CN109983133A - 用于分析受体-配体Koff速率的可逆和不可逆细胞标记的组合 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用可逆和不可逆细胞标记的组合测定靶细胞上受体分子R的解离速率常数(koff)的方法。本发明进一步涉及一种包含此类受体分子R的细胞，其中所述细胞具有与其结合的这样的细胞标记的组合。本发明进一步涉及用于实施本发明的方法的试剂盒和装置。本发明进一步涉及分离高亲合力T细胞的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用可逆和不可逆细胞标记的组合测定靶细胞上受体分子R的解离速率常数(koff)的方法。本发明进一步涉及一种包含这样的受体分子R的细胞，其中所述细胞具有与其结合的这样的细胞标记的组合。本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒和装置。本发明进一步涉及分离高亲合力T细胞的方法。
背景技术
通过耗竭实验或过继转移实验，以及在遗传小鼠模型中已有力地证明了细胞适应性免疫在控制病毒和一些细菌感染中的重要性。由此，抗原特异性CD8+T细胞似乎在防御细胞内病原体中起主导作用。同样，在某些癌症中，功能性CD8+T细胞的存在可能与诱导肿瘤消退有关。因此，不同的免疫治疗手段旨在在患者中重建功能性CD8+T细胞应答。如果抗原特异性T细胞仍然存在但被微环境(micromilieu)沉默，则“检查点抑制剂”的应用可以用于重新激活存在的T细胞的功效。然而，如果内源性抗原特异性T细胞缺失或存在的细胞所携带的T细胞受体(TCR)具有弱抗原识别，则更多有效T细胞的过继T细胞转移可代表一种恢复保护性抗原特异性CD8+T细胞应答的潜在手段。过去几十年的研究已表明，常见的或过继性转移的T细胞的数量和质量均与基于T细胞的免疫疗法的成功相关。因此，表征所定义的抗原特异性T细胞群在诊断和治疗应用中的功能性能力是本领域的重要研究内容。
描述T细胞功能性的一个重要参数称为“T细胞亲合力”，通常在功能水平上如随着抗原特异性刺激后的细胞因子产生来评估该参数。具有高功能亲合力的T细胞在清除病毒感染或诱导肿瘤消退方面可显示具有优势。T细胞亲合力的主要部分硬性固定(hard-wired)在TCR内并且可以评估为结构亲合力，其是TCR与其同源配体(肽主要组织相容性复合物(pMHC))的结合力量。
Nauerth等，2013,Science Translational Medicine,5(192):192ra87报道了所谓的“TCR-配体Koff-速率测定”，从而量化结构TCR亲合力的重要组分。该测定基于可逆多聚体，即所谓的Streptamer。重组表达的pMHC可以通过短的Streptag序列在Streptactin骨架上多聚化，所述短的Streptag序列与pMHC的C-末端融合。这些多聚体复合物可以稳定地结合活T细胞表面上表达的TCR。然而，通过添加生物素，所述多聚体复合物被破坏，在T细胞表面上留下单体TCR-pMHC复合物。此单体结合不稳定，并且pMHC与TCR解离的动力学取决于TCR-pMHC结合强度。如果pMHC是荧光标记的，则可以通过荧光染料的衰变来监测它们的解离。相比于其它评估结构亲合力的方法，TCR-配体koff-速率测定能够测量与活T细胞表面上表达的TCR结合的真正单体pMHC的解离。在荧光显微术的帮助下采用koff-速率测定，发明人可以证明TCR-pMHC结合半衰期时间(t1/2)与相应T细胞的功能性之间的明确相关性。具有慢的t1/2的T细胞不仅表现出更高的体外功能亲合力，而且还表现出更高的抗体内感染的保护能力。
通过实时显微术监测荧光衰变为在单细胞水平上准确分析TCR-配体koff-速率提供了可能性。不幸的是，测定设置非常耗费人力并且需要特定的仪器。Hebeisen等，2015,Cancer Res,75(10):1983-91提出将koff-速率测量与预先分选或克隆所分析的T细胞相组合。然而，该方法不仅是一个非常耗时的过程，而且由于体外扩增方案常常改变复杂T细胞群的组成，因此该方法还存在使所获得结果有偏差的风险。
因此，本发明的目的是提供至少部分地克服了这些缺点的手段和方法。
发明内容
本发明涉及一种测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)的方法，所述方法包括检测附着于所述靶细胞的第一可检测标记和附着于所述靶细胞的第二可检测标记，其中，已使所述细胞与下述接触：(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记彼此不同。
本发明进一步涵盖可已使所述细胞进一步与下述接触：(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
本发明还涵盖可已使所述细胞进一步与下述接触：(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
本发明还涵盖可已使所述细胞进一步与下述接触：(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
本发明进一步涵盖一种包含至少三个受体分子R的细胞，其中所述细胞具有结合至至少两个受体分子R的下述：(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和其中第一可检测标记被结合至所述第一受体结合试剂；和其中第二可检测标记被基本上不可逆地附着于至少一个受体分子R。
本发明进一步涵盖所述细胞可进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
本发明还涵盖所述细胞可进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述至少两个受体分子R基本上不可逆地结合所述细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
本发明还涵盖所述细胞可进一步具有结合至受体分子R的下述：(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
本发明进一步涵盖一种用于测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)的试剂盒，其中所述试剂盒包含(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂。
所述试剂盒进一步包含(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；其中第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物；或(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2；或(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2；和其中所述第一可检测标记不是所述第二可检测标记。
本发明进一步涵盖一种装置，所述装置包含含有靶细胞的第一容器，所述靶细胞包含受体分子R，和(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)能够形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R，其中所述第一可检测标记不是所述第二可检测标记；和含有流体的第二容器，所述流体包含(a)竞争试剂CR，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1；或(b)金属螯合剂，其中所述金属螯合剂优选为EDTA或EGTA，其中所述第一容器与所述第二容器相连接以使得流体可以从第二容器转移到第一容器。
所述装置的第一容器可进一步含有(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)能够形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
所述装置的第一容器可进一步含有(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
所述装置的第一容器可进一步含有(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
本发明进一步涵盖一种分离高亲合力T细胞的方法，所述方法包括(a)采用本文所述的方法测定自受试者获得的样品中的T细胞的解离速率常数(koff)；和(b)从自所述受试者获得的样品中分离所述T细胞。
附图说明
图1
图1A示出了下述的示意图：包含至少两个第一结合位点Z1(26)和可选地第三可检测标记(93)的第一多聚化试剂(25)；包含至少两个第二结合位点Z2(36)和第二可检测标记的第二多聚化试剂(35)；包含第一受体结合位点B1(71)、第一可检测标记(91)和第一结合配偶体C1(81)的第一受体结合试剂(20)；包含第二受体结合位点B2(72)和第二结合配偶体C2(82)的第二受体结合试剂(30)；包含至少两个第二受体结合位点B2(72)和第二可检测标记标记(92)的多聚体受体结合试剂M2(40)；包含不可逆受体结合位点B3(73)和第二可检测标记(92)的不可逆受体结合试剂I2(50)；以及包含至少一个受体分子R(11)的靶细胞(10)。
图1B阐明了采用第一多聚化试剂(25)和第二多聚化试剂(35)测定解离速率常数(koff)的原理。靶细胞(10)具有结合至至少两个受体分子R(11)的第一受体结合试剂(20)的第一受体结合位点B1(71)。所述第一受体结合试剂(20)包含第一受体结合位点B1(71)、第一可检测标记(91)和第一结合配偶体C1(81)。通过包含在第一受体结合试剂(20)中的第一结合配偶体C1(81)和包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)使至少两个第一受体结合试剂(20)可逆地结合第一多聚化试剂(25)。所述第一多聚化试剂(25)可选地包含第三可检测标记(93)。此外，靶细胞(10)具有结合至至少两个受体分子R(11)的第二受体结合试剂(30)的第二受体结合位点B2(72)。通过包含在第二受体结合试剂(30)中的第二结合配偶体C1(82)和包含在第二多聚化试剂(35)中的第二结合位点Z2(36)使至少两个第二受体结合试剂(30)稳定地结合第二多聚化试剂(35)。第二多聚化试剂(35)包含第二可检测标记(92)。或者，所述第二可检测标记除了或代替被包含在第二多聚化试剂(图中未示出)中还可被包含在第二受体结合试剂(30)中。当使所述复合物与竞争试剂CR(60)接触时，所述竞争试剂CR(60)与包含在第一受体结合试剂(20)中的第一结合配偶体C1(81)竞争包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)。由于竞争试剂CR(60)与包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)的结合，第一受体结合试剂(20)与第一多聚化试剂(25)之间的结合被破坏，从而第一多聚化试剂(25)以及最终第一受体结合试剂(20)自靶细胞(10)上分离。
图1C示出了采用第一多聚化试剂(25)和多聚体受体结合试剂M2(40)测定解离速率常数(koff)的原理。靶细胞(10)具有结合至至少两个受体分子R(11)的第一受体结合试剂(20)的第一受体结合位点B1(71)。所述第一受体结合试剂(20)包含第一受体结合位点B1(71)、第一可检测标记(91)和第一结合配偶体C1(81)。通过包含在第一受体结合试剂(20)中的第一结合配偶体C1(81)和包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)使至少两个第一受体结合试剂(20)可逆地结合第一多聚化试剂(25)。所述第一多聚化试剂(25)可选地包含第三可检测标记(93)。此外，靶细胞(10)具有结合至至少两个受体分子R(11)的多聚体受体结合试剂M2(40)的第二受体结合位点B2(72)。所述多聚体受体结合试剂M2(40)包含第二可检测标记(92)。当使所述复合物与竞争试剂CR(60)接触时，所述竞争试剂CR(60)与包含在第一受体结合试剂(20)中的第一结合配偶体C1(81)竞争包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)。由于竞争试剂CR(60)与包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)的结合，第一受体结合试剂(20)与第一多聚化试剂(25)之间的结合被破坏，从而第一多聚化试剂(25)以及最终第一受体结合试剂(20)自靶细胞(10)上分离。
图1D示出了采用第一多聚化试剂(25)和不可逆受体结合试剂I2(50)测定解离速率常数(koff)的原理。靶细胞(10)具有结合至至少两个受体分子R(11)的第一受体结合试剂(20)的第一受体结合位点B1(71)。所述第一受体结合试剂(20)包含第一受体结合位点B1(71)、第一可检测标记(91)和第一结合配偶体C1(81)。通过包含在第一受体结合试剂(20)中的第一结合配偶体C1(81)和包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)使至少两个第一受体结合试剂(20)可逆地结合第一多聚化试剂(25)。所述第一多聚化试剂(25)可选地包含第三可检测标记(93)。此外，靶细胞(10)具有结合至受体分子R(11)的不可逆受体结合试剂I2(50)。所述不可逆受体结合试剂I2(50)包含第二可检测标记(92)。当使所述复合物与竞争试剂CR(60)接触时，所述竞争试剂CR(60)与包含在第一受体结合试剂(20)中的第一结合配偶体C1(81)竞争包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)。由于竞争试剂CR(60)与包含在第一多聚化试剂(25)中的第一结合位点Z1(26)的结合，第一受体结合试剂(20)与第一多聚化试剂(25)之间的结合被破坏，从而第一多聚化试剂(25)以及最终第一受体结合试剂(20)自靶细胞(10)上分离。
图2：基于流式细胞术的koff-速率测定的设置和分析
图2A是流式细胞仪上示例性设置的示意图。图2B为具有用于koff-速率测定的FACS管的样品温度控制器的示例性描绘。图2C示出了采用T细胞克隆的基于流式的koff-速率测定的示例性门控策略：采用可逆多聚体(包含Streptactin APC和SIYRYYGL(SEQ ID NO:10)-H2Kb-Alexa488)和用于区分存活/死亡的碘化丙啶(PI)使表达2C TCR的T细胞克隆染色。在Cyan Lx上分析染色的细胞，30秒后加入2mM D-生物素并观察解离10min。在存活的淋巴细胞上对样品进行门控，并观察Streptactin-APC和MHC-Alexa488自这些细胞的解离。图2D示出了数据的缩减(reduction)从而使解离动力学可视化：将活的淋巴细胞的APC和Alexa488荧光强度针对在FlowJo中计算的分析时间绘图。将所计算时间分为200个门，计算包含在一个门中的所有细胞的平均荧光强度(MFI)。将APC(左轴)和Alexa488(右轴)的MFI值针对在Graph Pad Prism(上图)中的分析时间绘图。选择用于分析的数据点并进行指数衰变拟合(下图)。图2E为所有细胞的解离动力学的直接分析：将所有活淋巴细胞的荧光值直接输出到Graph Pad Prism。选择用于分析的数据点并进行指数衰变拟合。
图3：采用CMV-特异性T细胞克隆的基于流式细胞术的koff-速率测定
图3A至图3C示出了人CMV-特异性T细胞克隆的koff-速率测定：采用特异性可逆多聚体(包含Streptactin APC和MHC-Alexa488)和用于区分存活/死亡的碘化丙啶(PI)使T细胞克隆染色。在Cyan Lx上实施koff-速率测定。将Alexa488和APC染色的活细胞的荧光值针对分析时间绘图，如所述选择用于分析的数据点并进行指数衰变拟合。图3D示出了在显微镜和流式细胞仪上评估的TCR-pMHC结合半衰期的比较。
图4：采用可逆和不可逆多聚体进行双重染色的原理
图4A为用可逆和不可逆多聚体染色CD8+T细胞(左上)和添加D-生物素后可逆多聚体的解离(右下)的示意图。图4B示出了用特异性可逆多聚体(包含Streptactin APC和HLA-B8IE188-96-Alexa488)、用于区分存活/死亡的碘化丙啶(PI)并且用特异性不可逆多聚体(包含链霉亲和素BV421和未标记的B8IE188-96分子)使源自人CMV特异性T细胞克隆的T细胞染色。在添加D-生物素之前，双重染色(Streptactin APC和链霉亲和素BV421，在活的、CD8+淋巴细胞上门控)的人CMV特异性T细胞克隆的点图(左)。30秒后添加D-生物素，不可逆多聚体(链霉亲和素BV421)的骨架的染色强度和可逆多聚体(Streptactin APC)和pMHC分子(Alexa488)骨架的染色强度随分析时间的变化。
