JP2004527223A - 複数誘導性遺伝子調節系 - Google Patents

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Abstract

本発明は、バイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、複数遺伝子の定量的発現を同時に制御するために細胞内で機能する複数誘導性遺伝子調節系に関する。

Description

【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０００年１０月３日付出願の継続中の米国仮出願番号６０／２３７，４４６の優先権を主張し、その内容全てをここで参考のために取り入れる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、バイオテクノロジーまたは遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、細胞、組織または生物体中で機能して同時に二種以上の遺伝子の定量的発現を制御する、複数誘導性遺伝子調節系に関する。
【０００３】
（発明の背景）
種々の公報をここで引用し、その開示の全体を参考に取り入れる。しかしながら、いかなる引用文献も本出願の「従来技術」として利用し得ると解すべきではない。
【０００４】
遺伝子工学の分野において、遺伝子発現の正確な制御は、発生および他の生理学的プロセスを研究、操作および制御するための価値のあるツールである。遺伝子発現は、多くの特定の蛋白質−蛋白質相互作用を含む複合的生物学的プロセスである。遺伝子発現を開始させて、蛋白質合成の第１の工程として必要なＲＮＡを製造するために、転写アクチベータを、遺伝子転写を制御するプロモータに近接させなくてはならない。典型的には、転写アクチベータ自体が、遺伝子のプロモータ領域中に存在するＤＮＡ結合部位に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有する蛋白質と関連する。すなわち、遺伝子発現が起こるために、ＤＮＡ結合ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインから適当な距離をおいて配されるトランス活性化ドメインとを含む蛋白質を、遺伝子のプロモータ領域中の正確な位置に置かなければならない。
【０００５】
従来のトランスジェニック手段は、細胞型特異的プロモータを利用して、所望の導入遺伝子の発現を引き起こす。導入遺伝子を含むＤＮＡ構造体は、最初にホストゲノムに組み込まれる。転写アクチベータにより開始された場合、所定の細胞型において導入遺伝子が発現する。
【０００６】
複数遺伝子調節系は、同じ細胞、組織または生物体中で多くの異なる遺伝子の同時かつ定量的調節を可能にする系である。現在では、ヒトゲノムをプロテオミクスに分析して大量の蛋白質を製造することから遺伝子治療までの用途において、同じ細胞中で同時に２以上の遺伝子を調節する技術はない。遺伝子調節は、どの遺伝子を分析するかを正確かつ定量的に制御させ、従って、どのような結果が得られるかを他の遺伝子ではなく、その遺伝子に直接かつ特異的に関係付けるのを確実にするので、前記用途の全てにおいて重要である。しかしながら、現時点における遺伝子調節は、一度に一つの遺伝子に限定され、これは、重要な定性的かつ定量的限定である。同じ細胞中の複数の遺伝子の並行制御は、複数の遺伝子が関係している、より多くの複合的生物学的現象の分析を可能にし、また、新規治療用途を生み出す。
【０００７】
細胞内での外来遺伝子の発現の調節のもう一つの手段は、誘導性プロモータによるものである。そのようなプロモータの例には、ＰＲ１−ａプロモータ、原核生物リプレッサ−オペレーター系、免疫抑制分子に基づく系、およびより高度な真核生物転写活性化系がある。
【０００８】
タバコからのＰＲ１−ａプロモータは、病原体攻撃に続く全身獲得抵抗応答中に誘導される。ＰＲ１−ａの使用は、ＰＲ１−ａが内因性物質および、病原体、ＵＶ−Ｂ照射および汚染物質のような外部因子に反応することが多いので制限される場合がある。熱ショック、インターフェロンおよび重金属により誘導されたプロモータに基づく遺伝子調節系が記載されている（Ｗｕｒｎら著、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８３巻：５４１４〜５４１８頁；Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら著、１９９０ Ｃｅｌｌ 第６２巻：５１〜６１頁；Ｆｉｌｍｕｓら著、１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第２０巻：２７５５０〜２７５６０頁）。しかしながら、これらの系は、非標的遺伝子の発現へのそれらの効果故に限定される。これらの系は漏出性でもある。
【０００９】
原核生物リプレッサオペレーター系は、細菌リプレッサ蛋白質および、それらが結合する独自のオペレーターＤＮＡ配列を利用する。細菌大腸菌からのテトラサイクリン（「Ｔｅｔ」）とラクトース（「Ｌａｃ」）との両方のリプレッサオペレーター系が、遺伝子発現の調節のために植物および動物において用いられてきた。Ｔｅｔ系においては、テトラサイクリンがＴｅｔＲリプレッサ蛋白質に結合し、コンホメーションの変化が生じ、それによりオペレーターからリプレッサ蛋白質が放たれ、その結果、転写が起こるのを可能にする。Ｌａｃ系においては、ｌａｃオペロンが、ラクトースまたは、イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドのような合成アナログの存在に反応して活性化される。不運にも、そのような系の使用は、リガンド、すなわちテトラサイクリンおよびラクトースの不安定な化学特性、それらの毒性、それらの天然での存在、または誘導または抑制に必要な水準が比較的高いことにより制限される。同様の理由により、動物におけるそのような系の利用は制限される。
【００１０】
ＦＫ５０６、ラパマイシンおよびシクロスポリンＡのような免疫抑制分子は、イムノフィリン（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎｓ）ＦＫＢＰ１２、シクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）等に結合することができる。この情報を用いて、一般的手法が工夫されて、単にＦＫ５０６を２つの蛋白質の各々の上に配することにより、またはＦＫ５０６を一方の蛋白質の上にシクロスポリンＡを他方の蛋白質の上に配することにより、任意の２つの蛋白質を一緒にした。次に、ＦＫ５０６の合成ホモダイマー（ＦＫ１０１２）を、またはＦＫ５０６シクロスポリンの融合から生じる化合物（ＦＫＣｓＡ）を用いて、これらの分子の二量化を誘導することができる（Ｓｐｅｎｃｅｒら著、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２６２巻：１０１９〜２４頁；Ｂｅｌｓｈａｗら著、１９９６年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９３巻：４６０４〜７頁）。ＦＫＢＰ１２に融合されたＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン、およびシクロスポリンに融合されたＶＰ１６アクチベータドメイン、並びにＦＫＣｓＡ化合物を用いて、Ｇａｌ４結合部位を含むプロモータの制御下におけるヘテロ二量化およびレポーター遺伝子の活性化を示した。不運なことに、この系は、種々の哺乳動物遺伝子調節系用途に対して、その使用を制限する望まれない副作用を有し得る免疫抑制剤を含む。
【００１１】
ステロイドホルモン受容体系のような、高度の真核生物転写活性化系も用いられていた。ステロイドホルモン受容体は、核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、脊椎動物および無脊椎動物細胞中で見られる。不運なことに、特に植物および哺乳動物における、遺伝子発現の調節のための受容体を活性化するステロイド化合物の使用は、そのような生物体における多くの他の本来の生物学的経路にそれらが関与していることから制限される。そのような困難を克服するために、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）を用いる別の系が開発された。
【００１２】
昆虫におけるエクジソンのための分子標的は、少なくともエクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトラスパイラクル（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）蛋白質（ＵＳＰ）からなる。ＥｃＲは、シグニチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ＤＮＡ、リガンド結合ドメインおよび活性化ドメインにより特徴付けられる核ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｋｏｅｌｌｅら著、１９９１年、Ｃｅｌｌ、第６７巻：５９〜７７頁）。ＥｃＲは核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１のＨ群（ここで、「Ｈ群核受容体」と称する）に分類される。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメイン中で４０〜６０％のアミノ酸同一性を有し（Ｌａｕｄｅｔら著、Ａ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ、１９９９年；Ｃｅｌｌ 第９７巻：１６１〜１６３頁）。エクジソン受容体に加えて、この核受容体サブファミリー１のＨ群の他のメンバーとしては：ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用蛋白質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイド（ｆａｒｎｅｓｏｉｄ）ｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）およびファルネソル（ｆａｒｎｅｓｏｌ）受容体（ＨＲＲ−１）がある。
【００１３】
ＥｃＲ受容体は、ポナステロンＡおよびムリステロンＡのような多くのステロイド化合物に応答性である。最近、エクジステロイド作動薬活性を有する非ステロイド化合物が記載されており、ローム アンド ハース カンパニー（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａｓｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）から世界的に販売されている市販の殺虫剤テブフェノジドおよびメトキシフェノジドが挙げられる（国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／００６８６号および米国特許第５，５３０，０２８号を参照）。いずれのアナログも、他の生物体への例外的な安全プロフィールを有する。
【００１４】
昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、ウルトラスパイラクル（ＵＳＰ）、すなわち哺乳動物ＲＸＲの昆虫相同体とヘテロ二量化し、エクジステロイドおよびエクジソン受容体応答エレメントを結合し、エクジソン応答性遺伝子の転写を活性化する（Ｒｉｄｄｉｆｏｒｄら著、２０００年、Ｖｉｔａｍ Ｈｏｒｍ 第６０巻：１〜７３頁）。ＥｃＲ／ＵＳＰ／リガンド複合体は、昆虫の発育および生殖中に重要な役割を果たす。ＥｃＲは、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、５つの調節ドメイン、すなわちＡ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合性、ヘテロ二量化）、Ｄ（ヒンジ、ヘテロ二量化）、Ｅ（リガンド結合性、ヘテロ二量化およびトランス活性化）および、特定の場合には、Ｆ（トランス活性化）ドメインを有する。Ａ／Ｂ、ＣおよびＥのような、これらのドメインのいくつかは、他の蛋白質に融合されたときに、それらの機能を保持する。
【００１５】
厳密に制御された誘導性遺伝子発現系、すなわち「遺伝子スイッチ」が、遺伝子治療、細胞中での蛋白質の大規模製造、細胞系高処理能スクリーニングアッセイ、機能性ゲノミクス、およびトランスジェニック植物および動物における特性の制御のような種々の用途に有用である。ＥｃＲ系遺伝子スイッチの第１バージョンはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）およびマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）を使用し、これらの受容体が、ステロイドのポナステロンＡの存在下において哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウス中でレポーター遺伝子をトランス活性化することを示した（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎら著、（１９９２年）ＰＮＡＳ、第８９（１４）巻：６３１４〜８頁およびＮｏら著、（１９９６年）ＰＮＡＳ、第９８（８）巻：３３４６〜５１頁）。ＥｃＲおよびテトラサイクリン調節系を直接比較し、ＥｃＲ調節系が、テトラサイクリン系システム（ｔＴＡおよびｒｔＴＡ）の２つのバージョンのいずれと比べても低いベース活性を有し、ＥｃＲ系システムの漏出性が少ないことを示すと結論づけた。その後、Ｓｕｈｒら（１９９８年、ＰＮＡＳ 第９５巻：７９９９〜８００４頁）は、非ステロイド性エクジソン作動薬のテブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下にカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を通して哺乳動物細胞中でレポーター遺伝子の高水準トランス活性化を誘導したことを示した［国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５号（ＷＯ９９／０２６８３）も参照］。
【００１６】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０号（ＷＯ９７／３８１１７）およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０８３８１（ＷＯ９９／５８１５５）は、外因性遺伝子の発現を調節する方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構造体が、リガンドの存在下にかつ任意に、サイレントパートナー（ｓｉｌｅｎｔ ｐａｒｔｎｅｒ）として作用することができる受容体の存在下に、エクジソン応答エレメントに結合して遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む第２のＤＮＡ構造体により活性化される方法を開示している。選択されるエクジソン受容体を、キイロショウジョウバエから単離した。典型的には、そのような系は、最適な活性化を提供するために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞中において、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）が、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量化し、リガンド依存的に標的遺伝子の発現を調節する。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５（ＷＯ９９／０２６８３）は、カイコから単離されたエクジソン受容体が、外因性二量体パートナーを必要とすることなしに、哺乳動物系において機能的であることを開示する。
【００１７】
米国特許第６，２６５，１７３ Ｂ１号は、ステロイド／チロイドスーパーファミリーの種々のメンバーを、遺伝子発現系中での使用のために、キイロショウジョウバエウルトラスパイラクル受容体（ＵＳＰ）、またはＵＳＰの二量化ドメインを少なくとも含む、そのフラグメントと組み合わせることができることを開示している。米国特許第５，８８０，３３３号は、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なるハイブリッド蛋白質上に配されている、植物中で用いられるキイロショウジョウバエＥｃＲおよびウルトラスパイラクル（ＵＳＰ）ヘテロ二量体系を開示している。不運なことに、これらのＵＳＰベースの系は、動物細胞中において構成的であり、従って、レポーター遺伝子発現の調節に効果的でない。
【００１８】
これらの場合の各々において、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５における天然型ＥｃＲとして、または国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０における変性ＥｃＲとして）、単一の分子内に組み込まれ、他のヘテロ二量体パートナーのＵＳＰまたはＲＸＲのいずれかが、天然型状態で用いられる。
【００１９】
前記ＥｃＲ系遺伝子調節系の欠点は、リガンドの非存在下におけるかなりのバックグラウンド活性、植物および動物の両方に用いるためにこれらの系を適用できないこと（米国特許第５，８８０，３３３号を参照）、および複数遺伝子の発現の調節のための使用が限定されるまたはそれが不可能であることが挙げられる。従って、当該分野において、植物および動物の両方において２種以上の外因性遺伝子の発現を正確に調節するための改良されたＥｃＲ系系が必要である。そのような改良された系は、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞系高処理能スクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクスおよびトランスジェニック動物における特性の調節のような用途に有用である。遺伝子治療のような特定の用途には、合成非ステロイド性リガンドに良好に反応し同時に天然ステロイドに非感受性である誘導性遺伝子発現系を有することが望まれている。
【００２０】
最近、出願人は、トランス活性化およびＤＮＡ結合ドメインが２つの異なる蛋白質上に配されることにより、互いに分離されるエクジソン受容体系誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下にバックグラウンド活性を大きく低下させ、リガンドの存在下でバックグラウンドを超える顕著に増強された活性を生じさせることを示した（継続中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０の全体が本明細書の一部として参照される）。この２−ハイブリッド系は、出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５３３０およびＰＣＴ／ＵＳ９８／１４２１５中に開示された２つの系と比較して、かなり改良された誘導性遺伝子発現調節系である。この２ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合ドメインが遺伝子上のＤＮＡ結合部に結合したときにトランス活性化ドメインがプロモータをより効果的に活性化させるように、一対の相互作用蛋白質が、転写活性化ドメインを、ＤＮＡ結合ドメインに対してより好ましい位置に運ぶ能力を利用する（たとえば、米国特許第５，２８３，１７３号参照）。簡単に言えば、２ハイブリッド遺伝子発現系は、２つの遺伝子発現カセット；すなわち、核受容体ポリペプチドに融合されたＤＮＡ結合ドメインをコードする第１のカセット、および異なる核受容体ポリペプチドに融合されたトランス活性化ドメインをコードする第２のカセットを含む。リガンドの存在下で、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインをトランス活性化ドメインに効果的に結合させる。ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインは２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下におけるバックグラウンド活性は大きく低下される。
【００２１】
２ハイブリッド系は、ステロイド性リガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較したときに、非ステロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンへの向上した感受性も提供する。すなわち、ステロイドと比較すると、非ステロイドリガンドは、より低い濃度でより高い活性を提供する。さらに、ＥｃＲ遺伝子スイッチに基づくトランス活性化は細胞系依存的であることが多いので、各用途について最高のトランス活性化性能を得るようにスイッチング系を調整することが容易である。さらに、２ハイブリッド系は、非変性ＲＸＲをスイッチングパートナーとして用いた場合にしばしば起こるＲＸＲの過剰発現故の、幾つかの副作用を回避する。好ましい２ハイブリッド系において、ＥｃＲまたはＲＸＲの天然型ＤＮＡ結合ドメインおよびトランス活性化ドメインが除去され、その結果、これらのハイブリッド分子は、細胞中に存在する他のステロイドホルモン受容体と相互作用するチャンスがより少なく、それにより、副作用が低下する。
【００２２】
出願人の発明は、当該分野における欠点を克服し、同じ細胞中の２種以上の遺伝子の発現を同時に調節する手段を提供する。出願人の発明は、同じ細胞、組織または生物体における２種以上の異なる遺伝子の同時かつ定量的調節を可能にする複数誘導性遺伝子調節系を提供する。出願人の発明は、複数遺伝子調節が重要である用途において有用である。すなわち、出願人の発明は、遺伝子発現の分野における欠点を克服し、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、毒性スクリーニング、細胞系高処理能スクリーニングアッセイ、蛋白質製造および遺伝子治療等の分野において有用である。出願人の発明は、同じ細胞中での複数遺伝子の並行制御用の手段を提供し、当業者が、複数遺伝子または経路が含まれる複合的生物学的現象を分析し、また新規治療的用途を創造することを可能にする。
【００２３】
本発明は、遺伝子発現水準の制御が望まれる、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模製造、細胞系高処理能スクリーニングアッセイ、オルトゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）リガンドスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、毒性スクリーニング、およびトランスジェニック生物における特性の制御のような用途に有用である。出願人の発明の利点は、２種以上の遺伝子の発現を調節し、発現レベルを利用者の要求に合うように調整する手段を提供することである。
【００２４】
定義
この開示において、多くの用語および略語が用いられる。以下の定義が提供され、本発明の範囲および実施を理解する上で役立つはずである。
【００２５】
特定の実施形態において、「約」という用語は、所定の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内、さらに好ましくは１％以内を意味する。
【００２６】
特記しない限り、ここで用いられる全ての百分率は重量％であり全ての部は重量部であり、これは境界値を含み、組み合わせることができる。全ての比は重量基準で、全ての比の範囲は境界値を含み、組み合わせることができる。全てのモル範囲は境界値を含み、組み合わせることができる。
【００２７】
「実質的に含まない」という用語は、組成物中の蛋白質、ＤＮＡ、ベクターの少なくとも７５重量％（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーに依存して）が「Ａ」である場合に、「Ａ」（「Ａ」は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター、組換え宿主細胞等）を含む組成物が、実質的に「Ｂ」（「Ｂ」は一種または二種以上の汚染蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクター等を含む）を含まないことを意味する。好ましくは、「Ａ」は、組成物中に、Ａ＋Ｂ種の少なくとも約９０重量％、もっとも好ましくは少なくとも約９９重量％を含む。汚染物質を実質的に含まない組成物が、意図する種の活性または特性を有する単一分子量種のみを含むことも好ましい。
【００２８】
本発明の目的において「単離された」という用語は、その元来の環境（天然に存在する環境）から取出された生物学的物質（核酸または蛋白質）を示す。例えば、植物または動物中に天然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然に存在する近隣の核酸から分離された同じポリヌクレオチドは「単離された」と見なされる。「精製された」という用語は、物質が他の化合物の存在を排除する絶対的純度を示す状態で存在することを要求しない。これはむしろ相対的定義である。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、出発物質または天然物質の精製後に、少なくとも１オーダー、好ましくは２または３オーダー、好ましくは４または５オーダーの規模で、「精製された」状態にある。
【００３０】
「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合してなるポリマー化合物である。核酸は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、その両方が一本鎖または二本鎖であってよい。ＤＮＡは、限定はされないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび半合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは線状、環状またはスーパーコイル状であってよい。
【００３１】
「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）の燐酸エステルポリマー形態、またはホスホロチオエートおよびチオエステルのような、任意のそれらのホスホエステルアナログの一本鎖または二本鎖ヘリックスを意味する。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次および二次構造のみを意味し、任意の特定の三次元形状に限定されない。すなわち、この用語は、特に線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミドおよび染色体で見られる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の説明において、ＤＮＡの非転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに相同の配列を有するストランド）に沿った５’から３’方向の配列のみを与える標準の規則に従って配列が記載されることができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を行ったＤＮＡ分子である。
【００３２】
「フラグメント」という用語は、対照核酸に対して短くなった長さを有するヌクレオチド配列を意味し、共通部分においては対照核酸と同じヌクレオチド配列を含むと解される。本発明のそのような核酸フラグメントは、適当な場合には、それが構成成分である、より大きなポリヌクレオチド中に含まれる。そのようなフラグメントは、本発明によるポリヌクレオチドの少なくとも６〜１５００の連続ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【００３３】
本明細書で用いられる「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖であり、任意に合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマー状の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの一種または二種以上のセグメントを含んでよい。
【００３４】
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集まりを意味し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。「遺伝子」は、特定の蛋白質またはポリペプチドを発現する核酸フラグメントも意味し、コード配列の前側の調節配列（５’非コード配列）および後側の調節配列（３’非コード配列）を含む。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではなく、天然には一緒に見られない調節配列および／またはコード配列を含む任意の遺伝子を意味する。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源から得られる調節配列とコード配列を含むか、または同じ供給源から得られる調節配列とコード配列を含むが、天然に見られるものとは異なる方法で配列されるものを含むことができる。キメラ遺伝子は、異なる供給源から得られるコード配列および／または異なる供給源から得られる調節配列を含んでよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の自然の位置にある天然の遺伝子を意味する。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子は、ホスト生物体中に普通は見られないが遺伝子導入により宿主生物中に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、非天然生物またはキメラ遺伝子中に挿入された天然遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換法手順によりゲノム中に導入された遺伝子である。
