JP2019532255A - 受容体−リガンドkoff速度を分析するための可逆的細胞標識および不可逆的細胞標識の組み合わせ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、可逆的細胞標識および不可逆的細胞標識の組み合わせを用いて標的細胞上の受容体分子Rの解離速度定数(koff)を決定する方法に関する。本発明はさらに、そのような受容体分子Rを含む細胞であって、受容体分子Rにそのような細胞標識の組み合わせを結合させている、該細胞に関する。本発明はさらに、本発明の方法を実施するのに有用なキットおよび機器に関する。本発明はさらに、高アビディティT細胞の単離方法に関する。
ウイルス感染およびいくつかの細菌感染の制御における細胞性適応免疫の重要性は、枯渇実験または養子移入実験によって、ならびに遺伝的マウスモデルにおいて説得力をもって実証されている。それによって、抗原特異的CD8+ T細胞は、細胞内病原体に対する防御に関して主要な役割を果たすと見られている。また、ある種のがんにおいて、機能的CD8+ T細胞の存在は、腫瘍退縮の誘導と関連している可能性がある。それゆえ、さまざまな免疫療法的アプローチは、患者における機能的CD8+ T細胞応答の再構成を目的とする。抗原特異的T細胞が依然として存在しているが微小環境によって沈黙している場合、「チェックポイント阻害剤」の適用は既存のT細胞の有効性を再活性化するのに役立ちうる。しかし、内因性抗原特異的T細胞が欠如しているか、または既存の細胞が弱い抗原認識のT細胞受容体(TCR)を保有している場合、より強力なT細胞の養子T細胞移入は防御的抗原特異的CD8+ T細胞応答を回復する有望なアプローチとなりうる。過去数十年にわたる研究は、広範に存在するまたは養子移入されたT細胞の量だけでなく質も、T細胞に基づく免疫療法の成功と相関することを示している。したがって、診断用途および治療用途の両方について、規定の抗原特異的T細胞集団の機能的能力を特徴付けることは、この分野において非常に興味深い。
いくつかの用途、例えば、T細胞クローンまたは形質導入T細胞のような同種の集団の測定の場合、単一細胞の分離は必要ではなく、一般的に利用可能な器具の使用によりkoff速度値の迅速なスクリーニングを可能にする方法が望ましいであろう。それゆえ、本出願の発明者らは、可逆的多量体に基づくkoff速度アッセイの原理を、従来のフローサイトメトリーによって誘導される用途に移行することを目的とした。本発明者らは、驚くべきことに、koff速度の動態が実際にフローサイトメトリーによって高感度で得られることを実証した; それにより、この手順は、顕微鏡によって誘導されるアッセイと同等の値を有する信頼性の高い解離測定値をもたらす。本発明者らは、さらに驚くべきことに、この手順がエクスビボで直接的に抗原特異的T細胞集団の分析に移行されうることを実証した。インビボ抗原特異的T細胞集団は非常に小さいことが多く、付加的な(非特異的)細胞の存在が、koff速度測定に必要であるような染色動態の追跡を制限するため、これらの結果を以前には予想することができなかった。Hebeisen et al. 2015, Cancer Res, 75(10):1983-91には、被分析T細胞の事前選別またはクローニングとkoff速度測定を組み合わせることが提案されていた。しかしながら、本発明者らは、これが時間のかかる手順であるだけでなく、インビトロでの増殖プロトコルが複雑なT細胞集団の組成を変化させることが多いので、得られる結果を偏らせる危険性もあることを認識した。それゆえ、本発明者らは、可逆的および不可逆的特異的MHC多量体を用いた抗原特異的T細胞の二重染色による、細胞選別およびインビトロでの細胞増殖を伴わないkoff速度値の直接評価を想定した。不可逆的多量体で染色することにより、可逆的多量体の解離を観察しながら抗原特異的標的集団を安定的に同定することが可能になる。重要なことに、本出願の発明者らは、pMHCの解離速度が、不可逆的多量体によるさらなる染色によって影響されないことを実証することができた。ゆえに、フローサイトメトリーにより誘導されるTCRリガンドのkoff速度測定と組み合わせた多量体二重染色を、非常に小さな抗原特異的T細胞集団でさえも直接エクスビボで分析するために用いることができる。
と表記される2状態プロセスによって記述できることに留意されたい。対応する解離Kd定数は
と定義され、式中[B]、[R]、および[C]は、所与の温度および圧力での受容体、受容体結合試薬(リガンド)およびそれぞれの複合体の平衡モル濃度である。解離Kd定数はまた、複合体の会合/形成の速度についてのオン速度の定数(kon) (会合速度定数とも呼ばれる)および複合体の解離についてのオフ速度の定数(koff) (解離速度定数とも呼ばれる)の比として
で表すこともできる。本出願において、熱力学的および速度論的定数Kd、konおよびkoffの値は、温度4℃および大気圧1.013 barでのその決定をいう。
、di-tag2配列
または配列
(SEQ ID NO: 13、Twin-Strep-tag(登録商標)としても公知)が挙げられる。
ヒトCMV特異的T細胞クローンおよびネズミT細胞株を、Nauerth M, Weissbrich B, Knall R, Franz T, Doessinger G, Bet J, Paszkiewicz PJ, Pfeifer L, Bunse M, Uckert W and others. TCR-ligand koff rate correlates with the protective capacity of antigen-specific CD8+ T cells for adoptive transfer. Sci Transl Med 2013;5:192ra87-192ra87に記述されているように作製した。末梢血を健常成人ドナー(男性)から得た。書面によるインフォームドコンセントをドナーから入手し、血液サンプルの使用は、ヘルシンキ宣言にしたがい地域の施設内倫理委員会(Ethikkommission der Medizinischen Fakultaet der Technischen Universitaet Muenchen)による国内法にしたがって承認された。全血をPBS (pH 7.4)で1:1希釈し、フィコール層上2000 rpmで20分間の密度勾配遠心分離によってPBMCを得た。
