JP2004525354A - 抗原特異的t−細胞の機能的精製のための可逆的mhc多量体染色法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞、特に抗原特異的T細胞の可逆的染色および機能的単離または特徴付けのための新規方法に関する。この技術を用いた場合には、T細胞の本来の機能的性質は、その同定および精製の後も本質的に保持することができる。したがって、この新規方法は、基礎研究および臨床的適用のための広範囲の便益を有する。
【0002】
その機能的性質を変化させることのない抗原特異的T細胞の同定および精製は、科学的および臨床的重要性を有する。その抗原特異性に基づくT細胞の直接的同定方法(ELISPOT アッセイ(1)、細胞間サイトカイン染色(2)、分泌アッセイ[アフィニティ マトリックス](3)、MHC多量体(2、4、5))が近年開発されている。しかしながら、これら同定技術に関する多くは、T細胞のin vitro刺激を必要とし、この場合、これは、細胞の表現型および機能的性質を著しく変化させるものである。今日まで、MHC多量体技術のみ、その表現型と独立して、抗原特異的T細胞の同定および精製を可能にしているが、しかしながら不運なことに、通常のMHC多量体染色は、機能的T細胞分析の妨げとなる。
【0003】
Yeeら(J.Immunol.162(1999)、2227−2234)は、ペプチド−MHC四量体を用いての、不均質個体群からの高アビティティーメラノーマ反応性細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の単離を記載している。MHC四量体はビオチン化(biotinylated)され、かつ蛍光標識基を有するアビジンと不可逆的に結合する。したがって、生理学的条件下での蛍光マーカーの除去は不可能である。Youdeら(Cancer Res. 60 (2000), 365−371)は、内在性ヒトパピローマウイルス抗原を認識するヒトCTLsを単離するための蛍光標識化されたMHC四量体の使用を記載している。さらに、ビオチン化MHC分子が使用されるが、この場合、これは、生理学的条件下でストレプトアビジンと不可逆的に結合するため、T細胞からの検出試薬の除去は不可能である。
【0004】
US−A−5985658では、可逆的な高アフィニティー相互作用に基づく、複数個の細胞からの標的細胞の分離方法が記載されている。方法は、標的細胞/細胞結合試薬/第1分子/第2分子/固体担体複合体の形成を含み、その際、細胞結合試薬は、標的細胞、たとえば抗体に対して特異的であり、その際、第1分子は可逆的に第2分子と結合し、その際、第1分子および第2分子の一つはカルモジュリンであり、かつ、第1分子および第2分子の他方は、カルモジュリン−結合ペプチドである。固体の担体に接着しない非標的細胞の除去後に、第1分子と第2分子との間の結合がリバースし、それによって標的細胞が、複数個の出発細胞から分離した細胞として放出される。
【0005】
この方法の欠点は、標的細胞結合試薬が、標的細胞群の単離を可能にために、標的細胞に対して高いアフィニティーを有していることである。そのため、第1分子と第2分子との間の結合を除去した後に、標的細胞特異的試薬は、依然として標的細胞に結合したままである。
【0006】
Wertherら(J. Immunol. Meth. 238 (2000), 134−141)は、単核細胞懸濁液から腫瘍細胞を単離するための抗体に基づくプロトコールを示している。標的細胞は、マグネットビーズと結合する抗体によって染色され、これによって、出発細胞群から分離される。マグネットビーズは、標的細胞の他の表現型的特徴付けを可能にするために、DNaseで消化することができるDNAリンカーを介して標的細胞と結合する。さらに、この方法は、標的細胞から容易に除去することができない、高アフィニティー標的細胞結合試薬、すなわち、抗体を使用しなければならないといった欠点を有する。
【0007】
Marelli−Bergら(J.Immunol.244(2000),205−215)は、マウス組織からの内皮細胞の単離のためのプロトコールを示している。内皮細胞は、特異的抗体によって標識化され、その後に、マイクロビーズと結合させることによって精製する。また、この方法も前記欠点を含むものである。
【0008】
本質的にその機能的性質を変化させることのない、可逆的染色工程を含む、抗原−特異的T細胞群の同定および精製のための新規方法が見出された。より詳細には、標的細胞群の精製のために使用される試薬は、標的細胞から完全に除去することができる。この試みは、MHC多量体染色の特異性および感受性と、細胞の機能的性質の保存とを組合せたものである。
【0009】
T細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)(6)に関連する、プロセス化(processed)抗原フラグメント(エピトープ)を認識する。T細胞の特異性は、そのT細胞レセプター(TCR)の構造によって決定され、この場合、これは、細胞表面上で高いレベルで発現する。エピトープ−特異的T細胞の直接的同定のための、TCRの天然リガンド−MHC/エピトープ複合体−の使用に関する従来の試みは成功しなかった。この試みの欠点は、多くは、TCR−MHC/ペプチド相互作用の低いアフィニティーによって説明することができ、この場合、これは、特に高い解離速度によって特徴付けられる(図1のA)。
【0010】
MHC/ペプチドの多量化(たとえば、四量体分子への多量化)は、TCRsとの相互作用の相対的アビディティーを、T細胞表面上での安定かつエピトープ−特異的結合を可能にする程度に増加させる(図1のB)。蛍光色素と結合したMHC多量化試薬は、フローサイトメトリーによって抗原−特異的T細胞の直接的同定のために使用することができる。この方法は、少なくとも数年間に亘ってのT細胞研究に革命を起こすものであり、これは、動物モデルならびにヒトにおいて直接的にex vivoで、最初に抗原−特異的T細胞群の視覚化を可能にした(7、8)。
【0011】
MHC多量体染色を4℃でおこなう場合には、T細胞は、その本来の表現型を変化させることなく、同定かつ精製(FACS、MACS)することができる。しかしながら、MHC多量化試薬が、TCRと結合する天然のリガンドを示すために、細胞のin vitro細胞培養への置換、あるいはレシピエントへのin vivo養子免疫伝達(adoptive in vitro transfer)は、TCR内在化、活性化、過刺激および細胞死を含む、精製されたT細胞群の劇的な変化を生じる(図3および図4)。
【0012】
このように、通常のMHC多量体技術は、エピトープ−特異的T細胞の直接的な視覚化および表現型分析を可能にする。しかしながら、MHC多量体染色され、かつ精製されたT細胞のその後の機能分析およびin vivo導入は、TCR−MHC相互作用の残留およびその後に誘発されるシグナル化によって複雑化される。したがって、T細胞染色および精製の後に、表面−結合されたMHC多量体を除去するための方法の開発は、T細胞免疫の分野において極めて重要であり、かつ、MHC多量体技術の臨床的適用および機能的診断への移行のために不可欠である。
【0013】
したがって、本発明は:
(a)レセプター分子を有する細胞を含有する試料を提供し、
(b)前記細胞と、
(i)結合複合体の少なくとも一つの第1パートナーと結合している、前記レセプターと特異的に結合する少なくとも一つの成分;その際、成分とレセプターとは低いアフィニティー相互作用を有するものであり、
(ii)前記の第1パートナーに対する少なくとも2個の結合部位を有する前記結合複合体の少なくとも一つの他のパートナー;および
(iii)(i)および/または(ii)と結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識とを接触させ、その際、結合複合体の一つまたはそれ以上の第1パートナーおよび一つまたはそれ以上の他のパートナーは、可逆的結合を形成する能力を有し、かつ、少なくとも2個の成分(i)、少なくとも1個の成分(ii)および少なくとも1個の成分(iii)を含有する結合体が、レセプター分子を介して前記染色細胞と結合しており、
(c)場合によっては、前記染色細胞を、前記試料の他の成分から分離し、かつ、
(d)場合によっては、前記染色を、可逆的結合を分断することによって、前記細胞から除去する、
工程を含む、細胞の可逆的染色方法に関する。
【0014】
本発明の特に好ましい実施態様は:
(a)T細胞レセプター(TCR)分子を有する細胞を含む試料を供給し、
(b)前記細胞と、
(i)少なくとも一つのTCR結合リガンド、たとえば、TCR結合ペプチドおよび結合複合体の少なくとも一つの第1パートナーと結合するMHC分子;
(ii)結合複合体の第1パートナーに対する少なくとも2個の結合部位を有する結合複合体の少なくとも一つの他のパートナー;および
(iii)(i)および/または(ii)に結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識;
とを接触させ、その際、結合複合体の1個または複数個の第1パートナーおよび1個または複数個の他のパートナーは、可逆的結合を形成する能力を有し、かつ、少なくとも2個のTCR結合リガンド(i)、少なくとも1個の成分(ii)および少なくとも1個の成分(iii)を含有する結合体が、TCR分子を介して前記T細胞に結合し、その際、前記T細胞は染色されており、
(c)場合によっては、前記の染色されたT細胞を、前記試料の他の成分から分離し、かつ、
(d)場合によっては、前記染色を、前記T細胞から、可逆的結合を分断することによって除去する、
工程を含む、T細胞の可逆的染色のための方法である。
【0015】
