSCインスリンと時間-作用プロファイルについて比較した。この方法は、正常血糖を維持するためのグルコース注入を調節するために、頻回の血液グルコース試料値からの負のフィードバックを利用する。グルコース注入速度は、投与されたインスリンの薬力学的作用の測定を始める。

患者の来院2回目の絶食時血液グルコース濃度(ベースラインインスリン注入が確立される前に測定)は、グルコースクランプ実験において目標レベルであった。クランプ後、絶食時血液グルコース濃度は、この個別化されたクランプレベルから4mmol/L(72mg/dL)を超えて異ならないか、さもなければ来院は少なくとも24時間延期された。
各治療アームにおいて、患者全員が同じSC又は経口インスリン投与量を受け取った。ベースラインインスリン注入が確立される前に測定された患者の絶食時血液グルコース濃度は、このグルコースクランプ実験の目標レベルであった。連続グルコースクランプ実験の間に、絶食時血液グルコース濃度は、この個別化されたクランプレベルから4mmol/L(72mg/dL)を超えて異ならないか、さもなければ来院は少なくとも24時間延期された。

クランプレベルは、投薬前6時間のベースライン期間に、様々な静脈内(IV)インスリン注入及びグルコース注入速度により調節した。試験医薬品の投与前の最後の2時間、インスリン注入は、0.2mU/kg/分の速度に設定し、この速度は、本実験の最後まで変更しなかった。t=0分において、外因性インスリンは、経口投与又はSC注射により投与した。試験医薬品により誘発されたPD反応は、更に6時間記録した。この期間は、食物摂取は許可されなかったが、水は欲しいときに摂取することができた。

各試験期間中に、血漿インスリン濃度、血漿C-ペプチド及び血漿グルコース濃度を測定するために、血液試料を採取した。採血は、投薬前6時間から開始し、投与量の投与後6時間は継続した。血液試料は、静脈カニューレを使って採取した。血液試料は、治験薬投与に対して、(1)薬物投与試験前、-1及び-0.5時間、(2)治験薬投与直後(0時)、並びに(3)治験薬投与後、10、20、30、40、50分、及び1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、5、及び6時間で収集した。

グルコースクランプ手法は、Biostator(グルコース管理したインスリン注入システム-GCIIS、Life Science Instruments社、エルクハート、IN、米国)を用い行った。17-ゲージPTFEカテーテルを、採血のために肘前静脈に挿入し、0.15mol/L生理食塩水で開存(patent)を維持した。Biostatorのグルコース感知器に接続された18-ゲージPTFE二重管腔カテーテルの挿入のために、同じ腕の背側手静脈又は外側手根静脈に、逆向性の様式で、カニューレ挿管した。カテーテル挿管した手は、温かい箱(hot box)内に置き、空気温度を55℃に温めた。反対側の腕は、第三の静脈(third vein)に、グルコース溶液(水中20％)を注入するために、18-ゲージPTFEカテーテルをカニューレ挿管した。同じ静脈に、インスリン溶液(100mLにつき患者の血液2mLで希釈した生理食塩水1L中0.15molの標準ヒトインスリン)を、シリンジポンプ(Perfusor Secura FT、Braun社、Melsungen、独国)を用い連続注入した。

血漿インスリン濃度、血漿C-ペプチド、及び血漿グルコースを決定するための血液試料は、各治療期間に、各患者から採取した。グルコース注入速度及び血液グルコース測定値を、グルコースクランプ手法の間に連続して測定した。全ての治療は、それらの試料採取に関して同じであり、及び全来院期間モニタリングした。血液グルコース濃度を望ましいクランプレベルに安定化するための6時間の投与前ベースライン期間の後、治験薬投与後のクランプ手法を6時間維持した。
血液試料は、試料採取の1時間以内に、3000rpmで15分間、温度2℃〜8℃で遠心した。血漿インスリン、C-ペプチド、及び血漿グルコースの各分析のために、プラスチック製ピペットを用い、赤血球層を破壊することなく、採血管から血漿を、予めラベルを付けたポリプロピレン製チューブへピペッティングした(各々およそ0.3〜0.5μl)。これらの試料は、分析まで、-20℃で貯蔵した。

安全性は、本試験を通じた全ての来院期間中、生命徴候測定値及び有害事象(AE)の文書化でモニタリングした。患者はクランプ手法が完了するまで、食物摂取は許されなかったが、飲料水は自由に摂取することができた。最後の血液試料を採取した後、対象には食事が提供された。
試験期間中、治験担当者の評価が、治験結果の解釈と相容れないか、又はインスリン作用、グルコース利用又は低血糖症からの回復と臨床的に関連した干渉を引き起こすことが分かっている、インスリン療法及びあらゆる物質の慢性使用は、禁止した。全ての経口低血糖症性物質(hyperglycemic agent)の摂取は、各試験投薬日前24時間は停止し、クランプ手法の終了時までは再開しなかった。

血液グルコース濃度及びGIRの測定は、治験薬投与前-6時間から、治験薬投与後最大6時間まで、Biostatorにより連続して行った。これらのデータは、治療期間を通じ1分間隔で記録した。安全性評価は、AE、臨床検査データ、生命徴候、理学的検査及びECGを含んだ。
安全性データ及び薬物動態／薬力学データは、全ての対象について解析した。薬物動態／薬力学データは、第三の試験治療を受けた8名の患者対象についても解析した。薬物動態及び薬力学データは、少なくとも最初の2種の治療(来院1回目〜4回目)を受け取った対象及び3種全ての治療来院(来院1回目〜6回目)を完了した対象について統計解析した。

本試験の主要PDエンドポイントは、薬物投与後最初の1時間のグルコース注入速度曲線下面積(AUC_GIR)(AUC_GIR0-1h)であった。薬力学評価のための副次的エンドポイントは、下記のパラメータであった：最大グルコース注入速度(GIR_max)、GIR_max到達時間(t_GIRmax)、指定された時間間隔内のグルコース注入速度曲線下面積(AUC_GIR0-2h、AUC_GIR0-3h、AUC_GIR0-4h、AUC_GIR0-5h、AUC_GIR0-6h)、初期及び後期半値-最大グルコース注入速度(初期及び後期T_GIR50%)、並びにC-ペプチド濃度の最大低下。

薬物動態評価のための副次的エンドポイントは、下記のパラメータであった：最大血漿インスリン濃度(C_INSmax)、C_INSmax到達時間(t_INSmax)、指定された時間間隔内のインスリン濃度曲線下面積(AUC_INS0-1h、AUC_INS0-2h、AUC_INS0-3h、AUC_INS0-4h、AUC_INS0-5h、AUC_INS0-6h)。選択されたPD及びPKパラメータについて、対象間変動を調べた。
下記表22に示したように、インスリンの血漿濃度は、医薬品の安全性試験の実施に関する基準(GLP)によりバリデーションされた微粒子酵素イムノアッセイ(MEIA)により測定した。

表22において、ベースライン補正した値を用い、すなわち、投与前ベースライン値を減算し、結果が負である場合は、その値をゼロとした。
図13は、300U経口インスリン/400mg 4-CNAB、150U経口インスリン/200mg 4-CNAB及び15SCインスリンを使用する治療に関する、平均血漿インスリン濃度(ベースライン補正した)の時間プロットを示している。
下記表23は、C-ペプチドレベル(nmol/L)のまとめを示している：

図14は、15IU s.c.、300IU経口及び150IU経口に関する、C-ペプチド[nmol/l]、対、時間のプロットを示している。図14に示されたように、C-ペプチド測定値は、治療期間中に有意な変化を示さなかった。
本試験において評価したパラメータは、経口投与及びSC注射後のインスリン吸収のPK及びPD特性を比較するために適した標準測定であった。Biostatorと組合せたグルコースクランプの使用は、症候性低血糖症発症の尤度を最小化した。グルコースクランプ手法からの血漿インスリン濃度又はグルコース注入速度を基にした計算は、グルコースクランプ技法に通常使用される標準PK又はPD計算を反映している。

本試験の主要PDエンドポイントは、薬物投与後最初の1時間のグルコース注入速度曲線下面積(AUC_GIR)であった(AUC_GIR0-1h)。
PK及びPDデータは、少なくとも最初の2治療(来院1回目〜4回目)を受け取った対象及び3種全ての治療来院(来院1回目〜6回目)を完了した対象について統計解析した。

解析に使用したPDパラメータは、治験薬の適用後の最大グルコース注入速度(GIR_max)、最大グルコース注入速度到達時間(t_GIRmax)、GIRmax前の半値-最大GIR値到達時間(初期t_{GIR 50%})、GIRmax後の半-最大GIR値への時間(後期t_{GIR 50%})、並びに投薬後0から60、120、180、240、300、及び360分、及び投与後180〜360分のグルコース注入速度対時間曲線下面積(各々、AUC_GIR0-1h、AUC_GIR0-2h、AUC_GIR0-3h、AUC_GIR0-4h、AUC_GIR0-5h、AUC_GIR0-6h、AUC_GIR3-6h)であった。加えて、C-ペプチド血漿濃度及び血漿グルコース濃度を、PD解析に使用した。GIR_max、t_GIRmax並びに初期及び後期t_{GIR 50%}は、平均ベースラインGIRを減算した後の各個々のGIRプロファイルに、多項式関数(6次元)を合致することにより計算した。曲線下面積(AUC)は、生データから、台形公式を用いて算出した。

PKパラメータは、非-コンパートメント法を用いて計算した。決定したPKパラメータは、最大血漿インスリン濃度(C_INSmax)、最大インスリン濃度到達時間(t_INSmax)、並びに治験薬適用後の0から1、2、3、4、5及び6時間の血漿インスリン濃度対時間曲線下面積(各々、AUC_INS0-1h、AUC_INS0-2h、AUC_INS0-3h、AUC_INS0-4h、AUC_INS0-5h及びAUC_INS0-6h)を含んだ。投薬時点からベースライン濃度回復までのAUC(AUC_{INS 0-t'})の計算は、インスリン濃度が投薬後360分以内にベースライン測定値へ回復しなかった一部の患者は除外した。

得られたPK及びPDデータは、15U SCインスリン及び300U経口インスリンによる治療の比較解析に用いた。全ての検定は、両側対立仮説に対して行い、有意レベルは5％(α=0.05)であった。これらの検定は、計算したp-値が＜0.05である場合に、統計的有意性を宣言した。小さい標本サイズ及びいくつかの外れ値を考慮し、最初の解析は、ノン-パラメトリック検定(符号付きWilcoxon順位検定及びKruskal-Wallis検定)のみを用いて行った。しかし、Kolmogorov-Smirnov検定は、全てのPK及びPDパラメータの正常分布を示した。その結果、パラメトリック検定(対のあるt-検定及びANOVA)を追加して行った。ノン-パラメトリック検定及びパラメトリック検定の結果の間に実質的差異はなかったが、データの提示にはノン-パラメトリックな結果を使用することが決定された。

安全性データは、AE、臨床検査データ、生命徴候、理学的検査、及びECGを含んだ。各治療群に関する生命徴候(収縮期及び拡張期血圧、呼吸数、心拍数、及び体温)は、ベースライン時(-30分時点と定義)及び各試験日の最後にまとめた。
分析のための完全なデータを持つ10名の2型糖尿病患者で計画した(2系列の各々に5名の患者に割当てた)。1名の患者は、治療前に離脱し、1プロトコールとして再配置した。その結果、登録した患者数は11名であった。10名の患者が、当初計画された2種の治療で試験を完了した。これら10名の患者中8名は、プロトコール改正による150Uインスリン/200mg 4-CNABの追加の経口治療への参加の提案を受入れ、この追加治療はランダム順には行わなかった。PK/PDデータは、第二の経口試験治療を受け取った8名の患者のサブセットについても解析した。

薬物動態及び薬力学の解析
PK及びPDデータは、試験治療A及びB(経口300Uインスリン/400mg 4-CNAB、SC15U標準インスリン)を受け取り、評価可能なデータを有する10名の患者について解析した。PK及びPDデータは、第二の経口試験治療(治療C：経口150Uインスリン/200mg 4-CNAB)を受け取った8名の患者の改正された群についても解析した。治療された包含された患者は全員、本プロトコールの計画通り少なくとも2種の治療(1種の経口及び1種のSC治療)を受け取った。
下記表24は、異なる治療に関して計算された薬物動態及び薬力学のパラメータをまとめている。

ここで考察された薬物動態及び薬力学パラメータは、個々の値の平均及び標準偏差である。経口投与量300Uインスリン/400mg 4-CNABは、SC治療よりも血漿インスリン濃度のより迅速及びより高い上昇を示し、このことはより早い作用開始を示している(AUC_INS0-1h経口300U対SC 15U：2559±1831対542±296μU x mL^-1 x min、p＜0.01；C_{INS max}経口300U対SC 15U：93±71対33±11μU/mL、p＜0.01；t_INSmax経口300U対SC 15U：27±9対161±83分、p＜0.01)。

従って、この傾向は予想されたように、薬力学(GIR)結果において反映されており、経口治療後に、SC治療と比べ、PD作用の有意に早い開始があった(AUC_GIR0-1h 経口300U対SC 15U：173±86対27±32mg/kg、p＜0.01；t_GIRmax 経口300U対SC 15U：40±16対255±108分、p＜0.01；初期t_50%経口300U対SC 15U：13±6対150±87分、p＜0.01)。図15に示された最大グルコース注入速度は、統計学的に有意でない差を示したが、注入されたグルコースの初期レベルは、経口インスリンからのほうが、SCインスリンからよりもより高かった。

SC投与と比較した、ふたつの経口インスリン投与量の相対生物学的利用率(PK結果を基にした)及び生体効力(PD結果を基にした)は、先に定義したように計算した。経口インスリンの相対生物学的利用率は、表25に列記した。経口インスリンに関する生体効力の各値は、表26に列記した。

表27は、経口インスリンに関する相対生物学的利用率及び生体効力の比較を示している。

300U経口インスリン/400mg 4-CNABの相対生体効力(PD結果を基にした)は、適用後最初の1時間に54.9±91.9％と高く、6時間にわって31.0±89.4％であった。生物学的利用率(PK結果を基にした)各値は、43.7±60.5％、及び2.7±3.0％であった。時間間隔0-4、0-5及び0-6時間の平均相対生体効力の予想外の増加は、その値がこれらの3種の期間についてのみ計算され及びそれが他の患者において認められる値よりも最大100倍高かった患者101について説明される(各々、177.45％、447.03％、及び285.54％)。
150Uインスリン/200mg 4-CNABの経口投与量も、SC治療と比べた血漿インスリン濃度のより迅速な上昇を示した(AUC_INS0-1h経口150U対SC 15U：1100±1221±対542±296μU x mL^-1 x min；t_INSmax経口300U対SC 15U：23±7対161±83min)のに対し、観察された最大血漿濃度は、両治療について類似していた(C_INSmax経口150U対SC 15U：38±3.9対33±11μU/mL)。