Nauerth et al 2013に記述されているようにTwin-Strep-Tagを保有する可逆的多量体の作製のためのpMHC分子を再折畳みし、多量体化した。この報告のなかでkoff速度アッセイに用いられた全てのpMHC分子は、Alexa488マレイミドフルオロフォア(Thermo Fisher)および多量体化ストレプトアクチンAPC (IBA)にコンジュゲートされていた。Busch DH, Pilip IM, Vijh S, Pamer EG. Coordinate regulation of complex T cell populations responding to bacterial infection. Immunity 1998;8:353-62に記述されているプロトコルにしたがって不可逆的多量体の作製のためのビオチン化pMHC分子を再折畳みした。多量体化の場合、1 μgのビオチン化pMHC分子を総容量50 μl中1.25 μgのストレプトアビジンBV421またはストレプトアビジンPE (Biolegend)とともに45分間インキュベートした。koff速度アッセイの場合、5*106個までの細胞を可逆的多量体とともに45分間インキュベートした。必要なら、CD8抗体(CD8 eF450、eBioscienceまたはCD8 PeCy7、Beckman Coulter)を25分後に添加し、さらに20分間インキュベートした。生/死識別のため、0.2 μgのヨウ化プロピジウム溶液を添加し、5分間インキュベートした。細胞をその後、洗浄し、koff速度アッセイに直接使用するか、または(別段の指示がない限り)10分間不可逆的多量体でさらに染色した。不可逆的多量体の滴定の場合、細胞を50 μlの不可逆的多量体(1:1)で、25 μlのFACS緩衝液で希釈された25 μlのもの(1:2)でまたは37,5 μlのFACS緩衝液で希釈された12,5 μlの不可逆的多量体(1:4)のいずれかで染色した。
CyanLx 9色フローサイトメーター(Beckman Coulter)を用いてサンプルを分析した。koff速度アッセイの場合、分析したサンプルの計算パラメータを保存して、解離反応速度の分析を可能にした。細胞選別をMoFlo (Beckman Coulter)にて実施した。FACSデータをFlowJo v9.5.2ソフトウェア(Tree Star, Inc.)で分析した。
koff速度アッセイの実施の場合、細胞を1*106〜1*107細胞/mlに希釈し、FACS緩衝液900 μlを含有する予冷koff速度FACS管に細胞100 μlを添加した。koff速度FACS管をフローサイトメーターの冷却装置(qutools)と一緒に取り付け、分析を開始した。30秒後、進行中の分析の間に細胞に三方弁で2 mMのD-ビオチン1 mlを添加した。細胞を計15分間分析した。koff速度の分析の場合、特定のT細胞の蛍光データをFlowJoから表計算プログラム(GraphPad Software、San Diego、CA、USA)へエクスポートした。本文に記述されているようにkoff速度の分析のためのデータ点を選択し、そのデータ点に単相の指数関数的減衰曲線を当てはめた。
Nauerth et al. 2013に詳細に記述されているように実施した。
TRC-リガンドkoff速度アッセイの原理をフローサイトメトリーに移すためには、データ分析のための基本的な要素を、顕微鏡法に基づくオリジナルのアプリケーションと同様に取得する必要がある: 最初に、最初のpMHC/ストレプトアクチン多量体染色を決定する必要がある; その後、D-ビオチンをサンプルに添加する必要があり、引き続いて、ストレプトアクチン骨格およびpMHCの解離を、最小レベルのリガンド結合に達するまで追跡する必要がある。本発明者らは、いくつかのT細胞受容体の場合、koff速度動態が非常に速くなりうることを顕微鏡法に基づくアッセイから既に承知していたので、オンライン測定を中断することなくd-ビオチンをプローブに添加できるフローサイトメトリーのための実験設定をデザインした。この目的のために、本発明者らは、D-ビオチン溶液を含有する注射針に三方弁を介して接続された鋭い注射針で標準的なポリエチレンFACS管を貫通させた(図2A)。この設定により、いずれかの時点でサンプルホルダからプローブを取り出す必要なく、初期染色値(通常30秒)を取得し、その後D-ビオチン注入、続いて解離相の取得(通常15分)を行うことが可能になる。
顕微鏡法により誘導されるTCRリガンドkoff速度アッセイを用いて、Nauert et al. 2013は、koff速度と分析したT細胞の機能性との間の明確な相関関係を実証した。それにより、実験の設定を標準化することができ、再現性が高く真に定量的なkoff速度値の決定を確実にすることができる。新規のフローサイトメトリーに基づく設定から得られた結果が同等な値をもたらすかどうかを試験するために、本発明者らは両方の方法と並行してCMV特異的T細胞クローンのkoff速度を分析した。異なる特異性およびアビディティの3つのクローンを分析し(図3A〜C)、全ての場合において、得られたkoff速度は極めて同等であった(図3D)。これらのデータは、前述の顕微鏡法により誘導されるアプローチと比較して、同様の堅固性、再現性および精度を新規のフローサイトメトリーに基づく設定で達成できることを実証している。