图5：双重染色后可逆多聚体染色强度和koff-速率
图5A描绘了不可逆多聚体染色的温育时间和浓度的滴定分析(titration)：用特异性可逆多聚体(包含Streptactin APC和HLA-B7pp65-Alexa488)、针对CD8PE-Cy的抗体和用于存活/死亡区分的碘化丙啶(PI)温育来自CMV阳性(B7pp65)供体的PBMC。洗涤后，将样品用特异性不可逆多聚体温育，在点图的上方标明了所述多聚体的温育时间和稀释度(还参见“材料和方法”)。点图示出了CD8+活淋巴细胞的CD8Pe-Cy7和链霉亲和素BV421染色。图5B和图5C示出了在图5A)中描绘的门的不可逆多聚体(链霉亲和素BV421)和可逆多聚体(MHC Alexa 488和Streptactin APC)的染色的直方图。图5D示出了包含在A)中描述的样品中的B7pp65特异性T细胞的TCR-pMHC koff-速率。图5E和图5F示出了两种CMV-特异性T细胞克隆(对HLA B8IE188-96具有特异性)的结果，该两种CMV-特异性T细胞克隆用单独的可逆多聚体染色或用可逆多聚体与和BV421或PE缀合的不可逆多聚体组合染色。所有样品均用碘化丙啶(PI)染色以用于存活/死亡区分。从活的淋巴细胞中测量koff-速率。
图6：B7pp65特异性T细胞群的双重染色和分选
用特异性可逆多聚体(包含Streptactin APC和MHC-Alexa488)、针对CD8的抗体和用于存活/死亡区分的碘化丙啶(PI)使来自CMV阳性供体的PBMC(对HLA B7pp65具有特异性)染色。将细胞分为两组样品。将一组样品在MoFlo(Beckman Coulter)上进行活CD8+Streptactin APC+淋巴细胞的FACS分选。另一组样品另外用不可逆多聚体(包含链霉亲和素PE)染色。图6A示出了活淋巴细胞的链霉亲和素PE和CD8eF450染色(左图)及双重染色样品的链霉亲和素+细胞的MHC Alexa488和Streptactin染色(右图)的点图。图6B示出了利用可逆多聚体染色的B7pp65特异性T细胞的koff-速率测定，而图6C示出了利用双重染色的B7pp65特异性T细胞的koff-速率测定。将Alexa 488和APC染色的分析细胞的荧光值针对分析时间作图，如所述选择用于分析的数据点并进行指数衰变拟合。图6D示出了分选的和双重染色的样品的TCR-pMHC结合半衰期的比较。
图7：寡克隆的HLA*07 02/CMVpp65特异性CD8T细胞群的离体koff-速率测量
通过Ficoll梯度离心从健康供体的新鲜血液中分离PBMC。对单个活的CD19-CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff速率。
图8：寡克隆的HLA*02 01/CMVpp65特异性CD8T细胞群(供体HZ961)的离体koff-速率测量
通过Ficoll梯度离心从健康供体的新鲜血液中分离的冻存的PBMC的koff-速率测量。对单个活的CD19-CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff速率。
图9：寡克隆的HLA*02 01/CMVpp65特异性CD8T细胞群(供体HZ510)的离体koff-速率测量
通过Ficoll梯度离心从健康供体的新鲜血液中分离的冻存的PBMC的koff-速率测量。对单个活的CD19-CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff速率。
图10：采用CD8+J76肿瘤细胞的koff速率测量对分离的TCR进行功能表征
采用单克隆PCR分离两组HLA*02 01/CMVpp65特异性TCR。为了分析它们的结构亲合力，将TCR转导到缺乏内源性TCR的CD8+J76肿瘤细胞中。对单个活的CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff速率。
图11：在鼠模型系统中高亲合力和低亲合力TCR pMHC相互作用的koff速率测量
a行；SIIQFEKL:H2kb(SEQ ID NO:14)，b行：SIYNFEKL:H2kb(SEQ ID NO:15)；c行：SIINFEKL:H2kb(SEQ ID NO:15)。
具体实施方式
对于一些应用，如对T细胞克隆或转导T细胞等均质群体的测量，无需分辨单个细胞，因此需要一种允许采用常规仪器快速筛选koff-速率值的方法。因此，本申请的发明人旨在将基于可逆多聚体的koff-速率测定的原理转用于常规流式细胞术引导的应用中。发明人意外地证明，通过流式细胞术确实可以高灵敏度地获得koff-速率动力学；由此，该程序得到高度可靠的解离测量，其值与显微术引导的测定的值相当。发明人进一步惊奇地证明，该程序可以转用于直接离体分析抗原特异性T细胞群。这些结果在此之前是不可预期的，因为体内抗原特异性T细胞群通常非常小并且其它(非特异性)细胞的存在限制了染色动力学的示踪(如对koff-速率测量而言这是必需的)。Hebeisen等，2015,Cancer Res,75(10):1983-91提出将koff-速率测量与预先分选或克隆所分析的T细胞相结合。然而，本发明人已经认识到，这一方案不仅是一个非常耗时的过程，而且由于体外扩增方案常常改变复杂T细胞群的组成，因此该方法还存在使所获得结果有偏差的风险。因此，发明人设想通过采用可逆和不可逆特异性MHC多聚体对抗原特异性T细胞双重染色来直接评估koff-速率值而无需进行细胞分选和体外细胞扩增。采用不可逆多聚体染色允许在观察可逆多聚体解离时稳定地识别抗原特异性靶群。更重要的是，本申请的发明人能够证明pMHC的解离动力学不受采用不可逆多聚体的另外染色的影响。因此，多聚体双重染色与流式细胞术引导的TCR-配体koff-速率测量的结合可用于直接离体分析甚至非常小的抗原特异性T细胞群。
因此，本发明涵盖一种测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)的方法，所述方法包括检测附着于所述靶细胞的第一可检测标记和附着于所述靶细胞的第二可检测标记。而所述第一可检测标记可被可逆地结合至所述细胞，所述第二可检测标记可被基本上不可逆地结合至所述细胞。出于此目的，已使所述细胞与下述接触：(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1。优选地，所述第一多聚化试剂包含至少3个，优选地至少3个，优选地4-20个，优选地4-8个，优选地4个第一结合位点Z1。所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂。优选地，所述第一多价复合物包含至少3个，优选地至少4个，优选地4-20个，优选地4-8个，优选地4个结合至一个所述第一多聚化试剂的第一受体结合试剂。应理解，所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂。进一步理解，所述第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R。还应理解，所述第一可检测标记和所述第二可检测标记彼此不同，意即两者不是相同的化合物。任选地，所述第一多聚化试剂进一步包含第三可检测标记。应当理解，优选地，所述第一、第二和第三可检测标记彼此不同，并且优选地它们可以彼此区分。
在本文中，值得注意的是受体结合试剂B与其受体R(如细胞表面受体分子)之间复合物(C)的形成可以描述为记为下述的两状态过程：
相应的解离常数Kd定义为
其中[B]、[R]和[C]是在给定的温度和压力下受体、受体结合试剂(配体)和相应的复合物的平衡摩尔浓度。解离常数Kd也可表述为复合物结合/形成的速度即正反应速率(on-rate)常数(kon)(也称为结合速率常数)和复合物解离即逆反应速率(off-rate)常数(koff)(也称为解离速率常数)的比率
Kd＝koff/kon
在本申请中，热力学和动力学常数Kd、kon和koff的值是指在温度为4℃和大气压力为1.013bar下的测定值。
如本文所用，当在单价结合复合物的上下文中使用时，“可逆的”可以两个结合配偶体之间的结合如受体分子R与其结合配偶体B之间的结合的koff速率表述。可逆结合的koff速率可以为约0.5x10-4sec-1或更高、约1x10-4sec-1或更高、约2x10-4sec-1或更高、约3x10- 4sec-1或更高、约4x10-4sec-1或更高、约5x10-4sec-1或更高、约1x10-3sec-1或更高、约1.5x10- 3sec-1或更高、约2x10-3sec-1或更高、约3x10-3sec-1或更高、约4x10-3sec-1、约5x10-3sec-1或更高、约1x10-2sec-1或更高或约5x10-1sec-1或更高。该种可逆结合复合物的相应KD值可在约1x10-10M或更高、约1x10-9M或更高、约1x10-8M或更高、约1x10-7M或更高、约1x10-6M或更高、约1x10-5M或更高、约1x10-4M或更高、约1x10-3M或更高的范围内。与之相对地，“不可逆的”或“基本上不可逆的”(同义使用或可互换)也可以koff速率表述。如受体分子R与其结合配偶体B之间的(基本上)不可逆的结合的koff速率可以为约1x10-5sec-1或更低、约1x10-6sec-1或更低、约1x10-7sec-1或更低、约1x10-8sec-1或更低、约1x10-9sec-1或更低、约1x10-10sec-1或更低。该种不可逆结合复合物的相应KD值可在约2x10-10M或更低、约1x10-11M或更低、约1x10- 12M或更低、约1x10-13M或更低或约1x10-14M或更低的范围内。其可以在约2x10-10M至约10-15M的范围内。当在本文中将术语“约”与koff速率关联使用时，koff速率或Kd意指包含±0.1％、±0.2％、±0.3％、±0.4％、±0.5％、±0.7％、±0.9％、±1.0％、±1.2％、±1.4％、±1.6％、±1.8％、±2.0％、±2.2％、±2.4,％、±2.6％、±2.8％、±3.0％、±3.5％、±4.0％、±4.5％、±5.0％、±6.0％、±7.0％、±8.0％、±9.0％、±10.0％、±15.0％或±20.0％的误差范围。然而，由于受体分子R在靶细胞表面通常可以以两个或更多个拷贝存在，如果结合细胞的试剂包含两个或更多个结合位点B，则可能必须考虑亲合力效应。在这种情况下，尽管单个受体R和单个结合位点B之间的结合可能是可逆的，但是包含多个R的细胞和包含多个结合位点B的试剂的结合可能是基本上不可逆的。对于这样的多价结合，可以定义表观koff值，其中如果假设所述结合是单价的，表观koff值则为可以明显测量的koff值。如所讨论的，由于亲合力效应，包含两个或更多个受体R的细胞与包含多于一个结合位点B的试剂(如多聚体试剂)的结合可以是基本上不可逆的，比如，表观koff值可以处于对不可逆结合定义的范围内。然而，可以可逆地多聚化多个结合试剂，每个结合试剂包含结合位点B。出于此目的，可以使用包含至少两个结合位点Z的多聚化试剂。除了结合位点B之外，所述结合试剂进一步包含可以结合多聚化试剂上的结合位点Z的结合配偶体C。在本文中，C与Z之间的结合是可逆的，并且优选地，该结合可以如通过加入与C竞争结合位点Z从而可自C:Z复合物中置换C的试剂而被破坏。因此，具有两个或更多个结合试剂(每个均包含结合位点B)结合于其上的可逆多聚体，只要其为多聚体形式，就可以以高亲合力和通常表示基本上不可逆的结合的表观koff值结合包含两个或更多个受体R的细胞。如果如本文所述多聚化本身可以被逆转并且结合位点B与受体R的单价结合是可逆的，则与细胞的结合可仍为可逆的。在如美国专利7,776,562、国际专利申请WO 02/054065或国际专利申请WO 2013/011011中描述了此种通过可逆多聚体的可逆结合。
如本文所用，“可检测标记”是指在流式细胞术中可用于检测染色的细胞的可检测实体。优选地，所述标记不会对待染色或分离的细胞的特征产生负面影响。标记的实例是荧光标记，例如，藻红蛋白、藻蓝蛋白(APC)、Brilliant Violet 421、Alexa Fluor 488、香豆素或罗丹明，仅仅列举几个。标记可以被结合至受体结合试剂和/或多聚化试剂。在应用时，优选地，所述第一可检测标记被结合至受体结合试剂，而可选的第三可检测标记优选被结合至多聚化试剂。标记可以是直接标记，即结合至如上指定的多价结合复合物的成员中的一个。在这种情况下，所述标记可以，例如，被共价偶联(缀合)至或者受体结合试剂或者多聚化试剂。可选地，标记可以是间接标记，即标记与其它试剂结合，该其它试剂进而能够结合如上指定的多价结合复合物的成员中的一个。这种标记可在多价结合复合物已被形成之前、之中或之后添加。这种间接标记的实例是包含荧光染料的二、三或四-NTA，如Lata等，J.Am.Chem.Soc.2005,127,10205-10215或Huang等，Bioconjugate Chem.2006,17,1592-1600所描述。所述标记能够非共价结合(经由金属螯合)寡聚组氨酸标签。因此，在这一实例中，受体结合试剂和/或多聚化试剂可以携带寡聚组氨酸标签(例如，可以使用Fab片段作为受体结合试剂，其具有寡聚组氨酸标签，如融合到CH1或CL-结构域C-末端的六组氨酸标签，或链霉亲和素突变蛋白如商购可获得的Strep-突变蛋白(IBA GmbH,Germany)作为多聚化试剂，其具有融合到其一个亚基的N-或C-末端的寡聚组氨酸标签)，由此能够被用于非共价结合Lata等上文或Huang等上文描述的基于NTA的荧光染料化合物。这种非共价结合标记不一定需要在多价结合复合物形成前被结合至其靶标(受体结合试剂和/或多聚化试剂)，而是也能够在多价结合复合物形成时或多价结合复合物已经形成后添加至样品中。这种非共价结合标记也可在多价结合复合物被结合至靶细胞后添加。除了以上描述的包含荧光染料:寡聚组氨酸结合对的NTA，其他任意特异性结合对，如例如，携带荧光或其它标记的地高辛(digoxigenin)和抗地高辛抗体或抗体片段也可用于间接标记。在这种情况下，受体结合试剂和/或多聚化试剂被缀合到地高辛或与地高辛偶联，而携带所选标记的抗地高辛抗体或抗体片段(经由地高辛)结合多聚化试剂或受体结合试剂。本发明涵盖所述第一可检测标记或所述第二可检测标记均可为荧光染料。任选的第三可检测标记也可以是荧光染料。优选地，所述第一可检测标记是第一荧光染料和所述第二可检测标记为第二荧光染料，其中优选地第一荧光染料的发射信号可以与第二荧光染料的发射信号区分开。任选的第三可检测标记也可以是荧光染料，优选地其可以与第一和第二荧光染料区分开。作为说明性实例，所述第一可检测标记可以是Alexa Fluor 488(Alexa488)，而第二可检测标记可以是Brilliant Violet 421(BV421)。任选的第三可检测标记可以是藻蓝蛋白(APC)。
如所讨论的，靶细胞具有附着于其上的第二可检测标记，其中所述第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R。应当理解，存在多种可能将此种所述第二标记基本上不可逆地附着于一个或多个受体分子R。作为一种可能，本发明设想将所述第二可检测标记通过不可逆多聚体附着于所述细胞。出于此目的，可已使所述细胞进一步与下述接触：(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2。优选地，所述第二多聚化试剂包含至少3个，优选至少3个，优选至少4-20个，优选4-8个，优选4个第二结合位点Z2。第二结合配偶体C2与第二结合位点Z2之间的稳定结合可以是如本文所定义的基本上不可逆的结合。因此，所述第二结合配偶体C2与所述第二结合位点Z2之间的结合的解离速率常数(koff)可以例如在如本文对基本上不可逆的结合所定义的范围内。因此，所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。可选地，所述第二结合配偶体C2与所述第二结合位点Z2之间的结合可以是可逆的结合，且所述第二结合配偶体C2和所述第二结合位点Z2可以是对C1和Z1定义的任意化合物对，前提是C2和Z2之间的键不能被可破坏C1与Z1之间的键的相同方法破坏。作为说明性实例，C1可以是链霉亲和素结合亲和肽和Z1可以是如streptactin的链霉亲和素突变蛋白，而C2可以是寡聚组氨酸标签和Z2是包含二价阳离子的化合物。如果将生物素添加到这些复合物中，则C1与Z1之间的键将被破坏，而C2和Z2之间的键将保持完整。因此，尽管C2与Z2之间的键通常可以被破坏(例如通过使复合物与金属螯合剂如EDTA接触)，只要该C2与Z2之间的键不能被可破坏C1与Z1之间的键的相同手段或方法破坏，其就仍可以作为本发明方法中的不可逆多聚体。因此，优选地，Z2与C2之间的结合是不可逆的，或者优选地不会被可破坏C1与Z1之间的结合的手段破坏。优选地，第二多价复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少3个，优选至少4个，优选4-20个，优选4-8个，优选4个第二受体结合试剂。因此，优选地，可以选择性破坏Z1与C1之间的结合而Z2与C2之间的结合保持完整。因此，可能的是选择性地逆转第一可检测标记与细胞的附着，而第二可检测标记将保持附着于细胞。进一步应理解，B1和B2可以相同或不同。优选地，B1和B2相同。
