JP2004520328A - 活性物質としてポリアミンを含む医薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、活性物質としてポリアミンを含む医薬、ならびに免疫賦活薬またはヒトおよび動物の様々な疾患の処置用および/または予防用の医薬を製造するためのポリアミンの使用に関する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、活性物質としてポリアミンを含む医薬、ならびに免疫賦活薬および/またはヒトおよび動物の様々な疾患の処置用および/または予防用の医薬を製造するためのポリアミンの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
獣医療では、今まで比較的長年にわたって、「副特異的(paraspecific)免疫」を誘導する製品−免疫賦活剤または副免疫(paraimmunity)誘導剤と呼ばれるもの−が治療的、事後(二次)予防的(metaphylactically)、および予防的に使用されてきた。一例として、免疫賦活剤は化学的に不活化したパラポックスウイルスD1701株(DE-A 35 04 940)からなることができる。BAYPAMUN(登録商標)はこのウイルスに基づいて製造される製品である。
【0003】
動物において、不活化パラポックスウイルスは、極めて広範囲にわたる多様な病原体が引き起こす感染症に対する非特異的防御を誘導する。身体自身が持つ防御系の様々な機序が、この防御の媒介を担っていると考えられる。
【0004】
これらの機序には、インターフェロンの誘導、ナチュラルキラー細胞の活性化、「コロニー刺激活性」(CSA)の誘導、およびリンパ球増殖の刺激が含まれる。作用機序に関する初期の研究により、インターロイキン2およびインターフェロンαが刺激されることが証明されている(Steinmassl および Wolf, 1990)。
【0005】
この他、非適応免疫系を活性化するため、および疾患病原体の出現に対して身体を強化するために、非メチル化 CpG 含有オリゴヌクレオチド(WO 98/18810)などの免疫賦活剤を使用することもできる。単回投与で初期免疫応答を活性化し、様々な病原体による感染、例えばリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)による感染(Elkins ら, 1999;Krieg ら, 1998;Oxenius ら, 1999)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)による感染(Elkins ら, 1999)、リーシュマニア(Leishmania)による感染(Walker ら, 1999;Zimmeremann ら, 1998)、炭疽、エボラ病およびマラリア(Krieg, 2000;Klinman ら, 1999)などを予防できることは、実験的に種々のマウスモデルで示すことが、既にできるようになっている。
【0006】
作用機序の解析では、マウスの B 細胞、マクロファージ、樹状細胞および NK 細胞がいずれも CpG 含有オリゴヌクレオチドによって刺激されることを、証明することができた。また、サイトカイン IL-18、IL-12、およびインターフェロンγが誘導されることも証明された(Krieg, 2000)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、パラポックスウイルスの活性と類似する活性を示すと共に、化学合成することができ、したがって安価に製造され、化学療法剤との併用が容易である新規免疫賦活剤を含む医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
この目的は、活性物質としてポリアミンを含む医薬を提供することによって達成される。
【0009】
活性物質であると分類されるポリアミンは、少なくとも10個のモノマー単位または少なくとも10個の窒素原子、好ましくは45個のモノマー単位または少なくとも45個の窒素原子を含む。
ポリアミンは直鎖構造または分岐構造を持つことができる。
【0010】
ポリアミンは、好ましくは水に可溶性または分散性であり、水性媒体中ではpHに依存して部分的プロトン化が起こる。プロトン化度はゼータ電位測定などの物理化学的測定方法を使って決定することができる。
【0011】
疎水性置換基を持つポリアミンはさらに好ましい。
疎水性置換基はポリマー上に側鎖として配置するか、またはポリマーの末端に配置することができる。置換度(ポリマー主鎖中の官能化されたN原子の百分率)は好ましくは0.01〜10パーセントである。
【0012】
適切な疎水性置換基は、特に、アルキル鎖、アシル鎖またはステロイド様置換基である。アシル鎖はとりわけ適切な疎水性置換基である。ポリマー主鎖の窒素官能基をイソシアネートまたはα,β-不飽和カルボニル化合物に付加することによって導入することができる疎水性置換基も適切である。
ポリエチレンイミンであるポリアミンは特に好ましい。
【0013】
医薬の製造に好ましく使用することができるポリエチレンイミンは、以下の一般式:
【化8】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1は、水素、メチルまたはエチルを表し、
R2は、1〜23個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは12〜23個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは17個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R3およびR4(末端基)は、互いに独立して、水素、および1〜24個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアルキルを表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R5(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R3およびR4と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0014】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは、以下の一般式:
【化9】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1は、水素、メチルまたはエチルを表し、
R2は、1〜22個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは11〜22個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは16個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R3およびR4(末端基)は、互いに独立して、水素、もしくは1〜24個の炭素原子を有するアシル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアシル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアシルを表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R5(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R3およびR4と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0015】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化10】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1、R2およびR3は水素またはヒドロキシルを表す。
また、R4およびR5(末端基)は、互いに独立して、水素、もしくは胆汁酸などのステロイド親物質を表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R6(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R4およびR5と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
【0016】
この場合、ステロイド骨格鎖に関する立体異性体は全て包含される。特に、置換基R1、R2およびR3は、α立体配置とβ立体配置のどちらの配置をとることもできる。同様に、5位の置換基はα立体配置で存在することも、β立体配置で存在することもできる(命名法は「レンプ化学百科事典(Roempp-Chemielexikon)」(第9版, Georg Thieme Verlag, 1992)に準拠)。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0017】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化11】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1はOR4またはNR4R5を表し、
R4およびR5は、互いに独立して、水素、または1〜24個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R2およびR3(末端基)は、互いに独立して、ポリマー主鎖の窒素原子の置換基と一致するか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R6(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R2およびR3と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0018】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化12】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1は、1〜24個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R2およびR3(末端基)は、互いに独立して、ポリマー主鎖の窒素原子の置換基と一致するか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R4(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R2およびR3と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0019】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化13】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、基Rは水素であるか、または式:
【化14】
で示される基であることができ、Rxは水素であるか、またはここでも再びR型の基であることができる。
また、個々の[CH2-CH2-N]単位および末端基は、上述の置換基を持つことができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
このポリエチレンイミンは分岐構造または架橋構造を持つ。
【0020】
ポリマーは、好ましくは220000g/モル未満の平均分子量、特に好ましくは2000〜100000g/モルの分子量、非常に好ましくは20000〜100000g/モルの分子量を持つ。
【0021】
疎水性基は、ポリマー類似反応で、例えばハロゲノアルカンによるアルキル化、塩化カルボニルによるアシル化、反応性エステルによるアシル化、α,β-不飽和カルボニル化合物(カルボン酸、カルボキサミド、カルボン酸エステル)へのマイケル付加、またはイソシアネートへの付加などによって導入される。これらは文献公知の反応タイプである(March, 1992)。
【0022】