【００３５】
「異種」ＤＮＡは、細胞中、または細胞の染色体位置に天然には配されていないＤＮＡを意味する。好ましくは、異種ＤＮＡは、その細胞以外から得られた遺伝子を含む。
【００３６】
「ゲノム」という用語は、染色体および、ミトコンドリア、葉緑体およびウイルスのＤＮＡもしくはＲＮＡを含む。
【００３７】
温度および溶液イオン強度の適当な条件下で、一本鎖状の核酸分子が他の核酸分子にアニールすることができるとき、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのようなもう一つの核酸分子に「ハイブリダイズ可能である」（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の後記の書を参照）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）の特に第１１章および表１１．１に例示されている（全体が本明細書の一部として参照される）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」を決める。
【００３８】
ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物体からの相同配列からの相同配列をはじめとする中程度に類似したフラグメントについて、近縁の生物体からの酵素を倍加する遺伝子をはじめとする高度に類似したフラグメントについてスクリーニングするように調節することができる。相同核酸を予備スクリーニングするために、５５°のＴｍに相当する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、および、ホルムアミド無し；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍで、例えば４０％ホルムアミドを用いた、５×または６×ＳＣＣに相当する。高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍで、例えば５０％ホルムアミドを用いた、５×または６×ＳＳＣに相当する。
【００３９】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記載するために、「相補性」という用語が用いられる。例えば、ＤＮＡについては、アデノシンがチミンに相補的であり、シトシンがグアニンに相補的である。従って、本発明は、ここで開示または用いられている完全な配列に相補的な単離核酸フラグメント、並びに実質的に類似の核酸配列も含む。
【００４０】
本発明の特定の実施形態において、５５℃のＴｍでのハイブリダイゼーション工程を含むハイブリダイゼーション条件を用いることにより、および前述の条件を利用することによりポリヌクレオチドが検出される。好ましい実施形態において、Ｔｍは６０℃であり、より好ましい実施形態において、Ｔｍは６３℃であり、さらにより好ましい実施形態において、Ｔｍは６５℃である。
【００４１】
ハイブリダイゼーション後洗浄もストリンジェンシー条件を決める。一組の好ましい条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いて室温で１５分間洗浄し、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いて４５℃で３０分間洗浄、次に、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いて５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返す一連の洗浄を用いる。より好ましい組のストリンジェンシー条件はより高い温度を用いるが、洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中の最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に上げたことを除いて前述のものと同じである。もう一組の好ましい高度ストリンジェンシー条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で最後の洗浄を２回を行う。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。
【００４２】
核酸をハイブリダイゼーションするための適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度に依存し、変数は当該分野でよく知れらている。２つのヌクレイチド配列間の類似性または相同性の程度が大きい程、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍの値がより大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前記書の９．５０〜０．５１を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決める（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前記書の１１．７〜１１．８を参照）。
【００４３】
本発明の特定の実施形態において、５００ｍＭ未満の塩中での少なくとも３７℃でのハイブリダイゼーション工程、および２×ＳＳＰＥ中での少なくとも６３℃での洗浄工程を含むハイブリダイゼーション条件を用いることによりポリヌクレオチドが検出される。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程での２００ｍＭ未満の塩および少なくとも３７℃の温度を含む。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程の両方について２×ＳＳＰＥおよび６３℃の温度を含む。
【００４４】
一つの実施形態において、ハイブリダイズし得る核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズし得る核酸の最低長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、プローブの長さのような因子に従って必要であるように温度および洗浄溶液塩濃度を調節できることを認識する。
【００４５】
「プローブ」という用語は、相補的一本鎖標的核酸と塩基対を形成して二本鎖分子を形成することができる一本鎖核酸分子を意味する。
【００４６】
ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる、通常少なくとも１８ヌクレオチドの核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば３２Ｐヌクレオチドまたは、ビオチンのような標識が共有結合したヌクレオチドで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドを、核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。核酸の全長またはフラグメントをクローニングするためにまたは、核酸の存在を検出するために、オリゴヌクレオチド（一方または両方は標識されていてよい）をＰＣＲプライマーとして用いることができる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子とトリプルヘリックスを形成するために用いることもできる。通常、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸合成器において合成的に調製される。従って、例えばチオエステル結合等のような非天然で生じるホスホエステルアナログ結合を用いてオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００４７】
「プライマー」は、適当な条件下のＤＮＡ合成のための開始点として役立つことができる二本鎖核酸領域を形成するように、標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応において用いてよい。
【００４８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略され、特定の核酸配列を酵素的に増幅させるためのインビトロ方法を意味する。ＰＣＲは、テンプレート核酸を変性させて標的分子のストランドを解離させる段階、一本鎖ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーをテンプレート核酸にアニーリングする段階、およびアニーリングしたプライマーをＤＮＡポリメラーゼにより延長する段階の３つの段階を各サイクルが含む繰り返しの一連の温度サイクルを含む。ＰＣＲは、標的分子の存在を検出すると共に、定量的または半定量的条件下で、核酸の出発プール中の標的分子の相対的量を決めるための手段を提供する。
【００４９】
「逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと略され、ＲＮＡ分子の一つまたは複数から標的ｃＤＮＡ分子の一つまたは複数を酵素的に製造し、続いて、前述のような標的ｃＤＮＡ分子の一つまたは複数中の特定の核酸配列の一つまたは複数を酵素的に増幅するためのインビトロでの方法を意味する。ＲＴ−ＰＣＲは、標的分子の存在を検出すると共に、定量的または半定量的条件下で核酸の出発プール中における標的分子の相対的量を決めるための手段も提供する。
【００５０】
ＤＮＡ「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれたときにインビトロまたはインビボで細胞内で転写およびポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「適当な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、中または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモータ、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含んでよい。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における出発コドン、および３’（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンにより決められる。コード配列は、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列までも含むことができるが、これらに限定されない。コード配列を真核生物細胞中で発現することが意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列が、通常、コード配列の３’に配される。
【００５１】
「オープン・リーディング・フレーム」はＯＲＦと略され、ＡＴＧやＡＵＧのような、翻訳開始シグナルまたは開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に翻訳される可能性を有する、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列の長さを意味する。
【００５２】
「ヘッド−トゥ−ヘッド」という用語は、ここで、２つのポリヌクレオチド配列の互いに関する方向を記載するために用いられる。１つのポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端に隣接している場合に２つのポリヌクレオチドはヘッド−トゥ−ヘッド方向に位置し、そこで各ポリヌクレオチドの転写の方向が他方のポリヌクレオチドの５’末端から離れるように進む。「ヘッド−トゥ−ヘッド」という用語は（５’）−ｔｏ−（５’）と略することができ、符号（←→）または（３’←５’５’→３’）で示すこともできる。
【００５３】
「テイル−トゥ−テイル」という用語は、ここで、２つのポリヌクレオチド配列の互いに関する方向を記載するために用いられる。１つのポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接している場合に２つのポリヌクレオチドはテイル−トゥ−テイル方向に位置し、そこで各ポリヌクレオチドの転写の方向が他方のポリヌクレオチドに向かって進む。「テイル−トゥ−テイル」という用語は（３’）−ｔｏ−（３’）と略することができ、符号（→←）または（５’→３’３’←５’）で示すこともできる。
【００５４】
「ヘッド−トゥ−テイル」という用語は、ここで、２つのポリヌクレオチド配列の互いに関する方向を記載するために用いられる。１つのポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接している場合に２つのポリヌクレオチドはヘッド−トゥ−テイル方向に位置し、そこで各ポリヌクレオチドの転写の方向が他方のポリヌクレオチドの方向と同じ方向に進む。「ヘッド−トゥ−テイル」という用語は（５’）−ｔｏ−（３’）と略することができ、符号（→→）または（５’→３’５’→３’）で示すこともできる。
【００５５】
「下流」という用語は、対照ヌクレオチド配列に対して３’側に配置されるヌクレオチド配列を意味する。特に、下流ヌクレオチド配列は、通常、転写の開始位置に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置する。
【００５６】
「上流」という用語は、対照ヌクレオチド配列に対して５’側に配置されるヌクレオチド配列を意味する。特に、上流ヌクレオチド配列は、通常、コード配列または転写の開始位置の５’側に配される配列に関する。例えば、大部分のプロモータは、転写の開始部位の上流に位置する。
【００５７】
「制限エンドヌクレアアーゼ」および「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ中の特定のヌクレオチド配列中で結合および切断する酵素を意味する。
【００５８】
「相同組換え」は、外来ＤＮＡ配列を別のＤＮＡ分子に挿入すること、例えば、ベクターを染色体に挿入することを意味する。好ましくは、ベクターは、相同組換えのための特定の染色体部位を標的とする。特定の相同組換えのために、ベクターは、染色体の配列に相同する充分に長い領域を含み、それにより相補的結合およびベクターの染色体への組み込みが可能になる。相同する領域がより長く、配列の類似性がより大きいと、相同組換えの効率が向上する場合がある。
【００５９】
本発明によるポリヌクレオチドを増幅させるために、当該分野で知られている幾つかの方法を用いてよい。一旦、適当なホスト系および成長条件が達成されると、組換え発現ベクターを増幅させ多量に調製することができる。本明細書で記載されているように、用いることができる発現ベクターは、以下のベクターまたはそれらの誘導体を含むが、それらに限定されない：ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、並びにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター等。
【００６０】
「ベクター」は、核酸の宿主細胞中へのクローニングおよび／または転移の任意の意味に用いられる。ベクターは、付着されたセグメントの複製を引き起こすように別のＤＮＡセグメントが付着されることができるレプリコンであってよい。「レプリコン」は、ＤＮＡ複製の自立単位としてインビボで機能する、すなわちそれ自身の制御下で複製することができる、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」という用語は、インビトロ、エックスビボ、またはインビボで細胞中に核酸を導入するための、ウイルス性と非ウイルス性の両方の手段を含む。当該分野で知られている多数のベクターを用いて核酸を操作し、応答エレメントおよびプロモータを遺伝子中に組み込むこと等ができる。可能なベクターは、例えば、プラスミドまたは変性ウイルスを含み、これらは、例えば、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体のようなプラスミド、またはブルースクリプトベクターを含む。例えば、適当なベクター中への、応答エレメントおよびプロモータに相当するＤＮＡフラグメントの挿入は、相補的粘着末端を有する選択されたベクター中への適当なＤＮＡフラグメントのライゲーションにより達成することができる。別法では、ＤＮＡ分子の末端が酵素的に改変されることができ、またはＤＮＡ末端へのヌクレオチド配列（リンカー）のライゲーションにより、任意の部位を製造することができる。マーカーを細胞ゲノム中に組み込んだ細胞の選択を提供する選択可能なマーカー遺伝子を含むように、そのようなベクターを加工することができる。そのようなマーカーは、マーカーによりコードされた蛋白質を組み込みおよび発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。
【００６１】
ウイルスベクターおよび特にレトロウイルスベクターが、細胞ならびに生きている動物被検体における種々の遺伝子デリバリー用途に用いられてきた。用いることができるウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルスおよびカウリモウイルスを含むが、これらに限定されない。非ウイルス性ベクターは、プラスミド、リポソーム、帯電リピド（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｌｉｐｉｄｓ）（サイトフェクチン）、ＤＮＡ蛋白質複合体、およびバイオポリマーを含む。核酸に加えて、ベクターは、一種または二種以上の調節領域、および／または、核酸転移結果（その組織への転移、発現時間等）を選択、測定およびモニターするのに有用な選択可能マーカーも含んでよい。
【００６２】
「プラスミド」という用語は、細胞の中心代謝の一部ではない遺伝子をしばしば運ぶ、染色体外エレメントを意味し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の状態である。そのようなエレメントは、任意の供給源に由来する、自立複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状、環状またはスーパーコイル状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであって、そこでは、選択された遺伝子産物についてのプロモータフラグメントおよびＤＮＡ配列を、適当な３’未翻訳配列と共に、細胞中に導入することができる独自の構造に、多くのヌクレオチド配列が結合されまたは組み換えられている。
【００６３】
「クローニングベクター」は「レプリコン」であり、連続的に複製する核酸、好ましくはＤＮＡの単位長さであって、プラスミド、ファージまたはコスミドのような複製の起点を含み、そこに、別の核酸セグメントが付着して、付着したセグメントの複製を引き起こすことができる。クローニングベクターは、一つの細胞型中で複製を起こし、別の細胞型中で発現を起こすことができる（「シャトルベクター」）。
【００６４】
ベクターは、当該分野で知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、燐酸カルシウム沈殿、リポフェクション（ライソソーム融合）、遺伝子ガンの使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターにより所望の宿主細胞中に導入することができる（例えば、Ｗｕら著、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻：９６３〜９６７頁；ＷｕおよびＷｕ著、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６３巻：１４６２１〜１４６２４頁；およびＨａｒｔｍｕｔら著、カナダ国特許出願第２，０１２，３１１号、１９９０年３月１５日出願、参照）。
【００６５】
本発明によるポリヌクレオチドは、インビボでのリポフェクションにより導入することもできる。ここ十年間で、インビトロでの核酸の封入およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増えている。リポソーム媒介トランスフェクションで遭遇される困難および損害を制限するように設計された合成カチオン性脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら著、１９８７年．ＰＮＡＳ 第８４巻：７４１３頁；Ｍａｃｋｅｙら著、１９８８年．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８５巻：８０２７〜８０３１頁；およびＵｌｍｅｒら著、１９９３年．Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５９巻：１７４５〜１７４８頁）。カチオン性脂質の使用は、陰性に帯電した核酸の封入を促進し、また、陰性に帯電した細胞膜との融合を促進することができる（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ著、１９８９年．Ｓｃｉｅｎｃｅ第３３７巻：３８７〜３８８頁）。核酸の転移用の特に有用な脂質化合物および組成物が、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。インビボで特定の器官内に外因性遺伝子を導入するためにリポフェクションを用いることは、特定の実用的利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は、一種の利点を提供する。特定の細胞型にトランスフェクションを誘導することは、膵臓、肝臓、腎臓および脳のような細胞不均質性の組織において特に好ましいことが明らかである。標的化の目的で、他の分子に脂質を化学的に結合させることができる（Ｍａｃｋｅｙら著、１９８８年，前記書）。標的にされるペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、および、抗体のような蛋白質、または非ペプチド分子をリポソームに化学的に結合させることができる。
【００６６】
インビボでの核酸のトランスフェクションを容易化するのに、他の分子、例えば、カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合蛋白質から誘導されるペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８）またはカチオン性ポリマー（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）も有用である。
【００６７】
インビボでベクターを、裸のＤＮＡプラスミドとして導入することもできる（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）。受容体媒介ＤＮＡデリバリー手法も用いることができる（Ｃｕｒｉｅｌら著、１９９２年．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．第３巻：１４７〜１５４頁；およびＷｕおよびＷｕ著、１９８７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６２巻：４４２９〜４４３２頁）。
【００６８】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外因性もしくは異種ＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みを意味する。細胞は、外因性もしくは異種ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内に導入されるときに、当該ＲＮＡまたはＤＮＡで「トランスフェクトされる」。細胞は、ＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす場合に、トランスフェクトされた外因性または異質の当該ＲＮＡまたはＤＮＡにより「形質転換」されている。形質転換性ＲＮＡまたはＤＮＡを染色体ＤＮＡ中に一体化（共有結合）させて細胞のゲノムを作ることができる。
【００６９】
「形質転換」は、宿主生物体のゲノム中に核酸フラグメントを転移して、遺伝子的に安定な遺伝を生じさせることを意味する。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物体は、「トランスジェニック」、「組換え」または「形質転換された」生物体と呼ばれる。
【００７０】
「遺伝子領域」という用語は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸分子またはヌクレオチド配列の領域を意味する。
【００７１】
さらに、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、増幅またはその発現が求められる細胞宿主中での複製のための一種または二種以上の起点、マーカーまたは選択可能マーカーを含んでよい。
【００７２】
用語「選択可能マーカー」は同定因子、通常は、抗生物質または化学物質耐性遺伝子を意味し、それはマーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質への耐性、除草剤への耐性、比色分析マーカー、酵素、蛍光マーカー等に基づいて選択されることができ、ここで、その効果を用いて、意図する核酸の遺伝をたどる、および／または、意図する核酸を受け継いだ生物または細胞を確認する。当該分野において知られており使用されている選択可能マーカー遺伝子の例には、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）除草剤、スルホンアミド等への耐性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等が含まれる。
【００７３】
「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を意味し、その効果を用いて、意図する核酸の遺伝をたどり、意図する核酸を受け継いだ細胞または生物体を同定し、および／または、遺伝子発現の誘導または転写を測定する。当該分野において知られており使用されているレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が含まれる。選択可能マーカー遺伝子は、レポーター遺伝子としても考えられる。
【００７４】
「プロモータ」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列は、プロモータ配列の３’側に配される。プロモータはその全体が天然遺伝子から誘導されるか、または、天然に見られる異なるプロモータに由来する異なるエレメントからなるか、あるいは合成ＤＮＡセグメントさえ含むことができる。当業者によって、異なるプロモータが、異なる組織もしくは細胞型中で、または異なる発生段階で、または異なる環境的もしくは生理学的条件に応答して、発現を誘導し得ることが理解される。ほとんどの時間において、ほとんどの細胞型において、遺伝子を発現させるプロモータは、一般的に、「構成的プロモータ」と呼ばれる。特定の細胞型中において遺伝子を発現させるプロモータは、一般的に、「細胞特異的プロモータ」または「組織特異的プロモータ」と呼ばれる。発生または細胞分化の特定の段階において遺伝子を発現させるプロモータは、一般的に、「発生特異的プロモータ」または「細胞分化特異的プロモータ」と呼ばれる。プロモータを誘導する薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光に細胞を曝露し、またはそれらで細胞を処理した後に、誘導されると共に遺伝子を発現させるプロモータは、一般的に、「誘導性プロモータ」または「調節可能プロモータ」と呼ばれる。さらに、大部分の場合、調節配列の正確な境界は完全に定められていないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントは同じプロモータ活性を有しうることが知られている。
【００７５】
「プロモータ配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼと結合することができると共に下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモータ配列はその３’末端において転写開始部位により結合され、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルの転写を開始するのに必要な最少数の塩基またはエレメントを含む。プロモータ配列中には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることにより簡易に画定される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因である蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。
