JP2004518432A - 遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリー - Google Patents
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Abstract
抗体ペプチド、抗体ポリペプチド、および抗体タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの焦点を合わせた多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリー。これらのライブラリーは、ネイティブヒト抗体において見出される多様性を模倣する、長さおよび配列の多様性を有する。
Description
【０００１】
本出願は、２００１年１２月１８日に出願した米国特許仮出願６０／２５６，３８０号の、米国特許法第１２０条の下での利益を請求する。この仮出願およびそれに添付された表は、本明細書中で参考として特に援用される。
【０００２】
本発明は、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを各々が提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつそのファミリーの焦点を合わせた多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーに関する。本発明のライブラリーの焦点を合わせた多様性は、配列多様性および長さの多様性の両方を含む。好ましい実施形態において、本発明のライブラリーの焦点を合わせた多様性は、選択されたファミリーの天然の多様性へと偏向している。より好ましい実施形態において、このライブラリーは、ヒト抗体の天然の多様性へと偏向しており、そしてそれらの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）における多彩さにより特徴付けられる。
【０００３】
本発明はさらに、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の焦点を合わせた多様性ファミリーを提示するためか、または提示しかつ発現するための、ベクターおよび遺伝的パッケージ（例えば、細胞、胞子、またはウイルス）に関する。好ましい実施形態において、この遺伝的パッケージは、繊維状ファージまたはファージミドあるいは酵母である。また、このファミリーの焦点を合わせた多様性は、配列の多様性および長さの多様性を含む。
【０００４】
本発明はさらに、本発明の焦点を合わせたライブラリーをスクリーニングする方法、ならびにこのようなスクリーニングにより同定されたペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に関する。
【０００５】
（発明の背景）
ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつそのファミリーのアミノ酸の多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、遺伝的パッケージのライブラリーを調製することは、当該分野における現在一般的な実務である。多くの一般的なライブラリーにおいて、そのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、抗体（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、抗体全体、またはミニ抗体（すなわち、ＶＬに連結されたＶＨからなる二量体））に関する。しばしば、それらは、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の、ＣＤＲおよびフレームワーク領域のうちの１つ以上を含む。
【０００６】
ペプチドライブラリー、ポリペプチドライブラリー、またはタンパク質ライブラリーは、先行技術においていくつかの様式で生成されている。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６，ｐｐ．５７−８６（２０００）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。１つの方法は、未刺激（ｎａｉｖｅ）であるかまたは免疫されているかいずれかである、ネイティブドナーの多様性を捕捉することである。別の方法は、合成の多様性を有するライブラリーを作製することである。第３の方法は、この最初の２つの組み合わせである。代表的には、これらの方法により生成される多様性は、配列の多様性に限定される。すなわち、そのライブラリーの各メンバーは、そのペプチド鎖、ポリペプチド鎖、またはタンパク質鎖の所定の位置にて異なるアミノ酸すなわち多様性を有することによって、そのファミリーの他のメンバーと異なる。しかし、天然で多様なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、それらのアミノ酸配列でのみの多様性に限定されない。例えば、ヒト抗体は、それらのアミノ酸における配列多様性には限定されず、それらはまた、それらのアミノ酸鎖の長さでも多様である。
【０００７】
抗体に関し、長さの多様性は、例えば、可変領域の再配列の間に生じる。例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０，ｐｐ．５８７−９７（１９９７）を参照のこと。例えば、Ｖ遺伝子をＪ遺伝子に連結すると、その重鎖抗体配列のほぼ半分においてＣＤＲ３中の認識可能なＤセグメントが含まれ、それにより、種々の長さのアミノ酸をコードする領域が作製される。以下もまた、抗体遺伝子セグメントを連結する間に生じ得る：（ｉ）Ｖ遺伝子の末端が、欠失しているかまたは変化した０〜数個の塩基を有し得る；（ｉｉ）Ｄセグメントの末端が、除去されているかまたは変化した０個〜多くの塩基を有し得る；（ｉｉｉ）多数のランダムな塩基が、ＶとＤとの間かまたはＤとＪとの間に挿入され得る；ならびに（ｉｖ）Ｊの５’末端が、数塩基を除去するかまたは変化するように変更され得る。これらの再配列は、アミノ酸配列と長さとの両方が多様である、抗体を生じる。
【０００８】
従って、アミノ酸配列の多様性のみを含むライブラリーは、そのライブラリーが模倣することを意図するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の天然での多様性を反映していないという点で、不利である。さらに、長さの多様性は、そのタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの最終的機能にとって重要であり得る。例えば、抗体領域を含むライブラリーに関して、そのライブラリーの遺伝的パッケージにより提示されるか、提示されかつ発現されるか、または含まれる、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質の多くは、適切にフォールディングされないかもしれず、または配列と長さとの両方での多様性がそのライブラリー中に表されていない場合は、抗原にそれが結合することが不利になり得る。
【０００９】
ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、先行技術のライブラリーまたは遺伝的パッケージのさらなる不利は、それらが、天然に存在する多様性に基づくメンバーに、従って、機能的である可能性が最も高いメンバーに、焦点を合わせていないことである。むしろ、これらの先行技術のライブラリーは、代表的には、どのアミノ酸残基にも可能な限り多くの多様性または多彩さを含むことを企図する。これにより、ライブラリーの構築が時間がかかるものになり、そして可能な効率よりも少ない効率になる。完全な多様性を捕捉することを試みることにより生成されるメンバーの多数さによってもまた、スクリーニングが、必要とされるよりも扱いにくくなる。このことは、そのライブラリーの多くのメンバーが機能しないことを考慮すると、特に当てはまる。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の１つの目的は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の多様なファミリーのメンバーをコードする、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、ここで、このライブラリーは、長さと配列との両方が多様である集団をコードする。この多様な長さは、親のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の状況でフォールディングしかつ機能する可能性が高いモチーフを含む成分を含む。
【００１１】
本発明の別の目的は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつそのファミリーの焦点を合わせた多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーである。これらのライブラリーは、それらのアミノ酸配列が多様であるだけでなく、それらの長さもまた多様である。そして、それらの多様性は、そのライブラリーが表す特定のファミリーの天然に存在する多様性をより近似的に模倣するかまたはその多様性を考慮に入れるように、焦点を合わせられる。
【００１２】
本発明の別の目的は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の、多様であるが焦点を合わせた集団であって、この集団は、ライブラリーの特定の結合成分の選択を可能にする遺伝的パッケージ（例えば、ファージまたはファージミド）または他のレジメンを使用する、提示または提示かつ発現に適切である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸配列と長さとの両方が多様であるヒト抗体のＣＤＲを含む、焦点を合わせたライブラリー（このようなライブラリーの例としては、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、抗体全体、またはミニ抗体（すなわち、ＶＬに連結されたＶＨからなる二量体）のライブラリーが挙げられる）である。このような領域は、重鎖または軽鎖あるいはその両方に由来し得、そしてそれらの鎖のＣＤＲのうちの１つ以上を含み得る。より好ましくは、その多様性または多彩さは、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのすべてにおいて生じる。
【００１４】
上記のライブラリーを作製およびスクリーニングする方法、ならびにそのようなスクリーニングにて得られるペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態の中には、以下が存在する：
１． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物である、＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５；
