KR20030070085A - 활성 물질로서 폴리아민을 포함하는 약물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 활성 물질로서 폴리아민을 포함하는 약물에 관한 것이며, 또한 인간 및 동물의 면역자극 약물 또는 각종 질병의 치료 및(또는) 예방용 약물의 제조에 있어서 상기 폴리아민의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 활성 물질로서 폴리아민을 포함하는 약물, 및 인간 및 동물의 면역자극 약물 및(또는) 각종 질병의 치료 및(또는) 예방용 약물의 제조에 있어서 폴리아민의 용도에 관한 것이다.
현재까지 비교적 오랜 시간 동안, 면역자극제 또는 파라 (para)-면역 유도제라 불리우는, "파라-특이적 면역"을 유도하는 생성물이 수의학적 의료 처치에 있어서 치료적, 후-방어적 (metaphylactical) 및 예방적으로 이용되어 왔다. 예로서, 면역자극제는 화학적으로 실활화된 파라폭스바이러스 오비스 (Parapoxvirus ovis) 종 D 1701 (DE-A 35 04 940)으로 구성될 수 있다. 베이파문 (BAYPAMUN, 등록상표)은 이러한 바이러스를 기초로 제조된 제품이다.
동물에서, 실활화된 파라폭스바이러스는 매우 다양한 각종 병원체에 의해 유발되는 감염증에 대하여 비특이적 보호를 유도한다. 동물 체내의 자체적인 방어 시스템의 여러 메카니즘이 이러한 보호를 매개하는 역할을 하는 것으로 추정된다.
상기 메카니즘은 인터페론의 유도, 자연살세포의 활성화, "콜로니-자극 활성 (CSA)"의 유도 및 림프구 증식의 자극을 포함한다. 작용 메카니즘에 대한 선행 조사 결과, 인터루킨 2 및 인터페론 α가 자극된 것으로 입증되었다 (Steinmassl &Wolf, 1990).
이외에도, 메틸화되지 않은 CpG-함유 올리고뉴클레오티드 (WO 98/18810)와 같은 면역자극제는 질병 병원체의 출현에 대하여 비적응성 (nonadaptive) 면역계를 활성화하고 신체를 강화시키는데 사용될 수 있다. 다양한 마우스 모델에서 단일 투여에 의해 초기 면역 반응을 활성화시키고 각종 병원체에 의한 감염, 예를 들어 리스테리아 모노시토제네스 (Listeria monocytogenes)(Elkins et al., 1999; Krieg et al., 1998; Oxenius et al., 1999), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis)(Elkins et al., 1999), 레이쉬마니아 (Leishmania)(Walker et al., 1999; Zimmeremann et al., 1998), 탄저병, 에볼라 및 말라리아 (Krieg, 2000; Klinman et al., 1999)에 의한 감염을 예방할 수 있음이 실험적으로 이미 밝혀진 바 있다.
작용 메카니즘의 분석에서, 쥐의 B 세포, 대식세포, 수지상세포 및 NK 세포가 모두 CpG-함유 올리고뉴클레오티드에 의해 자극된다는 것을 입증할 수 있었다. 또한, 사이토카인 IL-18, IL-12 및 인터페론 γ가 유도되었음이 입증되었다 (Krieg, 2000).
본 발명의 목적은 신규 면역자극제를 포함하는 약물을 제공하기 위한 것이며, 이러한 면역자극제는 파라폭스 오비스 (Parapox ovis)의 활성과 유사한 활성을 나타내지만 화학적으로 합성될 수 있어서 생산 비용 측면에서 저렴하며 화학치료제와 배합하기가 보다 용이하다.
본 발명의 목적은 활성 물질로서 폴리아민을 포함하는 약물을 제공함으로써달성된다.
활성 물질로서 분류되는 폴리아민은 10개 이상의 단량체 단위 또는 10개 이상의 질소 원자, 바람직하게는 45개 이상의 단량체 단위 또는 45개 이상의 질소 원자를 포함한다.
폴리아민은 선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다.
폴리아민은 바람직하게는 물에 용해되거나 분산될 수 있으며, 부분적인 양성자화 (protonation)는 pH 의존성으로서 수성 매질에서 일어난다. 양성자화 정도는 제타 전위 측정과 같은 물리화학적 측정 방법에 의해 측정될 수 있다.
소수성 치환체를 보유하는 폴리아민이 또한 바람직하다.
소수성 치환체는 중합체상에서 측쇄 또는 말단으로서 배열될 수 있다. 치환도 (중합체 주쇄에서 관능화된 N 원자의 퍼센트)는 바람직하게는 0.01 내지 10 퍼센트이다.
적합한 소수성 치환체는 특히 알킬쇄, 아실쇄 또는 스테로이드형 치환체이다. 아실쇄가 특히 적합한 소수성 치환체이다. 중합체 주쇄의 질소 관능기를 이소시아네이트 또는 α,β-불포화 카르보닐 화합물로 부가함으로써 도입될 수 있는 소수성 치환체가 또한 적합하다.
폴리아민은 폴리에틸렌이민인 것이 특히 바람직하다.
약물의 제조에 바람직하게 사용될 수 있는 폴리에틸렌이민은 하기 화학식을갖는다:
상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,
R1은 수소, 메틸 또는 에틸이고,
R2는 탄소원자수 1 내지 23의 알킬, 바람직하게는 탄소원자수 12 내지 23의 알킬, 특히 바람직하게는 탄소원자수 17의 알킬이고,
R3및 R4(말단기)는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소원자수 1 내지 24의 알킬, 바람직하게는 탄소원자수 13 내지 24의 알킬, 특히 바람직하게는 탄소원자수 18의 알킬이거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,
R5(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체, 예를 들어 히드록실, NH2, NHR 또는 NR2이며, R 라디칼은 말단기 R3및 R4에 상응할 수 있고,
평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위, 바람직하게는 250 내지 2,250의 범위, 특히 바람직하게는 500 내지 2,050의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1, 바람직하게는 0.01 < a < 0.05, 특히 바람직하게는 a = 0.03)이다.
이와 관련하여, 단위 m 및 n은 블록 구조가 아니며, 대신 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
약물의 제조에 바람직하게 사용될 수 있는 다른 폴리에틸렌이민은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,
R1은 수소, 메틸 또는 에틸이고,
R2는 탄소원자수 1 내지 22의 알킬, 바람직하게는 탄소원자수 11 내지 22의 알킬, 특히 바람직하게는 탄소원자수 16의 알킬이고,
R3및 R4(말단기)는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소원자수 1 내지 24의 아실, 바람직하게는 탄소원자수 13 내지 24의 아실, 특히 바람직하게는 탄소원자수 18의 아실이거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,
R5(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체, 예를 들어 히드록실, NH2, NHR 또는 NR2이며, R 라디칼은 말단기 R3및 R4에 상응할 수 있고,
평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위, 바람직하게는 250 내지 2,250의 범위, 특히 바람직하게는 500 내지 2,050의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1, 바람직하게는 0.01 < a < 0.05, 특히 바람직하게는 a = 0.03)이다.
이와 관련하여, 단위 m 및 n은 블록 구조가 아니며, 대신 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
약물의 제조에 바람직하게 사용될 수 있는 또 다른 폴리에틸렌이민은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,
R1, R2및 R3는 수소 또는 히드록실이고,
R4및 R5(말단기)는 서로 독립적으로 수소 또는 스테로이드 모 (parent) 물질, 특히 담즙산이거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,
R6(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체, 예를 들어 히드록실, NH2, NHR 또는 NR2이며, R 라디칼은 말단기 R4및 R5에 상응할 수 있고,
평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위, 바람직하게는 250 내지 2,250의 범위, 특히 바람직하게는 500 내지 2,050의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1, 바람직하게는 0.01 < a < 0.05, 특히 바람직하게는 a = 0.03)이다.