上記のフローサイトメトリーに基づくkoff速度アッセイの実験設定により、分析は高度に精製された抗原特異的T細胞集団、T細胞クローンまたはTCR形質導入T細胞でのみ実施することができる。これらの場合、生きている細胞に対するゲーティングは、リガンド解離動態の取得を通して関心対象の細胞集団を同定するのに十分であるべきである。しかしながら、事前の選別またはクローニングなしに直接エクスビボで抗原特異的T細胞集団を分析するにはまた、koff速度アッセイ中の標的集団の安定的な同定が必要である。それゆえ、本発明者らは、これがさらなる抗原特異的な不可逆的染色によって達成されうるかどうかを試験した(図4A)。従来のMHC多量体は、C末端でビオチン化され、ストレプトアビジンに対して非常に高い親和性でこれらのドメインと結合する組み換えpMHCからなる。これらの結合は、D-ビオチンの添加によりかなりの量で破壊されることがなく、従来の多量体はそれゆえ、抗原特異的T細胞の疑似の不可逆的染色をもたらす。図4Bは、ストレプトアビジンBV421を含有する不可逆的多量体およびストレプトアクチンAPC骨格に結合したAlexa488コンジュゲートMHCを有する可逆的多量体による抗原特異的T細胞の二重染色の原理を示す。同じ特異性についてのMHC多量体二重染色が一般的に可能であることが他者らによって以前に記述されており、このアプローチは今や、抗原特異的T細胞同定の感度を高めるために頻繁に用いられる(Hadrup et al., 2009, Nat Methods, 6:520-6)。しかしながら、2つの異なるタイプの多量体試薬による二重染色はこれまで試験されていない。それゆえ、本発明者らは、可逆的および不可逆的な特異的多量体を用いてCMV由来HLA-B8拘束性エピトープIE188-96に特異的なT細胞クローンを染色した。図4B (左上のドットプロット)に示されるように、両方の多量体は、直接的に相関する二重染色パターンによって示されるように、標識細胞の細胞表面上に類似の染色特性を有して蓄積する。他のエピトープ特異性およびHLA拘束性を有する他のT細胞クローンでも非常によく似た結果が得られ(データは示さず)、このアプローチの一般的な実現可能性を示している。D-ビオチンの添加後、BV421染色は分析時間にわたって安定なままであるが、MHC-Alexa488およびストレプトアクチンAPC染色は減衰する(図4B、下パネル)。これらのデータは、従来の可逆的なMHC多量体との組み合わせ染色が、TCRリガンドkoff速度アッセイ中に関心対象の細胞集団を常に追跡するのに適したツールとなることを示している。
本発明者らは、koff速度アッセイに対する不可逆的および可逆的多量体による二重染色の適合性をより詳細にさらに分析するために、同じ特異性の不可逆的試薬による追加の染色が可逆的多量体染色およびその後のkoff速度を妨げるかどうかを試験した。それゆえ、本発明者らは、確立されたプロトコルにしたがって最初に特定の可逆的多量体を用いB7pp65特異的T細胞集団でCMV+ ドナー由来PBMCを染色して、最適なMHC-Alexa488染色強度を達成した。未結合の試薬を洗い流した後に、本発明者らは追加の染色段階において不可逆的多量体を加えた。本発明者らは、同様の初期の不可逆的多量体染色手順で濃度とインキュベーション時間の両方を滴定した。図5Aおよび図5Bに示されるように、不可逆的多量体の濃度の増加は、不可逆的多量体の染色強度にわずかしか影響を及ぼさなかった(図5B)。さらに重要なことには、異なる濃度の不可逆的多量体染色にわたって、その後に決定されたkoff速度は全ての条件下で同一であった(図5C、D)。インキュベーション時間を増やしても、可逆的MHC多量体染色またはその後のkoff速度測定に検出可能な影響はなかった(図5D)。これらのデータは、可逆的および不可逆的MHC多量体試薬を用いた二重染色アプローチが堅固であることを実証し、染色条件(インキュベーション時間、多量体濃度)のわずかな変化がその後のkoff速度結果に影響しないことを意味している。MHC多量体二重染色が何らかの形でkoff速度動態に影響を及ぼしうるかどうかを評価するために、本発明者らは、可逆的多量体のみで染色したまたは不可逆的多量体でさらに染色したT細胞のkoff速度測定を比較した。これらの実験は、TCRアビディティに依る潜在的な差異を制御するために、よく特徴付けられた高アビディティおよび低アビディティCMV特異的T細胞クローンで実施された。図5Eおよび図5Fに示されるように、両方のT細胞クローンは、一重または二重染色後に極めて同等のkoff速度を示した。これは、二重染色アプローチが結果として得られるkoff速度値に影響を及ぼさなかったこと、およびこの観察結果が、非常に異なるアビディティを有するT細胞に当てはまることを明確に実証している。
従来の不可逆的多量体による追加の染色は、koff速度アッセイ中にエピトープ特異的T細胞を安定的に染色するのに適したツールであるので、本発明者らは次に、PBMC由来の抗原特異的T細胞集団の直接分析がこの設定で可能かどうか調べた。この目的のために、本発明者らは、全リンパ球0.31%の容易に検出可能なB7pp65特異的T細胞集団を有するCMV陽性ドナー由来の血液を採取した(図6A)。本発明者らは密度遠心分離によってPBMCを精製し、細胞を可逆的多量体およびCD8抗体で、続いて不可逆的多量体で染色した。対照として、細胞の一部を可逆的多量体およびCD8抗体でのみ染色し、ストレプトアクチンAPC+ CD8+ T細胞のFACS選別後にkoff速度を分析した。エクスビボで直接、B7pp65特異的T細胞集団のkoff速度を測定するためのゲーティング戦略を図6Aに示す。シングレットおよび生きているリンパ球のゲーティング後、ゲートをCD8+ 不可逆的多量体+ T細胞に設定した。このゲートを分析に用いて、ストレプトアクチンAPCおよびMHC Alexa488の蛍光を経時的に表示し、koff速度を計算した。各測定細胞の蛍光値の直接的なエクスポートは、情報の損失を防ぐためにこの小集団を分析することによって選択された。この戦略は、経時的なMHC488蛍光の緩徐な減衰を有していた集団内の少なくとも1つの高アビディティT細胞クローンの存在を実証した(図6B、C)。事前選別された細胞と比べて直接分析された細胞のkoff速度は類似しており、直接分析の信頼性を実証していた(図6D)。まとめると、これらのデータは、不可逆的および可逆的多量体を用いた二重染色が、エクスビボで直接、エピトープ特異的T細胞集団のkoff速度測定を可能にし、事前選別されたT細胞と極めて同等な結果を提供することを示す。