（２）（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｗ）７であって、ここで、（Ｓ／Ｔ）は、Ｓ残基およびＴ残基の１：１混合物であり、（Ｓ／Ｇ／Ｘ）は、Ｓが０．２０２５、Ｇが０．２０２５、ならびにアミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々が０．０３５の混合物である、（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｗ）７；
（３）Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物である、Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４；ならびに
（４）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、重鎖ＣＤＲ１（１）：（２）：（３）の比が、０．８０：０．１７：０．０２である、混合物。
【００１６】
２． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；＜２＞は、アミノ酸残基Ｙ、Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｇ、およびＳの各々の等モル混合物であり；そして＜３＞は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ，およびＧの各々の等モル混合物であるかまたはＰおよびＳの等モル混合物である、＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（２）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；＜４＞は、残基Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｗ、Ｙの等モル混合物であり；そして＜５＞は、残基Ｓ、Ｇ、Ｄ、およびＮの等モル混合物である、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞＜Ｇ＞＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（３）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記に規定される通りである、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧ；
（４）＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧでここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；＜８＞は、Ｒが０．２７およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＳＴＶＷＹの各々が０．０２７である、＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧ；ならびに
（５）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、
好ましくは、重鎖ＣＤＲ２（１）／（２）（等モル）：（３）：（４）の比が、０．５４：０．４３：０．０３である、混合物。
【００１７】
３． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（２）ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（３）ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（４）ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＹおよびＷの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（５）ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧ；
（６）ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（７）ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；２は、ＤおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＳおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（８）ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、Ｔ、ＤおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧ；ならびに
（９）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、この混合物中で以下の比：
（１）０．１０
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１３
（５）０．１３
（６）０．１１
（７）０．０４および
（８）０．１０
であり；そしてより好ましくは、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、この混合物中で以下の比：
（１）０．０２
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１４
（５）０．１４
（６）０．１２
（７）０．０８および
（８）０．１１
である、混合物。
【００１８】
好ましくは、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）のうちの１つまたはすべてにおける１は、ＧおよびＹの各々が０．０９５、ならびにＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷの各々が、０．０４８である。
【００１９】
４． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ
（２）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜３＞は、Ｙが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷおよびＹの各々が０．０４４である、ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ１（１）：（２）の比が、０．６８：０．３２である、混合物。
【００２０】
５． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、κ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられ、このκ軽鎖ＣＤＲ１は、配列：
＜１＞ＡＳ＜２＞Ｒ＜４＞＜１＞
を有し、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜４＞は、Ａが０．２、ならびにＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０４４である、焦点を合わせたライブラリー。
【００２１】
６． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜３＞は、Ｙが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷの各々が０．０４４である、ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔ；
（２）ＱＱ３３１１１Ｐであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りである、ＱＱ３３１１１Ｐ；
（３）ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りであり、そして２は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４である、ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔ；ならびに
（４）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ３（１）：（２）：（３）の比が、０．６５：０．１：０．２５である、混合物。
【００２２】
７． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳであって、ここで、＜１＞は、Ｔが０．２７、Ｇが０．２７、およびＡＤＥＦＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷＹの各々０．０２７であり、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜３＞は、Ｙが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの各々が０．０３６である、ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳ；
（２）Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞であって、ここで、＜２＞は、上記（１）に規定される通りであり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物である、Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ１（１）：（２）の比が、０．６７：０．３３である、混合物。
【００２３】
８． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、λ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられ、このλ軽鎖ＣＤＲ２は、配列：
＜４＞＜４＞＜４＞＜２＞ＲＰＳ
を有し、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物である、
焦点を合わせたライブラリー。
【００２４】
９． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖであって、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物であり；そして＜５＞は、Ｓが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０３５５である、＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖ；
