JP2005274493A - レーザ走査型観察装置およびピンホール部材 - Google Patents

Abstract

【課題】 レーザ光源から発せられたパルス幅の短い極短パルスレーザを試料に照射しながら、試料から得られる蛍光量の損失を低減して明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、測定ヘッドをコンパクトに構成する。
【解決手段】 極短パルスレーザ光を発するレーザ光源４と、試料Ａからの戻り光を検出する撮像手段５とを備える光学ユニット６と、レーザ光源４からの極短パルスレーザ光を試料Ａ上に走査させる光走査部１０と、該光走査部１０により走査された極短パルスレーザ光を試料Ａ上に結像させる対物光学系２とを備える測定ヘッド３と、これら光学ユニット６と測定ヘッド３とを接続するマルチモードファイバ７と、測定ヘッド３に備えられ、可視光を透過させかつレーザ光を遮断する材質からなるピンホール手段１８とを備えるレーザ走査型観察装置１を提供する。
【選択図】 図１

Description

この発明は、レーザ走査型観察装置およびピンホール部材に関するものである。

従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の表面下の比較的深い位置から発せられる蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の測定装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この多光子励起型の測定装置においては、試料から発せられる蛍光を、シングルモードファイバにより接続された外部の光電子増倍管によって検出するように構成されている。
特開２００２−２４３６４１号公報（第３頁等）

しかしながら、シングルモードファイバは、コア径が細く、試料から戻る蛍光を制限してしまうため、効率よく測定することができないという不都合がある。蛍光を効率よく測定する目的からすれば、光電子増倍管は、測定ヘッドの対物レンズ直後に配置することが好ましいが、光電子増倍管はその大きさが比較的大きいために測定ヘッドが大型化してしまい、試料の観察対象部位に合わせて種々の姿勢や位置に配置する用途、例えば、実験小動物等を生きたまま(in vivo)観察する場合等には適していない。

一方、コア径が太く試料からの蛍光を制限しない光ファイバとして、マルチモードファイバを使用することが考えられるが、マルチモードファイバは、多数の伝送モードで光を伝播するため、レーザ光源から極短パルスレーザを入射させた場合、多モード分散を生じてパルス幅が長くなってしまい、そのまま使用したのでは、効率的に多光子励起効果を発生することができない不都合がある。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光源から発せられたパルス幅の短い極短パルスレーザを試料に照射しながら、試料から得られる蛍光量の損失を低減して明るい蛍光画像を得ることができ、かつ、測定ヘッドをコンパクトに構成することができるレーザ走査観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を発するレーザ光源と、試料からの戻り光を検出する撮像手段とを備える光学ユニットと、レーザ光源からの極短パルスレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査された極短パルスレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、これら光学ユニットと測定ヘッドとを接続するマルチモードファイバと、前記測定ヘッドに備えられ、可視光を透過させかつ極短パルスレーザ光を遮断する材質からなるピンホール手段とを備えるレーザ走査型観察装置を提供する。

本発明によれば、レーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光は、マルチモードファイバ内を伝播して測定ヘッドに入り、測定ヘッド内においてピンホール手段を透過させられる。ピンホール手段は極短パルスレーザ光を遮断する材質からなるので、マルチモードファイバを通過してきた極短パルスレーザ光の内、ファイバコアの中心付近の光のみがピンホール手段を通過させられる。

マルチモードファイバのファイバコアの中心付近においては、最低次モードの極短パルスレーザ光のみが出射されているため、ピンホール手段においては最低次モードの極短パルスレーザ光のみが通過させられることになる。その結果、マルチモードファイバ内における多モード分散の影響を受けることなく、比較的位相の揃った最低次モードの光を対物光学系から試料に向けて照射することができ、試料において多光子励起現象を効率よく発生させることができる。

また、試料において発生した蛍光は対物光学系を介してピンホール手段に入射される。ピンホール手段は、可視光を透過させる材質からなるので、蛍光はピンホール手段によって遮られることなく通過してマルチモードファイバ内を伝播し、光学ユニット内の撮像手段により撮像されることになる。この場合において、蛍光がピンホール手段によって遮られず、かつ、コア径の大きなマルチモードファイバによって伝播されるので、試料において発生した蛍光が無駄なく撮像手段によって撮像され、明るい蛍光画像を得ることができる。すなわち、測定ヘッドにマルチモードファイバを介して接続された光学ユニットに撮像手段を設置しても、画質をさほど劣化させることなく鮮明な蛍光画像を得ることができるので、測定ヘッドを十分に小さくすることが可能となり、実験小動物等の試料を生きたまま観察するのに適したレーザ走査型観察装置を提供することが可能となる。