異なるドナー由来のオリゴクローンヒトCMV特異的CD8+ T細胞のさらなるエクスビボkoff速度測定を、実施例1に記述されているように実施した。ここで、サンプルに含まれる細胞の一部のみがCMV特異的であった。図7は、オリゴクローンHLA*07 02/CMVpp65特異的CD8 T細胞集団のエクスビボkoff速度測定を示す。健常ドナーの新鮮な血液からフィコール勾配遠心分離によってPBMCを単離した。単一の生きているCD19- CD8+不可逆的pMHC-PE+ T細胞に対するBooleanゲーティングを実施した。経時的なストレプトアクチンAPCおよび可逆的pMHC-Alexa488のデータをGraphPad PRISMにエクスポートし、指数関数的減衰曲線に当てはめてkoff速度を決定した。図8は、オリゴクローンHLA*02 01/CMVpp65特異的CD8 T細胞集団(ドナーHZ961)のエクスビボkoff速度測定を示す。健常ドナーの新鮮血液からフィコール勾配遠心分離によって単離された凍結保存PBMCに対してkoff速度測定を行った。単一の生きているCD19- CD8+ 不可逆的pMHC-PE+ T細胞に対するBooleanゲーティングを実施した。経時的なストレプトアクチンAPCおよび可逆的pMHC-Alexa488のデータをGraphPad PRISMにエクスポートし、指数関数的減衰曲線に当てはめてkoff速度を決定した。図9: オリゴクローンHLA*02 01/CMVpp65特異的CD8 T細胞集団(ドナーHZ510)のエクスビボkoff速度測定。健常ドナーの新鮮血液からフィコール勾配遠心分離によって単離された凍結保存PBMCに対してkoff速度測定を行った。単一の生きているCD19- CD8+ 不可逆的pMHC-PE+ T細胞に対するBooleanゲーティングを行った。経時的なストレプトアクチンAPCおよび可逆的pMHC-Alexa488のデータをGraphPad PRISMにエクスポートし、指数関数的減衰曲線に当てはめてkoff速度を決定した。これらの実験は、標的特異的CD8+ T細胞のkoff速度決定が血液またはPBMCサンプルに対して直接行われうること、および信頼できる結果が異なるドナー由来の細胞で達成されることを実証する。
単一クローンPCRを用いて2つのHLA*02 01/CMVpp65特異的TCRを単離した。その構造的アビディティを分析するため、内因性TCRを欠くCD8+ J76腫瘍細胞にTCRを形質導入した。koff速度測定を実施例1に記述されているように行った。単一の生きているCD8+ 不可逆的pMHC-PE+ T細胞に対するBooleanゲーティングを実施した。経時的なストレプトアクチンAPCおよび可逆的pMHC-Alexa488のデータをGraphPad PRISMにエクスポートし、指数関数的減衰曲線に当てはめてkoff速度を決定した(図10)。ごく一部のJ76腫瘍細胞のみがそれぞれのTCRを組み換え発現したが、2つのTCRのkoff値は確実に決定された。この実験はこの場合もやはり、複雑な集団内のごく一部の細胞にのみ存在する受容体のkoff速度が、本明細書において記述される方法を用いて決定されうることを示す。
図11は、実施例1に記述されたように行われたネズミT細胞のkoff速度決定を示す。この目的のために、実施例1に記述された方法にしたがって可逆的および不可逆的ネズミMHC多量体を作製した。以下のエピトープ: SIIQFEKL:H2kb (SEQ ID NO:14)、SIYNFEKL:H2kb (SEQ ID NO: 15)、およびSIINFEKL:H2kb (SEQ ID NO: 15)を用いてH2-KB多量体を作製した。これらの結果は、本明細書において記述された方法が異なる種の細胞に対して行われうることを示している。
Claims (81)
- 標的細胞に付着した第1の検出可能な標識および該標的細胞に付着した第2の検出可能な標識を検出する段階を含む、標的細胞上の受容体分子Rと第1の受容体結合部位B1の解離速度定数(koff)を決定する方法であって、
該細胞が、
(i) 該受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第1の受容体結合部位B1を含む第1の受容体結合試薬であって、第1の多量体化試薬の第1の結合部位Z1に可逆的に結合することができる少なくとも1つの第1の結合パートナーC1をさらに含む、該第1の受容体結合試薬、および
(ii) 該第1の受容体結合試薬の該第1の結合パートナーC1の可逆的結合のための少なくとも2つの第1の結合部位Z1を含む第1の多量体化試薬
と接触されており、
該第1の受容体結合試薬(i)および該第1の多量体化試薬(ii)が、該標的細胞に結合する第1の多価結合複合体を形成し、該第1の多価結合複合体が、1つの該第1の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの該第1の受容体結合試薬を含み、かつ
該第1の検出可能な標識が該第1の受容体結合試薬に結合しているかまたは結合することができ、かつ
該第2の検出可能な標識が該受容体分子Rに本質的に不可逆的に付着しており、
該第1の検出可能な標識および該第2の検出可能な標識が互いに異なる、該方法。 - 前記細胞が、
(iii) 受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第2の受容体結合部位B2を含む第2の受容体結合試薬であって、第2の多量体化試薬の第2の結合部位Z2に安定的に結合することができる少なくとも1つの第2の結合パートナーC2をさらに含む、該第2の受容体結合試薬、および
(iv) 該第2の受容体結合試薬の該第2の結合パートナーC2の安定的結合のための少なくとも2つの第2の結合部位Z2を含む第2の多量体化試薬
とさらに接触されており、
該第2の受容体結合試薬(iii)および該第2の多量体化試薬(iv)が、該標的細胞に結合する第2の多価結合複合体を形成し、該第2の多価結合複合体が、1つの該第2の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの第2の受容体結合試薬を含み、かつ
第2の検出可能な標識が該第2の多価結合複合体に結合している、
請求項1記載の方法。 - 前記細胞が、