本発明の方法は、たとえばT細胞の機能的レセプター分子を有する細胞、すなわち、機能的TCR分子を有する細胞の可逆的染色に適しており、その際、前記レセプター分子は、レセプターリガンド、たとえばペプチド/MHC複合体と結合する能力を有する。レセプターリガンドは、特に、レセプターリガンドとレセプター分子とが低いアフィニティー相互作用、たとえば、10−2M〜10−7M、特に10−3M〜10−6Mの範囲での解離定数Kdを示す場合には、染色すべき細胞上に存在するレセプター分子に対して結合する能力を有する任意の分子であってもよい。したがって、レセプターリガンドの個々の分子は、標的細胞上で、レセプターとの安定した結合を形成する能力を有していない。レセプターとレセプターリガンドとの間の安定した結合を形成するための十分なアビディティーを提供するために、少なくとも2個またはそれ以上のリガンド分子は、標的細胞上でレセプター分子に対して協同的に結合しなければならない。この協同的結合は、第1パートナー−リガンド結合体のための、2個またはそれ以上、たとえば、3、4、5個またはそれ以上の結合部位を有する結合対の他のパートナーと結合する、結合対の第1パートナーと結合されたリガンド分子を用いることによって達成される。個々のリガンド分子が、極めて低い結合アフィニティーを有する場合には、協同的結合リガンド分子の数は、安定した結合形成のための十分なアビディティーを提供するために増加させなければならない。
【0016】
リガンド分子は、結合対の1個またはそれ以上の第1パートナーと結合されていてもよい。たとえば、リガンド分子がペプチド/MHC複合体である場合には、第1パートナー、たとえばペプチドは、MHC分子のα鎖および/またはβ鎖に対して結合していてもよい。より好ましくは、リガンド分子は、少なくとも2個の第1結合パートナーを含有し、たとえば、第1結合パートナーは、MHC分子のα鎖に結合されていてもよく、かつ、他の第1結合パートナーは、MHC分子のβ鎖に結合されていてもよい。二者択一的に、いくつかの第1結合パートナー分子の連続的な配列は、リガンド分子であるかまたはリガンド分子のサブユニット、たとえば、MHC分子のα鎖および/またはβ鎖と結合されていてもよい。
【0017】
そのリガンドに対して低いアフィニティー相互作用を有する適したレセプター分子の他の例は、(14)で記載されているような細胞接着レセプター分子、および(15)で記載されているような共同刺激分子のためのレセプターである。さらに他の例は、低いアフィニティーを有する抗体およびそのフラグメントおよび人工結合分子、たとえばペプチド、リポカリン(lipochalins)およびたとえば、ランダムなライブラリーからの他のアプタマー(aptamer)であり、この場合、これらは、細胞表面上に位置する分子と結合し、かつ、特異的結合特性を有するが低い結合アフィニティーを示す。レセプターリガンドが、MHC特異的ペプチドを含有する場合には、ペプチドが、分析すべき細胞のTCRレセプターおよびMHC分子に対して結合能力を有するT細胞エピトープであることが好ましい。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、たとえば哺乳動物T細胞、特にヒト細胞、たとえば、ヒトT細胞、特に、予め定められた抗原特異性を有する哺乳動物T細胞の亜細胞群(subpopulation)である。
【0018】
ペプチドは、TCR分子、好ましくは予め定められた抗原特異性を有するTCR分子と結合する能力を有するT細胞エピトープを含有する。ペプチドは、通常は、約8個〜約25個のアミノ酸の長さを有し、かつ、好ましくは予め定められたMHC分子クラス、たとえば、MHCクラスI、MHCクラスIIまたは非古典的MHCクラスと対立遺伝子(allele)−特異的に結合する能力を有する、いわゆるアンカーアミノ酸残基を含有する。MHC分子は、好ましくは、組換え体可溶性MHC分子であり、この場合、これは、細菌発現系(16)または昆虫細胞発現系(17)中で調製されてもよい。
【0019】
本発明の重要な特徴として、結合複合体、たとえば、結合対は、少なくとも一つの第1パートナーおよび少なくとも一つの他のパートナーから成り、その際、少なくとも一つの他のパートナーは、第1パートナーに対して少なくとも2個の結合部位およびより好ましくは、少なくとも4個の結合部位を有していることが選択される。第1パートナーおよび第2パートナー間の結合は、可逆的であるべきであり、すなわち、結合は、請求された方法を実施するために適した条件下で、分断される能力を有していなければならない。好ましくは、可逆的結合は、定められたように適切な条件下で、たとえば、蛍光滴定(11)による、10−2〜10−13M、より好ましくは10−3〜10−10Mおよび最も好ましくは10−5〜10−8MのKdを有する。特に好ましくは、高いKoff値を有する可逆的結合であって、たとえば、10−1/秒〜10−4/秒、特に10−2/秒〜10−3/秒を有する。
【0020】
本発明の他の重要な特徴として、標的細胞、たとえばT細胞の染色および引き続いての場合による工程、すなわち染色された標的細胞、たとえばT細胞の単離および精製、および染色の除去は、低い温度、すなわち、本質的に、標的細胞、たとえばT細胞表現型の変化を生じうる活性化および/またはシグナル化を生じない温度で実施されてもよい。好ましくは、染色および引き続いての染色の除去は、≦15℃、好ましくは≦10℃、より好ましくは約4℃の温度で実施される。
【0021】
染色された標的細胞、たとえばT細胞の、他の試料成分、たとえば染色されていないT細胞からの分離は、通常の方法、たとえば、細胞のソーティング、好ましくは市販の系を用いてのFACS法(たとえば、FACSVantage、Becton Dickinson or Moflo by Cytomation)であるか、あるいは、磁気的細胞分離法(たとえば、MACS by Miltenyi)によっておこなわれてもよい。
【0022】
染色の除去は、好ましくは、結合複合体の第1パートナーと第2パートナーの間の可逆的結合の標的化された分断によって生じる。この分断は、染色細胞と、結合複合体の遊離第1パートナーであるか、あるいは結合第1パートナー(i)および他のパートナー(ii)との間の結合を分断する能力を有するそれらの類似体とを接触させることによって達成されてもよい。好ましくは、遊離第1パートナーは、結合第1パートナーよりも他のパートナーに対して高いアフィニティーを有する、結合第1パートナーの類似体である。より好ましくは、遊離第1パートナーは、結合された第1パートナーのアフィニティーよりも少なくとも3オーダー、特に少なくとも5オーダーの大きさで高いアフィニティーを有する。特に、遊離第1パートナーは、少なくとも1x10−3および特に1x10−5の低いファクターによる、解離定数Kdを有する。
【0023】
染色細胞の検出のために使用された標識は、診断方法および分析方法において使用された任意の標識であってもよい。好ましくは、標識は、記載された方法中の細胞の特徴に悪影響を及ぼすことのないものである。標識の好ましい例は、蛍光染料または磁気性標識である。標識は、リガンド、たとえばペプチドおよび/またはMHC分子、結合複合体の第1パートナーおよび/または第2パートナーと結合していてもよい。標識は、直接的に標識されていてもよく、すなわち、標識は、前記に示したように、結合体の群の一つと結合していてもよい。二者択一的に、標識は間接的に標識されていてもよく、すなわち、前記に示したように結合体の群の一つと、順に結合する能力を有するレセプターと結合する標識である。
【0024】
第1パートナーと第2パートナーとの間の可逆的結合の分断による、標的細胞からの染色の除去は、標的細胞上の少なくとも2個の低アフィニティーリガンドとレセプター分子との間の協同的結合の損失を示す。したがって、少なくとも2個の成分(i)、少なくとも1個の成分(ii)および少なくとも1個の成分(iii)を含有する結合体は、完全に分断される。これは、結果として、標的細胞と結合する任意の試薬の完全な除去を生じ、それというのも、標的細胞上のレセプター結合成分とレセプターとの間の結合が、低いアフィニティー相互作用であるためである。
【0025】
本発明による方法の原理は、以下の好ましい実施態様中で示され、この場合、結合複合体は:
(a)(i)ビオチンおよび(ii)ビオチンと可逆的に結合する能力を有するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、
(b)(i)ストレプトアビジンまたはアビジンと可逆的に結合する能力を有するビオチン類似体および(ii)前記ビオチン類似体と可逆的に結合する能力を有するストレプトアビジンまたはアビジンまたはストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、
(c)(i)ストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドおよび(ii)ストレプトアビジンまたはアビジン、または前記ストレプチアビジン結合ペプチドおよびアビジン結合ペプチドと可逆的に結合する能力を有するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体
から選択される。
【0026】