従って、経口150Uインスリン投与量に関するGIR結果は、PD作用のより迅速な開始を示した(AUC_GIR0-1h経口150U対SC 15U：58±40対27±32mg/kg；t_GIRmax経口150U対SC 15U：132±146対255±108min；初期t_50%経口150U対SC 15U：104±141対150±87min)。最大グルコース注入速度は、経口のほうがSC治療よりも低かった(GIR_max経口150U対SC 15U：2.1±0.9対3.6±1.8mg/kg/min)。
これらの知見は、150U経口インスリンのより低い投与量によっても、肝グルコース生成の抑制が達成されうることを示している。

150U経口インスリン/200mg 4-CNABの相対生体効力は、適用後最初の1時間において110.9±193.4％であり、6時間にわたって3.2±2.8％であった。生物学的利用率の各値は、21.4±19.8％、及び3.1±2.4％であった。最初の1時間の異常に高い平均相対生体効力110.9％は、患者102において認められた極端な高値455.95％、及びわずか5名の患者の値のみが得られたという事実のせいである。言及した生体効力平均の歪曲のために、中央値がこのデータのより適当な代表と見なされた。
2種の経口インスリン投与量のPK及びPDデータの比較は、PKパラメータAUC_INS及びC_INSmaxのほぼ直線状の投与量関係を示した。AUC_GIR及びGIR_maxにより表わされたPD反応も、投与量で増加するが、様式の明確さが少ない。

薬物動態／薬力学の結論
この第一のグルコースクランプ試験は、経口的に適用されたインスリンは、明確な代謝作用を発揮することを示している。示されたPD及びPK特性及び経口投与の利点(高い門脈インスリン濃度、投与の簡便さ)の観点において、インスリン/4-CNABは、1型及び2型糖尿病患者の食前(食事前)インスリン療法の非常に魅力的な候補であるように見える。
試験期間に評価された全ての治療は、安全であり及び良く忍容された。インスリン/4-CNABカプセル剤の経口投与又は標準インスリンの皮下注射の後に、有害事象は認められなかった。

実施例7
経口インスリン及びs.c.間の短期作用する食後血液グルコース可動域の比較
糖尿病治療薬を服用しない2型糖尿病対象における食後血液グルコース可動域に対する経口インスリン処方剤の作用(すなわち、食後薬物動態及び薬力学プロファイル)を、s.c.投与された短期作用性インスリンのそれと比較するために、無作為化3-期間クロスオーバー二重盲検二重ダミー試験を実施した。
この試験の主要目的は、経口インスリン処方剤(2個のカプセル剤中300Uインスリンの400mg 4-CNABとの併用、各カプセル剤は150Uインスリン/200mg 4-CNAB含有)の食後血液グルコース可動域に対する作用の、12U皮下(s.c.)注射された短期作用性インスリン[Eli Lilly社の Humalog(登録商標)注射100U/ml]との比較である。食後血液グルコース可動域は、標準化された朝食摂取後に評価した。

1年より長く米国糖尿病学会(ADA)(1998版Diabetes care、21:S5-S19)により定義された2型真性糖尿病である年齢35歳〜70歳までの15名の男性対象を選択した。本試験に包含された対象は、BMI＜36kg/m²を有し、安定した血糖管理(HbA_1C＜11％)を有し、あらゆる経口低血糖症性物質を各試験投薬日前24時間は服用せず、及びあらゆる治験薬を来院1回目前少なくとも4週間は服用せず、入院前72時間及び試験期間は激しい身体活動を控え、及びプロトコールにより必要とされた臨床検査施設に拘束された。対象は、一定の体重を維持した(+/-2kg)。

患者は全員、無作為化された系列内で同じ経口及びSC注射治療を受け取った。来院1回目に、各患者は、6種の可能性のある治療系列のひとつに無作為化された(表28参照)。4種の別個の症例において、患者は、標準化された朝食前に4種の可能性のある治療のひとつを受けとった：300U経口インスリン/400mg 4-CNAB (2個のカプセル剤、各カプセル剤は150Uインスリン/200mg 4-CNAB含有)、150U経口インスリン/200mg 4-CNAB(1個のカプセル剤)、12U SC短期作用性インスリン(Humalog(登録商標))、及び非補充(no supplemental)インスリン(プラセボ)。最初の3種の治療期間に、300U経口、12U SC及びプラセボインスリンが、無作為に及び盲検条件(二重ダミー法)下で投与された。第4の治療期間に、患者は、150U経口インスリンを、オープン様式で受け取った。全般的試験デザインは、下記表28に例示している。

*) 全ての患者に関して、来院7及び8回目は、一緒にした(すなわち、最終試験は、来院7回目に、実験手技終了直後に行った。)。
SCインスリン投与量12Uは、2型糖尿病患者にとっての典型的範囲内に収まるように選択した。経口投与量300Uインスリン(400mg 4-CNBAとの併用)は、前記実施例5において有効であることが示されている。経口投与量150Uインスリン(200mg 4-CNBAとの併用)は、肝グルコース生成に対する作用がより低いインスリン投与量によっても達成されるかどうかを調べるために選択した。

治験薬投与の時点(SC注射：摂食の15分前；経口投与：摂食の30分前)は、投与されたインスリン処方剤のPK及びPD特性を血液グルコースの食後の上昇と合致するために、選択した。最初の3種の治療セッション間の休薬期間は、1〜20日であった。各セッションの期間は、およそ8〜9時間であり、全ての実験は、約12時間の一晩絶食後に行った。

来院1回目(スクリーニング来院)に、患者は、絶食状態(すなわち、少なくとも12時間はカロリーを摂取せずに)で臨床検査施設を訪問した。患者の身体の統計、既往歴及び生活習慣を記録し、理学的検査を行った。以後14日を超えない来院2回目に、各患者は、下記表40に示した6種の治療系列のひとつに無作為化し、及び2種の活性治療(300U経口インスリン/400mg 4-CNAB又は12U短期作用性SCインスリン)又は非補充インスリン(プラセボ)のいずれかひとつを受け取った。経口投与の30分後及びSC薬物投与の15分後、患者は、標準化された朝食を摂取し、食後血液グルコース濃度を6時間モニタリングした。連続した血液試料を、血漿インスリン、4-CNAB、及びC-ペプチド濃度の測定のために、一定間隔で収集した。試験患者は、治療セッションの終了時に施設から帰宅した。

来院3及び4回目に、試験患者は、それらの治療系列に従い被験食と共に、別の治療を受け取るために、臨床施設を再訪した。全ての実験手法及び測定は、先の治療日のものと同じであった。最終試験(来院5回目)は、来院4回目の後に行い、好ましくは実験手法が完了した直後、来院4回目以後15日を超えずに行った。

患者は、被験食の30分前の150Uインスリン/200mg 4-CNABの単回経口投与である第4の治療セッション(来院7回目)に参加するために来院した。全ての実験手法及び測定は、先の治療日のものと同じであった。患者は、追加のセッション前20日を超えずに、スクリーニング(来院6回目)に参加し、好ましくは来院7回目の実験手法が完了した直後、しかし以後14日を超えず最終実験(来院8回目)に参加した。来院7回目及び8回目は、一般に一緒にした(すなわち、全ての患者の最終実験は、来院7回目に、実験手法完了直後に行った。)。
患者は、下記の治療系列のひとつに無作為に割当てた：

二重ダミー法に従い、各患者は、最初の3種の治療セッション(来院2-4回目)に、その予定された治療投与(経口又はSC)に加え、プラセボ調製物としての別の投与(SC又は経口)を受け取った。補充インスリンを伴わないセッション時には、両治療(経口及びSC)はプラセボ調製物であった。最後の治療セッション(来院7回目)に、全ての患者は、オープン様式で150Uインスリン/200mg 4-CNABの単回経口投与量を受け取った。

先に示した6種の系列を基に、下記の治療を、試験期間に投与した：
系列1：
-来院2：食前30分の2個のインスリンカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院3：食前30分の2個のプラセボ、15分の1回のSCインスリン注射。
-来院4：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院7：食前30分の1個のインスリンカプセル剤。
系列2：
-来院2：食前30分の2個のインスリンカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院3：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院4：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCインスリン注射。
-来院7：食前30分の1個のインスリンカプセル剤。

系列3：
-来院2：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCインスリン注射。
-来院3：食前30分の2個のインスリンカプセル剤、15分の1回のSCインスリン注射。
-来院4：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院7：食前30分の1個のインスリンカプセル剤。
系列4：
-来院2：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCインスリン注射。
-来院3：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院4：食前30分の2個のインスリンカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院7：食前30分の1個のインスリンカプセル剤。

系列5：
-来院2：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院3：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCインスリン注射。
-来院4：食前30分の2個のインスリンカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院7：食前30分の1個のインスリンカプセル剤。
系列6：
-来院2：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院3：食前30分の2個のインスリンカプセル剤、15分の1回のSCプラセボ注射。
-来院4：食前30分の2個のプラセボカプセル剤、15分の1回のSCインスリン注射。
-来院7：食前30分の1個のインスリンカプセル剤。

カプセル剤に使用した4-CNABは、GMP遵守し製造した。カプセル剤調製に使用したインスリンは、Eli Lilly社(インディアナポリス、IN)から得たヒト結晶性インスリン亜鉛：プロインスリン由来(組換えDNA起源)USP品質であった。このインスリン/4-CNABカプセル剤は、150インスリン単位USP及び200mg 4-CNABを含有した。このインスリン/4-CNABカプセル剤は、AAI Pharma社(ウィルミントン、NC)により調製した。

インスリン/4-CNABカプセル剤は、各々40個のカプセル剤及びポリエステルコイルを含むHDPE瓶に入れ提供した。各瓶は、ヒートインダクションシール及び子供が空けられないキャップを有し、-10℃又はそれ以下に凍結保存した。投薬日に、適当な数のカプセル剤を、冷凍庫から取り出し、室温(15〜30℃)で約1時間放置した。カプセル剤は、分配の4時間以内に使用し、未開封の瓶は、4時間より長くは室温に放置しなかった。

対象は、薬物投与後15分で食事をとった。血液グルコース濃度は、グルコース摂取後6時間モニタリングし、連続した血液試料を、インスリン濃度、4-CNAB濃度、C-ペプチド、及び血液グルコースの測定のために一定の間隔で採取し、薬物動態及び薬力学の決定の情報を提供した。血液グルコース濃度は、試料採取した直後に決定し、文書化した。全ての実験は、全ての来院について、それらの試料採取及びモニタリング期間が同じであった。食事後の実験手法は、6時間維持した(望ましい食前血液グルコースレベルでの血液グルコース濃度の安定化のための+1時間ベースライン期間)。

各治療セッション時に、血液試料を、4-CNAB、インスリン及びC-ペプチドの血漿濃度及び血液グルコース濃度の決定のために採取した。採取は、被験食摂取の1時間前に開始し、及びその後6時間継続した。血液試料は、静脈カニューレにより採血し、時点0で被験食を開始することに関連し収集した。予定された試料の時期は、臨床的必要性及び薬物動態データの必要性に従い調節した。各セッションの期間は、およそ8〜9時間であった。全ての実験は、およそ12時間一晩絶食後に行った。
試験は、朝に開始した。血液グルコース、並びに血漿インスリン、4-CNAB及びC-ペプチド濃度測定のための血液採取のために、17-ゲージPTFEカテーテルを、腕の静脈に挿入した。このラインは、0.15-mol/L(0.9％)滅菌生理食塩水で開存を維持した。

時点-15で、外因性インスリンを、3実験日の2日で、経口インスリン投与又は皮下注射により投与した。各試験日(来院2-4及び7回目)に、時点0で、対象は標準朝食を摂取した。経口治療(インスリン/4-CNABカプセル剤及びプラセボカプセル剤)は、食事開始前30分で、及び注射(短期作用性インスリン及びプラセボ溶液)は15分で投与した。誘発された薬力学反応は、別の6時間についての、血液グルコース濃度の5分間隔での測定により試験し、この期間食物摂取は許されなかったが、水は欲しいときに摂取した。

血液グルコース決定のための血液試料(0.25mL／試料)は、-1分(ベースライン)、食事摂取開始後5分、及びその後5分間隔で食事摂取開始後120分まで、10分間隔で240分まで、及び15分間隔で360分まで採取した(45試料／セッション)。血液グルコース濃度は、試料採取直後に、自動化されたGOD法(Super GL Ambulance Glucose Analyzer、Ruhrtal Labortechnik社、Delecke-Mohnesee、独国)を用いて測定した。

4-CNAB血漿濃度を決定するための血液試料(ヘパリンナトリウム管内2mL)は、食事摂取後10、20、30、40、60、90、120、240及び360分で採取した(9試料／セッション)。インスリン及びC-ペプチド血漿濃度を決定するための血液試料(ヘパリンナトリウム管内5mL)は、-60及び-30分、及び0時(食物摂取開始時)、及び10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、150、180、210、240、300、及び360分で採取した(19試料／セッション)。インスリン血漿濃度は、GLP-バリデーションされた微粒子酵素イムノアッセイ(MEIA)により測定した。

低血糖症(血液グルコース濃度が60mg/dl以下と定義)の場合、血液グルコース濃度60mg/dlは、20％グルコースの可変-速度静脈内注入により維持した。グルコース注入速度は、必要ならば、この血液グルコースレベルを維持するために測定した血液グルコース濃度に関連して、適合させた。血液グルコース濃度が60分以上350mg/dlを超えた場合、これらの実験は中止し、その対象は、追加のs.c.インスリンで、その正常血液グルコース濃度へと治療した。
血漿インスリン濃度、4-CNAB及びC-ペプチドの決定のための血液試料は、前述のように、決められた間隔で採取した。血漿試料は、イムノアッセイによる測定が行われるまで、およそ -20℃(4-CNABは-70℃)で保存した。採血期間の終了後、試験対象は臨床施設から退院した。

選択された薬力学及び薬物動態パラメータに関する対象間変動性を評価した。食後低血糖症の発生率は、各対象について及び試験集団を横断して評価した。
食事摂取後に記載された血液グルコース可動域(すなわち、食前と食後血液グルコース濃度間の差異)を用い、2種のインスリン投与経路の薬力学パラメータを評価し、補充インスリンを伴わずに試験日に得た同じデータと比較した。これらの測定値から、0-6時間(及び他の時間間隔)のグルコース注入速度対時間曲線下面積、最大血液グルコース可動域(C_max)及び最大血液グルコース可動域到達時間(t_max)を分析した。

薬力学評価に関して、下記のパラメータを計算した：最大血液グルコース可動域(BG_max)、BG_max到達時間(t_BGmax)、時間間隔で規定された血液グルコース可動域曲線下面積(AUC_BG0-1h、AUC_BG0-2h、AUC_BG0-3h、AUC_BG0-4h、AUC_BG0-6h)、最大絶対血液グルコース濃度(BGabs_max)、BGabs_max到達時間(t_BGabsmax)。
薬物動態評価に関して、下記のパラメータを計算した：最大血漿インスリン濃度(INS_max)、INS_max到達時間(t_INSmax)、規定された時間間隔内のグルコース注入速度下面積(AUC_Ins0-1h、AUC_Ins0-2h、AUC_Ins0-3h、AUC_Ins0-4h、AUC_Ins0-6h)及びC-ペプチド濃度の最大低下。