이와 관련하여, 스테로이드 주쇄에 대한 모든 입체이성질체가 포함된다. 특히, 치환체 R1, R2및 R3는 α배열 및 β배열 둘 다로 배열될 수 있다. 동일한 방식으로, 5 위치의 치환체는 α배열 및 β배열로 존재할 수 있다 (문헌 (Roempp-Chemielexikon [Roempp chemical encyclopedia], 9th edition, Georg Thieme Verlag, 1992)에 다른 명명법).
이와 관련하여, 단위 m 및 n은 블록 구조가 아니며, 대신 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
약물의 제조에 바람직하게 사용될 수 있는 또 다른 폴리에틸렌이민은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,
R1은 OR4또는 NR4R5이고, 여기서 R4및 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소원자수 1 내지 24의 알킬, 바람직하게는 탄소원자수 13 내지 24의 알킬, 특히 바람직하게는 탄소원자수 18의 알킬이고,
R2및 R3(말단기)는 서로 독립적으로 중합체 주쇄의 질소 원자의 치환체에 상응하거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,
R6(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체, 예를 들어 히드록실, NH2, NHR 또는 NR2이며, R 라디칼은 말단기 R2및 R3에 상응할 수 있고,
평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위, 바람직하게는 250 내지 2,250의 범위, 특히 바람직하게는 500 내지 2,050의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1, 바람직하게는 0.01 < a < 0.05, 특히 바람직하게는 a = 0.03)이다.
이와 관련하여, 단위 m 및 n은 블록 구조가 아니며, 대신 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
약물의 제조에 바람직하게 사용될 수 있는 또 다른 폴리에틸렌이민은 하기화학식을 갖는다:
상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,
R1은 탄소원자수 1 내지 24의 알킬, 바람직하게는 탄소원자수 13 내지 24의 알킬, 특히 바람직하게는 탄소원자수 18의 알킬이고,
R2및 R3(말단기)는 서로 독립적으로 중합체 주쇄의 질소 원자의 치환체에 상응하거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,
R4(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체, 예를 들어 히드록실, NH2, NHR 또는 NR2이며, R 라디칼은 말단기 R2및 R3에 상응할 수 있고,
평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위, 바람직하게는 250 내지 2,250의 범위, 특히 바람직하게는 500 내지 2,050의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1, 바람직하게는 0.01 < a < 0.05, 특히 바람직하게는 a = 0.03)이다.
이와 관련하여, 단위 m 및 n은 블록 구조가 아니며, 대신 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
약물의 제조에 바람직하게 사용될 수 있는 또 다른 폴리에틸렌이민은 하기 화학식을 갖는다:
상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서, 라디칼 R은 수소 또는 화학식의 라디칼이며, 여기서 RX는 수소 또는 타입 R의 라디칼일 수 있고,
각각의 [CH2-CH2-N] 단위 및 말단기는 상기 언급된 치환체를 보유할 수 있고,
평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위, 바람직하게는 250 내지 2,250의 범위, 특히 바람직하게는 500 내지 2,050의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1, 바람직하게는 0.01 < a < 0.05, 특히 바람직하게는 a = 0.03)이다. 이러한 폴리에틸렌이민은 분지되거나 가교결합된 구조를 갖는다.
중합체의 평균분자량은 바람직하게는 220,000 g/mol 미만, 특히 바람직하게는 2,000 내지 100,000 g/mol, 매우 특히 바람직하게는 20,000 내지 100,000 g/mol이다.
소수성 기는, 예를 들어 할로게노알칸으로 알킬화하거나, 염화카르보닐로 아실화하거나, 반응성 에스테르로 아실화하거나, α,β-불포화 카르보닐 화합물 (카르복실산, 카르복사미드, 카르복실산 에스테르)로 미하엘 (Michael) 부가하거나 또는 이소시아네이트로 부가하여 중합체-유사 반응으로 도입한다. 이들 반응은 문헌 (March, 1992)으로부터 공지되어 있는 반응 유형들이다.
선형 폴리에틸렌이민은 예를 들어 양이온성 개시제를 사용한, 2-에틸옥사졸린의 양이온성 개환 중합에 의해, 바람직하게는 문헌 (B.L. Rivas and S.I. Ananias (1992))에 따른 프로토콜에 따라 제조한다. 이러한 방식으로 얻어지는 폴리(에틸옥사졸린)은 진한 염산과 물로 이루어진 혼합물, 바람직하게는 진한 염산과 물의 1:1 혼합물로 처리하여 선형 폴리에틸렌이민으로 정량적으로 전환시키며, 프로판산은 제거된다. 반응 온도는 바람직하게는 80 내지 100 ℃, 특히 바람직하게는 100 ℃이다. 반응 시간은 바람직하게는 12 내지 30 시간, 특히 바람직하게는 24시간이다. 생성물은 바람직하게는 에탄올로부터 수회 결정화하여 정제한다.
설명된 방법은 목적하는 분자량 범위가 2,000 내지 220,000 g/mol인 선형 폴리에틸렌이민을 제조하는데 이용될 수 있다.
알킬기, 예를 들어 C18-알킬기는 예를 들어 적절한 선형 폴리에틸렌이민의 5％ 용액을 40 내지 75 ℃, 바람직하게는 60 ℃의 반응 온도에서 순수 에탄올 중 염화옥타데실과 반응시킴으로써 도입한다. 계량되는 염화알킬의 양은 목적하는 치환도 (0.1 내지 10％)로 정확하게 조절된다. 반응 시간은 바람직하게는 10 내지 24시간, 특히 바람직하게는 17시간이다.
아실기, 예를 들어 C18-아실기는 예를 들어 적절한 선형 폴리에틸렌이민의 5％ 용액을 40 내지 60 ℃, 바람직하게는 50 ℃의 반응 온도에서 순수 에탄올 중 염화옥타데카노일과 반응시킴으로써 도입한다. 계량되는 산 클로라이드의 양은 목적하는 치환도 (0.1 내지 10％)로 정확하게 조절된다. 반응 시간은 바람직하게는 10 내지 24시간, 특히 바람직하게는 20시간이다.
또한 반응성 에스테르 방법을 이용하여 아실기를 도입할 수도 있으며, 카르복실산 유도체는 N-히드록시숙신이미드로 활성화된다. 이러한 방법은 폴리에틸렌이민을 담즙산으로 관능화하는 경우 바람직하다. 이 경우, 담즙산 유도체 케노데옥시콜산 (3α,7α-디히드록시-5β-콜란산)은 예를 들어 디시클로헥실카르보디이미드의 존재하에 용매로서 디메톡시에탄 중 N-히드록시숙신이미드와 반응한다는 점에서 치환체로서 CDC로 줄여 쓴다. 반응은 실온에서 수행되며, 반응 시간은 16시간이다. 이러한 방식으로 제조된 반응성 에스테르를 순수 에탄올 중 적절한 선형 폴리에틸렌이민의 5％ 용액과 반응시킨다. 계량되는 반응성 에스테르의 양은 목적하는 치환도 (0.1 내지 10％)로 정확하게 조절된다. 반응 온도는 20 내지 60 ℃, 바람직하게는 50 ℃이다. 반응 시간은 바람직하게는 10 내지 24시간, 특히 바람직하게는 20시간이다.
예를 들어 케노데옥시콜산을 올리고아민, 예컨대 스페르민 또는 펜타에틸렌헥사민으로 도입하기 위해 반응성 에스테르 방법을 이용하는 것에 대하여는 문헌 (Walker et al., 1998)에 설명되어 있다. 본 발명에 따른 담즙산-치환된 중합체는 소수성 치환체를 보유하며, 히드록실기를 적절히 사용하여 문헌 (S. Walker et al.)에 기재된 양이온성 표면상 양쪽성물질과 유사한 방식으로 소수성도를 조절할 수 있다.