特に好ましい実施態様において、ストレプトアビジンまたはアビジン、またはストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体のオリゴマーまたはポリマーを、カルボキシル残基を多糖、たとえば、デキストランに導入することによって製造されてもよく、この場合、これらは、本質的に“Noguchi,A., Talahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Tkakura,Y.,Hashida,M.& Sezaki,H.(1992)Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti−human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3,132−137”で記載されたように、主要工程で製造されてもよい。その後に、ストレプトアビジンまたはアビジンまたはこれらの類似体は、内部リシン残基および/または遊離N−末端基の第1アミノ基を介して、デキストラン骨格中のカルボキシル基に、通常のカルボイミド化学を用いて、副次的工程で結合される。特に好ましい実施態様に関して、カップリング反応は、デキストラン1モル当たり、約60モルのストレプトアビジンまたはStrep−Tactinのモル比で実施される。しかしながら、ストレプトアビジンまたはアビジンのオリゴマーまたはポリマーは、二官能性リンカー、たとえば、グルタルデヒドを介しての架橋であるか、あるいは文献中に記載された他の方法によって得ることができる。
【0027】
ストレプトアビジン結合ペプチドは、好ましくは、(9)、(10)または米国特許5506121号明細書中で記載されたストレプトタグ(Strep−tag)ペプチドから選択され、この場合、これらの文献は参考のために本明細書中に記載されるものである。より好ましくは、ストレプトタグ(Strep−tag−)ペプチドは、アミノ酸配列 Trp−X−His−Pro−Gln−Phe−Y−Z[式中、Xは任意の好ましいアミノ酸であり、YおよびZの双方はGlyであるか、あるいはYはGluであり、かつZはArgまたはLysである]を含む。特に好ましくは、ペプチド Trp−Ser−His−Pro−Gln−Phe−Glu−Lys(strep−tagII)である。
【0028】
他の特に好ましい実施態様において、結合複合体は、米国特許第5985658号明細書中に記載されたカルモジュリン−結合ペプチドおよびカルモジュリン、または二価のカチオンの存在に基づく任意の他の相互作用、特にレセプターと結合するペプチド、たとえばFLAGペプチドから選択されてもよく、この場合、これらは、米国特許第4851341号明細書中で記載されたようなモノクローナル抗体4E11と結合する。これらの結合複合体の分断は、金属イオンのキラル化、たとえばカルシウムのキラル化によって、たとえばEDTAの添加によって達成される。
【0029】
方法の原理:
MHC多量体は、“相対的結合アビディティー”を増加させるが、一価のTCR−MHC/ペプチド相互作用のアフィニティーを増加させることはない(図1A)。単量体MHC/ペプチド複合体は、安定してTCRsと結合しないために、MHC多量体のMHC単量体への標的化された分断は、結果として表面結合されたTCRリガンドの急速な解離を生じる。MHC/ペプチド複合体の完全な解離の後に(活性化/シグナル化を生じることのない温度、好ましくは4℃)、T細胞の機能的性質は、引き続いての細胞培養への導入またはin vivo養子免疫伝達においても変化することはない。
【0030】
従来のMHC多量体試薬の製造は、可溶性MHC複合体の特異的なビオチン化に基づく。ストレプトアビジン(SA)が4個のビオチン結合部位を有しているために、ビオチン化されたMHC分子と(蛍光色素結合された)ストレプトアビジンとの4:1の比でのインキュベーションは、結果として、四量体MHC試薬の形成を生じる(図1のB)。ストレプトアビジン:ビオチン結合の安定性は高く(Kd<1x10−13M、“Weber, P.C., Wendoloski, J.J., Pantolino, M.W. & Salemme, F.R. (1992) Crystallographic and thermodynamic comparison of natural and synthetic ligand bound to streptavidin. J. Am. Chem. Soc. 114, 3197−3200”中では4x10−4と記載されている)、したがって、試薬は極めて安定である。ビオチンのMHC−ストレプトアビジン多量体染色T細胞への添加(50mMの濃度まで試験された)は、試薬の安定性に対して著しい効果を与えることはなかった(適当なタイムウインドウの範囲内(≦1日))。
【0031】
これとは対照的に、本発明による方法は、抗原−特異的T細胞の機能的単離のための生理学的条件下で、急速かつ標的化されたMHC多量体試薬の分断を可能にする技術であり;この場合、これは、特に低い温度(好ましくは4℃)での本質的に簡単かつ急速な分断を可能にする技術である。さらに、方法は、本質的にT細胞に対して非毒性であり、かつ使用された物質は、in vivo適用(臨床適用)に関して無毒である。
【0032】
米国特許第5506121号明細書中で開示されているようなペプチド配列(Strep−tags)は、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に対する結合アフィニティーを、たとえば、約10−4〜10−5の間のKdで試験した(9、10)。結合アフィニティーは、さらに、ストレプトアビジン分子の範囲内での突然変異タンパク質を生じさせることによって改善されてもよい。最適化されたストレプトアビジン突然変異タンパク質の例(Strep−Tactins)は、米国特許第6103493号明細書または(11)中に記載されており、この場合、これらは、本明細書中において参考のためにのみ記載されている。好ましくは、ストレプトアビジン突然変異タンパク質は、野生型ストレプトアビジンの44位で、Gluが疎水性脂肪族アミノ酸(hlydrophobic aliphatic amino acid)たとえば、Val、Ala、IIeまたはLeuによって置換されており、45位で任意のアミノ酸が存在し、46位で脂肪族アミノ酸および好ましくは疎水性脂肪族アミノ酸が存在し、および/または47位でValが、塩基性アミノ酸、たとえば、ArgまたはLys、特にArgによって置換されていることによって特徴付けられる。より好ましくは、Alaは46位であり、および/またはArgは47位であり、および/またはValまたはIIeは44位である。さらに好ましくは突然変異タンパク質は、IIe44−Gly45−Ala46−Arg47またはVal44−Thr45−Ala46−Arg47((11)で記載されているような“Strep−Tactin”)から選択された配列を有する。Strep−TactinとStrep−tagIIとの相互作用は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用に関する約10−3のKdと比較して、約10−6M(11)のKdを有する結合アフィニティーによって特徴付けられる。Strep−Tactinに対して高いアフィニティー(10−10M〜10−13のKdであると推定される)でさらに結合するビオチンは、結合部位に関してストレプタグII(Strep−tagII)と競合する。
【0033】
本発明によれば、抗原−特異的T細胞染色のための安定したMHC多量体は、Strep−tagII/StrepTactinの相互作用に基づいて生成される。したがって、急速に、好ましくは2時間未満で、より好ましくは1時間未満で、かなり低い濃度のビオチンの存在下で、多量体を競合的に分断することが可能である(図2)。
【0034】
この系は、MHC多量体の分断のために要求される基準を満たすものであるが(前記参照のこと):それというのも、ストレプ−タグII(Strep−tagII)/ストレプタクチン(StrepTactin)とビオチン/ストレプタクチン(StrepTactin)との間の著しいアフィニティーの差異のためであり、ビオチンの完全かつ極めて急速な競合的結合(低い温度であっても)が生じ;ビオチン(50mMの濃度まで試験された)はT細胞に関して非毒性であり、T細胞の機能を変化させることなく、かつ、少量のビオチン(ビタミンH)は、in vivo適用においても無毒である。
【0035】
ストレプ−タグII(Strep−tagII)/ストレプタクチン(StrepTactin)系を、MHC多量体の生成およびT細胞表面に結合する多量体のビオチンの添加による標的化された分断の双方について試験した。また、この試みに対して、可逆的T細胞染色は、Strep−tagsを、ビオチン類似体、たとえばビオチンと比較して、ストレプトアビジンまたはアビジンに対して低いアフィニティーを有するアミノビオチン、イミノビオチンまたデスビオチンで置換することによって達成されてもよい。さらに好ましい実施態様は、ビオチン化MHC分子の結合に対する遊離ビオチンと、ストレプ−タクチン(Strep−Tactin)またはビオチンに対してより低いアフィニティーを有する他のストレプトアビジン類似体との競合に関する。
【0036】
二者択一的に、従来公知の他のストレプトアビジン−結合ペプチドは、たとえば、Wilsonらによって記載されているように使用されてもよい(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 3750−3755)。
【0037】
本発明の特徴は、可逆的結合が、標的化された方法で、少量の生理学的化合物ビオチン(ビタミンH)の添加によって分断することができるといった事実であり、この場合、この化合物は、生細胞に対して有害でもなければ、その機能的性質を変更するものでもなく、本発明において、この化合物またはその類似体で選択的に分断することができるすべての結合複合体を請求する。したがって、ストレプトアビジンまたはアビジンまたはその類似体と、ビオチンまたはビオチン類似体、あるいはストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドとの結合複合体に加えて、さらに他の結合複合体が本発明の目的のために適しており、この場合、これは、染色されるべき細胞に対して任意の悪影響を及ぼすことのない化合物、たとえばビオチンまたはビオチン類似体の添加によって分断することができる細胞の可逆的染色を可能にする。たとえば、抗原/抗体−結合対は、特にポリマー化またはオリゴマー化された抗体が使用される場合に適用することができる。ストレプトアビジン/アビジンおよびその類似体および/または抗体の以外のこのような結合複合体の他の例は、“Skerra A. (2000). Engineered protein scaffolds for molecular recognition. j. Mol. recognit. 13, 167−187”で記載されているような分子認識のための足場(scaffolds)となるいわゆる工学的タンパク質(engineered protein)であってもよく、この場合、これは、ビオチンまたはビオチン類似体を用いての分断による標的化された方法で分断することができる化合物を認識するために作製される。