（２）＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖであって、ここで＜１＞は、ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記（１）にて規定される通りである、＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ３（１）：（２）の比が１：１である、混合物。
【００２５】
１０． 以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列を含む焦点を合わせたライブラリー：
（１）上記段落１の重鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（２）上記段落２の重鎖ＣＤＲ２のうちの１つ以上；
（３）上記段落３の重鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（４）（１）、（２）および（３）により特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。
【００２６】
１１． 段落１、段落２、および段落３の重鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列のうちの１つ以上を含む焦点を合わせたライブラリーであって、以下：
（１）段落４の１つ以上のκ軽鎖ＣＤＲ１；
（２）段落５のκ軽鎖ＣＤＲ２；
（３）段落６のκ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；
（４）段落７のκ軽鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（５）段落８のλ軽鎖ＣＤＲ２；
（６）段落９のλ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（７）（１）〜（６）のうちの１つ以上により特徴付けられるベクターおよび遺伝的パッケージの混合物；
からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、焦点を合わせたライブラリー。
【００２７】
１２．上記段落１〜１１に記載される多彩なＤＮＡ配列の集団。
【００２８】
１３．上記段落１〜１１に記載される多彩なＤＮＡ配列を含む、ベクターの集団。
【００２９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
抗体（「Ａｂ」）は、特定の標的に対するＡｂの親和性および特異性を決定することに関与する領域に、その多様性を集中させる。これらの領域は、配列または長さが多様であり得る。一般に、これらは、両方の様式で多様である。しかし、ヒト抗体のファミリー内では、配列および長さの両方の多様性は、真にランダムではない。むしろ、いくつかのアミノ酸残基はＣＤＲの特定の位置で好まれ、そしてＣＤＲのいくつかの長さが好まれる。これらの好ましい多様性は、抗体ファミリーの天然の多様性を説明する。
【００３０】
本発明に従って、そして以下により完全に記載されるように、配列および長さの両方の天然の多様性をより密に反映する、抗体ファミリーまたはその部分のベクターライブラリーもしくは遺伝子パッケージが調製され、そして使用される。
【００３１】
（ヒト抗体重鎖の配列および長さの多様性）
（（ａ）フレームワーク）
重鎖（「ＨＣ」）生殖系列遺伝子（ＧＬＧ）３−２３（ＶＰ−４７としても公知）は、全てのヒトＡｂの約１２％を占め、本発明の好ましい実施形態においてフレームワークとして好まれる。しかし、他の周知のフレームワーク（例えば、４−３４、３−３０、３−３０．３および４−３０．１）がまた、本発明の焦点を合わせた多様性の原則から逸脱することなく、使用され得ることが理解されるべきである。
【００３２】
さらに、ＪＨ４（ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＵＳＳ）は、ネイティブの抗体においてＪＨ３よりも頻繁に生じる。従って、本発明の焦点を合わせたライブラリーについて好ましい。しかしＪＨ３（ＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）も同様に使用され得る。
【００３３】
（（ｂ）焦点を合わせた長さの多様性：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）
（（ｉ）ＣＤＲ１）
ＣＤＲ１について、ＧＬＧは、５、６および７の長さのＣＤＲ１のみを提供する。しかし、Ｖドメイン遺伝子の成熟の間の変異は、２程度の短さおよび１６程度の長さを有するＣＤＲ１を生じ得る。それにもかかわらず、長さ５が優勢である。従って、本発明の好ましい実施形態において、好ましいＨＣ ＣＤＲ１は、５アミノ酸であり、そしてあまり好ましくないＣＤＲ１は、７および１４の長さを有する。本発明の最も好ましいライブラリーにおいて、３つ全ての長さが、天然の抗体において見出される割合と類似の割合で使用される。
【００３４】
（（ｉｉ）ＣＤＲ２）
ＧＬＧは、１５〜１９の長さのＣＤＲ２のみを提供するが、成熟の間の変異は、１６〜２８アミノ酸の長さのＣＤＲ２を生じ得る。長さ１６および１７は、成熟Ａｂ遺伝子において優勢である。従って、長さ１７は、本発明のＨＣ ＣＤＲ２について好ましい長さである。本発明のより好ましくないＨＣ ＣＤＲ２は、長さ１６および１９を有する。本発明の最も好ましい焦点を合わせたライブラリーにおいて、３つ全ての長さが、天然の抗体ファミリーにおいて見出される割合と類似の割合で含まれる。
【００３５】
（（ｉｉｉ）ＣＤＲ３）
ＨＣ ＣＤＲ３は、長さが異なる。約半分のヒトＨＣは、成分Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎからなり、ここでＶは、Ｖ遺伝子であり、ｎｚは、実質的にランダムな塩基の連続（平均１２）であり、Ｄは、しばしば両端で大きい編集を受ける、Ｄセグメントであり、ｎｙは、実質的にランダムな塩基の連続（平均６）であり、そしてＪＨは、しばしば５’末端で大きい編集を受ける、６つのＪＨセグメントのうち１つである。Ｄセグメントは、ＩｇＧの折り畳みを可能にするスペーサーセグメントを提供するようである。最も高い多様性は、ＤとＶとの連結部およびＤとＪＨとの連結部である。
【００３６】
本発明の好ましいライブラリーにおいて、両方の型のＨＣ ＣＤＲ３が使用される。同定可能なＤセグメントを有さないＨＣ ＣＤＲ３において、この構造は、Ｖ：：ｎｚ：：ＪＨｎであり、ここで、ＪＨは、通常５’末端で編集される。同定可能なＤセグメントを有するＨＣ ＣＤＲ３において、この構造は、Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎである。
【００３７】
（（ｃ）焦点を合わせた配列多様性：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）
（（ｉ）ＣＤＲ１）
５アミノ酸長のＣＤＲ１において、ヒト化Ａｂの３Ｄモデルの試験は、残基１、３および５の側鎖が、結合ポケットに指向されることを示した。結果として、本発明の焦点を合わせたライブラリーにおいて、これらの位置の各々は、システイン（「Ｃ」）を除く任意のネイティブのアミノ酸残基から選択され得る。システインは、標準的なＩｇ折り畳みの重要な成分であるジスルフィド結合を形成し得る。従って、遊離のチオール基を有することは、ＨＣの適切な折り畳みを妨害し得、そして選択されたＡｂの産生または操作において問題を生じ得る。従って、本発明の焦点を合わせたライブラリーにおいて、システインは、好ましい５アミノ酸のＣＤＲ１の位置１、３および５から排除される。他の１９種の天然のアミノ酸残基が、位置１、３および５において使用され得る。好ましくは、各々は、本発明の多彩なライブラリーにおいて等モル比で存在する。
【００３８】
３Ｄモデリングはまた、５アミノ酸のＣＤＲ１における残基２の側鎖が、結合ポケットから離されることを示唆する。この位置は、ＧＬＧおよび成熟遺伝子の両方において、実質的な多様性を示すが、本発明の焦点を合わせたライブラリーにおいて、この残基は、好ましくはＴｙｒ（Ｙ）である。なぜなら、これは、８２０の成熟抗体遺伝子のうちの６８１において生じるからである。しかし、Ｃｙｃ（Ｃ）以外の任意の他の天然アミノ酸残基もまた、この位置で使用され得る。
【００３９】
位置４について、ＧＬＧおよび成熟抗体遺伝子においていくらかの多様性が存在する。しかし、ほとんど全ての成熟遺伝子は、この位置で、非荷電の疎水性アミノ酸残基：Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｉ、Ｖを有する。３Ｄモデルの検査はまた、残基４の側鎖が、ＨＣの内部にパックされることを示す。従って、フレームワーク３−２３を使用する本発明の好ましい実施形態において、残基４は、好ましくはＭｅｔである。なぜなら、これは、３−２３のフレームワークに、非常に良好に適合する可能性があるからである。他のフレームワークを用いて、類似の適合考慮を使用して、残基４を割り当てる。
【００４０】
従って、本発明の最も好ましいＨＣ ＣＤＲ１は、アミノ酸配列＜１＞Ｙ＜１＞Ｍ＜１＞からなる。ここで、＜１＞は、アミノ酸残基：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ（Ｃを除く）のいずれか１つであり得、好ましくは、各位置において等モル量で存在する。この多様性は、表１において、フレームワーク３−２３：ＪＨ４に関して示される。これは、６８５９倍の多様性を有する。
【００４１】
本発明の２つのあまり好ましくないＨＣ ＣＤＲ１は、長さ７および１４を有する。長さ７について、好ましい多彩性は、（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／＜１＞）２（Ｓ／Ｇ／＜１＞）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／＜１＞）７であり；ここで、（Ｓ／Ｔ）は、ＳｅｒおよびＴｈｒコドンの等モルの混合を示し；（Ｓ／Ｇ／＜１＞）は、Ｓが０．２０２５、Ｇが０．２０２５およびＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙの各々について０．０３５の混合を示す。この設計は、成熟ＨＣ遺伝子において生じるような、位置２、３および７での優勢なＳｅｒおよびＧｌｙを与える。長さ１４について、好ましい多彩性は、ＶＳＧＧＳＩＳ＜１＞＜１＞＜１＞ＹＹＷ＜１＞であり、ここで＜１＞は、Ｃｙｓ（Ｃ）以外の１９種の天然アミノ酸残基の等モルの混合である。
【００４２】
これらの好ましいＨＣ ＣＤＲ１をコードするＤＮＡは、好ましくは、トリヌクレオチドの構築ブロックを使用して合成され、その結果、各アミノ酸残基は、実質的に等モルでか、または他の記載された量で存在する。＜１＞のアミノ酸残基についての好ましいコドンは、ｇｃｔ、ｇａｔ、ｇａｇ、ｔｔｔ、ｇｇｔ、ｃａｔ、ａｔｔ、ａａｇ、ｃｔｔ、ａｔｇ、ａａｔ、ｃｃｔ、ｃａｇ、ｃｇｔ、ｔｃｔ、ａｃｔ、ｇｔｔ、ｔｇｇおよびｔａｔである。もちろん、選択されたアミノ酸残基についての他のコドンもまた使用される。
【００４３】