고도로 순수한 샘플은 폴리아민, 특히 소수성 폴리에틸렌이민을 pH 7의 물 중에서 0.1 내지 1 mg/ml, 바람직하게는 0.5 mg/ml의 농도로 용해시키고 나서, 이를 세파덱스 (Sephadex)를 통한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한 다음, 동결 건조시키는 방식으로 제조한다. 이후, 중합체를 물, 바람직하게는 생리학적 염화나트륨 용액 중에 다시 한번 용해시키면서 잠깐 동안 초음파분해하고, pH 7로 조절한다. 폴리아민 또는 폴리에틸렌이민 스탁 (stock) 용액의 농도는 바람직하게는 0.1 내지 1 mg/ml, 특히 바람직하게는 0.5 mg/ml이다. 스탁 용액은 실온에서 보관하는 동안 안정하며, 바람직하게는 4 ℃에서 이 용액을 보관한다.
양이온성 중합체를 특성화하기 위해 1H NMR 분광법, FT-IR 분광법 및 제타 전위 측정법과 같은 표준 방법을 이용할 수 있다.
또한 약물의 제조에 사용될 수 있는 폴리아민을 세포-특이적 리간드에 커플링시킬 수도 있다. 이러한 세포-특이적 리간드들은 예를 들어 이들이 표적 세포, 바람직하게는 동물 또는 인간 표적 세포의 외부막에 결합하도록 구성할 수 있다. 표적 세포는 예를 들어 내피 세포, 근육 세포, 대식세포, 림프구, 신경교 세포, 조혈 세포, 종양 세포, 예를 들어 백혈병 세포, 바이러스에 감염된 세포, 기관지 상피 세포 또는 간세포, 예를 들어 간의 시누소이드 세포일 수 있다. 내피 세포에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어 내피 세포에 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 단편, 말단에 만노스를 보유하는 당단백질, 당지질 또는 폴리사카라이드, 사이토킨, 성장 인자 또는 부착 분자로 이루어진 군, 또는 특히 바람직한 실시양태에서 내피 세포에 대해 친화성 (tropism)을 갖는 바이러스의 엔벨로프로부터의당단백질들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 평활근 세포에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어 액틴, 세포막 수용체 및 성장 인자에 대해 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 군, 또는 특히 바람직한 실시양태에서 평활근 세포에 대해 친화성을 갖는 바이러스의 엔벨로프로부터 유도된 당단백질들로부터 선택될 수 있다. 대식세포 및(또는) 림프구에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어 대식세포 및(또는) 림프구상의 막 항원에 대해 특이적인 모노클로날 항체, 막 항원 또는 대식세포 및(또는) 림프구에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 원형 이뮤노글로불린 또는 Fc 단편, 사이토카인, 성장 인자, 말단에 만노스를 보유하는 펩티드, 단백질, 지질 또는 폴리사카라이드를 포함하는 군, 또는 특히 바람직한 실시양태에서 바이러스의 엔벨로프로부터 유도되는 당단백질들, 특히 뉴클레오티드 위치 872에서 돌연변이를 갖는 인플루엔자 C 바이러스의 HEF 단백질, 또는 촉매 삼련구조 (triad)인 세린 71, 히스티딘 368 또는 369 및 아스파르트산 261을 포함하는 인플루엔자 C 바이러스 HEF 절단 생성물로부터 선택될 수 있다. 신경교 세포에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어 신경교 세포막 구조에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편, 부착 분자, 말단에 만노스를 보유하는 펩티드, 단백질, 지질 또는 폴리사카라이드, 성장 인자를 포함하는 군, 또는 특히 바람직한 실시양태에서 담즙 세포에 대해 친화성을 갖는 바이러스의 엔벨로프로부터 유도되는 당단백질들로부터 선택될 수 있다. 조혈 세포에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어 줄기 세포 인자 수용체에 대해 특이적인 항체 또는 항체 단편, IL-1 (특히 수용체 유형 I 또는 II), IL-3 (특히 수용체 유형 α또는 β), IL-6 또는 GM-CSF, 및 또한 이러한 특이성을 나타내는 원형 이뮤노글로불린 또는 Fc 단편 및 성장 인자, 예를 들어 SCF, IL-1, IL-3, IL-6 또는 GM-CSF, 및 적절치 않은 수용체에 결합하는 이들의 단편들을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 백혈병 세포에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어 백혈병 세포상의 막 구조물, 예를 들어 CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, 시알로실-Le, CD5, CD1e, CD23, M38, IL-2 수용체, T 세포 수용체, CALLA 또는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린 또는 Fc 단편, 및 또한 성장 인자, 또는 이들로부터 유도되는 단편, 또는 레티노이드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바이러스에 감염된 세포에 특이적으로 결합하는 리간드는 예를 들어 바이러스에 의한 감염 이후에 감염된 세포의 세포막상에 발현되는 바이러스 항원에 대해 특이적인 항체, 항체 단편, 원형 이뮤노글로불린 또는 Fc 단편을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 기관지 상피 세포, 간의 시누소이드 세포 또는 간세포에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드는 예를 들어 트랜스페린, 아시알로당단백질, 예를 들어 아시알로오로소뮤코이드, 네오당단백질 또는 갈락토스, 인슐린, 말단에 만노스를 보유하는 펩티드, 단백질, 지질 또는 폴리사카라이드, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 원형 이뮤노글로불린 또는 Fc 단편을 포함하는 군, 및 특히 바람직한 실시양태에서 표적 세포에 특이적으로 결합하는 바이러스의 엔벨로프로부터 유도되는 당단백질들로부터 선택될 수 있다. 리간드의 다른 상세한 예는 예를 들어 EP-A 0 790 312 및 EP-A 0 846 772호에 개시되어 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 약물은 활성 물질 투여량 당 폴리아민 0.5 내지500 mg, 바람직하게는 투여량 당 20 내지 100 mg을 포함한다.
활성 물질로서 폴리아민 이외에도, 본 발명에 따른 약물은 또한 제약상 활성인 다른 화합물, 예를 들어 파라폭스 오비스 (예를 들어, 베이파문 (등록상표)의 형태), 파라폭스 오비스의 단편, CpG-함유 올리고뉴클레오티드, 항생제 및 세포성장억제제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약물의 제조에 사용될 수 있는 폴리아민 또는 본 발명에 따른 약물 그 자체는 바람직하게는 폴리아민이 정제 및 동결건조된 이후에 고체 형태로 존재하며, 이후 투여 직전에 적합한 수성 매질, 바람직하게는 생리학적 염화나트륨 용액에 용해시키거나, 또는 경우에 따라 수성 매질, 바람직하게는 생리학적 염화나트륨 용액에 분산시킨 후, 첨가제가 혼합된 적합한 제제로 직접 투여할 수 있다.
제제화 보조제로서 적합한 다른 것으로는 생적합성 및 생분해성 중합체, 예를 들어 폴리락티드, 폴리락티드코글리콜리드, 폴리아크릴레이트, 폴리오르토에스테르, 다가무수물, 폴리아미드, 폴리아미노산, 셀룰로스 유도체, 전분 유도체 또는 키토산 유도체가 있다.
임상적인 문제에 따라, 폴리아민-기재 약물은 전신 (예를 들어, 경구, 근육내, 피하, 복강내 또는 정맥내) 투여되거나 국소 (예를 들어 관련 기관내) 투여된다.
이와 관련하여 다수회 투여, 또는 임상적인 문제의 요건에 상응하는 시간표에 따른 장기간 처치가 필요할 수 있다.
폴리아민은 특히 그의 면역자극성, 항염증성 및 항-아폽토시스성 효과 (사이토카인 유도 및 항염증성 및 항-아폽토시스성 인자의 과다발현)로 인해 하기 질병/병소의 치료 또는 하기 질병의 예방/후-방어를 위해 사용할 수 있다.