【００７６】
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、それが次にトランスＲＮＡスプライスされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列によりコードされる蛋白質に翻訳される場合、コード配列は、細胞中の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００７７】
「転写および翻訳制御配列」は、宿主細胞中でコード配列の発現を提供する、プロモータ、エンハンサ、ターミネータ等をはじめとするＤＮＡ調節配列である。真核細胞中において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
【００７８】
「応答エレメント」という用語は、第一のキメラ遺伝子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用により媒介されるプロモータに応答性を与える、一種または二種以上のシス作用ＤＮＡエレメントを意味する。このＤＮＡエレメントは、その配列においてパリンドローム（完全または不完全）であるか、配列モチーフもしくは、可変の数のヌクレオチドにより分離されたハーフサイトからなることができる。ハーフサイトは類似または同一であり、さらに直接のもしくは逆反復として、または、単一のハーフサイトとして、もしくは隣接するハーフサイトが縦列に並んだマルチマーとして配されることができる。応答エレメントは、応答エレメントが組み込まれる細胞または生物体の性質に依存して、異なる生物から単離された最小プロモータを含んでよい。第１のハイブリッド蛋白質のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合して、この応答エレメントの制御下で下流遺伝子の転写を開始または抑制する。天然のエクジソン受容体の応答エレメントのためのＤＮＡ配列の例には：ＲＲＧＧ／ＴＴＣＡＮＴＧＡＣ／ＡＣＹＹ（Ｃｈｅｒｂａｓ Ｌ．ら著（１９９１年）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．第５巻、１２０〜１３１頁参照）；ＡＧＧＴＣＡＮ（ｎ）ＡＧＧＴＣＡ（ここで、Ｎ（ｎ）は一種または二種以上のスペーサーヌクレオチドとすることができる）（Ｄ’Ａｖｉｎｏ ＰＰ．ら著、（１９９５年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第１１３巻、１〜９頁参照）およびＧＧＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴ（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ Ｃ．ら著、（１９９４年）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．第１４巻、４４６５〜４４７４頁参照）が挙げられる。
【００７９】
「操作可能に結合」という用語は、単一核酸フラグメント状の核酸配列の関連であって、１つの機能が他の機能により影響されるものを意味する。例えば、そのプロモータがコード配列の発現に影響を与えることができる場合、プロモータはコード配列に操作可能に結合している（すなわち、コード配列がプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に操作可能に調節配列に結合することができる。
【００８０】
ここで用いられる「発現」という用語は、核酸またはポリヌクレオチドに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を意味する。発現は、ｍＲＮＡの蛋白質またはポリペプチドへの翻訳も意味する。
【００８１】
「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特定の制限部位において、または相同組換えにより、核酸もしくはポリヌクレオチド中に挿入することができるＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡのセグメントは、意図するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のために適当なリーディングフレーム中でのカセットの挿入を確実にするように設計される。「形質転換カセット」は、意図するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むと共に、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特定のベクターを意味する。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセットおよび形質転換カセットは、宿主細胞中において意図するポリペプチドをコードすポリヌクレオチドの発現を向上させることができるエレメントも含んでよい。これらのエレメントは、プロモータ、最小プロモータ、エンハンサ、応答エレメント、ターミネータ配列およびポリアデニル化配列等を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明の目的において、「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモータに関わる応答エレメントと、一種または二種以上のリガンドの存在下で応答エレメントおよびプロモータがその中に組み込まれる遺伝子の発現を調節する、ＥｃＲベース系との組み合わせを意味する。
【００８３】
「調節」という用語は、核酸もしくは遺伝子の発現を誘導、低下または抑制して、蛋白質またはポリペプチドの生成を、それぞれ誘導、低下または抑制することを意味する。
【００８４】
本発明によるプラスミドまたはベクターは、さらに、宿主細胞中で遺伝子の発現を引き起こすのに適した少なくとも一つのプロモータを含んでよい。「発現ベクター」という用語は、宿主への形質転換に続いて、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。クローンされた遺伝子、すなわち、挿入された核酸配列は、通常、プロモータ、最小プロモータまたはエンハンサ等の制御エレメントの制御下に置かれる。所望の宿主細胞中で核酸の発現を起こすのに有用な、開始制御領域またはプロモータは種々あり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動することができる実質的にいかなるプロモータも本発明に適しており、限定はされないが以下のものがある：ウイルスプロモータ、バクテリアプロモータ、動物プロモータ、哺乳動物プロモータ、合成プロモータ、構成的プロモータ、組織特異的プロモータ、発生特異的プロモータ、誘導性プロモータ、光調節プロモータ；ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、アルカリホスファターゼプロモータ（サッカロマイセス属中での発現に有用である）；ＡＯＸ１プロモータ（ピヒア属中での発言に有用である）；ｂ−ラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７，ｔａｃおよびｔｒｃプロモータ（大腸菌中での発現に有用である）；光制御された、種特異的、花粉特異的、卵巣特異的、病原性または疾患に関連したカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ３５Ｓ最小ウイルス、カッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質、リブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ、茎特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロバシリフォーム（ｔｕｎｇｒｏ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ）ウイルス、植物スーパープロモータ、ポテトロイシンアミノペプチダーゼ、ナイトレートレダクターゼ、マンノピンシンセターゼ、ノパリンシンセターゼ、ユビキチン、ゼイン蛋白質、およびアントシアニンプロモータ（植物細胞中での発現に有用である）；また、当該分野で知られている動物および哺乳動物プロモータには、限定はされないが以下のものがある：ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモータ領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）中に含まれるプロモータ、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａのプロモータまたは主要後期プロモータ（ＭＬＰ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期プロモータ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ、バキュロウイルスＩＥ１プロモータ、伸長因子１α（ＥＦ１）プロモータ、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモータ、アルブミンプロモータ、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモータおよび転写制御領域の調節配列、ユビキタスプロモータ（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリン等）、中間フィラメント（デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ等）のプロモータ、治療遺伝子（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ型因子、等の）のプロモータ、病原性もしくは疾患関連プロモータ、および組織特異性を示すと共にトランスジェニック動物中において利用されているプロモータ、例えば、膵臓腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ細胞中で活性なイムノグロブリン遺伝子制御領域、睾丸、乳房、リンパおよび肥満細胞中で活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域；アルブミン遺伝子、肝臓中で活性なＡｐｏ ＡＩおよびＡｐｏ ＡＩＩ制御領域、肝臓中で活性なα−フェト蛋白質遺伝子制御領域、肝臓中で活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域、ミエローマ細胞中で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域、脳内の希突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルベートキナーゼプロモータ、ビリンプロモータ、脂肪酸結合性腸蛋白質のプロモータ、平滑筋細胞α−アクチンのプロモータ等。さらに、これらの発現配列は、エンハンサまたは調節配列等の追加により改変することができる。
【００８５】
本発明の実施形態で用いることができるエンハンサには、限定はされないが、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサ、伸長因子１（ＥＦ１）エンハンサ、酵母エンハンサ、ウイルス遺伝子エンハンサ等がある。
【００８６】
終止制御領域、すなわち、ターミネータまたはポリアデニル化配列は、好ましい宿主本来の種々の遺伝子に由来しうる。任意に、終止部位は、不必要であることができるが、しかし、含まれる場合は、最も好ましい。本発明の好ましい実施形態では、終止制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルス性ターミネータ配列等に含まれるか、またはこれらに由来しうる。
【００８７】
「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」という用語は、コード配列の下流（３’）に配されるＤＮＡ配列をいい、ポリアデニル化［ポリ（Ａ）］認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼす能力のある制御シグナルをコードする他の配列を含みうる。ポリアデニル化シグナルは、通常には、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端に、ポリアデニル酸区域を加えることに作用することによって特徴付けられる。
【００８８】
「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、元来特定の核酸（相同領域）を発現する配列を含みうるか、または異なる蛋白質もしくは合成蛋白質（異種領域）までも発現する、異なる起源の配列を含みうる。特に、配列は、特異的または非特異的手段で、誘導性または非誘導性手段で、遺伝子の転写を刺激または抑制する、原核生物、真核生物、もしくはウイルスの遺伝子の配列、またはこれらに由来する配列であり得る。調節領域は、複製の起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモータ、エンハンサ、転写終止配列、および標的細胞の分泌経路にポリペプチドを向かわせるシグナル配列を含む。
【００８９】
「異種起源」からの調節領域は、発現される核酸と本来は関連しない調節領域である。異種調節領域の中に含まれるのは、異なる種からの調節領域、異なる遺伝子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には生じないが、しかし当業者によって設計された調節配列である。
【００９０】
「ＲＮＡ転写産物」は、ＲＮＡポリメラーゼで触媒されたＤＮＡ配列の転写から生じる生成物に相当する。ＲＮＡ転写産物が、そのＤＮＡ配列の完全な相補的複写物である場合、それは、一次転写産物と称されるか、または一次転写産物の転写後のプロセシングに由来するＲＮＡ配列であることができ、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、細胞によって蛋白質に翻訳されうるＲＮＡに相当する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補であり、それに由来する二本鎖ＤＮＡに相当する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、それにより細胞により蛋白質に翻訳されうるＲＮＡ転写産物に相当する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写産物に相当する。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列に相補的であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはまだ翻訳されておらず、細胞のプロセスに効果を示す他のＲＮＡに相当する。
「ポリペプチド」は、共有結合で結合されたアミノ酸残基から構成される重合性化合物である。アミノ酸は、以下の一般構造：
【化１】
Figure 2004527223
を示す。アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２）水酸（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性基またはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香族環を含む側鎖、および（７）側鎖が、アミノ基に融合されるイミノ酸であるプロリン。本発明のポリペプチドは、好ましくは少なくとも約１４のアミノ酸を含む。
【００９１】
「蛋白質」は、生きている細胞で構造的または機能的役割を果たすポリペプチドである。
【００９２】
「単離されたポリペプチド」または「単離された蛋白質」は、天然の状態でそれらと正常に関連している化合物（例えば、他の蛋白質またはポリペプチド、核酸、炭化水素、脂質）を実質的に含まないポリペプチドまたは蛋白質である。「単離された」とは、他の化合物との人工的もしくは合成混合物、または生物学的活性に干渉せず、例えば、不完全な精製、安定化剤の添加、または医薬上許容しうる標品へのコンパウンド化により存在しうる不純物の存在を排除することは意図されない。
【００９３】
本発明によるポリペプチドの「フラグメント」は、そのアミノ酸配列が、参照ポリペプチドの配列より短く、これらの参照ポリペプチドを示す全体にわたる部分で同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意図すると解釈される。このようなフラグメントは、適切な場合、それらが一部である大型ポリペプチドに含まれうる。本発明によるポリペプチドのこのようなフラグメントは、少なくとも２−３００個のアミノ酸の長さを有しうる。
【００９４】
ポリペプチドまたは蛋白質の「変種」は、ポリペプチドまたは蛋白質に由良医し、そのポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも１つの生物学的特性を保持する任意のアナログ、フラグメント、誘導体または変異体である。ポリペプチドまたは蛋白質の様々の変種は、天然に存在しうる。これらの変種は、蛋白質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における差によって特徴付けられる対立遺伝子変種であり得るか、または異なるスプライシングまたは翻訳後の修飾を包含しうる。当業者は、単数または複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変種を生じさせることができる。これらの変種は、とりわけ：（ａ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、保存的または非保存的アミノ酸で置換される変種、（ｂ）１つまたはそれ以上のアミノ酸が、ポリペプチドまたは蛋白質に付加される変種、（ｃ）１つまたはそれ以上のアミノ酸が、置換基を含む変種、および（ｄ）ポリペプチドまたは蛋白質が、血漿アルブミンのような別のポリペプチドと融合される変種が挙げられうる。遺伝的（抑制、欠失、突然変異など）、化学的、および酵素的技術を含むこれらの変種を得るための技術は、当業者に知られている。変種ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも約１４のアミノ酸を包含する。
【００９５】
「異種蛋白質」は、細胞中に天然には産生されない蛋白質に相当する。
【００９６】
「成熟蛋白質」は、翻訳後に加工されたポリペプチド、すなわち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレ−またはプロペプチドがそれから取り除かれたものに相当する。「前駆体」蛋白質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物に相当し、すなわちプレ−およびプロペプチドがまだ存在する。プレ−およびプロペプチドは、それに限定されないが、細胞内局在シグナルでありうる。
【００９７】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌される成熟蛋白質に先立つアミノ末端ポリペプチドに相当する。シグナルペプチドは、成熟蛋白質から切断され、したがって、成熟蛋白質に存在しない。シグナルペプチドは、分泌される蛋白質を細胞膜を越えるように向かわせ、トランスロケートさせる機能を示す。シグナルペプチドは、シグナル蛋白質とも称される。
【００９８】
「シグナル配列」は、細胞の表面に発現されるべき蛋白質のコード配列の先頭に含まれる。この配列は、成熟ポリペプチドに対するＮ−末端であり、宿主細胞に、ポリペプチドをトランスロケートさせるシグナルペプチドをコードする。用語「トランスロケーションシグナル配列」は、この種のシグナル配列に言及するためにここで使用される。トランスロケーションシグナル配列は、真核生物および原核生物に本来的な多様な蛋白質に関連することが分かっており、しばしば、両方の型の生物体で機能性である。
【００９９】
「相同性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性の割合に相当する。一方からの配列と他方の間の対応は、当該技術分野で知られる技術によって決定されうる。例えば、相同性は、配列情報を並べ、容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することによって、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定されうる。代替的には、相同性は、相同領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下での、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた消化および消化されたフラグメントのサイズ測定によって決定されうる。
【０１００】
ここで使用される場合、全ての文法的形態および語尾変化を含む「相同な」という用語は、「共通の進化起点」を保有する蛋白質の間の関係に相当し（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ ５０巻：６６７頁、１９８７年）、前記蛋白質にはスーパーファミリー（例えば、イムノグロブリンスーパーファミリー）からの蛋白質、および異なる種からの相同蛋白質（例えば、ミオシン軽鎖等）を含む。このような蛋白質（およびそれらのコード遺伝子）は、それらの高度の配列類似性によって反映されるように、配列相同性を示す。しかし、一般的用語で、本出願で、「高度に」のような副詞で修飾される場合、「相同な」という用語は、配列類似性に相当しうるものであるが、共通の進化起点には相当しない。
【０１０１】
したがって、それの全ての文法的形態において「配列類似性」という用語は、共通の進化起点を有していても、有していなくてもよい蛋白質の核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または対応の程度に相当する（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ ５０巻：６６７頁、１９８７年参照）。
【０１０２】
特定の実施形態において、２つのＤＮＡ配列が、少なくとも約５０％（好ましくは、少なくとも約７５％、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドが、定義された長さのＤＮＡ配列にわたり合致するときに、「実質的に相同な」または「実質的に類似な」ものである。実質的に相同である配列は、配列データバンクで、入手可能な標準ソフトウエアを用いて配列を比較することによって、または例えば、その特定の系について定義されるストリンジェンシー条件下でのサザン・ハイブリダイゼーション実験において同定されうる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業界の技術の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、１９８９年参照。
【０１０３】
ここで用いられる「実質的に類似な」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基における変化が、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換を生じるが、しかし、ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質の機能上の特性に影響を及ぼさない核酸フラグメントに相当する。「実質的に類似な」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基における変化が、アンチセンスまたは同時抑制技術による遺伝子発現の改変を仲介する核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フラグメントにも相当する。「実質的に類似な」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの改変であって、生じる転写産物の機能上の特性に実質的に影響を及ぼさないにも相当する。したがって、本発明は、特定の代表的な配列以上のものを包含することが理解される。コードされた産物の生物学的活性の維持を決定するものである、提案される改変の各々は、充分に、当業界の日常技術の範囲内のものである。
【０１０４】
さらに、当業者は、本発明によって包含される実質的に類似な配列が、ここに例示される配列を用いて、ストリンジェンシー条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される）下でハイブリダイズする能力によっても定義されることを認識する。本発明の実質的に類似な核酸フラグメントは、そのＤＮＡ配列が、ここに報告される核酸フラグメントのＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％同一である核酸フラグメントである。好ましい、本発明の実質的に類似の核酸フラグメントは、そのＤＮＡ配列が、ここに報告される核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも８０％同一である核酸フラグメントである。さらに好ましい核酸フラグメントは、ここに報告される核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である。いっそうさらに好ましいのは、ここに報告される核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一である核酸フラグメントである。
【０１０５】
２つのアミノ酸配列は、そのアミノ酸の約４０％より多くが同一であるか、または６０％より多くが類似（機能的に同一）である場合に「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同な配列は、例えば、ＧＣＧ（ジェネティックス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、ＧＣＧパッケージについてのプログラムマニュアル、バージョン７、ウイスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））パイルアッププログラムを用いた配列比較によって同定される。
【０１０６】
「に対応する」という用語は、正確な位置が、類似性または相同性が測定される分子と同一であるか、または異なるかにかかわらず、類似または相同な配列に言及するためにここで使用される。核酸またはアミノ酸配列の配列比較は、スペースを包含しうる。したがって、「に対応する」という用語は、配列類似性に相当するが、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングには相当しない。
【０１０７】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」は、当業者による配列の手動評価によるか、またはＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３−４１０頁；さらにｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／参照）のようなアルゴニズムを用いたコンピュータ自動化配列比較および同定によるかのいずれかで、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列、または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、１０またはそれ以上の隣接するアミノ酸または３０またはそれ以上のヌクレオチドの配列は、公知蛋白質または遺伝子と相同である、ポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するために必須である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、２０−３０の隣接するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブは、遺伝子同定（例えば、サザン・ハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークのインサイチューハイブリダイゼーション）の配列依存的方法で使用されうる。さらに、１２−１５の塩基の短オリゴヌクレオチドは、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るために、ＰＣＲにおいて増殖プライマーとして使用されうる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、その配列を含む核酸フラグメントを特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を包含する。
【０１０８】