【0038】
さらに、本発明は、本質的に純粋な標的化細胞群に関し、この場合、これは、特定のレセプターの存在によって定義され、かつ、前記の共通のレセプターと結合するアフィニティー試薬を用いて、不均質細胞群(すなわち、不均質細胞とは、特定の共通レセプターの有無に関連する)から精製される。標的細胞群は、アフィニティー試薬が本質的に、完全に前記レセプターから除去されることを特徴とする(好ましくは、検出限界未満に除去される)。アフィニティー試薬の完全な除去は、前記に示されたように可逆的に多量化された低いアフィニティーのリガンドを用いて達成される。したがって、標的細胞群は、精製方法によって変化されることのない機能的性質(共通の特異的レセプターによって定義される)を有するものが提供される。標的細胞群を定義する特異的な共通のレセプターは、前記に示したような低いアフィニティーのリガンドが示されてもよいことに対しての任意のレセプターであってもよい。たとえば、レセプターは、細胞群または亜細胞群を定義する抗原であってもよく、たとえば、血液細胞、たとえばリンパ球、単球またはナチュラルキラー細胞、骨髄細胞または幹細胞、たとえば、CD34−ポジティブ−周縁幹細胞(peripheral stem cells)の細胞群または亜細胞群であってもよい。他方では、レセプターは、さらに腫瘍細胞のためのマーカーであってもよい。
【0039】
特に、本発明は、好ましいT細胞群の染色、未染色T細胞群を含有する試料からの染色されたT細胞の単離および前記染色の除去を含む精製工程によって、本質的に変化されることのない機能的性質を有する、本質的に純粋な抗原特異的T細胞群に関し、すなわち、このT細胞群の機能的性質は精製前と、精製後とは本質的に同一である。このT細胞群は、前記に示した方法によって得られてもよい。特に、T細胞群は、たとえば、抗体またはTCR結合リガンド、たとえば、多量体TCR結合リガンドのような群の単離のために使用される任意の結合試薬を本質的に含有していない。
【0040】
最後に、本発明は、融合ポリペプチドに関し、この場合、これは、(a)結合複合体の少なくとも一つの他のパートナーとの可逆的結合を形成する能力を有する、結合複合体の第1パートナーである少なくとも一つのペプチドドメイン、および(b)細胞表面上のレセプターに対して特異的ではあるが低いアフィニティーで結合するリガンドドメインを含有する。融合ペプチドは、好ましくは遺伝的融合体であり、その際、一つまたはそれ以上の順次クラスター化されたペプチドドメインが、リガンドドメインのN−末端および/またはC−末端上に位置する。さらに、融合ポリペプチドは、いくつかのサブユニットから成り、その際、それぞれのサブユニットは、レセプターと一緒になって結合するリガンドサブドメインを形成する。この場合において、それぞれのサブユニットは、好ましくは、少なくとも一つのペプチドドメインを含有する。好ましい実施態様において、融合ポリペプチドは、(a)ストレプトアビジン−結合ペプチドおよび(b)MHC分子、好ましくは可溶性MHC分子を含有する。たとえば、ストレプトアビジン結合ペプチドは、MHC分子のα−鎖および/またはβ−ミクログロブリン鎖のN−末端および/またはC−末端と融合することができる。たとえば、少なくとも2個のストレプトアビジン−結合ペプチドを含有する融合ポリペプチド、たとえば、α−鎖およびβ−鎖の双方のC−末端に結合したストレプトアビジン−結合ペプチドを含有する融合ポリペプチドは、本発明の目的に適していることが示された。好ましいストレプトアビジン−結合ペプチドは、前記に示したようなストレプ−タグ(Strep−tag)ペプチドであり、特にストレプタグII(Strep−tagII)である。さらに、本発明は、前記に示されたような融合ペプチドをコードする核酸に関し、その際、核酸は、好ましくは、組換えベクター上、特に、適したホスト細胞、たとえば、真核ホスト細胞または原核ホスト細胞中で請求された融合ポリペプチドの発現を可能にする発現ベクター上に位置する。
【0041】
本発明の方法は、可逆的染色方法によって、標的細胞群、たとえば抗原特異的T細胞群の機能的単離を可能にする。標的細胞、たとえばT細胞の本来の機能的性質は、本質的に、同定および精製の後にも保持することができる。したがって、本発明の方法は、基礎的研究および臨床的適用に関する広範の便益を有するものである。好ましい適用例は、以下の通りである:
基礎的研究;
抗原特異的T細胞群の機能的性質の直接的ex vivo研究
in vivoにおけるT細胞の機能的性質は、極めて多様性であり、かつin vivo条件における特異性に依存していると示唆されるが、しかしながら、適切な研究ツールを欠くという理由から、これらの点についてはわずかにばかり理解されているにすぎない。MHC多量体技術によって、エピトープ特異的T細胞群を、その機能的性質とは非依存的に、同定および精製することができる。しかしながら、多量体試薬の結合は、その後の機能的アッセイを妨害する。たとえば、MHC−ストレプタグII(Strep−tagII)/ストレプタクチン(Strep−Tactin)試薬を用いての可逆的T細胞染色は、変化していない種々のT細胞群の直接的な機能的ex vivo研究を可能にした最初の技術である。
【0042】
高い効率を有するin vitroエキスパンション(expansion)のための抗原−特異的T細胞群の精製
ex vivoで得られたT細胞群の特徴付けは、しばしばさらに、T細胞系またはT細胞クローンへのin vitroエキスパンションを必要とする。MHC多量体技術を用いて、種々のT細胞群の範囲内の単一細胞または別個の表現型亜細胞群を単離することができるが、しかしながら、TCRに対する試薬の結合は、in vitroエキスパンションの効率を阻害する。この試験の問題は、本発明の試薬、たとえば、MHC−Strep−tagII/Strep−Tactin試薬を用いての可逆的T細胞染色によって解決される。
【0043】
養子免疫伝達試験のための抗原−特異的T細胞群の精製
免疫学的研究におけるin vivo試験の多くは、精製されたT細胞のレシピエント動物への養子免疫伝達を必要とする。移植されたT細胞群の純度および移植工程中に細胞中の考えられうる変化の双方について、これらの試験系において試験された。細胞群の最も高い純度は、ポジティブセレクトによって達成されるが、しかしながら、同定のために使用されたマーカー(通常は抗体)は、単離された細胞表面から除去することが困難であり、かつ、引き続いてのin vivo試験の結果の妨げとなる。本発明の試薬を用いての可逆的T細胞染色、たとえば、MHC−ストレプタグII(Strep−tagII)/ストレプタクチン(Strep−Tactin)試薬は、ポジティブセレクトと、その後の選択マーカーの除去との組合せを可能にし、養子免疫伝達試験を著しく改善するものである。
【0044】
TCR−MHCアフィニティー測定
エピトープ特異的T細胞群の多様性は、TCR−MHC/ペプチド結合アフィニティーの程度によって反映される。T細胞のTCR−MHC/ペプチド結合アフィニティーの測定は極めて困難である一方で、いくつかの最近の試験では、MHC/ペプチド解離速度は、かなりの結合アフィニティーとの相関があることが示されている(12,13)。本発明の試薬、たとえばMHC−Strep−tagII/Strep−Tactin試薬を用いて、MHC/ペプチド複合体は、エピトープ特異的T細胞の細胞表面上で堆積させることができ、かつ、MHC解離速度は、ビオチンの添加による急速な単量化の後に、測定することができる。これは、Strep−Tactin骨格の除去は、MHC解離速度よりも著しく速いことから可能である。
【0045】
臨床的適用:
高い効率を有するin vitroエキスパンションのための抗原−特異的T細胞群の精製
ヒトT細胞系またはクローンの生成(たとえば、病原体/腫瘍−特異的または自己反応性(autoreactive)T細胞)は、臨床研究、診断および免疫療法の多くの領域において必要である。in vitro培養は、しばしば、抗原−特異的刺激のための標準的な条件における困難性によって制限される。抗原−特異的T細胞群の精製のための改善されたストラテジーは、invitroエキスパンションの効率を著しく増加させ、抗原−非依存的刺激、たとえばマイトージェンおよび抗−CD3の使用を可能にする。本発明による、たとえば、MHC−Strep−tagII/Strep−Tactin試薬を用いて、抗原−特異的T細胞は、ex vivoで直接的に単離されてもよく、かつ、試薬の解離後にin vitroにおいてエキスパンションすることができる。この試みは、通常のMHC多量体試薬を用いての精製よりもさらに効率がよいと期待され、たとえば、試薬の結合は、in vitro T細胞エキスパンションの効率をネガティブに干渉する。
【0046】
他の機能的アッセイまたは療法のためのin vitroエキスパンション細胞系またはクローンからの、抗原−特異的T細胞群の精製。
【0047】