血漿インスリン濃度には、適当な薬物動態分析を施した。決定されたパラメータは、C_max、t_max、及び投薬時からベースライン測定値回復までの血漿濃度対時間曲線下面積(AUC_0-t')を含み、ここでt'は、血漿インスリン濃度のレベルがベースラインへ回復した時間である。加えて、他の薬物動態パラメータ、例えばt_1/2、消失速度定数(λz)及び部分的AUC値を、本試験に登録した各個々の対象について、適当と考えられる場合は、計算した。

薬力学
経口インスリン/4-CNABカプセル剤の薬力学的作用の測定として、6時間に渡って測定された血液グルコース可動域を考え、食事摂取開始後最初の2時間の血液グルコース可動域対時間曲線下面積(AUC_0-2h)を、主要な薬力学エンドポイントとして決定した。
個々の血液グルコース可動域データを基に、1治療当りの血液グルコース可動域の平均時間プロファイル(標準偏差を伴う)をプロットした。図16は、全ての対象に関する、食後血液グルコース可動域(mg/dL)対時間の相加平均のプロットを示している。図16に示されたように、異なる治療の平均血液グルコース可動域は、食事摂取開始後1〜2時間の間にそれらの最大値に到達し、その後ベースラインへと回復した。最大グルコース可動域(中央値)到達時間は、SC 12U短期作用性インスリンについて1.3時間、プラセボについて1.7時間、経口150Uインスリン/200mg 4-CNABについて1.8時間、経口300Uインスリン/400mg 4-CNABについて2.2時間であった。

最小の全般的可動域は、12U SC短期作用性インスリン注射で達成された。経口インスリン治療物及びプラセボの両方と比べ、SC注射後の血液グルコース可動域は、45〜360分の期間は顕著に低く、約180分でベースラインを超えた後、その値は、食事摂取後360分まで、負に増加し始めた。

経口300Uインスリン/400mg 4-CNABの後、15分で-20.8mg/dLまでのベースラインからの急激な下降が認められ、その後30分でベースラインへ回復した。従ってほぼ最初の1時間の間に、投与量300U経口インスリン/400mg 4-CNABは、注射と比較しても、より低い可動域へと導いた。その後、曲線の上昇及び引き続きの下降は、経口150Uインスリン/200mg 4-CNAB用量及び無治療(プラセボ)について認められるパターンに従った。150U経口インスリン/200mg 4-CNABと無治療 (プラセボ)の間に、差異は認められなかった。
これらのプロファイルを基に、パラメータAUC_0-1h、AUC_0-2h、AUC_0-3h、AUC_0-4h、AUC_0-6h及びC_maxを計算し、下記表30に示した。

このデータは、AUC_0-1hは300U経口インスリン/400mg 4-CNAB用量後に最低であることを示している。2時間及び3時間までに、AUCは、150U経口インスリン/200mg 4-CNAB及び無治療(プラセボ)のAUCよりも依然小さいが、12U SC短期作用性インスリンのAUCよりも大きい。しかし、4時間〜6時間について、経口適用と無治療の間に差異は認められなかった。150U経口インスリン/200mg 4-CNABについて、全てのAUCは、無治療で得られるものと等しいよりもより多く又はより少なかった。経口インスリン投与後及び無治療後の両方の平均最大血液グルコース可動域(C_max)は、類似しており、SC注射後のC_maxよりもはるかに高かった。

これらの試験結果は、下記のようにまとめた：3時間またはそれ以上のC_max及びAUCが考慮される場合、経口治療と無治療(プラセボ)を比較し、統計学的有意差は確立されなかった。他方で、両方の経口治療は、SCインスリン注射と有意に異なり、経口治療はより高い平均値につながった。
主要エンドポイントAUC_0-2hを考慮し、標準被験食の30分前に投与された単回経口投与量300Uインスリン/400mg 4-CNABは、無治療(プラセボ)と比べ、食後血液グルコース可動域の統計学的に有意な低下を生じた。しかしこの作用は、12U短期作用性インスリンのSC注射後よりも有意に低かった。150U経口インスリン/200mg 4-CNABの作用は、無治療(プラセボ)とは有意に異ならなかった。

薬物動態
採取された血液試料から、4-CNAB、インスリン及びC-ペプチドの個別の血漿濃度を決定し、要約的濃度対時間プロファイルをプロットした。
図17は、4-CNAB血漿濃度(ng/mL)対時間のプロファイル(相加平均)を示す。図17に示されたように、血漿4-CNAB濃度は、食事摂取開始後最初の2時間以内に急激な下降を示した。2時間後、濃度は、10分後に認められたレベルの10％未満であった。これらの結果は、インスリン/4-CNABカプセル剤の摂取と食事摂取開始後最初の測定10分の間の時間で、顕著に高い濃度に到達し得ることを示している。400mg 4-CNAB摂取後の濃度は、200mg摂取後のおよそ2倍である。

図18は、インスリン血漿濃度(pmol/l)対時間(相加平均)のプロファイルを示している。図18に示されたように、最高の平均インスリン血漿濃度に、150U経口投与量後に到達し、これに300U経口、プラセボ、及び12U SC注射が続いた。経口300Uインスリン/400mg 4-CNABの曲線は、ふたつの最大を示し、最初は0分で及び第二は120分であった。0分のピークは、1803pmol/Lの値により、この顕著な平均インスリン濃度の偏りにほとんどに寄与している特定の患者1名によるものであった。ほとんど全ての患者は、0時でインスリン濃度のより多い又はより少ない顕著な孤立した増加を示したが、前記患者程ではなかった。加えて、プラセボ下でのインスリン濃度の上昇は、食事摂取により誘導された、患者の内因性インスリン生成により説明される。

図19は、C-ペプチド血漿濃度(nmol/l)対時間のプロファイル(相加平均)を示している。C-ペプチドの平均血漿濃度は、内因性インスリン生成の指標であり、これは全ての治療後に増大した。減少、又は一定よりもより多くもしくはより少ないC-ペプチド濃度が、数名の患者においてのみ及び短期作用性インスリンのSC注射後のみ、認められた。これは、大部分の患者において、内因性インスリン生成する能力が依然維持されていることを反映している。予想されたように、150U経口インスリン投与量及びプラセボは、最も顕著な増加を示したのに対し、300U経口投与量及び12U SC注射後の増加は余り明確ではなかった。

インスリン濃度対時間プロファイルを基に、パラメータC_max、t_max及び時点0時からベースラインインスリンレベルへ再度到達した時点までのAUC(AUC_0-t*)を計算し、下記表31に示した。

t*は、ベースラインインスリンレベルへ再度達した時間、又は最後のデータポイント(360分)を示す。
このデータは、平均インスリン血漿濃度対時間プロファイルが、150U経口インスリン後に最高AUCを示し、これにプラセボ、300U経口インスリン、及び12U SC注射が続くことを指摘している。最高の平均C_maxは、150U経口インスリン投与後に達し、これに300U経口インスリン、プラセボ、及び12U SC注射が続いた。C_max到達時間(t_max)の中央値は、150U経口インスリン及びプラセボについて最長であり、これに300U経口インスリン及び12U SC注射が続いた。

結論
本試験の主要目的は、標準朝食後の、経口投与された300Uインスリン/400mg 4-CNABの食後血液グルコース可動域に対する作用を、12U皮下注射された短期作用性インスリン(Humalog(登録商標))と比較することであった。薬力学評価の主要パラメータとしてのAUC_0-2hに関して、血液グルコース可動域に対する最高の作用は、12U SC短期作用性インスリンについて認められ、これに経口300Uインスリン/400mg 4-CNAB、経口150Uインスリン/200mg 4-CNAB、及びプラセボが続き、並びにふたつの後者の作用は等しいよりもより大きい又はより小さいように見えた。しかしこれらの結果は、全ての計算されたAUCについて一貫していなかった。最初の1時間に、300U経口インスリンは、12U SCよりも勝っており、この順番は、2時間以上についてAUCが比較される場合に変化した：両方の経口治療は、最早無治療(プラセボ)と有意差はなかったが、12U SC注射は依然有意差及び明らかに小さいAUCを示した。

300U経口インスリン投与量の後、平均血液グルコース可動域は変化し(turned)(食事摂取開始後15分で-20.8mg/dLまで)、及び30分でベースラインに回復した。この一過性の下降は、ほとんどの患者において認められたが、ベースライン血液グルコースが80mg/dL未満の特定の1名においてのみ、低血糖症エピソードにつながった。これらの知見は、被験食からのかなりの糖質の吸収に先立つ、経口投与された300Uインスリン/400mg 4-CNABの作用の迅速な開始を示している。従って、投与量投与と食事摂取開始の間の30分の時間間隔は、長すぎるかもしれない。

可動域の計算のための参照として利用するベースライン(-1分)での平均絶食時血液グルコース濃度は、経口150Uインスリン/200mg 4-CNABについて124.38mg/dL (99.10-172.00)、経口300Uインスリン/400mg 4-CNABについて120.26mg/dL (72.20-175.00)、12U SC短期作用性インスリンについて143.11mg/dL (104.00-190.00)、及びプラセボについて137.32mg/dL (93.10-183.00)であった。これらのベースライン値に関して、4種の治療を、2群に分け、ふたつの経口治療は約120mg/dLの値を持ち、及びSC注射はプラセボと共に約140mg/dLの値を示している。この知見は、投与量投与と食事摂取開始の間の時間における、経口インスリン製剤の初期作用により説明することができ、これはこのプロファイルにより対象とされていない。しかし、説明された不均一性は、この結果の質を損なうとは考えられない。

4-CNABの濃度対時間プロファイルは、血漿からのこの物質の消失のみを示している。吸収相及び最大濃度は見あたらない。-30〜+10分の間の時間において、急激な上昇、それに続く急激な下降を推定することができ、並びに到達した最大濃度は、食事摂取開始後10分で認められた値よりも明らかに高いはずである。従って、4-CNAB薬物動態の更なる研究は、投与量投与後最初の1時間から適当な数の試料を含むはずである。

インスリンプロファイルは、150U経口インスリン後に最高のAUCを示し、これにプラセボ、300U経口インスリン、及び12U SC短期作用性インスリンが続いた。プラセボ後の平均血漿インスリン濃度の顕著な増加は、食事摂取により誘導される患者の内因性インスリン生成の能力が依然維持されていることを指摘している。同じく150U経口インスリンの高いAUCも、恐らく主に内因性インスリン生成を反映し、並びに他の治療の曲線も、ある量の内因性インスリンで説明することができる。

C-ペプチド血漿濃度プロファイルは、この観点を確認し、及び同じくかなりの量の内因性インスリンの放出を示している。これらのレベルは、150U経口インスリン後に最高であり、これにプラセボ、300U経口インスリン、及び12U SC短期作用性インスリンが続く。予想されるように、150U経口投与量及びプラセボは、最も顕著な増加を導くのに対し、300U経口投与量及び12U SC注射後の増加は、明らかに低く、並びにこれらの知見は、様々な治療について認められた血液グルコース低下作用に相関している：外部インスリン投与量の作用が低くなるにつれ、内因性インスリン生成の指標であるC-ペプチド量は多くなる。

本試験において両方の経口投与量で認められたインスリン濃度対時間プロファイルは、実施例6で得たものとはかなり異なっており、ここでは平均インスリン濃度は、およそ2時間後、ベースラインに回復し、並びに最大濃度は約30分後に生じた。これらの差異は食事の影響に起因し、内因性インスリン放出を刺激し及び恐らくは経口インスリン調製物の再吸収を妨害するであろう。実施例6において、患者は、全実験期間絶食し、及び内因性インスリン生成は、一定の低い-投与量のインスリン注入により抑制された。その結果、実施例6の濃度対時間曲線は、投与された外因性インスリンのより純粋な薬物動態を示しているのに対し、本試験における、外因性及び内因性インスリンの作用は重複している。

本試験において、有害事象は報告されなかった。臨床試験安全性パラメータ、生命徴候、ECG又は理学的検査の所見に関連した治療は存在しなかった。4名の患者において発生した5件の低血糖症エピソードは、静脈内グルコース注入の迅速な介入のために、無症候性で有り続けた。これらのエピソードのひとつのみが経口300Uインスリン/400mg 4-CNABに起因し、及び大半(4/5)が、12U SC短期作用性インスリン注射後に生じた。従って、全ての試験治療は、忍容性が良かった。

全般的に、この試験結果は(主要エンドポイントAUC_0-2hを基に)、経口的に投与された300Uインスリン/400mg 4-CNABは、2型糖尿病患者において血液グルコースの食後上昇を低下するように作用することを示唆している。しかしこの作用は、12U SC短期作用性インスリンの注射後よりも小さく、これは両経口投与よりも有意に優れている。経口投与量150Uインスリン/200mg 4-CNABは、無治療(プラセボ)のようにより小さく作用する。両投与時に、経口的に投与されたインスリン/4-CNABは、忍容性が良いように見える。

実施例8
1型真性糖尿病患者において、経口4-CNAB/インスリンの単回投与後のインスリンの吸収及び薬物動態への食物の作用を調べ、並びに4-CNAB/インスリンの単回経口投与後のグルコース及びC-ペプチドの薬力学に対する食物の作用を決定するために、単施設オープンラベル無作為化単回投与3元配置クロスオーバー試験を行った。
糖尿病志願者について、各々米国糖尿病学会(ADA)(1998版Diabetes care、21:S5-S19)により定義された1型真性糖尿病を伴う18〜65歳までの男性又は閉経後の女性対象が試験された。対象は、ボディマス指数18〜30kg/m²を有し、及びスクリーニング時に血糖管理HgA1cの＜10％を有した。患者は、スクリーニング時にインスリンに対する抗体に関する陰性試験、スクリーニング時の絶食時血液グルコース＜12.0mmol/l、及びスクリーニング時の絶食時C-ペプチド＜0.2nmol/mlも有した。健常対象志願者に関して、1年以上にわたり、18〜65歳までの男性対象が選択された。試験に含まれた対象は、18〜30kg/m²であった。

糖尿病患者に関して、本試験は、適格性スクリーニング期間、3種の試験期間及び最終期間の最後の経過観察試験からなった。3種の試験期間は、下記を含んだ：4-CNAB/インスリンの単回投与量の投与、その後の絶食(治療A)、その後の投薬後20分のADA朝食(治療B)、及びその後の投薬後20分のADA朝食(治療C)。本試験は、治療間で少なくとも7日の間隔で、オープンラベル無作為化クロスオーバーデザインを用いて行った。患者は、一晩絶食した。1型糖尿病は、期間1及び2に、治療A又は治療Bに無作為化した。期間3において、全ての糖尿病対象は、治療Cを受け取った。8名の1型糖尿病患者は全員登録した。対照群として、健常志願者2名が登録した。