(iii') 多量体受容体結合試薬M2であって、多量体第2受容体結合試薬が、受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも2つの第2の受容体結合部位B2を含む、該多量体受容体結合試薬M2
とさらに接触されており、
該多量体受容体結合試薬M2が該受容体分子Rを介して標的細胞に本質的に不可逆的に結合し、
第2の検出可能な標識が該多量体受容体結合試薬M2に結合している、
請求項1記載の方法。 - 前記細胞が、
(iii'') 受容体分子Rに特異的に結合する不可逆的受容体結合試薬I2であって、該受容体分子Rに本質的に不可逆的に結合する、該不可逆的受容体結合試薬I2
とさらに接触されており、
第2の検出可能な標識が該不可逆的受容体結合試薬I2に結合している、
請求項1記載の方法。 - 受容体分子RがT細胞受容体(TCR)である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第1の受容体結合部位B1がMHC分子である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- a. 第1の結合パートナーC1がストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドを含み、かつ第1の多量体化試薬がストレプトアビジンもしくはアビジン、または該ストレプトアビジン結合ペプチドもしくはアビジン結合ペプチドに可逆的に結合するストレプトアビジン類似体もしくはアビジン類似体を含む、あるいは
b. 第1の結合パートナーC1が、ストレプトアビジンまたはアビジンに可逆的に結合するビオチン類似体を含み、かつ第1の多量体化試薬がストレプトアビジンもしくはアビジン、または該ビオチン類似体に可逆的に結合するストレプトアビジン類似体もしくはアビジン類似体を含む、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 第1の結合パートナーC1がストレプトアビジン結合ペプチドTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 01)を含み、かつ多量体化試薬がストレプトアビジン類似体Va144-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 02)またはストレプトアビジン類似体lle44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03)を含む、請求項7記載の方法。
- 第1の結合パートナーC1と第1の多量体化試薬の第1の結合部位Z1との間の結合が二価カチオンの存在下で起こる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- a. 第1の結合パートナーC1がカルモジュリン結合ペプチドを含み、かつ第1の多量体化試薬がカルモジュリンを含む、または
b. 第1の結合パートナーC1がオリゴヒスチジンタグを含み、かつ第1の多量体化試薬が、金属キレート剤に結合した金属イオンを含む、
請求項9記載の方法。 - 第1の結合パートナーC1が抗原を含み、かつ第1の多量体化試薬が該抗原に対する抗体を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 抗原がエピトープタグである、請求項11記載の方法。
- エピトープタグがFLAGタグ(配列: DYKDDDDK、SEQ ID NO: 04)、Mycタグ(配列: EQKLISEEDL、SEQ ID NO: 05)、HAタグ(配列: YPYDVPDYA、SEQ ID NO: 06)、VSV-Gタグ(配列: YTDIEMNRLGK、SEQ ID NO: 07)、HSVタグ(配列: QPELAPEDPED、SEQ ID NO: 08)、およびV5タグ(配列: GKPIPNPLLGLDST、SEQ ID NO: 09)からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 抗原がタンパク質を含む、請求項11記載の方法。
- タンパク質が、マルトース結合タンパク質(MBP)、キチン結合タンパク質(CBP)およびチオレドキシンの群より選択される、請求項14記載の方法。
- 第1の結合パートナーC1がグルタチオンS-トランスフェラーゼを含み、かつ第1の多量体化試薬がグルタチオンを含む、または第1の結合パートナーC1がグルタチオンを含み、かつ第1の多量体化試薬がグルタチオンS-トランスフェラーゼを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 第1の結合パートナーC1が免疫グロブリンFc部分を含み、かつ第1の多量体化試薬がプロテインA、プロテインG、プロテインa/g、およびプロテインLからなる群より選択されるタンパク質を含む、または第1の結合パートナーC1がプロテインA、プロテインG、プロテインa/g、およびプロテインLからなる群より選択されるタンパク質を含み、かつ第1の多量体化試薬が免疫グロブリンFc部分を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 第2の受容体結合部位B2がMHC分子である、請求項2、3および5〜17のいずれか一項記載の方法。
- 第1の受容体結合部位B1および第2の受容体結合部位B2が同じである、請求項2、3および5〜18のいずれか一項記載の方法。
- 第2の受容体結合部位B2または不可逆的受容体結合試薬I2が、抗体、二価抗体断片、一価抗体断片、および抗体様結合を有するタンパク質性結合分子からなる群より選択される、請求項2〜17のいずれか一項記載の方法。
- 二価抗体断片が(Fab)2'断片または二価一本鎖Fv断片である、請求項20記載の方法。
