JP2005512534A5 - - Google Patents

Claims (35)

1. β−グルコシダーゼ活性を有する酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含む、真菌源由来の単離ポリヌクレオチド。
2. 以下からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド：
   （ａ）図２（配列番号２）で表すアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するＢＧＬ５ポリペプチドをエンコードする核酸配列または相補的な核酸配列；
   （ｂ）図２（配列番号２）で表すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するＢＧＬ５ポリペプチドをエンコードする核酸配列または相補的な核酸配列；
   （ｃ）図２で表すアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＢＧＬ５ポリペプチドをエンコードする核酸配列または相補的な核酸配列；
   （ｄ）図２で表すアミノ酸配列を有するＢＧＬ５ポリペプチドをエンコードする核酸配列または相補的な核酸配列；
   （ｅ）配列番号２として表すアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＢＧＬ５ポリペプチドをエンコードする核酸配列または相補的な核酸配列；
   （ｆ）配列番号２として表すアミノ酸配列を有するＢＧＬ５ポリペプチドをエンコードする核酸配列または相補的な核酸配列；
   （ｇ）配列番号３として表す核酸配列またはその相補的配列；及び
   （ｈ）高ストリンジェンシーな条件下で配列番号３として表す配列にハイブリダイズする核酸配列またはその相補的または断片配列であり、前記単離ポリヌクレオチドがβ−グルコシダーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをエンコードするもの。
3. １０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の延長ギャップペナルティ及びＢＬＯＳＵＭ３０類似マトリックスの初期値パラメーターを用いて操作するＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用して同一性％を計算する、請求項２の単離ポリヌクレオチド。
4. ５０％ホルムアミド、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でハイブリダイゼーションを行い、続いて室温で２Ｘ ＳＳＰＥ及び０．５％ ＳＤＳ中で２回洗浄し及び４２℃で０．１Ｘ ＳＳＰＥ及び０．５％ＳＤＳ中でさらに２回洗浄した、請求項２の単離ポリヌクレオチド。
5. 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である、請求項２の単離ポリヌクレオチド。
6. β−グルコシダーゼ活性を有する酵素をエンコードし、該酵素がトリコデルマ源由来である単離ポリヌクレオチド。
7. 酵素がトリコデルマｒｅｅｓｅｉ由来である、請求項６の単離ポリヌクレオチド。
8. 以下のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む発現構築体；（ｉ）図２（配列番号２）に表すアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、または（ｉｉ）図２に記載のヌクレオチド配列由来のプローブに中から高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズできる配列、または（ｉｉｉ）図２（配列番号２）に表すアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的な配列。
9. 請求項８の発現構築体を含むベクター。
10. 請求項２の単離ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に連結するベクター。
11. 請求項９のベクターにより形質転換された宿主細胞。
12. 請求項１０のベクターにより形質転換された宿主細胞。
13. 宿主細胞が原核細胞である、請求項１２の宿主細胞。
14. 宿主細胞が真核細胞である、請求項１２の宿主細胞。
15. 請求項２のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
16. 組換え宿主細胞が原核細胞である、請求項１５の組換え宿主細胞。
17. 組換え宿主細胞が真核細胞である、請求項１５の組換え宿主細胞。
18. 以下からなる群より選択される配列を含む、β−グルコシダーゼの生物学的活性を有する精製ＢＧＬ５ポリペプチド：
    （ａ）図２（配列番号２）に表すアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｂ）図２（配列番号２）に表すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｃ）図２に表すアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｄ）図２に表すアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号２として表すアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号２として表すアミノ酸配列；
    （ｇ）配列番号２として表すアミノ酸配列の精製された生物学的活性断片。
19. β−グルコシダーゼ活性を有する酵素を生成する方法であって、以下を含む：
    （ａ）請求項２で定義するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて宿主細胞を安定に形質転換する工程；
    （ｂ）前記形質転換宿主細胞を該宿主細胞に適切な条件下で培養し、前記β−グルコシダーゼを生成する工程；及び
    （ｃ）前記β−グルコシダーゼを再生する工程。
20. 宿主細胞が糸状菌または酵母菌細胞である、請求項１９の方法。
21. 請求項１９の方法により調製されるβ−グルコシダーゼ活性を有する精製酵素。
22. 遺伝子を不活化させ、ＢＧＬ５ポリペプチド生成を防ぐ欠失または挿入またはその他の変異をｂｇｌ５遺伝子内に含む組換え宿主細胞。
23. 配列番号２として表す配列を有するＢＧＬ５ポリペプチドをエンコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、β−グルコシダーゼ生成宿主細胞にさらすと、前記宿主細胞によるβ−グルコシダーゼ生成を減少または抑制する前記オリゴヌクレオチド。
24. 宿主細胞が糸状菌である、請求項２３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
25. 以下からなる群より選択されるポリペプチドを含む洗剤組成物：
    （ａ）図２（配列番号２）に表すアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｂ）図２（配列番号２）に表すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｃ）図２に表すアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｄ）図２に表すアミノ酸配列；
    （ｅ）配列番号２として表すアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｆ）配列番号２として表すアミノ酸配列；
    （ｇ）配列番号２として表すアミノ酸配列の精製された生物学的活性断片。
26. アルペルギルス種内でβ−グルコシダーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現する方法であって、以下を含む：
    （ａ）異種β−グルコシダーゼをエンコードするポリヌクレオチドに結合し、それによりキメラポリペプチドをエンコードする、シグナル配列をエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する宿主アスペルギルスを提供する工程；
    （ｂ）前記キメラポリペプチドが生成される前記アスペルギルスに適切な条件下で、宿主アスペルギルスを培養し、前記キメラポリペプチドを生成する工程。
27. エタノールを生成する方法であって、前記方法は以下の工程を含む：
    （ａ）バイオマス組成物をβ−グルコシダーゼ４を含む酵素組成物と接触させ、砂糖水を得る工程；
    （ｂ）砂糖水に発酵生物を加える工程；及び
    （ｃ）エタノールを生成するのに十分な条件下で発酵生物を培養する工程、及びバイオマス組成物は任意で前処理する。
28. さらに、工程（ａ）が少なくとも１のエンドグルカナーゼを追加する工程を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 工程（ａ）がさらに少なくとも１のセロビオヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）を追加する工程を含む、請求項２７に記載の方法。
30. 工程（ａ）がさらに少なくとも１のセロビオヒドロラーゼを追加する工程を含む、請求項２８に記載の方法。
31. エタノールを生成する方法であって、前記方法は以下の工程を含む：
    （ａ）バイオマス組成物をβ−グルコシダーゼ４を含む酵素組成物及び発酵生物と接触させる工程；及び
    （ｂ）エタノールを生成するのに十分な条件下で発酵生物を培養する工程、及びバイオマス組成物は任意で前処理する。
32. さらに、工程（ａ）が少なくとも１のエンドグルカナーゼを追加する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 工程（ａ）がさらに少なくとも１のセロビオヒドロラーゼを追加する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
34. 工程（ａ）がさらに少なくとも１のセロビオヒドロラーゼを追加する工程を含む、請求項３２に記載の方法。
35. 前処理は希酸を用いる、請求項２７または３１に記載の方法。