当業界で知られるとおり、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することによって決定されるとおり、２個またはそれ以上のポリペプチド配列または２個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当業界では、「同一性」は、一連のこのような配列の間の合致によって測定されるとおり、場合によって、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は、それに限定されないが、「コンピュータ処理分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８８年）；「バイオコンピューティング：インフォーマチックス・アンド・ゲノム・プロジェクツ（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９３年）；配列データのコンピュータ解析、パートＩ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，ＰａｒｔＩ）（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）（１９９４年）；分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（１９８７年）；および配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９１年）に記述されるものを含めた公知方法によって容易に計算されうる。同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列の間の最高の合致を示すように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムで体系付けられる。配列比較および同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマチックス・コンピュタ処理スーツのメガリン（Ｍｅｇａｌｉｎ）プログラム（ディーエヌエイスター，インク．（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、ウイスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いて行われうる。その配列の複数配列比較は、デフォルト・パラメータ（ギャップペナルティー＝１０、ギャップレングスペナルティー＝１０）を用いた配列比較のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）方法を用いて行われうる（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９年）ＣＡＢＩＯＳ．５巻：１５１〜１５３頁）。クラスタル方法を用いた一対の配列比較についてのデフォルト・パラメータが選択されうる：ＫＴＵＰＬＥ１、ギャップペナルティー＝３、ウインドウ＝５およびダイアゴナルズセーブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５。
【０１０９】
「配列解析ソフトウエア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析のために有用である任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウエアプログラムに相当する。「配列解析ソフトウエア」は、市販で入手可能であるか、または独立に開発されうる。典型的配列解析ソフトウエアとしては、それに限定されないが、ＧＣＧセットのプログラム（ウィスコンシン・パッケージ・バージョン９．０、ジェネティックス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）、ウイスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ディーエヌエイスター，インク．（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）、米国５３７１５、ウイスコンシン州マディソン、エス・パーク・ストリート１２２８（１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１５ＵＳＡ））が挙げられる。本出願の内容の範囲内で、配列解析ソフトウエアが解析のために使用される場合、その解析の結果は、特に指示されない限り、引用されたプログラムの「デフォルト値」に基づくことが分かる。ここで用いられる「デフォルト値」は、最初に初期化されるときに、ソフトウエアで最初に起動する任意の値またはパラメータのセットを意味する。
【０１１０】
「合成遺伝子」は、当業者に知られる手段を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構築ブロックから組立てられうる。これらの構築ブロックは、連結され、アニールされて、次いで酵素的に組み立てて、遺伝子セグメントを形成し、全遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関連した場合に、「化学的に合成される」とは、構成要素ヌクレオチドが、インビトロで組立てられることを意味する。ＤＮＡの手動の化学的合成は、十分に樹立された手段を用いて達成されるか、または自動化された化学的合成は、多数の市販で入手可能な機械の内の１つを使用して行われうる。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスに反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいた最適な遺伝子発現のために適合させられ得る。当業者は、コドン用法が、宿主に好まれるコドンに偏らされる場合、好結果の遺伝子発現の可能性を認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づきうる。
【０１１１】
ここで用いられる場合、２個またはそれ以上の個々に操作可能な遺伝子調節系は、ａ）選択された濃度で、その個別のリガンドによる与えられた系の各々の調節が、その系の遺伝子の発現の規模に測定可能な変化を生じさせ、ｂ）その変化が、実際の調節の同時性または連続性に関係なく、細胞、組織または生物体において同時に操作可能な他の全ての系の発現における変化と統計学的に有意に異なる場合、「オルトゴナル」と言われる。好ましくは、各々の個々に操作可能な遺伝子調節系の調節は、細胞、組織または生物体での他の全ての操作可能な系より少なくとも２倍大きい、遺伝子発現における変化を引き起こす。さらに好ましくは、その変化は、少なくとも５倍大きい。さらにいっそう好ましくは、その変化は、少なくとも１０倍大きい。なおいっそう好ましくは、その変化は、１００倍大きい。さらになおいっそう好ましくは、その変化は、少なくとも５００倍大きい。理想的には、選択された濃度で、その個別のリガンドによる与えられた系の各々の調節は、その系の遺伝子の発現の規模に測定可能な変化を生じさせ、細胞、組織または生物体で操作可能な他の全ての系の発現における測定可能な変化を生じさせない。このような場合に、複数誘導性遺伝子調節系は、「十分にオルトゴナル」であると言われる。
【０１１２】
本発明の複数遺伝子発現調節系
ここで使用される場合、出願人らの発明は、同じ細胞、組織または生物体中の二種またはそれ以上の異なる遺伝子の同時および定量的制御を可能にする複数誘導性遺伝子調節系を提供する。出願人らは、受容体ベースの系が、改変され、組合されて、複数の個々に操作可能な遺伝子調節系を含む複数誘導性遺伝子調節系を作成しうることを見出した。
【０１１３】
特定の実施形態では、複数誘導性遺伝子調節系は、個々に操作可能な遺伝子調節系を含み、
ａ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が、
ｉ）Ａ）ＤＮＡ結合ドメイン：
Ｂ）リガンド結合ドメインおよび
Ｃ）トランス活性化ドメイン：
を含む受容体複合体をコードする一種以上のポリヌクレオチド：
ｉｉ）リガンド
ｉｉｉ）Ａ）外因性または内因性遺伝子および
Ｂ）応答エレメント
を含むポリヌクレオチド：
を含み、ここで、
Ａ）外因性または内因性遺伝子は応答エレメントの制御下にあり；さらに
Ｂ）リガンドの存在または非存在下における、応答エレメントへのＤＮＡ結合ドメインの結合が、遺伝子の活性化または抑制を生じさせ；さらに
ｂ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が、複数誘導性遺伝子調節系中に存在する他の個々に操作可能な遺伝子調節系に対してオルトゴナルである、
前記遺伝子調節系。
【０１１４】
別の実施形態では、出願人らの発明は、複数の個々に操作可能な遺伝子調節系を含む複数誘導性遺伝子調節系であって、
ａ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が
ｉ）Ａ）ＤＮＡ結合ドメイン；
Ｂ）リガンド結合ドメイン；および
Ｃ）トランス活性化ドメイン；
を含む一種以上の受容体複合体；
ｉｉ）リガンド；
ｉｉｉ）Ａ）外因性または内因性遺伝子；および
Ｂ）応答エレメント；
を含むポリヌクレオチド
を含み、ここで、
Ａ）外因性または内因性遺伝子は応答エレメントの制御下にあり；さらに
Ｂ）リガンドの存在または非存在下における、応答エレメントへのＤＮＡ結合ドメインの結合が、遺伝子の活性化または抑制を生じさせ；さらに
ｂ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が、複数誘導性遺伝子調節系に存在する他の個々に操作可能な遺伝子調節系に対してオルトゴナルである、
前記遺伝子調節系を提供する。
【０１１５】
出願人らは、核受容体が、本発明の複数誘導性遺伝子発現系で使用するための好ましい受容体であることを見出した。好ましい核受容体としては、Ｈ群核受容体が挙げられる。さらに好ましい核受容体としては、エクジソン受容体が挙げられる。
【０１１６】
天然には、ＥｃＲ制御系は、昆虫における脱皮および他の発生過程を制御する、ステロイドホルモンである２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）のパルスを利用する。２０Ｅは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）およびウルトラスパイラクル（ＵＳＰ）を含むヘテロ二量体蛋白質複合体を通してそのシグナルを変換する。ＥｃＲは、それらのプロモータに存在するエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）に結合することによって、エクジソン応答性遺伝子の発現を制御する。ＥｃＲｃＤＮＡは、キイロショウジョウバエから最初にクローン化された。ＥｃＲおよびＵＳＰの両方は、それらが、特徴的ドメイン：Ａ／Ｂ（トランス活性化）、Ｃ（ＤＮＡ結合）、Ｄ（ヒンジ）、およびＥ（リガンド結合）を含むような、核受容体スーパーファミリーのメンバーであることが見出された。全体的に、２０個のＥｃＲ配列が、昆虫、カニおよびマダニ種（以下参照）からクローン化された。これらのｃＤＮＡから得られる推定アミノ酸配列の比較は、６６のアミノ酸ＤＮＡ結合ドメインが、ＥｃＲの中で十分に保存されるのに対して、Ａ／Ｂ、ＤおよびＦドメインが、非常に十分には保存されないことを示した。リガンド結合ドメイン中の重要な残基が、十分に保存される。ＥｃＲ配列のグループ内でのリガンド結合ドメインにおいては約９０％アミノ酸類似性があるが、しかし、これは、２つの群の間で比較された場合、５０−６０％に下がる。
【０１１７】
したがって、出願人らの複数誘導性遺伝子発現系で使用するための好ましい受容体としては、核受容体が挙げられ、さらに好ましい受容体としては、エクジソン受容体、ユビキタス（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用蛋白質−１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）からなる群から選択されるＨ群核受容体が挙げられる；さらにいっそう好ましい受容体としては、エクジソン受容体が挙げられる。
【０１１８】
本発明は、遺伝子発現レベルの調節が望まれる、遺伝子治療、蛋白質および抗体の大規模生産、細胞ベースの高処理能スクリーニングアッセイ、オルトゴナルリガンドスクリーニングアッセイ、機能性ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、バイオセンサー、およびトランスジェニック生物体での特徴の制御のような用途に有用である。出願人らの発明の利点は、それが、複数遺伝子の発現を調節し、使用者の要求に適応する発現レベルに合わせる手段を提供することである。
【０１１９】
特に、出願人らは、ここで、少なくとも二種の個々に操作可能な遺伝子発現系を含む新規複数誘導性遺伝子発現系を記述する。個々に操作可能な遺伝子発現系の各々は、少なくとも、応答エレメント、発現されるべき目的のポリヌクレオチドまたは遺伝子に操作的に結合されたプロモータ、発現されるべき目的の遺伝子のポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセットを含む。第１の遺伝子発現カセットの誘導は、少なくとも第２の遺伝子発現カセットを用いて達成されうる。
【０１２０】
特定の実施形態では、第２の遺伝子発現カセットは、第１の遺伝子発現カセットの応答エレメントを結合するＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、第１の遺伝子発現カセットのプロモータをトランス活性化するトランス活性化ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む。この実施形態は、目的のポリヌクレオチドまたは遺伝子を含む第１の遺伝子発現カセットを発現させる「シングルスイッチ」ベースの遺伝子発現系を使用する。「シングルスイッチ」ベースの遺伝子発現系は、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインが、１つのコードされたポリペプチド上にあるものである。
【０１２１】
代わりに、遺伝子発現調節系は、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインが、２つの異なるコードされたポリペプチド上に配置される、「デュアルスイッチ」または「２−ハイブリッド」ベースの遺伝子発現調節系でありうる。この特定の実施形態では、第１の遺伝子発現カセットの誘導は、少なくとも第２の遺伝子発現カセットおよび第３の発現カセットを使用して達成されうる。好ましくは、第２の遺伝子発現カセットは、第１の遺伝子発現カセットの応答エレメントを結合するＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する；および第３の遺伝子発現カセットは、第１の遺伝子発現カセットのプロモータをトランス活性化するトランス活性化ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
【０１２２】
好ましい実施形態では、本発明の複数誘導性遺伝子発現系は、少なくとも２つの遺伝子発現調節系を含み、各々の操作可能な遺伝子発現調節系が、
ａ）ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべきである遺伝子と関連した応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、
ｉｉ）リガンド、および
ｉｉｉ）Ａ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインによって認識される応答エレメント；Ｂ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインによって活性化されるプロモータ；およびＣ）その発現が調節されるべきである遺伝子を含む第２の遺伝子発現カセット；
ｂ）
ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現を調節すべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、
ｉｉ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、および、２つのポリペプチドフラグメントを含むキメラリガンド結合ドメインであって、第１のポリペプチドフラグメントが脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものであり、また、第２のポリペプチドフラグメントが異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものである、第２のポリペプチドフラグメントものである当該キメラリガンド結合ドメインからなる群より選択される第２の核受容体リガンド結合ドメイン、
ｉｉｉ）リガンド、および
ｉｖ）Ａ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現が調節される遺伝子を含む第２の遺伝子発現カセット；または
ｃ）
ｉ）その発現が調節される遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、
ｉｉ）トランス活性化ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセット、
ｉｉｉ）リガンド、および
ｉｖ）Ａ）第１の遺伝子発現カセットの第１のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）第２の遺伝子発現カセットの第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現が調節される遺伝子、を含む第３の遺伝子発現カセット
を含み；
ｃ）ｉ）またはｃ）ｉｉ）の核受容体リガンド結合ドメインの一つがＨ群核受容体リガンド結合ドメインである、前記遺伝子発現調節系。
【０１２３】
別の好ましい実施形態では、本発明の複数誘導性遺伝子発現系は、少なくとも２つの遺伝子発現調節系を含み、ここで、操作可能な遺伝子発現調節系の各々が、
ａ）
ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節される遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、
ｉｉ）リガンド、および
ｉｉｉ）Ａ）ａ）ｉ）のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）ａ）ｉ）のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現が調節される遺伝子を含む遺伝子発現カセット；
ｂ）
ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現を調節すべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、
ｉｉ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、および、２つのポリペプチドフラグメントを含むキメラリガンド結合ドメインであって、第１のポリペプチドフラグメントが脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものであって、第２のポリペプチドフラグメントが、異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものである、前記キメラリガンド結合ドメインからなる群より選択される第２の核受容体リガンド結合ドメイン、
ｉｉｉ）リガンド、および
ｉｖ）Ａ）ｂ）ｉ）のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）ｂ）ｉ）のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現を調節すべき遺伝子
を含む遺伝子発現カセット；または
ｃ）
ｉ）その発現を調節すべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチド、
ｉｉ）トランス活性化ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチド、
ｉｉｉ）リガンド、および
ｉｖ）Ａ）ｃ）ｉ）の第１のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）ｃ）ｉｉ）の第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現を調節すべき遺伝子、を含む遺伝子発現カセット
を含み；
ｃ）ｉ）またはｃ）ｉｉ）の核受容体リガンド結合ドメインの一つがＨ群核受容体リガンド結合ドメインである、前記遺伝子発現調節系。
【０１２４】
好ましい実施形態では、遺伝子発現調節系が、Ｃ）を含む場合、第１のポリペプチドは、トランス活性化ドメインを実質的に含まず、さらに第２のポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを実質的に含まない。本発明の目的のために、「実質的に含まない」とは、問題となっている蛋白質が、活性化または結合活性を提供するのに充分な問題となっているドメインの配列を含まないことを意味する。一方の核受容体リガンド結合ドメインのみが、Ｈ群リガンド結合ドメインである場合、他方の核受容体リガンド結合ドメインは、Ｈ群リガンド結合ドメインを有する二量体を形成する任意の他の核受容体から得られうる。例えば、Ｈ群核受容体リガンド結合ドメインが、エクジソン受容体リガンド結合ドメインである場合、他方の核受容体リガンド結合ドメイン（「パートナー」）は、エクジソン受容体、脊椎動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、無脊椎動物ＲＸＲ、ウルトラスパイラクル蛋白質（ＵＳＰ）、またはキメラ核受容体：当該キメラ核受容体は、脊椎動物ＲＸＲ、無脊椎動物ＲＸＲ、およびＵＳＰ（共に係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９０５０号、米国特許出願第６０／２９４，８１４号および米国特許出願第６０／２９４，８１９号参照、それらの全体は本明細書の一部として参照される）からなる群から選択される少なくとも２つの異なる核受容体リガンド結合ドメイン・ポリペプチドフラグメントを含むものであり得る。「パートナー」核受容体リガンド結合ドメインは、さらに、切断突然変異、欠失突然変異、置換突然変異、または別の改変を含みうる。
【０１２５】
好ましくは、脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、ヒト ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス ムスムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット ラツスノルベジクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ニワトリ ガルスガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ブタ サススクロファドメスチカ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、カエル キセノプスレビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、ゼブラフィッシュ ダニオレリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、マグロ ポリアンドロカルパミサキエンシス（Ｐｏｌｙａｎｄｒｏｃａｒｐａ ｍｉｓａｋｉｅｎｓｉｓ）、またはクラゲ トリペダリアシソフォラ（Ｔｒｉｐｅｄａｌｉａ ｃｙｓｏｐｈｏｒａ）ＲＸＲから由来する。
【０１２６】
好ましくは、無脊椎動物ＲＸＲリガンド結合ドメインは、バッタ ロカスタミグラトリア（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）ウルトラスパイラクルポリペプチド（「ＬｍＵＳＰ」）、マダニ科マダニ アンブリオマアメリカヌム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ＲＸＲ相同体１（「ＡｍａＲＸＲ１」）、マダニ科マダニ アンブリオマアメリカヌム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ＲＸＲ相同体２（「ＡｍａＲＸＲ２」）、シオマネキ セルカプジレーター（Ｃｅｌｕｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ）ＲＸＲ相同体（「ＣｐＲＸＲ」）、甲虫 テネブリオモリター（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ）ＲＸＲ相同体（「ＴｍＲＸＲ」）、ミツバチ アピスメリフェラ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＲＸＲ相同体（「ＡｍＲＸＲ」）、アブラムシ ミズスペルシカエ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）ＲＸＲ相同体（「ＭｐＲＸＲ」）、または非双翅目／非鱗翅目のＲＸＲ相同体から由来する。２００１年５月３１日に提出され、全体が本明細書の一部として参照される、共に係属中の米国特許仮出願第６０／２９４，８１４号参照。
【０１２７】
好ましくは、キメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、脊椎動物種ＲＸＲポリペプチドフラグメント、無脊椎動物種ＲＸＲポリペプチドフラグメント、および非双翅目／非鱗翅目無脊椎動物種ＲＸＲ相同体ポリペプチドフラグメントから構成される群から選択される少なくとも２つのポリペプチドフラグメントを含む。本発明に使用するためのキメラＲＸＲリガンド結合ドメインは、少なくとも２つの異なる種のＲＸＲポリペプチドフラグメントを含み得るか、または種が同じである場合、２つまたはそれ以上のポリペプチドフラグメントは、その種のＲＸＲポリペプチドフラグメントの２つまたはそれ以上の異なるアイソフォームから由来しうる。２００１年５月３１日に提出され、全体が本明細書の一部として参照される、共に係属中の米国特許仮出願第６０／２９４，８１４号参照。
【０１２８】
特定の実施形態では、その発現が調節されるべきである遺伝子は、宿主細胞に関して相同な遺伝子である。別の特定の実施形態では、その発現が調節されるべきである遺伝子は、宿主細胞に関して異質な遺伝子である。
【０１２９】
好ましくは、ハイブリッド遺伝子スイッチを提供する１つまたはそれ以上の受容体ドメインは、変化させられる。一般に、３つのドメインＤＢＤ、ＬＢＤおよびトランス活性化ドメインの内の１つまたはそれ以上は、他のドメインの起源と異なる起源から選択されることができ、その結果、ハイブリッド遺伝子および生じるハイブリッド蛋白質は、トランス活性化活性、リガンドの相補的結合、および特異的な応答エレメントの認識について、選択される宿主細胞または生物体で最適化される。さらに、応答エレメントそれ自身を、酵母から得られるＧＡＬ−４蛋白質（Ｓａｄｏｗｓｋｉら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ，３３５巻：５６３〜５６４頁参照）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｋｉａ ｃｏｌｉ）から得られるＬｅｘＡ蛋白質（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ（１９８５年）、Ｃｅｌｌ、４３巻：７２９〜７３６頁参照）のような他のＤＮＡ結合蛋白質ドメインについての応答エレメントで、またはこのような特異的相互作用のために設計、改変および選択された蛋白質との標的にされた相互作用に特異的な合成応答エレメント（例えば、Ｋｉｍら（１９９７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９４巻：３６１６〜３６２０頁参照）で改変または置換して、ハイブリッド受容体を適応させうる。２つのハイブリッド・系の別の利点は、それらが、所望の最終結果に従った遺伝子発現を起こさせるために使用されるプロモータの選択を可能にすることである。このような二重制御は、発現のタイミングおよび発現が起こる細胞の両方が制御されうるので、特に細胞毒性蛋白質が産生される場合に、遺伝子治療の領域で、特に重要でありうる。適切なプロモータに操作可能に結合された遺伝子が、目的の細胞に導入される場合、外因性遺伝子の発現は、本発明の系の存在によって制御される。プロモータは、構成的に、または誘導的に制御されうるか、または組織特異的（すなわち、特定の型の細胞でのみ発現される）または生物体の特定の発生段階に特異的でありうる。
【０１３０】