多様性オリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、好ましくは、ＢｓｐＥＩからＢｓｔＸＩへと合成され（表１に示すように）、従って、重複ＯＮを使用するＰＣＲ合成によって組み込まれるか、またはＢｓｐＥＩ／ＢｓｔＸＩ切断されたフラグメントのライゲーションによって導入されるかのいずれかであり得る。表２は、本発明の好ましい長さ５のＨＣ ＣＤＲ１の特定の多彩性を具体化するオリゴヌクレオチドを示す。ＯＮ−Ｒ１Ｖ１ｖｇ、ＯＮ−Ｒ１ｔｏｐおよびＯＮ−Ｒｌｂｏｔを使用するＰＣＲは、７３塩基対のｄｓＤＮＡ産物を生じ、ＢｓｐＥＩおよびＢｓｐＸＩでの切断は、末端から１１塩基および１３塩基をトリミングし、そして表１に示される３−２３ドメインを有する、同様に切断されたベクターに連結され得る粘着末端を提供する。ＯＮＲ１Ｖ２ｖｇまたはＯＮＲ１Ｖ３ｖｇのいずれかでのＯＮ−Ｒ１Ｖ１ｖｇの置換（表２を参照のこと）は、２つの代替的な多様性パターン（７残基長および１４残基長のＨＣ ＣＤＲ１）の合成を可能にする。
【００４４】
本発明のより好ましいライブラリーは、３つの好ましいＨＣ ＣＤＲ１長さの多様性を含む。最も好ましくは、この３つの長さは、ＣＤＲの長さを参照せずに選択された抗体において観察されるおよその比率で組み込まれるはずである。例えば、１０９５個のＨＣ遺伝子の１つのサンプルは、以下の比率で存在する３つの長さを有する：Ｌ＝５：Ｌ＝７：Ｌ＝１４：：８２０：：１７５：：２３：：０．８０：：０．１７：：０．０２。これは、本発明に従う好ましい比率である。
【００４５】
（（ｉｉ）ＣＤＲ２）
ＨＣ ＣＤＲ２における多様性を、ＨＣ ＣＤＲ１：ＧＬＧ配列、成熟配列および３Ｄ構造についての考慮と同じ考慮を用いて設計した。ＣＤＲ２についての好ましい長さは、表１に示すように、１７である。この好ましい１７の長さのＣＤＲ２について、本発明に従う好ましい多彩性は、以下：＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであり、ここで＜２＞は、Ｙ、Ｒ、Ｗ、Ｖ、ＧおよびＳ（等モルの混合物）の群から選択される任意のアミノ酸残基を示し、＜３＞は、Ｐ、ＳおよびＧまたはＰおよびＳのみであり（等モルの混合物）、そして＜１＞は、Ｃ以外の任意の天然のアミノ酸残基である（等モルの混合物）。
【００４６】
表３に示されるＯＮ−Ｒ２Ｖ１ｖｇは、この多様性パターンを具体化する。これは、好ましくは、ＢｓｔＸＩ部位およびＸｂａＩ部位を含むｄｓＤＮＡのフラグメントが、ＰＣＲによって作製され得るように合成される。ＯＮ−Ｒ２Ｖ１ｖｇ、ＯＮ−Ｒ２ｔｏｐおよびＯＮＲ２ｂｏｔを用いるＰＣＲは、１２２塩基対のｄｓＤＮＡ産物を生じる。ＢｓｔＸＩおよびＸｂａＩによる切断は、各末端から約１０塩基を除去し、そして表１に示される３−２３遺伝子を含む、同様に切断されたベクターに連結され得る粘着末端を生じる。
【００４７】
１７の長さのＨＣ ＣＤＲ２についての代替の実施形態において、以下の多彩性：＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ、が使用され得；ここで、＜１＞は、ＨＣ ＣＤＲ２のより好ましい代替について上記された通りであり；＜４＞は、等モルのＤＩＮＳＷＹの混合物を示し；そして＜５＞は、等モルのＳＧＤＮの混合物を示す。この多様性パターンは、表３に示されるＯＮ−Ｒ２Ｖ２ｖｇにおいて具体化される。好ましくは、これら２つの実施形態は、本発明のライブラリーにおいて、等モル混合物で使用される。
【００４８】
他の好ましいＨＣ ＣＤＲ２は、長さ１６および１９を有する。長さ１６：＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧ；長さ１９：＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧ、ここで、＜１＞は、Ｃ以外の全ての天然のアミノ酸残基の等モルの混合物であり；＜４＞は、ＤＩＮＳＷＹの等モル混合物であり；＜５＞は、ＳＧＤＮの等モルの混合物であり；そして＜８＞は、Ｒが０．２７および残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＳＴＶＷＹの各々が０．０２７である。表３は、長さ１６の好ましいＣＤＲ２多彩性を具体化するＯＮ−Ｒ２Ｖ３ｖｇ、および長さ１９の好ましいＣＤＲ２多彩性を具体化するＯＮ−Ｒ２Ｖ４ｖｇを示す。これらの多彩性を調製するため、ＯＮ−Ｒ２Ｖ３ｖｇは、ＯＮ−Ｒ２ｔｏｐおよびＯＮ−Ｒ２ｂｏ３を用いてＰＣＲ増幅され得、そしてＯＮ−Ｒ２Ｖ４ｖｇは、ＯＮ−Ｒ２ｔｏｐおよびＯＮ−Ｒ２−ｂｏ４を用いてＰＣＲ増幅され得る。表３を参照のこと。本発明の最も好ましい実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２の３つ全ての長さが使用される。好ましくは、これらは、以下の比で存在する：１７：１６：１９：：５７９：４６４：３１：：０．５４：０．４３：０．０３。
【００４９】
（（ｉｉｉ）ＣＤＲ３）
本発明の好ましいライブラリーは、いくつかのＨＣ ＣＤＲ３成分を含む。これらのいくつかは、配列多様性のみを有する。その他は、長さを伸ばすために嵌め込まれたＤセグメントを含む配列多様性を有し、一方でまた、Ｉｇが折り畳まれるのを可能にする既知の配列を取り込む。本発明の好ましいライブラリーのＨＣ ＣＤＲ３成分およびその多様性は、表４：成分１〜８に示される。
【００５０】
この成分のセットを、１３８３個のヒトＨＣ配列の配列の研究後に選択した。
提案された成分は、以下の目的を満たすはずである：
１）ネイティブのＡｂ遺伝子において見られるのとほぼ同じ長さ分布；
２）ネイティブのＡｂ遺伝子において高い多様性を有する場所での高レベルの配列多様性；および
３）ネイティブのＡｂ遺伝子においてしばしば見られる定常配列の組み込み。
【００５１】
成分１は、長さ０〜８（ＦＲ３の末端のＹＹＣＡＲモチーフ〜Ｊ領域（すなわち、ＦＲ４）の開始点近くのＷＧジペプチドモチーフからなる）を有する全ての遺伝子を示す。成分２は、長さ９または１０を有する全ての遺伝子に対応する。成分３は、長さ１１または１２を有する遺伝子および長さ１３を有する遺伝子の半分に対応する。成分４は、長さ１４を有する遺伝子、および長さ１３を有する遺伝子の半分に対応する。成分５は、長さ１５を有する遺伝子、および長さ１６を有する遺伝子の半分に対応する。成分６は、長さ１７を有する遺伝子、および長さ１６を有する遺伝子の半分に対応する。成分７は、長さ１８を有する遺伝子に対応する。成分８は、長さ１９以上を有する遺伝子に対応する。表４を参照のこと。
【００５２】
多様性＜１＞を有する各ＨＣ ＣＤＲ３残基について、等モルの比率は、好ましくは使用されない。むしろ、以下の比率が使用される：０．０９５［ＧおよびＹ］および０．０４８［Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷ］。従って、等モル比の他の残基と共に、二倍用量のＧおよびＹが存在する。他の多様性について、例えば、ＫＲまたはＳＧの残基が、等モルの混合物中に存在する。
【００５３】
本発明の好ましいライブラリーにおいて、８つの成分は、以下の割合で存在する：１（０．１０）、２（０．１４）、３（０．２５）、４（０．１３）、５（０．１３）、６（０．１１）、７（０．０４）および８（０．１０）。表４を参照のこと。
【００５４】
本発明のより好ましい実施形態において、８つの成分の量は調整される。なぜなら、第１の成分は、それがライブラリーの１０％として含まれることを証明するには十分複雑でないからである。例えば、最終ライブラリーが、１×１０９のメンバーを含むとすると、１×１０８の配列が成分１から生じることになるが、たった２．６×１０５のＣＤＲ３配列しか生じず、その結果、各々の配列は、約３８５個のＣＤＲ１／２の状況で生じる。従って、８つの成分のより好ましい量は、１（０．０２）、２（０．１４）、３（０．２５）、４（０．１４）、５（０．１４）、６（０．１２）、７（０．０８）、８（０．１１）である。より好ましい実施形態に従って、成分１は、約７７個のＣＤＲ１／２の状況で生じ、そしてその他（より長いＣＤＲ３）が、より頻繁に生じる。
【００５５】
表５は、表４に示される８つのＨＣ ＣＤＲ３成分の各々を具体化するｖｇＤＮＡを示す。表５において、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）Ｃｔｏｐ２５、ＣｔｐｒｍＡ、ＣＢｐｒｍＢおよびＣＢｏｔ２５は、以下の多彩化ＯＮ（ｖｇＤＮＡ）の各々のＰＣＲ増幅を可能にする：Ｃ１ｔ０８、Ｃ２ｔ１０、Ｃ３ｔ１２、Ｃ４ｔ１４、Ｃ５ｔ１５、Ｃ６ｔ１７、Ｃ７ｔ１８およびＣ８ｔ１９。増幅後、ｄｓＤＮＡを、ＡｆｌＩＩおよびＢｓｔＥＩＩ（またはＫｐｎＩ）で切断し得、そして３−２３ドメインの残りを含む、同様に切断されたベクターに連結され得る。好ましくは、このベクターはすでに、本明細書中に開示されるようなＣＤＲ１およびＣＤＲ２の一方または両方において多様性を含む。最も好ましくは、これは、ＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域の両方において多様性を含む。もちろん、種々の多様性が、任意の順序でベクター中に組み込まれ得ることが理解されるべきである。
【００５６】
好ましくは、受容側のベクターは、元々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場所にスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を含み、その結果、得られたライブラリー中に続いて生じる親配列は存在しない。表６は、各ＣＤＲが、終止コドンおよびスタッファーが除去されていない任意のベクターの特異的な切断を可能にする制限部位の両方を含む短いセグメントによって置換された、Ｖ３−２３遺伝子セグメントのバージョンを示す。スタッファーは、短いか、最終ライブラリー中に生じない制限酵素部位を含むかのどちらでもよく、ＡｆｌＩＩおよびＢｓｔＥＩＩ（またはＫｐｎＩ）の両方によって切断されず、再連結されないベクターの除去を可能にする。あるいは、このスタッファーは、２００〜４００塩基長であり得、その結果、切断されないかまたは１回切断されたベクターは、二重に切断されたベクターから容易に分離され得る。
【００５７】
（ヒト抗体軽鎖：配列および長さの多様性）
（（ｉ）κ鎖）
（（ａ）フレームワーク）
本発明の好ましい実施形態において、κ軽鎖は、ＪＫ１領域と共にＡ２７フレームワークに構築される。これらは、ネイティブな遺伝子において最も一般的なＶ領域およびＪ領域である。しかし、他のフレームワーク（例えば、Ｏ１２、Ｌ１２およびＡ１１）および他のＪ領域（例えば、ＪＫ４）は、本発明の範囲から逸脱することなく使用され得る。
【００５８】
（（ｂ）ＣＤＲ１）
ネイティブなヒトκ鎖において、１１、１２、１３、１６および１７の長さを有するＣＤＲ１が観察され、長さ１１が優勢であり、そして長さ１２が十分に示される。従って、本発明の好ましい実施形態において、長さ１１および長さ１２のＬＣ ＣＤＲ１は、単独でか、またはネイティブな抗体において観察される混合と類似の混合で使用され、長さ１１が最も好ましい。長さ１１は、以下の配列：ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡを有し、そして長さ１２は、以下の配列：ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡを有する。ここで、＜１＞は、Ｃ以外のネイティブなアミノ酸残基全ての等モルの混合であり、＜２＞は、Ｓが０．２およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり、そして＜３＞は、Ｙが０．２およびＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹの各々が０．０４４である。本発明の最も好ましい実施形態において、両方のＣＤＲ１の長さが使用される。好ましくは、これらは、１１：１２：：１５４：７３：：０．６８：０．３２の比で存在する。