将第二可检测标记基本上不可逆地附着于靶细胞的另一种可能性可以是采用包含多个B2结合位点的结合试剂。因此，本发明涵盖，本发明的方法可包括已使所述细胞进一步与下述接触：(iii’)多聚体受体结合试剂M2，其中所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，优选地至少3个、优选地至少4个、优选地4-20个、优选地4-8个、优选地4个受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，和其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。因此，所述多聚体受体结合试剂M2与所述靶细胞之间的结合的表观解离速率常数(koff)可以是，例如约1x10-5sec-1或更低、约1x10-6sec-1或更低、约1x10-7sec-1或更低、约1x10-8sec-1或更低、约1x10-9sec-1或更低、约1x10-10sec-1或更低。因此，同样应理解，B1和B2可以相同或不同，优选地，B1和B2相同。
将第二可检测标记基本上不可逆地附着于靶细胞还可以通过使用不可逆地结合受体R的试剂来实现。因此，本发明涵盖，本发明的方法可包括已使所述细胞进一步与下述接触：(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，和其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。应理解，对于结合R，I2可包含不可逆结合位点B3，该位点基本上不可逆地结合R且优选地与B1不同。因此，所述不可逆结合位点B3与所述受体分子R之间的结合的解离速率常数(koff)可以是，例如约1x10-5sec-1或更低、约1x10-6sec-1或更低、约1x10-7sec-1或更低、约1x10-8sec-1或更低、约1x10-9sec-1或更低、约1x10-10sec-1或更低。
在本发明的方法中，实际上任何具有至少一个常见受体分子的所述靶细胞均可用于koff速率测量。为了实现亲合力效应，受体分子通常于靶细胞表面以两个或更多个拷贝存在。在典型的实施方案中，靶细胞为真核细胞或原核细胞，优选地为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可以是淋巴细胞或干细胞。因此，所述靶细胞可以是T细胞、T辅助细胞、B细胞或天然杀伤细胞，比如CMV-特异性CD8+T-淋巴细胞、细胞毒性T-细胞、记忆T细胞和调节性T细胞。类似地，定义靶细胞群的至少一个常见(特异性)受体可以是能够测定与给定结合位点B1结合的koff速率的任何受体。例如，所述受体可以是定义免疫细胞的群或亚群，如T细胞、T辅助细胞(例如CD4+T-辅助细胞)、B细胞或天然杀伤细胞的群或亚群的受体。T细胞的实例包括比如CMV-特异性CD8+T-淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞(Treg)的细胞。受体分子R可以是靶细胞上存在的任何受体。然而，优选地，所述受体是抗原-特异性受体，比如，如T细胞受体或B细胞受体。优选地，所述受体可以为T细胞受体，而优选地靶细胞可以为CD8+T细胞。在本文中，应注意本文所用的术语“靶细胞”包括所有生物实体/囊泡，其中膜(也可以是脂质双层)将内部与外部环境隔开，并且该生物实体/囊泡包含在生物实体表面上的特异性受体分子。此类实体的实例包括，但不限于，细胞、病毒、脂质体和如线粒体、叶绿体、细胞核或溶酶体的细胞器。
在本发明的方法中，特异性地结合所述受体分子R的所述受体结合试剂的第一受体结合位点B1可以是例如MHC分子。用作第一受体结合位点B1的MHC分子允许直接离体表征T细胞的抗原特异性亚群的T细胞受体的koff速率。值得注意的是，术语“MHC分子”包括与肽缀合的MHC分子。第一受体结合位点B1还可以是抗体或二价抗体片段，比如(Fab)2’-片段、二价单链Fv片段。其也可以是二价蛋白质样人工结合分子，比如二聚脂质运载蛋白突变蛋白，也称为“duocalin”。在其它实施方案中，受体结合试剂可具有单个结合位点B1，即可以是单价的。单价受体结合试剂的实例包括，但不限于单价抗体片段或具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子，比如脂质运载蛋白突变蛋白。
如本文所讨论的，第一结合配偶体C1与第一结合位点Z1之间的键应是可逆的，即，该键应在适于实施要求保护的方法的条件下能够被破坏。所述第一结合配偶体C1与所述第一结合位点Z1之间的结合的解离速率常数(koff)可以，例如在本文中如对于可逆结合定义，如在约5x10-4sec-1的范围内。这种键的koff也可以通过任意合适的方法测定，例如，通过荧光滴定、平衡透析或表面等离子共振。染色的多聚化试剂从细胞的解离/移除导致了解离的受体结合试剂、和因此包含可检测标记的整个多价结合复合物从预先染色的细胞移除。
根据本发明，可选择受体结合试剂，以使得其包含至少一个第一结合配偶体C1，而所述第一多聚化试剂包含针对第一结合配偶体C1的至少两个第一结合位点Z1、至少三个或至少四个第一结合位点Z1。可选地，可以使用两种不同(种类)的受体结合试剂。
根据本发明，所述配偶体可以选自：(a)所述第一结合配偶体C1包含链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽，和所述第一多聚化试剂包含可逆地结合所述链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽的链霉亲和素、或抗生物素蛋白、或链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物；或(b)所述第一结合配偶体C1包含可逆地结合链霉亲和素或抗生物素蛋白的生物素类似物，和第一多聚化试剂包含可逆地结合所述生物素类似物的链霉亲和素、或抗生物素蛋白、或链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。所述第一结合配偶体C1可包含链霉亲和素结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)，和所述多聚化试剂包含在野生型链霉亲和素序列的44至47位具有氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:02)的链霉亲和素类似物，或在野生型链霉亲和素序列的44至47位具有氨基酸序列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)的链霉亲和素类似物。这两种突变体例如描述于美国专利6,103,493，可以从德国IBA GmbH,以商标Strep-购得。链霉亲和素结合肽可以是，例如，单一肽，如描述于例如美国专利5,506,121的“Strep-”，或具有如国际专利公开WO 02/077018所述的顺序排列的两个或更多个单个结合分子的链霉亲和素结合肽。具有顺序排列的两个或更多个单个结合分子的链霉亲和素结合肽的实例包括国际专利申请WO 02/077018或美国专利7,981,632中描述的di-tag3序列(WSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK；SEQ ID NO:11)、di-tag2序列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:12)或序列WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK(SEQ ID NO:13，也称为Twin-Strep-)。
本发明还涵盖第一结合配偶体C1与所述多聚化试剂的所述至少2个第一结合位点Z1之间的结合可在二价阳离子存在下发生。在一个说明性实例中，所述第一结合配偶体C1包含钙调蛋白结合肽，和多聚化试剂包含例如如美国专利5,985,658中描述的多聚体钙调蛋白。可选地，第一结合配偶体C1可包含FLAG肽，而所述第一多聚化试剂可包含结合FLAG肽的抗体，如结合如美国专利4,851,341中所描述的单克隆抗体4E11的FLAG肽。在另一个说明性实例中，所述第一结合配偶体C1包含寡聚组氨酸标签，而所述第一多聚化试剂包含结合寡聚组氨酸标签的抗体或过渡金属离子。所有这些结合复合物的破坏均可通过金属离子螯合来完成，如钙螯合，如通过添加EDTA或EGTA。钙调蛋白、抗体如4E11或螯合的金属离子或游离螯合剂可通过常规方法被多聚化，如通过生物素化和与链霉亲和素或抗生物素蛋白或其多聚体复合，或通过在第一步中将羧基残基引入多糖如葡聚糖中，基本上如Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H.(1992).“Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-humancolon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextranconjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137”中所描述，并且在第二步中使用常规的碳二亚胺化学使钙调蛋白或抗体或螯合的金属离子或游离螯合剂经由伯胺基与多糖如葡聚糖主链上的羧基偶联。
在本发明所述方法中，多聚化试剂也可以是链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任意类似物的低聚物或聚合物。该低聚物或聚合物可以通过多糖交联。链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的类似物的低聚物或聚合物可以通过在第一步中将羧基残基引入多糖如葡聚糖中来制备，基本上如“Noguchi,A.,Takahashi,T.,Yamaguchi,T.,Kitamura,K.,Takakura,Y.,Hashida,M.&Sezaki,H.(1992).Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-humancolon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextranconjugate.Bioconjugate Chemistry 3,132-137”中所描述。然后在第二步中使用常规的碳二亚胺化学使链霉亲和素或抗生物素蛋白或它们的类似物经由内部赖氨酸残基和/或游离N-末端的伯胺基偶联到葡聚糖主链的羧基上。但是，链霉亲和素或抗生物素蛋白或者链霉亲和素或抗生物素蛋白的任意类似物的交联的低聚物或聚合物也可通过经由双官能团连接物如戊二醛(glutardialdehyde)交联或通过文献中描述的其他方法获得。
本发明进一步涵盖所述第一结合配偶体C1可包含抗原，和所述多聚化试剂可包含针对所述抗原的抗体或抗体片段。这种抗原可以是，例如，表位标签。合适的表位标签的实例包括，但不限于，FLAG-标签(序列：DYKDDDDK，SEQ ID NO:04)、Myc-标签(序列：EQKLISEEDL，SEQ ID NO:05)、HA-标签(序列：YPYDVPDYA，SEQ ID NO:06)、VSV-G-标签(序列：YTDIEMNRLGK，SEQ ID NO:07)、HSV-标签(序列：QPELAPEDPED，SEQ ID NO:08)和V5-标签(序列：GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO:09)。所述抗原还可以是蛋白，例如，所述第一结合配偶体C1可包含麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)或硫氧还蛋白作为抗原。在这些情况下，多聚化试剂的所述至少两个第一结合位点Z1(抗体)与抗原之间形成的复合物可通过添加游离抗原(即如Myc-标签或HA-标签(表位标签)的游离肽或游离蛋白(如MBP或CBP))来破坏。在本文中，需要注意的是，如果FLAG-标签用作第一结合配偶体C1而所述第一多聚化试剂包含结合FLAG标签的抗体或抗体片段，则也可通过添加游离FLAG肽来破坏这一可逆的键。
本发明还涵盖所述第一结合配偶体C1可包含谷胱甘肽S-转移酶(GST)，和所述第一多聚化试剂可包含谷胱甘肽作为第一结合位点Z1，或其中所述第一结合配偶体C1可包含谷胱甘肽，和所述第一多聚化试剂可包含谷胱甘肽S-转移酶作为第一结合位点Z1。因此，GST与谷胱甘肽之间的键可以通过添加过量的谷胱甘肽来解离。游离的谷胱甘肽可竞争性地置换与GST结合的包含在C1或Z1中的谷胱甘肽，从而允许所述第一受体结合剂从所述第一多聚化试剂中解离。
本发明还涵盖所述第一结合配偶体C1可包含免疫球蛋白Fc部分，和所述第一多聚化试剂可包含选自蛋白A、蛋白G、蛋白a/g和蛋白L的蛋白，或其中所述第一结合配偶体C1包含选自蛋白A、蛋白G、蛋白a/g和蛋白L的蛋白作为第一结合位点Z1，和所述第一多聚化试剂包含免疫球蛋白Fc部分作为第一结合位点Z1。免疫球蛋白Fc部分与蛋白A、蛋白G、蛋白a/g或蛋白L之间的键可通过如使用酸性pH来破坏。
本发明进一步预期，包含在第二受体结合试剂中或包含在多聚体受体结合试剂M2中的第二受体结合位点B2通常可以是本文对于第一受体结合试剂B1定义的任何化合物。优选地，B2为MHC分子。本发明进一步涵盖，第二受体结合位点B2优选可与第一受体结合位点B1相同。第二受体结合位点B2也可以是抗体、二价抗体片段、单价抗体片段和具有抗体样结合的蛋白质性结合分子。
二价抗体片段的实例包括，但不限于二价抗体片段为(Fab)2’-片段或二价单链Fv片段。单价抗体片段的实例包括，单不限于Fab片段、Fv片段、单链结构域抗体和单链Fv片段(scFv)。
可用作特异性地结合受体分子的受体结合试剂的具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子的实例包括，但不限于，适体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白(glubody)、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、adnectin、高亲和性多聚体(avimer)、EGF-样结构域、三环结构域(Kringle-domain)、纤连蛋白Ⅰ型结构域、纤连蛋白Ⅱ型结构域、纤连蛋白Ⅲ型结构域、PAN结构域、G1a结构域、SRCR结构域、库尼茨(Kunitz)/牛胰蛋白酶抑制剂结构域、淀粉酶抑肽(tendamistat)、Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶(P-型)结构域、血管性血友病因子C型结构域、过敏毒素样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白Ⅰ型重复序列、LDL受体A类结构域、Sushi结构域、Link结构域、凝血酶敏感蛋白Ⅰ型结构域、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白样结构域(例如，结构域抗体或骆驼重链抗体)、C型凝集素结构域、MAM结构域、血管性血友病A型结构域、生长调节素B结构域、WAP型四二硫化物核心结构域、F5/8C型结构域、血红素结合蛋白结构域、SH2结构域、SH3结构域、层粘连蛋白型EGF样结构域、C2结构域、“Kappabody”(Ill.等."Design and construction of ahybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chainvariable regions"Protein Eng 10:949-57(1997))、“微抗体”(Martin等."Theaffinity-selection of a minibody polypeptide inhibitor of human interleukin-6"EMBO J 13:5303-9(1994)),"Janusins"(Traunecker等."Bispecific single chainmolecules(Janusins)target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells"EMBO J10:3655-3659(1991)和Traunecker等."Janusin:new molecular design for bispecificreagents"Int J Cancer Suppl 7:51-52(1992))、纳米抗体、adnectin、四连接素、微体(microbody)、affilin、亲和体或锚蛋白、晶状体蛋白、knottin、泛素、锌指蛋白、自体荧光蛋白、锚蛋白或锚蛋白重复蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白、avimer(Silverman,Lu Q,Bakker A,To W,Duguay A,Alba BM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,MooreKW,Swimmer C,Perlroth V,Vogt M,Kolkman J,Stemmer WP 2005,Nat Biotech,Dec；23(12):1556-61,E-Publication in Nat Biotech.2005Nov 20版)；以及通过人受体结构域家族的外显子穿梭进化来的多价avimer蛋白，如还描述于Silverman J,Lu Q,Bakker A,ToW,Duguay A,Alba BM,Smith R,Rivas A,Li P,Le H,Whitehorn E,Moore KW,Swimmer C,Perlroth V,Vogt M,Kolkman J,Stemmer WP,Nat Biotech,Dec；23(12):1556-61,E-Publication in Nat.Biotechnology.2005Nov 20版。