T細胞のin vitroエキスパンションにおいて、培養への抗原含有細胞またはフィーダー細胞の添加が必要とされる。他の機能的アッセイおよび特に治療的適用(たとえば、養子免疫伝達)に関して、コンタミネーションしたこれらの細胞を除去することは有用である。ポジティブセレクトのために(この場合、これらは、通常は、最も高い程度の純度を生じる)、選択マーカーは、T細胞表面から除去可能でなければならず、それというのも、機能的アッセイまたは養子免疫伝達の妨げとなるためである。T細胞がin vivo適用において使用される場合には、選択マーカーは、臨床的複雑性、たとえばアレルギー反応を引き起こす物質を含有する場合にはさらに除去しなければならない。たとえば、MHC−Strep−tagII/Strep−Tactin試薬を用いての可逆的T細胞染色は、これらすべての基準を十分に満たす。
【0048】
“直接的養子免疫伝達法”のための抗原−特異的T細胞群のex vivo精製
細胞のレシピエントへの直接的導入によって、ex vivoで直接的におこなわれた抗原−特異的T細胞群の単離(他の任意のin vitro増殖を含まない)は、特に臨床的に重要である。直接的に単離された細胞群は、in vivo適用のための培養細胞よりもより効率的であることが期待された。特にin vitroエキスパンションされたT細胞の極めて多くの数は、効果的な養子免疫伝達のために必要とされ、この現象は、in vitro培養条件へのT細胞の養子免疫伝達の際に最もおこりうる。この方法に関する重要な臨床適用のための例は、(別の方法で)T細胞−不含幹細胞移植中において、EBV−および/またはCMV−特異的T細胞群の並行的な精製および養子免疫伝達であり、この場合、このプロトコールは、移植患者におけるEBVおよびCMV−関連毒性の発生を減少させるとされる。たとえば、MHC−Strep−tagII/Strep−Tactin試薬を用いての可逆的T細胞染色および単離は、これらの臨床的適用のための理想的な方法であろう。
【0049】
機能的T細胞診断
MHC多量体技術は、直接的にex vivoにおいて、抗原−特異的T細胞の定量化および表現型の特徴付けを可能にする。しかしながら、多量体試薬のTCRへの結合は、機能的アッセイ中での精製された細胞の使用を複雑化させるものである(たとえば、慢性ウイルス感染症[HIV、CMV、EBV、HBV、HCV]、腫瘍−特異的T細胞群)。たとえば、MHC−Strep−tagII/Strep−Tactin試薬を用いての可逆的T細胞および単離は、多くの臨床的状態における抗原−特異的T細胞の力強い評価を達成するものである。
【0050】
本発明を、さらに、以下の図および実施例にしたがって説明する。
【0051】
実施例
1.材料および方法
H2−Kd Sterp−tagII融合タンパク質の生成
pET3a/H2−Kd発現ベクター(5)は、標準的なPCR技術によって変化させ、C−末端ビオチン化部位をStrep−tagII配列と交換する。タンパク質発現は、IPTGの添加によって、発現ホストBL21(DE3)中で誘発され、引き続いて、前記に示したように(5)封入体を精製する。
【0052】
多量体MHC Strep−tagII試薬のin vitroリフォールディングおよび生成
H2−Kd Strep−Tagおよびマウスβ2−ミクログロブリン(C−末端でのHSVエピトープtagを含有する)封入体を、8M尿素中で溶解し、かつ、その後に従来記載されているように(5)高い量の合成MHC結合ペプチド(ここでは:それぞれ0.5mg/mlのLLO91−99、GYKDGNEYIまたはp60217−225、KYGVSVQDI)の存在下での、アルギニン冨化バッファー中への急速な希釈によってリフォールディングされる。可溶性MHC複合体は、ゲル濾過(Superdex 200HR, Pharmacia)によってさらに精製され、アリコートを液体窒素中で保存した。多量化のために、Strep−Tactinポリマーは、可溶性H2−Kd Strep−tagII/LLO91−99複合体と一緒に、2:1または1:1のモル比でインキュベートした(Strep−tag結合部位1当たり2MHC分子または1MHC分子)。
【0053】
常用の多量体MHC試薬の製造
常用の四量体を、PE−またはAlexa546−結合ストレプトアビジン(Molecular Probes)を用いて製造した。MHC多量体試薬は、0.02%NaAzide、0.1mMEDTA、1μg/ml ペプスタシンおよび1μg/mlロイペプチン(5)を含有する、pH8.0のPBS中で2mg/ml中で保存した。
【0054】
T細胞系の製造および染色、機能的アッセイ
LLO91−99特異的T細胞系について、従来示されているように(18)invitroエキスパンションをおこなった。MHC−多量体染色を、1x106細胞当たり、約2μgのH2−Kd Strep−tagII多量体試薬で、4℃で30分に亘ってインキュベートすることによっておこなった。エピトープ−tag染色のために、細胞を洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中で簡単に固定し、引き続いて、未結合の第1マウスmAbまたはラットmAb(たとえば、TB067、Novagen)および第2抗−マウスまたは抗−ラット−PE抗体(たとえば、A85−1、PharMingen)を用いて、抗−HSVtagに対して染色した。フローサイトメトリーを、FACSCalibur(Becton Dickinson)およびFlowJo ソフトウエアを用いておこなった。解離試験に関して、染色された細胞を数回に亘って(通常10回)、1mMビオチンバッファー(PBS、5%FCS)中で、通常4℃で洗浄した。通常の51Cr−放出および3H−チミジンの組込みアッセイを、従来示されているようにしておこなった(18)。
【0055】
養子免疫伝達試験
LLO91−99特異的T細胞を、H2−Kd Strep−tagII多量体試薬で、4℃(30分)で染色し、引き続いて、ビオチン不含の媒体中で大規模に洗浄した。ビオチンの添加による解離を、前記に示したようにおこなった(コントロール群細胞を、ビオチン不含下で同様に処理した)。養子細胞導入を、1群当たり1マウス当たり1x107細胞を、ナイーブ(vaive)BALB/cマウスの尾の静脈中に挿入することによっておこなった。5xLD50Listeria monocytogen系 43251(2x404細胞)の静脈注入の48時間後に、器官(脾臓および肝臓)当たりの細菌数を、組織ホモジネートの連続的な希釈のプレーティングによって測定した。
【0056】
2.結果
in vivoにおけるMHC多量体染色とT細胞機能との干渉
細胞群の表現型の変更は、これまで低い温度(4℃)での以下のエピトープ−特異的T細胞が報告されている。これらの条件下で、TCR−MHC介在型シグナル化は達成されなかった。高い温度でのMHC多量体染色(たとえば、室温(RT)または37℃)は、多量体のエピトープ特異的内在化によって蛍光シグナルの強度および/または安定性を改善するために実施されている。その表現型におけるT細胞の種々の処理の影響を分析するために、引き続いて染色されるLLO91−99−特異的T細胞系と、LLO91−99/H2−Kd四量体とを、4℃または37℃で比較した。ネガティブコントロールとして、異なるListeriap エピトープ(p60217−227)を含有するMHC四量体を使用し;これらの試薬はLLO91−99−特異的T細胞のTCRsと結合することができず、このようにして潜在的なペプチド−非依存的作用をコントロールする。37℃でのインキュベーションで、減少しより拡散した染色パターンを示すにもかかわらず、4℃で2時間に亘ってのインキュベーションの後に、すべてのLLO91−99−特異的T細胞は、高い強度の染色を示した(図3a、上部ヒストグラム)。これらの変化は、37℃での染色の後に、表面TCRの相当のダウンレギュレーション(図3のa、中間のヒストグラム)、およびannexinVの増加した結合、アポトーシスの早期マーカー(図3のa、下ヒストグラム)と相関を示した。免疫蛍光顕微鏡法(図3)は、4℃でのインキュベーションの後に、LLO91−99/H2−Kd四量体の典型的な表面染色パターンを示し、その一方でもっとも多くの多量体は、37℃で内在化する。表現型の変化は、非結合性MHC多量体試薬を用いては検出されない。
【0057】
MHC多量体染色がさらにT細胞の機能を妨げるかどうかについて試験するために、我々は種々の処理がなされた細胞傷害性T細胞(CTLs)の細胞溶解能力について比較した。CTLsは、特異的MHC四量体またはコントロール試薬を用いて染色し、その後に、未結合のMHC分子を除去するためによく洗浄し、引き続いて、種々の濃度のLLO91−99ペプチドの存在下で、標的細胞比に対する一定のエフェクターで、37℃でインキュベートした。MHC四量体でのCTLsの標識化は、その細胞傷害プロフィールに著しい影響を及ぼす(図3のc):(1)特異的溶解の最大%の減少(試験間で変化する減少の範囲、さらに図7のb参照)、(2)減少したペプチド感受性、および(3)LLO91−99ペプチド不含下での増加した溶解性。溶解性の最大の減少および減少したペプチド感受性は、TCR内在化および早期のアポトーシスによるものとみられる(図3のa参照)。自然な溶解の増加は、少なくとも部分的に、“バイスタンダー作用”によって介在されるが、それというのも、さらにMHCミスマッチ細胞系が影響するめであり(図3のc,棒グラフ);細胞溶解性物質のMHC四量体によって誘発された放出は、隣接する標的細胞の生存性に作用する。さらに、エピトープ特異的T細胞のさらなるin vitroエキスパンション上でのMHC多量体染色のネガティブな影響は著しい。LLO91−99/H2−Kd四量体処理された細胞(図3のd)は、抗原またはマイトージェンによる刺激に対してあまり増殖せず、これは、アポトーシスを引き起こすMHC多量体によって誘発された過剰刺激を介してのT細胞の損失によるものと考えられる(図3のa)。以上のことから、これらの発見は、MHC多量体染色が、生理学的温度(37℃)において、エピトープ特異的T細胞の本質的な表現型変化および機能的変化を誘発することを示している。
【0058】