上記発明においては、前記ピンホール手段が、ガラス板の表面にコーティングを施してなるピンホール部材により構成されていることが好ましい。
このように構成することで、マルチモードファイバにより伝播されてきた多モード分散を付与された極短パルスレーザ光から最低次モードの極短パルスレーザ光のみを抽出して試料に照射し、試料から得られた蛍光を遮ることなくマルチモードファイバで撮像手段まで導くことを可能にするピンホール手段を簡易に構成することができる。この場合のピンホールは比較的大きくて済み、製造も容易である。

また、上記発明においては、前記ピンホール手段が、前記マルチモードファイバの端面に施されたコーティングにより形成されていることとしてもよい。
このように構成することで、部品点数を増加させることなく上記作用を達成することが可能となる。

さらに、上記発明においては、前記光学ユニットに設けられ、レーザ光を発する第２のレーザ光源と、前記測定ヘッドに設けられ、レーザ光および可視光を遮断する材質からなる共焦点ピンホール部材と、前記ピンホール部材と前記共焦点ピンホール部材とを選択的に交換する交換機構とを備えることが好ましい。
交換機構を作動させピンホール部材から共焦点ピンホール部材に変更するとともに、レーザ光源から発せられたレーザ光を試料に入射させることで、共焦点観察を行うことが可能となる。この場合に、ピンホール部材と極短パルスレーザ光とを用いて行う多光子励起観察と、共焦点観察とを同一のマルチモードファイバおよび撮像手段を用いて行うことが可能となり、レーザ走査型観察装置を簡易かつコンパクトに構成することができる。

また、口径の異なる複数種類の共焦点ピンホールを備えることとしてもよい。この場合には、共焦点ピンホールの口径を大きくすることで、蛍光画像の解像度を低下させる一方、検出される蛍光量を増大させて明るい蛍光画像を得ることができる。

さらに、上記発明においては、前記共焦点ピンホール部材より口径の大きな空穴部材を備え、前記交換機構が該空穴部材をも選択的に交換することとしてもよい。
このようにすることで、試料に照射する光量を制限せず、試料からの戻り光も制限することがないので、例えば、試料の表面に対するピント合わせを行う際に、明るい鮮明な画像を得ることができ有利である。

また、本発明は、可視光を透過させかつレーザ光を遮断する材質からなるピンホール部材を提供する。
本発明によれば、多数の伝送モードのレーザ光の内から最低次モードのレーザ光のみを一方向に透過させる一方、多方向から入射される蛍光等の可視光を遮断することなく通過させることができる。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたパルス幅の短い極短パルスレーザを試料に照射して、効率的に多光子励起効果を発生させることができるとともに、試料から得られる蛍光量の損失を低減して明るい蛍光画像を得ることができ、しかも、測定ヘッドをコンパクトに構成することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ走査型観察装置１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１は、多光子励起型観察装置であって、図１に示されるように、実験小動物を始めとする試料Ａに対向配置される対物レンズ２を備える測定ヘッド３と、例えば、パルス幅が１００ｆｓｅｃ（フェムト秒）程度、波長９７６ｎｍ程度の近赤外極短パルスレーザ光を発生するレーザ光源４と蛍光観察用の光検出器５とを備える装置本体６と、これら装置本体６と測定ヘッド３とを接続するマルチモードファイバ７とを備えている。

前記測定ヘッド３には、集光レンズ８と、コリメートレンズ９と、レーザ走査部１０と、瞳投影レンズ１１と、結像レンズ１２とが設けられている。
集光レンズ８は、マルチモードファイバ７内を伝播してきた極短パルスレーザ光を第１中間像Ｂ位置に結像させるようになっている。
コリメートレンズ９は、集光レンズ８により第１の中間像を形成した極短パルスレーザ光を平行光に変換するようになっている。