本发明还涵盖，包含在不可逆受体结合试剂I2中的不可逆受体结合位点B3可以是抗体，二价抗体片段、单价抗体片段和具有抗体样结合的蛋白质性结合分子。应理解，优选地所述不可逆受体结合位点B3与第一受体结合位点B1不是相同的化合物。
本发明进一步涵盖所述第二结合配偶体C2可包含生物素或生物素类似物，和所述第二多聚化试剂可包含基本上不可逆地结合所述生物素或生物素类似物的作为第二结合位点Z2的链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。作为说明性实例，所述第二结合配偶体C2可以是生物素和所述第二结合位点Z2可以是链霉亲和素。同时，所述第一结合配偶体B1可包含如SEQ ID NO:01所示的链霉亲和素结合肽，而所述第一多聚化试剂的第一结合位点Z1可包含在链霉亲和素野生型序列的44至47位具有氨基酸序列Va144-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:02)的链霉亲和素类似物，或在所述序列的44至47位具有氨基酸序列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)的链霉亲和素类似物。因此，当将多聚体复合物与过量游离生物素接触时，包含在C1中的链霉亲和素结合肽自第一结合位点Z1中被置换，而包含在C2中的生物素仍然被结合至所述第二结合位点Z2。由此，所述第一多聚化试剂可自靶细胞上解离，从而允许测量受体与第一受体结合位点B1的koff速率，而第二多聚化试剂保持附着于所述靶细胞。
可选地，所述第二结合配偶体C2和所述第二结合位点Z2可以是对C1和Z1定义的任意化合物对，前提是C2和Z2之间的键不能被可破坏C1与Z1之间的键的相同方法破坏。作为说明性实例，C1可以是strep-标签和Z1可以是streptactin，而C2可以是寡聚组氨酸标签和Z2是包含二价阳离子的化合物。如果将生物素添加到这些复合物中，则C1与Z1之间的键将被破坏，而C2和Z2之间的键将保持完整。因此，尽管C2与Z2之间的键通常可以被破坏(例如通过使复合物与金属螯合剂如EDTA接触)，只要该C2与Z2之间的键不能被可破坏C1与Z1之间的键的相同手段或方法破坏，其就仍可以作为本发明方法中的不可逆多聚体。
本发明的方法可包括使包含受体分子R的靶细胞与第一受体结合试剂和所述第一多聚化试剂接触的步骤。可以以任何顺序将这三个组分相互接触。作为说明性实例，可首先使第一受体结合剂与第一多聚化试剂接触，以允许形成第一受体结合剂与第一多聚化试剂的复合物，然后使该两个化合物与靶细胞接触。作为另一个说明性实例，可以首先使细胞与第一受体结合试剂接触，然后使第一多聚化试剂与细胞和第一受体结合试剂接触。作为进一步的说明性示例，可以同时使所有三个组分彼此接触。
本发明的方法可进一步包括使靶细胞与第二受体结合试剂和第二多聚化试剂接触的步骤。同样，可以以任何顺序将这三个组分相互接触，并且针对使靶细胞与第一受体结合试剂和第一多聚化试剂接触的说明性实例经适当变形后适用于此。可选地，本发明的方法可进一步包括使靶细胞与本文所述的多聚体受体结合试剂接触的步骤，或使靶细胞与本文所述的不可逆受体结合试剂接触的步骤。优选地，在使细胞与第二受体结合试剂和第二多聚化试剂或多聚体受体结合试剂或不可逆受体结合试剂接触之前进行使靶细胞与第一受体结合试剂和第一多聚化试剂接触的步骤。任选地，在上述两个步骤之间可实施洗涤步骤。
本发明的方法可进一步包括破坏第一受体结合试剂与第一多聚化试剂之间的结合的步骤。应当理解，该步骤可以在已使细胞与第一受体结合试剂和第一多聚化试剂以及第二受体结合试剂和第二多聚化试剂或多聚体受体结合试剂或不可逆受体结合试剂接触之后实施。可以通过技术人员已知的或本文描述的任意合适的方法破坏第一受体结合试剂与第一多聚化试剂之间的结合。例如，可以通过使结合的复合物与竞争试剂CR接触破坏所述结合。在本文中，所述竞争试剂CR可能够与第一结合配偶体C1竞争结合第一多聚化试剂上的第一结合位点Z1。本文描述了合适的竞争试剂，并且其取决于第一受体结合试剂中包含的第一结合配偶体C1的类型和第一多聚化试剂中包含的第一结合位点Z1的类型。作为说明性实例，在第一结合配偶体C1是链霉亲和素结合肽和第一多聚化试剂可以是链霉亲和素突变蛋白比如Strep-时，竞争试剂CR可以是生物素或生物素类似物。
第一受体结合试剂和第一多聚化试剂之间的结合的破坏还可以通过金属离子螯合，如通过使复合物与金属螯合剂(比如EDTA或EGTA)接触来进行。该类还可以通过金属离子螯合进行的破坏所述结合试剂与第一多聚化试剂可以在例如当第一结合配偶体C1为寡聚组氨酸标签和第一结合位点Z1包含二价阳离子时进行。另一种破坏第一受体结合试剂和第一多聚化试剂之间的结合的方法是pH改变。该方法可以在例如当第一结合位点Z1包含免疫球蛋白Fc区和第一结合位点Z1包含蛋白A时进行。
在优选的实施方案中，靶细胞为T细胞，优选为CD8+T细胞；受体R为T细胞受体；第一受体结合位点B1和第二受体结合位点B2相同并均为MHC分子；第一结合配偶体C1包含链霉亲和素结合肽和第一多聚化试剂包含streptactin；第二结合配偶体包含生物素和第二多聚化试剂包含链霉亲和素，第一可检测标记(如Alexa 488)被结合至第一受体结合试剂，第二可检测标记(如BV421)优选被结合至第二多聚化试剂；第三可检测标记(如APC)优选被附着于第一多聚化试剂。应理解，第一、第二和任选的第三可检测标记可彼此区分。在本文中，生物素可以用作用于破坏C1与steptactin的Z1之间的可逆结合的竞争试剂CR。
本发明的方法可进一步包括检测附着于靶细胞的第一可检测标记和检测附着于靶细胞的第二可检测标记的步骤。在本文中，优选地，检测两种可检测标记可以在破坏第一受体结合试剂与第一多聚化试剂之间的结合的步骤之后实施。如果第一多聚化试剂包含第三可检测标记，则本发明的方法可进一步包括检测第三可检测标记。此外，本发明的方法可包括检测其它可检测标记。作为说明性实例，靶细胞可以用具有其它可检测标记如eF450的CD8抗体另外染色。靶细胞也可以用允许区分存活细胞和死亡细胞的染料染色。此类染料的说明性实例是碘化丙啶，碘化丙啶是一种嵌入剂和荧光分子，其是膜不渗透的并且通常被活细胞排斥，因此可用于识别死细胞。
本发明预期，可以通过基于流式细胞术的分析检测可检测标记。基于流式细胞术的分析通常与光学检测结合以识别和分类细胞，并允许速度与高灵敏度和特异性相结合。该分析允许同时多参数分析流经光学或电子检测设备的单个细胞的物理和化学特性。这些特定的物理和化学特性可包括每个细胞的特定光散射和/或荧光特性。
本发明涵盖直接或间接结合至受体分子R的两种可检测标记的用途。其中，第一可检测标记被可逆地结合至细胞，而第二可检测标记与靶细胞/受体分子R的结合是基本上不可逆的。因此，检测到第二可检测标记的信号可指示靶细胞上存在受体分子R。同样，第二可检测标记的存在可以指示靶细胞上存在受体分子R，所述细胞上第一可检测标记的存在或不存在可指示所述第一受体结合位点B1与受体分子的未解离或解离。在本文中，第一可检测标记的存在指示第一受体结合位点未解离，第一可检测标记的不存在指示第一受体结合位点解离。应当理解，在检测到所述第二可检测信号的细胞上的所述第一可检测标记的检测事件的减少可指示所述第一受体结合位点B1与所述受体分子R的解离动力学。此类解离可能遵循指数衰变的动力学。在分析细胞(在该细胞处存在第二可检测标记)上第一个可检测标记的检测事件的数量时，受体分子R与第一受体结合位点B1的结合的解离速率常数(koff)可以通过本领域技术人员熟悉的标准方法(例如曲线拟合)获得。
本发明的方法通常可测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1结合的任意koff值。然而，优选地，所述方法用于靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的结合，其中怀疑所述koff值在约100sec-1至约10-4sec-1的范围内，优选地在10-1sec-1至约10-3sec-1的范围内。
本发明的方法可以在任何合适的温度下实施。典型地，含有靶细胞的混合物与第一受体结合试剂、第一多聚化试剂、第二受体结合试剂、第二多聚化试剂、多聚体受体结合试剂M2或不可逆受体结合试剂I2中任意者的接触，和随后第一受体结合试剂与第一多聚化试剂之间的结合的破坏以及第一可检测标记、第二可检测标记或第三可检测标记中的任意之一的检测，可在一定温度下进行，在所述温度下，基本上没有可能导致靶细胞如T细胞表型(在T细胞将被染色或分离的情况下)改变的活化和/或信号传导事件发生。因此，优选地，本发明的方法或本发明的方法的每个单个步骤可在温度≤15℃或在温度≤4℃下进行。
本发明进一步涵盖，所述靶细胞可被包含在样品中。所述样品可包含靶细胞和多种其它细胞。所述样品可包含细胞(如CD8+T细胞)群和所述靶细胞可包含其亚群(如对某种抗原具有特异性的CD8+T细胞)。
所述样品可以来自任何合适的来源，通常为身体组织的所有样品或诸如血液的体液。因此，所述样品可以是外周血样品。在后一种情况下，所述样品可以是例如，能够通过标准分离方法(如血细胞的Ficoll梯度)获得的外周血单核细胞(PBMC)群。然而，包含在样品中的细胞群也可以是纯化形式，并且可以采用如美国专利7,776,562、美国专利8,298,782、国际专利申请WO02/054065或国际专利申请WO2013/011011中所述的可逆细胞染色/分离技术分离。可选地，经由如美国专利6,352,694 B1或欧洲专利EP 0 700 430 B1中所述的负磁性免疫粘附通过细胞分选获得所述细胞群。如果将本文所述的分离方法用于基础研究，则样品可能是体外细胞培养实验的细胞。通常已将样品制成流体形式，例如溶液或分散体。
可以从受试者中获得所述样品。本文所用“受试者”是指人或非人动物，通常为哺乳动物。受试者可以是哺乳动物物种，比如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、猪、牛、山羊、绵羊、马、猴、猿或者优选人。虽然受试者通常是活的生物体，但是也可以在死后进行取样。
本发明还涵盖一种包含至少三个受体分子R的细胞，其中所述细胞具有结合至至少两个受体分子R的下述：(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1。所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂。应当理解，所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂。因此，所述细胞具有附着于其上的第一可检测标记。此外，所述细胞具有附着于其上的第二可检测标记。所述第一可检测标记可以被可逆地结合至所述细胞，而所述第二可检测标记可以被基本上不可逆地附着于所述细胞。还应理解，所述第一可检测标记和所述第二可检测标记彼此不同，意即两者不是相同的化合物。任选地，所述第一多聚化试剂进一步包含第三可检测标记。应当理解，优选地，所述第一、第二和第三可检测标记的每一个彼此不同，并且优选地它们可以彼此区分。这种细胞特别用于测定受体分子R与第一受体结合位点B的解离速率常数(koff)，所述测定可以根据本发明的方法进行。
如所讨论的，所述细胞具有附着于其上的第二可检测标记，其中所述第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R。应当理解，存在多种可能将所述第二标记基本上不可逆地附着到一个或多个受体分子R。作为一种可能，本发明因此涵盖将所述第二可检测标记通过根据本发明的不可逆多聚体附着于所述细胞。因此，所述细胞可以进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中，所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
可选地，所述细胞可具有附着于其上的根据本发明的多聚体受体结合试剂M2。因此，所述细胞可进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述至少两个受体分子R基本上不可逆地结合所述细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
作为另一种选择，所述细胞可具有附着于其上的根据本发明的不可逆受体结合试剂I2。因此，所述细胞可进一步具有结合至受体分子R的下述：(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
应当理解，所述细胞可以是根据本发明的任何靶细胞。类似地，所述受体分子R可以是根据本发明的任意受体分子R。
本发明进一步涵盖一种适用于实施本发明的方法的试剂盒。因此，所述试剂盒包含(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)能够形成能够结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，其中所述第一多价结合复合物可包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂，其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂。
所述试剂盒可进一步包含(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)能够形成能够结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；其中第二可检测标记被结合至或能够结合所述第二多价结合复合物。
可选地，所述试剂盒可进一步包含(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2能够经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
可选地，所述试剂盒可进一步包含(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2能够基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
所述试剂盒可进一步包含竞争试剂CR，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1。所述试剂盒可进一步包含金属螯合剂，其中所述金属螯合剂优选为EDTA或EGTA。
本发明进一步涵盖一种装置。此类装置包含第一容器，所述第一容器含有包含受体分子R的靶细胞，和(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)能够形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和其中第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和其中第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R，其中所述第一可检测标记不是所述第二可检测标记。
所述装置进一步包含第二容器，所述第二容器含有包含竞争试剂CR的流体，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1，或金属螯合剂，其中所述金属螯合剂优选为EDTA或EGTA。所述第一容器与第二容器相连接以使得流体可以从第二容器转移到第一容器。
所述装置的第一容器可进一步含有(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)能够形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
可选地，所述装置的第一容器可进一步含有(iii’)多聚体受体结合试剂M2，其中所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2能够经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