- 一価抗体断片が、Fab断片、Fv断片、および一本鎖Fv断片(scFv)からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 抗体様結合特性を有するタンパク質性結合分子が、アプタマー、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づく突然変異タンパク質、グルボディ(glubody)、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶性骨格に基づくタンパク質、アドネクチン(adnectin)、およびアビマー(avimer)の群より選択される、請求項20記載の方法。
- 第2の結合パートナーC2がビオチンまたはビオチン類似体を含み、かつ第2の多量体化試薬が、ビオチンまたは該ビオチン類似体に本質的に不可逆的に結合するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体を含む、請求項2および5〜23のいずれか一項記載の方法。
- 標的細胞が哺乳動物細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物細胞がリンパ球または幹細胞である、請求項24記載の方法。
- リンパ球がT細胞、Tヘルパー細胞、B細胞またはナチュラルキラー細胞である、請求項25記載の方法。
- T細胞がCMV特異的CD8+ Tリンパ球、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞および制御性T細胞の群より選択される、請求項26記載の方法。
- 第1の検出可能な標識が蛍光色素である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第2の検出可能な標識が蛍光色素である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第1の検出可能な標識の各々が第1の蛍光色素であり、かつ第2の検出可能な標識が第2の蛍光色素であり、該第1の蛍光色素の発光シグナルが、好ましくは該第2の蛍光色素の発光シグナルと区別することができる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- (a) 受容体分子Rを含む標的細胞を、(i)第1の受容体結合試薬および(ii)第1の多量体化試薬と接触させる段階、ならびに
(b) 該標的細胞を、(iii)第2の受容体結合試薬および(iv)第2の多量体化試薬と接触させる段階、または
該標的細胞を、(iii')多量体受容体結合試薬と接触させる段階、または
該標的細胞を、(iii'')不可逆的受容体結合試薬と接触させる段階
を含む、請求項2〜31のいずれか一項記載の方法。 - (a)が(b)の前に実施される、請求項32記載の方法。
- (a)の後かつ(b)の前に洗浄段階をさらに含む、請求項33記載の方法。
- (c) (i)第1の受容体結合試薬と(ii)第1の多量体化試薬との間の結合を破壊する段階
をさらに含む、請求項32〜34のいずれか一項記載の方法。 - (i)第1の受容体結合試薬と(ii)第1の多量体化試薬との間の結合が、(i)および(ii)を競合試薬CRと接触させることにより破壊され、該競合試薬CRが、該第1の多量体化試薬上の第1の結合部位Z1への結合について第1の結合パートナーC1と競合することができる、請求項35記載の方法。
- 第1の結合パートナーC1がストレプトアビジン結合ペプチドであり、かつ競合試薬CRがビオチンまたはビオチン類似体である、請求項36記載の方法。
- 第1の多量体化試薬がストレプトアビジンまたはストレプトアビジン類似体を含む、請求項36または37記載の方法。
- (i)第1の受容体結合試薬と(ii)第1の多量体化試薬との間の結合が、金属イオンキレート化により破壊される、請求項35記載の方法。
- 金属キレート化がEDTAまたはEGTAの添加により達成される、請求項39記載の方法。
- (i)第1の受容体結合試薬と(ii)第1の多量体化試薬との間の結合が、pH変化により破壊される、請求項35記載の方法。
- (d) 標的細胞に付着した第1の検出可能な標識を検出し、かつ該標的細胞に付着した第2の検出可能な標識を検出する段階
をさらに含む、請求項32〜41のいずれか一項記載の方法。 - 第1の検出可能な標識が第1の蛍光色素であり、かつ第2の検出可能な標識が第2の蛍光色素であり、該第1の蛍光色素の発光シグナルが、好ましくは該第2の蛍光色素の発光シグナルと区別することができる、請求項42記載の方法。
- 第1の検出可能な標識および第2の検出可能な標識の検出がフローサイトメトリーによる、請求項43記載の方法。
- 第2の検出可能なシグナルの検出が、標的細胞上の受容体分子Rの存在を示す、請求項44記載の方法。
- 第2の検出可能なシグナルが検出される細胞上での第1の検出可能な標識の検出が、該第1の検出可能な標識の検出時の受容体分子Rからの第1の受容体結合部位B1の非解離を示す、請求項45記載の方法。
- 第2の検出可能なシグナルが検出される細胞上での第1の検出可能な標識の非検出が、該第1の検出可能な標識の検出時の受容体分子Rからの第1の受容体結合部位B1の解離を示す、請求項45記載の方法。
- 第2の検出可能なシグナルが検出される細胞上での第1の検出可能な標識の検出事象の減少が、受容体分子Rからの第1の受容体結合部位B1の解離の動態を示す、請求項45〜47のいずれか一項記載の方法。
- 結合部位Z1とパートナーC1との間の可逆的結合の解離速度定数(koff)が、0.5×10-4秒-1以上の範囲内である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 結合部位Z2とパートナーC2との間の結合の解離速度定数(koff)が、1×10-5秒-1以下の範囲内である、請求項2および5〜48のいずれか一項記載の方法。
- 多量体受容体結合試薬M2と標的細胞との間の本質的に不可逆的な結合の解離速度定数(koff)が、1×10-5秒-1以下の範囲内である、請求項3および5〜48のいずれか一項記載の方法。
- 不可逆的受容体結合試薬I2と受容体分子Rとの間の本質的に不可逆的な結合の解離速度定数(koff)が、1×10-5秒-1以下の範囲内である、請求項4〜48のいずれか一項記載の方法。