【００５９】
（（ｃ）ＣＤＲ２）
ネイティブのκにおいて、ＣＤＲ２は、長さ７のみを示す。この長さは、本発明の好ましい実施形態において使用される。これは、配列＜１＞ＡＳ＜２＞Ｒ＜４＞＜１＞を有し、ここで＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合であり；＜２＞は、Ｓが０．２およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．００４であり、そして＜４＞は、Ａが０．２およびＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＵＷＹの各々が０．０４４である。
【００６０】
（ｄ）ＣＤＲ３
ネイティブなκにおいて、ＣＤＲ３は、１、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１９の長さを示す。これらの長さのいずれかおよびこれらの混合物は、本発明において使用され得るが、長さ８、９および１０が好ましく、長さ９が最も好ましい。好ましい長さ９について、その配列は、ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔであり、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり、そして＜３＞は、Ｙが０．２およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷの各々が０．０４４である。長さ８は、好ましくは、ＱＱ３３１１１Ｐであり、そして長さ１０は、好ましくはＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔであり、ここで、１および３は、長さ９で規定されたものであり、そして２は、Ｓ（０．２）およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４である。３つの長さ全ての混合物が、最も好ましい（ネイティブな抗体における比）（すなわち、８：９：１０：：２８：１６６：６３：：０．１：０．６５：０．２５である）。
【００６１】
表７は、ｐｌａｃＺプロモーター（リボソーム結合部位およびシグナル配列（Ｍ１３ ＩＩＩシグナル））を含む本発明のκ鎖遺伝子を示す。ＤＮＡ配列は、ＧＬＧアミノ酸配列をコードするが、ＧＬＧ ＤＮＡ配列を含まない。制限部位は、各フレームワーク領域内に含まれるように設計され、その結果、多様性がＣＤＲ中にクローニングされ得る。ＸｍａＩおよびＥｓｐＩはＦＲ１内に、ＳｅｘＡＩはＦＲ２内に、ＲｓｒＩＩはＦＲ３内に、そしてＫｐｎＩ（またはＡｃｃ６５Ｉ）はＦＲ４内にある。さらなる部位が、この遺伝子の構築を容易にするために、定常κ鎖内に提供される。
【００６２】
表７はまた、κについての適切な多彩性（ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）スキームを示す。ＣＤＲ１において、最も好ましい長さ１１が示される。しかし、最も好ましい長さ１１および１２の両方が使用される。ＣＤＲ１中の長さ１２は、＜２＞（すなわち、Ｓｅｒバイアス混合物）としてコドン５１を導入することによって構築され得る。κのＣＤＲ２は、常に７コドンである。表７は、ＣＤＲ２について好ましい多彩性スキームを示す。表７は、最も好ましいＣＤＲ３（長さ９）についての多彩性スキームを示す。同様の多彩性が、長さ８および１０のＣＤＲについて使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、これら３つの長さ（８、９および１０）は、上記のように、ネイティブな比率で本発明のライブラリー中に含まれる。
【００６３】
表９は、表７に示されるκ鎖多様性を構築するために使用され得る、オリゴヌクレオチドおよびプライマーの一連の多様性を示す。
【００６４】
（ｉｉ）λ鎖
（ａ）フレームワーク
λ鎖は、好ましくはＬ２Ｊ領域を用いて２ａ２フレームワーク中に作製され得る。これらは、最も一般のネイティブな遺伝子におけるＶ領域およびＪ領域である。しかし、他のフレームワーク（例えば、３１、４ｂ、１ａおよび６ａ）および他のＪ領域（例えば、Ｌ１Ｊ、Ｌ３ＪおよびＬ７Ｊ）は、本発明の範囲から逸脱することなく使用され得る。
【００６５】
（ｂ）ＣＤＲ１
ネイティブなヒトλ鎖において、長さ１４を有するＣＤＲ１が優勢であるが、長さ１１、１２および１３もまた生じる。これらの長さのいずれかが本発明において使用され得るが、長さ１１および１４が好ましい。長さ１１について、その配列は：ＴＧ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞であり、そして長さ１４について、その配列は：ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳであり、ここで、＜１＞は、Ｔが０．２７、Ｇが０．２７およびＡＤＥＦＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜３＞は、Ｙが０．３６およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの各々が０．０３５５であり；そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物である。最も好ましくは、混合物（ネイティブな抗体中に生じるものと類似）（好ましくは、これら３つの長さの比が１１：１４：：２３：４６：：０．３３：０．６７である）が使用される。
【００６６】
（ｃ）ＣＤＲ２
ネイティブなヒトλ鎖において、長さ７を有するＣＤＲ２が、はるかに一般的である。この長さは、本発明において好ましい。この長さ７のＣＤＲ２の配列は、＜４＞＜４＞＜４＞＜２＞ＲＰＳであり、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物である。
【００６７】
（ｄ）ＣＤＲ３
ネイティブなヒトλ鎖において、長さ１０および１１のＣＤＲ３が優勢であるが、長さ９もまた一般的である。これら３つの長さのいずれかが本発明において使用され得る。長さ１１が好ましく、そして１０および１１の混合物がより好ましい。長さ１１の配列は：＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖであり、ここで、＜２＞および＜４＞は、λＣＤＲ１について規定したものであり、そして＜５＞は、Ｓが０．３６およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０３５５である。長さ１０の配列は：＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖであり、ここで、＜１＞は、ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、長さ１１について規定したものである。本発明の好ましい混合物としては、長さ１０および１１の等モル混合物が挙げられる。表８は、本発明に従う、好ましい重点的なλ軽鎖多様性を示す。
【００６８】
表９は、表７に示されたλ鎖多様性を構築するために使用され得る、一連の多様性オリゴヌクレオチドおよびプライマーを示す。
【００６９】
（遺伝的パッケージの構築方法）
別々のベクターに構築される重鎖ならびにκ軽鎖およびλ軽鎖の多様性が、最良である。第一に、合成遺伝子を設計して、合成可変ドメインの各々を具体化する。軽鎖は、ＡｐａＬＩ（シグナル配列のまさに末端に位置する）およびＡｓｃＩ（終止コドンの後ろに位置する）に対する制限部位によって結合される。重鎖は、ＳｆｉＩ（ＰｅｌＢシグナル配列内に位置する）およびＮｏｔＩ（ＣＨ１とアンカータンパク質との間のリンカー中に位置する）によって結合される。ＰｅｌＢ以外のシグナル配列（例えば、Ｍ１３ ｐＩＩＩシグナル配列）もまた必要であり得る。
【００７０】
最初の遺伝子を、所望のＣＤＲの代わりに「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列を用いて作成する。「スタッファー」は、裁断されて多様なＤＮＡによって置換されるべき配列であるが、機能的抗体遺伝子の発現を可能にしない。例えば、スタッファーは、正確に完成したライブラリーベクターを生じない、いくつかの終止コドンおよび制限部位を含み得る。例えば、表１０には、κＡ２７のＣＤＲ１についてのスタッファーは、ＳｔｕＩ部位を含む。ＣＤＲ１についてのｖｇＤＮＡは、ＥｓｐＩ、ＸｍａＩまたはＡｆｌＩＩ〜ＳｅｘＡＩまたはＫａｓＩのいずれかのカセットとして導入される。連結後、ＤＮＡは、ＳｔｕＩで切断され；所望のベクター中にはＳｔｕＩ部位は存在すべきではない。
【００７１】
スタッファーを有する重鎖遺伝子の配列が、表６に示される。スタッファーを有するκ軽鎖遺伝子の配列が、表１０に示される。スタッファーを有するλ軽鎖遺伝子の配列が、表１１に示される。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、重鎖およびκ軽鎖またはλ軽鎖の多様性は、これらの鎖のクローニングを可能にする適切な制限部位を有する単一のベクターまたは遺伝的パッケージ中に構築される（例えば、表示または表示および発現のために）。このようなベクターを構築するためのプロセスは、当該分野において周知であり、そして広範に用いられている。好ましくは、重鎖およびκ軽鎖のライブラリー、ならびに重鎖およびλ軽鎖のライブラリーは、単独に好ましい。次いで、最も好ましくは、２つのライブラリーを等モル量で混合して、最大の多様性を得る。
【００７３】
最も好ましくは、表示が、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上に有される。最も好ましいベクターは、Ｍ１３の全ての遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、および表示カセットを含む。好ましいベクターは、カセットとして遺伝子の多様なファミリーのメンバーを導入および切除を可能にする制限部位を有して提供される。好ましいベクターは、増幅ファージに用いられる増殖条件下での再配列に対して安定である。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法によって捕捉される多様性は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を表示および／または発現するファージミドベクター（例えば、ｐＣＥＳ１）中で、表示および／または発現され得る。このようなベクターをまた使用して、他のベクターまたはファージを使用する次の表示および／または発現についての多様性を保存し得る。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法によって捕捉された多様性は、酵母ベクター中で表示および／または発現され得る。