健常対照対象に関して、試験は、適格性スクリーニング期間、1種の試験期間、及び期間の最後の経過観察期間からなった。健常対照対象は、いかなる医薬品も受け取らなかったが、インスリン生成に対する朝食の作用について対照として利用した。血液採取及び安全性評価は、糖尿病に関するものと同じスケジュールに従った。健常対照対象は、ひとつの試験期間において1型糖尿病と同時に、標準のADA朝食を受け取った(治療D)。
典型的標準ADA朝食は、およそ30％の脂肪、50％の炭水化物、及び20％のタンパク質を含有していた。このような朝食は、例えば、全粒小麦パンの3切れ、低脂肪マーガリン15g、低カロリージュース15g、30％脂肪チーズ20g、肉(ハムなど)15g、2％脂肪分ミルク200ml、及びコーヒ、紅茶又は水(砂糖を含まず)を含んだ。
本試験デザインは、下記表32及び33に示した：

本試験は、投薬後30又は20分で投与された標準ADA朝食の、経口カプセル剤として投与された4-CNAB/インスリンの吸収及び薬物動態に対する作用を試験した。健常対照対象において標準ADA朝食のために生成されたインスリンの量を測定するために、健常対象の対照群は、1期間において標準ADA朝食を受け取った。I型糖尿病患者は、投薬前24時間は自身の長期作用性インスリンから離脱し、彼らのグルコースレベルは、一晩インスリン注入することにより、投薬前は管理した。

下記の治療を、無作為化スケジュールに従い、1型糖尿病者へ投与した(下記参照)。
a)400mg 4-CNAB/300IUインスリン、その後絶食；
b)400mg 4-CNAB/300IUインスリン、その後投薬後30分でADA朝食；
c)400mg 4-CNAB/300IUインスリン、その後投薬後20分でADA朝食。

投薬前に、患者は一晩絶食した。患者は、インスリン注入を一晩受け取った。治験薬は、注入を停止した後30分で投与した(ほぼ午前9:00の投薬)。1期間において、経口投与後、投薬後3時間まで絶食した。ふたつの他の期間においては、経口投与後、標準ADA朝食を、投薬後30又は20分で摂取した。各試験期間の第1日目に、試験医薬品を対象に投与した。健常志願者には、ADA朝食のみを投与した。

I型糖尿病者は、投薬前24時間は、自身の通常の長期作用性インスリンは、中止したが、自身の即時作用性インスリンは、 1日目のほぼ午後3:00に臨床施設に入院するまで許可した。彼らは、1日目のほぼ午後5:30に、標準インスリンの4〜6単位(体重に応じて)を皮下(s.c.)的に受け取り、皮下インスリン投与後30分で標準夕食を受け取った。午後8:30から9:00の間に、糖尿病者は、軽食を取った。-1日目のほぼ午後9:00に、インスリン静脈内注入を、表36に示した注入速度で開始した。インスリン注入の組成物及び注入速度は、表34及び35に説明したように、患者の体重及び血液グルコース濃度により左右された。

必要ならば、注入速度は、60分毎に行った血液グルコース測定の結果を基に調節した。Glucocard(登録商標)を使用する実時間血液グルコース評価のための血液試料(1滴)は、留置カテーテルから採取し、及び血液グルコース濃度は、6〜8mmol/lに維持するように調節した。インスリン注入は、1日目のほぼ午前9:00に、薬物投与前30分に停止した。インスリンが必要でない時点では、通常の生理食塩水のみを投与した。

4-CNAB(N-[4-(4-クロロ-2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]酪酸ナトリウム)は、400mg強度の経口カプセル剤で、Emisphere Technologies社(タリータウン、NY)により製造された。投薬前のグルコース安定化は、Novo Nordisk社が製造したActrapidにより行い、インスリンの活性化合物を静脈内注入により100U/mlで有した。皮下注射のためのインスリンも、Actrapid、強度100U/mlであった。
I型糖尿病者は、自身の通常の長期作用性インスリンを、投薬の24時間前に停止したが、-1日目のほぼ午後3:00の診療施設への入院までは、自身の即時作用性インスリンの使用は許可された。彼らは、-1日目のほぼ午後5:30に、皮下標準インスリン4〜6単位を受け取り、皮下インスリン投与後30分で、標準夕食を受け取った。午後8:30から9:00の間に、糖尿病者は、軽食を受取り、その後翌朝まで絶食した。ほぼ午後9:00に、インスリンの静脈内注入を開始した。このインスリン注入は、1日目のほぼ午前9:00の薬物投与前30分には停止した。

各試験期間の1日目に、試験医薬品は、直立した姿勢の対象に投与し、水200mLと共に嚥下した(噛まずに)(対象は、投薬後3時間は横臥しなかった)。与えられた治療に応じて、患者は、標準ADA朝食を投薬後30又は20分で受け取るか、又は絶食を続けた。3時間後、血液試料を採取し、患者には、本人の通常のパターンの食事の再開を許可し、及び自身の通常の長期又は即時作用性インスリンの使用を再開した。水は、各治療において薬物投与の前1時間及び投与後1時間を除いて、試験期間中は自在に摂取することを許可した。
健常対照対象は、いなかる医薬品も受け取らなかったが、標準ADA朝食は、一晩絶食後、糖尿病者と同時に受け取った(1日目のほぼ午前9:30)。対照は、血液試料採取した3時間後に、通常の食事を再開した。

試験参加者は、臨床研究施設に入院前14日間及び本試験期間中は、いかなる処方又は非処方医薬品(パラセタモール、(アセトアミノフェン)及び外用医薬品を除く)も受け取らなかった。このルールの例外は、以下であった：1型糖尿病者は、自身のインスリン療法を継続し、及び最近6ヶ月間は変更せずに使用した併用医薬品を固定した(fixed)。メチルキサンチン-含有する飲料又は食物(コーヒー、紅茶、コーク、チョコレート)、グレープフルーツジュース、及びアルコールは、臨床検査施設入院前48時間(2日間)及び試験期間は許可されなかった。
各試験期間中に、4-CNAB及びインスリン薬物動態分析のために、連続して血液試料を採取した。用語前-投与は、糖尿病群が、4-CNAB/インスリンを受け取る時期を意味している。健常対照対象は、医薬品を受け取らなかった。

4-CNAB及びインスリンの薬物動態分析のための血液試料は、4-CNAB/インスリン投与前30、15及び5分、並びに投与後10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、150、180、210及び240分に採取した(1期間1対象につき17試料)。血漿グルコースに関する血液試料は、投与前30、15及び5分、並びに投与後10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、150、180、210、及び240分に採取した(1期間1対象につき17試料)。C-ペプチドに関する血液試料は、投与前30及び5分、並びに投与後30、60、90、120、180及び240分に採取した(1期間1対象につき8試料)。

健常な対照対象に関して、血液試料(1滴)を、糖尿病患者への4-CNAB/インスリンの前投与時、1日目の各薬物投与の 30、60、90、120、150、180及び240分後に、実時間分析した(1期間1対象につき8試料)。4-CNAB及びインスリンの薬物動態分析に関する血液試料は、薬物投与前30、15及び5分、並びに投与後10、20、30、40、50、60、75、90、120、150、180、210、及び240分で採取した(1期間1対象につき16試料)。血漿グルコースに関する血液試料は、薬物投与前30、15及び5分、並びに投与後10、20、30、40、50、60、75、90、120、150、180、210、及び240分に採取した(1期間1対象につき16試料)。C-ペプチドに関する血液試料は、薬物投与前30及び5分、並びに投与後30、60、90、120、180及び240分で採取した(1期間1対象につき8試料)。

血液試料(各6mL)は、ヘパリンナトリウム含有管へ直接静脈穿刺することによるか、又は留置Venflon(登録商標)カテーテルにより採取した。血液試料は、試料採取の1時間以内に、1500 x gで15分間、温度2℃〜8℃で遠心した。総容量約450mL(1型糖尿病)又は約180mL(健常対照対象)血液は、本試験期間中採取した。
糖尿病患者は、標準インスリン4〜6単位(患者の体重によって決まる)を、1日目のほぼ午後5:30に皮下(s.c.)により受け取った。インスリン注入は、1日目のほぼ午前9:00に開始し、ポンプは、1日目のほぼ午前9:00の4-CNAB/インスリン投薬前30分に停止した。血液試料(1滴)は、インスリン注入時は60分毎、及び前投与前、各薬物投与後30、60、90、120、150、180、及び240分の時点で、実時間グルコースについて分析した(1期間1対象につき8試料)。血液試料は、留置カテーテル(閉塞具を伴う)から1評価につき1滴を採取し、並びにグルコースをGlucocard(登録商標)を用い実時間で分析した。

4-CNAB及びインスリンの血漿濃度時間データから決定又は計算した薬物動態パラメータは、C_max、t_max、K_el、t_1/2、AUC_last(時点tまでの血漿濃度-時間曲線下面積、ここでtは定量の低限上の濃度の最後の時点である(線形台形公式))、AUC_(0-inf)、AUC_last + C_last/k_el、及び％AUC_extrap (AUC_(0-inf)の計算で推定された部分の百分率：(AUC_(0-inf)−AUC_last)/AUC_(0-inf))*100％))である。
下記の薬力学パラメータは、非-コンパートメント分析を用い、グルコース及びC-ペプチドの血漿濃度-時間データからコンピュータにより計算した(当初及びベースラインを減算した両データ)：E_max、t_emax、及びAUEC_last (ゼロから時点tまでの線形台形公式総和を用いて計算した作用-時間曲線下面積、ここでtは、最後の測定可能な作用(E)の時点である。

薬物動態／薬力学評価
このセクションにおいて、食物の、4-CNAB及びインスリンの吸収及び薬物動態に対する並びに4-CNAB/インスリン単回経口投与後のグルコース及びC-ペプチドの薬力学に対する作用を示した。
図20は、全ての3種治療群の 4-CNAB血漿濃度データの平均プロファイルを示している。図20に示されたように、濃度-時間プロファイルは、3種の治療群(絶食時、投与後30又は20分で朝食)についてはほとんど同じであった。

対象8名中6名の絶食状態下での個々のデータは、投与後30分あたりに明らかな4-CNABピークを示したのに対し、2名の対象(対象106及び108)については、4-CNAB濃度は明らかなピークを示さなかったが、上昇が延長された。投与後30分で朝食を取る場合、対象8名中7名が、投与後30分あたりに明らかなピークを示したが、1名の対象(対象104)は、平坦なピークを示した。投与後20分に朝食を取る場合、8名の対象全員が、投与後20〜40分の間に明らかな4-CNABピークを有した。一般に、血漿4-CNABは、迅速に吸収され、及び濃度-時間プロファイルは、投与後20又は30分の朝食により影響を受けなかった。

インスリンに関しては、対象間及び対象内の高い変動性のために、平均プロファイルは示さなかった。個々のプロファイルを考慮し、インスリン濃度のわずかな減少が、前投与で観察され、これは、試験医薬品の投薬前30分で中止された一晩インスリン注入の結果であった。

絶食条件下で、ピークインスリン濃度は、245〜4450pmol/Lの範囲であった。対象が投与後30分で朝食を摂った場合、ピークインスリン濃度は、87〜2486pmol/Lの範囲であった。対象が投与後20分で朝食を取った場合、ピークインスリン濃度は、84〜1260pmol/Lの範囲であった。健常対象は、ピークインスリン濃度254〜662pmol/Lを朝食後に示した。大きいインスリンピークは、高い又は低いかにかかわらず、投与後20分くらいであるように見えた。しかし4症例においては、2個のインスリンピークが観察された。別の一症例において、1個の遅れたインスリンピークが観察され、及び遅れて認められるインスリンピークは、グルコースの減少とは相関していなかった。
一般に、インスリンピークは、グルコースのわずかな減少又は安定化に伴って起こる。しかし、到達したインスリン濃度の高さは、グルコース低下の程度とは相関していなかった。

各対象は、インスリン濃度の顕著な個人内変動を示した。健常対象は、朝食後約1時間から、朝食後2時間まで、又は朝食後3時間まで、血漿インスリン濃度の軽度(1名の対象についてピークインスリン：254mmol/L)から中等度(1名の対象についてピークインスリン662mmol/L)の増加を示した。対象間及び対象内のインスリン血漿濃度のかなりの変動のために、食物摂取の、インスリン血漿濃度-時間プロファイルに対する作用は結論付けられなかった。

図21は、血漿グルコースの平均濃度-時間プロファイルを示している。図21を参照し、患者の大部分は、前-投与のグルコース濃度のわずかな増加が示され、これは、試験医薬品投薬前30分で停止された一晩インスリン注入に関連していた。絶食状態下で、血漿グルコース濃度は、投与後およそ60分から以降わずかな増加を示した。患者が、投与後20又は30分で朝食を取った場合、血漿グルコース濃度は、より迅速に増加し、及びより高値に到達した。絶食状態下で、10〜60分の間のグルコースのごくわずかな低下が認められた。患者が投与後30分に朝食を取った場合、この低下はわずかにより顕著になった。患者が投与後20分に朝食を取った場合、グルコースの明らかな低下は認められなかった。健常対象は、朝食後1〜2時間の間にグルコースの軽度の増加を示した。

C-ペプチドに関して、大部分の試料について、血漿C-ペプチド濃度は、LOQ以下であった。従って、記述統計又はプロファイルは示されなかった。
4-CNABについて、薬物動態パラメータは、予定されたように計算した。加えて、3種のパラメータ(C_max、t_max及びAUC)の部分値は、投与後0-20分、投与後0-30分及び投与後0-3時間の期間について計算した。インスリンについて、投与後0-20分、投与後0-30分及び投与後0-3時間の期間についてC_max、t_max及びAUC値のみが計算された。グルコース及びC-ペプチドの薬力学パラメータは計算されなかった。

4-CNABのPKパラメータに関する要約統計は、表36に示し、及び投与後0-20分、投与後0-30分及び投与後0-3時間の期間についての4-CNAB由来のPKパラメータは、表37に示した。

* 中央値(最低-最高)

絶食状態下で、平均C_max値は、摂食状態と比べ低かったが、AUC_0-inf値は反対を示した。しかし、C_max、AUC_0-inf及びt_1/2の全ての標準偏差は高かった。全ての治療に関して、最大濃度は、投薬後短期間、投与後25から30分で到達した。平均半減期は、摂食状態下で絶食時状態と比べわずかに短かった。

0-20分の期間について、異なる治療群間でC_max、t_max及びAUCの差異は、理論的に予想されたものではなかった。C_maxについて、実際明らかな差異は認められなかったが、AUCの平均値は、投与後30分に朝食を受け取った群について、他の2治療群と比べより低かった。食物摂取が4-CNABの薬物動態に影響を及ぼすならば、0-30分の期間について、C_max、t_max及びAUCの差異が、投与後20分で朝食を受け取った群と他の2治療群の間で認められると予想された。しかしこれは観察されなかった。全て3種の治療群について、C_maxは、投与後ほぼ30分以内に達し；平均C_max(0-30分)値のみが、C_max(0-3時間)と比べ、有意に低かった。