本発明のエクジソン受容体ベースの遺伝子発現調節系は、ヘテロ二量体およびホモ二量体性のいずれかでありうる。機能的ＥｃＲ複合体は、一般に、ステロイド受容体ファミリーの２つのメンバー、種々の昆虫から得られるエクジソン受容体蛋白質、およびウルトラスパイラクル（ＵＳＰ）蛋白質またはＵＳＰの無脊椎動物相同体レチノイドＸ受容体蛋白質からなるヘテロ二量体性蛋白質複合体、（Ｙａｏら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ ３６６巻、４７６〜４７９頁；Ｙａｏら、（１９９２年）Ｃｅｌｌ ７１巻、６３〜７２頁参照）に相当する。しかし、複合体は、下に詳述されるとおりホモ二量体でもありうる。機能的エクジステロイド受容体複合体は、イムノフィリンのような追加の蛋白質も含みうる。転写因子（ＤＨＲ３８またはベータＦＴＺ−１のような）として知られるステロイド受容体ファミリーの蛋白質の追加のメンバーは、ＥｃＲ、ＵＳＰ、および／またはＲＸＲについてのリガンド依存的なまたは独立のパートナーでもありうる。さらに、コアクチベーター（アダプタまたはメディエータとしても称される）として一般に知られる蛋白質のような他の補因子が、要求されうる。これらの蛋白質は、ＤＮＡに配列特異的に結合せず、ベースの転写に関係しない。それらは、クロマチン構造に影響を及ぼすことによるか、またはアクチベーター−開始複合体相互作用を仲介することによって、アクチベーターのＤＮＡ結合の刺激を含めた種々の機構を通して転写活性化における効果を及ぼしうる。このようなコアクチベーターの例としては、ＲＩＰ１４０、ＴＩＦ１、ＲＡＰ４６／Ｂａｇ−１、ＡＲＡ７０、ＳＲＣ−１／ＮＣｏＡ−ｌ、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ／ＮＣｏＡ−２、ＡＣＴＲ／ＡＩＢ１／ＲＡＣ３／ｐＣＩＰ並びにプロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｏｕｓ）コアクチベーターＣ応答エレメントＢ結合蛋白質、ＣＢＰ／ｐ３００（レビューについては、Ｇｌａｓｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９巻：２２２〜２３２頁、１９９７年参照）が挙げられる。さらに、コリプレッサー（リプレッサー、サイレンサーまたはサイレンシング・メディエータとしても知られる）として一般に知られる蛋白質補因子は、リガンドの不在下で効果的に転写活性化を阻害するために要求されうる。これらのコリプレッサーは、非リガンド化エクジソン受容体と相互作用し、応答エレメントでの活性を沈黙させうる。最近の証拠は、リガンドの結合が、受容体のコンホメーションを変化させ、それが、コリプレッサーの放出および上述のコアクチベーターの補充を生じさせ、それによりそれらのサイレンス活性を根絶することを示唆する。コリプレッサーの例としては、Ｎ−ＣｏＲおよびＳＭＲＴ（レビューについては、Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０巻：１１６７−１１７７頁、１９９６年参照）が挙げられる。これらの補因子は、細胞または生物体内で内因性でありうるか、または制御もしくは制御されない様式のいずれかで発現されるべき導入遺伝子として外因的に添加されうるかのいずれかである。エクジソン受容体蛋白質、ＵＳＰまたはＲＸＲのホモ二量体複合体は、ある種の環境下でも機能性がありうる。
【０１３１】
エクジソン受容体複合体としては、一般に、全メンバーが、一般に、アミノ末端トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）、およびヒンジ領域によりＤＢＤから分離されたリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）の存在によって特徴付けられる、核受容体スーパーファミリーのメンバーである蛋白質が挙げられる。ここで用いられる「ＤＮＡ結合ドメイン」という用語は、ＤＮＡ結合ドメインは、特定の応答エレメントと関連して機能する限り、ＤＮＡ結合蛋白質の全長まで、ＤＮＡ結合蛋白質の最小ポリペプチド配列を含む。核受容体スーパーファミリーのメンバーは、４個または５個のドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよびある種のメンバーでは、Ｆ（米国特許第４，９８１，７８４号およびＥｖａｎｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０巻：８８９〜８９５頁（１９８８年）参照）の存在によっても特徴付けられる。「Ａ／Ｂ」ドメインは、トランス活性化ドメインに対応し、「Ｃ」は、ＤＮＡ結合ドメインに対応し、「Ｄ」は、ヒンジ領域に対応し、「Ｅ」は、リガンド結合ドメインに対応する。そのファミリーのある種のメンバーは、「Ｆ」に対応する、ＬＢＤのカルボキシ末端側の別のトランス活性化ドメインも有しうる。
【０１３２】
ＤＢＤは、２つのアミノ酸モチーフであるＰ−ボックスおよびＤ−ボックスの間にある、２つのシステインジンクフィンガーの存在によって特徴付けられ、これはエクジソン応答エレメントについての特異性を付与する。これらのドメインは、天然に生じ得て；欠失、挿入または突然変異によって改変され；合成であり；異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラ；またはそれらの組合せでありうる。ステロイド受容体ファミリーの亜種のようなこの受容体は、ヘテロ二量化特性の原因であるあまり十分に明らかにされていない領域をも保有する。ＥｃＲ、ＵＳＰ、およびＲＸＲのドメインは、天然ではモジュラーであるので、ＬＢＤ、ＤＢＤ、およびトランス活性化ドメインは、相互交換されうる。
【０１３３】
遺伝子発現カセット
本発明の新規複数誘導性遺伝子発現系は、遺伝子発現カセットの各々が、目的のポリペプチドもしくは遺伝子の発現を誘導する「スイッチ」ポリペプチドとして、または本発明の複数誘導性遺伝子発現系によって発現されることが望まれる目的のポリペプチドもしくは遺伝子としてのいずれかで、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、宿主細胞で発現されることのできる遺伝子発現カセットを含む。したがって、出願人らの発明は、本発明の複数誘導性遺伝子発現系で使用するための遺伝子発現カセットをも提供する。
【０１３４】
特定の実施形態では、宿主細胞中で発現される能力のある遺伝子発現カセットは、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ結合ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよび核受容体リガンドドメインを含むポリペプチド、からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１３５】
別の特定の実施形態では、本発明は、遺伝子発現カセットが、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ結合ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドからなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、宿主細胞中で発現されることができる遺伝子発現カセットを提供する。本発明によるハイブリッドポリペプチドは、各ポリペプチドフラグメントが、異なる起源、すなわち異なるポリペプチド、異なる核受容体、異なる種等から由来することを特徴とする、少なくとも２つのポリペプチドフラグメントを含む。本発明によるハイブリッドポリペプチドは、各ポリペプチドドメインが、異なる起源から由来することを特徴とする、少なくとも２つのポリペプチドドメインを含みうる。
【０１３６】
特定の実施形態では、核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用蛋白質−１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様蛋白質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用蛋白質１４、およびファルネソール受容体からなる群から選択されるＨ群核受容体である。好ましい実施形態では、核受容体リガンド結合ドメインは、エクジソン受容体から得られる。
【０１３７】
したがって、本発明は、またａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ結合ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子発現カセットを提供する。好ましくは、遺伝子発現カセットは、ａ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；ｂ）ＤＮＡ結合ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチド；およびｃ）トランス活性化ドメインおよびエクジソン受容体リガンド結合ドメインを含むハイブリッドポリペプチドからなる群から選択されるハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、コードされたハイブリッドポリペプチドが、少なくとも２つのポリペプチドフラグメントを含み、各ポリペプチドフラグメントが、異なる起源からのものである。
【０１３８】
エクジソン受容体（ＥｃＲ）配位子結合ドメイン（ＬＢＤ）は、鱗翅目のＥｃＲ、双翅目のＥｃＲ、節足動物のＥｃＲ、直翅目のＥｃＲ、同翅目のＥｃＲおよび半翅目のＥｃＲからなる群から選択される無脊椎動物のＥｃＲからのものである。好ましくは、本発明に使用するためのＥｃＲ配位子結合ドメインは、
トウヒシントメハマキＥｃＲ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ ＥｃＲ）（「ＣｆＥｃＲ」；Ｋｏｔｈａｐａｌｌｉら著、１９９５年Ｄｅｖ Ｇｅｎｅｔ．１７巻：３１９〜３０頁）、
チャイロコメノゴミムシダマシＥｃＲ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ ＥｃＲ）（「ＴｍＥｃＲ」；Ｍｏｕｉｌｌｅｔら著、１９９７年、Ｅｕｒ．Ｊ．ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８巻：８５６〜８６３頁）、
タバコスズメガＥｃＲ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ＥｃＲ）（「ＭｓＥｃＲ」；Ｆｕｊｉｗａｒａら著、１９９５年、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２５巻、８４５〜８５６頁）、
オオタバコガＥｃＲ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｅｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ ＥｃＲ）（「ＨｖＥｃＲ」；Ｍａｒｔｉｎｅｚら著、１９９９年、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９巻：９１５〜３０頁）、
キミドリユスリカＥｃＲ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ ＥｃＲ）（「ＣｔＥｃＲ」；Ｉｍｈｏｆら著、１９９３年、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３巻、１１５〜１２４頁）、
カイコＥｃＲ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＥｃＲ）（「ＢｍＥｃＲ」；Ｓｗｅｖｅｒｓら著、１９９５年、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２５巻、８５７〜８６６頁）、
スクインティングブッシュブラウン（ｓｑｕｉｎｔｉｎｇ ｂｕｓｈ ｂｒｏｗｎ）ＥｃＲ（Ｂｉｃｙｃｌｕｓ ａｎｙｎａｎａ ＥｃＲ）（「ＢａｎＥｃＲ」）、
アメリカタテハモドキＥｃＲ（Ｊｕｎｏｎｉａ ｃｏｅｎｉａ ＥｃＲ）（「ＪｃＥｃＲ」）、
キイロショウジョウバエＥｃＲ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥｃＲ）（「ＤｍＥｃＲ」；Ｋｏｅｌｌｅら著、１９９１年、Ｃｅｌｌ ６７巻、５９〜７７頁）、
ネッタイシマカＥｃＲ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ ＥｃＲ）（「ＡａＥｃＲ」；Ｃｈｏら著、１９９５年、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２５巻、１９〜２７頁）、
ブロウフライ（ｂｌｏｗ ｆｌｙ）ＥｃＲ（Ｌｕｃｉｌｉａ ｃａｐｉｔａｔａ ＥｃＲ）（「ＬｃＥｃＲ」）、
ヒツジキンバエＥｃＲ（Ｌｕｃｉｌｉａ ｃｕｐｒｉｎａ ＥｃＲ）（「ＬｕｃＥｃＲ」；ＨａｎｎａｎおよびＨｉｌｌ著、１９９７年、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７巻、４７９〜４８８頁）、
ホホアカクロバエＥｃＲ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｖｉｃｉｎｉａ ＥｃＲ）（「ＣｖＥｃＲ」）、
チチュウカイミバエＥｃＲ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ）ＥｃＲ（「ＣｃＥｃＲ」；Ｖｅｒｒａｓら著、１９９９年、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５巻、７９８〜８０８頁）、
トノサマバッタＥｃＲ（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ ＥｃＲ）（「ＬｍＥｃＲ」；Ｓａｌｅｈら著、１９９８年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３巻：９１〜９頁）、
モモアカアブラムシＥｃＲ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ ＥｃＲ）（「ＭｐＥｃＲ」；国際特許出願公開公報第ＷＯ９９／３６５２０号）、
フィドラークラブ（ｆｉｄｄｌｅｒ ｃｒａｂ）ＥｃＲ（Ｃｅｌｕｃａ ｐｕｇｉｌａｔｏｒ ＥｃＲ）（「ＣｐＥｃＲ」；Ｃｈｕｎｇら著、１９９８年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １３９巻：２０９〜２７頁）、
イクソディドティック（ｉｘｏｄｉｄ ｔｉｃｋ）ＥｃＲ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ ＥｃＲ）（「ＡｍａＥｃＲ」；Ｇｕｏら、１９９７年、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７巻、９４５〜９６２頁）、
シルバーリーフコナジラミＥｃＲ（Ｂａｍｅｃｉａ ａｒｇｅｎｔｉｆｏｌｉ ＥｃＲ）（「ＢａＥｃＲ」）、２００１年９月２６日に提出された米国特許仮出願、その全体が本明細書の一部として参照される）、
またはツマグロヨコバイＥｃＲ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ ＥｃＲ）（「ＮｃＥｃＲ」；Ｐａｌｌｉ著、２００１年９月２６日に提出された米国特許仮出願、その全体が本明細書の一部として参照される）からなる群から選択される無脊椎動物のＥｃＲから得られうる。さらに好ましくは、ＬＢＤは、ＣｆＥｃＲ、ＤｍＥｃＲ、またはＮｃＥｃＲからのものである。
【０１３９】
ＤＮＡ結合ドメインは、合成およびキメラＤＮＡ結合ドメインをはじめとする既知の応答エレメント、またはそれらのアナログ、組み合わせ、もしくはこれらの改変体を有する任意のＤＮＡ結合ドメインであることができる。好ましくは、ＤＢＤは、ＧＡＬ４ ＤＢＤ、ＬｅｘＡ ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、Ｈ群の核受容体メンバーＤＢＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、または細菌ＬａｃＺ ＤＢＤである。さらに好ましくは、ＤＢＤは、ＥｃＲ ＤＢＤ、ＧＡＬ４ ＤＢＤ、またはＬｅｘＡ ＤＢＤである。
【０１４０】
トランス活性化ドメイン（「ＡＤ」または「ＴＡ」と略される）は、任意のＨ群核受容体メンバーＡＤ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体ＡＤ、合成またはキメラＡＤ、ポリグルタミンＡＤ、塩基性または酸性アミノ酸ＡＤ、ＶＰ１６ ＡＤ、ＧＡＬ４ ＡＤ、ＮＦ−κＢ ＡＤ、ＢＰ６４ ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ）、ｐ６５トランス活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ）、またはそれらのアナログ、組合せ、もしくはその改変体でありうる。特定の実施形態では、ＡＤは、合成またはキメラＡＤであるか、またはＥｃＲ、グルココルチコイド受容体、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ−κＢ、またはＢ４２酸性活性化ドメインＡＤから得られる。好ましくは、ＡＤは、ＥｃＲ ＡＤ、ＶＰ１６ ＡＤ、Ｂ４２ ＡＤ、またはｐ６５ ＡＤである。
【０１４１】
本発明はまた、ｉ）ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドによって認識されるドメインを含む応答エレメント；ｉｉ）トランス活性化ドメインを含むポリペプチドによって活性化されるプロモータ；およびｉｉｉ）その発現が調節されるべき遺伝子、を含む遺伝子発現カセットを提供する。
【０１４２】
応答エレメント（「ＲＥ」）は、公知のＤＮＡ結合ドメインを有する任意の応答エレメント、そのアナログ、組み合わせ、もしくはそれらの改変体を有する任意の応答エレメントであることができる。単一のＲＥが使用されうるか、または同じＲＥもしくは２以上の異なるＲＥの複数のコピーのいずれかである複数のＲＥが本発明に使用されうる。特定の実施形態では、ＲＥは、ＧＡＬ４からのＲＥ（「ＧＡＬ４ＲＥ」）、ＬｅｘＡ、Ｈ群核受容体ＲＥ、ステロイド／チロイドホルモン核受容体ＲＥ、または合成ＤＮＡ結合ドメインを認識する合成ＲＥである。好ましくは、ＲＥは、エクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、ＧＡＬ４ＲＥ、またはＬｅｘＡ ＲＥ（オペロン、「ｏｐ」）である。
【０１４３】
本発明によるステロイド／チロイドホルモン核受容体ＤＮＡ結合ドメイン、活性化ドメインまたは応答エレメントは、チロイドホルモン受容体α（ＴＲα）、チロイド受容体１（ｃ−ｅｒｂＡ−１）、チロイドホルモン受容体α（ＴＨＲＡ）、チロイドホルモン受容体β（ＴＲβ）、チロイドホルモン受容体β（ＴＨＲＢ）、レチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）、レチノイン酸受容体β（ＲＡＲβ）、ヘパトーマ（ＨＡＰ）、レチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）、レチノイン酸受容体ガンマ様（ＲＡＲＤ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体β（ＰＰＡＲβ）、ペルオキシソーム・増殖因子活性剤関連受容体（ＮＵＣ−１）、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体δ（ＰＰＡＲδ）、ペルオキシソーム増殖因子活性剤関連受容体（ＦＦＡＲ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）、チロイドホルモン受容体αの非コード鎖によってコードされたオーファン受容体（ＲＥＶＥＲＢα）、ｖ−ｅｒｂ Ａ関連受容体（ＥＡＲ−１）、ｖ−ｅｒｂ関連受容体（ＥＡＲ−１Ａ）、γ）、チロイドホルモン受容体βの非コード鎖によってコードされたオーファン受容体（ＲＥＶＥＲＢβ）、ｖ−ｅｒｂ関連受容体（ＥＡＲ−１β）、オーファン核受容体ＢＤ７３（ＢＤ７３）、ｒｅｖ−ｅｒｂＡ関連受容体（ＲＶＲ）、ジンクフィンガー蛋白質１２６（ＨＺＦ２）、エクジソン誘導性蛋白質Ｅ７５（Ｅ７５）、エクジソン誘導性蛋白質Ｅ７８（Ｅ７８）、ドロソフィラ受容体７８（ＤＲ−７８）、レチノイド関連オーファン受容体α（ＲＯＲα）、レチノイドｘ受容体α（ＲＸＲα）、レチノイド関連オーファン受容体β（ＲＯＲβ）、レチノイドＺ受容体β（ＲＺＲβ）、レチノイド関連オーファン受容体γ（ＲＯＲγ）、レチノイドＺ受容体γ（ＲＺＲγ）、レチノイド関連オーファン受容体（ＴＯＲ）、ホルモン受容体３（ＨＲ−３）、ドロソフィラホルモン受容体３（ＤＨＲ−３）、ミオヘメリチン（ＭＨＲ−３）、成長ホルモン受容体３（ＧＨＲ−３）、シー．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）核受容体３（ＣＮＲ−３）、シー．エレガンスホルモン受容体３（ＣＨＲ−３）、シー．エレガンス核受容体１４（ＣＮＲ−１４）、エクジソン受容体（ＥＣＲ）、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン核受容体（ＯＲ−１）、ＮＥＲ−１、受容体相互作用蛋白質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様蛋白質（ＲＬＤ−１）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓Ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用蛋白質１４（ＲＩＰ−１４）、ＨＲＲ−１、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、オーファン核受容体（ＯＮＲ−１）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、ステロイドおよび生体内異物受容体（ＳＸＲ）、ベンゾエートＸ受容体（ＢＸＲ）、核受容体（ＭＢ−６７）、構成的アンドロスタン受容体１（ＣＡＲ−１）、構成的アンドロスタン受容体α（ＣＡＲα）、構成的アンドロスタン受容体２（ＣＡＲ−２）、構成的アンドロスタン受容体β（ＣＡＲβ）、ドロソフィラホルモン受容体９６（ＤＨＲ−９６）、核ホルモン受容体１（ＮＨＲ−１）、肝細胞核因子４（ＨＮＦ−４）、肝細胞核因子４Ｇ（ＨＮＦ−４Ｇ）、肝細胞核因子４Ｂ（ＨＮＦ−４Ｂ）、ＤＨＮＦ−４、肝細胞核因子４Ｄ（ＨＮＦ−４Ｄ）、レチノイドＸ受容体α（ＲＸＲα）、レチノイドＸ受容体β（ＲＸＲβ）、Ｈ−２領域ＩＩ結合蛋白質（Ｈ−２ＲＩＩＢＰ）、核受容体コレギュレーター−１（ＲＣｏＲ−１）、レチノイドＸ受容体γ（ＲＸＲγ）、ウルトラスパイラクル（ＵＳＰ）、２Ｃ１、コリオン因子１（ＣＦ−１）、精巣受容体（ＴＲ−２）、精巣受容体（ＴＲ２−１１）、ＴＲ４、ＴＡＫ−１、ドロソフィラホルモン受容体（ＤＨＲ７８）、テイルレス（ＴＬＬ）、テイルレス相同体（ＴＬＸ）、ＸＴＬＬ、ニワトリオボアルブミン上流プロモータ転写因子Ｉ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモータ転写因子Ａ（ＣＯＵＰ−ＴＦＡ）、ＥＡＲ−３、ＳＶＰ−４４、ニワトリオボアルブミン上流プロモータ転写因子ＩＩ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモータ転写因子Ｂ（ＣＯＵＰ−ＴＦＢ）、ＡＲＰ−１、ＳＶＰ−４０、ＳＶＰ、ニワトリオボアルブミン上流プロモータ転写因子ＩＩＩ（ＣＯＵＰ−ＴＦＩＩＩ）、ニワトリオボアルブミン上流プロモータ転写因子Ｇ（ＣＯＵＰ−ＴＦＧ）、ＳＶＰ−４６、ＥＡＲ−２、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）、エストロゲン関連受容体１（ＥＲＲ１）、エストロゲン関連受容体α（ＥＲＲα）、エストロゲン関連受容体２（ＥＲＲ２）、エストロゲン関連受容体β（ＥＲＲβ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラロコルチコイド受容体（ＭＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、神経成長因子誘導遺伝子Ｂ（ＮＧＦＩ−Ｂ）、Ｎｕｒ−７７に類似の核受容体（ＴＲＳ）、Ｎ１０、オーファン受容体（ＮＵＲ−７７）、ヒト初期応答遺伝子（ＮＡＫ−１）、Ｎｕｒｒ関連因子１（ＮＵＲＲ−１）、ヒト初期応答遺伝子（ＮＯＴ）、再生肝臓核受容体１（ＲＮＲ−１）、造血性ジンクフィンガー３（ＨＺＦ−３）、Ｎｕｒ関連蛋白質―１（ＴＩＮＯＲ）、核オーファン受容体１（ＮＯＲ−１）、ＮＯＲ１関連受容体（ＭＩＮＯＲ）、ドロソフィラホルモン受容体３８（ＤＨＲ−３８）、シー．エレガンス核受容体８（ＣＮＲ−８）、Ｃ４８Ｄ５、ステロイド産生因子１（ＳＦ１）、エンドゼピン様ペプチド（ＥＬＰ）、フシ・タラズ（ｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ）因子１（ＦＴＺ−Ｆ１）、副腎性４結合蛋白質（ＡＤ４ＢＰ）、肝臓受容体相同体（ＬＲＨ−１）、Ｆｔｚ−Ｆ１関連オーファン受容体Ａ（ｘＦＦｒＡ）、Ｆｔｚ−Ｆ１関連オーファン受容体Ｂ（ｘＦＦｒＢ）、ＬＲＨ−１に関連した核受容体（ＦＦＬＲ）、ＬＲＨ−１に関連した核受容体（ＰＨＲ）、フェト蛋白質転写因子（ＦＴＦ）、生殖細胞核因子（ＧＣＮＦＭ）、レチノイド受容体関連の精巣関連受容体（ＲＴＲ）、クニルプス（ｋｎｉｒｐｓ）（ＫＮＩ）、クニルプス関連（ＫＮＲＬ）、胚性腺（ＥＧＯＮ）、リガンド依存性核受容体についてのドロソフィラ遺伝子（ＥＡＧＬＥ）、トリソラックスに類似の核受容体（ＯＤＲ７）、トリソラックス（ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）、用量感受性性転換副腎形成不全先天性発症領域染色体Ｘ遺伝子（ＤＡＸ−１）、副腎形成不全先天性および性腺刺激ホルモン分泌低下性生殖機能不全（ＡＨＣＨ）、および短ヘテロ二量体パートナー（ＳＨＰ）からなる群から選択されるステロイド／チロイドホルモン核受容体から得られうる。
【０１４４】
本発明の目的のために、核受容体、Ｈ群核レセプター、ＥｃＲ、ＵＳＰ、およびＲＸＲは、合成およびキメラ核受容体、Ｈ群核受容体、エクジソン受容体、ＥｃＲ、ＵＳＰ、ＲＸＲ、およびそれらの相同体も含む。
【０１４５】
出願人らの遺伝子発現カセットに使用するための遺伝子は、内因性遺伝子または異種遺伝子でありうる。所望の遺伝子または蛋白質についての核酸またはアミノ酸配列情報は、多くの公的利用のデータベース、例えばジーンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）、ＥＭＢＬ、スイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ）、およびＰＩＲの内の１つに、または多くの生物学関連雑誌出版物に示されうる。したがって、当業者は、実質的に全ての公知遺伝子についての核酸配列情報を入手することができる。このような情報は、次ぎに、ここに記述される出願人らの方法で使用される遺伝子発現カセット内の目的の遺伝子の挿入のために望まれる構築物を構築するために使用されうる。
【０１４６】
出願人らの遺伝子発現カセットに使用する目的の遺伝子の例としては、それに限定されないが、モノクローナル抗体、酵素、プロテアーゼ、サイトカイン、インターフェロン、インシュリン、エリスロポイエチン、凝固因子、他の血液因子もしくは構成要素をはじめとする、症状、疾病、傷害、機能不全、遺伝的欠損を治療するために使用されうる治療的に望ましいポリペプチドまたは産物をコードする遺伝子；遺伝子治療用のウイルスベクター、ワクチン用のウイルス；医薬品発見のためのターゲット、機能的ゲノミクス、並びにプロテオミクス分析および適用などが挙げられる。
【０１４７】
以下の手段は、本発明の複数遺伝子調節系を調製するために使用される：
複数遺伝子調節系は、調節系リガンドの初期開発を必要とし、該リガンドは、新規リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）をスクリーニングするために使用される。その後、特徴的なＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が作成され、そこから、対応する高親和性ＤＮＡ応答エレメント（ＲＥ）が単離される。最終的に、核受容体（ＮＲ）の特徴的集合は、新規ＬＢＤおよびＤＢＤを、十分に特徴付けられた転写活性化ドメイン（ＡＤ）に融合させることによって作成される。
【０１４８】
一連の非交差相互作用性（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）（「十分にオルトゴナルな」）リガンド／受容体対を開発するために、リガンドおよび受容体の両方についてのリード構造は、最大限に構造的に多様である。エクジソンベースの受容体について、２つの化学型が、リガンドとして使用するのに理想的である：例えば、２０−ヒドロキシエクジソン、およびジアシルヒドラジンのような天然のエクジステロイドが挙げられる。
【０１４９】
【化２】
Figure 2004527223
【０１５０】
天然のエクジステロイドは、強力（約１ｎＭと同じくらい低いＫｄ）であるが、しかし、全昆虫および細胞ベースのアッセイで利用可能なデータに基づいて、昆虫種にわたって、相当の交差相互作用があると示された。ジアシルヒドラジン（約０．５ｎＭと同じくらい低いＫｄ）は、大部分、それがまったく活性であるＥｃＲについて交差相互作用性があると示された（Ｄｈａｄｉａｌｌａら、（１９９８年）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｅｎｔｏｍｏｌ、４３巻：５４５〜６９頁参照）。オルトゴナルなリガンド／受容体の組は、これらの２つの構造的ファミリー内に存在しない。複数のオルトゴナルな遺伝子調節系の目標を達成するために、リガンド同定は、特異的受容体についてのファルマコフォア合致試験、並びに非相互作用受容体についてのファルマコフォアミスマッチ試験の両方を必要とする。我々は、まさにこのようなオルトゴナルな系を見出した。
【０１５１】