ㆍ바이러스 감염.
잠재적인 만성의 지속성 바이러스 감염에 대한 Th1 면역 반응의 영향 (Lucin et al., 1994; Smith et al., 1994)과 면역자극제인 파라폭스 오비스의 효과에 필적하는 폴리아민의 효과 사이의 공지된 관계를 기초로, 폴리아민을 단독요법으로 또는 생물학적으로 활성인, 예를 들어 항바이러스성인 저분자량 화합물과 함께 인간 및 동물에서 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 또는 간염 유발성 바이러스 군으로부터의 임의의 다른 병원체에 의한 감염, 및 내장의 기타 바이러스 감염, 및 다른 질병에 의해 유발되는 감염을 비롯하여 다른 유형의 단순 포진 바이러스 (HSV), 다른 유형의 인간 파필로마 바이러스 (HPV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV)에 의한 감염, 및 동물에서 상응하는 바이러스성 질병에 대한 항바이러스 요법을 위해 사용할 수 있으며 이는 치료적으로 가치있는 것이다.
ㆍ 호흡기 및 내장의 급성 또는 만성 바이러스 감염.
ㆍ 스트레스로 인한 감염 또는 수술 또는 치과 치료 이후의 감염.
ㆍ 박테리아 감염, 특히 세포내 박테리아 감염.
ㆍ 암, 종양.
ㆍ 기관 섬유증, 특히 간 섬유증 또는 바이러스성 간염 이후의 간경변 또는에탄올-유발성 간 질병 및 낭성 섬유증.
ㆍ 콜라겐 침착 증가에 의해 유발되는 질병, 내장, 예를 들어 간, 및 피부 및 그의 부속기관은 모두 상기 콜라겐 침착과 관련하여 영향을 받을 수 있음.
ㆍ 눈을 비롯하여 내장, 피부, 혈액 또는 중추신경계 및 그의 부속기관의 염증성, 퇴행성 및 증식성 질병.
ㆍ 알러지성 질환의 군, 특히 전신성 알러지의 개시 방지 또는 국소성 알러지 또는 천식과 관련하여 사용되는 경우.
폴리아민은 또한 보조제로 사용할 수도 있다.
실시예 1
선형 폴리에틸렌이민 (LPEI)의 합성:
2-에틸옥사졸린을 양이온성 개환 중합시켜 폴리(에틸옥사졸린)을 얻고 (문헌 (Rivas & Ananias, 1992)과 유사), 이후 산으로 가수분해하고 프로판산을 제거하여 선형 폴리에틸렌이민을 합성하였다. 여러 전구 중합체 (폴리(에틸옥사졸린))는 또한 상업적으로 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany) 입수할 수 있었다. 전구 중합체를 겔 투과 크로마토그래피, 1H NMR 및 FT-IR에 의해 특성화하였다.
예를 들어 폴리(에틸옥사졸린) (Mw 200,000 g/mol) 24.7 g을 100 ℃에서 물 40 ml 및 진한 염산 40 ml로 이루어진 혼합물 중에서 반응시켜 정량적 가수분해를 수행하였다. 24시간 후, 형성된 많은 침전물에 물 250 ml를 가하여 용해시켰다. 20 ℃로 냉각시킨 다음, 20％ NaOH를 가하여 생성물을 pH 11로 조절하고, 침전시켰다. 침전물을 흡입에 의해 여과 제거하고 세척한 후 (물 (pH 7)로 세척), 고 진공하에 오산화인 상에서 건조시켰다. 이어서, 조 생성물을 에탄올로부터의 재결정화하였다 (수율 9.5 g/88％). 폴리에틸렌이민의 포화 수용액 (pH 7)을 용출제로 밀리포어 (Millipore) 물을 사용하여 세파덱스 G25 (Pharmacia 일회용 PD-10 탈염 컬럼)를 통한 컬럼 크로마토그래피로 처리한 다음, 동결 건조시켜 고도로 순수한 배치 (batch)(밀리그램 양)를 얻었다.
선형 폴리에틸렌이민을 1H NMR 및 FT-IR에 의해 특성화함으로써, 가수분해가 정량적이었음을 확인할 수 있었다.
실시예 2
예로서 C18-알킬기 3 mol％를 Mw 87,000 g/Mol의 LPEI로 도입하는 것에 의한 소수성 관능화된 선형 폴리에틸렌이민 (H-LPEI)의 합성
이 경우, LPEI 0.5 g을 60 ℃에서 아르곤하에 에탄올 10 ml 중에 용해시키고, 염화옥타데실 0.11 g (0.13 ml)을 천천히 첨가한 다음, 혼합물을 17시간 동안 교반하였다. 20 ℃에서 물 20 ml를 가하여 반응 생성물을 침전시킨 다음, 여과시키고, 물 (세척용 물, pH 7)로 세척하고, 고 진공하에 오산화인 상에서 건조시켰다 (수율 0.48 g/96％). 폴리에틸렌이민의 포화 수용액 (pH 7)을 용출제로 밀리포어 물을 사용하여 세파덱스 G25 (Pharmacia 일회용 PD-10 탈염 컬럼)를 통한 컬럼 크로마토그래피로 처리한 다음, 동결 건조시켜 고도로 순수한 배치 (밀리그램 양)를 얻었다.
알킬화된 선형 폴리에틸렌이민을 1H NMR 및 FT-IR에 의해 특성화함으로써,목적하는 정도의 알킬화가 일어났음을 확인할 수 있었다.
실시예 3
예로서 C18-아실기 3 mol％를 Mw 87,000 g/Mol의 LPEI로 도입하는 것에 의한 소수성 관능화된 선형 폴리에틸렌이민 (H-LPEI)의 합성
이 경우, LPEI 0.5 g을 50 ℃에서 아르곤하에 에탄올 10 ml 중에 용해시키고, 염화옥타데카노일 0.11 g (0.12 ml)을 천천히 첨가한 다음, 혼합물을 20시간 동안 교반하였다. 여과 후, 반응 혼합물을 진공에서 정량적으로 농축시켰다. 잔류물을 가열하에 에탄올 4 ml 중에 용해시키고, 20 ℃에서 물 8 ml를 가하여 생성물을 침전시켰다. 여과시키고, 물 (세척용 물, pH 7)로 세척한 다음, 침전물을 고 진공하에 오산화인 상에서 건조시켰다 (수율 0.38 g/76％). 폴리에틸렌이민의 포화 수용액 (pH 7)을 용출제로 밀리포어 물을 사용하여 세파덱스 G25 (Pharmacia 일회용 PD-10 탈염 컬럼)를 통한 컬럼 크로마토그래피로 처리한 다음, 동결 건조시켜 고도로 순수한 배치 (밀리그램 양)를 얻었다.
아실화된 선형 폴리에틸렌이민을 1H NMR 및 FT-IR에 의해 특성화함으로써, 목적하는 정도의 아실화가 일어났음을 확인할 수 있었다.