直鎖ポリエチレンイミンは、例えば、カチオン開始剤を使った2-エチルオキサゾリンのカチオン開環重合により、好ましくは B.L. Rivas および S.I. Ananias(1992)の手順に従って製造される。このようにして得られるポリ(エチルオキサゾリン)は、濃塩酸および水からなる混合物、好ましくは濃塩酸と水との1:1混合物で処理し、プロパン酸を除去することにより、直鎖ポリエチレンイミンに定量的に変換される。反応温度は好ましくは80〜100℃、特に好ましくは100℃である。反応時間は好ましくは12〜30時間、特に好ましくは24時間である。生成物は、好ましくは、エタノールから数回結晶化することによって精製される。
【0023】
上述の方法は、2000〜220000g/モルの望ましい分子量範囲にある直鎖ポリエチレンイミンを製造するために使用することができる。
【0024】
C18アルキル基などのアルキル基は、例えば適当な直鎖ポリエチレンイミンの5%溶液を、無水エタノール中、40〜75℃、好ましくは60℃の反応温度で、塩化オクタデシルと反応させることによって導入される。計量して投入する塩化アルキルの量は、所望する置換度(0.1〜10%)に合わせて正確に調整される。反応時間は好ましくは10〜24時間、特に好ましくは17時間である。
【0025】
C18アシル基などのアシル基は、例えば、適当な直鎖ポリエチレンイミンの5%溶液を、無水エタノール中、40〜60℃、好ましくは50℃の反応温度で、塩化オクタデカノイルと反応させることによって導入される。計量して投入される酸塩化物の量は、所望する置換度(0.1〜10%)に合わせて正確に調整される。反応時間は好ましくは10〜24時間、特に好ましくは20時間である。
【0026】
アシル基の導入には、カルボン酸誘導体をN-ヒドロキシスクシンイミドで活性化する反応性エステル法を使用することもできる。ポリエチレンイミンを胆汁酸で官能化する場合は、この方法を使用することが好ましい。その場合は、例えば、胆汁酸誘導体ケノデオキシコール酸(3α,7α-ジヒドロキシ-5β-コラン酸)(以下、置換基としては CDC と略記する)を、溶媒としてのジメトキシエタン中、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させる。反応は室温で行ない、反応時間は16時間である。このようにして調製した反応性エステルを、適当な直鎖ポリエチレンイミンの5%溶液と無水エタノール中で反応させる。計量して投入する反応性エステルの量は、所望する置換度(0.1〜10%)に合わせて正確に調整される。反応温度は20〜60℃、好ましくは50℃である。反応時間は10〜24時間、特に好ましくは20時間である。
【0027】
例えばケノデオキシコール酸をスペルミンまたはペンタエチレンヘキサミンなどのオリゴアミンに導入するために反応性エステル法を使用した例は文献に記載がある(Walkerら, 1998)。本発明の胆汁酸置換ポリマーは疎水性置換基を持ち、疎水性度は、S. Walkerらが記載したカチオン性面状両親媒性物質(cationic facial amphiphile)の場合と同様に、ヒドロキシル基の数を利用して制御することができる。
【0028】
純度の高い試料はポリアミン、特に疎水性ポリエチレンイミンを0.1〜1mg/ml、好ましくは0.5mg/mlの濃度で、pH7の水に溶解し、セファデックスによるカラムクロマトグラフィーで精製した後、凍結乾燥することによって製造される。次に、ポリマーを再び水に、または好ましくは生理食塩溶液に、短時間超音波処理しながら溶解し、pH7に調節する。ポリアミンまたはポリエチレンイミン原液の濃度は、好ましくは0.1〜1mg/ml、特に好ましくは0.5mg/mlである。原液は室温で貯蔵しても安定であるが、好ましくは4℃で保存する。
【0029】
カチオンポリマーの特徴づけには、1H NMR分光法、FT-IR分光法およびゼータ電位測定などの標準的方法を使用することができる。
【0030】
医薬の製造に使用することができるポリアミンは、細胞特異的リガンドにカップリングすることもできる。これらの細胞特異的リガンドは、例えば、標的細胞、好ましくは動物またはヒト標的細胞の外膜に結合するように構成させることができる。標的細胞としては、例えば内皮細胞、筋細胞、マクロファージ、リンパ球、グリア細胞、造血細胞、腫瘍細胞、例えば白血病細胞、ウイルス感染細胞、気管支上皮細胞、または肝細胞、例えば肝臓の類洞細胞などを挙げることができる。内皮細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体またはその断片、マンノースを末端に持つ糖タンパク質、糖脂質または多糖、サイトカイン、成長因子または接着分子からなる群、または特に好ましい態様として、内皮細胞に対して向性を持つウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質からなる群より選択することができる。平滑筋細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、アクチンに特異的なモノクローナル抗体またはその断片、細胞膜受容体および成長因子を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、平滑筋細胞に対して向性を持つウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質から選択することができる。マクロファージおよび/またはリンパ球に特異的に結合するリガンドは、例えば、マクロファージおよび/またはリンパ球上の膜抗原に特異的なモノクローナル抗体、マクロファージおよび/またはリンパ球上の膜抗原に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片、サイトカイン、成長因子、末端にマンノースを持つペプチド、タンパク質、脂質または多糖を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、ウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質、特に872位のヌクレオチドに突然変異を持つ C 型インフルエンザウイルスの HEF タンパク質または触媒三つ組残基セリン71、ヒスチジン368または369およびアスパラギン酸261を含むC型インフルエンザウイルス HEF 切断産物から選択することができる。グリア細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、グリア細胞膜構造物を特異的に結合する抗体および抗体断片、接着分子、マンノースを末端に持つペプチド、タンパク質、脂質または多糖、成長因子を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、グリア細胞に対して向性を持つウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質から選択することができる。造血細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、幹細胞因子受容体、IL-1(特に I 型または II 型受容体)、IL-3(特にα型またはβ型受容体)、IL-6または GM-CSF の受容体に特異的な抗体または抗体断片、およびこの特異性を示す完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片、ならびに関連受容体に結合する SCF、IL-1、IL-3、IL-6または GM-CSF などの成長因子およびそれらの断片を含む群から選択することができる。白血病細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、白血病細胞上の膜構造物、例えば CD13、CD14、CD15、CD33、CAMAL、シアロシル-Le、CD5、CD1e、CD23、M38、IL-2 受容体、T 細胞受容体、CALLA または CD19などに特異的に結合する抗体、抗体断片、免疫グロブリンまたは Fc 断片、ならびに成長因子もしくはそれらに由来する断片、またはレチノイドを含む群から選択することができる。ウイルス感染細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、ウイルス感染後に感染細胞の細胞膜上に発現するウイルス抗原に特異的な抗体、抗体断片、完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片を含む群から選択することができる。気管支上皮細胞、肝臓の類洞細胞または肝細胞に特異的に結合することができるリガンドは、例えば、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド、ネオグリコプロテインまたはガラクトース、インスリン、マンノースを末端に持つペプチド、タンパク質、脂質または多糖、標的細胞に特異的に結合する完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、標的細胞に特異的に結合するウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質から選択することができる。リガンドの他の詳細な例は、例えば EP-A 0 790 312および EP-A 0 846 772に開示されている。
【0031】
一般に、本発明の医薬は、活性物質として1回量あたり0.5〜500mgのポリアミン、好ましくは1回量あたり20〜100mgのポリアミンを含む。
【0032】
活性物質としてのポリアミンに加えて、本発明の医薬は、パラポックス・オビス(Parapox ovis)(例えば BAYPAMUN(登録商標)として)、パラポックス・オビスの断片、CpG 含有オリゴヌクレオチド、抗生物質および細胞増殖抑制剤などの他の医薬活性化合物も含むことができる。
【0033】
本発明の医薬を製造するために使用することができるポリアミン、または本発明の医薬そのものは、ポリアミンを精製および凍結乾燥した後に、好ましくは固形で存在し、その場合は、投与の直前に適切な水性媒質、好ましくは生理食塩溶液に溶解するか、または添加剤と混合された適切な製剤として、必要に応じて水性媒質、好ましくは生理食塩溶液に分散させた後で、直接投与することができる。
【0034】
他の適切な製薬助剤は、ポリラクチド、ポリラクチドコグリコリド、ポリアクリレート、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリアミド、ポリアミノ酸、セルロース誘導体、デンプン誘導体またはキトサン誘導体などの生体適合性および生分解性ポリマーである。
【0035】
臨床的問題に依存して、上記ポリアミン系医薬は全身的に(例えば経口、筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内)投与されるか、または局所的に(例えば当該器官中に)投与される。
これに関連して、臨床的問題の要求に合致した予定表による数回の投与または長期処置が必要になりうる。
【0036】
ポリアミンは、特に免疫賦活、抗炎症および抗アポトーシス効果(サイトカイン誘導ならびに抗炎症および抗アポトーシス因子の過剰発現)を持つことから、以下の疾患/病変の処置、または以下の疾患の予防/事後予防に使用することができる。
【0037】
・ウイルス感染
潜伏、慢性、持続ウイルス感染に対するTh1免疫応答の影響(Lucinら, 1994;Smithら, 1994)と、免疫賦活剤パラポックス・オビスの効果に匹敵するポリアミンの効果との既知の関係から判断して、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスまたは肝炎原因ウイルス群から選択される他の病原体のいずれかによる感染、ならびに内臓の他のウイルス感染、ならびに様々なタイプの単純疱疹ウイルス(HSV)、様々なタイプのヒトパピローマウイルス(HPV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびヒトサイトメガロウイルス(HCMV)による感染(他の疾患を伴うものを含む)、ならびに動物における対応するウイルス性疾患の抗ウイルス治療を目的として、ヒトおよび動物に、ポリアミンを単独療法として使用するか、または生物学的に活性な、例えば抗ウイルス性の、低分子量化合物と併用することが可能であり、またそうすることには治療的価値がある。
・気道および内臓の急性または慢性ウイルス感染。
・ストレスによる感染または手術後もしくは歯科処置後の感染。
・細菌感染、特に細胞内細菌による感染。