可选地，所述装置的第一容器进一步含有(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2能够基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
所述装置可进一步包含用于控制第一容器的温度的设备。所述设备可包含至少部分地围绕所述第一容器的分离层。所述装置还可包括能够测定第一容器内的温度的温度计。所述设备还可进一步包含冷却元件。这种冷却元件可以是空气冷却器。冷却元件可以允许电子控制第一容器的温度或在第一容器内的温度。
所述第一容器可以是例如样品管。典型的样品管可以由塑料(如聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯)、玻璃或金属(如钢)组成。所述管可具有圆柱形状和圆形、扁平或锥形底部。第一容器的体积通常可以具有在微升至升范围内的体积，所述范围通常为约0.01mL至约1000mL、优选约0.05mL至约500mL、约0.1mL至约200mL、约0.5mL至约100mL、约1mL至约50mL、约1mL至约25mL，包括约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25mL，包括其间的任何数字。
第二容器可以是注射器。任何注射器均可包含在本发明的装置中。注射器可以由对于注射器来说典型的任何材料包括塑料(如聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯)、玻璃或金属(如钢)或它们的混合物制成。所述注射器可以适合于手动操作或者可以适合于电子控制操作。
本发明的装置可包含在用于流式细胞术的装置中。所述装置的第一容器可以与用于流式细胞术的装置的样品入口连接。
所述第一容器与所述第二容器可以通过套管或管道连接。通常，套管可以是注射器针，并且可以例如由金属(如铜)或(不锈)钢制成。管道可以是通常用于管道的任何材料的。所述管道可以由如硅、树胶、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、铜或(不锈)钢组成，仅举几例。所述套管或管道的内径可以为约0.1至约20mm，通常为约0.2至约10mm、约0.5至约5mm，包括约0.5mm、约0.6mm、约0.7mm、约0.8mm、约0.9mm、约1mm、约1.2、约1.5mm、约2mm、约3mm、约4mm或约5mm。
可以将阀布置在所述第一容器与所述第二容器之间的连接内。优选地，此类阀可为三通阀。该三通阀可以与第三容器连接。所述第三容器可含有能够破坏第一结合配偶体C1与包含在第一容器中含有的化合物中的第一结合位点Z1之间的结合的试剂。通过使用三通阀，可以装载和卸载第二容器/注射器，而无需将第二容器/注射器从第一容器上拆下或断开。
本发明还涵盖一种分离高亲合力T细胞的方法。所述方法可包括第一步，在该步骤中根据本发明的方法测定自受试者获得的样品中的T细胞的解离速率常数(koff)。由此可识别高亲合力T细胞。“高亲合力T细胞”可以通过与给定抗原结合时T细胞受体的koff值来定义。如果koff值等于给定阈值或在给定阈值以下，则T细胞可具有“高亲合力”。阈值可以取决于分离高亲合力T细胞的目的。通常，所述阈值在约10-1sec-1至约10-3sec-1的范围内，优选地，所述阈值可以在约5x10-2sec-1至约2x10-3sec-1，优选约2x10-2sec-1至约5x10-3sec-1，优选约1x10-2sec-1的范围内。
然后，所述方法可进一步包括从自相同受试者获得的样品中分离所述T细胞或T细胞群的另一步骤。可以通过本领域已知的任何方法，例如通过使用美国专利7,776,562、美国专利8,298,782、国际专利申请WO02/054065或国际专利申请WO2013/011011中描述的可逆细胞染色/分离技术来实施所述T细胞(群)的分离。在第二步中从中分离出T细胞(群)的样品可以是与第一步中相同的样品，或者可以是从相同受试者中获得的另一样品。
本发明的特征还在于以下项目：
项目1、一种测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)的方法，所述方法包括检测附着于所述靶细胞的第一可检测标记和附着于所述靶细胞的第二可检测标记，其中，已使所述细胞与下述接触：(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记彼此不同。
项目2、根据项目1所述的方法，其中已使所述细胞进一步与下述接触：(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
项目3、根据项目1所述的方法，其中已使所述细胞进一步与下述接触：(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
项目4、根据项目1所述的方法，其中已使所述细胞进一步与下述接触：(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
项目5、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受体分子R为T细胞受体(TCR)。
项目6、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述第一受体结合位点B1是MHC分子。
项目7、根据前述项目中任一项所述的方法，其中(a)所述第一结合配偶体C1包含链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽，和所述第一多聚化试剂包含可逆地结合所述链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽的链霉亲和素、或抗生物素蛋白、或链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物；或(b)所述第一结合配偶体C1包含可逆地结合链霉亲和素或抗生物素蛋白的生物素类似物，和所述第一多聚化试剂包含可逆地结合所述生物素类似物的链霉亲和素、或抗生物素蛋白、或链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物。
项目8、根据项目7所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含链霉亲和素-结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)，和所述多聚化试剂包含链霉亲和素类似物Va144-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:02)或链霉亲和素类似物Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)。
项目9、根据项目1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1与所述第一多聚化试剂的所述第一结合位点Z1之间的结合在二价阳离子存在下发生。
项目10、根据项目9所述的方法，其中a.所述第一结合配偶体C1包含钙调蛋白结合肽和所述第一多聚化试剂包含钙调蛋白，或b.所述第一结合配偶体C1包含寡聚组氨酸标签和所述第一多聚化试剂包含结合至金属螯合剂的金属离子。
项目11、根据项目1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含抗原，和所述第一多聚化试剂包含针对所述抗原的抗体。
项目12、根据项目11所述的方法，其中所述抗原为表位标签。
项目13、根据项目18所述的方法，其中所述表位标签选自FLAG-标签(序列：DYKDDDDK，SEQ ID NO:04)、Myc-标签(序列：EQKLISEEDL，SEQ ID NO:05)、HA-标签(序列：YPYDVPDYA，SEQ ID NO:06)、VSV-G-标签(序列：YTDIEMNRLGK，SEQ ID NO:07)、HSV-标签(序列：QPELAPEDPED，SEQ ID NO:08)和V5-标签(序列：GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO:09)。
项目14、根据项目11所述的方法，其中所述抗原包含蛋白。
项目15、根据项目14所述的方法，其中所述蛋白选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)和硫氧还蛋白。
项目16、根据项目1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含谷胱甘肽S-转移酶和所述第一多聚化试剂包含谷胱甘肽，或其中所述第一结合配偶体C1包含谷胱甘肽和所述第一多聚化试剂包含谷胱甘肽S-转移酶。
项目17、根据项目1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含免疫球蛋白Fc部分和所述第一多聚化试剂包含选自蛋白A、蛋白G、蛋白a/g和蛋白L的蛋白，或其中所述第一结合配偶体C1包含选自蛋白A、蛋白G、蛋白a/g和蛋白L的蛋白和所述第一多聚化试剂包含免疫球蛋白Fc部分。
项目18、根据项目2、3和5至17中任一项所述的方法，其中所述第二受体结合位点B2为MHC分子。
项目19、根据项目2、3和5至18中任一项所述的方法，其中所述第一受体结合位点B1和所述第二受体结合位点B2相同。
项目20、根据项目2至17中任一项所述的方法，其中所述第二受体结合位点B2或可逆受体结合试剂I2选自抗体、二价抗体片段、单价抗体片段和具有抗体样结合的蛋白质性结合分子。
项目21、根据项目20所述的方法，其中所述二价抗体片段为(Fab)2’-片段或二价单链Fv片段。
项目22、根据项目20所述的方法，其中所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
项目23、根据项目20所述的方法，其中所述具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白(glubody)、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、adnectin和高亲和性多聚体(avimer)。
项目24、根据项目2和5至23中任一项所述的方法，其中所述第二结合配偶体C2包含生物素或生物素类似物，和所述第二多聚化试剂包含基本上不可逆地结合生物素或所述生物素类似物的链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。
项目25、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为哺乳动物细胞。
项目26、根据项目24所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为淋巴细胞或干细胞。
项目27、根据项目25所述的方法，其中所述淋巴细胞为T细胞、T-辅助细胞、B细胞或天然杀伤细胞。
项目28、根据项目26所述的方法，其中所述T细胞选自CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞。
项目29、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记为荧光染料。
项目30、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述第二可检测标记为荧光染料。
项目31、根据前述项目中任一项所述的方法，其中每个所述第一可检测标记为第一荧光染料和所述第二可检测标记为第二荧光染料，其中优选地可将所述第一荧光染料的发射信号与所述第二荧光染料的发射信号相区别。
项目32、根据项目2至31中任一项所述的方法，所述方法包括(a)使包含所述受体分子R的所述靶细胞与(i)所述第一受体结合试剂和(ii)所述第一多聚化试剂接触，和(b)使所述靶细胞与(iii)所述第二受体结合试剂和(iv)所述第二多聚化试剂接触，或使所述靶细胞与(iii’)所述多聚体受体结合试剂接触；或使所述靶细胞与(iii”)所述不可逆受体结合试剂接触。
项目33、根据项目32所述的方法，其中(a)在(b)之前实施。
项目34、根据项目33所述的方法，所述方法进一步包括在(a)之后和(b)之前的洗涤步骤。
项目35、根据项目32至34中任一项所述的方法，所述方法进一步包括(c)破坏(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合。
项目36、根据项目35所述的方法，其中通过使(i)和(ii)与竞争试剂CR接触来破坏(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1。
项目37、根据项目36所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1为链霉亲和素结合肽，和所述竞争试剂CR为生物素或生物素类似物。
项目38、根据项目36或37所述的方法，其中所述第一多聚化试剂包含链霉亲和素或链霉亲和素类似物。
项目39、根据项目35所述的方法，其中(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合通过金属离子螯合破坏。
项目40、根据项目39所述的方法，其中所述金属螯合通过添加EDTA或EGTA完成。
项目41、根据项目35所述的方法，其中(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合通过pH改变破坏。
项目42、根据项目32至41中任一项所述的方法，所述方法进一步包括(d)检测附着于所述靶细胞的所述第一可检测标记和检测附着于所述靶细胞的所述第二可检测标记。
项目43、根据项目42所述的方法，其中所述第一可检测标记为第一荧光染料和所述第二可检测标记为第二荧光染料，其中优选地能够将所述第一荧光染料的发射信号与所述第二荧光染料的发射信号相区别。
项目44、根据项目43所述的方法，其中通过流式细胞术进行所述第一可检测标记和所述第二可检测标记的检测。
项目45、根据项目44所述的方法，其中检测到第二可检测信号指示靶细胞上存在受体分子R。
项目46、根据项目45所述的方法，其中在检测到所述第二可检测信号的细胞上检测到所述第一可检测标记指示在检测所述第一可检测标记时所述第一受体结合位点B1与所述受体分子R未解离。
项目47、根据项目45所述的方法，其中在检测到所述第二可检测信号的细胞上未检测到所述第一可检测标记指示在检测所述第一可检测标记时所述第一受体结合位点B1与所述受体分子R解离。
项目48、根据项目45至47中任一项所述的方法，其中在检测到所述第二可检测信号的细胞上的所述第一可检测标记的检测事件的减少指示所述第一受体结合位点B1与所述受体分子R的解离动力学。
项目49、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述结合位点Z1与所述配偶体C1之间的可逆结合的解离速率常数(koff)在0.5×10-4sec-1或更大的范围内。
项目50、根据项目2和5至48中任一项所述的方法，其中所述结合位点Z2与所述配偶体C2之间的结合的解离速率常数(koff)在1×10-5sec-1或更小的范围内。
项目51、根据项目3和5至48中任一项所述的方法，其中所述多聚体受体结合试剂M2与所述靶细胞之间的基本上不可逆地结合的解离速率常数(koff)在1×10-5sec-1或更小的范围内。
项目52、根据项目4至48中任一项所述的方法，其中所述不可逆受体结合试剂I2与所述受体分子R之间的基本上不可逆地结合的解离速率常数(koff)在1×10-5sec-1或更小的范围内。
项目53、根据前述项目中任一项所述的方法，其中怀疑靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)在100sec-1至10-4sec-1的范围内。
项目54、根据前述项目中任一项所述的方法，其中在≤15℃的温度下使所述细胞与所述第一受体结合试剂接触。
项目55、根据项目54所述的方法，其中所述接触在≤4℃的温度下进行。
项目56、一种包含至少三个受体分子R的细胞，其中所述细胞具有结合至至少两个受体分子R的下述：(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和其中第一可检测标记被结合至所述第一受体结合试剂；和其中第二可检测标记被基本上不可逆地附着于至少一个受体分子R。
项目57、根据项目56所述的细胞，其中所述细胞进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
项目58、根据项目56所述的细胞，其中所述细胞进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述至少两个受体分子R基本上不可逆地结合所述细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
项目59、根据项目56所述的细胞，其中所述细胞进一步具有结合至受体分子R的下述：(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