インスリンについて、投与後0-20分、0-30分及び0-3時間の期間のインスリン由来のPKパラメータの要約統計が、表37に示された。

0-20分の期間について、異なる治療群間でC_max、t_max及びAUCの差異は、理論的に予想されなかった。しかし、平均C_max及びAUCについて明らかな差異が認められたが、かなりの変動が報告された。C_max及びAUC値は、摂食状態下では、絶食状態と比較し、かなり低い。食物摂取がインスリンの薬物動態に影響を及ぼしたならば、0-30分の期間に関する、C_max、t_max及びAUCの差異は、投与後20分で朝食を受け取った群及び他の2種の治療群の間で認められることが予想された。しかし、これは観察されず；投与後30分で朝食を受け取った群も、絶食時と比較した場合は明らかな差異を示し、このことは予想されなかった。

インスリンの吸収における対象内の変動はかなりであるように見える。この現在の結果を基に、インスリン吸収に対する朝食の作用は投与後30又は20分で与えられた場合にはないように見える。しかし、一部の絶食状態の又は投与後30分の朝食を有する対象において、遅れたインスリンピークが認められたのに対し、これは投与後20分の朝食を有する対象においては決して認められなかった。従って、投与後20分の食物摂取の作用は排除することはできない。

結論
4-CNABの吸収は迅速であり、及び投薬後30及び20分での食物摂取は、4-CNABの薬物動態に対する作用を示さなかった。3種の治療群全てについて、4-CNAB-プロファイルは、高度の類似性を示した。加えて、4-CNABに由来した薬物動態パラメータC_max、t_max及びAUCに関する治療間の明らかな差異は、認められなかった。朝食を、投与後20又は30分に摂取したとしても、食物は、4-CNABに対して作用を有さないと結論付けることができる。

投薬後30又は20分の食物摂取の影響に関する確固とした結論は得ることができなかったために、インスリンの吸収は、対象間及び対象内(治療間)で高い変動性を示した。4-CNABとインスリンの間に相関関係は認められなかった。このことは、インスリンがその担体4-CNABから放出される時期及び場所に関連しているであろう。残念ながら、この目的に関しては非常に限定された情報しか入手できない。この結果から、食物が、血漿インスリン濃度データから得られた薬物動態パラメータに影響を及ぼすと結論付けることはできない。

I型糖尿病患者において、食物摂取は、血漿グルコース濃度の上昇を引き起こしたが、4-CNAB/インスリンのグルコースに対する作用には影響を及ぼさなかった。糖尿病患者において、血漿グルコース濃度データは、朝食後には、絶食状態と比べ、より急な上昇を示し、これは予想されたことであった。概して、インスリンピークは、グルコースのわずかな減少又は安定化を伴っていた。しかし到達した最高インスリン濃度は、グルコース低下の程度とは相関していなかった。
血漿C-ペプチド濃度は、統計解析を行うには余りにも低かった。4-CNAB/インスリンが、これらの最低レベルを変化するとは予想されない。食物摂取のC-ペプチドに対する作用は、I型糖尿病患者において結論付けられなかった。

AEの数は、朝食を、4-CNAB/インスリン投薬後30分で摂取した場合に最高であった。主なAEは高血糖症であり、これはI型糖尿病患者において予想された。低血糖症は見られないが、これは予想された。恐らく4-CNAB/インスリン投与量は非常に低かったが、高いインスリンピークが観察された。生命徴候、ECG及び臨床化学に関して、臨床的に有意な所見はなかった。Glucocard(登録商標)を使用するグルコース測定は、高いグルコース濃度を、特に朝食後に示した。患者は、これらの高血糖症事象を治療するための併用薬を受け取った。食物と組合せた又は絶食状態下での400mg 4-CNAB/300IUインスリンの単回経口投与量は、安全であり及び良い忍容性がある。

実施例9
自分自身の制御を利用する絶食している2型糖尿病患者における、経口的に投与された4-CNAB/インスリンの安全性、薬物動態、及び薬力学を比較するための、並びに自身の標準医薬品が与えられた2型患者における標準食後の血液グルコース、インスリン及びC-ペプチドレベルを、4-CNAB/インスリンと共に標準食後の血液グルコース、インスリン及びC-ペプチドレベルのそれと比較するための、オープンラベル単回投与クロスオーバー試験を行った。

各自2型真性糖尿病である年齢46〜70歳の 24名の志願者を試験した。患者は、ボディマス指数21〜35を有し、及び安定した血糖管理を有した(HgA1cは5.9〜11.6％の範囲)。15名の患者は、糖尿病治療薬(メトホルミン又はアカルボースのいずれか)に、及び9名の患者は食餌療法のみで自身の糖尿病を管理した。薬物療法に割当てられた参加者全員は、試験前24時間は自身の糖尿病治療薬を服用しなかった。
糖尿病の志願者は、2群に分けた--第1群において、12名の患者を、絶食状態で試験し、及び第2群において、12名の患者を、標準食前及び途中で試験した。患者毎に、患者自身の管理を利用し、及びインスリン/4-CNAB混合物を得ることなく試験した。

第1群に関して、最低8時間の一晩絶食の後、対象は、漸増様式のインスリン(3名の患者は200Uインスリンを受取り、5名の患者は300Uインスリンを受取り、及び4名の患者は400Uインスリンを受け取った)及び固定された投与量の送達物質としての300mg 4-CNABの混合物を含有するカプセル剤1個が与えられた。対照セッションにおいて、プラセボが、これらの同じ患者に与えられた。第1群対象に関する血漿グルコース対時間のプロットについては、図22参照。
第2群に関して、対象は、最低8時間の一晩絶食後に、標準食(350kcal)を得た。食物摂取の20分前に、患者には、300U又は400Uインスリン(6名の患者は300Uインスリンを受取り、及び6名の患者は400Uインスリンを受け取った)及び300mgの4-CNABを含有したカプセル剤が投与された。対照セッションにおいて、これらは同じ患者が、850mgメトホルミン又は100mgアカルボースのいずれかの、患者自身の標準医薬品を服用した。自分の糖尿病を食餌療法のみで管理する対象は、薬物は伴わずに、それらの食事(炭水化物47g(54％)及び総カロリー350kcal)を得た。第2群対象に関する血漿グルコース対時間のプロットは、図23を参照のこと。

血液グルコースレベルは30％低下されない(第1の3種の絶食対象の平均)という事実のために、投与量は300Uインスリンへ増加した。その後、両群(絶食及び標準食)において、血液グルコースレベルは300Uインスリンによって30％減少しなかったので(3名の対象の平均)、インスリンの投与量を400Uインスリンへ増加した。
送達物質4-CNABは、Emisphere Technologies社(タリータウン、NY)により供給され、及び使用時まで乾燥し室温で保存した。組換えヒトインスリン亜鉛は、Eli Lilly社から直接出荷され、-20℃で保存した。標準カプセル剤は、サイズ00Cのゼラチンで作成した。

カテーテルは、各患者の肘前腕静脈に挿入した。血液は、ベースラインで2回、5〜10分隔てて、及びカプセル剤投与後時間を決めた間隔で採血した。絶食群である第1群において、血液は、最初の1時間は5分毎に、その後10-20分毎に採血した。標準食群である2群において、血液は、最初の2時間は10分毎に、その後は20分毎に採血した。両群において、血液試料は、血液グルコースが基本レベルに到達するまで採血した。全ての血漿試料は、グルコース、インスリン、C-ペプチド及び送達物質4-CNABについて分析した。血液グルコースレベルは、2個のElite Glucometers(Bayer社、Elkhart、インディアナポリス、IN、米国)を用い、実時間で測定した。本治験の最後に、血漿グルコース濃度は、Roche Diagnostics (Roche Diagnostics社、インディアナポリス、IN、米国)の酵素的UV試験を用い測定した。血漿インスリン及びC-ペプチドは、Linco Research社(セントチャールズ、MO、米国)により製造されたラジオイムノアッセイキットを用いて決定した。

結果及び結論
結果は変動性が高かったが、ほとんどの対象において、食後に、インスリンの吸収及びその生物学的作用が、低血糖症又は血液グルコースの抑制された上昇のいずれかを引き起こすことを示す明らかな傾向が存在した。食事のセッションにおいて、投与されたインスリンの作用を与えられた糖尿病治療薬の作用と比較した場合、血液グルコース濃度の小さい差異のみが存在し、これは、食事中であっても、経口インスリンは、生物学的に有効であるという事実を明らかにしている。本願明細書に提示された非糖尿病志願者を対象とする先の例におけるように、インスリンレベルの上昇は、カプセル剤の嚥下後、10〜30分で明らかになり、血液グルコースレベルの下落に先行していた(下落が存在する場合)。

インスリンの腸吸収の程度を評価するために、C-ペプチドレベルを測定した。インスリンの吸収は、特に標準食群において、C-ペプチドレベルの下落を引き起こし、これはインスリンの吸収に起因した内因性インスリン分泌の減少、及び結果としての低血糖症を示している。

インスリン(200U〜400Uインスリン)の漸増量が、300mg送達物質4-CNABと共に経口的に与えられた絶食する2型糖尿病志願者は、グルコースレベルの減少及びインスリンレベルの中程度の増加を明らかにした。標準食群において、インスリンカプセル剤は、より高いインスリンレベル及びC-ペプチドレベルの低下を引き起こした。ほとんどの症例において、カプセル剤摂取後に、血漿グルコースレベルの減少が存在し、絶食群において底(nadir)が10〜30分後に明らかになった。通常の糖尿病治療薬を受け取った標準食の患者において、4-CNAB/インスリンカプセル剤は、それらの食事を、メトホルミン又はアカルボースと同様に、時にはより良く「カバー」した。標準食群のほとんどの患者において、C-ペプチドレベルは抑制され、これは内因性ホルモンの分泌が部分的に損なわれたという事実を指摘している。

血漿インスリンレベルは、絶食群のほとんどの対象において上昇した。これらのレベルに、グルコースレベルの低下が常に続くわけではなかった。
本カプセル剤服用後5分で、恐らく本治験混合物とは関連がないと思われる軽度の頭痛を愁訴した対象1名を除き、治験期間又は数週間後に有害事象は検出されなかった。
この経口インスリン調製物は、安全及び有効であることが結論付けられた。しかし、生物学的活性インスリンの吸収には更なる改善の必要がある。

追加実施例
インスリンの慢性投与に関連した1種又は複数の病態の発生及び／又は重症度を低下する方法をより良く理解するために、下記実施例を示す。これらの実施例は、例証する目的のみであり、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定するようには構成されていない。

送達物質4-CNABは、Emisphere Technologies社(タリータウン、NY)が調製した。インスリン(亜鉛、ヒト組換え)は、Calbiochem社(サンディエゴ、CA)から購入した。このインスリン効力は、およそ26USP単位/mgであった。インスリンは、凍結乾燥した固形物として-20℃で保存した。溶液中において、1回のみの凍結-融解サイクルが施された凍結したアリコート(15mg/mL)として保存した。
水性インスリン保存溶液は、最終インスリン濃度およそ15mg/mLで調製した(pH7.5)。送達物質は、水中に溶解し、その後水酸化ナトリウム又は塩酸を、両方とも送達物質を溶解し、及び投薬溶液をpH7.5〜8.5に滴定するために添加した。投薬前に、必要量のインスリンを、この送達物質溶液に添加した。

ラットにおけるインスリンレベルは、インスリンELISA試験キット[DSL社、ウェブスター、TX、カタログ番号DSL-10-1600]を用いてアッセイした。このアッセイは、3.125〜250mU/mLの範囲を対象としていた。ラットにおける血液グルコースレベルは、Lifescan社(ミルピタス、CA)により製造されたグルコメーターであるOne-Touch Basic Blood Glucose Monitoring Systemを用いて測定した。

動物モデル
合計60匹の雄のスプラーグ・ドーリーラットを、24時間絶食し、その後ソラジン(1.5mg/kg、im)及びケタミン(44mg/kg、im)により麻酔をかけた。次にこれらは下記の5治療群に分けた：
1. H₂O (p.o.、1mL/kg)
2. 担体(p.o.、1mL/kg；200mg/kg)
3. インスリン (p.o.、1mL/kg；0.5mg/kg)
4. インスリン及び担体(p.o.、1mL/kg；0.5mg/kgインスリン及び200mg/kg 1182)
5. インスリン (s.c.、0.05mg/kg)

1群につき12匹の動物を、3匹づつ30、60、120及び180分に屠殺した。血清インスリン及び血液グルコースのモニタリングのために、血液0.4mLを尾動脈から採取した。安楽死させた後、大動脈試料を摘出し、及び液体窒素中で瞬時に凍結した。IACUCが承認したプロトコールに従い全ての動物試験は行った。
動物は、施設に馴化した後に、ストレプトゾトシン(65mg/kg、iv)を受け取った。血液グルコースは、注射後24、48及び72時間で測定した。血液グルコースが150mg/dlより大きいこれらの動物は、12時間絶食し、説明した治療を受けた。

ハイブリダイゼーション試料の調製
総RNAを、トリアゾール試薬(Invitrogen社、カールスバッド、CA)の使用に関するプロトコールに従い、凍結した組織試料から調製した。これらの試料は更に、Qiagen Midi Kit(バレンシカ、CA)を使用し清浄とした。各RNA試料の品質を、アガロースゲル電気泳動並びに260及び280でのUV吸光度を用いて評価した。許容できるRNA試料は、質量ベースで等量でプールした。このプールした試料を用い、Affymetrixにより提供されたプロトコールに従い、cDNAを調製した。次にこの試料は、Enzo BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit (Affymetrix社、サンタクララ、CA)を使用するin vitro転写標識及び増幅における鋳型として使用した。次に標識した転写産物15μgを断片化し、Affymetrix GeneChip Protocol(Affymetrix社、2000年)に説明されたハイブリダイゼーション溶液を調製するために使用した。

遺伝子チップ解析
試料は、試験アレイにハイブリダイズし、並びに5'対3'比、検出限界、及び画質を評価し、標識した試料の品質を確認した。次に許容可能な試料を、Affymetrix Rat U34Aアレイにハイブリダイズした。これらのアレイの洗浄及び染色を、標準Affymetrixプロトコールを用い行った。試験アレイと同じ方法で、アレイ品質を評価した。許容できる試料を、群を超えて認められた発現パターンに加え下記の方法で対形成(pair wise)し、両方で評価した：
1. 第2群対第1群
2. 第3群対第1群
3. 第4群対第1群
4. 第5群対第1群
5. 第4群対第5群
6. 第4群対第2群

実施例12
倍率変化(fold change)は、Affymetrix Microアレイ Suite Softwareパッケージにより決定し、2倍未満の値は意義なしと見なした。このソフトウェアパッケージ分析は、各プローブセットの個々の一員を比較し、Difference Callを決定した。この報告において、全ての計算された倍率変化は、図面において使用したが、これらの結果及び考察においては、Affymetrix softwareにより Increasing又はDecreasing callを受けたこれらの倍率変化のみを使用し、結論を引き出した。これらのデータは、下記表38に含めた。

表38の太字の数は、Affymetrix Microarray SuiteソフトウェアがIncreasing又はｈDecreasing callを生じた値を示す。