許容しうるリガンドは、リガンドの存在下における応答エレメントへのＤＢＤ結合が、複数遺伝子調節系中の１つの遺伝子の発現の活性化または抑制を生じさせるときに、遺伝子の発現を調節し、かつ複数制御系の他の遺伝子を活性化または抑制しない、任意のものであり、すなわち当該系はオルトゴナルである。好ましいリガンドとしては、天然に生じるホルモンであるポナステロンおよびムリステロンＡ、それらの誘導体および／または相同体、並びに米国特許第６，０１３，８３６号、第５，１１７，０５７号、第５，５３０，０２１号、および第５，３７８，７２６号に開示されるようなＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；欧州特許出願第４６１，８０９号に開示されるようなジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号に開示されるようなＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州特許出願第２３４，９９４号に開示されるもののようなＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号に開示されるようなＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジンが挙げられ；その各々は、本明細書の一部として参照され、他の類似の材料としては、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンザミド、８−Ｏ−アセチルハーパジド、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート、ファルネソール、胆汁酸、１，１−ビホスホネートエステル、幼若ホルモンＩＩＩなどが挙げられる。
【０１５２】
複数遺伝子調節系は、それら自身の間で、または細胞内の他の受容体と交差反応しないが、特異的受容体のみに特異的であって、かつ特異的受容体のみを誘導する、ディスクリート（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）リガンドが要求されるので、いくつかの戦略が、各複数遺伝子調節系の組合せのために適切なリガンドを定めるために使用される。
【０１５３】
リガンド相補化は、３つの方法の内の１つで公知の高度に活性なリガンドから開始する：
１）リガンド上の個々のファルマコフォア（すなわち、活性部位）エレメント（ＰＥ）同一性の段階的変化、ここでは、リガンドファルマコフォアが仮定され、そのファルマコフォア内のエレメントが劇的に改変され、突然変異受容体ライブラリーが相補的改変について検査される。いったん首尾よい突然変異体／リガンドの組合せが同定されると、蛋白質モデリングリガンドデザイン反復配列が利用され、応答を最大化にするか、または応答を最小化にするか（発現を誘導するよりむしろ遺伝子発現を抑制することが望ましい場合に）のいずれかに、リガンド／受容体相互作用を最適化する。
【０１５４】
２）新たなリガンド「可変ドメイン」の追加、ここでは、ファルマコフォアおよび相補的結合部位が、多かれ少なかれ残っている。必須でないが、しかし天然の受容体への結合に潜在的に有害である別の基が、コアリガンドに取り付けられる。この基のサイズおよび特性は、多様な修飾および官能化を可能にする。上述のとおり、その後、突然変異受容体ライブラリーが検査される。
【０１５５】
３）リガンドファルマコフォアエレメントのクラスターの大量除去および新規ＰＥマップとの交換（キメラ構造のコンセプトと同種）、ここでは、既知のファルマコフォアのほぼ半分を保持し、さらに欠失したファルマコフォアクラスターを多様な存在物で置換する。これらの新たな分子フラグメントは、別のＰＥパターンを提供するか、または元のパターンを部分的に（全体的にではなく）複製するかのいずれかである。そのメンバーが、ＰＥ結合部位での残基改変および／またはキャビティー形状改変を有する突然変異受容体ライブラリーは、引き続いて、新たな乱されたファルマコフォアとの相補性について検査される。
【０１５６】
リガンドの観点から、その手段は、以下のとおりである：
１．増加するＰＥ変化、新たなリガンド「可変ドメイン」の追加、および大規模なＰＥクラスター交換に基づいた、多様に改変されたリガンドの組を定める。出発リガンドテンプレートとしては、ジアシルヒドラジンおよび天然のエクジステロイドが挙げられる。
【０１５７】
２．受容体ＬＢＤが、天然に生じ；欠失、挿入または突然変異によって改変され；合成性であり；異種受容体蛋白質の異なるドメインのキメラであり；またはその組合せである受容体の組を製造する。改変は、ＤＮＡシャフリング、ＩＴＣＨＹまたは複数の天然の受容体からの突然変異誘発を介して起こりうる。ＬＢＤ突然変異は、結合ポケットの領域、および理想的には、親油性特性の、推定される結合点からのＨ結合供与体／授与体として機能しうる−／＋電荷のサンプル残基を探査するべきである。
【０１５８】
３．任意に、細胞に突然変異受容体を導入する。
【０１５９】
４．遺伝子改変および／または結合についてリガンドの組と受容体の組を検査し、ここで前記遺伝子改変および結合の両方の紹介が、インビボ（突然変異受容体が導入された細胞内で）またはインビトロのいずれかで行われうる。好ましくは、遺伝子改変検査は細胞中でインビボで行われ、結合検査はインビトロで行われる。
【０１６０】
５．データ解析−受容体およびリガンドの関数として誘導／結合の規模を作表する。オルトゴナリティー（遺伝子調節系として相互に非生産的である受容体／リガンドの組合せ）についてグリッドを調べる。
【０１６１】
６．最適化−第１回目から得られる構造／活性の結果、および蛋白質相同性モデリング情報に基づいて、より焦点が絞られたリガンド改変および部位特異的ＬＢＤ突然変異を伴う工程１〜５を繰返す。
【０１６２】
これらのアプローチに適するリガンドは、１）合成して入手することが容易であり、２）医薬品として許容しうる薬物動態について効能を示し、さらに３）構造改変に適しているべきである。エクジステロイドおよびジアシルヒドラジンの両方は適しているが、ステロイド改変がさらに合成的に要求され、最適に機能させるために、代謝に適した化学的官能性を排除すべきである。
【０１６３】
ここで用いられる「組」という用語は、一つまたはそれ以上を意味する。しかし、好ましくは、「組」または「ライブラリー」は、２つまたはそれ以上のメンバーを含む。一般に、組は、複数誘導性遺伝子調節系における個々に操作可能な遺伝子調節系の総数よりも、より多くのメンバーを含む。
【０１６４】
細胞内に複数遺伝子調節系を含む個々の系の各々は、適切な受容体を要求する。本発明の目的のために、「細胞」という用語は、ウイルスを含む。多くの受容体が本発明の系に使用可能であるが、核受容体が好ましい。各調節系が、非常に厳密な遺伝子発現を提供し、さらにＥｃＲファミリーにおいて、複数の新規ＥｃＲ受容体の発生を可能にするのに充分な変動性があるので、ＥｃＲベースの遺伝子調節系は、本発明に使用するのに理想的である。ＤＮＡ配列に突然変異を導入する多数の技術が当業界で知られており、部位特異的突然変異誘発、エラープローン（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ＡＬ−１レッド・ミューテーター株の使用、ＤＮＡシャフリング（Ｃｈａｎｇ、Ｃ．Ｃ．ら（１９９９年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７（８）巻、７９３〜７頁、およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．（１９９４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９１（２２）巻、１０７４７〜５１頁参照）、およびＩＴＣＨＹとしても知られるハイブリッド酵素の作成のためのインクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）（Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．およびＡｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．（１９９９年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７（１２）巻、１１５９〜６０頁およびＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｍ．ら（１９９９年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７（１２）巻、１２０５〜９頁参照）が挙げられる。
【０１６５】
トウヒシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｅｎｅｕｒｉａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）（ＣｆＥｃＲ）からのＥｃＲ ＬＢＤは、それが、特定のジアシルヒドラジンと高いリガンド結合親和性を示すため、突然変異誘発のための理想的な候補である。しかし、他のエクジソン受容体および他の核受容体は、本発明の系内で使用するために突然変異されうる。部位特異的突然変異誘発、エラープローンＰＣＲによる、およびミューテーター株エピキュリアン・コリ（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｒｅｄを用いることによる、ランダム突然変異誘発が、ＣｆＥｃＲ ＬＢＤ中に多数のランダム突然変異を生じさせる。ＸＬ−１Ｒｅｄミューテーター株は、ＤＮＡ補修に関与する３つの遺伝子、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤおよびｍｕｔＴが欠けているように遺伝子操作される。その株へのプラスミドの形質転換は、その株が５，０００倍高い突然変異比率を示すので、配列じゅうにランダムに組み入れられた突然変異の発生を生じる。結果として生じる突然変異ＬＢＤをコードするポリヌクレオチドは、その後、適切なベクターにクローニングされ、ライブラリーが作成される。続いて、後述の方法を用いて、ライブラリーがスクリーニングされる。リガンド結合、特異性および／または感受性に影響を及ぼす切断突然変異および置換突然変異を含むエクジソン受容体が、最近得られている（共に係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１９０５０号および２００１年８月２１日に提出され、まだシリアルナンバーが割当てられていないＰａｌｌｉらの「新規置換突然変異受容体および核受容体ベースの誘導性遺伝子発現系におけるそれらの使用法」と題される米国特許仮出願を参照し、それらの全体は本明細書の一部として参照される）。
【０１６６】
置換突然変異は、当業界で知られる突然変異誘発についての任意の技術によって行われることができ、限定されないが、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、１９７８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３巻：６５５１頁；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８４年、ＤＮＡ ３巻：４７９〜４８８頁；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、１９８６年、Ｇｅｎｅ ４４巻：１７７頁；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３巻：７１０頁）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（ファルマシア）の使用、制限エンドヌクレアーゼ消化／フラグメント欠失および置換、ＰＣＲ媒介／オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発などが挙げられる。ＰＣＲベースの技術は、部位特異的突然変異誘発のために好ましい（Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９８９年、ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅についての原理および使用法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）における「ＤＮＡ操作のためのＰＣＲの使用」Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編、ストックトン・プレス、６章、６１〜７０頁参照）。
【０１６７】
ＤＮＡシャフリングは、遺伝子のファミリーが共有する配列相同性を利用する技術である。このプロセスで、遺伝子のファミリーは、通常のベクターにクローニングされ、挿入物に隣接するベクター配列に特異的な組のプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。この方法で、増幅した遺伝子の全ては、同じ５’および３’配列を共有する。その後、ＰＣＲ増幅遺伝子産物を、ＤＮａｓｅＩで処理し、結果として生じる１０〜６０塩基対（「ｂｐ」）サイズ範囲内のフラグメントをゲルで精製した。その後、そのフラグメントを、プライマーとしてオリゴヌクレオチドを含まないＰＣＲ反応に使用する。この様式で、テンプレートのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長についてのプライミングは、そのファミリーの遺伝子中の相同領域のアニーリングから来る。ＤＮＡシャフリングに続いて、そのプロセスを、継続的に繰り返して、シャッフルされた配列のサチュレーティッド（ｓａｔｕｒａｔｅｄ）ライブラリーを生じさせることができる。シャフリングの完了時に、ベクターからのクローン化配列を増幅するために使用されたプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅が行われる。この方法で、そのメンバーが、一般に、それらの親遺伝子と同じサイズのものである、シャッフルされた遺伝子のライブラリーを増幅する。その後、ライブラリーをクローン化し、所望の表現型について分析する（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４年、上記参照）。さらに、核受容体およびＥｃＲは、特に、このプロセスについての良好な選択であり、ここで、その核受容体スーパーファミリーは、ＥｃＲがそのメンバーであり、脊椎動物、節足動物および線形動物からの３００を超える認識されたメンバーを含む。
【０１６８】
単に、異なる種から最近入手可能な野生型Ｈ群核受容体の配列を利用し、さらにそれらの各々についての特有のリガンドを操作することによる、開発中の複数のＨ群核ベースの遺伝子調節系に対する代替物として、基本（ｂａｓｉｃ）受容体／核受容体／Ｈ群核、好ましくはＥｃＲ構築になお適合する新規Ｈ群核受容体ＬＢＤも操作され得る（共に係属中の２００１年８月２１日に提出され、まだシリアルナンバーが割当てられていない、、発明者ら：Ｐａｌｌｉらの「新規置換突然変異受容体および核受容体基本の誘導性遺伝子発現系におけるそれらの使用法」と題される米国特許仮出願であって；リガンド結合ドメインの感受性、特異性またはトランス活性化の規模を改変する置換突然変異を含むＨ群核受容体リガンド結合ドメインを開示し、その全体が本明細書の一部として参照される）。これを達成するために、多量の最も多様化した配列からのＤＮＡ配列がシャッフルされた。その利点は、多くの公知およびクローン化された受容体の中で明らかな核酸配列相同性があるという事実による。これは、新規ＬＢＤを含む受容体のライブラリーを作成するより大きな機会を提供する。
【０１６９】
本発明の重要な態様は、このプロセス中でヒト核受容体を利用することにより、ヒト遺伝子治療用途を伴う複数遺伝子調節系が開発されうることである。さらに、ＤＮＡシャフリングは、新規ＤＢＤを生じさせるヒト核受容体配列を利用しうる。新規ＬＢＤを得るためにＥｃＲシャフリングを用いる場合、異なるヒト核受容体を一緒にシャフリングして、新規ＤＢＤを得る利点および欠点がある。利点は、２倍である。第一に、ヒト配列を利用することは、ヒト遺伝子治療用途での新規受容体の抗原性についての機会を大いに減じる。第二に、より大きなＣドメイン配列多様性を与える、異なる種からのＥｃＲをシャフリングするよりも、スーパーファミリー内から異なるヒト核ホルモン受容体をシャフリングすることによる新規ＤＢＤを生じさせる上で、より大きな可能性が存在する。しかし、ＤＮＡシャフリングを成功させるために、最少量の相同性が存在しなければならない。
【０１７０】
ＲＸＲを有するヘテロ二量体、ホモ二量体、または単量体のいずれかとして、核受容体がＤＮＡに結合する。核受容体スーパーファミリーの二量化ドメインは、二つの部分に分かれており、それは、受容体のＣおよびＥドメインの間に分けられる。本発明は、シャフリングされたヒト核受容体のＣドメインのみを利用する。したがって、ＳＦ−１、ＮＧＦＩ−Ｂ、ＥＲＲ、ＲＯＲ、ＴＬＬおよびＲｅｖ−Ｅｒｂのような単量体としてＤＮＡを結合するヒト受容体をシャフリングするために選択することは論理的である。この型の受容体のみを入換えることを選択することによって、本発明の遺伝子調節系は、第一に、新規ＥｃＲ ＬＢＤベースの受容体をＲＸＲなしで機能させることを可能にする。この様式で、ＥｃＲ ＬＢＤベースの受容体は、内因性ＲＸＲを利用せず、よって内因性受容体からそれらを遠ざける。第二に、宿主ゲノムにデリバリーされる必要があるコードされた配列の量は、ＲＸＲデリバリーについての必要性を妨げることによって、本質的に半分に削られる。現在の公知の遺伝子デリバリービヒクルが示すサイズ制限を考えると、遺伝子治療用途での宿主にデリバリーされるべきＤＮＡの量におけるあらゆる減少は、非常に有益である。ヒトの遺伝子治療用途については、新規ＤＢＤは、新規ＥｃＲベースのＬＢＤに融合される。受容体を完成させるために、ヒト転写因子から得られる活性化ドメインが加えられる。
【０１７１】
ＤＮＡシャフリングと違い、ＩＴＣＨＹは、キメラ遺伝子の作成について配列相同性に依存しない。ＩＴＣＨＹは、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）によるそれらの末端のインクリメンタルダイジェスチョンにより、２つの遺伝子のＮ−およびＣ−末端の切断のライブラリーを生じさせる。ＥｘｏＩＩＩは、平滑または５’オーバーハングからのモノヌクレオチド欠失を触媒する。したがって、３’オーバーハングは、消化から配列の末端を保護する。ＥｘｏＩＩＩのこの特性は、目的の遺伝子の方向性欠失を得るために利用されうる。例えば、ＩＴＣＨＹが、エストロゲン受容体（「ＥＲ」）およびプロゲステロン受容体（「ＰＲ」）遺伝子で行われる場合、所望の突然変異体のライブラリーは、ＰＲ Ａ／Ｂドメインに連結されたＥＲ Ａ／Ｂドメインを有しない。所望の産物は、ＰＲ ｃＤＮＡの３’領域（カルボキシル末端）に連結されたＥＲ ｃＤＮＡの５’領域（アミノ末端）、またはＥＲ ｃＤＮＡの３’領域に連結されたＰＲ ｃＤＮＡの５’領域のいずれかを有する。親配列を一定方向で欠失することは、望ましくない連結が起こることを防止する。全手段の終結時に、ｃＤＮＡの長さに沿って、１塩基対欠失した完全ライブラリーが得られるように、ＥｘｏＩＩＩ反応の間に、短い間隔で少量が除去され、酵素が不活性化される。その後、このフラグメントのライブラリーは連結され、新たなキメラ遺伝子のライブラリーを作成する。ＩＴＣＨＹの産物は、大きな範囲のサイズ分布を示しうる。本発明の目的のために、上に明記されるＥｃＲ配列のＤＥＦドメインおよび単量体のヒト核受容体のＣドメインで起こる組換えは、ヒトの遺伝子治療用途に重要である。本プロセスで有用な可能性のあるヒトＤＮＡ結合ドメインとしては、例えば、ミトコンドリア転写因子Ａ（「ｍｔＴＦＡ」）が挙げられる。短いアミノ酸配列を有し、正常にはヘテロ二量化しない２つのＤＢＤをつなぎ、特徴的ＤＢＤを生じさせることも有用でありうる。
【０１７２】
上述のＤＮＡシャフリングに対する比較で、ＩＴＣＨＹが２つの遺伝子の間のただ１つの交差または組換えを生じさせるという事実にもかかわらず、当該技術は、配列相同性に基づかないので、全ての可能性のある交差の発生を生じさせる。これは、ＤＮＡシャフリングと比較して、改善された機能についてスクリーニングするための、より多様な配列スペースを生じさせる。配列相同性を有するＣおよびＥドメイン内に別個の領域があることを考えれば、ＤＮＡシャフリングは、限定された数のシャフリングされた領域を生じさせることができるのみである。しかし、ＩＴＣＨＹは、配列相同性に基づかず、全ての組換え可能性を生じうる。これは、新規ＬＢＤおよびＤＢＤ操作について考慮する非常に重要な事実である。さらに、最初に数種の異なる遺伝子対上でＩＴＣＨＹを行い、その後、ＤＮＡシャフリングで、そのライブラリー、またはそのライブラリーのサブセットを使用する可能性が存在する。この方法で、全ての可能な組換えが得られ、新規リガンドおよびＤＮＡ結合ドメインを同定する機会は増加される。
【０１７３】
潜在的なリガンド、ＬＢＤ、および受容体ＤＢＤのライブラリーを開発した後に、それらは、機能上の相互作用について評価されなければならない。いったん複数遺伝子調節系についての受容体およびリガンド構成要素が組立てられると、適切な細胞系およびアッセイにおけるその系の試験および認証が必要である。
【０１７４】
以下のプロセスは、このような評価のために利用される。第一に、特徴的な制限部位が、突然変異誘発／シャフリング／ＩＴＣＨＹの前に、ＬＢＤのいずれかの末端およびＤＢＤのいずれかの末端で、出発ＤＮＡ配列に導入される。その後、ＬＢＤおよびＤＢＤは、突然変異誘発／シャフリング／ＩＴＣＨＹから生じるＤＮＡのライブラリーから切り取られる。その後、結果として生じるＬＢＤおよびＤＢＤライブラリーを、適切なベクターにクローニングさせ、１つまたはそれ以上の以下のプロセスを用いて、リガンド、ＬＢＤ、ＤＢＤ、およびＲＥの機能的組合せの同定によって評価する。
【０１７５】
ａ．突然変異／シャフリング／ＩＴＣＨＹ ＬＢＤに、カナマイシンのような抗生物質の耐性遺伝子を融合させることによる、抗生物質耐性遺伝子に翻訳的に結合されたＬＢＤを用いたＬＢＤスクリーニング。ライブラリーにおける受容体のＬＢＤをコードするＤＮＡは、ＣおよびＤドメインの間で、そのライブラリー転写物の３’末端で、操作された特徴的制限部位を使用して切り取られる。これらのＬＢＤは、プラスミド内に含まれる発現カセットに挿入され、大腸菌にライブラリーを形質転換し、カナマイシンに対する耐性について選択することにより、プラスミドのライブラリーは、全長翻訳蛋白質についてスクリーニングされる。プラスミドＤＮＡは、全ての耐性コロニーから単離され、哺乳類細胞スクリーニングに使用される。
【０１７６】
ｂ．相補的リガンドについて、およびホモ二量体としてまたは単量体としてのいずれかで、転写を活性化するリガンド結合受容体の能力についての両方のための哺乳類細胞ＬＢＤおよび１ハイブリッド系を用いたＬＢＤスクリーニング。このプロセスは、ＧＦＰの発現を制御する、多量体化されたＧａｌＬ４ ＲＥおよび最小プロモータから構成されるレポーター構築物で安定にトランスフェクションされた細胞系を利用する。上記工程ａでカナマイシン耐性コロニーから単離されたプラスミドライブラリーから、ＶＰ１６活性化ドメイン、Ｇａｌ４ ＤＢＤおよび新規ＬＢＤを含む領域を、レトロウイルス発現ベクターにサブクローニングさせる。このレトロウイルスは、選択可能な抗生物質耐性遺伝子もコードする。これらの融合蛋白質をコードするＤＮＡを含むレトロウイルスのライブラリーが製造され、コンカタメリック（Ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｃ）Ｇａｌ４ ＲＥの制御下でＧＦＰレポーターを含む上に記述された細胞系に感染させるために使用される。安定に蓄積されたレトロウイルスＤＮＡを有する細胞は、抗生物質耐性によって選択される。さらに、これらの細胞は、ＧＦＰの発現についてＦＡＣＳによって分類されうる。任意の外因性リガンドの不在下でＧＦＰを発現する細胞は、排除される。残りの細胞の集団は、広げられ、複数穴プレートに、グループに分けられる。高処理能アッセイで、各群の細胞を、そのリガンドライブラリーからの、異なるリガンドと共にインキュベートする。最高レベルまでＧＦＰを活性化させるリガンドが選択され、二回目にＬＢＤのライブラリーをスクリーニングするために使用される。前記のとおり、突然変異受容体のライブラリーを、グループに分け、各グループを、異なるリガンドとインキュベートする。しかし、リガンドの数が限定されているので、各群の細胞は、ＦＡＣＳによって分別される。リガンドに応答して最高レベルのＧＦＰ発現を示す細胞を収集し、低密度でプレートにまき、個々のクローンを選択する。これらのクローンの各々でＬＢＤをコードするＤＮＡは、ＰＣＲ増幅によって単離され、配列決定される。これらの転写産物は、それが一緒にスクリーニングされたリガンドに曝露する応答で転写活性化を仲介する能力のあるＬＢＤをコードする。その後、これらのリガンドは、その相補的ＬＢＤについての親和性および特異性を最適化するために修飾される。修飾リガンドは、上に記述される出発のリガンドライブラリーであると評価される。ＧＦＰが、レポータープラスミド中で抗生物質耐性遺伝子に置換される場合、哺乳類細胞スクリーニングは、抗生物質選択に基づいても行われうる。この場合には、レトロウイルスに感染した細胞は、抗生物質の存在下で育成され、生存細胞が単離される。上述のとおり、各々の細胞クローンでＬＢＤをコードするＤＮＡが単離され、配列決定される。
【０１７７】
ｃ．不完全に翻訳された蛋白質に対して選択するＬＢＤスクリーニングについて、上に記述されるものに類似の戦略で、抗生物質耐性遺伝子に翻訳的に結合されたＤＢＤを使用するＤＢＤスクリーニング。ライブラリー中の受容体のＤＢＤをコードするＤＮＡは、Ａ／ＢおよびＣドメインと、ＣおよびＤドメインとの間で操作された特徴的制限部位を使用して切り取られる。その後、これらのＤＢＤは、プラスミド内に含まれる種々の発現カセットの複数のクローニング部位に挿入される。
【０１７８】
ｄ．上で選択されたＤＢＤのライブラリーが、ＲＥのライブラリーでスクリーニングされる酵母１−ハイブリッドアッセイを用いた同系ＲＥについてのＤＢＤスクリーニング。このアッセイに使用される酵母株は、チミジンキナーゼの不在下でガンシクロビルに感受性ではなく、以下の栄養要求も示す：ロイシン（ｌｅｕ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）、およびウラシル（ｕｒａ）（すなわち、その株は、ＬＥＵ、ＨＩＳ、およびＵＲＡを欠く）。ＲＥのライブラリーは、突然変異誘発／入換え／ＩＴＣＨＹ手段で使用される単量体性核受容体のコンセンサスＲＥに基づいた、オリゴヌクレオチドの部分的変性プールである。このライブラリーは、オリゴヌクレオチドの各末端にある制限部位を用いて合成される。制限消化オリゴヌクレオチドは、ＬＥＵ２／チミジンキナーゼ融合蛋白質から構成されるレポーターの３’末端で、酵母発現ベクターにクローニングされる。この融合蛋白質は、転写活性のポジティブまたはネガティブ選択の両方が可能である。レポーターベクターは、ｕｒａ−培地での安定な形質転換体のポジティブ選択のための構成的に発現されたＵＲＡ選択性マーカーも含む。チミジンキナーゼの発現は、成長培地にヌクレシドアナログガンシクロビルを添加することによって、内因性酵母因子によるＲＥの活性化についてネガティブで選択するために使用される。形質転換に続いて、細胞は、ｕｒａ−ガンシクロビル＋培地で育成される。活性化された、ＲＥを含む酵母転写因子を結合する能力のある細胞は生き残らない。生存している形質転換細胞を、貯蔵する。上で単離された細菌性発現プラスミドから得られるＶＰ１６−核受容体ＤＢＤカセットが切り取られ、酵母発現ベクター中の構成的プロモータの制御下にクローン化する。このベクターは、形質転換についてのＨＩＳ選択性マーカーを含む。その後、ＲＥ−ＬＥＵ２／チミジンキナーゼレポーターの存在下で形質転換および選択された酵母を、ＶＰ１６−核受容体ＤＢＤ融合蛋白質のこのライブラリーで、二回目の形質転換をされる。その酵母を、ｕｒａ− ｈｉｓ− ｌｅｕ− 培地で育成して、レポータープラスミドの存在について、ＤＢＤライブラリーを含むプラスミドについて、レポーター中のＲＥへのＶＰ１６−ＤＢＤ蛋白質の結合についてそれぞれ選択する。レポーターのＲＥに結合するＶＰ１６−ＤＢＤ蛋白質を発現する細胞は、活性なチミジンキナーゼも発現する。しかし、ガンシクロビルは、ここで培地に添加されず、これらの細胞はそれにより選択されない。その代わりに、細胞は、ＬＥＵ２マーカーの発現により、ポジティブ成長選択下にある。
【０１７９】
ｅ．蛋白質が結合するＤＮＡ ＲＥを使用した結合された転写因子ＤＢＤのスクリーニング。結合された転写因子は、エピトープタグを有する融合蛋白質として大腸菌で発現される。エピトープタグは、結合されたＤＢＤの親和性カラムを構築するために使用される。このカラムは、ＤＮＡ ＲＥについて選択するために使用される。スクリーニングされる候補のＲＥは、合成オリゴヌクレオチド・ライブラリー内に含まれる。このライブラリー中のオリゴヌクレオチドは、ＲＥの間に様々な長さのランダム配列スペーサーを有する結合された蛋白質を含むＤＢＤの各々についてのＲＥを含む。オリゴヌクレオチドのこのライブラリーの両方の末端は、定義された配列である。異なる変性ライブラリーが、各キメラ蛋白質について合成される。ＰＣＲベースのスクリーニング方法論が、結合されたＤＢＤについての最高の結合親和性を示すＤＮＡ配列を単離するために使用される。結合された蛋白質ＤＢＤ親和性カラムは、ＲＥのライブラリーとインキュベートされ、未結合のオリゴヌクレオチドを洗い流し、結合されたオリゴヌクレオチドを溶出させる。溶出したオリゴヌクレオチドは、候補ＲＥであり、オリゴヌクレオチドの定義された末端にアニールするプライマーを用いたＰＣＲによって増幅される。結果として生じるＰＣＲ産物を、親和性カラムにかける。オリゴヌクレオチド選択およびＰＣＲのこの手段を、数回、好ましくは１０から１２回繰り返す。繰返しスクリーニングした後に、オリゴヌクレオチドの最終混合物をベクターにクローニングし、結果として生じるベクターのプールを、大腸菌に形質転換させる。個々のクローンにおけるオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列決定によって決定される。複数のクローンから得られる配列を配列比較して、結合されたＤＢＤの各々についてのコンセンサス結合部位を決定する。このコンセンサス結合部位に基づいたオリゴヌクレオチドを合成し、上に記述の酵母アッセイでの対応の結合されたＤＢＤと共に使用する。この方法で、突然変異／シャフリング／ＩＴＣＨＹ産物を用いて単離されたＲＥ／ＤＢＤの組合せと、結合されたＤＢＤとの間の相対的親和性を測定する。