项目60、根据项目56至59中任一项所述的细胞，其中所述靶细胞为哺乳动物细胞。
项目61、根据项目60所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞为淋巴细胞或干细胞。
项目62、根据项目61所述的细胞，其中所述淋巴细胞为T细胞、T-辅助细胞、B细胞或天然杀伤细胞。
项目63、根据项目62所述的细胞，其中所述T细胞选自CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞。
项目64、根据项目56至63中任一项所述的细胞，其中所述受体分子R为T细胞受体(TCR)。
项目65、一种用于测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)的试剂盒，其中所述试剂盒包含(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2；其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；其中第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物；或(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2；或(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2；其中所述第一可检测标记不是所述第二可检测标记。
项目66、根据项目65所述的试剂盒，其进一步包含竞争试剂CR，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1。
项目67、根据项目65所述的试剂盒，其进一步包含金属螯合剂，其中所述金属螯合剂优选为EDTA或EGTA。
项目68、一种装置，其包含第一容器，所述第一容器含有包含受体分子R的靶细胞，和(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)能够形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和其中第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和其中第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R，其中所述第一可检测标记不是所述第二可检测标记；和含有流体的第二容器，所述流体包含a)竞争试剂CR，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1；或b)金属螯合剂，其中所述金属螯合剂优选为EDTA或EGTA，其中所述第一容器与第二容器相连接以使得流体可以从第二容器转移到第一容器。
项目69、根据项目68所述的装置，其中所述第一容器进一步含有(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)能够形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
项目70、根据项目68所述的装置，其中所述第一容器进一步含有(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
项目71、根据项目68所述的装置，其中所述第一容器进一步含有(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
项目72、根据项目68至71中任一项所述的装置，其被包含在用于流式细胞术的装置中。
项目73、根据项目68至72中任一项所述的装置，其中将所述第一容器与用于流式细胞术的装置的样品入口连接。
项目74、根据项目68至73中任一项所述的装置，其中所述第一容器与所述第二容器通过套管或管道连接。
项目75、根据项目68至74中任一项所述的装置，其包括布置在所述第一容器与所述第二容器之间的连接内的阀。
项目76、根据项目75所述的装置，其中所述阀为三通阀。
项目77、一种分离高亲合力T细胞的方法，所述方法包括a)采用根据项目1至56中任一项所述的方法测定自受试者获得的样品中的T细胞的解离速率常数(koff)；b)从自所述受试者获得的样品中分离所述T细胞。
项目78、根据项目77所述的方法，其中测定的解离速率常数具有等于给定阈值或在给定阈值以下的值。
项目79、根据项目77所述的方法，其中所述阈值在约10-1sec-1至约10-3sec-3的范围内。
项目80、根据项目77至79中任一项所述的方法，其中所述样品为外周血样品或PBMC样品。
项目81、根据项目77至80中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物，优选为人。
必须注意的是，除非上下文另有明确说明，否则本文所用单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代。因此，举例而言，对“一种试剂”的指代包括此类不同试剂中的一或多种，且对“所述方法”的指代包括对本领域普通技术人员已知的等效步骤和方法的指代，所述等效步骤和方法可被修改或取代本文中所描述的方法。
除非另有说明，否则一系列元素前的术语“至少”应理解为指代该系列中的每一个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文中所描述的本发明的特定实施方式的许多等效物。此类等效物意欲由本发明涵盖。
本文中使用的术语“和/或”均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的所有或任何其它组合”的含义。
如本文中所用的术语“约”或“大约”意为在给定值或范围的20％内，优选在10％内，更优选在5％内。然而，该术语还包括具体数字，如约20包括20。
除非上下文另有需要，否则本说明书和下文的权利要求书全文中，词语“包含(comprise)”和变体(比如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)应理解为意为包括所述整数或步骤或者整数组或步骤组而不排除任何其他整数或步骤或者整数组或步骤组。当在本文中使用时，术语“包含”可由术语“含有(containing)”或“包括(including)”替代，或当在本文中使用时，有时可由术语“具有(having)”替代。
当在本文中使用时，“由......组成”排除所要求保护的元素中未说明的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本和新特征的材料或步骤。
在本文的每种情况中，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一者均可由其它两个术语中的任一者替换。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因为这些能够改变。本文中所使用的术语仅用于描述特定实施方案，并未旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
本说明书全文所引用的所有出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导书等)以全文通过引用并入本文。本文不能被解释为承认本发明由于在先发明而不早于这样的公开物。在通过引入并入的材料与本说明书或矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。
实施例
细胞
按照Nauerth M,Weiβbrich B,Knall R,Franz T,G,Bet J,Paszkiewicz PJ,Pfeifer L,Bunse M,Uckert W等，TCR-ligand koff rate correlateswith the protective capacity of antigen-specific CD8+T cells for adoptivetransfer.Sci Transl Med 2013；5:192ra87-192ra87所述产生人CMV-特异性T细胞克隆和鼠T细胞系。自健康的成年供者(雄性)获得外周血。从供者处获得了书面知情同意书，并且根据赫尔辛基宣言，血样的使用根据国家法律已由当地机构审查委员会(Ethikkommissionder Medizinischender Technischen München)批准。用PBS(pH7.4)以1:1稀释全血，并通过在Ficoll层上以2000rpm密度梯度离心20分钟获得PBMC。
多聚体和抗体染色
按照Nauerth等2013中所述使用于产生携带Twin-Strep-标签的可逆多聚体的pMHC分子重折叠并多聚化。在该文献中，用于koff-速率测定的全部pMHC分子均与Alexa488马来酰亚胺荧光团(Thermo Fisher)和多聚Streptactin APC(IBA)缀合。根据Busch DH,Pilip IM,Vijh S,Pamer EG.Coordinate regulation of complex T cell populationsresponding to bacterial infection.Immunity 1998；8:353-62中描述的方案使用于产生不可逆多聚体的生物素化pMHC分子重折叠。对于多聚化，将1μg生物素化的pMHC分子与1.25μg链霉亲和素BV421或链霉亲和素PE(Biolegend)以总体积50μl一起孵育45分钟。对于koff-速率测定，将高达5*106个细胞与可逆多聚体温育45分钟。如果需要，在25分钟后加入CD8抗体(CD8eF450，eBioscience或CD8PeCy7，Beckman Coulter)并另外温育20分钟。对于存活/死亡识别，加入0.2μg碘化丙啶溶液并温育5分钟。随后洗涤细胞并直接用于koff-速率测定或用于采用不可逆多聚体另外染色10分钟(除非另有说明)。对于不可逆多聚体的滴定分析，将细胞用50μl不可逆多聚体(1:1)染色，其中将25μl不可逆多聚体用25μl FACS缓冲液(1:2)稀释；或用采用37.5μl FACS缓冲液(1:4)稀释的12.5μl不可逆多聚体染色。
FACS分析和分选
采用CyanLx 9色流式细胞仪(Beckman Coulter)分析样品。对于koff-速率测定，保存所分析样品的计算参数从而能够分析解离动力学。在MoFlo(Beckman Coulter)上实施细胞分选。用FlowJo v9.5.2软件(Tree Star,Inc.)分析FACS数据。
基于流式细胞仪的koff-速率测定
为了进行koff-速率测定，将细胞稀释至1*106-1*107个细胞/ml，并将100μl细胞加入到含有900μl FACS缓冲液的预冷的koff-速率FACS管中。将koff-速率FACS管与冷却装置(qutool)一起安装在流式细胞仪上并开始分析。30秒后，在进行分析期间，将1ml 2mM D-生物素经由三通阀加入到细胞中。分析细胞共15分钟。为了分析koff-速率，将特定T细胞的荧光数据从FlowJo输出到电子表格(spreadsheet)程序(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)中。如本文所述选择用于分析koff-速率的数据点，并且将一阶指数衰变曲线拟合到数据点中。
采用显微镜的koff-速率测定
按照Nauerth等2013中详细描述的内容进行。
实施例1：基于流式细胞术的TCR-配体koff-速率测定的设置和分析
为了将TRC-配体koff-速率测定的原理转用到流式细胞术，用于数据分析的基本组成部分需要与最初的基于显微术的应用类似地获取：首先，必须测定初始的pMHC/Streptactin多聚体染色；然后，需要将D-生物素添加到样品中，随后进行Streptactin骨架与pMHC的解离直至达到最低水平的配体结合。由于本发明人已经从基于显微术的测定中得知，对于一些T细胞受体而言，koff-速率动力学可能是非常快的，因此发明人设计了用于流式细胞术的实验设置，其中可以将d-生物素添加到探针而不中断在线测量。出于此目的，本发明人使用通过三通阀与含有D-生物素溶液的注射器连接的尖锐的注射针穿透标准聚乙烯FACS管(图2A)。这种设置允许获得初始染色值(通常30秒)，然后进行D-生物素注射并随后获得解离相(通常15分钟)，而无需在任何时间点将探针从样品架中取出。
为了获得可在不同样品之间进行比较的可重复的结果，koff-速率测定优选在限定的温度下进行。对于TCR-配体相互作用，所述测定在低温(优选在4℃)下进行。出于此目的，发明人设计了一种珀尔帖效应(peltier)-控制的冷却设备，其紧紧围绕样品管，同时仍为D-生物素注射系统留下小开口(图2B)。
采用该实验装置，发明人随后利用表达2C TCR的T细胞系获得了完整koff-速率系列。发明人采用基于Alexa488-标记的pMHC(H2Kb-SIYRYYGL(SEQ ID NO:10))和APC-缀合的Streptactin作为骨架的可逆MHC多聚体使细胞染色。进行另外的PI染色以识别死亡细胞。通过对目的群(在此为活的淋巴细胞)门控并随后展示相对于分析时间的Streptactin-APC荧光和MHC-Alexa488荧光来进行解离的数据分析。为了使潜在的解离动力学可视化，发明人首先在分析时间内设置(draw)了200个门，并计算了每个门的MHCAlexa488和Streptactin-APC的MFI。这种数据的缩减允许在一个图中绘制MHCAlexa488和Streptactin-APC荧光值，因此允许直接比较两种解离动力学(图2D)。在分析开始时，两种荧光染料的初始染色强度是可见的并保持恒定。添加D-生物素后，APC荧光的快速衰变是可检测的，这是由分离的Streptactin骨架的解离引起的。有趣的是，在Streptactin-APC解离的同时，Alexa488荧光在开始时也表现出快速衰变。在Streptactin-APC完全解离后，Alexa488的第二个和更慢的衰变变得可检测。通过多聚化的MHC分子的不同结合状态可以解释MHC-Alexa48衰变的这两种动力学。多聚化于Streptactin骨架上的MHC分子中可能仅有一部分被结合至表面表达的TCR。一些MHC分子仅被结合至Streptactin并因此在加入D-生物素后与骨架同时解离，从而显示出非常快的动力学。而随后较慢的Alexa488衰变动力学是由单体TCR结合的MHC分子与T细胞表面的解离引起的，并且是计算TCR-配体koff-速率的基础。这些发现表明，由于TCR结合与未结合的MHC-Alexa488分子的重叠动力学是干扰的，因此只有在非细胞结合的组分完全解离后才能正确计算koff-速率。因此，本发明人决定使用Streptactin-APC完全解离的时间点作为MHC-Alexa488解离的koff-速率计算的起点。
为了最后计算koff-速率，发明人直接将每个所分析细胞的荧光和时间值输出到电子表格软件，并得到相对于分析时间的Streptactin-APC和MHC-Alexa488荧光的点图(图2E)。然后，本发明人选择加入D-生物素后的Streptactin-APC的数据点和选择Streptactin骨架完全解离后的MHC-Alexa488的数据点。由于指数衰变随后直接拟合到所有细胞的点图中，因此通过在有限数量的门中计算MFI并没有进行信息的缩减，这在仅可以分析有限数量的细胞时尤其重要。
综上，将TCR-配体koff-速率测定转用到流式细胞仪上允许在温度受控条件下快速分析T细胞并准确计算koff-速率。
实施例2：基于流式细胞术的和显微术引导的TCR-配体koff-速率测定提供可比较的值
采用显微术引导的TCR-配体koff-速率测定，Nauert等2013证明了koff-速率与分析的T细胞的功能之间的明确相关性。由此，可以使实验设置标准化从而确保测定的高度可再现和真实定量的koff-速率值。为了测试从新型基于流式细胞术的设置获得的结果是否提供可比较的值，发明人采用两种方法平行分析了CMV-特异性T细胞克隆的koff-速率。分析了三种不同特异性和亲合力的克隆(图3A-C)，并且在所有情况下得到的koff-速率均是高度可比较的(图3D)。这些数据证明，与之前描述的显微术引导方法相比，使用新型基于流式细胞术的设置可以实现类似的稳健性、再现性和精确性。
实施例3：采用可逆和不可逆MHC多聚体的双重染色原理