・癌、腫瘍。
・臓器線維症、特にウイルス性肝炎またはエタノール誘発性肝疾患に続発する肝線維症または肝硬変、および嚢胞性線維症。
・内臓、例えば肝臓、および皮膚、ならびにその付属器を冒しうる、コラーゲン沈着の増加を伴う疾患。
・内臓、皮膚、血液または中枢神経系およびその付属器(眼を含む)の炎症性、変性および増殖性疾患。
・アレルギー疾患群、特に全身アレルギーの発症を予防するため、または局所アレルギーもしくは喘息に使用するため。
【0038】
ポリアミンは佐剤として使用することもできる。
【実施例】
【0039】
実施例1
直鎖ポリエチレンイミン(LPEI)の合成
(Rivas および Ananias, 1992に準じて)2-エチルオキサゾリンのカチオン開環重合によってポリ(エチルオキサゾリン)を得た後、酸加水分解を行ない、プロパン酸を除去することによって、直鎖ポリエチレンイミンを合成した。前駆体ポリマー(ポリ(エチルオキサゾリン))には市販されているものもある(Sigma-Aldrich Chemie GmbH、ドイツ)。前駆体ポリマーはゲル透過クロマトグラフィー、1H NMR および FT-IR によって特徴づけた。
【0040】
定量的加水分解は、40ml の水と40ml の濃塩酸とからなる混合物中で、例えば24.7g のポリ(エチルオキサゾリン)(Mw 200000g/mol)を100℃で反応させることによって行なった。24時間後に、生成した多量の沈殿物を、250ml の水を加えることによって溶解した。これを20℃まで冷却した後、20%NaOH を添加することによって生成物を pH11に調節し、沈殿物を吸引ろ過し、洗浄(洗浄水、pH7)した後、五酸化リン上、高真空下で乾燥した。次に、粗生成物をエタノールから再結晶した(収量9.5g/88%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0041】
直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、加水分解が定量的であることを確認することができるようにした。
【0042】
実施例2
疎水性基で官能化された直鎖ポリエチレンイミン(H-LPEI)の合成:87000g/モルのMwを持つ LPEI への3モル%のC18アルキル基の導入を例として
この合成を行なうために、0.5g の LPEI を60℃、アルゴン下で、10ml のエタノールに溶解し、0.11g(0.13ml)の塩化オクタデシルをゆっくり加えた後、その混合物を17時間撹拌した。20ml の水を加えることによって反応生成物を20℃で沈殿させた後、濾別し、水(洗浄水、pH7)で洗浄し、五酸化リン上、高真空下で乾燥した(収量0.48g/96%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0043】
アルキル化直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、所望のアルキル化度が得られたことを確認することができるようにした。
【0044】
実施例3
疎水性基で官能化された直鎖ポリエチレンイミン(H-LPEI)の合成:87000g/モルのMwを持つ LPEI への3モル%のC18アシル基の導入を例として
この合成を行なうために、0.5g の LPEI を50℃、アルゴン下で、10ml のエタノールに溶解し、0.11g(0.12ml)の塩化オクタデカノイルをゆっくり加えた後、その混合物を20時間撹拌した。濾別した後、反応混合物を真空下で定量的に濃縮した。残渣を4ml のエタノールに熱時溶解し、8ml の水を加えることにより、生成物を20℃で沈殿させた。沈殿物を濾別し、水(洗浄水、pH7)で洗浄した後、沈殿物を五酸化リン上、高真空下で乾燥した(収量0.38g/76%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0045】
アシル化直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、所望のアシル化度が得られたことを確認することができるようにした。
【0046】
実施例4
疎水性基で官能化された直鎖ポリエチレンイミン(H-LPEI)の合成:87000g/モルのMwを持つ LPEI への3モル%のケノデオキシコール酸(CDC)基(3α,7α-ジヒドロキシ-5β-コラン酸)の導入を例として
この合成を行なうために、N-ヒドロキシスクシンイミドを使ってケノデオキシコール酸(Sigma-Aldrich Chemie GmbH)を反応性エステル化合物に変換した。1g のケノデオキシコール酸および0.32g のN-ヒドロキシスクシンイミドを、5ml のジメトキシエタンに溶解し、0〜5℃で0.63g のジクロロヘキシルカルボジイミドと反応させた。反応混合物を16時間撹拌した後、沈殿物を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。反応性エステルを高真空下で乾燥し(安定な泡状物)、1H NMRで特徴づけた。さらなる精製は行なわずに、179mgのケノデオキシコール酸反応性エステルを、室温、アルゴン下で、10ml のエタノールに溶解した0.5g の LPEI に加えた。次に、反応混合物を50℃で20時間撹拌した。混合物を室温まで冷却した後、25ml の水を加えることによって生成物を沈殿させた。残渣を濾別し、水(洗浄水、pH7)で洗浄し、五酸化リン上、高真空下で乾燥した(収量0.41g/82%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0047】
反応性エステル法を使ってアシル官能化された直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、所望のアシル化度が得られたことを確認することができるようにした。
【0048】
実施例5
ゼータ電位測定
水溶液中かつ生理的 pH での直鎖ポリエチレンイミンおよび疎水性基で官能化されたポリエチレンイミンの電荷またはプロトン化度を決定するために、ゼータ電位測定を行なった。平均分子量とは無関係に、またポリマーのタイプとも無関係に、平均プロトン化度は pH7で50%であることがわかった。すなわち pH7の水溶液中では、窒素原子の約50%がプロトン化している。
【0049】
実施例6
全てのポリエチレンイミン(LPEI、H-LPEI)の原液を、pH7の生理食塩溶液中に、それぞれ0.5mg/mlのポリエチレンイミン濃度で調製した。そのために、25mg の LPEI または H-LPEI を、加熱し短時間超音波処理しながら、30ml の水または生理食塩溶液に溶解した。次に、得られた溶液を0.1N HClで pH7に調節し、最終体積を50mlにした。これらの原液をろ過(0.2μm)によって滅菌した。これは20℃で長期間保存しておくことができる。
【0050】
免疫治療剤としての使用に関するポリアミンの適性、特にポリエチレンイミンの適性を実証するために、ポリアミンのインターフェロンγ刺激効果を生体内で証明し、次いでポリアミンの生体内効力を証明した。
【0051】
1.マウス脾細胞測定法でのIFN-γの誘導
a)動物管理
実験開始の8日前に NMRI マウス(非近交系、雌、体重18〜20g)を Charles River(ドイツ・ズルツフェルト)から入手した。これらの動物には飼料と水を自由に摂取させ、人工的な昼/夜リズム(07:00〜19:00は点灯、19:00〜07:00は消灯)で飼育した。
【0052】
b)マウス脾細胞の調製
頚部脱臼によって動物を屠殺した後、脾臓を摘出した。付着している結合組織を脾臓から取り除き、以下の手順に従って処理した。
【0053】
脾臓を金属製ふるい(網目の幅約70μm)に置き(ペトリ皿)、鋏を使って細かく切る。次に、5ml のPBS を加え、ガラス製乳棒を使って組織片をふるいに通す。次に、ふるいを PBS で数回洗浄した後、PBS 計50ml中の細胞を、Falcon 管に移し、300×g で10分間遠心分離する。上清を捨て、細胞を20ml の PBS に再懸濁した後、再び300×g で10分間遠心分離する。細胞を5〜10ml の培地に再懸濁した後、細胞数を決定し、2.5×106細胞/ml になるように培地で調節する。
【0054】
c)マウス脾細胞の刺激
刺激は24穴プレート中、1ml の体積、37℃および5%CO2で、72時間行なった。2×106個の脾細胞を1ml の総体積(0.8ml の培地:RPMI、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)で刺激した。刺激剤の数に応じて、各測定毎に、以下の成分を一つに混合した:
2.5×106細胞/ml を含む800μl の培地
100μl の刺激剤(ポリエチレンイミン、0.5mg/ml)
100μl のPBS。
脾細胞刺激はすべて二重に行なった。
【0055】
刺激が終了した後、上清を1.5ml の反応管に移し、残留細胞を300×g で10分間の遠心分離によって分離した。無細胞上清を取り出し、IFN-γを ELISA で測定するまで、−20℃で保存しておいた。
【0056】
d)IFN-γ濃度の測定
刺激上清中のIFN-γ濃度の決定には、マウス IFN-γ OptEIA(登録商標)-ELISAセット(Pharmingen、ドイツ・ハイデルベルク)を、製造者の説明書に従って使用した。
【0057】
図1に示す結果:
試験したポリエチレンイミンはマウス脾細胞測定法でIFN-γの有意な誘導を示す。
【0058】
2.生体内でのIFN-γの誘導
a)マウス管理
NMRI マウス(非近交系 HdsWin:NMRI、雌、体重18〜20g、ドイツ・ボルヘンの Harlan/Winkelmann から入手)を、S2隔離畜舎で、加圧滅菌可能な、おが屑敷きのポリカーボネート箱に、20〜22℃(大気湿度50〜60%)および人工的昼/夜リズム(06:30〜18:30は点灯、18:30〜06:30は消灯)で飼育した。飼料と水は自由に摂取させた。
【0059】
b)実験の実行
動物を無作為化し、それぞれ6匹からなる2群に分けた。到着後、まず3日間は、さらなる処置を施さずにマウスを檻で飼育した。
【0060】
被分析物質を0.2mlの体積で腹腔内投与した。以下の処置計画を使用した。
第1群:偽薬:PBS
第2群:ポリエチレンイミン、H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%、実施例3によるもの(マウス1匹につき0.1mg)。
【0061】
処置の9時間後にマウスを屠殺し、腹部を5ml の氷冷 PBS ですすぐことにより、腹膜細胞を得た。
【0062】
遠心分離工程(室温、16,000×g で30秒)によって細胞を濃縮した後、NucleoSpin RNA II キット(Machery-Nagel、ドイツ・デューレン)を使って細胞中の全 RNA を抽出した。
【0063】
そのために、細胞ペレットを400μl の RA1緩衝液(NucleoSpin RNA II キットのもの)に再懸濁し、−80℃で凍結した。37℃で融解した後、粘度を下げる目的で、その混合物を NucleoSpin フィルターに載せ、1分間遠心分離した(16,000×g、室温)。濾液に300μl のエタノールを加え、その混合物を NucleoSpin RNA カラムにのせた。遠心分離し(8,000×g で30秒)、濾液を取り出して、カラムを遠心分離乾燥(1分、16,000×g)にかけた後、DNA を DN アーゼ I で切断した。そのために、90μl の DN アーゼ反応緩衝液を10μl のDN アーゼ I(どちらもNucleoSpin RNA II キットのもの)と混合し、その溶液のうち95μl を乾燥フィルターにのせた。15分間インキュベート(室温)した後、フィルターをまず500μl の RA2で洗浄し、次に600μl の RA3で洗浄し、さらに250μl の RA3(NucleoSpin RNA II キットのもの)で洗浄した。これを行なうために、洗浄緩衝液をのせ、カラムをそれぞれ8,000×g で30秒間遠心分離し、最後の洗浄工程後は、16,000×g で2分間遠心分離した。その後、RNA を60μl の RN アーゼ非含有蒸留水に溶出させた(16,000×g で1分)。
RNAの品質は光度測定によって調べた。
【0064】
ポリメラーゼ反応用プライマーとしてランダムヘキサマーを使用して RNA を逆転写することにより、cDNA を合成した。これにはTaqMan 逆転写試薬(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)を利用した。合成は100μl の液量で行なった。