レーザ走査部１０は、例えば、互いに直交する２軸回りにそれぞれ回転可能に設けられた２枚のガルバノミラー（図示略）を備えており、レーザ光源４から伝播されてきた極短パルスレーザ光の偏向方向を変更して、試料Ａにおいて２次元方向に走査するようになっている。また、瞳投影レンズ１１は、レーザ走査部１０により２次元方向に走査された極短パルスレーザ光を第２中間像Ｃ位置に結像させるようになっている。結像レンズ１２は、第２中間像Ｃを結像した極短パルスレーザ光を集光して対物レンズ２に入射させるようになっている。

これらを収容する測定ヘッド３は、ベース１３から上方に延びる支柱１４に上下方向に移動可能に取り付けられるとともに、微調整機構１５により上下動可能なアーム１６の先端に固定されている。図中、符号１７は、試料Ａを載置するステージであり、水平２方向および鉛直軸線回りの回転を許容するようになっている。

本実施形態においては、測定ヘッド３の前記集光レンズ８とコリメートレンズ９との間の第１中間像Ｂ位置に、フィルタ部材１８が配置されている。このフィルタ部材１８は、例えば、図２に示されるように、ガラス板１８ａの一表面に、その中央の一点を除いてコーティング１８ｂを施すことにより構成されたピンホール１８ｃを備えている。コーティング１８ｂは、可視光を透過させかつ極短パルスレーザ光を遮断する材質、例えば、誘電体多層膜により構成されている。ピンホール１８ｃは前記第１中間像Ｂ位置に略一致する位置に配置されている。

すなわち、集光レンズ８により集光された極短パルスレーザ光の内、中心部近傍の光のみがピンホール１８ｃを通過してコリメートレンズ９を介してレーザ走査部１０に達することができる一方、レーザ走査部１０側から戻ってきた戻り光は、フィルタ部材１８により遮られることなく通過して集光レンズ８に入射されるようになっている。

装置本体６には、マルチモードファイバ７内を戻ってきた戻り光を平行光に変換するコリメートレンズ１９と、平行光に変換された戻り光から蛍光を分岐するダイクロイックミラー２０と、励起光を遮断するバリアフィルタ２１とが備えられている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１によれば、レーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光は、ダイクロイックミラー２０を透過してコリメートレンズ１９によりマルチモードファイバ７の端面に入射させられる。そして、マルチモードファイバ７内を伝播して測定ヘッド３内に入り、集光レンズ８によって集光されてフィルタ部材１８のピンホール１８ｃ近傍にマルチモードファイバ７の出射端と同じ中間像を結像する。

この場合において、本実施形態によれば、フィルタ部材には中央にピンホールが形成され、その周囲は、コーティングによって極短パルスレーザ光の通過が遮断されているので、極短パルスレーザ光は、その中央部のみがフィルタ部材１８の通過を許容されてレーザ走査部１０に入射させられることになる。

マルチモードファイバ７を通過させられる極短パルスレーザ光は、種々の伝送モードで伝播される。その伝送モードを模式的に示すと、図３の通りである。この図３は、マルチモードファイバ７の出射端における極短パルスレーザ光の光強度分布を示している。図中の斜線部は、光強度がゼロとなる領域である。すなわち、図３（ａ）に示されるように、最低次の伝送モード（すなわち、ＬＰ_０１モード）の極短パルスレーザ光が伝播される場合は、コア内では、光強度分布がゼロになる領域はない、一方、他の伝送モード（ＬＰ_ｎｍモード、但し、ｎ≧１、ｍ≧１）（ｂ）、（ｃ）ではいずれもコアの中心近傍に光強度がゼロになる領域が存在する。

したがって、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１のように、マルチモードファイバ７の端面７ａの像を結像する集光レンズ８の第１中間像Ｂ位置にフィルタ部材１８を配置しておくことにより、マルチモードファイバ７内を伝播されてきた種々の伝送モードの極短パルスレーザ光の内、最低次モードの極短パルスレーザ光のみを選択的に通過させ、他の伝送モードの光の通過を阻止することができる。そして、コリメートレンズ９によって平行光に変換され、レーザ走査部１０により偏向方向を変更させられた極短パルスレーザ光は、瞳投影レンズ１１、結像レンズ１２および対物レンズ２を経て、試料Ａに照射される。