실시예 4
예로서 케노데옥시콜산 (CDC)기 (3α,7α-디히드록시-5β-콜란산) 3 mol％를 Mw 87,000 g/Mol의 LPEI로 도입하는 것에 의한 소수성 관능화된 선형 폴리에틸렌이민 (H-LPEI)의 합성
이 경우, N-히드록시숙신이미드를 사용하여 케노데옥시콜산 (Sigma-AldrichChemie GmbH)을 반응성 에스테르 화합물로 전환시켰다. 케노데옥시콜산 1 g 및 N-히드록시숙신이미드 0.32 g을 디메톡시에탄 5 ml 중에 용해시키고, 디시클로헥실카르보디이미드 0.63 g과 0 내지 5 ℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반하고, 침전물을 여과한 다음, 여과물을 진공 농축시켰다. 반응성 에스테르를 고 진공하에 건조시키고 (안정한 포말체) 1H NMR에 의해 특성화하였다. 임의의 추가의 정제 없이, 케노데옥시콜산 반응성 에스테르 179 mg을 실온 및 아르곤하에 에탄올 10 ml 중 LPEI 0.5 g의 용액에 가하였다. 이후, 반응 혼합물을 50 ℃에서 20시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음, 물 25 ml를 가하여 생성물을 침전시켰다. 잔류물을 여과시키고 물 (세척용 물, pH 7)로 세척하고, 고 진공하에 오산화인 상에서 건조시켰다 (수율 0.41 g/82％). 폴리에틸렌이민의 포화 수용액 (pH 7)을 용출제로 밀리포어 물을 사용하여 세파덱스 G25 (Pharmacia 일회용 PD-10 탈염 컬럼)를 통한 컬럼 크로마토그래피로 처리한 다음, 동결 건조시켜 고도로 순수한 배치 (밀리그램 양)를 얻었다.
반응성 에스테르 방법을 이용하여 아실-관능화된 선형 폴리에틸렌이민을 1H NMR 및 FT-IR에 의해 특성화함으로써, 목적하는 정도의 아실화가 일어났음을 확인할 수 있었다.
실시예 5
제타 전위 측정
제타 전위 측정은 생리학적 pH에서 수용액 중 선형 폴리에틸렌이민 및 소수성 관능화된 폴리에틸렌이민의 전하 또는 양성자화도를 측정하여 수행하였다. 평균 양성자화도는 평균 분자량 및 중합체의 유형과는 독립적으로 pH 7에서 대략 50％인 것으로 나타났으며, 즉 pH 7의 수용액에서 질소 원자의 약 50％가 양성자화되었다.
실시예 6
모든 폴리에틸렌이민 (LPEI, H-LPEI)의 스탁 용액을 pH 7의 생리학적 염화나트륨 용액에서 제조하였으며, 각 경우에서 폴리에틸렌이민의 농도는 0.5 mg/ml이었다. 이 경우, LPEI 또는 H-LPEI 25 mg을 가열하면서 용해시키고, 물 또는 생리학적 염화나트륨 용액 30 ml 중에서 잠깐 초음파분해한 다음, 생성된 용액을 0.1 N HCl을 사용하여 pH 7로 조절하고, 최종 부피를 50 ml로 하였다. 스탁 용액을 여과 (0.2 ㎛)에 의해 멸균하였으며, 20 ℃에서 장기간 보관할 수 있었다.
면역치료제로서 사용하기 위한 폴리아민, 특히 폴리에틸렌이민의 적합성을 실증하기 위해, 폴리아민의 인터페론 γ-자극 효과를 생체내에서 입증하였으며, 이후 폴리아민의 생체내 효능을 입증하였다.
1. 마우스 비장 세포 분석에서 IFN-γ의 유도
a) 동물 관리
NMRI 마우스 (이종교배된 종, 암컷, 체중 18 내지 20 g)를 실험 시작 8일 전 찰스 리버 (Charles River)(Sulzfeld, Germany)사로부터 구입하였다. 동물이 사료 및 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하고, 인공적인 주간/야간 반복 (07:00부터 19:00시까지는 조명 유지, 19:00부터 익일 07:00시까지는 암조건)하에 유지하였다.
b) 마우스 비장 세포의 준비
동물을 경추탈구에 의해 희생시킨 후, 비장을 적출하였다. 비장에서 부착성 결합 조직을 제거하고, 하기 프로토콜에 따라 처리하였다.
비장을 금속 체 (메쉬 폭 약 70 ㎛)상에 놓고 (페트리 디쉬), 한쌍의 가위를 사용하여 잘게 썰었다. 이후, PBS 5 ml를 가하고, 유리 막자를 사용하여 조직 단편을 눌러 체를 통과시켰다. 이어서, 체를 PBS로 수회 씻어내고, 세포를 PBS 총 50 ml로 하여 팰콘 (Falcon) 튜브로 옮긴 다음, 300 ×g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 PBS 20 ml 중에 재현탁시킨 다음, 300 ×g로 10분 동안 다시 한번 원심분리하였다. 세포를 배지 5 내지 10 ml 중에 재현탁시킨 다음, 세포수를 측정하고, 배지를 사용하여 ml 당 세포수를 2.5 ×106개로 조절하였다.
c) 마우스 비장 세포의 자극
자극을 37 ℃ 및 5％ CO2에서 72시간 동안 24-웰 플레이트에서 1 ml의 부피로 수행하였다. 2 ×106개의 비장 세포를 총 부피 1 ml (배지 0.8 ml: RPMI, 10％ FCS, 1％ 페니실린/스트렙토마이신)로 자극하였다. 자극제의 수에 따라, 각 분석에서 하기 물질들을 함께 혼합하였다.
2.5 ×106세포/ml를 포함하는 배지 800 ㎕
자극제 (폴리에틸렌이민, 0.5 mg/ml) 100 ㎕
PBS 100 ㎕
모든 비장 세포 자극을 2회 반복하여 수행하였다.
자극의 종료 후, 상청액을 1.5 ml 들이 반응 튜브에 옮기고, 잔류 세포를 300 ×g로 10분 동안 원심분리하여 분리하였다. 세포-무함유 상청액을 제거하고, -20 ℃에서 보관한 다음, ELISA에 의해 IFN-γ를 측정하였다.
d) IFN-γ농도의 측정
마우스 IFN-γOptEIA (등록상표)-ELISA 세트 (Pharmingen, Heidelberg, Germany)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 자극 상청액 중 IFN-γ의 농도를 결정하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
시험된 폴리에틸렌이민은 마우스 비장 세포 분석에서 IFN-γ의 유의한 유도를 나타내었다.
2. 생체내 IFN-γ유도
a) 마우스 관리
NMRI 마우스 (이종교배된 종 HdsWin:NMRI, 암컷, 체중 18 내지 20 g, Harlan/Winkelmann (Borchen, Germany)사로부터 구입)를 오토클레이브가능한 우드 쉐이빙-라인드 (wood shaving-lined) 폴리카르보네이트 박스, 20 내지 22 ℃의 S2 격리용 우리 (대기 습도 50 내지 60％) 및 인공적인 주간/야간 반복 (06:30분부터 18:30분까지는 조명 유지, 18:30분부터 익일 06:30분까지는 암조건)하에 유지하였다. 동물이 사료 및 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
b) 실험 수행
동물을 무작위로 나누어 각 군이 6마리의 동물로 구성된 2개의 군으로 분류되도록 하였다. 이들의 도착 후, 마우스를 처음 3일 동안은 어떤 추가의 처리 없이 작은 우리안에 넣어 두었다.
분석할 물질을 0.2 ml의 부피로 복강내 투여하였다. 다음과 같은 처리 계획을 이용하였다.
1군: 위약:PBS
2군: 폴리에틸렌이민, H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％, 실시예 3에 따름 (마우스 당 0.1 mg).
처리하고 나서 9시간 후, 마우스를 희생시키고, 복부를 빙냉 PBS 5 ml로 씻어내어 복막 세포를 얻었다.
세포를 원심분리 단계 (16,000 ×g로 30초, 실온)에 의해 농축시키고, 상청액을 따라내고, NucleoSpin RNA II 키트 (Machery-Nagel, Dueren, Germany)를 사용하여 세포 중 총 RNA를 추출하였다.