【0065】
合成混合物の組成は次のとおりであった:
・1300〜1500μg の RNA
・10μl の RT 緩衝液(10×)
・22μl のMgCl2(25mM)
・5μl のランダムヘキサマー
・2.5μlの MultiScribe RT
・2μl の RN アーゼ阻害剤
・20μl の dNTP
・RN アーゼ非含有水(総体積を100μl にする量)。
【0066】
この混合物を、Thermocycler GeneAmp 2400(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)で、まずは25℃で10分間インキュベートした後、48℃で30分間インキュベートし、次にそれを+4℃まで冷却した。このようにして合成されたcDNAを−20℃で保存しておいた。
【0067】
PRISM(登録商標)5700ABI(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)を使って、定量 PCR を行なった。これには、ネズミ IFN-γ用のPDAR(プレデベロップト(Pre-Developed)TaqMan(登録商標)測定試薬)キット(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)を使用した。
【0068】
PDAR キット「内在性対照リボソームRNA対照(18S RNA)」を使用し、ハウスキーピング遺伝子(18S RNA)により、cDNAの量を標準化した。
【0069】
誘導の標準化および計算には較正用 cDNA を使用した。このcDNAは、第1群に従って処置した11匹のマウスから得たcDNAの混合物からなっていた。
【0070】
増幅はそれぞれ50μl の液量で行なった。その組成は次のとおりである:
内在性18S RNA対照:
・1ng の cDNA
・25μl の2×TaqMan ユニバーサル PCR マスターミックス(Universal PCR Master Mix)
・2.5μl の18S RNA
・RN アーゼ非含有水(総体積を100μl にする量)。
【0071】
IFN-γの検出:
・10ng の cDNA
・25μlの2×TaqManユニバーサルPCRマスターミックス
・2.5μl の IFN-γプライマー
・RN アーゼ非含有水(総体積を100μl にする量)。
【0072】
50℃で2分間インキュベートし、続いて初期変性(95℃、10分)を行なった後、変性(94℃、15秒)およびアニーリング/伸長(60℃、1分)を45サイクル行なった。産物の解析には、GeneAmp(登録商標)5700配列検出システムソフトウェア(Sequence Detection System Software)(v.1.3)を使用した。
【0073】
以下の結果を得た:
インターフェロンγの発現は、ポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%による処置の9時間後に生体内で誘導される(図2参照)。動物によって、この誘導は、標準物質より16〜120倍高い。これに対して、無処置の動物または PBS で処置した動物は、標準物質の0.9〜7倍のインターフェロンγ発現量を示す。
【0074】
3.オーエスキー(Aujeszky)マウスモデルにおける免疫賦活効果の検出
オーエスキーマウスモデルは、様々な免疫賦活剤(例えばBAYPAMUN(登録商標)およびCpG-オリゴヌクレオチド)の効果を検出するための生体内ストレスモデルである。
【0075】
a)マウス管理
NMRI マウス(非近交系 HdsWin:NMRI、雌、体重18〜20g、ドイツ・ボルヘンの Harlan/Winkelmann から入手)を、S2隔離畜舎で、加圧滅菌可能な、おが屑敷きのポリカーボネート箱に、20〜22℃(大気湿度50〜60%)および人工的昼/夜リズム(06:30〜18:30は点灯、18:30〜06:30は消灯)で飼育した。飼料と水は自由に摂取させた。
【0076】
b)ストレスモデル
研究のために各群10匹からなるマウス群を形成させた。どの一群でも、動物にはそれぞれ同じ試験物質を投与した。
【0077】
到着後、マウスを2〜3日間、檻で飼育した。次に、ポリエチレンイミン(出発濃度0.5mg/ml)を、生理的 NaCl 溶液(pH7.6)で1:10および1:100に希釈した。これらの溶液をマウス1匹につき0.2mlの割合で腹腔内投与した。
【0078】
処置の24時間後に、仮性狂犬病ウイルス・ハノーバー(Hannover)H2株の腹腔内投与によって、マウスにストレスを与えた。そのために、ウイルスを PBS に希釈してストレス価を103.8〜104.1 TCID50/mlとした後、その懸濁液のうち0.2ml を投与した。
【0079】
陰性対照として、あるマウス群には、生理的 NaCl 溶液で処置してから、ストレスを与えた。
【0080】
この群のマウスはストレス負荷の3〜8日後に死亡した。ポリエチレンイミン処置マウスの大部分は、仮性狂犬病ウイルスによる感染に耐えて生き残った。この実験はストレス負荷の10日後に終了した。
【0081】
NaCl 対照群および試験群中の死亡したマウスを比較することにより、誘導された免疫賦活の強さを決定し、有効性指数を使って定量化した。これは、試験物質によって免疫賦活された結果としてオーエスキーウイルスの致死効果から保護されるマウスのパーセンテージ数を表す。これは式:
【数1】
を使って計算される。この式において、b は対照群中の死亡マウスの百分率を表し、a は試験群中の死亡マウスの百分率を表す。
【0082】
結果(図3参照):
【表1】
【0083】
様々な濃度のポリエチレンイミンをオーエスキーマウスモデルで試験することにより、驚くべきことに、以下の事実が証明される:
・0.1または0.01mg の H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%または H-LPEI, Mw:87000, CDC アシル, 3モル%でマウスを処置することにより、60%以上の有効性指数を持つ有意な免疫賦活が、それぞれ証明された。
・2つのポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%と、H-LPEI, Mw:87000, CDCアシル, 3モル%とを、様々な濃度で使用したところ、用量/効果関係が、それぞれに証明された。
【0084】
4.PIQOR(商標)cDNA アレイシステムを使った、ネズミ腹膜細胞における遺伝子発現に対するポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%および H-LPEI, Mw:87000, CDCアシル, 3モル%の効果の解析(生体内)
a)動物管理
実験開始の8日前に NMRI マウス(非近交系、雌、体重18〜20g)を Charles River(ドイツ・ズルツフェルト)から入手した。これらの動物には飼料と水を自由に摂取させ、人工的な昼/夜リズム(07:00〜19:00は点灯、19:00〜07:00は消灯)で飼育した。
【0085】
b)実験手順
動物を無作為化し、それぞれ4匹からなる3群に分けた。被分析物質を0.2mlの体積で腹腔内投与した。以下の処置計画を使用した。
第1群:偽薬:生理的 NaCl 溶液
第2群:ポリエチレンイミン, H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%(マウス1匹につき0.1mg)
第3群:ポリエチレンイミン, H-LPEI, Mw:87000, CDC アシル, 3モル%(マウス1匹につき0.1mg)。
【0086】
処置の6時間後にマウスを屠殺し、腹部を10ml の培地(DMEM, 5% FCS)で洗浄することにより、腹膜細胞を単離した。
【0087】
次に、細胞を遠心分離(室温、300×g で10分)によって濃縮した後、RNA 抽出に直ちに使用するか、またはまず赤血球の溶解にかけた。
【0088】
赤血球溶解
赤血球溶解のために、ペレット化した腹膜細胞を1ml の PBS に再懸濁した後、10ml の溶解緩衝液(10ml の0.17M トリス, pH7.2+90ml の0.16M NH4Cl, pH7.2)を加え、その混合物を室温で10分間インキュベートした。次に、300×gで10分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を10ml の PBS で洗浄し、再び遠心分離(300×g で10分間)した。
【0089】
全 RNA の調製
RNeasy ミニキット(QIAGEN、ドイツ・ヒルデン)を製造者の説明書に従って使用して、腹膜細胞から全 RNA を調製した。この場合、それぞれ2つのバッチを混合して処理した。
【0090】
それぞれ4匹の動物から得た腹膜細胞からの全 RNA の収量は、10〜20μg の RNA であった。
【0091】
RNAの中間増幅
RNAの中間増幅を実施するには、Eberwineらの手順(1992)に基づく方法を使用した。この方法では全RNAの調製物からmRNAを増幅する。
【0092】
cDNA アレイ
誘導された遺伝子および抑制された遺伝子を解析するために、Memorec Stoffel GmbH(ドイツ・ケルン)のPIQOR(商標)cDNA アレイシステムを使用した。ここでは、免疫関連遺伝子(インターロイキン、分化クラスター(differentiation cluster)(CD)、転写因子、受容体など)に由来する cDNA をチップ上に載せた。
【0093】
増幅されたRNAをハイブリダイゼーションに使用した。それぞれ2μg の増幅 RNA を RT 反応で cDNA に転写し、蛍光標識ヌクレオチドを同時に組み込んだ。対照は Cy3で標識し、試料は Cy5で標識した。
【0094】
製造者が指定した手順(PIQOR(商標)cDNA アレイシステム、第2.6版、2000年2月)に従って以下のハイブリダイゼーションを行い、評価した:
【表2】
【0095】
ハイブリダイゼーションシグナルを評価する場合は、それぞれに比較すべき試料(それぞれ Cy3および Cy5シグナル)の少なくとも1つが、2つの陰性対照(塩およびニシン精子 DNA)の平均値より少なくとも2倍強いシグナルを示すようなシグナルだけを解析した。遺伝子発現の決定には、2倍を越える差次的発現を示す遺伝子のシグナルだけを含めた。
【0096】
結果:
以下の表に上記 cDNA 解析を要約する。(A)において2.0を越える値は各 mRNA の発現量の特異的増加を示し、(B)において−2.0未満の値は抑制を示す。ポリエチレンイミンによる刺激後に過剰発現されるのは、特に抗炎症または抗アポトーシス因子である。文献で強い抗炎症効果の原因であるとされているインターロイキン1受容体2型(Brownら, 1996;Bossuら, 1995)の発現量の増加は極めて高い。FERHA(フェリチン重鎖 mRNA)の発現は、抗炎症性または抗アポトーシス性であると記載されている(Weissら, 1997;Oberle および Schroder, 1997)。MCL-1の2.88への増加も、このポリマーが抗アポトーシス効果を持つことを示している(Fujiseら, 2000)。
【0097】
PIQOR(商標)cDNA アレイシステムを使った、ネズミ腹膜細胞における遺伝子発現に対するポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%および H-LPEI, Mw:87000, CDC アシル, 3モル%の効果の解析(生体内)
A)誘導される遺伝子
【表3】
【0098】
B)抑制される遺伝子
【表4】
【0099】
文献一覧
Bossu, P., Visconti, U., Ruggiero, P., Macchia, G., Muda, M., Bertini, R., Bizzarri, C., Colagrande, A., Sabbatini, V. および Maurizi, G.(1995)「II 型インターロイキン1受容体をトランスフェクトするとインターロイキン1に対するヒト角化細胞の応答性が損なわれる(Transfected type II interleukin-1 receptor impairs responsiveness of human keratinocytes to interleukin-1)」Am.J.Pathol., 147, 1852-1861.