in vivoにおけるMHC多量体染色とT細胞機能との干渉
MHC多量体染色がさらにin vivoにおける機能に影響するかどうかを試験するために、種々の処理が施されたT細胞を、未成熟(naive)レシピエントマウスに養子免疫伝達し、引き続いて、リステリアモノサイトゲネスでの第1感染に対する保護を観察した。ネガティブコントロール群のBALB/cマウスにおいて、高い数の生菌が、感染48時間後の脾臓において検出可能であった(図4のa、灰色の棒グラフ)。非結合コントロールMHC四量体で処理された、1x107LLO91−99−特異的CTLsの養子免疫伝達は、リステリア−特異的保護(黒色の棒グラフ)を生じた。しかしながら、結合LLO91−99/H2−Kd四量体試薬での標的細胞の前処理は、結果として、保護能力の著しい損失を導く。保護の度合いは、標的細胞(図4b)の数と相関し;結合MHC四量体で予め処理された1x107CTLsは、著しいリステア−特異的保護を与えるが、その一方で1x106細胞が導入されたマウスにおけるリストリア菌感染は、未処理マウスとは区別されない。1x106コントロールCTLsの養子免疫伝達はなおも著しい保護を介在する。細胞導入の後に、コントロール細胞と比較して、より少ない数のLLO91−99特異的T細胞が、MHC多量体染色細胞が与えられたレシピエントマウスから回収されうる(図4c);同様の結果は、導入されたT細胞とアロタイプ表面マーカー thy1.1とのトラッキング(データは示されていない)で得られる。これらのデータは、in vivo細胞導入上で、生存率および機能性の双方の点において、MHC多量体染色の強い負の影響を示す。
【0059】
可逆的MHC多量体染色技術の改善
MHC多量体は、“相対的結合アビディティー”を増加させるが、しかしながら、TCR−MHC/ペプチド相互作用のアフィニティーを増加させることはない。エピトープ−特異的T細胞は、ホルムアルデヒドと直接固定した場合に単量体MHC/エピトープ分子とのいくつかの検出可能な相互作用を示すけれども(図5a、上部ヒストグラム)、簡単な洗浄の後に、すべての試薬によって誘導されたMHC分子は、細胞表面から消失する(図5a、下部ヒストグラム、4℃でおこなった)。これらの観察に基づいて、多量体のMHC単量体への標的化された分断は、結果として、表面結合TCRリガンドの急速な解離を引き起こすと仮定され、かつ、すべての方法が低い温度で実施される場合には、T細胞は、本来の機能的性質および表現型を保持することができるとされる(図2のモデル参照)。
【0060】
近年、短いペプチド配列(streptagII)が同定され、この場合、これは、突然変異されたストレプトアビジン分子、いわゆる“StrepTactin”のビオチン結合部位に関する結合アフィニティー(KD約10−6M)が示された。StrepTactinと高いアフィニティー(KD<10−13M)で結合する分子ビオチンは、効果的に、結合部位に対してStreptagIIと競合する。streptagII/StrepTactinの相互作用に基づくMHC多量体が、T細胞染色のために製造される場合には、したがって、d−ビオチンの相対的に低い濃度の存在下で、多量体を競合的に分断することが可能である(図2のモデル参照のこと)。
【0061】
可溶性H2−Kd−streptagII融合タンパク質を製造し;この場合、これは、組換えMHC分子を特異的に検出することが可能であり、エピトープ−tag配列(HSV/gpD、Novagen)が、β2−ミクログロブリンのC−末端に対して融合される。これらの変化は、in vivoフォールディングされたMHC分子の安定性の結合特異性に影響することはなかった(データは示されていない)。多量化のためのMHC−streptagII分子と“骨格”としてStrepTactin−ポリマー(IBA、Goettingen、Germanyにより提供されたもの)とのインキュベーションは、高い強度のT細胞染色を示し(図5b)、この場合、これは、d−ビオチンの存在下におけるインキュベーションの後に急速に減少する(1mM、すべて4℃)。不運にも、MHCstreptagII/StrepTactinポリマーでの染色は、さらに、d−ビオチンの不含下での時間経過につれて減少し、その際、試薬の不安定性を示す(図5c)。MHC−streptagII多量体の安定性を改善させるために、付加的なstreptagIIを、β2−ミクログロブリンのC−末端と融合させた(HSV−tagの後方、図6a)。このストラテジーは、本質的に試薬を改善し;LLO91−99/Kd(2x)streptagII StrepTactin−ポリマー試薬によって染色されたLLO91−99−特異的T細胞は、時間に亘って安定している(図6b)。d−ビオチンの添加(1mM、すべて4℃)は、StrepTactinポリマー骨格の急速かつ完全な解離を生じる(図6のdおよび未発表の結果)。表面結合した試薬によって誘導されたMHC分子の量は、その後に急速に減少した(図6のb)。
【0062】
可逆的MHC多量体染色
T細胞機能上での可逆的MHC多量体染色の効果を試験するために、in vitroエキスパンションされたLLO91−99−特異的T細胞系を、LLO91−99/Kd(2x)streptagIIStrepTactin−ポリマー試薬で染色し、かつd−ビオチン(1mM)を含有するかまたは含有しない冷バッファー(4℃)中で4時間に亘って洗浄した。コントロールとして、細胞を、結合(LLO91−99/H2−Kd)または非結合(p60217−227/H2−Kd)の常用の四量体試薬を用いて予め処理した。MHC−streptagII多量体によって誘導されたMHC/LLO91−99分子は、インキュベーションし、かつ、1mM d−ビオチンの存在下で洗浄した後に、細胞表面上で検出されることなく(図7のa);これらの条件下で、TCRダウンレギユレーションまたは増加したannexinV結合のような表現型の変更は観察されず;d−ビオチンは、50mMの濃度まで試験され、かつ、傷害性またはT細胞機能の変化は観察されなかった(データは示されていない)。細胞傷害アッセイでの種々の処理が施されたT細胞の試験(図3cの参照)は、解離することなく、MHC−streptagII多量体染色細胞の高いバイスタンダー溶解を示し(図7のb、白抜きの四角);試薬の解離の後に(白抜きの三角)、細胞傷害性T細胞の機能は、基本的にコントロール群とは区別されなかった(黒色の四角)。可逆的T細胞染色の正の効果は、さらに増殖アッセイにおいても証明された。MHC多量体試薬が細胞表面上で保持される場合には(図7のc)、LLO91−99−特異的T細胞は、抗原−特異的刺激またはマイトージェン刺激に対する乏しい反応性を示し;表面−結合されたMHC/LLO91−99複合体の解離の後に、細胞の増殖反応性は、コントロール細胞と同様である。MHCstreptagII多量体染色細胞のin vivo機能の維持は、養子免疫伝達試験においてテストされた。LLO91−99−特異的T細胞の常用の結合MHC四量体試薬での前処理(図7のd、白抜きの棒グラフ)は、結果として、養子免疫伝達後のリステリア菌感染に対する保護を著しく減少させることが見出された。これとは対照的に、試薬によって誘導されたMHC複合体の完全な解離の後に、同数の細胞は、ポジティブコントロールと比較してほぼ同程度の保護が得られた。興味深いことに、養子免疫伝達前にMHC−streptagII多量体の解離がない場合には、細胞は、常用のMHC四量体によって被覆された細胞よりもより効果的に再生される。血清中において、低いレベルのd−ビオチンがMHC−streptagII多量体から骨格を分断することができることが見出されたことから(データは示されていない)、血清d−ビオチンはさらに、in vivo移入後に、ある程度の解離を生じさせることができると考えられる。
【0063】
3.考察
我々のデータは、MHC多量体が、生理学的温度下で染色されたT細胞の表現型および機能を著しく変更させることを示した。これは、我々のグループによる最近の発見によれば、MHC多量体試薬によって介在される強いシグナルを示し、過刺激および細胞死を導く。この問題を克服するために、我々は、低い温度での表面染色によって抗原−特異的T細胞の特異的検出を可能にする可逆的染色工程を開発した。競合相手の添加によって、表面結合多量体の急速な解離、および引き続いてのT細胞表面からの単量体MHC/ペプチド分子の解離が生じた。この新規技術を用いて、我々は、T細胞の機能的性質が、その同定および精製の後にも保持されうることを見出した。
【0064】
いくつかのファクターについては、可逆的T細胞染色技術の改善において考慮されることが好ましい:(1)急速かつ完全な単量化は、低い温度(好ましくは4℃)で達成されるべきであり;(2)方法は、T細胞に対して非傷害性でなければならず;かつ、(3)使用された物質は、in vivo適用(臨床)に対して無害でなければならない。MHC−streptagII多量体系は、これらすべての要求を満たすものである:(1)streptagII/StrepTactinと、d−ビオチン/StrepTactinとの間の極端なアフィニティーの差異から、完全かつ極めて急速な競合的結合が、低い温度であっても達成され;(2)低い濃度でのd−ビオチン(ビタミンH)は、T細胞に対して非傷害性であり;この場合、d−ビオチンを50mMの濃度まで試験し、障害性またはT細胞機能の変化が見られなかった;(3)可逆的染色T細胞と一緒に移入されてもよいd−ビオチンの量は、通常のビタミン補給においてみられるd−ビオチン濃度よりもかなり低く、したがって無害である。
【0065】
我々のデータは、可逆的染色工程が、T細胞群の表現型および機能的性質を保持することを示した。T細胞機能はさほど影響を受けない(図7参照)。表面結合MHC/ペプチド複合体の解離後に、細胞上に試薬が残留することはない。従来の抗体に基づく染色および単離方法を用いた場合には、マーカーはポジティブに染色された細胞群上に残存し、その際、潜在的にT細胞機能に影響し、かつin vivo適用の成功に影響する;副作用(たとえばアレルギー反応)は、Fc−レセプターによって介在された機序または蛍光マーカー自体を介して誘発されうる。可逆的MHC多量体染色は、これらの潜在的な複雑性を回避し、さらに、この技術のin vivo適用のためにさらに有利である。