【０１８０】
上に記述されるスクリーニングで同定された各対のＬＢＤ変種の各々の組を、上で同定された特有のＤＢＤと対にする。これらの新たなキメラＬＢＤ／ＤＢＤ変種の各々をコードするＤＮＡを、哺乳類発現ベクター中の構成的プロモータの制御下に置く。キメラＬＢＤ／ＤＢＤ蛋白質のＤＢＤの各々のＤＮＡ応答エレメントを、この同じプラスミド中のレポーター遺伝子の上流に挿入する。各プラスミドは、構成的プロモータの制御下で抗生物質耐性マーカーを含む。これらの個々の安定な細胞系の各々におけるキメラ受容体変異体およびＲＥは、リガンドの不在下でのレポーター発現のレベル、並びにリガンドの存在下でのレポーター活性の誘導倍率に関して特徴付けられる。
【０１８１】
その後、官能性キメラ受容体およびそれらに対応するＲＥをコードするプラスミドの群を、連続的に、哺乳類細胞に安定にトランスフェクションさせる。各プラスミドのトランスフェクションの後、細胞は、細胞が含むキメラ受容体についてのリガンドに対する細胞の応答について分析される。これらのプラスミドの安定な蓄積を有する細胞の選択は、細胞を複数の抗生物質（ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブレオマイシン、ブラストサイジン）に耐性にさせる蛋白質をコードする遺伝子の使用を要求する。誘導性遺伝子発現についてのアッセイは、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および成長ホルモンのような複数のレポーター蛋白質を要求する。これらの材料は全て容易に入手可能である。
【０１８２】
受容体およびそれらに対応する応答エレメントの全てをコードするＤＮＡが、ゲノム内に安定に蓄積された後、結果として生じた細胞系は、同じ細胞の内容物中の異なるリガンドと異なるキメラ受容体の間の交差反応性（オルトゴナリティー）を評価するために使用される。細胞を個々のリガンドとインキュベートして、全てのレポーター蛋白質の活性を分析する。細胞は、リガンドの様々の組合せでもインキュベートされ、続いて、全てのレポーター蛋白質が分析される。
【０１８３】
好ましくは、リガンド／ＬＢＤ対の各々についてのリガンド／ＬＢＤ相互作用は、０．１から１０００ｎｍの間のＫｄを示す。さらに好ましくは、リガンド／ＬＢＤ対の各々についてのリガンド／ＬＢＤ相互作用は、０．１から１００ｎｍの間のＫｄを示す。いっそうさらに好ましくは、リガンド／ＬＢＤ対の各々についてのリガンド／ＬＢＤ相互作用は、０．１から１０ｎｍの間のＫｄを示す。最も好ましくは、リガンド／ＬＢＤ対の各々についてのリガンド／ＬＢＤ相互作用は、０．１から１．０ｎｍの間のＫｄを示す。
【０１８４】
本発明の複数の遺伝子調節系は、遺伝子調節の範囲そのもののみならず、例えば、プロテオミクス、機能的ゲノミクス、遺伝子治療、細胞ベースの高処理能アッセイ、バイオセンサー、毒性スクリーニング、および大規模蛋白質生産のような他の主要な領域でも有用である。
【０１８５】
特に、機能的ゲノミクスおよびプロテオミクスは、複数の遺伝子が関与する多機能の表現型を扱うことの不能性により、今日阻げられている。膨大な例がある。最も劇的なもののいくつかとして、例えば、２０個以上の蛋白質が関与することを特徴とするｗｎｔ／カテニン経路のようなシグナル伝達カスケードが挙げられる。この経路は、癌、神経変性疾病、免疫系機能不全およびその他に関連している。機能的ゲノミクスおよびプロテオミクス研究における経路のメンバーの間での相互作用を分析することは、複数遺伝子調節系の出現により大いに促進される。その後、研究者は、同時に複数因子を制御し、さらに遺伝子ノックアウト、ノックインまたは突然変異誘発戦略に基づく技術的アプローチの現状よりも、よりいっそう厳密に、鍵となる相互作用を決定しうる。
【０１８６】
同様に、特定の遺伝子治療は、調節されるべき遺伝子の１以上を要求する。例えば、サイトカインおよび抗原遺伝子カクテルの導入を通じて、癌に対する免疫応答を生じさせることは、複数制御系を要求する。これは、安全に、かつ定量的で、まとめられた方法で、機能する治療を可能にする。
【０１８７】
本発明の複数遺伝子調節系は、その用途によって、現在使用されている他の遺伝子誘導系より多くの利点を示す。プロテオミクスおよび機能的ゲノミクスでは、細胞表現型および遺伝子機能が分析される方法を明らかに変化させる。同時に、１つの遺伝子／蛋白質の代わりに、それは、細胞中の全体の分子経路の分析を可能にし、それは、実際の生物で実際に起こることによりいっそう近い。蛋白質生成または高処理能スクリーニングでは、当該技術は、並行的な蛋白質生成について、または複数標的に対して同時にスクリーニングすることについての新たな基盤である。
【０１８８】
宿主細胞および非ヒト生物
本発明の別の態様は、本発明に従った、複数遺伝子調節系を含む単離された宿主細胞に関する。上に記述されるとおり、本発明の複数遺伝子調節系は、宿主細胞中の遺伝子発現を調節するために使用されうる。トランスジェニック宿主細胞での発現は、種々の目的の遺伝子の発現のために有用でありうる。出願人らの発明は、原核生物および真核生物の宿主細胞での遺伝子発現の調節を提供する。トランスジェニック宿主細胞での発現は、目的とする様々なポリペプチドの発現に有用であり、それに限定されないが、植物中に生産されるワクチンとしての抗原；α−アミラーゼ、フィターゼ、グルカナーゼ、およびキシラナーゼの様な酵素；昆虫、線形動物、真菌、細菌、ウイルス、および無生物性ストレスに対する耐性についての遺伝子；抗原、栄養、医薬、ビタミン；アミノ酸含有率、耐除草剤性、寒冷、渇水、および熱寛容を改変する遺伝子；工業製品、油、蛋白質、炭化水素、抗酸化剤、雄不稔植物、花、燃料、他のアウトプット特性、治療用ポリペプチド、経路中間体が挙げられ、また；従来は宿主を用いることができなかった新たな産物を合成するために、宿主ですでに存在する経路の改変のためのもの；；細胞ベースのアッセイ；機能的ゲノミクスアッセイ、生物治療用蛋白質製品、プロテオミクスアッセイ等にも有用である。さらに、遺伝子産物は、宿主のより高い成長収率を付与するのに、または利用されるべき別の成長状態を可能にするのに有用でありうる。
【０１８９】
特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、原核生物の宿主細胞または真核生物の宿主細胞である。別の特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、無脊椎動物宿主細胞または脊椎動物宿主細胞である。好ましくは、単離された宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、線形動物細胞、昆虫細胞、魚類細胞、植物細胞、鳥類細胞、動物細胞、哺乳類細胞からなるされる群から選択される。さらに好ましくは、単離された宿主細胞は、酵母細胞、線形動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、ゼブラフィッシュ細胞、ニワトリ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メスウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、類人猿細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、またはヒト細胞である。
【０１９０】
好ましい宿主細胞の例としては、それに限定されないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）のような真菌または酵母種、またはシネコサイスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エッシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の属のような細菌種；リンゴ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、パールミレット、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、クロヒヨコマメ（ｂｌａｃｋｇｒａｍ）、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、エンバク、オクラ、パニクム（Ｐａｎｉｃｕｍ）、パパイア、落花生、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、ファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、ジャガイモ、カボチャ、コメ、モロコシ、ダイズ、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギからなる群から選択される植物種；動物；および哺乳類宿主細胞が挙げられる。
【０１９１】
特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、サッカロマイセス、ピヒア、およびカンジダ宿主細胞からなる群から選択される酵母細胞である。
【０１９２】
別の特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）線虫細胞である。
【０１９３】
別の特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、リンゴ、アラビドプシス、パールミレット、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、クロヒヨコマメ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、エンバク、オクラ、パニクム、パパイア、落花生、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、ファセオルス、ジャガイモ、カボチャ、コメ、モロコシ、ダイズ、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギ細胞からなる群から選択される植物種である。
【０１９４】
別の特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、ゼブラフィッシュ細胞である。
【０１９５】
別の特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、ニワトリ細胞である。
【０１９６】
別の特定の実施形態で、単離された宿主細胞は、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、メスウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される哺乳類細胞である。
【０１９７】
宿主細胞形質転換は、当業界でよく知られており、それに限定されないが、エレクトロポレーション、ウイルス感染、プラスミド／ベクタートランスフェクション、非ウイスル性ベクター媒介トランスフェクション、アグロバグテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介トランスフェクション、微粒子銃等を含む多様な方法によって達成されうる。所望の遺伝子産物の発現は、適切な条件下で形質転換された宿主細胞を培養し、形質転換遺伝子の発現を誘導することを含む。原核生物および真核生物の細胞での培養条件および遺伝子発現プロトコールは、当業界でよく知られている（実施例の全般的方法の区分参照）。細胞が収穫され、遺伝子産物は、遺伝子産物に特異的なプロトコールによって単離されうる。
【０１９８】
さらに、トランスフェクションされたポリヌクレオチドの発現を調節するか、または望ましい特定の形態で、ポリペプチド産物を改変および加工する、宿主細胞が選択されうる。異なる宿主細胞は、蛋白質の翻訳並びに翻訳後のプロセシング、および改変［例えば、グリコシル化、切断（例えば、シグナル配列の）］についての特徴的および特異的機構を有する。発現される外因性蛋白質の望ましい改変およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系が選ばれうる。例えば、細菌系での発現は、非グリコシル化コア蛋白質産物を生成するために使用されうる。しかし、細菌中で発現されたポリペプチドは、適切に折畳まれ得ない。酵母における発現は、グリコシル化産物を産出しうる。真核生物細胞での発現は、異種蛋白質の「本来」のグリコシル化および折畳みの可能性を増しうる。さらに、哺乳類細胞での発現は、ポリペプチドの活性を再構築、または構築するための道具を提供しうる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度に、蛋白質分解性切断のようなプロセッシング反応に影響を及ぼしうる。
【０１９９】
出願人の発明は、本発明に従った単離された宿主細胞を含む非ヒト生物体にも関する。特定の実施形態で、非ヒト生物体は、原核生物の生物体または真核生物の生物体である。別の特定の実施形態で、非ヒト生物は、無脊椎動物または脊椎動物である。
【０２００】
好ましくは、非ヒト生物は、細菌、真菌、酵母、線虫、昆虫、魚類、植物、鳥類、動物および哺乳類からなる群から選択される。さらに好ましくは、非ヒト生物は、酵母、線虫、昆虫、植物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヤギ、メスウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、類人猿、サル、またはチンパンジーである。
【０２０１】
特定の実施形態で、非ヒト生物は、サッカロマイセス、ピヒア、およびカンジダから構成される群から選択される酵母である。
【０２０２】
別の特定の実施形態で、非ヒト生物は、カエノルハブディティス・エレガンス線虫である。
【０２０３】
別の特定の実施形態で、非ヒト生物は、リンゴ、アラビドプシス、パールミレット、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、クロヒヨコマメ、ヒヨコマメ、チリ、キュウリ、ナス、ソラマメ、トウモロコシ、メロン、キビ、ヤエナリ、エンバク、オクラ、パニクム、パパイア、落花生、エンドウ、コショウ、キマメ、パイナップル、ファセオルス、ジャガイモ、カボチャ、コメ、モロコシ、ダイズ、スカッシュ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、サツマイモ、茶、トマト、タバコ、スイカ、およびコムギからなる群から選択される植物である。
【０２０４】
別の特定の実施形態で、非ヒト生物は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）である。
【０２０５】
遺伝子発現／転写の測定
本発明の複数遺伝子調節系および方法の１つの有用な測定は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ種の同一性および存在量を含む、細胞の転写状態のものである。このような測定は、いくつかの既存の遺伝子発現技術のいずれかによる、ｃＤＮＡ存在量を測定することによって簡易に行われる。
【０２０６】
核酸アレイ技術は、異なるｍＲＮＡ発現を決定するための有用な技術である。このような技術としては、例えば、オリゴヌクレオチドチップおよびＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。これらの技術は、固体支持体上に固定され、細胞、組織または生物全体から抽出した総ｍＲＮＡプールから製造した、またはｃＤＮＡに変換されたプローブにハイブリダイゼイズされる、異なる遺伝子またはｃＤＮＡに対応するＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドによる。オリゴヌクレオチドチップは、光リソグラフ技術を用いて、基体上に合成されたオリゴヌクレオチドのアレイである。１７００の遺伝子まで分析できるチップが製造された。ＤＮＡマイクロアレイは、顕微鏡スライドガラス上に機械的にプリントされたＤＮＡサンプル、典型的にはＰＣＲ産物のアレイである。各遺伝子は、全部または部分長標的ＤＮＡ配列によって分析される。１０，０００の遺伝子までを有するマイクロアレイは、現在、市販で日常的に製造される。これらの２つの技術の間の主な差は、オリゴヌクレオチドチップが、一般に、短いＤＮＡ分子の分画を可能にする２５マーのオリゴヌクレオチドを利用するのに対して、マイクロアレイの、およそ１０００塩基対という、より長い型ＤＮＡ標的は、複雑なＤＮＡ混合物を分画する上でさらなる感度を供しうることである。
【０２０７】
本発明の出願人の複数遺伝子調節系および方法の有用な他の測定は、当業界でよく知られた方法を用いて細胞中に存在する構成的蛋白質種の存在量を測定することによって細胞の翻訳状態を測定するものである。
【０２０８】
種々の生理学上の機能に関連した遺伝子の同定が望まれる場合、細胞成長、アポトーシス、老化、分化、接着、特定分子に対する結合、別の細胞に対する結合、細胞組織、器官形成、細胞間輸送、輸送促進、エネルギー変換、代謝、筋形成、神経形成、および／または造血のような機能における変化が、測定されるアッセイが使用されうる。
【０２０９】
さらに、選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子発現は、出願人らの発明を使用した遺伝子発現を測定するために使用されうる。
【０２１０】
遺伝子発現の産物を検出する別の方法は、当業界でよく知られており、サザンブロット（ＤＮＡ検出）、ドットまたはスロットブロット（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ノーザンブロット（ＲＮＡ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＮＡ）、ウエスタンブロット（ポリペプチド検出）、およびエライザ（ＥＬＩＳＡ）（ポリペプチド）分析が挙げられる。好ましさはより低下するが、標識蛋白質は、それがハイブリダイズする特定の核酸配列を検出するために使用されうる。
【０２１１】
ある種の場合には、核酸配列の量を増幅することが必要である。これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（「ＳＤＡ」）、転写ベースの増幅などを含めた、多数の適切な方法の内の１つまたはそれ以上を用いて行われうる。ＰＣＲは、例えば、ハイブリダイズ条件下で、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、核酸サンプルが、１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、検出されるべき特異的配列の一方の鎖（テンプレート）にハイブリダイズする１つのプライマーを用いて処理される公知技術によって行われる。プライマーは、それらとハイブリダイズする特異的配列の各テンプレート鎖と十分に相補的である。各プライマーの伸長産物が合成され、それがハイブリダイズする核酸テンプレート鎖に相補的である。各プライマーから合成された伸長産物は、同じプライマーを用いた伸長産物のさらなる合成のためのテンプレートとしても役割を果たしうる。十分な回数の伸長産物の合成に続いて、検出されるべき配列が存在するかどうかを評価するために、サンプルは上述の通り分析されうる。
【０２１２】
本発明は、本発明の例示として提供される以下の限定なしの実施例を参照してさらに理解されうる。
【０２１３】
実施例
全般的方法
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学、および当業界の技術の範囲内の組換えＤＮＡ技術を使用することができる。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第二版（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（ここで「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年」）；ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５年）］；転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）］；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６年）］；固定化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）［ＩＲＬプレス、（１９８６年）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、分子クローニングに対する実践的指針（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ，インク．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（１９９４年）参照。
【０２１４】
従来のクローニングビヒクルとしては、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ型プラスミドおよびＭ１３シリーズのファージが挙げられる。これらは、市販で得られうる（ベセダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））。
【０２１５】
ライゲーションについては、ＤＮＡフラグメントは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動により、それらのサイズによって分離され、フェノールで、もしくはフェノール／クロロホルム混合液で抽出され、エタノールで沈殿させ、その後、供給者の推奨に従って、ファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボズ（Ｂｉｏｌａｂｓ））の存在下でインキュベートされうる。
【０２１６】
５’突出末端の充填は、供給者の説明書にしたがって、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（バイオラボズ）のクレノウフラグメントで行われうる。３’突出末端の破壊は、製造業者の推奨に従って使用されるファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（バイオラボズ）の存在下で行われる。５’突出末端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた制御された処置によって行われる。
【０２１７】
合成オリゴデオキシヌクレオチドによるインビトロで行われる突然変異誘発は、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって配布されるキットを用いて、Ｔａｙｌｏｒら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３巻（１９８５年）８７４９〜８７６４頁］により開発された方法によって行われうる。
【０２１８】
ＰＣＲ［ポリメラーゼ触媒連鎖反応、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０巻（１９８５年）１３５０〜１３５４頁；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．およびＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５巻（１９８７年）３３５〜３５０頁］技術によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、製造業者の説明書にしたがって、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて行われうる。
【０２１９】
ヌクレオチド配列の認証は、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって供給されるキットを用いて、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４巻（１９７７年）５４６３〜５４６７頁］によって開発された方法により行われうる。
【０２２０】
プラスミドＤＮＡは、製造業者の指示にしたがって、キアゲン・プラスミド精製系（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）によって精製されうる。
【０２２１】
遺伝子配列の操作は、ジェネティック・コンピューター・グループ，インク．（ウイスコンシン・パッケージ・バージョン９．０、ジェネティック・コンピューター・グループ，インク．（ＧＣＧ）、ウイスコンシン州マディソン）から入手可能なプログラムのパッケージソフトを使用して達成されうる。ＧＣＧプログラム「パイルアップ」が使用される場合、１２のギャップ作成デフォルト値、および４のギャップ伸長デフォルト値が使用されうる。ＣＧＣ「ギャップ」または「ベストフィット」プログラムが使用される場合、５０のデフォルトギャップ作成ペナルティーおよび３のデフォルトギャップ伸長ペナルティーが使用されうる。ＧＣＧプログラムパラメータが、試行されない任意の場合に、これらのまたは他の任意のＧＣＧプログラムで、デフォルト値が使用されうる。
【０２２２】
略号の意味は以下のとおりである：「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「Ａ」はアデニンまたはアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミンまたはチミジンを意味し、「Ｇ」はグアニンまたはグアノシンを意味し、「Ｃ」はシチジンまたはシトシンを意味し、「ｘｇ」は重力倍を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ａａ」はアミノ酸を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋ」はキロを意味し、「μ」はマイクロを意味し、「℃」は摂氏温度を示す。
【０２２３】
実施例１
この実施例は、本発明による複数誘導性遺伝子発現系で使用するための数種の遺伝子発現カセットの構築を記述する。出願人らは、トウヒシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）ＥｃＲ（「ＣｆＥｃＲ」）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＥｃＲ（「ＤｍＥｃＲ」）、ツマグロヨコバイ（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｉｘ ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）エクジソン受容体（「ＮｃＥｃＲ」）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）レチノイドＸ受容体アイソフォームα（「ＭｍＲＸＲα」）、およびトノサマバッタ（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）無脊椎動物ＥｃＲ相同体ウルトラスパイラクル蛋白質（「ＬｍＵＳＰ」）をべーすとした、数種の遺伝子発現カセットを構築した。作成された受容体構築物は、ＥｃＲもしくは脊椎動物ＲＸＲのいずれかのリガンド結合ドメイン；およびＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）もしくはＶＰ１６トランス活性化ドメイン（ＡＤ）を含む。レポーター構築物は、レポーター遺伝子、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）または分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含み、ＧＡＬ４ ＤＢＤが結合するＧＡＬ４応答エレメントを含む合成プロモータ構築物に操作可能に結合している。これらの受容体およびレポーター構築物の種々の組合せは、下に記述されるとおり、哺乳類細胞に同時形質導入された。
【０２２４】
遺伝子発現カセット：二重スイッチエクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系で使用するための遺伝子発現カセットは、当業界で利用可能な標準クローニング方法を用いて、以下のとおりに構築された。以下は、ここに記述される実施例で使用される各スイッチの調製および組成の簡潔な説明である。
【０２２５】