Brown, E.A., Dare, H.A., Marsh, C.B. および Wewers, M.D.(1996)「エンドトキシンとデキサメタゾンを併用すると単球においてII 型インターロイキン1受容体(IL-1r II)が誘導される:インターロイキン1ベータ(IL-1ベータ)およびインターロイキン1受容体拮抗薬(IL-1ra)との比較(The combination of endotoxin and dexamethasone induces type II interleukin 1 receptor(IL-1r II)in monocytes: a comparison to interleukin 1 beta(IL-1 beta)and interleukin 1 receptor antagonist(IL-1ra))」Cytokine., 8, 828-836。
Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M. および Coleman, P.(1992)「単一生ニューロンにおける遺伝子発現の解析(Analysis of gene expression in single live neurons)」Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 89, 3010-3014。
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【図面の簡単な説明】
【0100】
【図1】図1は、インターフェロンγの検出結果を示すグラフである。
【図2】図2は、標準物質との比較でIFN-γが誘導された回数を示すグラフである。
【図3】図3は、オーエスキーマウスモデルにおけるポリエチレンイミンの用量依存的効果を示すグラフである。
【0001】
本発明は、活性物質としてポリアミンを含む医薬、ならびに免疫賦活薬および/またはヒトおよび動物の様々な疾患の処置用および/または予防用の医薬を製造するためのポリアミンの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
獣医療では、今まで比較的長年にわたって、「副特異的(paraspecific)免疫」を誘導する製品−免疫賦活剤または副免疫(paraimmunity)誘導剤と呼ばれるもの−が治療的、事後(二次)予防的(metaphylactically)、および予防的に使用されてきた。一例として、免疫賦活剤は化学的に不活化したパラポックスウイルスD1701株(DE-A 35 04 940)からなることができる。BAYPAMUN(登録商標)はこのウイルスに基づいて製造される製品である。
【0003】
動物において、不活化パラポックスウイルスは、極めて広範囲にわたる多様な病原体が引き起こす感染症に対する非特異的防御を誘導する。身体自身が持つ防御系の様々な機序が、この防御の媒介を担っていると考えられる。
【0004】
これらの機序には、インターフェロンの誘導、ナチュラルキラー細胞の活性化、「コロニー刺激活性」(CSA)の誘導、およびリンパ球増殖の刺激が含まれる。作用機序に関する初期の研究により、インターロイキン2およびインターフェロンαが刺激されることが証明されている(Steinmassl および Wolf, 1990)。
【0005】
この他、非適応免疫系を活性化するため、および疾患病原体の出現に対して身体を強化するために、非メチル化 CpG 含有オリゴヌクレオチド(WO 98/18810)などの免疫賦活剤を使用することもできる。単回投与で初期免疫応答を活性化し、様々な病原体による感染、例えばリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)による感染(Elkins ら, 1999;Krieg ら, 1998;Oxenius ら, 1999)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)による感染(Elkins ら, 1999)、リーシュマニア(Leishmania)による感染(Walker ら, 1999;Zimmeremann ら, 1998)、炭疽、エボラ病およびマラリア(Krieg, 2000;Klinman ら, 1999)などを予防できることは、実験的に種々のマウスモデルで示すことが、既にできるようになっている。
【0006】
作用機序の解析では、マウスの B 細胞、マクロファージ、樹状細胞および NK 細胞がいずれも CpG 含有オリゴヌクレオチドによって刺激されることを、証明することができた。また、サイトカイン IL-18、IL-12、およびインターフェロンγが誘導されることも証明された(Krieg, 2000)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、パラポックスウイルスの活性と類似する活性を示すと共に、化学合成することができ、したがって安価に製造され、化学療法剤との併用が容易である新規免疫賦活剤を含む医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
この目的は、活性物質としてポリアミンを含む医薬を提供することによって達成される。
【0009】
活性物質であると分類されるポリアミンは、少なくとも10個のモノマー単位または少なくとも10個の窒素原子、好ましくは45個のモノマー単位または少なくとも45個の窒素原子を含む。
ポリアミンは直鎖構造または分岐構造を持つことができる。
【0010】
ポリアミンは、好ましくは水に可溶性または分散性であり、水性媒体中ではpHに依存して部分的プロトン化が起こる。プロトン化度はゼータ電位測定などの物理化学的測定方法を使って決定することができる。
【0011】
疎水性置換基を持つポリアミンはさらに好ましい。
疎水性置換基はポリマー上に側鎖として配置するか、またはポリマーの末端に配置することができる。置換度(ポリマー主鎖中の官能化されたN原子の百分率)は好ましくは0.01〜10パーセントである。
【0012】
適切な疎水性置換基は、特に、アルキル鎖、アシル鎖またはステロイド様置換基である。アシル鎖はとりわけ適切な疎水性置換基である。ポリマー主鎖の窒素官能基をイソシアネートまたはα,β-不飽和カルボニル化合物に付加することによって導入することができる疎水性置換基も適切である。
ポリエチレンイミンであるポリアミンは特に好ましい。
【0013】
医薬の製造に好ましく使用することができるポリエチレンイミンは、以下の一般式:
【化8】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1は、水素、メチルまたはエチルを表し、
R2は、1〜23個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは12〜23個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは17個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R3およびR4(末端基)は、互いに独立して、水素、および1〜24個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアルキルを表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R5(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R3およびR4と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0014】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは、以下の一般式:
【化9】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1は、水素、メチルまたはエチルを表し、
R2は、1〜22個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは11〜22個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは16個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R3およびR4(末端基)は、互いに独立して、水素、もしくは1〜24個の炭素原子を有するアシル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアシル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアシルを表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R5(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R3およびR4と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0015】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化10】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1、R2およびR3は水素またはヒドロキシルを表す。
また、R4およびR5(末端基)は、互いに独立して、水素、もしくは胆汁酸などのステロイド親物質を表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R6(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R4およびR5と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
【0016】
この場合、ステロイド骨格鎖に関する立体異性体は全て包含される。特に、置換基R1、R2およびR3は、α立体配置とβ立体配置のどちらの配置をとることもできる。同様に、5位の置換基はα立体配置で存在することも、β立体配置で存在することもできる(命名法は「レンプ化学百科事典(Roempp-Chemielexikon)」(第9版, Georg Thieme Verlag, 1992)に準拠)。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0017】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化11】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1はOR4またはNR4R5を表し、
R4およびR5は、互いに独立して、水素、または1〜24個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R2およびR3(末端基)は、互いに独立して、ポリマー主鎖の窒素原子の置換基と一致するか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R6(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R2およびR3と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0018】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化12】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、
R1は、1〜24個の炭素原子を有するアルキル、好ましくは13〜24個の炭素原子を有するアルキル、特に好ましくは18個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R2およびR3(末端基)は、互いに独立して、ポリマー主鎖の窒素原子の置換基と一致するか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R4(末端基)は、停止反応に依存する置換基、例えばヒドロキシル、NH2、NHRまたはNR2などであり、R基は末端基R2およびR3と一致することができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
この場合、単位mおよびnはブロック構造ではなく、ポリマー中にランダムに分布する。
【0019】
医薬の製造に好ましく使用することができるもう一つのポリエチレンイミンは以下の一般式:
【化13】
[式中、個々の[CH2-CH2-N]単位において、基Rは水素であるか、または式:
【化14】
で示される基であることができ、Rxは水素であるか、またはここでも再びR型の基であることができる。
また、個々の[CH2-CH2-N]単位および末端基は、上述の置換基を持つことができる。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲、好ましくは250〜2250の範囲、特に好ましくは500〜2050の範囲にあり、n=a×Pである(ここで、0.0001<a<0.1、好ましくは0.01<a<0.05、特に好ましくはa=0.03である)。]
で示される。
このポリエチレンイミンは分岐構造または架橋構造を持つ。
【0020】
ポリマーは、好ましくは220000g/モル未満の平均分子量、特に好ましくは2000〜100000g/モルの分子量、非常に好ましくは20000〜100000g/モルの分子量を持つ。
【0021】
疎水性基は、ポリマー類似反応で、例えばハロゲノアルカンによるアルキル化、塩化カルボニルによるアシル化、反応性エステルによるアシル化、α,β-不飽和カルボニル化合物(カルボン酸、カルボキサミド、カルボン酸エステル)へのマイケル付加、またはイソシアネートへの付加などによって導入される。これらは文献公知の反応タイプである(March, 1992)。
【0022】