実施例13
薬物動態及び薬力学
図24は、皮下及び経口送達による単回投与後の経時的血液グルコース(mg/mL)の図を示す。この図は、担体として4-CNABを使用するインスリンの経口投与が、従来の皮下投薬により認められるグルコース抑制の約95％を生じたことを示している。しかし、図24の投与を使用する経時的血清インスリン(mU/mL)を示す図25に示されたように、しかしこの抑制を達成するために必要とされた血清インスリンC_maxは、経口投与された動物において、皮下注射を受け取るそれらの約30％であった。皮下試料についてt_maxも、約15分遅かった。血液グルコースの抑制は恐らく、血液採取を継続するための、麻酔薬の継続された投与により削除された。

実施例14
グルコース調節
解糖／糖新生は、解糖／糖新生の両方向で起動することができる3種の主なサイクルを通じて生じる。解糖的見地から、第1のサイクルは、Glu/Glu-6-Paseサイクルであり、これはグルコースをGlc-6-Pに転換する。これに、Fru-6-P/Fru-1,6-P2サイクル、及びピルビン酸/PEPCKサイクルが続く。

Glu/Glu-6-Paseサイクル
筋肉組織において、グルコースは、ヘキソキナーゼによりGlc-6-Pに転換される。Grannerらの論文、J Biol Chem、265:10173-6 (1990)を参照のこと。本試験において、皮下及び経口の両方で投与されたインスリンは、酵素ヘキソキナーゼIIのmRNAレベルの上昇を生じた。図26は、偽投薬と比較したグルコキナーゼ及びG6Pase mRNA発現を示す。図26に示されたように、より低い血清インスリンレベルにも関わらず、経口的に投与された動物は、120分でヘキソキナーゼIIの2-倍高いレベルを示した。経口投与された及び皮下投与された動物からのアレイの直接比較は、30分で、2.8-倍高いmRNAレベルを示している。

Fru-6-P/Fru-1,6-P2サイクル
二機能性酵素6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース2,6-ビスホスファターゼは、解糖と糖新生の間のスイッチとして利用される。インスリン投与は、この酵素の増加を起動することが示されている。Grannerら、J Biol Chem、265:10173-6 (1990)；Lemaigreら、Biochem J、303:1-14 (1994)；Dentonら、Adv Enzyme Regul、36:183-98 (1996)。図20は、偽投薬と比較した、Fru-1,6-P及び6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼmRNA発現を示している。本発明者らの試験において及び図27に示されたように、この酵素は、観察された遺伝子発現において有意差を伴わない投与のふたつの経路の発現のほぼ同じパターンを示した。
酵素フルクトース1,6-ビスホスファターゼは、Fru-1,6-P2をFru-6-Pへの転換を触媒し、これはこのサイクルの糖新生側である。このmRNAは、糖尿病及び飢餓により誘導され、並びにインスリン投与により減少される。図27に示され及び6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース2,6-ビスホスファターゼに類似しているように、この酵素の発現パターンは、被験動物の両方のセットでほぼ同じである。

ピルビン酸/PEPサイクル
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)は、オキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸に転換する糖新生経路において重要な酵素である。これは、インスリンにより下方調節されることは分かっている。例えば、Grannerら、J Biol. Chem.、265:10173-6 (1990)；Lemaigreら、Biochem J、303:1-14 (1994)；Denton, R. M.ら、Adv Enzyme Regul、36:183-98 (1996)；Gabbayら、J Biol Chem、271:1890-7 (1996)を参照のこと。図21は、偽投薬と比較してPEPCK mRNA発現を示している。図28に示されたように、このmRNAの発現レベルにおいてほとんど差異は認められない。

グリコーゲン合成
インスリンは、グリコーゲンへのグルコース転換率を増加することも知られている。これは、グルコース-1-P分子の分枝鎖への結合により行われる。次にこの鎖は、低血糖症状態で利用されるグルコース貯蔵として利用する。
グリコーゲンシンターゼは、グルコース分子鎖の延長に寄与している。インスリン投与は、この酵素をアップレギュレーションすることが分かっている。Vestergaardら、Dan Med Bull、46:13-34 (1999)。図29は、偽投薬と比較したグリコーゲンシンターゼmRNA発現を示している。図29に示されたように、経口投薬及び皮下投薬は、この酵素のレベルの発現のほぼ同一のパターンを生じ、経口投薬は、120分で、mRNAのほぼ2倍を得た。
酵素グリコーゲンシンターゼキナーゼ3は、グリコーゲンシンターゼのリン酸化によるグリコーゲン合成の阻害に関与している。図29に示されたように、2種の投薬試料においてこの酵素の発現パターンは、非常に類似しており、120及び180分で偽レベルに回復する最初の減少を示している。皮下投薬は、60分でわずかに強力なダウンレギュレーションを達成し；しかし、この差は、2種の遺伝子チップ間の直接比較においては認められなかった。

酵素グリコーゲンホスホリラーゼは、グリコーゲン鎖の破壊に寄与している。インスリンは、糖尿病性動物においてリン酸化レベルを正常化することがわかっている。本発明者らの試験において、図29に示されたように、この酵素レベルにおいて劇的差異が認められた。経口投薬は、180分で、偽レベルでは緩徐に増加したmRNAレベルの即時減少を達成した。皮下投薬は、120分で劇的に逆転された早期のアップレギュレーションを生じ、180分でほぼ偽レベルに回復した。経口と皮下投薬の間で認められた差異は、偽投薬との比較に加え互いの比較においても認められた。

実施例15
損傷に対する血管反応
血管疾患は、通常損傷に対する反応として説明されている。血管は、血管壁に対する損傷を修復する反応の進行につながる刺激(損傷)に曝されている。この損傷は、いくつかの形があり、これは酸化的ストレス、力学的ストレス、ウイルス感染症及び剪断応力の変化を含む。損傷それ自身は多様であるが、損傷に対する反応には、多くの共通の局面がある。初期反応遺伝子はアップレギュレーションされ、細胞遊走及び増殖に加え、損傷部位への炎症細胞の動員のための遺伝子転写につながる。この反応は継続するので、マトリックス再構築につながる酵素が発現されるであろう。この結果は一般に、平滑筋増殖及び粥状斑形成を通じて人工壁を肥厚する。臨床結果は、糖尿病が関連した動脈症である。本出願において、血管損傷の様々な形が関連した遺伝子のmRNAレベルを試験する方法が説明されている。

血管疾患は、mRNAレベルの多くの変化が関連したプロセスの複合セットである。本願明細書に示された血管損傷のmRNAマーカーは、この具体的試験において認められたが、恐らく他のいくつかも存在する。これらは、初期応答遺伝子(すなわち、c-myb及びc-fos)、サイトカイン(すなわち、インターロイキン、及びケモカイン)、増殖因子及びそれらの受容体(すなわち、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、及びトランスフォーミング増殖因子β)、接着分子(すなわち、セレクチン、及びインテグリン)、細胞外マトリックスタンパク質(すなわち、コラーゲン及びアクチン)、マトリックスメタロプロテアーゼ及びそれらのインヒビター、細胞周期タンパク質(すなわち、サイクリン及びサイクリン依存型キナーゼ)、並びにタンパク質キナーゼ(すなわち、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、及びプロテインキナーゼC)、本願明細書に説明されたものの一部を含む。このリストは、血管疾患がより良く理解され始めているので成長し続け、及びそのマーカーは特定の試料中において変動し得る。

初期応答遺伝子
動脈損傷の初期マーカーのひとつは、損傷に対する血管反応を強化することに寄与するタンパク質の引き続きの発現の制御における転写因子の発現である。これらの初期応答遺伝子は、c-myc、c-fos、jun、及びEgr-1を含む。図30A及び30Bは、偽投薬と比較した初期応答遺伝子mRNA発現を示している。本発明者らの試験において、図30A及び30Bに示されたように、Egr-1、c-myc、Jun B及びEts-1のレベルの示差的発現が認められた。

Egr-1は、損傷に対する血管反応のいくつかの要素に関連している。その発現は、未損傷の血管においては非常に低いが、力学的又は酸化的損傷により増加する。Egr-1は、サイトカイン、接着分子、増殖因子及び凝固カスケードの一員のmRNAレベルの増加を起動することが明らかにされている。本発明者らの試験において、図30A及び30Bに示されたように、Egr-1は、皮下インスリン投与により、経口によるよりも4.7-倍高いレベルに、直ちにアップレギュレーションされる。経口投与は、Egr-1 mRNAレベルの初期増加を誘導しない。代わりに、皮下投与動物のそれをわずかに下回るように上昇された場合、レベルは180分まで偽レベルの近傍に維持される。

ラット大動脈のバルーン損傷は、Jun BのmRNAの急激な増加につながる。Jun及びFosは結合し、ヘテロダイマー性転写因子AP-1を形成する。この因子は、損傷に対する反応に関連した接着分子、サイトカイン、及び他の因子の発現につながる。図30A及び30Bに示されたように、JunB発現は、全ての時点において、偽レベル近傍に維持されるが；しかし、アレイの直接の比較は、120及び180分での皮下投与された試料における有意に高いレベルを示している。両方のレベルが120及び180分で対照近傍であるが、ふたつのアレイ間の比較は、経口的に投与された試料における発現の有意な減少を示している。

細胞周期の状態の静止期G0から増殖期G1へのスイッチは、c-mycの増大したレベルにより達成される。血管障害は、c-myc発現を誘導し、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるc-mycの阻害は、ラット及びブタにおけるバルーン損傷後の内膜過形成を防止する。従って、これは血管損傷の重要なマーカーである。図30A及び30Bに示されたように、皮下投薬及び非経口投薬は、180分でのc-mycのmRNAレベルの有意な増加につながる。経口的に投与された試料は、偽レベル近傍に維持され；しかしこれらふたつの投与経路の間に、直接比較した場合、有意差は認められなかった。
皮下及び経口投薬に関するEts-1 mRNAレベルを、図30Aに示した。

実施例16
インスリン-様増殖因子ファミリー
インスリン-様増殖因子(IGF)I及びIIは、プロインスリンと相同性を共有する1本鎖ポリペプチドである。これらは、全身のグルコース代謝において重要な役割を果たすが、細胞周期進行、有糸分裂、細胞遊走及びアポトーシスに対する作用も示されている。IGF機能の多くは、IGF-結合タンパク質(IGFBP)により調節されている。一般に、IGFBPはIGFに結合し、そのIGF受容体への結合を妨害する。IGFBP-3は、この観点において最も有力であり、成人血清においてIGFの＞90％が結合している。それらの主要機能はIGFの調節であるが、IGFBPは、血管損傷部位に生物学的作用を有することが示されている。IGFBP-1は、IGF-1依存型で血管平滑筋細胞(VSMC)の遊走を刺激する。IGFBP-1から-5は、再発狭窄症組織において発現されることが示されており、このことは、血管損傷に対する動脈の反応における役割を示唆している。

図31は、偽投薬に比較したIGFBP mRNA発現を示している。図31に示されたように、IGF-1、IGF-2又はIGF受容体の発現における有意差は、これらふたつの投薬経路の間で認められない。しかし、IGFBPに関しては、劇的な差異が認められる。IGFBP-1は、偽投薬と比べ2時間で、3-倍に対して、39-倍低下し、並びにIGFBP-2は、6-倍に比べ、15-倍低下した。両方の場合において、血管損傷において認められた作用とは反対に、IGFBP発現は減少された。この変化を起動する機序は、インスリンのVSMCに対する直接作用のそれに勝っているかもしれない。それにもかかわらず、IGFBP-1及び-2発現のレベルは、皮下投与された動物においてより高く、これは損傷に対する増加した反応に相関していることは明らかである。IGFBP-3においてはほとんど変化は認められない。

実施例17
接着分子
動脈症の初期段階のひとつは、炎症細胞の血管壁への接着である。これは、細胞内接着分子-1(ICAM-1)、血管細胞接着分子-1(VCAM-1)、セレクチン及びインテグリンなどの接着分子により媒介される。これらの遺伝子のmRNAの変化を試験し、図32は細胞内接着分子-1のmRNA発現を、偽投薬と比較した。図32に示されたように、ICAM-1の場合を除き、投薬グループのいずれにおいても有意な作用は認められなかった。ICAM-1は、皮下投与された動物において、180分で増加した。ICAM-1の増加した発現は、血管損傷のいくつかの異なる形において認められ、及び損傷部位への炎症細胞の動員に関連している。この差異は、偽投薬との比較及びこれらふたつの投薬群のアレイの直接比較の両方において認められる。

実施例18
サイトカイン
血管損傷部位は、オートクリン及びパラクリンの両作用を通じて増殖因子、サイトカイン、接着因子、及びマトリックスメタロプロテアーゼの発現を調節する前炎症性サイトカインの発現を介し、それらの炎症状態と連絡している。これらの中で、血管疾患の部位で通常認められるもののひとつは、インターロイキン-6(IL-6)である。VSMCは、両方ともIL-6シグナル伝達をもたらすIL-6受容体又は糖タンパク質130(gp130)のいずれも発現しないので、これは最初はIL-6刺激を受け難い。VSMCは、gp130がアップレギュレーションされることが示されている第一の細胞である。図33A及び33Bは、偽投薬と比較したサイトカインmRNA発現を示している。本発明者らの試験において、図33A及び33Bに示されたように、gp130は、皮下及び経口の両方で投与された動物において、同等に増加することが認められた。しかし、IL-6 mRNAの有意な増加は、図33A及び33において示されたように、皮下投与された群においてのみ認められた。これは損傷に対する反応については両群の大動脈を「プライミング」するが、実際には皮下投薬のみが予想されたシグナルの有意な産生を起動することを示しているので、これは決定的な差異である。図33において、サイトカインデータは、サイトカイン類、エオタキシン、MCP-1、IL-12及びEL-13についても図示されている。

実施例19
脂質過酸化
脂質代謝及びLDL酸化に関連したいくつかのタンパク質は、アテローム性動脈硬化症の進行に関連している。LDL酸化は、単球を動員し、それらの内皮細胞への接着を促進し、及びマクロファージの遊走を阻害する物質を生成することが示唆されている。これらの工程は、アテローム性動脈硬化症病巣において認められる泡沫細胞及び脂肪線条の形成につながる。12-リポキシゲナーゼ(12-LO)は、アテローム性動脈硬化症病巣の形成を起動することが明らかにされており、及び損傷に対する血管反応が有意にアップレギュレーションされることも記録されている。その結果、これはこの状況において決定的に重要である。

図34は、偽投薬と比較した、脂質過酸化mRNA発現を示している。図34に示されたように、60分で、経口投与した場合の2.7-倍と比較して、皮下投与した試料において5.8-倍の増加が存在している。経口投与した試料において、このアップレギュレーションは、120及び180分で、mRNAレベルが偽投薬と比べ、3.4-及び2.1-倍の低下に逆転されている。皮下投与された動物において、mRNAレベルは、180分まで高くあり続け、この時点で6.4-倍の減少が観察される。120分の値が、皮下投与された試料中のこのmRNAが14-倍高いレベルよりもより大きいことに注目することは重要である。

ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)は、緩徐に酸化されたLDLにより誘導される。これは、ヘムの消失を通じた保護的酸化防止機構及びその反応生成物の更なる酸化防止能を利用する。図24に示されたように、この遺伝子のmRNAレベルは、60分で経口投与した動物と比べ、皮下投与した動物において6-倍高いことが認められる。この酵素の機能は保護的であるが、そのアップレギュレーションは、損傷に対する反応を表わし、及び12-LO又はそのLDL酸化の刺激の増大したレベルに対し良く反応するであろう。