【0066】
我々は、特に、養子免疫伝達試験の結果における常用のMHC四量体染色の毒性を重要視し、この問題を、本発明による可逆的T細胞染色工程によって克服した。直接的なex vivo単離(たとえば、蛍光活性化(FACS)または磁気活性化細胞分離)および定義された抗原−特異的T細胞群の養子免疫伝達は、極めて効果的な治療ストラテジーとして実証することができる。たとえば、(別の方法で)T細胞不含肝細胞移植中でのEBV−および/またはCMV−特異的T細胞群の養子免疫伝達は、移植患者においてもEBV−およびCMVに関連する悪性腫瘍の発生率を減少させると考えられる。さらに、抗原−特異的T細胞の精製は、T細胞クローニングストラテジーの改善において重要な役割を示し、特に、精製された抗原−特異的細胞が、効果的な抗原−非依存型刺激細胞(マイトージェンまたは抗CD3)によってさらにエキスパンションされることが必要である場合には、特に重要である。我々は、ヒトHLA−StrepTagII融合タンパク質および直接的に蛍光色素または磁気に結合されたStrepTactinを製造する工程において、その潜在的臨床適用を試験した。さらに、可逆的多量体染色工程の基本原理は、他の低い結合アビディティーのレセプターリガンド相互作用に対して適用されてもよい。
【0067】
【外1】
【0068】
【外2】
【0069】
【外3】
【0070】
【図面の簡単な説明】
【図1】
T細胞のTCRに対する単量体および多量体ペプチド/MHC複合体の結合を示す図。TCRに対するペプチド/MHC複合体の結合によって、T細胞の機能的性質が、生理学的条件下において著しく変化する(従来技術)。
【図2】
本発明によるTCR分子に対するペプチド/MHC多量体結合を示す図。TCR分子に対するペプチド/MHC多量体結合の標的化された分断によって、染色が取り除かれ、その結果として本質的に変化のない特性を有する精製されたT細胞群が得られる(本発明)。
【図3】
in vitroでのMHC多量体染色のT細胞機能に対する干渉を示す図。aは、LLO91−99特異的T細胞が、結合(LLO91−99/H2−Kd)または非結合(p60217−225/H2−Kd)ストレプトアビジン−PE−四量体(“tet”)試薬で、4℃または37℃で染色され、MHC四量体染色(上)、TCR発現(中央、TCRhigh細胞群後方の黒塗りグラフ)、およびアネキシンV結合(下)について、ヒストグラムで示したものである。bは、LLO91−99/H2−Kdストレプトアビジン−Alexa546四量体で、4℃または37℃でインキュベーションした後の1時間に亘っての、LLO91−99−特異的T細胞の免疫蛍光染色(赤色)を示したものである。cは、結合または非結合四量体試薬で、4℃で30分に亘って染色されたLLO91−99−特異的T細胞を、その後に洗浄して未結合試薬を除去し、クロム放出アッセイに移した(エフェクターと標的との比は約5:1)ものである。LLO91−99ペプチド濃度およびパーセント特異的溶解は、それぞれx軸およびy軸上に示した。棒グラフは、非結合MHC四量体試薬(黒塗りのバー)または結合試薬(白抜きのバー)によって処理されたエフェクター細胞による、MHCミスマッチ標的細胞(10−8M LLO91−99ペプチド条件およびペプチド不含条件のみ)の溶解度を示す。dは、LLO91−99特異的T細胞を、cと同様に処理し、同系の放射線処理された脾細胞の存在下での増殖アッセイ中に移し、かつ、ペプチドまたは種々のマイトージェンの存在下で刺激したものである(x軸)。
【図4】
in vivoにおけるMHC多量体染色とT細胞機能との干渉を示す図。aおよびbは、LLO91−99特異的T細胞を、結合(LLO91−99/H2−Kd)または非結合(p60217−225/H2−Kd)四量体(“tet”)試薬で、30分に亘って染色し、未結合の試薬を取り除くためによく洗浄し、かつ、未成熟のレシピエントマウス中に導入した。6時間後に、マウスを、2x104のリステリアモノサイトゲネスで感染させた。脾臓中で感染後48時間で測定された生菌の数(y軸)が、結合(LLO91−99/H2−Kd、白抜き棒グラフ)または非結合(p60217−225/H2−Kd、黒抜き棒グラフ)四量体試薬で処理された、1x107のLLO91−99特異的T細胞(a)または種々の数のLLO91−99特異的T細胞(b)を養子免疫伝達した(1群当たり2マウス、標準偏差が示されている)ものについて示した。コントロール群のマウスはNaClのみのものである。cは、1x107の種々の処理が施されたT細胞(aと同様)の導入後のLLO91−99/H2−Kd四量体染色(y軸);ドットプロットは、CD8+T細胞上につけられ(gate)、その際、活性化T細胞上でダウンレギュレーションされた活性化マーカーである、CD62Lで染色されておりx軸で示されている。
【図5】
可逆的MHC多量体染色技術の発現を示す図。aは、LLO91−99−特異的T細胞を、単量体または四量体(“tet”)LLO91−99/H2−Kd/β2m−HSV−tagまたはp60217−225/H2−Kd/β2m−HSV−tag試薬で、30分に亘って染色した結果を示す。細胞を、洗浄することなく固定するか(上ヒストグラム)、あるいは2段階の洗浄工程後に、1%ホルムアルデヒドで固定し(下ヒストグラム)、引き続いて細胞表面(x軸)上で保持されているHSV−エピトープtagを染色した。bおよびcは、LLO91−99−特異的T細胞を、LLO91−99/KdstreptagII/β2−HSV−tagStrepTactinポリマー(“poly”)で、45分に亘って染色し、簡単に洗浄することによって、未結合の試薬を除去し、かつ、1mMd−ビオチンの存在下(b)または不含下(c)でインキュベートし;すべての工程を4℃で実施した。細胞アリコートを、異なる時間間隔でハーベストし(前記ヒストグラムに示した)、1%パラホルムアルデヒドで固定し、かつ細胞表面上に残存するHSV−エピトープ−tagについて染色した(x軸)。
【図6】
MHCstreptagII/StrepTactin多量体試薬の改善を示す図。aは、副次的なstrepttagII配列とβ2−ミクログロブリンとの融合によるMHCstreptagII多量体試薬の安定化のためのモデルを示す図である。bは、LLO91−99特異的T細胞を、LLO91−99/KdstreptagII/β2−streptagII−HSV−tag StrepTactinポリマー(“ポリ”)で、45分に亘って染色し、簡単に洗浄することによって未結合の試薬を除去し、かつ、1mM ビオチンの存在下(上ヒストグラム)または不含下(下ヒストグラム)でインキュベートした。すべての工程を4℃でおこない、細胞のアリコートを、異なる時間間隔の後にハーベストし(前記ヒストグラムに示した)、1%ホルムアルデヒドで固定し、かつ、細胞表面上の残存するHSV−エピトープtagについて染色した結果を示す(x−軸)。
【図7】
可逆的MHC多量体染色およびT細胞機能を示す図。LLO91−99特異的T細胞を、結合LLO91−99/KdstreptagII/β2m−streptagII−HSV−tag StrepTactinまたは非結合(p60217−225/H2−Kd)多量体試薬で、30分に亘って染色し、その後に、アッセイまたは養子免疫伝達の前に、d−ビオチン(1mM、すべて4℃でおこなった)の存在下または不含下で4時間に亘って激しく洗浄した。aは、組み換えMHC−分子の異なる処理が施されたT細胞上での染色を示す(エピトープ−tag染色によって検出されたもの、x軸)。
bは、LLO91−99ペプチド被覆された標的細胞に対する(ペプチド滴定、x軸)異なる処理が施されたT細胞の細胞傷害性(%特異的溶解、y軸)を示し、その際、エフェクターの標的細胞に対する比は約5:1であり、図1のcと比較する。cは、エピトープまたは種々のマイトージェンによって刺激された、異なる処理が施されたT細胞の、先天的に放射線照射された脾細胞中での増殖を示す図(y軸)であり、図1dと比較する。dは、結合(LLO91−99)または非結合(p60217−225)で処理された(左に示した)、4.1x106LLO91−99特異的T細胞の養子免疫伝達後の、リステリアモノサイトゲネス感染に対する保護を示す図である。マウスの2群は、結合MHCstreptagII試薬(ストライプの棒グラフ)でインキュベートし、それぞれd−ビオチンの存在下で、洗浄された(上棒グラフ、大きいストライプ)かまたは洗浄されていない(下棒グラフ、小さいストライプ)ものであり、細胞に導入した。コントロールマウスは、結合された(白抜き棒グラフ)かまたは非結合の(黒塗り棒グラフ)常用のMHC四量体試薬(加えて、d−ビオチン洗浄をおこなった)で処理された細胞を導入されたか、あるいは、NaClのみが注入されたものである(灰色の棒グラフ)。生菌の数(y軸)は、リステリア感染の48時間後に測定した。データは、3個の独立した試験を示し、それぞれ1群当たり2個体のマウスであった。
【図8】