이 경우, 세포 펠릿을 (NucleoSpin RNA II 키트로부터의) RA1 완충액 400 ㎕ 중에 재현탁시키고, -80 ℃에서 동결시켰다. 37 ℃에서 해빙시킨 다음, 혼합물을 그의 점도 감소를 위해 NucleoSpin 필터상에 로딩하고, 1분 동안 원심분리하였다 (16,000 ×g, 실온). 에탄올 300 ㎕를 여과물에 가하고, 혼합물을 NucleoSpin RNA 컬럼상에 로딩하였다. 원심분리 (8,000 ×g에서 30초)하고, 여과물을 제거하고, 이어서 컬럼을 원심분리 건조 (1분, 16,000 ×g)로 처리한 후, DNA를 DNaseI으로 절단하였다. 이 경우, DNase 반응 완충액 90 ㎕를 DNaseI (이들 둘 다는NucleoSpin RNA II 키트로부터 얻음) 10 ㎕와 함께 혼합하고, 이 용액 95 ㎕를 건조 필터에 가하였다. (실온에서) 15분 동안 인큐베이션한 다음, 필터를 먼저 RA2 500 ㎕로 세척한 다음, RA3 600 ㎕로 세척하고, 이후 RA3 250 ㎕로 세척하였다 (이들은 모두 NucleoSpin RNA II 키트로부터 얻음). 이를 수행하기 위해, 세척용 완충액을 가하고, 각 경우에서 컬럼을 8,000 ×g로 30초 동안 원심분리한 다음, 마지막 세척 단계 후, 16,000 ×g로 2분 동안 원심분리하였다. 이후, RNA를 RNase-무함유 증류수 60 ㎕ 중에서 용출시켰다 (16,000 ×g로 1분).
RNA의 양을 광도 측정에 의해 확인하였다.
중합효소 반응을 위한 프라이머로 랜덤 육합체를 사용하여 RNA를 역전사함으로써 cDNA를 합성하였다. 이와 관련하여 TaqMan 역전사 시약 (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)을 사용하였다. 합성은 100 ㎕로 수행하였다.
합성 혼합물의 조성은 다음과 같았다.
ㆍ RNA 1,300 내지 1,500 ㎍
ㆍ RT 완충액 (10×) 10 ㎕
ㆍ MgCl2(25 mM) 22 ㎕
ㆍ 랜덤 육합체 5 ㎕
ㆍ MultiScribe RT 2.5 ㎕
ㆍ RNase 억제제 2 ㎕
ㆍ dNTP 20 ㎕
ㆍ RNase-무함유 물 (총 부피를 100 ㎕로 함)
혼합물을 먼저 25 ℃에서 10분에 이어서 48 ℃에서 30분 동안 GeneAmp 2400 Thermocycler (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)에서 인큐베이션한 다음, +4 ℃로 냉각시켰다. 이러한 방식으로 합성된 cDNA를 -20 ℃에서 보관하였다.
PRISM (등록상표) 5700 ABI (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 이러한 목적을 위해 쥐의 IFN-γ(Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)에 대해 PDAR (미리 개발된 TaqMan (등록상표) 분석 시약) 키트를 사용하였다.
PDAR 키트를 사용하고 하우스키핑 유전자 (18S RNA), "내인성 조절 리보좀 RNA 조절 (18S RNA)"로 보조하여 cDNA의 양을 표준화하였다.
캘리브레이터 (calibrator) cDNA를 사용하여 유도를 표준화하고 계산하였다. 이 cDNA는 상기 1군에 따라 처리된 11마리의 다른 마우스로부터의 cDNA 혼합물로 구성되었다.
각 경우에서 50 ㎕의 부피로 증폭을 수행하였으며, 이들의 조성은 다음과 같았다:
내생성 18S RNA 조절:
ㆍ cDNA 1 ng
ㆍ 2 ×Taqman Universal PCR Master Mix 25 ㎕
ㆍ 18S RNA 2.5 ㎕
ㆍ RNase-무함유 물 (총 부피를 100 ㎕로 함)
IFN-γ검출:
ㆍ cDNA 10 ng
ㆍ 2 ×Taqman Universal PCR Master Mix 25 ㎕
ㆍ IFN-γ프라이머 2.5 ㎕
ㆍ RNase-무함유 물 (총 부피를 100 ㎕로 함)
50 ℃에서 2분 동안 인큐베이션하고 이후 초기 변성 (95 ℃, 10분)시킨 다음, 변성 (94 ℃, 15초) 및 어닐링/연장 (60 ℃, 1분)의 45 사이클을 수행하였다. 생성물을 분석하기 위해, GeneAmp (등록상표) 5700 서열 검출 시스템 소프트웨어 (v. 1.3)를 사용하였다.
아래과 같은 결과를 얻었다:
폴리에틸렌이민 H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％로 처리하고 나서 9시간 후, 생체내에서 인터페론-γ의 발현을 유도하였다 (도 2 참조). 동물에 따라, 상기 유도는 캘리브레이터보다 16 내지 120배 더 높았다. 한편, 처리되지 않은 동물 또는 PBS로 처리된 동물은 캘리브레이터의 발현보다 0.9배에서 7배까지 달라지는 인터페론-γ발현을 나타내었다.
3. 아우제스즈키 (Aujeszky) 마우스 모델에서 면역자극 효과의 검출
아우제스즈키 마우스 모델은 여러 면역자극제 (예, 베이파문 (등록상표) 및 CpG-올리고뉴클레오티드)의 효과를 검출하기 위한 생체내 스트레스 모델이다.
a) 마우스 관리
NMRI 마우스 (이종교배된 종 HdsWin:NMRI, 암컷, 체중 18 내지 20 g,Harlan/Winkelmann (Borchen, Germany)사로부터 구입)를 오토클레이브가능한 우드 쉐이빙-라인드 폴리카르보네이트 박스, 20 내지 22 ℃의 S2 격리용 우리 (대기 습도 50 내지 60％) 및 인공적인 주간/야간 반복 (06:30분부터 18:30분까지는 조명 유지, 18:30분부터 익일 06:30분까지는 암조건)하에 유지하였다. 이들이 사료 및 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
b) 스트레스 모델
조사를 위해, 군 당 10마리의 마우스를 포함하는 마우스 군을 형성시켰다. 각 경우에서 어떤 한 군의 동물들에게 동일한 시험 물질을 제공하였다.
도착 후, 마우스를 2 내지 3일 동안 작은 우리안에 넣어 두었다. 이후, 폴리에틸렌이민 (출발 농도 0.5 mg/ml)을 생리학적 NaCl 용액 (pH 7.6)을 사용하여 1:10 및 1:100으로 희석시켰다. 이 용액을 마우스 당 0.2 ml의 속도로 복강내 투여하였다.
처리하고 나서 24시간 후, 마우스에게 슈도래비스 바이러스 종 하노버 (Hannover) H2를 복강내 투여하여 스트레스를 주었다. 이 경우, 바이러스를 PBS 중에 희석시켜 103.8내지 104.1TCID50/ml의 스트레스 역가를 제공한 다음, 이 현탁액 0.2 ml를 투여하였다.
음성 대조군으로, 마우스 군을 생리학적 NaCl 용액으로 처리한 다음, 스트레스를 주었다.
이 군의 마우스는 스트레스를 받은지 3 내지 8일 후 사망하였다. 높은 비율의 폴리에틸렌이민으로 처리된 마우스는 슈도래비스 바이러스에 의한 감염으로부터 생존하였다. 실험은 스트레스를 주고 나서 10일 후 종결시켰다.
유도된 면역자극의 강도는 NaCl 대조군 및 시험군에서 사망한 마우스를 비교하여 결정하였으며, 효능 지수를 이용하여 정량하였다. 이는 아우제스즈키 바이러스의 치명적인 효과로부터 보호된 마우스의 퍼센트 수치를 시험되는 물질로 면역자극한 결과로서 구체화한 것이다. 이는 하기 식을 이용하여 계산하였다:
EI = (b - a)/b ×100
상기 식에서, b는 대조군에서 사망한 마우스의 퍼센트를 나타내며, a는 시험군에서 사망한 마우스의 퍼센트를 나타낸다.