実施例20
血栓症
動脈壁へのフィブリン付着は、アテローム性動脈硬化症において大きな役割を果たすと考えられる。それらのフィブリン溶解性活性により、プラスミノーゲンアクチベーターは、これが発生することをブロックする。これらの保護的作用は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター(PAI-1及び-2)によりブロックされる。図35は、偽投薬と比較した、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターmRNA発現を示している。本発明者らの試験において、図35に示されたように、PAI-1レベルは、皮下試料のみ上昇された。偽投薬を超える2.6-倍の増加及び経口を超える2.8-倍の増加が、120分で認められた。これらのレベルの2.6-倍の減少は、60分で経口試料において認められ、これは120及び180分で、偽レベルに回復した。PAI-2発現は、投薬の両セットに類似していた。60分で、経口投与した試料は、PAI-2の有意に増加した(4.8-倍)レベルを示した。この上昇は、120及び180分では存在しなかった。このmRNAのこれらふたつの投薬経路の間の有意差は存在しなかった。

実施例21
追加のマーカーは、図36に例示しており、これらはNPY、TGF-β、ICAM-1及び12-LOのmRNA発現に対するインスリンの皮下送達及びインスリンの経口送達の作用を比較するものである。
実施例22
インスリン皮下送達及びインスリン経口送達の間のmRNA発現の比較は、マーカーTHY-1、VEGF-B及びインテグリンaE2について、図37に示されている。経口送達データに関して、ふたつの異なる用量のmRNA発現に対する作用が示されている。

実施例23
ストレプトゾシン糖尿病モデルにおける薬物動態及び薬力学
図38は、ストレプトゾシン糖尿病モデルに関する、皮下及び経口送達による単回投与後の血液グルコース(mg/mL)のグラフを示している。ふたつの異なるインスリン経口用量が示されている。図39は、図38の投与を用いた経時的血清インスリンレベル(mU/mL)を示す。

遺伝子チップ試験のための対照
対照グループとして、担体及びインスリンは、個別に経口投与された。これらの遺伝子チップの結果を分析し、組成物の個別の成分の可能性のある活性を同定した。担体単独試料は、大動脈におけるmRNAレベルの一貫し及び有意な変化を生じなかった。これは、インスリン単独試料についても当てはまった。

考察
先に考察した例は、インスリン経口組成物の、mRNA調節のレベルでの従来の皮下投薬の血管系に対する望ましくない作用を緩和する能力を明らかにし、並びに投薬経路の変更により引き起こされたグルコース代謝の変化を記録している。薬力学データは、経口投与された組成物の、従来の投薬法のものに類似したグルコース抑制を達成する能力を明らかにしている。薬力学データは類似しているが、薬物動態データは、経口投与された組成物において、従来の投薬法のものと比べて大きく低い血清インスリンレベルを示している。血清インスリンレベルの差は、肝臓へのインスリンの直接投与の結果でなければならない。肝臓は、ふたつの方法でインスリンのボーラス投与に作用する。第一に、高インスリン血症に関連した解糖、グリコーゲン合成及び他の機序を促進する。第二に、初回通過代謝は、全身循環に達するインスリンレベルを減少する。この結果は、血液グルコースの急激な減少及び全身循環が曝されるインスリンレベルの減少である。末梢循環のインスリンへの曝露を低下する間に、皮下投薬に類似したグルコース制御が達成されるために、非-標的組織に対するインスリンの望ましくない作用を防止することができる。

グルコース代謝の主要部位を考慮せずに、VSMCは、グルコース調節能を有し、これにより投薬経路の変化に対する末梢反応の差異に関する洞察を得る。驚いたことに循環インスリンの劇的に低下したレベルにもかかわらず、グルコース調節に関連した重要な酵素のmRNAレベルの差がほとんどないことが観察された。実際、ヘキソキナーゼII及びグリコーゲンシンターゼについて認められたレベルは、経口組成物に対するより強力な反応を示唆している。本発明者らは、グルコースの自然の調節は、肝臓が制御する末梢グルコース代謝及びインスリン以外のメッセンジャーを通した利用が関与していると結論する。インスリンのより高い循環レベルは、この自然の過程の喪失を補償することができるという事実は、これらの単純に2種のタンパク質が同じ又は類似の受容体に結合するという事実が原因かもしれない。

IGFシステムは、このような二次的シグナル伝達の主要な候補であり、及びグルコース調節活性を示すことが分かっている。IGFBP-1及び-2は、データの両セットにおいてダウンレギュレーションされた。これは、血管損傷について公表されたデータに対して逆であり、及びグルコース制御において役割を果たすほどには血管損傷反応に関連していない。インスリン投薬経路の変化に対する肝臓の反応について先に報告されたデータは、IGF又はそれらの結合タンパク質のいずれかにおける示差的反応を明らかにしていない。IGFBPの分解に寄与するプロテアーゼに関するデータは利用可能でないので、これは、この経路を除外するものではない。肝臓は、IGFBPプロテアーゼの放出により、上昇したインスリンレベルに反応し、次にIGFBPの遊離の(freeing)IGFを分解し、グルコースの還元を起動することは、全く可能である。更なる試験が、これが真実(the case)であるかどうかを決定するために必要であるが、肝臓及び大動脈遺伝子のアレイデータはこの仮説を支持している。この仮説が正しいならば、これは自然のグルコース制御経路を模倣するその能力を単に基にしたインスリンの経口組成物の使用を支持している。

糖尿病に関連した多くの病態が存在し、ニューロパシー、ネフロパシー及び網膜症を含む。これらは、少なくともひとつには、インスリンの慢性投薬後の微小血管の破壊に起因することがある。経口投与されたインスリンはインスリンの比較的低い全身レベルによるより大きいグルコース抑制を達成することができるので、糖尿病関連疾患のより少ない発生が生じる。

遺伝子マイクロアレイを使用し、本発明者らは、本発明者らの経口組成物及び従来の皮下インスリンを受け取る動物における、損傷に対する血管反応の多くの領域をモニタリングすることができた。第一の工程は、担体単独の投与からの作用を評価することである。全身循環に進入時に、担体及びインスリンは、希釈作用のために最早相互作用しないと考えられている。更に何らかの反応を同定するための第二の3時間実験を追加することを含む、インスリンを伴わない担体を受け取る動物のアレイデータの網羅的分析を行った。この分析は、そのレベルが担体投与により影響されるように見えるmRNAを生じなかった。明確にするために、担体単独試料において認められた反応は、担体を伴わないインスリンを経口的に受け取る動物においても認められ、このことは、この作用は、偽投薬を説明するものではなく、実験パラメータに起因することを示唆している。このような試験は、各時点で複数の動物が必要であるので、本試験は、担体により調節された特定の遺伝子を同定するようにはデザインされていない。しかしながら、このデータは、担体は、血管系に対する最小作用を有するという観点を裏付けている。

損傷に対する血管反応は、長期間にわたり発生するプロセスの複雑なセットである。粥状斑の形成のような、これらの一部は、数年又は数十年かけて発生するが、再狭窄のようなより急激な例は、数ヶ月で発生する。従って、動物モデルにおける血管障害を試験する時間スケールは、数日又は数週間の桁であり、数時間ではない。この試験において、本発明者らは、インスリンの単回投与により誘導された血管損傷の何らかの徴候を同定し、及び投与経路変更がこれらのマーカーに及ぼす作用を記録することを目的とした。これは、血管損傷の標準モデルと比較して損傷の種類は軽度であり及び時間経過は非常に短いので、かなり楽観的な方法であったが、極めて驚くべきことにその結果は、進入の通常の経路を単に模倣していることに勝るインスリンの経口投薬は、血管損傷も減弱することを定性的に示している。

皮下インスリン投薬は、これらの重要な初期応答遺伝子のより高いレベルにつながるが、これらの遺伝子のただひとつのみが、経口投薬で有意な増加が認められたことが決定された。同様に、上昇したレベルのIL-6及びICAM-1は、皮下投与した動物においてのみ認められた。これらの遺伝子は、細胞増殖の初期徴候に加え、炎症反応の開始を表わしており、並びにそれらの発現は、血管壁劣化につながる事象のカスケードの引き金となることができる。皮下投薬も、より高いレベルの12-リポキシゲナーゼ、PAI-1、PAI-2及びヘムオキシゲナーゼ-1を生じた。この遺伝子の第二のセットは、血栓及び酸化されたLDLの形での更なる血管損傷形成に貢献することができる。これらの遺伝子の反復された発現は、アテローム性動脈硬化症及び血栓につながるであろう。インスリンの経口投薬は、皮下投薬で認められるものと有意差がないPAI-2上昇を除く全てのこれらの遺伝子の上昇を防ぐことが分かった。まとめると、このデータは、インスリン皮下投薬に勝るインスリン経口投薬の明らかな利点は、より少ない血管疾患の発生であることを示唆している。

皮下投与された動物のデータは、損傷に対する延長された血管反応の極初期段階での健康な大動脈像を表わしている。経口投与された動物のデータは、この反応の劇的減弱を明らかに示している。インスリン経口投与により、細胞増殖及び移動、炎症細胞動員、並びに粥状斑形成に関連した遺伝子レベルの上昇は、ほとんど全て避けられた。
この差異は、例え単にインスリン単回投与後であっても非常に明らかであることは注目すべきことである。大動脈においてmRNAレベルが明確な差に達する前に、反復投薬が必要であろうと最初に考えられた。このデータを鑑み、どのように慢性皮下投薬が、血管疾患及びそれらに随伴した臨床合併症の発生増加につながるのかを調べることは容易である。慢性皮下投薬における血管疾患発生の増加を支持する試験が、現在進行中である。更に、このデータは、循環インスリンレベルの低下にもかかわらず、末梢グルコース代謝は類似していることを示唆している。

本発明者らの結果は、インスリン送達がその循環への進入の通常の部位に戻ること、及びその結果としての末梢インスリンレベルの低下は、糖尿病に随伴した疾患の発生の低下を実現することができることを示している。本発明者らは本発明の多くの態様を説明しているが、本願明細書に示され及び説明されたこれらのものに加え、本発明の様々な修飾が、先の説明から当業者には明らかであろう。このような修飾は、添付された「特許請求の範囲」内であることが意図されている。

先の明細書において、本発明は、具体的に例示された態様及びそれらの実施例を参照し説明されている。しかし、別記「特許請求の範囲」に示された本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、それに様々な修飾及び変更を行うことができることは明白であろう。従って本願明細書及び図面は、限定的意味よりもむしろ例証と見なされるべきである。
本発明者らは、本願明細書において多くの態様を説明しているが、本発明者らの基本的構築は、本発明のプロセス及び組成物を利用する他の態様を提供するために変更することができることは明らかである。従って、本発明の範囲は、実施例として先に提示された具体的態様よりもむしろ、添付された「特許請求の範囲」により限定されることは理解されるであろう。

図1は、健常男性志願者への4-CNAB単独投与後の、4-CNABの平均(+SD)血漿濃度/時間プロファイルを示す。 図2は、健常男性志願者へのインスリン/4-CNABカプセル剤投与後の、4-CNABの平均(+SD)血漿濃度/時間プロファイルを示す。 図3A、3B及び3Cは、非低血糖症対象における、150単位/200mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/600mg、10単位SCインスリン及び経口プラセボ治療の投与後の、平均(+SD)血漿インスリン濃度/時間プロファイルを示す。 図4A及び4Bは、非低血糖症対象における、100単位/300mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/450mg、150単位/100mg、150単位USP経口インスリン及び経口プラセボ治療投与後の、平均(+SD)血漿インスリン濃度/時間プロファイルを示す。 図5は、4-CNAB単独、プラセボ及び150Uヒトインスリン単独の経口投薬後の、C-ペプチド濃度対時間を示す。 図6は、非低血糖症対象における、150単位/200mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/600mg、10単位SCインスリン及び経口プラセボ治療の投与後の、平均(+SD)血漿C-ペプチド濃度/時間プロファイルを示す。 図7は、4-CNAB存在下でのインスリン皮下投与及び経口投与後の、C-ペプチド％低下対時間を示す。 図8は、非低血糖症対象における、100単位/300mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/450mg、150単位/100mg、150単位USPインスリン及び経口プラセボ治療プロファイルの投与後の、平均(+SD)血漿C-ペプチド濃度/時間プロファイルを示す。 図9A及び9Bは、非低血糖症対象における、150単位/200mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/600mg、10単位SCインスリン及び経口プラセボ治療の投与後の、平均(+SD)グルコース濃度/時間プロファイルを示す。 図10A及び10Bは、非低血糖症対象における、100単位/300mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/450mg、150単位/100mg、150単位USP経口インスリン及び経口プラセボ治療の投与後の、平均(+SD)グルコース濃度/時間プロファイルを示す。 図11A、11B及び11Cは、非低血糖症対象における、150単位/200mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/600mg、10単位SCインスリン及び経口プラセボ治療の投与後の、ベースラインからのグルコース濃度変化の割合(％)の平均(+SD)/時間プロファイルを示す。 図12は、非低血糖症対象における、100単位/300mg(インスリン/4-CNAB)、100単位/450mg、150単位/100mg、150単位USP経口インスリン及び経口プラセボ治療の投与後の、ベースラインからのグルコース濃度変化の割合(％)の平均(+SD)/時間プロファイルを示す。 図13は、300U経口インスリン/400mg 4-CNAB、150U経口インスリン/200mg 4-CNAB及び15SCインスリンを用いる治療に関する、平均血漿インスリン濃度(ベースライン補正した)の時間プロットを示す。 図14は、経口的及び皮下的に送達されたインスリンに関する、C-ペプチド測定値を示す。 図15は、経口的及び皮下的に送達されたインスリンに関する、グルコース注入速度の時間プロットを示す。 図16は、全ての対象に関する食後血液グルコース可動域の相加平均のプロットを示す。 図17は、4-CNAB血漿濃度(ng/mL)対時間(相加平均)のプロットを示す。 図18は、インスリン血漿濃度(pmol/l)対時間(相加平均)のプロットを示す。 図19は、C-ペプチド血漿濃度(nmol/l)対時間(相加平均)のプロットを示す。 図20は、3種の治療群(絶食、投与後30又は20分に朝食)に関する、4-CNAB/インスリン単回経口投与後の、4-CNAB血漿濃度の平均濃度/時間プロファイルを示す。 図21は、3種の治療群(絶食、投与後30又は20分に朝食)に関する、4-CNAB/インスリン単回経口投与後の、血漿グルコース濃度の平均濃度/時間プロファイルを示す。 図22は、段階様式のインスリン(3名の患者は200Uインスリンを受取り、5名の患者は300Uインスリンを受取り、及び4名の患者は400Uインスリンを受け取った)及び固定用量300mgの4-CNABの混合物を含有するカプセル剤1錠を与えられた患者の、血漿グルコース対時間を示す。 図23は、300U又は400Uインスリン及び300mgの4-CNABを含有したカプセル剤が投与された患者に関する、血漿グルコース対時間を示す。 図24は、インスリンの経口及び皮下投与後の、期間180分にわたる血液グルコースレベルの比較を示す(平均±SE)。 図25は、単回経口及び皮下投与後の、期間180分にわたる血清インスリンレベルを示す(平均±SE)。 図26は、偽投薬と比較した、グルコキナーゼ及びG6Pase mRNAの発現を示している。 図27は、偽投薬と比較した、Fru-1,6-P及び6-ホスホフルクト-2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビスホスファターゼのmRNA発現を示す。 図28は、偽投薬と比較した、PEPCK mRNA発現を示す。 図29は、偽投薬と比較した、グリコーゲンシンターゼmRNA発現を示す。 図30A及び30Bは、偽投薬と比較した、初期応答遺伝子mRNA発現を示す。 図31は、偽投薬と比較した、インスリン-様増殖因子結合タンパク質mRNA発現を示す。 図32は、偽投薬と比較した、細胞内接着分子-1のmRNA発現を示す。 図33A及び33Bは、偽投薬と比較した、サイトカインmRNA発現を示す。 図34は、偽投薬と比較した、脂質過酸化酵素mRNA発現を示す。 図35は、偽投薬と比較した、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターmRNA発現を示す。 図36は、偽投薬と比較した、NPY、TGF-β、ICAM-1及び12-LOのmRNA発現を示す。 図37は、偽投薬と比較した、THY-1、VEGF-B及びインテグリンaE2のmRNA発現を示す。 図38は、ストレプトゾシン糖尿病モデルにおける、インスリンの単回経口及び皮下投与後の、期間180分にわたる血液グルコースレベル(平均±SE)の比較を示す。 図39は、ストレプトゾシン糖尿病モデルにおける、インスリンの単回経口及び皮下投与後の、期間180分にわたる血清インスリンレベルを示す。