采用用于上述基于流式细胞术的koff-速率测定的实验设置，分析只能用高度纯化的抗原特异性T细胞群、T细胞克隆或TCR-转导的T细胞进行。在这些情况下，对活细胞的门控应当足以在获得配体解离动力学的过程中识别目的细胞群。然而，无预先分选或克隆步骤的抗原特异性T细胞群的直接离体分析也需要在koff-速率测定期间稳定识别靶细胞群。因此，发明人测试了这是否能够通过另外的抗原特异性不可逆染色来实现(图4A)。常规MHC-多聚体由重组pMHC组成，所述重组pMHC在C-末端生物素化并且以这些结构域以非常高的亲和力结合链霉亲和素。这些结合不会通过添加D-生物素而被显著破坏，因此常规多聚体提供抗原特异性T细胞的拟不可逆染色(quasi-non-reversible)。图4B示出了用含有链霉亲和素BV421的不可逆多聚体和具有结合至Streptactin APC骨架的缀合Alexa488的MHC的可逆多聚体使抗原特异性T细胞双重染色的原理。其他人先前已经描述了针对相同特异性的MHC多聚体双重染色通常是可能的，并且这种方法现在经常用于增加抗原特异性T细胞识别的敏感性(Hadrup等，2009,Nat Methods,6:520-6)。然而，到目前为止尚未测试过用两种不同类型的多聚体试剂进行双重染色。因此，本发明人用可逆和不可逆的特异性多聚体将对CMV衍生的HLA-B8限制性表位IE188-96特异性的T细胞克隆进行了染色。如图4B所示(左上角的点图)，两种多聚体在所标记细胞的细胞表面上以相似的染色特征积累，表现为直接相关的双重染色模式。采用具有其它表位特异性和HLA-限制性的其它T细胞克隆得到了非常类似的结果(数据未示出)，这表明了该方法具有普遍的可行性。加入D-生物素后，BV421染色在分析时间内保持稳定，而MHC-Alexa488和Streptactin APC染色衰变(图4B，底部小图)。这些数据显示，采用常规和可逆MHC多聚体的组合染色代表了在TCR-配体koff-速率测定期间不断追踪目标细胞群的合适工具。
实施例4：双重染色对可逆多聚体染色强度和koff-速率无影响
为了更详细地进一步分析采用不可逆和可逆多聚体的双重染色对koff-速率测定的适用性，发明人测试了用相同特异性的不可逆试剂进行的另外染色是否干扰可逆多聚体染色及随后的koff-速率。因此，本发明人根据建立的方案首先用特异性可逆多聚体使来自具有B7pp65特异性T细胞群的CMV+供体的PBMC染色，以得到最佳MHC-Alexa488染色强度。在洗去未结合的试剂后，发明人在另外的染色步骤中添加了不可逆的多聚体。本发明人在类似的初始不可逆多聚体染色程序中滴定分析(titrate)了浓度和温育时间两者。如图5A和图5B所示，增加不可逆多聚体的浓度仅轻微影响不可逆多聚体的染色强度(图5B)。更重要地，在不同浓度的不可逆多聚体染色中，随后测定的koff-速率在所有条件下均相同(图5C、D)。增加温育时间对可逆MHC多聚体染色或随后的koff-速率测量没有可检测的影响(图5D)。这些数据证明，采用可逆和不可逆MHC多聚体试剂的双重染色方法是稳健的，意即，染色条件(温育时间、多聚体浓度)的轻微改变不会影响随后的koff-速率结果。为了评估MHC多聚体双重染色是否能以某种方式影响koff-速率动力学，本发明人比较了仅用可逆多聚体染色的或另外再用不可逆多聚体染色的T细胞的koff-速率测量。为了控制取决于TCR亲合力的潜在差异，这些实验采用良好表征的高和低亲合力CMV特异性T细胞克隆进行。如图5E和图5F所示，两种T细胞克隆在单一或双重染色后均显示出高度可比较的koff-速率。这清楚地证明双重染色方法不影响所得的koff-速率值，并且该观察结果适用于亲合力非常不同的T细胞。
实施例5：双重染色能够直接离体测量CD8+T细胞群的koff-速率
由于采用常规不可逆多聚体的另外染色是koff-速率测定期间使表位特异性T细胞稳定染色的合适工具，因此，本发明人接下来研究了是否能够采用此设置直接分析来自PBMC的抗原特异性T细胞群。出于此目的，发明人从CMV阳性供体采集血液，该供体中易于检测的B7pp65特异性T细胞群占所有淋巴细胞的0.31％(图6A)。发明人通过密度离心纯化PBMC，并采用可逆多聚体以及CD8抗体、随后采用不可逆多聚体使所述细胞染色。作为对照，一部分细胞仅用可逆多聚体和CD8抗体染色，并且在FACS分选后分析Streptactin APC+CD8+T细胞的koff-速率。图6A示出了B7pp65-特异性T细胞群的直接离体koff-速率测量的门控策略。在对单线态和活淋巴细胞进行门控后，对CD8+不可逆的多聚体+T细胞设置门。在分析中该门用于展示Streptactin-APC和MHC Alexa488荧光随时间变化并计算koff-速率。通过分析这种小群来选择直接输出每个所测量细胞的荧光值以防止信息丢失。该策略证明了在该群中存在随时间具有MHC488荧光缓慢衰变的至少一个高亲合力T细胞克隆(图6B、C)。与预先分选的细胞相比，直接分析的细胞的koff-速率与之相似，这证明了直接分析的可靠性(图6D)。总之，这些数据表明采用不可逆和可逆多聚体的双重染色使得能够直接离体测量表位特异性T细胞群的koff-速率，并且提供与预先分选的T细胞高度可比较的结果。
实施例6：寡克隆人CMV-特异性CD8+T细胞的离体koff-速率测量
按照实施例1所述，另外实施来自不同供体的寡克隆人CMV-特异性CD8+T细胞的离体koff-速率测量。在此，仅一部分包含在样品中的细胞是CMV-特异性的。图7示出了寡克隆HLA*07 02/CMVpp65特异性CD8T细胞群的离体koff-速率测量。通过Ficoll梯度离心从健康供体的新鲜血液中分离PBMC。对单个活的CD19-CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff-速率。图8示出了寡克隆HLA*02 01/CMVpp65特异性CD8T细胞群(供体HZ961)的离体koff-速率测量。对冷冻保存的PBMC进行koff-速率测量，该PBMC通过Ficoll梯度离心从健康供体的新鲜血液中分离。对单个活的CD19-CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff-速率。图9：寡克隆HLA*02 01/CMVpp65特异性CD8T细胞群(供体HZ510)的离体koff-速率测量。对冷冻保存的PBMC进行koff-速率测量，该PBMC通过Ficoll梯度离心从健康供体的新鲜血液中分离。对单个活的CD19-CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff-速率。这些实验证明，可以直接在血液或PBMC样品上进行靶特异性CD8+T细胞的koff-速率测定，并且使用来自不同供体的细胞均获得可靠的结果。
实施例7：采用CD8+J76肿瘤细胞的koff速率测量对分离的TCR进行功能表征
采用单克隆PCR分离两组HLA*02 01/CMVpp65特异性TCR。为了分析它们的结构亲合力，将TCR转导至缺乏内源性TCR的CD8+J76肿瘤细胞中。按照实施例1中所述进行koff速率测量。对单个活的CD8+不可逆pMHC-PE+T细胞实施Boolean门控。将Streptactin APC和可逆pMHC-Alexa488随时间的数据输出到GraphPad PRISM以拟合指数衰变曲线从而测定koff-速率(图10)。尽管只有一小部分J76肿瘤细胞重组表达相应的TCR，但可靠地测定了两组TCR的koff值。该实验再次表明，可以使用本文所述的方法测定仅存在于复杂群内的一小部分细胞中的受体的koff速率。
实施例8：在鼠模型系统中高亲合力和低亲合力TCR pMHC相互作用的koff速率测量
图11示出了按照实施例1中所述进行的鼠T细胞的koff速率测定。出于此目的，根据实施例1中描述的方法产生可逆和不可逆的鼠MHC多聚体。采用以下表位产生H2-KB多聚体：SIIQFEKL:H2kb(SEQ ID NO:14)、SIYNFEKL:H2kb(SEQ ID NO:15)和SIINFEKL:H2kb(SEQ IDNO:15)。这些结果表明本文所述的方法可以在不同物种的细胞上实施。
本文说明性地描述的本发明可以适于在缺少本文未具体公开的任一或多种要素或元素、一种或多种限制条件下实施。另外，本文所采用的术语和表达是描述性的而不是限制条件，且没有使用这种术语和表达排除所显示和描述特征或其部分的任何等价物的意图，而是需要认识到多种修饰可能包含在本发明要求保护的范围内。因此，应当理解尽管本发明已经通过示例性实施方式和可选的特征具体公开，本领域技术人员可以寻求体现于本文的本发明的修饰和变化，这些修饰和变化被认为包含在本发明的范围内。
本文已经广泛地且一般地描述了发明。每一个较窄的种类和落入一般公开范围亚属组都构成本发明的一部分。这包括用附加条件或从该属中除去任何主题的负面限制的本发明的一般描述，无论去除的材料是否是本发明具体描述的一部分。
其它实施方式在以下权利要求内。此外，如果本发明的特征或方面是以马库什组的方式描述的，本领域技术人员将认识到本发明还由此以马库什组的任何单个成员或成员亚组的形式来描述。
序列表
<110> 慕尼黑工业大学
朱诺治疗学有限公司
<120> 用于分析受体-配体Koff速率的可逆和不可逆细胞标记的组合
<130> LC18310023P
<150> EP 16176537.5
<151> 2016-06-28
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<223> 与H2kb复合的肽
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<223> 与H2kb复合的肽
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<220>
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<223> 与H2kb复合的肽
<400> 16
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
Claims (81)
1.一种测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)的方法，所述方法包括检测附着于所述靶细胞的第一可检测标记和附着于所述靶细胞的第二可检测标记，
其中，已使所述细胞与下述接触：
(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和
(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，
其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和
其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和
其中所述第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R，
其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记彼此不同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中已使所述细胞进一步与下述接触：
(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和
(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，
其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和
其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中已使所述细胞进一步与下述接触：
(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，
其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，
其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
4.根据权利要求1所述的方法，其中已使所述细胞进一步与下述接触：
(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，
其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受体分子R为T细胞受体(TCR)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一受体结合位点B1是MHC分子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
a.所述第一结合配偶体C1包含链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽，和所述第一多聚化试剂包含可逆地结合所述链霉亲和素或抗生物素蛋白结合肽的链霉亲和素、或抗生物素蛋白、或链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物；或
b.所述第一结合配偶体C1包含可逆地结合链霉亲和素或抗生物素蛋白的生物素类似物，和所述第一多聚化试剂包含可逆地结合所述生物素类似物的链霉亲和素、或抗生物素蛋白、或链霉亲和素类似物、或抗生物素蛋白类似物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含链霉亲和素-结合肽Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(SEQ ID NO:01)，和所述多聚化试剂包含链霉亲和素类似物Va144-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:02)或链霉亲和素类似物Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO:03)。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1与所述第一多聚化试剂的所述第一结合位点Z1之间的结合在二价阳离子存在下发生。
10.根据权利要求9所述的方法，其中
a.所述第一结合配偶体C1包含钙调蛋白结合肽，和所述第一多聚化试剂包含钙调蛋白，或
b.所述第一结合配偶体C1包含寡聚组氨酸标签，和所述第一多聚化试剂包含结合至金属螯合剂的金属离子。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含抗原，和所述第一多聚化试剂包含针对所述抗原的抗体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗原为表位标签。
13.根据权利要求18所述的方法，其中所述表位标签选自FLAG-标签(序列：DYKDDDDK，SEQ ID NO:04)、Myc-标签(序列：EQKLISEEDL，SEQ ID NO:05)、HA-标签(序列：YPYDVPDYA，SEQ ID NO:06)、VSV-G-标签(序列：YTDIEMNRLGK，SEQ ID NO:07)、HSV-标签(序列：QPELAPEDPED，SEQ ID NO:08)和V5-标签(序列：GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO:09)。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗原包含蛋白。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述蛋白选自麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)和硫氧还蛋白。
16.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含谷胱甘肽S-转移酶和所述第一多聚化试剂包含谷胱甘肽，或其中所述第一结合配偶体C1包含谷胱甘肽和所述第一多聚化试剂包含谷胱甘肽S-转移酶。
17.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1包含免疫球蛋白Fc部分和所述第一多聚化试剂包含选自蛋白A、蛋白G、蛋白a/g和蛋白L的蛋白，或其中所述第一结合配偶体C1包含选自蛋白A、蛋白G、蛋白a/g和蛋白L的蛋白和所述第一多聚化试剂包含免疫球蛋白Fc部分。
18.根据权利要求2、3和5至17中任一项所述的方法，其中所述第二受体结合位点B2为MHC分子。
19.根据权利要求2、3和5至18中任一项所述的方法，其中所述第一受体结合位点B1和所述第二受体结合位点B2相同。
20.根据权利要求2至17中任一项所述的方法，其中所述第二受体结合位点B2或可逆受体结合试剂I2选自抗体、二价抗体片段、单价抗体片段和具有抗体样结合的蛋白质性结合分子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述二价抗体片段为(Fab)2’-片段或二价单链Fv片段。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述单价抗体片段选自Fab片段、Fv片段和单链Fv片段(scFv)。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述具有抗体样结合特性的蛋白质性结合分子选自适体、基于脂质运载蛋白家族的多肽的突变蛋白、重组蛋白(glubody)、基于锚蛋白支架的蛋白、基于结晶支架的蛋白、adnectin和高亲和性多聚体(avimer)。