결과 (도 3 참조):
| 물질, 농도, 마우스 당 투여량 | 사망한 동물의합계 | 효능 지수 EI | |
| 1 | NaCl | 9 | - |
| 2 | H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％, 0.5 mg/ml(마우스 당 0.1 mg) | 1 | 89 |
| 3 | H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％, 0.05 mg/ml(마우스 당 0.01 mg) | 3 | 67 |
| 4 | H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％, 0.005 mg/ml(마우스 당 0.001 mg) | 5 | 44 |
| 5 | H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％, 0.5 mg/ml(마우스 당 0.1 mg) | 1 | 89 |
| 6 | H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％, 0.05 mg/ml(마우스 당 0.01 mg) | 2 | 78 |
| 7 | H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％, 0.005 mg/ml(마우스 당 0.001 mg) | 7 | 22 |
아우제스즈키 마우스 모델에서 폴리에틸렌이민의 여러 농도를 시험한 결과, 놀랍게도 하기와 같은 결과가 입증되었다:
ㆍ 각 경우에서 H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％, 또는 H-LPEI, Mw:87,000, CDC 아실, 3 mol％ 0.1 또는 0.01 mg으로 마우스를 처리하고 나서, 효능 지수 60％ 이상의 유의한 면역자극이 입증되었다.
ㆍ 각 경우에서 두 폴리에틸렌이민 H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％, 및 H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％를 여러 농도로 사용했을 때 투여량/효과 관계가 입증되었다.
4. PIQOR (등록상표) cDNA 배열 시스템을 사용한, 쥐의 복막 세포에서 유전자 발현에 대한 폴리에틸렌이민 H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％, 및 H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％의 효과 분석 (생체내)
a) 동물 관리
NMRI 마우스 (이종교배된 종, 암컷, 체중 18 내지 20 g)를 실험 시작 8일 전 찰스 리버 (Charles River)(Sulzfeld, Germany)사로부터 구입하였다. 동물이 사료 및 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하고, 인공적인 주간/야간 반복 (07:00시부터 19:00시까지는 조명 유지, 19:00시부터 익일 07:00시까지는 암조건)하에 유지하였다.
b) 실험 과정
동물을 무작위로 나누어 각 군이 4마리의 동물로 구성된 3개의 군으로 분류되도록 하였다. 분석할 물질을 0.2 ml의 부피로 복강내 투여하였다. 다음과 같은 처리 계획을 이용하였다.
1군: 위약:생리학적 NaCl 용액
2군: 폴리에틸렌이민, H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％ (마우스 당0.1 mg)
3군: 폴리에틸렌이민, H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％ (마우스 당 0.1 mg)
처리하고 나서 6시간 후, 마우스를 희생시키고, 복부를 배지 (DMEM, 5％ FCS) 10 ml로 씻어내어 복막 세포를 단리하였다.
이후, 세포를 원심분리 (300 ×g로 10분, 실온)에 의해 농축시킨 다음, RNA 추출을 위해 즉시 사용하거나, 우선 적혈구를 용해시키는 처리를 하였다.
적혈구 용해
적혈구 용해를 위해, 펠릿화된 복막 세포를 PBS 1 ml 중에 재현탁시킨 다음, 용해 완충액 (0.17 M Tris 10 ml, pH 7.2 + 0.16 M NH4Cl 90 ml, pH 7.2) 10 ml를 가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 300 ×g로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 따라내고, 세포를 PBS 10 ml로 세척하고, 다시 한번 원심분리 (300 ×g로 10분)하였다.
총 RNA의 제조
RNeasy 미니 키트 (QIAGEN, Hilden, Germany)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 복막 세포로부터의 총 RNA를 제조하였다. 이와 관련하여, 각 경우에서 2개의 배치를 혼합하여 처리하였다.
각 경우에서 4마리의 동물로부터 유래하는 복막 세포로부터의 총 RNA 수율은 RNA 10 내지 20 ㎍이었다.
RNA의 중간 증폭
문헌 (Eberwine et al. (1992))의 프로토콜에 기초한 방법을 이용하여 RNA의 중간 증폭을 수행하였다. 이는 총 RNA의 시료로부터 mRNA를 증폭시키는 것을 포함한다.
cDNA 배열
Memorec Stoffel GmbH (Cologne, Germany)사로부터의 PIQOR (등록상표) cDNA 배열 시스템을 사용하여 유도 및 억제된 유전자를 분석하였다. 이와 관련하여, 면역학적으로 관련된 유전자 (인터루킨, 분화 클러스터 (CD), 전사 인자, 수용체 등)로부터 유도된 cDNA를 칩상에 로딩하였다.
증폭된 RNA를 혼성화에 사용하였다. 각 경우, 증폭된 RNA 2 ㎍을 RT 반응에서 cDNA로 전사시키고, 이와 동시에 형광-표지된 뉴클레오티드를 혼입시켰다. 대조군은 Cy3로 표지하였으며, 샘플은 Cy5로 표지하였다.
하기 혼성화를 제조자에 의해 특정된 프로토콜 (PIQOR (등록상표) cDNA 배열 시스템, 에디션 2.6, 2000년 2월)에 따라 수행하고, 결과를 평가하였다.
| 투여 물질 | 표지 |
| H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％,(마우스 당 0.1 mg) | Cy3: NaCl 대조군Cy5: H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％ |
| H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％,(마우스 당 0.1 mg) | Cy3: NaCl 대조군Cy5: H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％ |
각 경우에서 비교된 샘플들 (각각 Cy3 및 Cy5 신호) 중 하나 이상과 관련된 신호들만이 혼성화 신호를 평가했을 때 분석된 2가지 음성 대조군 (염 및 청어 정액 DNA)의 평균치보다 2배 이상 더 강한 신호를 나타냈다. 유전자 발현을 결정하는데 있어서 2배 넘는 발현 차이를 나타낸 유전자의 신호들만이 포함되었다.
결과:
하기 표는 cDNA 분석에 대한 요약을 제공한다. 2.0을 넘는 수치는 (A)에서 각 mRNA의 발현에 있어서 특이적 증가를 나타내지만, -2.0 미만의 수치는 (B)에서 억제를 나타낸다. 폴리에틸렌이민으로 자극한 후, 과다발현된 것은 특히 항염증성 또는 항-아폽토시스성 인자였다. 강한 항염증성 효과를 부여하는 것으로 문헌 (Brown et al., 1996; Bossu et al., 1995)에 기재되어 있는 인터루킨-1 수용체 유형 2의 발현 증가는 매우 높았다. FERHA (페리틴-중쇄 mRNA)의 발현은 항염증성 또는 항-아폽토시스성인 것으로 기재되어 있다 (Weiss et al., 1997; Oberle & Schroder, 1997). 또한 MCL-1이 2.88로 증가하는 것은 항-아폽토시스성 효과를 갖는 중합체를 나타낸다 (Fujise et al., 2000).