可逆的MHC多量体染色がヒトT細胞に対して導入することができることを示す図。HLA*A0201streptagII融合タンパク質を製造し、かつ、組換えヒトβ2ミクログロブリン−HSVtag−streptagIIおよびエピトープMART127−35の存在下でフォールドし、可溶性MHC分子を得た。これらは、引き続いて、ストレプトタクチン−ポリマーで多量化し、かつ、MART27−35特異的T細胞クローン(Burkhard Schmidt, Instotute of Hematology, Klinikum rechts der Isar, Munichよって提供された)の染色のために使用された。MART127−35−特異的T細胞を、4℃で30分に亘って、HLA*A0201streptagII−Streptactin多量体試薬で染色し;洗浄の後に、染色された細胞のアリコートを、1mM d−ビオチンの存在下で異なる時間に亘って培養し、その際、すべてを4℃で行った。HSV−エピトープに対する第2染色を、前記に示したようにおこなった(図3の説明文参照のこと);その後に細胞を1%パラホルムアルデヒド中で固定し、かつフローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、HSVエピトープtag染色に関する蛍光強度を示す。
Claims (29)
- 細胞の可逆的染色のための方法において:
(a)レセプター分子を有する細胞を含む試料を提供し、
(b)この細胞と、
(i)結合複合体の少なくとも一つの第1パートナーと結合している、前記レセプターと特異的に結合する少なくとも一つの成分;その際、成分とレセプターとは、低いアフィニティー相互作用を示すものであり、
(ii)第1パートナーに対する少なくとも2個の結合部位を有する結合複合体の少なくとも一つの他のパートナー;および
(iii)(i)および/または(ii)と結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識とを接触させ、その際、結合複合体の1個または複数個の第1パートナーおよび1個または複数個の他のパートナーは、可逆的結合を形成する能力を有し、かつ、少なくとも2個の成分(i)、少なくとも1個の成分(ii)および少なくとも1個の成分(iii)を含む結合体は、レセプター分子を介して前記細胞に結合し、その際、前記細胞は染色され、
(c)場合によっては、前記試料の他の成分と前記染色細胞とを分離し、かつ、
(d)場合によっては、可逆的結合を分断することによって、前記細胞から前記染色を除去する工程を含むことを特徴とする、細胞の可逆的染色のための方法。 - T細胞の可逆的染色のための方法において:
(a)T細胞レセプター(TCR)分子を有する細胞を含む試料を提供し、
(b)このT細胞と、
(i)TCR結合ペプチドおよび結合複合体の少なくとも一つの第1パートナーと結合されたMHC分子を有する少なくとも一つのTCR結合リガンド;および
(ii)結合複合体の第1パートナーに対する少なくとも2個の結合部位を有する結合複合体の少なくとも一つの他のパートナー;および
(iii)(i)および/または(ii)と結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識とを接触させ、その際、結合複合体の1個または複数個の第1パートナーおよび1個または複数個の他のパートナーが、可逆的結合を形成する能力を有し、かつ、少なくとも2個のTCR結合リガンド(i)、少なくとも一つの成分(ii)および少なくとも一つの成分(iii)を含む結合体が、TCR分子を介して前記T細胞と結合し、その際、前記T細胞が染色され、
(c)場合によっては、前記試料の他の成分と前記の染色されたT細胞とを分離し、かつ、
(d)場合によっては、可逆的結合を分断することによって、T細胞から前記染色を除去する工程を含むことを特徴とする、T細胞の可逆的染色のための方法。 - 工程(b)、工程(c)および工程(d)を、15℃以下の温度で実施する、請求項1または2に記載の方法。
- 温度が約4℃である、請求項3に記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。
- MHC分子が、可溶性哺乳動物MHC分子である、請求項2から5までのいずれか1項に記載の方法。
- 染色された細胞と、結合複合体の遊離第1パートナーとを接触させるか、あるいは結合された第1パートナー(i)と他のパートナー(ii)との間の結合を分断する能力を有する前記第1パートナーの類似体とを接触させることによって、染色を取り除く、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- 第1遊離パートナーが、染色すべき細胞に対して非毒性の化合物である、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。
- 結合複合体が、
(a)(i)ビオチンおよび(ii)ビオチンと可逆的結合が可能なストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、
(b)(i)ストレプトアビジンまたはアビジンと可逆的結合が可能なビオチン類似体、および(ii)ストレプトアビジンまたはアビジン、または前記ビオチン類似体と可逆的結合が可能なストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、および
(c)(i)ストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチド、および(ii)ストレプトアビジンまたはアビジン、または前記ストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドと可逆的結合可能なストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体
から選択される、請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法。 - 結合複合体が、(i)ストレプトアビジン−結合ペプチド Trp−Ser−His−Pro−Gln−Phe−Glu−Lysおよび(ii)ストレプトアビジン類似体 ストレプトアビジンVal44−Thr45−Ala46−Arg47および/またはストレプトアビジンIIe44−Gly45−Ala46−Arg47から選択される、請求項9に記載の方法。
- 結合複合体が、二価のカチオンの存在下で結合するパートナーから選択される、請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法。
- 染色の除去によって、染色細胞からのレセプター結合成分の解離が生じる、請求項1から11までのいずれか1項に記載の方法。
- 特異的な細胞群を、これら本来の機能的性質を本質的に変化させることなく単離するための、請求項1から12までのいずれか1項に記載の方法の使用。
- 細胞群が、抗原特異的T細胞群である、請求項13に記載の使用。
- 抗原特異的T細胞群の機能的性質を測定するための、請求項14に記載の使用。
- in vitro発現のための抗原特異的T細胞群の精製のための、請求項14に記載の使用。
- 養子免疫伝達または免疫療法のための抗原特異的T細胞の精製のための、請求項14に記載の使用。
- T細胞診断のための、請求項14に記載の使用。
- 細胞の可逆的染色のための試薬キットにおいて、
(i)結合複合体の少なくとも一つの第1パートナーと結合している、細胞上でレセプター分子と特異的に結合する少なくとも1個の成分、その際、成分とレセプターとは低いアフィニティー相互作用を示しており、
(ii)前記第1パートナーに対して少なくとも2個の結合部位を有する前記複合体の少なくとも一つの他のパートナー、および
(iii)(i)および/または(ii)と結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識を含み、その際、結合複合体の1個または複数個の第1パートナーおよび1個または複数個の第2パートナーは、可逆的結合を形成する能力を有する、細胞の可逆的染色のための試薬キット。 - T細胞の可逆的染色のための試薬キットにおいて、
(i)結合複合体の少なくとも一つの第1パートナーと結合した少なくとも一つのMHC分子を有する、少なくとも一つのTCR結合リガンド、
(ii)結合複合体の第1パートナーに対して少なくとも2個の結合部位を有する結合複合体の少なくとも一つの他のパートナー、および
(iii)(i)および/または(ii)と結合しているかあるいは結合する能力を有する検出可能な標識を含み、その際、結合複合体の1個または複数個の第1パートナーおよび1個または複数個の他のパートナーが、高いアフィニティーを有する可逆的結合を形成する能力を有する、T細胞の可逆的染色のための試薬キット。 - TCR結合リガンドがさらにTCR結合ペプチドを有する、請求項20に記載のキット。
- 好ましい特異性を有するTCR結合ペプチドが、別個に提供されている、請求項20に記載のキット。
- さらに前記結合複合体の遊離第1パートナーであるか、あるいは、結合第1パートナー(i)と他のパートナー(ii)との間の結合を分断する能力を有する前記第1パートナーの類似体を含む、請求項19から22までのいずれか1項に記載のキット。
- 細胞群を、特定の共通レセプターの存在によって定義し、かつ、共通レセプターと結合するアフィニティー試薬を用いて、不均質細胞群から精製し、その際、前記アフィニティー試薬は、本質的に完全に前記レセプターから除去されている、本質的に純粋な標的細胞群。
- 本質的に精製によって変化されない機能的性質を有する、本質的に純粋な抗原特異的T細胞群。
- 請求項1から12までのいずれか1項に記載の方法によって得ることが可能な、請求項24または25に記載の細胞群。
- TCR結合リガンドの相当量を含まない、請求項24、25または26に記載の細胞群。
- (a)結合複合体の第1パートナーである、少なくとも一つのペプチドドメイン、この場合、これは、結合複合体の少なくとも一つの他のパートナーとの可逆的な結合を形成する能力を有しており、および(b)細胞表面上でレセプターと低いアフィニティーではあるが結合するリガンドドメインを有する、融合ポリペプチド。
- 少なくとも一つのストレプトアビジン−結合ペプチドおよび(b)MHC分子を有する、融合ポリペプチド。
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