- 標的細胞上の受容体分子Rと第1の受容体結合部位B1の解離速度定数(koff)が、100秒-1〜10-4秒-1の範囲内であると推測される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 前記細胞を第1の受容体結合試薬と接触させる段階が15℃以下の温度で行われる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 接触させる段階が4℃以下の温度で行われる、請求項54記載の方法。
- 少なくとも3つの受容体分子Rを含む細胞であって、該細胞が、
(i) 該受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第1の受容体結合部位B1を含む第1の受容体結合試薬であって、第1の多量体化試薬の第1の結合部位Z1に可逆的に結合することができる少なくとも1つの第1の結合パートナーC1をさらに含む、該第1の受容体結合試薬、および
(ii) 該第1の受容体結合試薬の該第1の結合パートナーC1の可逆的結合のための少なくとも2つの第1の結合部位Z1を含む第1の多量体化試薬
を、少なくとも2つの受容体分子Rに結合させており、
該第1の受容体結合試薬(i)および該第1の多量体化試薬(ii)が、標的細胞に結合する第1の多価結合複合体を形成し、該第1の多価結合複合体が、1つの該第1の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの該第1の受容体結合試薬を含み、かつ
第1の検出可能な標識が該第1の受容体結合試薬に結合しており、かつ
第2の検出可能な標識が少なくとも1つの受容体分子Rに本質的に不可逆的に付着している、該細胞。 - 前記細胞が、
(iii) 受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第2の受容体結合部位B2を含む第2の受容体結合試薬であって、第2の多量体化試薬の第2の結合部位Z2に安定的に結合することができる少なくとも1つの第2の結合パートナーC2をさらに含む、該第2の受容体結合試薬、および
(iv) 該第2の受容体結合試薬の該第2の結合パートナーC2の安定的結合のための少なくとも2つの第2の結合部位Z2を含む第2の多量体化試薬
を、少なくとも2つの受容体分子Rにさらに結合させており、
該第2の受容体結合試薬(iii)および該第2の多量体化試薬(iv)が、標的細胞に結合する第2の多価結合複合体を形成し、該第2の多価結合複合体が、1つの該第2の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの第2の受容体結合試薬を含み、かつ
第2の検出可能な標識が該第2の多価結合複合体に結合している、
請求項56記載の細胞。 - 前記細胞が、
(iii') 多量体受容体結合試薬M2であって、多量体第2受容体結合試薬が、受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも2つの第2の受容体結合部位B2を含む、該多量体受容体結合試薬M2
を、少なくとも2つの受容体分子Rにさらに結合させており、
該多量体受容体結合試薬M2が該少なくとも2つの受容体分子Rを介して該細胞に本質的に不可逆的に結合し、
第2の検出可能な標識が該多量体受容体結合試薬M2に結合している、
請求項56記載の細胞。 - 前記細胞が、
(iii'') 受容体分子Rに特異的に結合する不可逆的受容体結合試薬I2であって、該受容体分子Rに本質的に不可逆的に結合する、該不可逆的受容体結合試薬I2
を、該受容体分子Rにさらに結合させており、
第2の検出可能な標識が該不可逆的受容体結合試薬I2に結合している、
請求項56記載の細胞。 - 標的細胞が哺乳動物細胞である、請求項56〜59のいずれか一項記載の細胞。
- 哺乳動物細胞がリンパ球または幹細胞である、請求項60記載の細胞。
- リンパ球がT細胞、Tヘルパー細胞、B細胞またはナチュラルキラー細胞である、請求項61記載の細胞。
- T細胞がCMV特異的CD8+ Tリンパ球、細胞傷害性T細胞、記憶T細胞および制御性T細胞の群より選択される、請求項62記載の細胞。
- 受容体分子RがT細胞受容体(TCR)である、請求項56〜63のいずれか一項記載の細胞。
- 標的細胞上の受容体分子Rと第1の受容体結合部位B1の解離速度定数(koff)を決定するための試薬キットであって、該キットが、
(i) 該受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第1の受容体結合部位B1を含む第1の受容体結合試薬であって、第1の多量体化試薬の第1の結合部位Z1に可逆的に結合することができる少なくとも1つの第1の結合パートナーC1をさらに含む、該第1の受容体結合試薬、および
(ii) 該第1の受容体結合試薬の該第1の結合パートナーC1の可逆的結合のための少なくとも2つの第1の結合部位Z1を含む第1の多量体化試薬、
ここで、
該第1の受容体結合試薬(i)および該第1の多量体化試薬(ii)が、該標的細胞に結合する第1の多価結合複合体を形成し、該第1の多価結合複合体が、1つの該第1の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの該第1の受容体結合試薬を含み、
第1の検出可能な標識が該第1の受容体結合試薬に結合しているかまたは結合することができる; ならびに
(iii) 該受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第2の受容体結合部位B2を含む第2の受容体結合試薬であって、第2の多量体化試薬の第2の結合部位Z2に安定的に結合することができる少なくとも1つの第2の結合パートナーC2をさらに含む、該第2の受容体結合試薬; および
(iv) 該第2の受容体結合試薬の該第2の結合パートナーC2の安定的結合のための少なくとも2つの第2の結合部位Z2を含む第2の多量体化試薬、
ここで、
該第2の受容体結合試薬(iii)および該第2の多量体化試薬(iv)が、該標的細胞に結合する第2の多価結合複合体を形成し、該第2の多価結合複合体が、1つの該第2の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの第2の受容体結合試薬を含み、