PIQOR (등록상표) cDNA 배열 시스템을 사용한, 쥐의 복막 세포에서 유전자 발현에 대한 폴리에틸렌이민 H-LPEI, Mw 87,000, C18 아실, 3 mol％, 및 H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％의 효과 분석 (생체내)
A) 유도된 유전자
| 번호 | 명칭 | H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％ | H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％ |
| 219 | CD121b/인터루킨-1 수용체, 유형 2 | 21.99 | 47.92 |
| 201 | CD62/L-셀렉틴 | 4.45 | 4.13 |
| 119 | FERHA 페리틴 중쇄 mRNA | 3.15 | 4.80 |
| 363 | 림포톡신-베타 | 3.13 | 3.51 |
| 139 | MCL1 | 2.87 | 2.88 |
| 204 | CD52 | 2.65 | 2.49 |
| 85 | CD128/고 친화성 인터루킨 8 수용체 A | 2.52 | 2.98 |
| 319 | CKR1 C-C 케모카인 수용체 유형 1 (MIP-1 알파-R)(RANTES-R) | 2.44 | 2.32 |
| 360 | BFL1 | 2.37 | 3.52 |
| 293 | 인터루킨 18 | 2.34 | -1.00 |
| 68 | SYCL-시스테닌 | 2.32 | 2.06 |
| 296 | 인터루킨 15 | 2.27 | 1.23 |
| 294 | CD24 | 2.21 | 1.58 |
| 67 | Fgr 티로신 키나제 Fgr (Src2) | 2.03 | 2.04 |
| 131 | GDF3 성장/분화 인자 3 전구체 | 2.03 | 2.47 |
| 152 | CD87/유로키나제 플라스미노겐 활성자 표면 수용체 | 1.95 | 2.37 |
| 203 | GTPA GRPASE-활성화 단백질 (RAS P21 단백질 활성자) | 1.77 | 2.76 |
| 30 | Fas/CD95 | 1.53 | 2.69 |
| 234 | 프로테오좀 이오타 서브유닛 (Glast) | 1.33 | 2.35 |
| 107 | PRDC | 1.32 | 2.00 |
| 377 | ENIGMA | 1.13 | 2.09 |
| 358 | FMLR FMET-LEU-PHE 수용체 (FMLP 수용체) | 1.06 | 3.82 |
| 192 | AA2B 아데노신 A2B 수용체 | 0.00 | 2.14 |
B) 억제된 유전자
| 번호 | 명칭 | H-LPEI, Mw: 87,000, C18 아실, 3 mol％ | H-LPEI, Mw: 87,000, CDC 아실, 3 mol％ |
| 215 | TGF2 변형 성장 인자 베타 2 전구체 (TGF-베타 2) | -10.72 | -9.06 |
| 308 | EMR1 세포 표면 당단백질 EMR1 전구체 | -10.07 | -5.67 |
| 390 | CD49f/인테그린 알파-6 | -3.53 | -8.74 |
| 287 | CD29/인테그린 베타-1 | -3.46 | -1.81 |
| 109 | ETBR 엔도텔린 B 수용체 전구체 (ET-B) | -3.04 | -2.70 |
| 280 | RDC1 G 단백질-커플링된 수용체 RDC1 동족체 | -2.87 | -2.48 |
| 216 | CD136/대식세포-자극 단백질 수용체 | -2.77 | -2.91 |
| 297 | CD2 | -2.73 | -2.46 |
| 225 | CD115/대식세포 콜로니 자극 인자 I 수용체 | -2.67 | -1.49 |
| 285 | CD36 혈소판 당단백질 IV | -2.58 | -2.54 |
| 57 | APRIL | -2.36 | -2.14 |
| 3 | 액틴 | -2.35 | -1.89 |
| 61 | CD81/AAPA1 | -2.33 | -2.72 |
| 330 | CD147/바시긴 (Basigin) | -2.26 | -2.03 |
| 347 | CD107a/LAMP1 | -2.13 | -1.62 |
| 257 | CD79a | -2.04 | -1.77 |
| 156 | GBAF 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질 G(OLF), 알파 서브유닛 | -1.75 | -2.05 |
| 376 | GAS3/PMP22 | 0.00 | -2.95 |
| 406 | P2Y5 P2Y 퓨리노셉터 5 (PSY5) (퓨린작동성 수용체 5) | 0.00 | -2.04 |
<참고문헌>
Claims (28)
- 활성 물질로서 폴리아민을 포함하는 약물.
- 제1항에 있어서, 폴리아민이 소수성 치환체를 갖는 것을 특징으로 하는 약물.
- 제2항에 있어서, 상기 치환체가 측쇄 또는 말단으로서 배열되는 것을 특징으로 하는 약물.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 치환체가 알킬쇄, 아실쇄 또는 스테로이드형 치환체이며, 또한 폴리아민 주쇄의 질소 관능기를 이소시아네이트 또는 α,β-불포화 카르보닐 화합물로 부가함으로써 도입될 수 있는 소수성 치환체인 것을 특징으로 하는 약물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아민이 폴리에틸렌이민인 것을 특징으로 하는 약물.
- 제5항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로하는 약물.상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,R1은 수소, 메틸 또는 에틸이고,R2는 탄소원자수 1 내지 23의 알킬이고,R3및 R4(말단기)는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소원자수 1 내지 24의 알킬이거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,R5(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체이고,평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1)이며, 단위 m 및 n은 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
- 제5항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 약물.상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,R1은 수소, 메틸 또는 에틸이고,R2는 탄소원자수 1 내지 22의 알킬이고,R3및 R4(말단기)는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소원자수 1 내지 24의 아실이거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,R5(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체이고,평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1)이며, 단위 m 및 n은 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
- 제5항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 약물.상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,R1, R2및 R3는 수소 또는 히드록실이고,R4및 R5(말단기)는 서로 독립적으로 수소 또는 스테로이드 모 (parent) 물질, 특히 담즙산이거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,R6(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체이고,평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1)이며, 단위 m 및 n은 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
- 제5항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 약물.상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,R1은 OR4또는 NR4R5이며, 여기서 R4및 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소원자수 1 내지 24의 알킬이고,R2및 R3(말단기)는 서로 독립적으로 중합체 주쇄의 질소 원자의 치환체에 상응하거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,R6(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체이고,평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위이고, 여기서 n = a ×P (0.0001 < a < 0.1)이며, 단위 m 및 n은 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
- 제5항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 약물.상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,R1은 탄소원자수 1 내지 24의 알킬이고,R2및 R3(말단기)는 서로 독립적으로 중합체 주쇄의 질소 원자의 치환체에 상응하거나, 개시제에 의존하는 구조를 갖고,R4(말단기)는 종결 반응에 의존하는 치환체이고,평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위이고, 여기서 n = a ×P(0.0001 < a < 0.1)이며, 단위 m 및 n은 중합체내에 랜덤하게 분포되어 있다.
- 제5항에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민이 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 약물.상기 식 중 각각의 [CH2-CH2-N] 단위에서,라디칼 R은 수소 또는 화학식의 라디칼이며, 여기서 RX는 수소 또는 타입 R의 라디칼일 수 있고,각각의 [CH2-CH2-N] 단위 및 말단기는 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 언급된 치환체를 보유할 수 있으며,평균중합도 P = (m + n)은 45 내지 5,250의 범위이다.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아민의 분자량이 220,000 g/mol 미만인 것을 특징으로 하는 약물.
- 제12항에 있어서, 상기 폴리아민의 분자량이 2,000 내지 100,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 약물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아민이 세포-특이적 리간드에 커플링되는 것을 특징으로 하는 약물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제제화 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
- 약물로서 사용하기 위한 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의 면역자극 약물의 제조에서의 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의 바이러스 감염 치료용 또는 바이러스 감염 예방용 약물의 제조에 있어서의 용도.
- 제18항에 있어서, 상기 감염이 파필로마 바이러스, 헤르페스 그룹의 바이러스, 간염 바이러스 또는 HIV에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제18항에 있어서, 상기 감염이 호흡기 또는 내장의 감염인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제18항에 있어서, 상기 예방이 스트레스로 인한 감염 또는 수술 또는 치과 치료 후 감염의 예방인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의 박테리아 감염 치료용 약물의 제조에서의 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의 암 또는 종양 치료용 약물의 제조에서의 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의 기관 섬유증 치료용 또는 기관 섬유증 예방용 약물의 제조에서의 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의, 콜라겐 침착 증가에 의해 유발되는 질병 치료용 약물의 제조에서의 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의, 눈을 비롯하여 내장, 피부, 혈액 또는 중추신경계 및 그의 부속기관의 염증성, 퇴행성 및 증식성 질병 치료용 약물의 제조에서의 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의, 알러지성 질환 그룹의 질병, 특히 천식 치료용 약물의 제조에서의 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 폴리아민의 보조제로서의 용도.
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