これにより、シングルモードファイバにより伝播されてきた場合と同様に、極短パルレーザ光のパルス幅が伸びることを防止することができる。したがって、レーザ光源４から発せられた元々の短いパルス幅の極短パルスレーザ光を試料Ａに照射することができ、多光子励起現象を効率的に発生させることができる。
極短パルスレーザ光が焦光される位置において多光子励起現象が生じさせられると、試料Ａの内部の比較的深い位置において蛍光を発生させることができる。発生された蛍光は、試料Ａの表面から対物レンズ２内に戻り、結像レンズ１２、瞳投影レンズ１１およびレーザ走査部１０を経てフィルタ部材１８に通過させられる。

この場合において、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１によれば、フィルタ部材１８は、蛍光を通過させる材質からなるコーティング１８ｂにより形成されているので、蛍光がフィルタ部材１８によって遮られることなくマルチモードファイバ７に入射されることになる。そして、マルチモードファイバ７内を伝播された後に、装置本体６に備えられている光電子増倍管６によって検出される。

すなわち、コア径の大きなマルチモードファイバ７によって、試料Ａから発生された蛍光を無駄なく伝播して測定ヘッド３外部の光電子増倍管５により検出することができ、蛍光の損失を低減して明るくかつ高い解像度の蛍光画像を得ることができる。また、蛍光の損失を低減しながら、比較的大きな光電子増倍管５を測定ヘッド３から分離することができる。したがって、測定ヘッド３を小型化することができ、実験小動物等の試料Ａの観察に際しての測定ヘッド３の取り回しを容易にして、操作性を向上することが可能となる。

なお、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置１においては、ガラス板１８ａにコーティング１８ｂしてなるフィルタ部材１８を採用したが、これに代えて、図４に示されるように、マルチモードファイバ７の端面７ａに中央部のみを残してコア７ｂを覆うコーティング１８ｂにより、中央部にピンホール１８ｃを形成してピンホール手段を構成することにしてもよい。
本実施形態のように集光レンズ８とコリメートレンズ９との間の第１中間像Ｂ位置にフィルタ部材１８を配置する方が、マルチモードファイバ７の端面７ａに構成する場合と比較して、部品を大きくすることができる分、製造が容易であるというメリットがある。

次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０について、図５を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を簡略化する。

本実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０は、多光子励起型の観察と、共焦点観察とを切替可能である点で、第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置１と相違している。
本実施形態においては、装置本体６に、２つのレーザ光源４，３１が備えられている。第１のレーザ光源４は、第１の実施形態と同様の極短パルスレーザ光を発する多光子励起観察用の光源である。第２のレーザ光源３１は、例えば、波長４８８ｎｍのレーザ光を発生する共焦点観察用の光源である。第２のレーザ光源３１の出射口には、全反射ミラー３２とダイクロイックミラー３３とが配置され、第１のレーザ光源４からの光路と同一光路にレーザ光を入射させることができるようになっている。

また、測定ヘッド３には、集光レンズ８とコリメートレンズ９との間にターレット３４が設けられ、該ターレット３４を回転させることにより、上記フィルタ部材１８と、共焦点ピンホール部材３５とを選択使用することができるようになっている。

多光子励起型の観察を行う場合は、ターレット３４のフィルタ部材１８を選択し、第１のレーザ光源４から極短パルスレーザ光を出射させることにより、第１の実施形態と同様にして行う。マルチモードファイバ７を伝播して戻る蛍光は、装置本体６内のダイクロイックミラー２０によって光路から分離され、バリアフィルタ２１によって励起光がカットされて光電子増倍管５により検出されることになる。

共焦点観察を行う場合には、ターレット３４の共焦点ピンホール部材３５を選択し、第２のレーザ光源３１からレーザ光を出射させる。第２のレーザ光源３１から出射されたレーザ光は、全反射ミラー３２とダイクロイックミラー３３を介して第１のレーザ光源４からの出射光路と同一光路に入射させられる。そして、マルチモードファイバ７を伝播して測定ヘッド３に入り、集光レンズ８によって共焦点ピンホール３５の位置に中間像Ｂを形成し、レーザ走査部１０によって走査されて瞳投影レンズ１１、結像レンズ１２および対物レンズ２を経て試料Ａに照射させられる。

共焦点ピンホール３５は、対物レンズ２の焦点位置と共役な位置に配されているので、試料Ａから戻る蛍光は、対物レンズ２の焦点位置から発せられたもののみが、共焦点ピンホール３５を通過できる。これにより、対物レンズ２の焦点位置が配されている試料Ａ内部の共焦点蛍光画像を得ることができる。マルチモードファイバ７を伝播して戻る蛍光は、装置本体６内のダイクロイックミラー２０によって光路から分離されて光電子増倍管５により検出されることになる。