第2の検出可能な標識が該第2の多価結合複合体に結合している;
または
(iii') 多量体受容体結合試薬M2であって、多量体第2受容体結合試薬が、該受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも2つの第2の受容体結合部位B2を含む、該多量体受容体結合試薬M2、
ここで、
該多量体受容体結合試薬M2が該受容体分子Rを介して該標的細胞に本質的に不可逆的に結合し、
第2の検出可能な標識が該多量体受容体結合試薬M2に結合している;
または
(iii'') 該受容体分子Rに特異的に結合する不可逆的受容体結合試薬I2であって、該受容体分子Rに本質的に不可逆的に結合する、該不可逆的受容体結合試薬I2、
ここで、
第2の検出可能な標識が該不可逆的受容体結合試薬I2に結合している;
を含み、
該第1の検出可能な標識が該第2の検出可能な標識ではない、該キット。 - 第1の多量体化試薬上の第1の結合部位Z1への結合について第1の結合パートナーC1と競合することができる競合試薬CRをさらに含む、請求項65記載のキット。
- 好ましくはEDTAまたはEGTAである金属キレート試薬をさらに含む、請求項65記載のキット。
- 受容体分子Rを含む標的細胞と、
(i) 該受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第1の受容体結合部位B1を含む第1の受容体結合試薬であって、第1の多量体化試薬の第1の結合部位Z1に可逆的に結合することができる少なくとも1つの第1の結合パートナーC1をさらに含む、該第1の受容体結合試薬と、
(ii) 該第1の受容体結合試薬の該第1の結合パートナーC1の可逆的結合のための少なくとも2つの第1の結合部位Z1を含む第1の多量体化試薬と
を含有する第1の容器であって、
該第1の受容体結合試薬(i)および該第1の多量体化試薬(ii)が、該標的細胞に結合する第1の多価結合複合体を形成することができ、該第1の多価結合複合体が、1つの該第1の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの該第1の受容体結合試薬を含み、かつ
第1の検出可能な標識が該第1の受容体結合試薬に結合しているかまたは結合することができ、かつ
第2の検出可能な標識が該受容体分子Rに本質的に不可逆的に付着しており、
該第1の検出可能な標識が該第2の検出可能な標識ではない、
該第1の容器; ならびに
a. 該第1の多量体化試薬上の該第1の結合部位Z1への結合について第1の結合パートナーC1と競合することができる競合試薬CR、または
b. 好ましくはEDTAもしくはEGTAである金属キレート試薬
を含む流体を含有する第2の容器
を含む機器であって、
該第1の容器および第2の容器が、流体を該第2の容器から該第1の容器へ移動させることができるように接続されている、該機器。 - 第1の容器が、
(iii) 受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも1つの第2の受容体結合部位B2を含む第2の受容体結合試薬であって、第2の多量体化試薬の第2の結合部位Z2に安定的に結合することができる少なくとも1つの第2の結合パートナーC2をさらに含む、該第2の受容体結合試薬と、
(iv) 該第2の受容体結合試薬の該第2の結合パートナーC2の安定的結合のための少なくとも2つの第2の結合部位Z2を含む第2の多量体化試薬と
をさらに含有し、
該第2の受容体結合試薬(iii)および該第2の多量体化試薬(iv)が、標的細胞に結合する第2の多価結合複合体を形成することができ、該第2の多価結合複合体が、1つの該第2の多量体化試薬に結合した少なくとも2つの第2の受容体結合試薬を含み、かつ
第2の検出可能な標識が該第2の多価結合複合体に結合している、
請求項68記載の機器。 - 第1の容器が、
(iii') 多量体受容体結合試薬M2であって、多量体第2受容体結合試薬が、受容体分子Rに特異的に結合する少なくとも2つの第2の受容体結合部位B2を含む、該多量体受容体結合試薬M2
をさらに含有し、
該多量体受容体結合試薬M2が該受容体分子Rを介して標的細胞に本質的に不可逆的に結合し、
第2の検出可能な標識が該多量体受容体結合試薬M2に結合している、
請求項68記載の機器。 - 第1の容器が、
(iii'') 受容体分子Rに特異的に結合する不可逆的受容体結合試薬I2であって、該受容体分子Rに本質的に不可逆的に結合する、該不可逆的受容体結合試薬I2
をさらに含有し、
第2の検出可能な標識が該不可逆的受容体結合試薬I2に結合している、
請求項68記載の機器。 - フローサイトメトリー用の機器に含まれる、請求項68〜71のいずれか一項記載の機器。
- 第1の容器がフローサイトメトリー用の機器のサンプル入口と接続されている、請求項68〜72のいずれか一項記載の機器。
- 第1の容器および第2の容器が、カニューレまたは管を介して接続されている、請求項68〜73のいずれか一項記載の機器。
- 第1の容器と第2の容器との間の接続部内に配置された弁を含む、請求項68〜74のいずれか一項記載の機器。
- 弁が三方弁である、請求項75記載の機器。
- (a) 請求項1〜56のいずれか一項記載の方法を用いて、対象から得られたサンプル中のT細胞の解離速度定数(koff)を決定する段階、
(b) 該対象から得られたサンプルから該T細胞を単離する段階
を含む、高アビディティT細胞を単離する方法。 - 決定された解離速度定数が、所与の閾値以下である値を有する、請求項77記載の方法。
- 閾値が約10-1秒-1〜約10-3秒-3の範囲内である、請求項77記載の方法。
- サンプルが末梢血サンプルまたはPBMCサンプルである、請求項77〜79のいずれか一項記載の方法。
- 対象が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項77〜80のいずれか一項記載の方法。
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