１．１−ＧＡＬ４ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲ−ＬｍＵＳＰ−ＥＦキメラおよびＬｅｘＡＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲ−ＬｍＵＳＰ−ＥＦキメラ：キイロショウジョウバエＥｃＲから得られるＣ、Ｄ、ＥおよびＦドメインをコードするポリヌクレオチド（「ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦ」；配列番号：１）は、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（「Ｇａｌ４ＤＮＡＢＤ」または「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：２）に融合され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ（配列番号：３）の制御下に配置された。トウヒシントメハマキＥｃＲから得られるＣ、Ｄ、ＥおよびＦドメインをコードするポリヌクレオチド（「ＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ」；配列番号：４）は、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（「ＬｅｘＡＤＮＡＢＤ」または「ＬｅｘＡＤＢＤ」；配列番号：５）に融合され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ（配列番号：３）の制御下に配置された。マウスレチノイドＸ受容体アイソフォームα（「ＭｍＲＸＲα」）、およびトノサマバッタウルトラスパイラクル蛋白質（「ＬｍＵＳＰ−ＥＦ」）（配列番号：６）から得られるキメラＥＦドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＶＰ１６から得られるトランス活性化ドメインをコードするポリヌクレオチド（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：７）に融合され、さらにＣＭＶプロモータ／エンハンサ（配列番号：３）の制御下に配置された。６つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「６ＸＧＡＬ４ＲＥ」；配列番号：８）が、アルブミン最小プロモータ（配列番号：９）に融合され、さらに分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子（配列番号：１０）の上流に配置された。８つのコンセンサスＬｅｘＡ応答エレメント結合部位（「８ｏｐＬｅｘＡＲＥ」；配列番号：１１）は、合成ＴＡＴＡＡ（配列番号：１２）に融合され、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：１３）の上流に配置された。
【０２２６】
１．２ ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦおよびＧＡＬ４ＮｃＥｃＲ−ＣＤＥ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦ：この構築物は、以下のとおりに製造された。トウヒシントメハマキＥｃＲから得られるＤ、ＥおよびＦドメインをコードするポリヌクレオチド（「ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ」；配列番号：１４）は、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：２）に融合され、さらにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ（配列番号：３）の制御下に配置された。ツマグロヨコバイエクジソン受容体から得られるＣ、Ｄ、およびＥドメインをコードするポリヌクレオチド（「ＮｃＥｃＲ−ＣＤＥ」；配列番号：１５）は、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（「Ｇａｌ４ＤＢＤ」；配列番号：２）に融合され、さらにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ（配列番号：３）の制御下に配置された。マウスレチノイドＸ受容体アイソフォームα（「ＭｍＲＸＲα」；配列番号：１６）から得られるＥおよびＦドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＶＰ１６から得られるトランス活性化ドメインをコードするポリヌクレオチド（「ＶＰ１６ＡＤ」；配列番号：７）に融合され、さらにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ（配列番号：３）の制御下に配置された。６つのコンセンサスＧＡＬ４応答エレメント結合部位（「６ＸＧＡＬ４ＲＥ」；配列番号：８）が、合成ＴＡＴＡＡ（配列番号：１２）に融合され、さらにホタルのルシフェラーゼ遺伝子（配列番号：１３）の上流に配置された。
【０２２７】
実施例１．１および１．２の結果として生じる二重スイッチ系は、ポナステロンＡ（ＰｏｎＡ）ステロイド性リガンドおよびＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（ＧＳ（商標）−Ｅ）非ステロイド性リガンドの存在下で、それらをＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＣＨＯ細胞にトランスフェクションすることによって、活性について試験された。
【０２２８】
リガンド：ステロイド性リガンドポナステロンＡは、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入された。非ステロイド性リガンドＮ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン（ＧＳ−Ｅ非ステロイド性リガンド）は、ローム アンド ハース カンパニー（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）で合成された合成の安定なエクジソンリガンドである。両方のリガンドを、ＤＭＳＯに溶解させ、ＤＭＳＯの最終濃度を、対照および試料の両方において０．１％に維持した。
【０２２９】
トランスフェクション：実施例１．１および１．２で概説される二重スイッチ構築物に対応するＤＮＡを、以下のとおりマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ；実施例１．１）またはＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ；実施例１．２）にトランスフェクションさせた。細胞の培養および保持のための標準的な方法は次の通りである。細胞が、５０％コンフルエンシーに達したときに、それを収穫し、それぞれ、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含む２．５、１．０、または０．５ｍｌの成長培地に、それぞれ、１２５，０００、５０，０００、または２５，０００細胞で、６−、１２−、または２４−ウェルプレートに播種した。翌日に、細胞を、成長培地で洗浄し、４時間トランスフェクションさせた。スーパーフェクト（商標）（キアゲン，インク．）を、３Ｔ３細胞のために使用し、リポフェクトＡＭＩＮＥ（商標）（ライフ・テクノロジーズ）を、トランスフェクション試薬としてＣＨＯ細胞のために使用した。１２穴プレートについて、４μｌのスーパーフェクトまたはリポフェクトＡＭＩＮＥを、１００μｌの成長培地と混合させた。１μｇのレポーター構築物および０．２５μｇの分析されるべき受容体対の各受容体構築物を、トランスフェクションミックスに添加した。チミジンキナーゼ（ＴＫ）構成的プロモータに操作可能に結合され、その制御下に置かれるレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ、ウミシイタケ）ルシフェラーゼ遺伝子を含む第２のレポーター構築物を添加し〔ｐＴＫＲＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．１μｇ／トランスフェクションミックス〕、標準化のために使用した。トランスフェクションミックスの内容物を、ボルテックス混合機で混合させて、３０分間室温に静置させた。インキュベーションの終わりに、そのトランスフェクションミックスを、４００μｌ成長培地で維持された細胞に添加した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、４時間維持した。インキュベーションの終わりに、２０％ＦＢＳおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）またはステロイド性または非ステロイド性リガンドのＤＭＳＯ溶液のいずれかを含む５００μｌの成長培地を添加し、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、４８時間維持した。細胞を収穫し、レポーター活性を分析した。同じ手段を６および２４ウェルプレートについても行ったが、ただし全ての試薬が、６ウェルプレートについては二倍にされ、２４ウェルプレートについては半分に減少された。
【０２３０】
レポーターアッセイ：リガンドを添加した４８時間後に、細胞を回収し、レポーター活性を、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得られるデュアル−ルシフェラーゼ（商標）レポーターアッセイ系を用いて定量した。１２５μｌの受動溶解緩衝液（プロメガ社から得られるデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系の一部）を、２４ウェルプレートの各ウエルに添加した。プレートを、１５分間、ロータリーシェーカーに入れた。２０μｌの溶解物を分析した。プロメガ社から得られるデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いて、製造業者の指示にしたがって、ルシフェラーゼ活性を測定した。トロピックス（ＴＲＯＰＩＸ）から得られるホスフォライト（商標）アッセイキットを用いて、製造業者の指示にしたがって、アルカリホスファターゼ活性を測定した。標準としてウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを使用して、全てのルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ活性を標準化させた。ＤＭＳＯ処理された細胞（未処理対照）で標準化した相対的光単位（「ＲＬＵ」）で、リガンド処理された細胞における標準化されたＲＬＵを割ることによって活性倍率を計算した。
【０２３１】
実施例２
この実施例は、２つのレポーター遺伝子発現カセットが、２つの異なるリガンドによって独立に調節されることを特徴とする、２つのレポーター遺伝子発現カセットの発現を調節する出願人の発明の二重スイッチ遺伝子発現系の能力を記述する。特に、１つのレポーター遺伝子発現カセットは、ステロイドリガンドによって誘導的に調節され、他方のレポーター遺伝子発現カセットは、非ステロイドリガンドによって誘導的に調節される。簡潔には、出願人らは、上記実施例１．１に記述される二重スイッチ誘導性遺伝子発現系を調製した。次いで、結果として生じる二重スイッチ系は、以下のとおりにＮＩＨ３Ｔ３哺乳類細胞で試験された。
【０２３２】
実施例１．１に概説された二重スイッチ構築物に対応するＤＮＡを、実施例１で記述されるとおりに、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクションさせた。トランスフェクションインキュベーション期間の終わりに、２０％ＦＢＳ、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）または０．０２、０．１、０．５、もしくは２．５μＭＰｏｎＡステロイド性リガンドおよび／またはＧＳ−Ｅ［Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン］非ステロイド性リガンドのＤＭＳＯ溶液のいずれかを含む２５０μｌの成長培地を添加し、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性を上述のとおり分析した。
【０２３３】
図１に示されるとおり、細胞を非ステロイド性リガンド単独で処理した場合、ルシフェラーゼ活性のみが誘導された（図１Ａ参照）。細胞をステロイド性リガンド単独で処理した場合、ＳＥＡＰレポーター活性のみが誘導された（図１Ｂ参照）。細胞がステロイド性および非ステロイド性リガンドの両方で処理された場合、両方のレポーター遺伝子活性が誘導された（図１Ｃ参照）。この実施例は、２つの個々に操作可能な遺伝子発現系であって、１方が双翅目ＥｃＲベース（ＤｍＥｃＲ）および他方には鱗翅目ＥｃＲベース（ＣｆＥｃＲ）のものを含む複数誘導性遺伝子発現系を示す。
【０２３４】
実施例３
この実施例は、２つのレポーター遺伝子発現カセットが、２つの異なるリガンドによって独立に調節されることを特徴とする、２つのレポーター遺伝子発現カセットの発現を調節する出願人の発明の二重スイッチ遺伝子発現系の能力を記述する。特に、一方のレポーター遺伝子発現カセットは、ステロイドリガンドによって誘導的に調節され、他方のレポーター遺伝子発現カセットは、非ステロイドリガンドによって誘導的に制御される。簡潔には、出願人らは、上記実施例１．２に記述される二重スイッチ誘導性遺伝子発現系を調製した。次いで、結果として生じる二重スイッチ系は、以下のとおりにチャイニーズ・ハムスター卵巣ＣＨＯ細胞で試験された。
【０２３５】
実施例１．２に概説された二重スイッチ構築物に対応するＤＮＡを、実施例１で記述されるとおりに、ハムスターＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクションさせた。ＣＨＯ細胞を、１）ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦおよびｐＦＲＬｕｃ、または２）ＧＡＬ４ＮｃＥｃＲ−ＣＤＥ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦおよびｐＦＲＬｕｃでトランスフェクションさせた。トランスフェクションインキュベーション期間の終わりに、２０％ＦＢＳ、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；対照）または０．１、１、５、または１０μＭのＰｏｎＡステロイド性リガンドまたはＧＳ−Ｅ［Ｎ−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン］非ステロイド性リガンドのＤＭＳＯ溶液のいずれかを含む２５０μｌの成長培地を添加し、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で、４８時間維持した。細胞を回収し、レポーター活性を上述のとおり分析した。
【０２３６】
図２に示されるとおり、ＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦおよびｐＦＲＬｕｃでトランスフェクションされた細胞を、非ステロイド性リガンド単独で処理した場合、ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦによって調節されたルシフェラーゼ活性が、誘導されたが（図２のＣｆＥｃＲ／ＧＳＥ参照）、しかしステロイドリガンドＰｏｎＡを用いたこれらのトランスフェクション細胞の処理は、レポーター遺伝子発現を誘導しなかった（図２のＣｆＥｃＲ／ＰｏｎＡ参照）。ＧＡＬ４ＮｃＥｃＲ−ＣＤＥ／ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦおよびｐＦＲＬｕｃでトランスフェクションされた細胞を、ステロイド性リガンド単独で処理した場合、ＮｃＥｃＲ−ＤＥによって制御されたルシフェラーゼレポーター活性が誘導された（図２のＮｃＥｃＲ／ＰｏｎＡ参照）が、しかしながら非ステロイド性リガンドを用いたこれらのトランスフェクション細胞の処理は、レポーター遺伝子発現を誘導しない（図２のＮｃＥｃＲ／ＧＳＥ参照）。ＰｏｎＡに対するＮｃＥｃＲ−ＤＥＦの非感受性およびＧＳ−Ｅに対するＮｃＥｃＲ−ＣＤＥの非感受性が、ここで記述された２つの遺伝子発現調節系をオルトゴナルに調節させる。したがって、この実施例は、本発明の複数誘導性遺伝子発現系で使用するための２つの個々に操作可能な遺伝子発現系であって、一方が鱗翅目ＥｃＲ−ベース（ＣｆＥｃＲ）および他方が同翅亜目ＥｃＲ−ベース（ＮｃＥｃＲ）のものを示す。
【０２３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＬｍＵＳＰ−ＥＦキメラ、ｐ８ＯＰＬｅｘＡＲＥＬｕｃ、並びにｐ６ＸＧＡＬＲＥＴＴＰＳＥＡＰと一緒にＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションされたＧＡＬ４ＤｍＥｃＲ−ＣＤＥＦおよびＬｅｘＡＣｆＥｃＲ−ＣＤＥＦ構築物を通じた、ＰｏｎＡおよび／またはＧＳ−Ｅによる、レポーター遺伝子のオルトゴナルトランス活性化。バーの頂部の数は、ＤＭＳＯレベルを越える増加倍率を示す。
【図２】
ＶＰ１６ＭｍＲＸＲα−ＥＦおよびｐＦＲＬｕｃレポーターと一緒にＣＨＯ細胞へトランスフェクションされたＧＡＬ４ＣｆＥｃＲ−ＤＥＦまたはＧＡＬ４ＮｃＥｃＲ−ＣＤＥを通じた、ＰｏｎＡまたはＧＳ−Ｅによる、レポーター遺伝子のトランス活性化。バーの頂部の数は、ＤＭＳＯレベルを越える増加倍率を示す。

Claims (20)

  1. 複数の個々に操作可能な遺伝子調節系を含む複数誘導性遺伝子調節系であって、
    ａ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が、
    ｉ）Ａ）ＤＮＡ結合ドメイン、
    Ｂ）リガンド結合ドメイン、および
    Ｃ）トランス活性化ドメイン、
    を含む受容体複合体をコードする一種以上のポリヌクレオチド；
    ｉｉ）リガンド；および
    ｉｉｉ）Ａ）外因性または内因性ポリヌクレオチド、および
    Ｂ）応答エレメント、
    を含むポリヌクレオチド；
    を含み、ここで、
    Ａ）外因性または内因性ポリヌクレオチドは応答エレメントに操作可能に結合し；さらに
    Ｂ）リガンドの存在下または非存在下における、応答エレメントへのＤＮＡ結合ドメインの結合が、外因性もしくは内因性ポリヌクレオチドの活性化または抑制を生じさせ；さらに
    ｂ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が、複数誘導性遺伝子調節系において存在する他の個々に操作可能な遺伝子調節系に対してオルトゴナルである、
    前記複数誘導性遺伝子調節系。
  2. 操作可能な遺伝子発現調節系の各々が下記ａ）、ｂ）またはｃ）を含む請求項１に記載の複数誘導性遺伝子調節系：
    ａ）
    ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む第１の遺伝子発現カセット、
    ｉｉ）リガンド、および
    ｉｉｉ）Ａ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現が調節されるべき遺伝子、を含む第２の遺伝子発現カセット；
    ｂ）
    ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む第１の遺伝子発現カセット、
    ｉｉ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、および、キメラリガンド結合ドメイン（当該キメラリガンド結合ドメインは、２つのポリペプチドフラグメントを含み、ここで第１のポリペプチドフラグメントが、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものであり、また第２のポリペプチドフラグメントが、異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものである）からなる群より選択される第２の核受容体リガンド結合ドメイン、
    ｉｉｉ）リガンド、および
    ｉｖ）Ａ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）第１の遺伝子発現カセットのコードされたポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現が調節されるべき遺伝子、を含む第２の遺伝子発現カセット；または
    ｃ）
    ｉ）その発現が調節されるべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の遺伝子発現カセット、
    ｉｉ）トランス活性化ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２の遺伝子発現カセット、
    ｉｉｉ）リガンド、および
    ｉｖ）Ａ）第１の遺伝子発現カセットの第１のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）第２の遺伝子発現カセットの第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータおよびＣ）その発現が調節されるべき遺伝子、を含む第３の遺伝子発現カセット；
    ここで、ｃ）ｉ）またはｃ）ｉｉ）の核受容体リガンド結合ドメインの一つはＨ群核受容体リガンド結合ドメインである。
  3. 請求項１に記載の複数遺伝子調節系を含むウイルス。
  4. 請求項１に記載の複数遺伝子調節系を含む細胞。
  5. 請求項４に記載の細胞の一種以上を含むトランスジェニック生物体。
  6. 受容体複合体をコードするポリヌクレオチドの一種以上が核受容体複合体をコードする、請求項１に記載の複数誘導性遺伝子調節系。
  7. 受容体複合体をコードするポリヌクレオチドの一種以上が非哺乳動物受容体複合体をコードする、請求項１に記載の複数誘導性遺伝子調節系。
  8. 受容体複合体がエクジソン受容体複合体である、請求項６に記載の複数誘導性遺伝子調節系。
  9. 複数の個々に操作可能な遺伝子調節系を含む複数誘導性遺伝子調節系であって、
    ａ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が
    ｉ）一種以上の受容体複合体であって、各々が、
    Ａ）ＤＮＡ結合ドメイン、
    Ｂ）リガンド結合ドメイン、および
    Ｃ）トランス活性化ドメイン、
    を含む当該受容体複合体；
    ｉｉ）リガンド；
    ｉｉｉ）
    Ａ）外因性または内因性遺伝子、および
    Ｂ）応答エレメント、
    を含むポリヌクレオチド；
    を含み、
    ここで、
    Ａ）外因性または内因性遺伝子は応答エレメントの制御下にあり；さらに
    Ｂ）リガンドの存在下または非存在下における応答エレメントへのＤＮＡ結合ドメインの結合が、遺伝子の活性化または抑制を生じさせ；さらに、
    ｂ）個々に操作可能な遺伝子調節系の各々が、複数誘導性遺伝子調節系において存在する他の個々に操作可能な遺伝子調節系に対してオルトゴナルである、
    前記複数誘導性遺伝子調節系。
  10. 操作可能な遺伝子発現調節系の各々が下記ａ）、ｂ）またはｃ）を含む請求項９に記載の複数誘導性遺伝子調節系：
    ａ）
    ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメイン、を含むポリペプチド、
    ｉｉ）リガンド、および
    ｉｉｉ）Ａ）ａ）ｉ）のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）ａ）ｉ）のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現が調節されるべき遺伝子、を含む遺伝子発現カセット；
    ｂ）
    ｉ）トランス活性化ドメイン、その発現が調節されるべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメイン、および核受容体リガンド結合ドメインを含むポリペプチド、
    ｉｉ）脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、ウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメイン、および、キメラリガンド結合ドメイン（当該キメラリガンド結合ドメインは、２つのポリペプチドフラグメントを含み、ここで第１のポリペプチドフラグメントが、脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものであり、また第２のポリペプチドフラグメントが、異なる脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメイン、無脊椎動物レチノイドＸ受容体リガンド結合ドメインまたはウルトラスパイラクル蛋白質リガンド結合ドメインからのものである）からなる群より選択される第２の核受容体リガンド結合ドメイン、
    ｉｉｉ）リガンド、および
    ｉｖ）Ａ）ｂ）ｉ）のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）ｂ）ｉ）のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータ、およびＣ）その発現が調節されるべき遺伝子を含む遺伝子発現カセット；または
    ｃ）
    ｉ）その発現が調節されるべき遺伝子と関連する応答エレメントを認識するＤＮＡ結合ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチド、
    ｉｉ）トランス活性化ドメインおよび核受容体リガンド結合ドメインを含む第２のポリペプチド、
    ｉｉｉ）リガンド、および
    ｉｖ）Ａ）ｃ）ｉ）の第１のポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインにより認識される応答エレメント、Ｂ）ｃ）ｉｉ）の第２のポリペプチドのトランス活性化ドメインにより活性化されるプロモータおよびＣ）その発現が調節されるべき遺伝子、を含む遺伝子発現カセット；
    ここで、ｃ）ｉ）またはｃ）ｉｉ）の核受容体リガンド結合ドメインの一つがＨ群核受容体リガンド結合ドメインである。
  11. 請求項９に記載の複数遺伝子調節系を含むウイルス。
  12. 請求項９に記載の複数遺伝子調節系を含む細胞。
  13. 請求項１２に記載の細胞の一種以上を含むトランスジェニック生物体。
  14. 受容体複合体の一種以上がＨ群受容体複合体である、請求項９に記載の複数誘導性遺伝子調節系。
  15. Ｈ群受容体複合体がエクジソン受容体複合体である、請求項１４に記載の複数誘導性遺伝子調節系。
  16. ａ）インクリメンタルファルマコフォアエレメント変化に基づいて、種々に改変されたリガンドの組を定める工程、
    ｂ）各受容体ポリペプチドが、下記ｉ）〜ｖ）であるリガンド結合ドメインを含む受容体ポリペプチドの第１の組を調製する工程、
    ｉ）天然に存在するもの、
    ｉｉ）欠失、挿入または突然変異により改変されたもの、
    ｉｉｉ）キメラ、
    ｉｖ）合成物、または
    ｖ）これらの組み合わせ、
    ｃ）任意に、受容体ポリペプチドを細胞内に導入する工程、
    ｄ）種々に改変されたリガンドの組を用いて、ｃ）の細胞内でまたはインビトロで、遺伝子調節について、もしくはリガンド結合ドメインの結合について、または両方について、受容体ポリペプチドを検査する工程、
    ｅ）受容体ポリペプチド／リガンド組み合わせのオルトゴナリティーを決めて、種々の遺伝子調節特性を有するリガンドのサブセットを定める工程、
    ｆ）任意に、改変されたリガンドの組および改変された受容体ポリペプチドの組を用いて工程ａ）〜ｅ）を繰り返す工程、
    ｇ）各受容体ポリペプチドが、下記ｉ）〜ｖ）であるＤＮＡ結合ドメインを含む受容体ポリペプチドの第２の組を調製する工程、
    ｉ）天然に存在するもの、
    ｉｉ）欠失、挿入または突然変異により改変されたもの、
    ｉｉｉ）キメラ、
    ｉｖ）合成物、または
    ｖ）これらの組み合わせ、
    ｈ）外因性または内因性遺伝子および、下記ｉ）〜ｖ）である応答エレメントを含むＤＮＡ構造体の組を調製する工程：
    ｉ）天然に存在するもの、
    ｉｉ）欠失、挿入または突然変異により改変されたもの、
    ｉｉｉ）キメラ、
    ｉｖ）合成物、または
    ｖ）これらの組み合わせ、
    ｉ）受容体ポリペプチドの第１の組、受容体ポリペプチドの第２の組およびＤＮＡ構造体をクローニングし、次にクローンを細胞内に導入する工程、
    ｊ）工程ｅ）で同定されたリガンドへの共反応性について細胞をアッセイする工程、および
    ｋ）オルトゴナルな組の、リガンド、リガンド結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、および応答エレメントを、工程ｅ）およびｊ）の結果に基づいて選択して、複数誘導性遺伝子調節系を構成する工程
    を含む複数遺伝子調節系を開発する方法。
  17. 受容体ポリペプチドの一種以上が核受容体ポリペプチドである請求項１６に記載の方法。
  18. 受容体ポリペプチドの一種以上が非哺乳動物受容体ポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
  19. 核受容体ポリペプチドの一種以上がＨ群核受容体ポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
  20. 核受容体ポリペプチドの一種以上がエクジソン受容体ポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
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