直鎖ポリエチレンイミンは、例えば、カチオン開始剤を使った2-エチルオキサゾリンのカチオン開環重合により、好ましくは B.L. Rivas および S.I. Ananias(1992)の手順に従って製造される。このようにして得られるポリ(エチルオキサゾリン)は、濃塩酸および水からなる混合物、好ましくは濃塩酸と水との1:1混合物で処理し、プロパン酸を除去することにより、直鎖ポリエチレンイミンに定量的に変換される。反応温度は好ましくは80〜100℃、特に好ましくは100℃である。反応時間は好ましくは12〜30時間、特に好ましくは24時間である。生成物は、好ましくは、エタノールから数回結晶化することによって精製される。
【0023】
上述の方法は、2000〜220000g/モルの望ましい分子量範囲にある直鎖ポリエチレンイミンを製造するために使用することができる。
【0024】
C18アルキル基などのアルキル基は、例えば適当な直鎖ポリエチレンイミンの5%溶液を、無水エタノール中、40〜75℃、好ましくは60℃の反応温度で、塩化オクタデシルと反応させることによって導入される。計量して投入する塩化アルキルの量は、所望する置換度(0.1〜10%)に合わせて正確に調整される。反応時間は好ましくは10〜24時間、特に好ましくは17時間である。
【0025】
C18アシル基などのアシル基は、例えば、適当な直鎖ポリエチレンイミンの5%溶液を、無水エタノール中、40〜60℃、好ましくは50℃の反応温度で、塩化オクタデカノイルと反応させることによって導入される。計量して投入される酸塩化物の量は、所望する置換度(0.1〜10%)に合わせて正確に調整される。反応時間は好ましくは10〜24時間、特に好ましくは20時間である。
【0026】
アシル基の導入には、カルボン酸誘導体をN-ヒドロキシスクシンイミドで活性化する反応性エステル法を使用することもできる。ポリエチレンイミンを胆汁酸で官能化する場合は、この方法を使用することが好ましい。その場合は、例えば、胆汁酸誘導体ケノデオキシコール酸(3α,7α-ジヒドロキシ-5β-コラン酸)(以下、置換基としては CDC と略記する)を、溶媒としてのジメトキシエタン中、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下、N-ヒドロキシスクシンイミドと反応させる。反応は室温で行ない、反応時間は16時間である。このようにして調製した反応性エステルを、適当な直鎖ポリエチレンイミンの5%溶液と無水エタノール中で反応させる。計量して投入する反応性エステルの量は、所望する置換度(0.1〜10%)に合わせて正確に調整される。反応温度は20〜60℃、好ましくは50℃である。反応時間は10〜24時間、特に好ましくは20時間である。
【0027】
例えばケノデオキシコール酸をスペルミンまたはペンタエチレンヘキサミンなどのオリゴアミンに導入するために反応性エステル法を使用した例は文献に記載がある(Walkerら, 1998)。本発明の胆汁酸置換ポリマーは疎水性置換基を持ち、疎水性度は、S. Walkerらが記載したカチオン性面状両親媒性物質(cationic facial amphiphile)の場合と同様に、ヒドロキシル基の数を利用して制御することができる。
【0028】
純度の高い試料はポリアミン、特に疎水性ポリエチレンイミンを0.1〜1mg/ml、好ましくは0.5mg/mlの濃度で、pH7の水に溶解し、セファデックスによるカラムクロマトグラフィーで精製した後、凍結乾燥することによって製造される。次に、ポリマーを再び水に、または好ましくは生理食塩溶液に、短時間超音波処理しながら溶解し、pH7に調節する。ポリアミンまたはポリエチレンイミン原液の濃度は、好ましくは0.1〜1mg/ml、特に好ましくは0.5mg/mlである。原液は室温で貯蔵しても安定であるが、好ましくは4℃で保存する。
【0029】
カチオンポリマーの特徴づけには、1H NMR分光法、FT-IR分光法およびゼータ電位測定などの標準的方法を使用することができる。
【0030】
医薬の製造に使用することができるポリアミンは、細胞特異的リガンドにカップリングすることもできる。これらの細胞特異的リガンドは、例えば、標的細胞、好ましくは動物またはヒト標的細胞の外膜に結合するように構成させることができる。標的細胞としては、例えば内皮細胞、筋細胞、マクロファージ、リンパ球、グリア細胞、造血細胞、腫瘍細胞、例えば白血病細胞、ウイルス感染細胞、気管支上皮細胞、または肝細胞、例えば肝臓の類洞細胞などを挙げることができる。内皮細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば内皮細胞に特異的なモノクローナル抗体またはその断片、マンノースを末端に持つ糖タンパク質、糖脂質または多糖、サイトカイン、成長因子または接着分子からなる群、または特に好ましい態様として、内皮細胞に対して向性を持つウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質からなる群より選択することができる。平滑筋細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、アクチンに特異的なモノクローナル抗体またはその断片、細胞膜受容体および成長因子を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、平滑筋細胞に対して向性を持つウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質から選択することができる。マクロファージおよび/またはリンパ球に特異的に結合するリガンドは、例えば、マクロファージおよび/またはリンパ球上の膜抗原に特異的なモノクローナル抗体、マクロファージおよび/またはリンパ球上の膜抗原に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片、サイトカイン、成長因子、末端にマンノースを持つペプチド、タンパク質、脂質または多糖を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、ウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質、特に872位のヌクレオチドに突然変異を持つ C 型インフルエンザウイルスの HEF タンパク質または触媒三つ組残基セリン71、ヒスチジン368または369およびアスパラギン酸261を含むC型インフルエンザウイルス HEF 切断産物から選択することができる。グリア細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、グリア細胞膜構造物を特異的に結合する抗体および抗体断片、接着分子、マンノースを末端に持つペプチド、タンパク質、脂質または多糖、成長因子を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、グリア細胞に対して向性を持つウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質から選択することができる。造血細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、幹細胞因子受容体、IL-1(特に I 型または II 型受容体)、IL-3(特にα型またはβ型受容体)、IL-6または GM-CSF の受容体に特異的な抗体または抗体断片、およびこの特異性を示す完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片、ならびに関連受容体に結合する SCF、IL-1、IL-3、IL-6または GM-CSF などの成長因子およびそれらの断片を含む群から選択することができる。白血病細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、白血病細胞上の膜構造物、例えば CD13、CD14、CD15、CD33、CAMAL、シアロシル-Le、CD5、CD1e、CD23、M38、IL-2 受容体、T 細胞受容体、CALLA または CD19などに特異的に結合する抗体、抗体断片、免疫グロブリンまたは Fc 断片、ならびに成長因子もしくはそれらに由来する断片、またはレチノイドを含む群から選択することができる。ウイルス感染細胞に特異的に結合するリガンドは、例えば、ウイルス感染後に感染細胞の細胞膜上に発現するウイルス抗原に特異的な抗体、抗体断片、完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片を含む群から選択することができる。気管支上皮細胞、肝臓の類洞細胞または肝細胞に特異的に結合することができるリガンドは、例えば、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド、ネオグリコプロテインまたはガラクトース、インスリン、マンノースを末端に持つペプチド、タンパク質、脂質または多糖、標的細胞に特異的に結合する完全な免疫グロブリンまたは Fc 断片を含む群から選択するか、または特に好ましい態様として、標的細胞に特異的に結合するウイルスのエンベロープに由来する糖タンパク質から選択することができる。リガンドの他の詳細な例は、例えば EP-A 0 790 312および EP-A 0 846 772に開示されている。
【0031】
一般に、本発明の医薬は、活性物質として1回量あたり0.5〜500mgのポリアミン、好ましくは1回量あたり20〜100mgのポリアミンを含む。
【0032】
活性物質としてのポリアミンに加えて、本発明の医薬は、パラポックス・オビス(Parapox ovis)(例えば BAYPAMUN(登録商標)として)、パラポックス・オビスの断片、CpG 含有オリゴヌクレオチド、抗生物質および細胞増殖抑制剤などの他の医薬活性化合物も含むことができる。
【0033】
本発明の医薬を製造するために使用することができるポリアミン、または本発明の医薬そのものは、ポリアミンを精製および凍結乾燥した後に、好ましくは固形で存在し、その場合は、投与の直前に適切な水性媒質、好ましくは生理食塩溶液に溶解するか、または添加剤と混合された適切な製剤として、必要に応じて水性媒質、好ましくは生理食塩溶液に分散させた後で、直接投与することができる。
【0034】
他の適切な製薬助剤は、ポリラクチド、ポリラクチドコグリコリド、ポリアクリレート、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリアミド、ポリアミノ酸、セルロース誘導体、デンプン誘導体またはキトサン誘導体などの生体適合性および生分解性ポリマーである。
【0035】
臨床的問題に依存して、上記ポリアミン系医薬は全身的に(例えば経口、筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内)投与されるか、または局所的に(例えば当該器官中に)投与される。
これに関連して、臨床的問題の要求に合致した予定表による数回の投与または長期処置が必要になりうる。
【0036】
ポリアミンは、特に免疫賦活、抗炎症および抗アポトーシス効果(サイトカイン誘導ならびに抗炎症および抗アポトーシス因子の過剰発現)を持つことから、以下の疾患/病変の処置、または以下の疾患の予防/事後予防に使用することができる。
【0037】
・ウイルス感染
潜伏、慢性、持続ウイルス感染に対するTh1免疫応答の影響(Lucinら, 1994;Smithら, 1994)と、免疫賦活剤パラポックス・オビスの効果に匹敵するポリアミンの効果との既知の関係から判断して、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスまたは肝炎原因ウイルス群から選択される他の病原体のいずれかによる感染、ならびに内臓の他のウイルス感染、ならびに様々なタイプの単純疱疹ウイルス(HSV)、様々なタイプのヒトパピローマウイルス(HPV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびヒトサイトメガロウイルス(HCMV)による感染(他の疾患を伴うものを含む)、ならびに動物における対応するウイルス性疾患の抗ウイルス治療を目的として、ヒトおよび動物に、ポリアミンを単独療法として使用するか、または生物学的に活性な、例えば抗ウイルス性の、低分子量化合物と併用することが可能であり、またそうすることには治療的価値がある。
・気道および内臓の急性または慢性ウイルス感染。
・ストレスによる感染または手術後もしくは歯科処置後の感染。
・細菌感染、特に細胞内細菌による感染。
・癌、腫瘍。
・臓器線維症、特にウイルス性肝炎またはエタノール誘発性肝疾患に続発する肝線維症または肝硬変、および嚢胞性線維症。
・内臓、例えば肝臓、および皮膚、ならびにその付属器を冒しうる、コラーゲン沈着の増加を伴う疾患。
・内臓、皮膚、血液または中枢神経系およびその付属器(眼を含む)の炎症性、変性および増殖性疾患。
・アレルギー疾患群、特に全身アレルギーの発症を予防するため、または局所アレルギーもしくは喘息に使用するため。
【0038】
ポリアミンは佐剤として使用することもできる。
【実施例】
【0039】
実施例1
直鎖ポリエチレンイミン(LPEI)の合成
(Rivas および Ananias, 1992に準じて)2-エチルオキサゾリンのカチオン開環重合によってポリ(エチルオキサゾリン)を得た後、酸加水分解を行ない、プロパン酸を除去することによって、直鎖ポリエチレンイミンを合成した。前駆体ポリマー(ポリ(エチルオキサゾリン))には市販されているものもある(Sigma-Aldrich Chemie GmbH、ドイツ)。前駆体ポリマーはゲル透過クロマトグラフィー、1H NMR および FT-IR によって特徴づけた。
【0040】
定量的加水分解は、40ml の水と40ml の濃塩酸とからなる混合物中で、例えば24.7g のポリ(エチルオキサゾリン)(Mw 200000g/mol)を100℃で反応させることによって行なった。24時間後に、生成した多量の沈殿物を、250ml の水を加えることによって溶解した。これを20℃まで冷却した後、20%NaOH を添加することによって生成物を pH11に調節し、沈殿物を吸引ろ過し、洗浄(洗浄水、pH7)した後、五酸化リン上、高真空下で乾燥した。次に、粗生成物をエタノールから再結晶した(収量9.5g/88%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0041】