このように、本実施形態に係るレーザ走査型観察装置３０によれば、第１のレーザ光源４と第２のレーザ光源３１とを切り替えるとともに、これに合わせて、フィルタ部材１８と共焦点ピンホール部材３５とを切り替えることにより、多光子励起型の観察と、共焦点観察とを切り替えて行うことができる。この場合において、多光子励起型の観察と共焦点観察とを、同じマルチモードファイバ７を用いて行うことができるとともに、同一の光電子増倍管５を用いて検出することができる。

同一のマルチモードファイバ７を使用することにより、装置本体６と測定ヘッド３とを接続する光ファイバの本数を低減して、測定ヘッド３の操作性を向上することができる。また、共通の光電子増倍管５を使用することにより、部品点数を低減してコストを削減できるとともに、装置本体６の大型化を抑制することができる。

また、本実施形態においては、ターレット３４にフィルタ部材１８と単一の共焦点ピンホール部材３５とを備える場合について例を挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ピンホールの口径の異なる複数種類の共焦点ピンホール部材をターレット３４に選択可能に備えることにしてもよい。口径のより大きな共焦点ピンホール部材を使用した共焦点観察によれば、蛍光画像の解像度は落ちるものの、その分、ピンホールを通過させる蛍光量を増大させることができるので、より明るい蛍光画像を光電子増倍管５において検出することができる。

さらに、共焦点ピンホール部材１８の他に、口径の非常に大きなピンホール部材あるいは全ての光を通過させる空穴部材をターレット３４に備えることとすれば、試料Ａからの反射光により対物レンズ２のピント合わせを行う際に有利である。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型観察装置を示す全体構成図である。 図１のレーザ走査型観察装置に用いられるフィルタ部材を示す縦断面図である。 マルチモードファイバ内の伝送モードを説明する模式図である。 図２のフィルタ部材の変形例を示す縦断面図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型観察装置を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ 試料
１ レーザ走査型観察装置
２ 対物光学系
３ 測定ヘッド
４ レーザ光源
５ 光電子増倍管（撮像手段）
６ 装置本体（光学ユニット）
７ マルチモードファイバ
１０ レーザ走査部（光走査部）
１８ フィルタ部材（ピンホール手段）
１８ａ ガラス板
１８ｂ コーティング
３１ 第２のレーザ光源
３４ ターレット（交換機構）
３５ 共焦点ピンホール部材

Claims (7)

1. 極短パルスレーザ光を発するレーザ光源と、試料からの戻り光を検出する撮像手段とを備える光学ユニットと、
   レーザ光源からの極短パルスレーザ光を試料上に走査させる光走査部と、該光走査部により走査された極短パルスレーザ光を試料上に結像させる対物光学系とを備える測定ヘッドと、
   これら光学ユニットと測定ヘッドとを接続するマルチモードファイバと、
   前記測定ヘッドに備えられ、可視光を透過させかつレーザ光を遮断する材質からなるピンホール手段とを備えるレーザ走査型観察装置。
2. 前記ピンホール手段が、ガラス板の表面にコーティングを施してなるピンホール部材により構成されている請求項１に記載のレーザ走査型観察装置。
3. 前記ピンホール手段が、前記マルチモードファイバの端面に施されたコーティングにより形成されている請求項１に記載のレーザ走査型観察装置。
4. 前記光学ユニットに設けられ、レーザ光を発する第２のレーザ光源と、
   前記測定ヘッドに設けられ、レーザ光および可視光を遮断する材質からなる共焦点ピンホール部材と、
   前記ピンホール部材と前記共焦点ピンホール部材とを選択的に交換する交換機構とを備える請求項２に記載のレーザ走査型観察装置。
5. 口径の異なる複数種類の共焦点ピンホール部材を備える請求項４に記載のレーザ走査型観察装置。
6. 前記共焦点ピンホール部材より口径の大きな空穴部材を備え、
   前記交換機構が該空穴部材をも選択的に交換する請求項４または請求項５に記載のレーザ走査型観察装置。
7. 可視光を透過させかつレーザ光を遮断する材質からなるピンホール部材。

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