Claims (56)

1. ヒト糖尿病患者における血液グルコース濃度のそれらの患者における皮下インスリン注射と比べ同等の低下を達成する未修飾インスリン用量を含有すると同時に、皮下注射により得た末梢血インスリン濃度と比べ、急性、亜急性又は慢性の状態下で、末梢血循環中でのより低いインスリン濃度を提供する、経口固形剤形。
2. 少なくとも約20％のインスリンの低下を提供する、請求項１載の経口固形剤形。
3. ヒト糖尿病患者への経口投与後の、血液グルコースの治療に有効な低下を達成する未修飾インスリン用量を含有し、及び門脈インスリン濃度の末梢血に対する比約2.5:1から約6:1を提供する、経口剤形。
4. 前記剤形が固形である、請求項３記載の経口剤形。
5. ヒト糖尿病患者への経口投与後に血液グルコースの治療に有効な低下を達成する未修飾インスリン用量を含有する、経口剤形であり、この経口固形剤形が、該患者への経口投与後約0.25〜約1.5時間の時点でインスリンt_maxを提供し、少なくとも約80％の血液グルコース濃度の低下が、該剤形の経口投与後約２時間以内に生じる該インスリン用量により引き起こされる、経口剤形。
6. 治療有効量の未修飾インスリンを含有する経口剤形であり、該剤形が、ヒト糖尿病患者への食前の経口投与時に、該患者における平均ベースライン(絶食時)血漿グルコース濃度と比べ、経口投与後の最初の１時間に低下される該患者における平均血漿グルコース濃度を生じる、経口剤形。
7. 治療有効量の未修飾インスリンを含有する経口剤形であり、該経口剤形が、食前経口投与時に、該患者における平均ベースライン(絶食時)血漿グルコース濃度に対し、経口投与後最初の１時間について、約40％を超えて変動しない平均血漿グルコース濃度を提供し、ここで食事は、該剤形の経口投与の約30分以内に該患者により摂取される、経口剤形。
8. 経口投与後最初の１時間について、約30％を超えて変動しない平均血漿グルコース濃度を提供する、請求項７記載の経口剤形。
9. ヒト糖尿病患者への経口投与後約0.25〜約1.5時間の時点でインスリンt_maxに到達し、並びに患者におけるベースライン(絶食時)血漿グルコース濃度からの経口投与後最初の１時間について約40％を超えて変動しない血漿グルコース濃度を提供することにより明示されるような、患者への食前投与時に、固形食に反応した血液グルコース濃度の効果的管理を提供し、及び経口投与後４時間までに患者にベースライン血液インスリンレベルへの回復を提供する、インスリン用量を含有する、経口固形剤形。
10. インスリンが、ヒトの標準インスリン型である、請求項９記載の経口剤形。
11. 経口剤形が固形である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の経口剤形。
12. 経口剤形が、錠剤又はカプセル剤の形状である、請求項１１記載の経口剤形。
13. 前記剤形に含まれた未修飾インスリン用量が、約50単位〜約600単位(約2〜約23mg)である、請求項１１記載の経口固形剤形。
14. 未修飾インスリン用量が、約100単位(3.8mg)〜約400単位(15.3mg)のインスリンである、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
15. 未修飾インスリン用量が、約150単位(5.75mg)〜約300単位(11.5mg)である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の経口固形剤形。
16. 経口投与後約0.1〜約1.5時間でインスリンのt_maxを提供する、請求項１〜８記載の経口固形剤形。
17. 経口投与後約0.25〜約0.5時間でインスリンのt_maxを提供する、請求項１〜１６のいずれか１項記載の経口固形剤形。
18. 前記剤形が、門脈循環(胃粘膜を通じた吸収)へのインスリン送達を開始し、約30分又はそれ未満以内にピークレベルに到達する、請求項１〜１７のいずれか１項記載の経口固形剤形。
19. 更に、有効量の下記式の送達物質又はそれらの医薬として許容できる塩を含有する、請求項１〜１８のいずれか１項記載の経口固形剤形：
    

    

    (式中、
    Xは、水素又はハロゲンであり；
    Rは、置換又は未置換のC₁-C₃アルキレン、置換又は未置換のC₁-C₃アルケニレン、置換又は未置換のC₁-C₃アルキル(アリーレン)、置換又は未置換のC₁-C₃アリール(アルキレン)である。)。
20. Xがハロゲンである、請求項１９記載の経口固形剤形。
21. 前記ハロゲンが塩素である、請求項２０記載の経口固形剤形医薬組成物。
22. RがC₃アルキレンである、請求項１９記載の経口固形剤形。
23. 前記ピーク血漿送達物質濃度が、経口投与の2時間以内に生じる、請求項１９記載の経口固形剤形。
24. 前記送達物質が、4-[(4-クロロ,2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]酪酸である、請求項１９記載の経口固形剤形。
25. 経口投与後約0.3〜約1.5時間以内に、ピーク血漿送達物質濃度約5,000〜約15,000ng/mlを提供する、請求項１９記載の経口固形剤形。
26. 経口投与後約20〜60分に、治療された患者において血液グルコースの最大減少を生じる、請求項１９記載の経口固形剤形。
27. 経口投与後約40分で、治療された患者において血液グルコースの最大減少を生じる、請求項１９記載の経口固形剤形。
28. 前記組成物が、経口投与後約80〜120分に、治療された患者においてCペプチド濃度の最大減少を生じる、請求項１〜２７のいずれか１項記載の経口固形剤形。
29. ヒト患者において、経口投与後１時間以内に少なくとも10％低下した血清グルコースを生じる、請求項１〜２８のいずれか１項記載の経口固形剤形。
30. 請求項１〜２９のいずれか1項記載の経口剤形をヒト患者に慢性ベースで投与することを含む、耐糖能障害の治療、グルコースホメオスタシスの達成、初期糖尿病の治療、又は後期糖尿病の治療の方法。
31. 未修飾インスリンの治療に有効な経口投与可能な単位用量を提供する方法であり、未修飾インスリン約２〜約23mgを、該インスリンのヒト糖尿病患者の胃腸管からの吸収を促進する医薬として許容できる送達物質約100〜約600mgと併用すること、並びに該単位用量をヒト糖尿病患者に経口投与し、治療効果を提供することを含む、方法。
32. ヒト糖尿病患者を治療する方法であり、ヒト糖尿病患者へ食前に有効量のインスリンを含有する経口剤形を経口投与し、その結果経口投与後約0.25〜約1.5時間の時点でインスリンt_maxが得られ、及び患者の血液グルコース濃度が、患者におけるベースライン(絶食時)血漿グルコース濃度から経口投与後最初の１時間について約40％を超えて変動しない血漿グルコース濃度を提供することにより明示されるように、食事に反応して効果的に管理され、並びにこれが経口投与後４時間までに患者のベースライン血液インスリンレベルへの回復を提供する工程を含む、方法。
33. 前記経口剤形に含有されたインスリンが、ヒト標準インスリン型である、請求項３記載の方法。
34. 糖尿病を治療する方法であり、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血漿インスリン濃度に比べ低下されている血液グルコース及びピーク血漿インスリン濃度の治療に有効な低下を提供するために、糖尿病患者に、未修飾インスリン用量を、胃腸管からのインスリンの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を慢性ベースで経口投与する工程を含む、方法。
35. 慢性インスリン投与に関連した病態の発生を低下する、請求項３５記載の方法。
36. 糖尿病を治療し並びにインスリン慢性投与に関連した高インスリン血症の発生及び重症度を低下する方法であり、糖尿病患者に、インスリン用量及びこのインスリン用量の胃腸管からの吸収を促進する送達物質を慢性ベースで経口投与し、治療に有効な管理及び／又は血液グルコース濃度の低下、並びにヒト糖尿病患者集団の血液グルコース濃度の同等の管理及び／又は低下を達成するのに有効な量のインスリン皮下注射により提供された平均全身血液インスリン濃度と比べて低下された糖尿病患者の平均全身血液インスリン濃度を提供する工程を含む、方法。
37. インスリンの慢性投与に関連した１種又は複数の病態の発生及び／又は重症度を低下する方法であり、インスリン及びこのインスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質を含有する医薬組成物の治療有効量による慢性ベースの経口投与により糖尿病患者を治療し、その結果この医薬組成物は、インスリン皮下注射により達成された血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べ低下されている、糖尿病患者の血液グルコース及びピーク血清インスリン濃度の治療に有効な低下を提供する工程を含む、方法。
38. 前記方法が、インスリン皮下注射により患者集団において達成された血液グルコース濃度の同等の低下から生じる血管疾患に関連した遺伝子発現のレベルと比べて、血管疾患に関連した遺伝子の低下した発現を提供する、請求項３４〜３７記載の方法。
39. 血管疾患に関連した遺伝子が、初期応答遺伝子、サイトカイン関連遺伝子、接着分子関連遺伝子、脂質過酸化関連遺伝子、血栓関連遺伝子及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３８記載の方法。
40. 初期応答遺伝子が、c-myc、jun B、Egr-1、Ets-1及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３９記載の方法。
41. 前記方法から生じるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター濃度が、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下から生じるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター濃度と比較して、より低い、請求項３４〜３７記載の方法。
42. 前記方法から生じる前炎症性サイトカイン濃度が、インスリン皮下注射により達成される血液グルコース濃度の同等の治療に有効な低下から生じる前炎症性サイトカイン濃度と比較して、より低い、請求項３４〜３７記載の方法。
43. 病態が、心臓血管疾患である、請求項３４〜３７記載の方法。
44. 病態が、ニューロパシー、ネフロパシー、網膜症、動脈症、アテローム性動脈硬化症及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３４〜３７記載の方法。
45. 病態が、冠動脈疾患、高血圧性心筋症、及びうっ血性心不全からなる群より選択される、請求項３４〜３７記載の方法。
46. 送達物質が、下記式を有する化合物：
    

    

    又はそれらの医薬として許容できる塩である、請求項３４〜３７記載の方法：
    (式中
    Xは、水素又はハロゲンであり；
    Rは、置換又は未置換のC₁-C₁₂アルキレン、置換又は未置換のC₁-C₁₂アルケニレンである。)。
47. 送達物質が、4-[(4-クロロ,2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ酪酸又はそれらの誘導体もしくはアナログである、請求項４８記載の方法。
48. インスリンが、組換えヒトインスリン、ウシインスリン、ブタインスリン及びそれらの機能的同等物からなる群より選択される、請求項３４〜３７記載の方法。
49. 糖尿病の治療並びにインスリン慢性投与に関連した高インスリン血症の発生及び／又は重症度を低下する方法であり、インスリン用量及びこのインスリン用量の胃腸管からの吸収を促進する送達物質を糖尿病患者へ慢性ベースで経口投与し、インスリン皮下注射により達成された血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べて低下されている糖尿病患者における血液グルコース及びピーク血清インスリン濃度の治療に有効な低下を提供する工程を含む、方法。
50. 薬物の投与経路に関連した血管損傷のための薬物のスクリーニング法であり：
    第一の被験動物に非経口的に薬物を投与する工程；
    第二の被験動物へ経口的に薬物を投与する工程、及び
    第一及び第二の被験動物についてc-myc、c-fos、Jun B、Erg-1及びそれらの組合せからなる群より選択される初期応答遺伝子の発現を比較する工程を含み、ここで１種又は複数の初期応答遺伝子の発現の増加は血管損傷の指標である、方法。
51. 発現の変化を測定する工程が、遺伝子チップ解析を含む、請求項５２記載の方法。
52. 発現の変化を測定する工程が、mRNA発現の変化を測定することを含む、請求項５２記載の方法。
53. 糖尿病への慢性インスリン投与に関連した病態又は血管疾患の発生、重症度、又は発生及び重症度を低下する方法であり、糖尿病患者へ慢性ベースでインスリン用量を該インスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者における血液グルコースレベルを所望の量低下し、その結果インスリン治療の結果としての該糖尿病患者の血液中を循環するインスリン濃度が、インスリン皮下注射により達成された血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べ低下される、方法。
54. 糖尿病患者の血管系の高インスリン血症状態への曝露を低下する方法であり、糖尿病患者へ慢性ベースでインスリン用量を該インスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者の血液グルコースレベルを所望の量低下し、その結果インスリン治療の結果としての該糖尿病患者の血液中を循環するインスリン濃度が、インスリン皮下注射により達成された血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べ低下される、方法。
55. インスリン治療時のmRNAの増加に反応した複数の領域における穏やかな損傷刺激に対する反応から生じたプロセスを減弱する方法であり、糖尿病患者へ慢性ベースでインスリン用量を該インスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者の血液グルコースレベルを所望の量低下し、その結果インスリン治療の結果としての該糖尿病患者の血液中を循環するインスリン濃度が、インスリン皮下注射により達成された血液グルコース濃度と同等の治療に有効な低下のピーク血清インスリン濃度と比べ低下される、方法。
56. 糖尿病患者を治療する方法であり、糖尿病患者へ慢性ベースでインスリン用量を該インスリンの胃腸管からの吸収を促進する送達物質と共に含有する経口インスリン治療物を経口投与し、該糖尿病患者の血液グルコースレベルを所望の量低下し、その結果インスリン治療の結果としての該糖尿病患者の血液中を循環するインスリン濃度が、正常な生理的レベルよりも実質的に高くない、方法。

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