直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、加水分解が定量的であることを確認することができるようにした。
【0042】
実施例2
疎水性基で官能化された直鎖ポリエチレンイミン(H-LPEI)の合成:87000g/モルのMwを持つ LPEI への3モル%のC18アルキル基の導入を例として
この合成を行なうために、0.5g の LPEI を60℃、アルゴン下で、10ml のエタノールに溶解し、0.11g(0.13ml)の塩化オクタデシルをゆっくり加えた後、その混合物を17時間撹拌した。20ml の水を加えることによって反応生成物を20℃で沈殿させた後、濾別し、水(洗浄水、pH7)で洗浄し、五酸化リン上、高真空下で乾燥した(収量0.48g/96%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0043】
アルキル化直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、所望のアルキル化度が得られたことを確認することができるようにした。
【0044】
実施例3
疎水性基で官能化された直鎖ポリエチレンイミン(H-LPEI)の合成:87000g/モルのMwを持つ LPEI への3モル%のC18アシル基の導入を例として
この合成を行なうために、0.5g の LPEI を50℃、アルゴン下で、10ml のエタノールに溶解し、0.11g(0.12ml)の塩化オクタデカノイルをゆっくり加えた後、その混合物を20時間撹拌した。濾別した後、反応混合物を真空下で定量的に濃縮した。残渣を4ml のエタノールに熱時溶解し、8ml の水を加えることにより、生成物を20℃で沈殿させた。沈殿物を濾別し、水(洗浄水、pH7)で洗浄した後、沈殿物を五酸化リン上、高真空下で乾燥した(収量0.38g/76%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0045】
アシル化直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、所望のアシル化度が得られたことを確認することができるようにした。
【0046】
実施例4
疎水性基で官能化された直鎖ポリエチレンイミン(H-LPEI)の合成:87000g/モルのMwを持つ LPEI への3モル%のケノデオキシコール酸(CDC)基(3α,7α-ジヒドロキシ-5β-コラン酸)の導入を例として
この合成を行なうために、N-ヒドロキシスクシンイミドを使ってケノデオキシコール酸(Sigma-Aldrich Chemie GmbH)を反応性エステル化合物に変換した。1g のケノデオキシコール酸および0.32g のN-ヒドロキシスクシンイミドを、5ml のジメトキシエタンに溶解し、0〜5℃で0.63g のジクロロヘキシルカルボジイミドと反応させた。反応混合物を16時間撹拌した後、沈殿物を濾別し、濾液を減圧下で濃縮した。反応性エステルを高真空下で乾燥し(安定な泡状物)、1H NMRで特徴づけた。さらなる精製は行なわずに、179mgのケノデオキシコール酸反応性エステルを、室温、アルゴン下で、10ml のエタノールに溶解した0.5g の LPEI に加えた。次に、反応混合物を50℃で20時間撹拌した。混合物を室温まで冷却した後、25ml の水を加えることによって生成物を沈殿させた。残渣を濾別し、水(洗浄水、pH7)で洗浄し、五酸化リン上、高真空下で乾燥した(収量0.41g/82%)。溶離液としてミリポア水を使用するセファデックス G25(Pharmacia 使い捨て PD-10脱塩カラム)によるカラムクロマトグラフィーに、上記ポリエチレンイミンの飽和水溶液(pH7)をかけた後、凍結乾燥することにより、高純度のバッチ(ミリグラム量)を得た。
【0047】
反応性エステル法を使ってアシル官能化された直鎖ポリエチレンイミンを1H NMR および FT-IR で特徴づけることにより、所望のアシル化度が得られたことを確認することができるようにした。
【0048】
実施例5
ゼータ電位測定
水溶液中かつ生理的 pH での直鎖ポリエチレンイミンおよび疎水性基で官能化されたポリエチレンイミンの電荷またはプロトン化度を決定するために、ゼータ電位測定を行なった。平均分子量とは無関係に、またポリマーのタイプとも無関係に、平均プロトン化度は pH7で50%であることがわかった。すなわち pH7の水溶液中では、窒素原子の約50%がプロトン化している。
【0049】
実施例6
全てのポリエチレンイミン(LPEI、H-LPEI)の原液を、pH7の生理食塩溶液中に、それぞれ0.5mg/mlのポリエチレンイミン濃度で調製した。そのために、25mg の LPEI または H-LPEI を、加熱し短時間超音波処理しながら、30ml の水または生理食塩溶液に溶解した。次に、得られた溶液を0.1N HClで pH7に調節し、最終体積を50mlにした。これらの原液をろ過(0.2μm)によって滅菌した。これは20℃で長期間保存しておくことができる。
【0050】
免疫治療剤としての使用に関するポリアミンの適性、特にポリエチレンイミンの適性を実証するために、ポリアミンのインターフェロンγ刺激効果を生体内で証明し、次いでポリアミンの生体内効力を証明した。
【0051】
1.マウス脾細胞測定法でのIFN-γの誘導
a)動物管理
実験開始の8日前に NMRI マウス(非近交系、雌、体重18〜20g)を Charles River(ドイツ・ズルツフェルト)から入手した。これらの動物には飼料と水を自由に摂取させ、人工的な昼/夜リズム(07:00〜19:00は点灯、19:00〜07:00は消灯)で飼育した。
【0052】
b)マウス脾細胞の調製
頚部脱臼によって動物を屠殺した後、脾臓を摘出した。付着している結合組織を脾臓から取り除き、以下の手順に従って処理した。
【0053】
脾臓を金属製ふるい(網目の幅約70μm)に置き(ペトリ皿)、鋏を使って細かく切る。次に、5ml のPBS を加え、ガラス製乳棒を使って組織片をふるいに通す。次に、ふるいを PBS で数回洗浄した後、PBS 計50ml中の細胞を、Falcon 管に移し、300×g で10分間遠心分離する。上清を捨て、細胞を20ml の PBS に再懸濁した後、再び300×g で10分間遠心分離する。細胞を5〜10ml の培地に再懸濁した後、細胞数を決定し、2.5×106細胞/ml になるように培地で調節する。
【0054】
c)マウス脾細胞の刺激
刺激は24穴プレート中、1ml の体積、37℃および5%CO2で、72時間行なった。2×106個の脾細胞を1ml の総体積(0.8ml の培地:RPMI、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)で刺激した。刺激剤の数に応じて、各測定毎に、以下の成分を一つに混合した:
2.5×106細胞/ml を含む800μl の培地
100μl の刺激剤(ポリエチレンイミン、0.5mg/ml)
100μl のPBS。
脾細胞刺激はすべて二重に行なった。
【0055】
刺激が終了した後、上清を1.5ml の反応管に移し、残留細胞を300×g で10分間の遠心分離によって分離した。無細胞上清を取り出し、IFN-γを ELISA で測定するまで、−20℃で保存しておいた。
【0056】
d)IFN-γ濃度の測定
刺激上清中のIFN-γ濃度の決定には、マウス IFN-γ OptEIA(登録商標)-ELISAセット(Pharmingen、ドイツ・ハイデルベルク)を、製造者の説明書に従って使用した。
【0057】
図1に示す結果:
試験したポリエチレンイミンはマウス脾細胞測定法でIFN-γの有意な誘導を示す。
【0058】
2.生体内でのIFN-γの誘導
a)マウス管理
NMRI マウス(非近交系 HdsWin:NMRI、雌、体重18〜20g、ドイツ・ボルヘンの Harlan/Winkelmann から入手)を、S2隔離畜舎で、加圧滅菌可能な、おが屑敷きのポリカーボネート箱に、20〜22℃(大気湿度50〜60%)および人工的昼/夜リズム(06:30〜18:30は点灯、18:30〜06:30は消灯)で飼育した。飼料と水は自由に摂取させた。
【0059】
b)実験の実行
動物を無作為化し、それぞれ6匹からなる2群に分けた。到着後、まず3日間は、さらなる処置を施さずにマウスを檻で飼育した。
【0060】
被分析物質を0.2mlの体積で腹腔内投与した。以下の処置計画を使用した。
第1群:偽薬:PBS
第2群:ポリエチレンイミン、H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%、実施例3によるもの(マウス1匹につき0.1mg)。
【0061】
処置の9時間後にマウスを屠殺し、腹部を5ml の氷冷 PBS ですすぐことにより、腹膜細胞を得た。
【0062】
遠心分離工程(室温、16,000×g で30秒)によって細胞を濃縮した後、NucleoSpin RNA II キット(Machery-Nagel、ドイツ・デューレン)を使って細胞中の全 RNA を抽出した。
【0063】
そのために、細胞ペレットを400μl の RA1緩衝液(NucleoSpin RNA II キットのもの)に再懸濁し、−80℃で凍結した。37℃で融解した後、粘度を下げる目的で、その混合物を NucleoSpin フィルターに載せ、1分間遠心分離した(16,000×g、室温)。濾液に300μl のエタノールを加え、その混合物を NucleoSpin RNA カラムにのせた。遠心分離し(8,000×g で30秒)、濾液を取り出して、カラムを遠心分離乾燥(1分、16,000×g)にかけた後、DNA を DN アーゼ I で切断した。そのために、90μl の DN アーゼ反応緩衝液を10μl のDN アーゼ I(どちらもNucleoSpin RNA II キットのもの)と混合し、その溶液のうち95μl を乾燥フィルターにのせた。15分間インキュベート(室温)した後、フィルターをまず500μl の RA2で洗浄し、次に600μl の RA3で洗浄し、さらに250μl の RA3(NucleoSpin RNA II キットのもの)で洗浄した。これを行なうために、洗浄緩衝液をのせ、カラムをそれぞれ8,000×g で30秒間遠心分離し、最後の洗浄工程後は、16,000×g で2分間遠心分離した。その後、RNA を60μl の RN アーゼ非含有蒸留水に溶出させた(16,000×g で1分)。
RNAの品質は光度測定によって調べた。
【0064】
ポリメラーゼ反応用プライマーとしてランダムヘキサマーを使用して RNA を逆転写することにより、cDNA を合成した。これにはTaqMan 逆転写試薬(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)を利用した。合成は100μl の液量で行なった。
【0065】
合成混合物の組成は次のとおりであった:
・1300〜1500μg の RNA
・10μl の RT 緩衝液(10×)
・22μl のMgCl2(25mM)
・5μl のランダムヘキサマー
・2.5μlの MultiScribe RT
・2μl の RN アーゼ阻害剤
・20μl の dNTP
・RN アーゼ非含有水(総体積を100μl にする量)。
【0066】
この混合物を、Thermocycler GeneAmp 2400(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)で、まずは25℃で10分間インキュベートした後、48℃で30分間インキュベートし、次にそれを+4℃まで冷却した。このようにして合成されたcDNAを−20℃で保存しておいた。
【0067】
PRISM(登録商標)5700ABI(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)を使って、定量 PCR を行なった。これには、ネズミ IFN-γ用のPDAR(プレデベロップト(Pre-Developed)TaqMan(登録商標)測定試薬)キット(Applied Biosystems、ドイツ・ヴァイターシュタット)を使用した。
【0068】
PDAR キット「内在性対照リボソームRNA対照(18S RNA)」を使用し、ハウスキーピング遺伝子(18S RNA)により、cDNAの量を標準化した。
【0069】
誘導の標準化および計算には較正用 cDNA を使用した。このcDNAは、第1群に従って処置した11匹のマウスから得たcDNAの混合物からなっていた。
【0070】
増幅はそれぞれ50μl の液量で行なった。その組成は次のとおりである:
内在性18S RNA対照:
・1ng の cDNA
・25μl の2×TaqMan ユニバーサル PCR マスターミックス(Universal PCR Master Mix)
・2.5μl の18S RNA
・RN アーゼ非含有水(総体積を100μl にする量)。
【0071】
IFN-γの検出:
・10ng の cDNA
・25μlの2×TaqManユニバーサルPCRマスターミックス
・2.5μl の IFN-γプライマー
・RN アーゼ非含有水(総体積を100μl にする量)。
【0072】
50℃で2分間インキュベートし、続いて初期変性(95℃、10分)を行なった後、変性(94℃、15秒)およびアニーリング/伸長(60℃、1分)を45サイクル行なった。産物の解析には、GeneAmp(登録商標)5700配列検出システムソフトウェア(Sequence Detection System Software)(v.1.3)を使用した。
【0073】
以下の結果を得た:
インターフェロンγの発現は、ポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%による処置の9時間後に生体内で誘導される(図2参照)。動物によって、この誘導は、標準物質より16〜120倍高い。これに対して、無処置の動物または PBS で処置した動物は、標準物質の0.9〜7倍のインターフェロンγ発現量を示す。
【0074】
3.オーエスキー(Aujeszky)マウスモデルにおける免疫賦活効果の検出
オーエスキーマウスモデルは、様々な免疫賦活剤(例えばBAYPAMUN(登録商標)およびCpG-オリゴヌクレオチド)の効果を検出するための生体内ストレスモデルである。