24.根据权利要求2和5至23中任一项所述的方法，其中所述第二结合配偶体C2包含生物素或生物素类似物，和所述第二多聚化试剂包含基本上不可逆地结合生物素或所述生物素类似物的链霉亲和素类似物或抗生物素蛋白类似物。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为哺乳动物细胞。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为淋巴细胞或干细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述淋巴细胞为T细胞、T-辅助细胞、B细胞或天然杀伤细胞。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述T细胞选自CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一可检测标记为荧光染料。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二可检测标记为荧光染料。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个所述第一可检测标记为第一荧光染料和所述第二可检测标记为第二荧光染料，其中优选地能够将所述第一荧光染料的发射信号与所述第二荧光染料的发射信号相区别。
32.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，所述方法包括
(a)使包含所述受体分子R的所述靶细胞与(i)所述第一受体结合试剂和(ii)所述第一多聚化试剂接触，和
(b)使所述靶细胞与(iii)所述第二受体结合试剂和(iv)所述第二多聚化试剂接触，或
使所述靶细胞与(iii’)所述多聚体受体结合试剂接触；或
使所述靶细胞与(iii”)所述不可逆受体结合试剂接触。
33.根据权利要求32所述的方法，其中(a)在(b)之前实施。
34.根据权利要求33所述的方法，所述方法进一步包括在(a)之后和(b)之前的洗涤步骤。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，所述方法进一步包括
(c)破坏(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中通过使(i)和(ii)与竞争试剂CR接触来破坏(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一结合配偶体C1为链霉亲和素结合肽，和所述竞争试剂CR为生物素或生物素类似物。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述第一多聚化试剂包含链霉亲和素或链霉亲和素类似物。
39.根据权利要求35所述的方法，其中(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合通过金属离子螯合破坏。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述金属螯合通过添加EDTA或EGTA完成。
41.根据权利要求35所述的方法，其中(i)所述第一受体结合试剂与(ii)所述第一多聚化试剂之间的结合通过pH改变破坏。
42.根据权利要求32至41中任一项所述的方法，所述方法进一步包括
(d)检测附着于所述靶细胞的所述第一可检测标记和检测附着于所述靶细胞的所述第二可检测标记。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一可检测标记为第一荧光染料和所述第二可检测标记为第二荧光染料，其中优选地能够将所述第一荧光染料的发射信号与所述第二荧光染料的发射信号相区别。
44.根据权利要求43所述的方法，其中通过流式细胞术进行所述第一可检测标记和所述第二可检测标记的检测。
45.根据权利要求44所述的方法，其中检测到第二可检测信号指示所述靶细胞上存在所述受体分子R。
46.根据权利要求45所述的方法，其中在检测到所述第二可检测信号的细胞上检测到所述第一可检测标记指示在检测所述第一可检测标记时所述第一受体结合位点B1与所述受体分子R未解离。
47.根据权利要求45所述的方法，其中在检测到所述第二可检测信号的细胞上未检测到所述第一可检测标记指示在检测所述第一可检测标记时所述第一受体结合位点B1与所述受体分子R解离。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中在检测到所述第二可检测信号的细胞上的所述第一可检测标记的检测事件的减少指示所述第一受体结合位点B1与所述受体分子R的解离动力学。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合位点Z1与所述配偶体C1之间的可逆结合的解离速率常数(koff)在0.5×10-4sec-1或更大的范围内。
50.根据权利要求2和5至48中任一项所述的方法，其中所述结合位点Z2与所述配偶体C2之间的结合的解离速率常数(koff)在1×10-5sec-1或更小的范围内。
51.根据权利要求3和5至48中任一项所述的方法，其中所述多聚体受体结合试剂M2与所述靶细胞之间的基本上不可逆地结合的解离速率常数(koff)在1×10-5sec-1或更小的范围内。
52.根据权利要求4至48中任一项所述的方法，其中所述不可逆受体结合试剂I2与所述受体分子R之间的基本上不可逆地结合的解离速率常数(koff)在1×10-5sec-1或更小的范围内。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中怀疑靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)在100sec-1至10-4sec-1的范围内。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在≤15℃的温度下使所述细胞与所述第一受体结合试剂接触。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述接触在≤4℃的温度下进行。
56.一种包含至少三个受体分子R的细胞，其中所述细胞具有结合至至少两个受体分子R的下述：
(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和
(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，
其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和
其中第一可检测标记被结合至所述第一受体结合试剂；和
其中第二可检测标记被基本上不可逆地附着于至少一个受体分子R。
57.根据权利要求56所述的细胞，其中所述细胞进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：
(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和
(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，
其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和
其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
58.根据权利要求56所述的细胞，其中所述细胞进一步具有结合至至少两个受体分子R的下述：
(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，
其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述至少两个受体分子R基本上不可逆地结合所述细胞，
其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
59.根据权利要求56所述的细胞，其中所述细胞进一步具有结合至受体分子R的下述：
(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，
其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的细胞，其中所述靶细胞为哺乳动物细胞。
61.根据权利要求60所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞为淋巴细胞或干细胞。
62.根据权利要求61所述的细胞，其中所述淋巴细胞为T细胞、T-辅助细胞、B细胞或天然杀伤细胞。
63.根据权利要求62所述的细胞，其中所述T细胞选自CMV特异性CD8+T淋巴细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和调节性T细胞。
64.根据权利要求56至63中任一项所述的细胞，其中所述受体分子R为T细胞受体(TCR)。
65.一种用于测定靶细胞上受体分子R与第一受体结合位点B1的解离速率常数(koff)的试剂盒，其中所述试剂盒包含
(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和
(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，
其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；
其中所述第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和
(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和
(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，
其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；
其中第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物；
或
(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，
其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，
其中第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2；
或
(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，
其中第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2；
其中所述第一可检测标记不是所述第二可检测标记。
66.根据权利要求65所述的试剂盒，其进一步包含竞争试剂CR，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1。
67.根据权利要求65所述的试剂盒，其进一步包含金属螯合剂，其中所述金属螯合剂优选为EDTA或EGTA。
68.一种装置，其包含
第一容器，所述第一容器含有包含受体分子R的靶细胞，和
(i)第一受体结合试剂，所述第一受体结合试剂包含至少一个第一受体结合位点B1，其中所述第一受体结合位点B1特异性地结合所述受体分子R，所述第一受体结合试剂进一步包含至少一个第一结合配偶体C1，其中所述第一结合配偶体C1能够被可逆地结合至第一多聚化试剂的第一结合位点Z1，和
(ii)第一多聚化试剂，所述第一多聚化试剂包含用于所述第一受体结合试剂的第一结合配偶体C1的可逆结合的至少两个第一结合位点Z1，
其中所述第一受体结合试剂(i)和所述第一多聚化试剂(ii)能够形成结合所述靶细胞的第一多价结合复合物，所述第一多价结合复合物包含结合至一个所述第一多聚化试剂的至少两个所述第一受体结合试剂；和
其中第一可检测标记被结合至或能够结合所述第一受体结合试剂；和
其中第二可检测标记被基本上不可逆地附着于所述受体分子R，
其中所述第一可检测标记不是所述第二可检测标记；和
含有流体的第二容器，所述流体包含
a.竞争试剂CR，其中所述竞争试剂CR能够与第一结合配偶体C1竞争结合所述第一多聚化试剂上的所述第一结合位点Z1；或
b.金属螯合剂，其中所述金属螯合剂优选为EDTA或EGTA，
其中所述第一容器与所述第二容器相连接以使得流体能够从所述第二容器转移到所述第一容器。
69.根据权利要求68所述的装置，其中所述第一容器进一步含有
(iii)第二受体结合试剂，所述第二受体结合试剂包含至少一个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，所述第二受体结合试剂进一步包含至少一个第二结合配偶体C2，其中所述第二结合配偶体C2能够被稳定地结合至第二多聚化试剂的第二结合位点Z2，和
(iv)第二多聚化试剂，所述第二多聚化试剂包含用于所述第二受体结合试剂的第二结合配偶体C2的稳定结合的至少两个第二结合位点Z2，
其中所述第二受体结合试剂(iii)和所述第二多聚化试剂(iv)能够形成结合所述靶细胞的第二多价结合复合物，所述第二多价结合复合物包含结合至一个所述第二多聚化试剂的至少两个所述第二受体结合试剂；和
其中所述第二可检测标记被结合至所述第二多价结合复合物。
70.根据权利要求68所述的装置，其中所述第一容器进一步含有
(iii’)多聚体受体结合试剂M2，所述多聚体第二受体结合试剂包含至少两个第二受体结合位点B2，其中所述第二受体结合位点B2特异性地结合所述受体分子R，
其中所述多聚体受体结合试剂M2经由所述受体分子R基本上不可逆地结合所述靶细胞，
其中所述第二可检测标记被结合至所述多聚体受体结合试剂M2。
71.根据权利要求68所述的装置，其中所述第一容器进一步含有
(iii”)不可逆受体结合试剂I2，其中所述不可逆受体结合试剂I2特异性地结合所述受体分子R，其中所述不可逆受体结合试剂I2基本上不可逆地结合所述受体分子R，
其中所述第二可检测标记被结合至所述不可逆受体结合试剂I2。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的装置，其被包含在用于流式细胞术的装置中。
73.根据权利要求68至72中任一项所述的装置，其中将所述第一容器与用于流式细胞术的装置的样品入口连接。
74.根据权利要求68至73中任一项所述的装置，其中所述第一容器与所述第二容器通过套管或管道连接。
75.根据权利要求68至74中任一项所述的装置，其包括布置在所述第一容器与所述第二容器之间的连接内的阀。
76.根据权利要求75所述的装置，其中所述阀为三通阀。
77.一种分离高亲合力T细胞的方法，所述方法包括
a)采用根据权利要求1至56中任一项所述的方法测定自受试者获得的样品中的T细胞的解离速率常数(koff)；
b)从自所述受试者获得的样品中分离所述T细胞。
78.根据权利要求77所述的方法，其中测定的解离速率常数具有等于给定阈值或在给定阈值以下的值。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述阈值在约10-1sec-1至约10-3sec-3的范围内。
80.根据权利要求77至79中任一项所述的方法，其中所述样品为外周血样品或PBMC样品。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物，优选为人。
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| US20040082012A1 (en) * | 2000-12-28 | 2004-04-29 | Busch Dirk H. | Reversible mhc multimer staining for functional purification of antigen-specific t cells |
| CN103797028A (zh) * | 2011-07-18 | 2014-05-14 | Iba股份有限公司 | 使靶细胞可逆染色的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HEBEISEN ET AL: ""Identification of Rare High-Avidity, Tumor-Reactive CD8+ T Cells by Monomeric TCR-Ligand Off-Rates Measurements on Living Cells"", 《CANCER RESEARCH》 * |
| MICHAEL ET AL: ""Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer"", 《NATURE MEDICINE》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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