【0075】
a)マウス管理
NMRI マウス(非近交系 HdsWin:NMRI、雌、体重18〜20g、ドイツ・ボルヘンの Harlan/Winkelmann から入手)を、S2隔離畜舎で、加圧滅菌可能な、おが屑敷きのポリカーボネート箱に、20〜22℃(大気湿度50〜60%)および人工的昼/夜リズム(06:30〜18:30は点灯、18:30〜06:30は消灯)で飼育した。飼料と水は自由に摂取させた。
【0076】
b)ストレスモデル
研究のために各群10匹からなるマウス群を形成させた。どの一群でも、動物にはそれぞれ同じ試験物質を投与した。
【0077】
到着後、マウスを2〜3日間、檻で飼育した。次に、ポリエチレンイミン(出発濃度0.5mg/ml)を、生理的 NaCl 溶液(pH7.6)で1:10および1:100に希釈した。これらの溶液をマウス1匹につき0.2mlの割合で腹腔内投与した。
【0078】
処置の24時間後に、仮性狂犬病ウイルス・ハノーバー(Hannover)H2株の腹腔内投与によって、マウスにストレスを与えた。そのために、ウイルスを PBS に希釈してストレス価を103.8〜104.1 TCID50/mlとした後、その懸濁液のうち0.2ml を投与した。
【0079】
陰性対照として、あるマウス群には、生理的 NaCl 溶液で処置してから、ストレスを与えた。
【0080】
この群のマウスはストレス負荷の3〜8日後に死亡した。ポリエチレンイミン処置マウスの大部分は、仮性狂犬病ウイルスによる感染に耐えて生き残った。この実験はストレス負荷の10日後に終了した。
【0081】
NaCl 対照群および試験群中の死亡したマウスを比較することにより、誘導された免疫賦活の強さを決定し、有効性指数を使って定量化した。これは、試験物質によって免疫賦活された結果としてオーエスキーウイルスの致死効果から保護されるマウスのパーセンテージ数を表す。これは式:
【数1】
を使って計算される。この式において、b は対照群中の死亡マウスの百分率を表し、a は試験群中の死亡マウスの百分率を表す。
【0082】
結果(図3参照):
【表1】
【0083】
様々な濃度のポリエチレンイミンをオーエスキーマウスモデルで試験することにより、驚くべきことに、以下の事実が証明される:
・0.1または0.01mg の H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%または H-LPEI, Mw:87000, CDC アシル, 3モル%でマウスを処置することにより、60%以上の有効性指数を持つ有意な免疫賦活が、それぞれ証明された。
・2つのポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%と、H-LPEI, Mw:87000, CDCアシル, 3モル%とを、様々な濃度で使用したところ、用量/効果関係が、それぞれに証明された。
【0084】
4.PIQOR(商標)cDNA アレイシステムを使った、ネズミ腹膜細胞における遺伝子発現に対するポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%および H-LPEI, Mw:87000, CDCアシル, 3モル%の効果の解析(生体内)
a)動物管理
実験開始の8日前に NMRI マウス(非近交系、雌、体重18〜20g)を Charles River(ドイツ・ズルツフェルト)から入手した。これらの動物には飼料と水を自由に摂取させ、人工的な昼/夜リズム(07:00〜19:00は点灯、19:00〜07:00は消灯)で飼育した。
【0085】
b)実験手順
動物を無作為化し、それぞれ4匹からなる3群に分けた。被分析物質を0.2mlの体積で腹腔内投与した。以下の処置計画を使用した。
第1群:偽薬:生理的 NaCl 溶液
第2群:ポリエチレンイミン, H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%(マウス1匹につき0.1mg)
第3群:ポリエチレンイミン, H-LPEI, Mw:87000, CDC アシル, 3モル%(マウス1匹につき0.1mg)。
【0086】
処置の6時間後にマウスを屠殺し、腹部を10ml の培地(DMEM, 5% FCS)で洗浄することにより、腹膜細胞を単離した。
【0087】
次に、細胞を遠心分離(室温、300×g で10分)によって濃縮した後、RNA 抽出に直ちに使用するか、またはまず赤血球の溶解にかけた。
【0088】
赤血球溶解
赤血球溶解のために、ペレット化した腹膜細胞を1ml の PBS に再懸濁した後、10ml の溶解緩衝液(10ml の0.17M トリス, pH7.2+90ml の0.16M NH4Cl, pH7.2)を加え、その混合物を室温で10分間インキュベートした。次に、300×gで10分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を10ml の PBS で洗浄し、再び遠心分離(300×g で10分間)した。
【0089】
全 RNA の調製
RNeasy ミニキット(QIAGEN、ドイツ・ヒルデン)を製造者の説明書に従って使用して、腹膜細胞から全 RNA を調製した。この場合、それぞれ2つのバッチを混合して処理した。
【0090】
それぞれ4匹の動物から得た腹膜細胞からの全 RNA の収量は、10〜20μg の RNA であった。
【0091】
RNAの中間増幅
RNAの中間増幅を実施するには、Eberwineらの手順(1992)に基づく方法を使用した。この方法では全RNAの調製物からmRNAを増幅する。
【0092】
cDNA アレイ
誘導された遺伝子および抑制された遺伝子を解析するために、Memorec Stoffel GmbH(ドイツ・ケルン)のPIQOR(商標)cDNA アレイシステムを使用した。ここでは、免疫関連遺伝子(インターロイキン、分化クラスター(differentiation cluster)(CD)、転写因子、受容体など)に由来する cDNA をチップ上に載せた。
【0093】
増幅されたRNAをハイブリダイゼーションに使用した。それぞれ2μg の増幅 RNA を RT 反応で cDNA に転写し、蛍光標識ヌクレオチドを同時に組み込んだ。対照は Cy3で標識し、試料は Cy5で標識した。
【0094】
製造者が指定した手順(PIQOR(商標)cDNA アレイシステム、第2.6版、2000年2月)に従って以下のハイブリダイゼーションを行い、評価した:
【表2】
【0095】
ハイブリダイゼーションシグナルを評価する場合は、それぞれに比較すべき試料(それぞれ Cy3および Cy5シグナル)の少なくとも1つが、2つの陰性対照(塩およびニシン精子 DNA)の平均値より少なくとも2倍強いシグナルを示すようなシグナルだけを解析した。遺伝子発現の決定には、2倍を越える差次的発現を示す遺伝子のシグナルだけを含めた。
【0096】
結果:
以下の表に上記 cDNA 解析を要約する。(A)において2.0を越える値は各 mRNA の発現量の特異的増加を示し、(B)において−2.0未満の値は抑制を示す。ポリエチレンイミンによる刺激後に過剰発現されるのは、特に抗炎症または抗アポトーシス因子である。文献で強い抗炎症効果の原因であるとされているインターロイキン1受容体2型(Brownら, 1996;Bossuら, 1995)の発現量の増加は極めて高い。FERHA(フェリチン重鎖 mRNA)の発現は、抗炎症性または抗アポトーシス性であると記載されている(Weissら, 1997;Oberle および Schroder, 1997)。MCL-1の2.88への増加も、このポリマーが抗アポトーシス効果を持つことを示している(Fujiseら, 2000)。
【0097】
PIQOR(商標)cDNA アレイシステムを使った、ネズミ腹膜細胞における遺伝子発現に対するポリエチレンイミン H-LPEI, Mw:87000, C18アシル, 3モル%および H-LPEI, Mw:87000, CDC アシル, 3モル%の効果の解析(生体内)
A)誘導される遺伝子
【表3】
【0098】
B)抑制される遺伝子
【表4】
【0099】
文献一覧
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【図面の簡単な説明】
【0100】
【図1】図1は、インターフェロンγの検出結果を示すグラフである。
【図2】図2は、標準物質との比較でIFN-γが誘導された回数を示すグラフである。
【図3】図3は、オーエスキーマウスモデルにおけるポリエチレンイミンの用量依存的効果を示すグラフである。
Claims (28)
- 活性物質としてポリアミンを含む医薬。
- ポリアミンが疎水性置換基を持つことを特徴とする、請求項1に記載の医薬。
- 置換基が側鎖として配置されるか、または末端に配置されることを特徴とする、請求項2に記載の医薬。
- 置換基がアルキル鎖、アシル鎖またはステロイド様置換基、およびポリアミン主鎖の窒素官能基をイソシアネートまたはα,β-不飽和カルボニル化合物に付加することによって導入することができる疎水性置換基であることを特徴とする、請求項2または3に記載の医薬。
- ポリアミンがポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の医薬。
- ポリエチレンイミンが以下の一般式:
R1は、水素、メチルまたはエチルを表し、
R2は、1〜23個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R3およびR4(末端基)は、互いに独立して、水素、もしくは1〜24個の炭素原子を有するアルキルを表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R5(末端基)は、停止反応に依存する置換基である。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲にあり、n=a×P(ここで、0.0001<a<0.1)であって、かつ単位mおよびnはポリマー中にランダムに分布する。]
を持つことを特徴とする、請求項5に記載の医薬。 - ポリエチレンイミンが以下の一般式:
R1は、水素、メチルまたはエチルを表し、
R2は、1〜22個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R3およびR4(末端基)は、互いに独立して、水素、もしくは1〜24個の炭素原子を有するアシルを表すか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R5(末端基)は、停止反応に依存する置換基である。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲にあり、n=a×P(ここで、0.0001<a<0.1)であって、かつ単位mおよびnはポリマー中にランダムに分布する。]
で示されることを特徴とする、請求項5に記載の医薬。 - ポリエチレンイミンが以下の一般式:
R1はOR4またはNR4R5を表し、
R4およびR5は、互いに独立して、水素、または1〜24個の炭素原子を有するアルキルを表す。
また、R2およびR3(末端基)は、互いに独立して、ポリマー主鎖の窒素原子の置換基と一致するか、または開始剤に依存する構造を持つ。
R6(末端基)は、停止反応に依存する置換基である。
また、平均重合度P=(m+n)は45〜5250の範囲にあり、n=a×P(ここで、0.0001<a<0.1)であって、かつ単位mおよびnはポリマー中にランダムに分布する。]
で示されることを特徴とする、請求項5に記載の医薬。 - ポリアミンが220000g/モル未満の分子量を持つことを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載の医薬。
- ポリアミンが2000〜100000g/モルの分子量を持つことを特徴とする、請求項12に記載の医薬。
- ポリアミンが細胞特異的リガンドにカップリングされることを特徴とする、請求項1〜13のいずれかに記載の医薬。
- さらに製薬助剤を含むことを特徴とする、請求項1〜14のいずれかに記載の医薬。
- 医薬として使用される請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミン。
- 免疫賦活薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- ウイルス感染処置用またはウイルス感染予防用の医薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- 感染がパピローマウイルス、ヘルペス群のウイルス、肝炎ウイルスまたは HIV による感染であることを特徴とする、請求項18に記載の使用。
- 感染が気道または内臓の感染であることを特徴とする、請求項18に記載の使用。
- 予防がストレスによる感染または手術後もしくは歯科処置後の感染の防止であることを特徴とする、請求項18に記載の使用。
- 細菌感染処置用の医薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- 癌または腫瘍処置用の医薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- 臓器線維症処置用および/または臓器線維症予防用の医薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- コラーゲン沈着の増加を伴う疾患を処置するための医薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- 内臓、皮膚、血液または中枢神経系および眼を含むその付属器の炎症性、変性および増殖性疾患を処置するための医薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- アレルギー性疾患群の疾患、特に喘息を処置するための医薬を製造するための請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
- 佐剤としての請求項1〜14のいずれかに記載のポリアミンの使用。
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