【００７６】
【表１】
表２：ヒトＨＣのＣＤＲ１を多彩にするために使用したオリゴヌクレオチド
【００７７】
【表２】
表３：ヒトＨＣのＣＤＲ２を多彩にするために使用したオリゴヌクレオチド
【００７８】
【表３】
表４：ＨＣ ＣＤＲ３の好ましい成分
【００７９】
【表４】
表５：ＨＣ ＣＤＲ３の８成分を多彩にするために使用したオリゴヌクレオチド
【００８０】
【表５】
ＣｔｐｒｍＡの３’末端側の２０塩基は、各ｖｇＤＮＡ分子の最も５’側の２０塩基と同一である。
Ｃｔｏｐ２５は、ＣｔｐｒｍＡの最も５’側の２５塩基と同一である。
ＣＢｐｒｍＢの最も３’側の２３塩基は、各ｖｇＤＮＡ分子の最も３’側の２３塩基の逆相補体である。
ＣＢｏｔ２５は、ＣＢｐｒｍＢの５’末端の２５塩基と同一である。
【００８１】
【表５Ａ】
【００８２】
【表６】
【００８３】
【表７】
【００８４】
【表８】
【００８５】
【表９】
【００８６】
【表１０】
【００８７】
【表１１】
本出願は、２００１年１２月１８日に出願した米国特許仮出願６０／２５６，３８０号の、米国特許法第１２０条の下での利益を請求する。この仮出願およびそれに添付された表は、本明細書中で参考として特に援用される。
【０００２】
本発明は、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを各々が提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつそのファミリーの焦点を合わせた多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーに関する。本発明のライブラリーの焦点を合わせた多様性は、配列多様性および長さの多様性の両方を含む。好ましい実施形態において、本発明のライブラリーの焦点を合わせた多様性は、選択されたファミリーの天然の多様性へと偏向している。より好ましい実施形態において、このライブラリーは、ヒト抗体の天然の多様性へと偏向しており、そしてそれらの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）における多彩さにより特徴付けられる。
【０００３】
本発明はさらに、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の焦点を合わせた多様性ファミリーを提示するためか、または提示しかつ発現するための、ベクターおよび遺伝的パッケージ（例えば、細胞、胞子、またはウイルス）に関する。好ましい実施形態において、この遺伝的パッケージは、繊維状ファージまたはファージミドあるいは酵母である。また、このファミリーの焦点を合わせた多様性は、配列の多様性および長さの多様性を含む。
【０００４】
本発明はさらに、本発明の焦点を合わせたライブラリーをスクリーニングする方法、ならびにこのようなスクリーニングにより同定されたペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に関する。
【０００５】
（発明の背景）
ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつそのファミリーのアミノ酸の多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、遺伝的パッケージのライブラリーを調製することは、当該分野における現在一般的な実務である。多くの一般的なライブラリーにおいて、そのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、抗体（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、抗体全体、またはミニ抗体（すなわち、ＶＬに連結されたＶＨからなる二量体））に関する。しばしば、それらは、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の、ＣＤＲおよびフレームワーク領域のうちの１つ以上を含む。
【０００６】
ペプチドライブラリー、ポリペプチドライブラリー、またはタンパク質ライブラリーは、先行技術においていくつかの様式で生成されている。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６，ｐｐ．５７−８６（２０００）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。１つの方法は、未刺激（ｎａｉｖｅ）であるかまたは免疫されているかいずれかである、ネイティブドナーの多様性を捕捉することである。別の方法は、合成の多様性を有するライブラリーを作製することである。第３の方法は、この最初の２つの組み合わせである。代表的には、これらの方法により生成される多様性は、配列の多様性に限定される。すなわち、そのライブラリーの各メンバーは、そのペプチド鎖、ポリペプチド鎖、またはタンパク質鎖の所定の位置にて異なるアミノ酸すなわち多様性を有することによって、そのファミリーの他のメンバーと異なる。しかし、天然で多様なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、それらのアミノ酸配列でのみの多様性に限定されない。例えば、ヒト抗体は、それらのアミノ酸における配列多様性には限定されず、それらはまた、それらのアミノ酸鎖の長さでも多様である。
【０００７】
抗体に関し、長さの多様性は、例えば、可変領域の再配列の間に生じる。例えば、Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０，ｐｐ．５８７−９７（１９９７）を参照のこと。例えば、Ｖ遺伝子をＪ遺伝子に連結すると、その重鎖抗体配列のほぼ半分においてＣＤＲ３中の認識可能なＤセグメントが含まれ、それにより、種々の長さのアミノ酸をコードする領域が作製される。以下もまた、抗体遺伝子セグメントを連結する間に生じ得る：（ｉ）Ｖ遺伝子の末端が、欠失しているかまたは変化した０〜数個の塩基を有し得る；（ｉｉ）Ｄセグメントの末端が、除去されているかまたは変化した０個〜多くの塩基を有し得る；（ｉｉｉ）多数のランダムな塩基が、ＶとＤとの間かまたはＤとＪとの間に挿入され得る；ならびに（ｉｖ）Ｊの５’末端が、数塩基を除去するかまたは変化するように変更され得る。これらの再配列は、アミノ酸配列と長さとの両方が多様である、抗体を生じる。
【０００８】
従って、アミノ酸配列の多様性のみを含むライブラリーは、そのライブラリーが模倣することを意図するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の天然での多様性を反映していないという点で、不利である。さらに、長さの多様性は、そのタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの最終的機能にとって重要であり得る。例えば、抗体領域を含むライブラリーに関して、そのライブラリーの遺伝的パッケージにより提示されるか、提示されかつ発現されるか、または含まれる、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質の多くは、適切にフォールディングされないかもしれず、または配列と長さとの両方での多様性がそのライブラリー中に表されていない場合は、抗原にそれが結合することが不利になり得る。
【０００９】
ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、先行技術のライブラリーまたは遺伝的パッケージのさらなる不利は、それらが、天然に存在する多様性に基づくメンバーに、従って、機能的である可能性が最も高いメンバーに、焦点を合わせていないことである。むしろ、これらの先行技術のライブラリーは、代表的には、どのアミノ酸残基にも可能な限り多くの多様性または多彩さを含むことを企図する。これにより、ライブラリーの構築が時間がかかるものになり、そして可能な効率よりも少ない効率になる。完全な多様性を捕捉することを試みることにより生成されるメンバーの多数さによってもまた、スクリーニングが、必要とされるよりも扱いにくくなる。このことは、そのライブラリーの多くのメンバーが機能しないことを考慮すると、特に当てはまる。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の１つの目的は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の多様なファミリーのメンバーをコードする、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、ここで、このライブラリーは、長さと配列との両方が多様である集団をコードする。この多様な長さは、親のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の状況でフォールディングしかつ機能する可能性が高いモチーフを含む成分を含む。
【００１１】
本発明の別の目的は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつそのファミリーの焦点を合わせた多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーである。これらのライブラリーは、それらのアミノ酸配列が多様であるだけでなく、それらの長さもまた多様である。そして、それらの多様性は、そのライブラリーが表す特定のファミリーの天然に存在する多様性をより近似的に模倣するかまたはその多様性を考慮に入れるように、焦点を合わせられる。
【００１２】
本発明の別の目的は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするＤＮＡ配列の、多様であるが焦点を合わせた集団であって、この集団は、ライブラリーの特定の結合成分の選択を可能にする遺伝的パッケージ（例えば、ファージまたはファージミド）または他のレジメンを使用する、提示または提示かつ発現に適切である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、アミノ酸配列と長さとの両方が多様であるヒト抗体のＣＤＲを含む、焦点を合わせたライブラリー（このようなライブラリーの例としては、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、抗体全体、またはミニ抗体（すなわち、ＶＬに連結されたＶＨからなる二量体）のライブラリーが挙げられる）である。このような領域は、重鎖または軽鎖あるいはその両方に由来し得、そしてそれらの鎖のＣＤＲのうちの１つ以上を含み得る。より好ましくは、その多様性または多彩さは、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのすべてにおいて生じる。
【００１４】
上記のライブラリーを作製およびスクリーニングする方法、ならびにそのようなスクリーニングにて得られるペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態の中には、以下が存在する：
１． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物である、＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５；
（２）（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｗ）７であって、ここで、（Ｓ／Ｔ）は、Ｓ残基およびＴ残基の１：１混合物であり、（Ｓ／Ｇ／Ｘ）は、Ｓが０．２０２５、Ｇが０．２０２５、ならびにアミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々が０．０３５の混合物である、（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｗ）７；
（３）Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物である、Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４；ならびに
（４）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、重鎖ＣＤＲ１（１）：（２）：（３）の比が、０．８０：０．１７：０．０２である、混合物。
【００１６】
２． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；＜２＞は、アミノ酸残基Ｙ、Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｇ、およびＳの各々の等モル混合物であり；そして＜３＞は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ，およびＧの各々の等モル混合物であるかまたはＰおよびＳの等モル混合物である、＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（２）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；＜４＞は、残基Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｗ、Ｙの等モル混合物であり；そして＜５＞は、残基Ｓ、Ｇ、Ｄ、およびＮの等モル混合物である、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞＜Ｇ＞＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（３）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記に規定される通りである、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧ；
（４）＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧでここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；＜８＞は、Ｒが０．２７およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＳＴＶＷＹの各々が０．０２７である、＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧ；ならびに
（５）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、
好ましくは、重鎖ＣＤＲ２（１）／（２）（等モル）：（３）：（４）の比が、０．５４：０．４３：０．０３である、混合物。
【００１７】
３． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（２）ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（３）ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（４）ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＹおよびＷの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（５）ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧ；
（６）ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（７）ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；２は、ＤおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＳおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（８）ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、Ｔ、ＤおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧ；ならびに
（９）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、この混合物中で以下の比：
（１）０．１０
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１３
（５）０．１３
（６）０．１１
（７）０．０４および
（８）０．１０
であり；そしてより好ましくは、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、この混合物中で以下の比：
（１）０．０２
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１４
（５）０．１４
（６）０．１２
（７）０．０８および
（８）０．１１
である、混合物。
【００１８】
好ましくは、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）のうちの１つまたはすべてにおける１は、ＧおよびＹの各々が０．０９５、ならびにＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷの各々が、０．０４８である。
【００１９】
４． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ
（２）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜３＞は、Ｙが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷおよびＹの各々が０．０４４である、ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ１（１）：（２）の比が、０．６８：０．３２である、混合物。
【００２０】
５． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、κ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられ、このκ軽鎖ＣＤＲ１は、配列：
＜１＞ＡＳ＜２＞Ｒ＜４＞＜１＞
を有し、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜４＞は、Ａが０．２、ならびにＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０４４である、焦点を合わせたライブラリー。
【００２１】
６． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜３＞は、Ｙが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷの各々が０．０４４である、ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔ；
（２）ＱＱ３３１１１Ｐであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りである、ＱＱ３３１１１Ｐ；
（３）ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りであり、そして２は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４である、ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔ；ならびに
（４）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ３（１）：（２）：（３）の比が、０．６５：０．１：０．２５である、混合物。
【００２２】
７． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳであって、ここで、＜１＞は、Ｔが０．２７、Ｇが０．２７、およびＡＤＥＦＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷＹの各々０．０２７であり、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜３＞は、Ｙが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの各々が０．０３６である、ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳ；
（２）Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞であって、ここで、＜２＞は、上記（１）に規定される通りであり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物である、Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ１（１）：（２）の比が、０．６７：０．３３である、混合物。
【００２３】
８． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、λ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられ、このλ軽鎖ＣＤＲ２は、配列：
＜４＞＜４＞＜４＞＜２＞ＲＰＳ
を有し、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物である、
焦点を合わせたライブラリー。
【００２４】
９． ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつこの抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、このベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖであって、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物であり；そして＜５＞は、Ｓが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０３５５である、＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖ；
（２）＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖであって、ここで＜１＞は、ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記（１）にて規定される通りである、＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物であって、好ましくは、ＣＤＲ３（１）：（２）の比が１：１である、混合物。
【００２５】
１０． 以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列を含む焦点を合わせたライブラリー：
（１）上記段落１の重鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（２）上記段落２の重鎖ＣＤＲ２のうちの１つ以上；
（３）上記段落３の重鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（４）（１）、（２）および（３）により特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。
【００２６】
１１． 段落１、段落２、および段落３の重鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列のうちの１つ以上を含む焦点を合わせたライブラリーであって、以下：
（１）段落４の１つ以上のκ軽鎖ＣＤＲ１；
（２）段落５のκ軽鎖ＣＤＲ２；
（３）段落６のκ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；
（４）段落７のκ軽鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（５）段落８のλ軽鎖ＣＤＲ２；
（６）段落９のλ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（７）（１）〜（６）のうちの１つ以上により特徴付けられるベクターおよび遺伝的パッケージの混合物；
からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、焦点を合わせたライブラリー。
【００２７】
１２．上記段落１〜１１に記載される多彩なＤＮＡ配列の集団。
【００２８】
１３．上記段落１〜１１に記載される多彩なＤＮＡ配列を含む、ベクターの集団。
【００２９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
抗体（「Ａｂ」）は、特定の標的に対するＡｂの親和性および特異性を決定することに関与する領域に、その多様性を集中させる。これらの領域は、配列または長さが多様であり得る。一般に、これらは、両方の様式で多様である。しかし、ヒト抗体のファミリー内では、配列および長さの両方の多様性は、真にランダムではない。むしろ、いくつかのアミノ酸残基はＣＤＲの特定の位置で好まれ、そしてＣＤＲのいくつかの長さが好まれる。これらの好ましい多様性は、抗体ファミリーの天然の多様性を説明する。
【００３０】
本発明に従って、そして以下により完全に記載されるように、配列および長さの両方の天然の多様性をより密に反映する、抗体ファミリーまたはその部分のベクターライブラリーもしくは遺伝子パッケージが調製され、そして使用される。
【００３１】
（ヒト抗体重鎖の配列および長さの多様性）
（（ａ）フレームワーク）
重鎖（「ＨＣ」）生殖系列遺伝子（ＧＬＧ）３−２３（ＶＰ−４７としても公知）は、全てのヒトＡｂの約１２％を占め、本発明の好ましい実施形態においてフレームワークとして好まれる。しかし、他の周知のフレームワーク（例えば、４−３４、３−３０、３−３０．３および４−３０．１）がまた、本発明の焦点を合わせた多様性の原則から逸脱することなく、使用され得ることが理解されるべきである。
【００３２】
さらに、ＪＨ４（ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＵＳＳ）は、ネイティブの抗体においてＪＨ３よりも頻繁に生じる。従って、本発明の焦点を合わせたライブラリーについて好ましい。しかしＪＨ３（ＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ）も同様に使用され得る。
【００３３】
（（ｂ）焦点を合わせた長さの多様性：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）
（（ｉ）ＣＤＲ１）
ＣＤＲ１について、ＧＬＧは、５、６および７の長さのＣＤＲ１のみを提供する。しかし、Ｖドメイン遺伝子の成熟の間の変異は、２程度の短さおよび１６程度の長さを有するＣＤＲ１を生じ得る。それにもかかわらず、長さ５が優勢である。従って、本発明の好ましい実施形態において、好ましいＨＣ ＣＤＲ１は、５アミノ酸であり、そしてあまり好ましくないＣＤＲ１は、７および１４の長さを有する。本発明の最も好ましいライブラリーにおいて、３つ全ての長さが、天然の抗体において見出される割合と類似の割合で使用される。
【００３４】
（（ｉｉ）ＣＤＲ２）
ＧＬＧは、１５〜１９の長さのＣＤＲ２のみを提供するが、成熟の間の変異は、１６〜２８アミノ酸の長さのＣＤＲ２を生じ得る。長さ１６および１７は、成熟Ａｂ遺伝子において優勢である。従って、長さ１７は、本発明のＨＣ ＣＤＲ２について好ましい長さである。本発明のより好ましくないＨＣ ＣＤＲ２は、長さ１６および１９を有する。本発明の最も好ましい焦点を合わせたライブラリーにおいて、３つ全ての長さが、天然の抗体ファミリーにおいて見出される割合と類似の割合で含まれる。
【００３５】
（（ｉｉｉ）ＣＤＲ３）
ＨＣ ＣＤＲ３は、長さが異なる。約半分のヒトＨＣは、成分Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎからなり、ここでＶは、Ｖ遺伝子であり、ｎｚは、実質的にランダムな塩基の連続（平均１２）であり、Ｄは、しばしば両端で大きい編集を受ける、Ｄセグメントであり、ｎｙは、実質的にランダムな塩基の連続（平均６）であり、そしてＪＨは、しばしば５’末端で大きい編集を受ける、６つのＪＨセグメントのうち１つである。Ｄセグメントは、ＩｇＧの折り畳みを可能にするスペーサーセグメントを提供するようである。最も高い多様性は、ＤとＶとの連結部およびＤとＪＨとの連結部である。
【００３６】
本発明の好ましいライブラリーにおいて、両方の型のＨＣ ＣＤＲ３が使用される。同定可能なＤセグメントを有さないＨＣ ＣＤＲ３において、この構造は、Ｖ：：ｎｚ：：ＪＨｎであり、ここで、ＪＨは、通常５’末端で編集される。同定可能なＤセグメントを有するＨＣ ＣＤＲ３において、この構造は、Ｖ：：ｎｚ：：Ｄ：：ｎｙ：：ＪＨｎである。
【００３７】
（（ｃ）焦点を合わせた配列多様性：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）
（（ｉ）ＣＤＲ１）
５アミノ酸長のＣＤＲ１において、ヒト化Ａｂの３Ｄモデルの試験は、残基１、３および５の側鎖が、結合ポケットに指向されることを示した。結果として、本発明の焦点を合わせたライブラリーにおいて、これらの位置の各々は、システイン（「Ｃ」）を除く任意のネイティブのアミノ酸残基から選択され得る。システインは、標準的なＩｇ折り畳みの重要な成分であるジスルフィド結合を形成し得る。従って、遊離のチオール基を有することは、ＨＣの適切な折り畳みを妨害し得、そして選択されたＡｂの産生または操作において問題を生じ得る。従って、本発明の焦点を合わせたライブラリーにおいて、システインは、好ましい５アミノ酸のＣＤＲ１の位置１、３および５から排除される。他の１９種の天然のアミノ酸残基が、位置１、３および５において使用され得る。好ましくは、各々は、本発明の多彩なライブラリーにおいて等モル比で存在する。
【００３８】
３Ｄモデリングはまた、５アミノ酸のＣＤＲ１における残基２の側鎖が、結合ポケットから離されることを示唆する。この位置は、ＧＬＧおよび成熟遺伝子の両方において、実質的な多様性を示すが、本発明の焦点を合わせたライブラリーにおいて、この残基は、好ましくはＴｙｒ（Ｙ）である。なぜなら、これは、８２０の成熟抗体遺伝子のうちの６８１において生じるからである。しかし、Ｃｙｃ（Ｃ）以外の任意の他の天然アミノ酸残基もまた、この位置で使用され得る。
【００３９】
位置４について、ＧＬＧおよび成熟抗体遺伝子においていくらかの多様性が存在する。しかし、ほとんど全ての成熟遺伝子は、この位置で、非荷電の疎水性アミノ酸残基：Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、Ｉ、Ｖを有する。３Ｄモデルの検査はまた、残基４の側鎖が、ＨＣの内部にパックされることを示す。従って、フレームワーク３−２３を使用する本発明の好ましい実施形態において、残基４は、好ましくはＭｅｔである。なぜなら、これは、３−２３のフレームワークに、非常に良好に適合する可能性があるからである。他のフレームワークを用いて、類似の適合考慮を使用して、残基４を割り当てる。
【００４０】
従って、本発明の最も好ましいＨＣ ＣＤＲ１は、アミノ酸配列＜１＞Ｙ＜１＞Ｍ＜１＞からなる。ここで、＜１＞は、アミノ酸残基：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ（Ｃを除く）のいずれか１つであり得、好ましくは、各位置において等モル量で存在する。この多様性は、表１において、フレームワーク３−２３：ＪＨ４に関して示される。これは、６８５９倍の多様性を有する。
【００４１】
本発明の２つのあまり好ましくないＨＣ ＣＤＲ１は、長さ７および１４を有する。長さ７について、好ましい多彩性は、（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／＜１＞）２（Ｓ／Ｇ／＜１＞）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／＜１＞）７であり；ここで、（Ｓ／Ｔ）は、ＳｅｒおよびＴｈｒコドンの等モルの混合を示し；（Ｓ／Ｇ／＜１＞）は、Ｓが０．２０２５、Ｇが０．２０２５およびＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙの各々について０．０３５の混合を示す。この設計は、成熟ＨＣ遺伝子において生じるような、位置２、３および７での優勢なＳｅｒおよびＧｌｙを与える。長さ１４について、好ましい多彩性は、ＶＳＧＧＳＩＳ＜１＞＜１＞＜１＞ＹＹＷ＜１＞であり、ここで＜１＞は、Ｃｙｓ（Ｃ）以外の１９種の天然アミノ酸残基の等モルの混合である。
【００４２】
これらの好ましいＨＣ ＣＤＲ１をコードするＤＮＡは、好ましくは、トリヌクレオチドの構築ブロックを使用して合成され、その結果、各アミノ酸残基は、実質的に等モルでか、または他の記載された量で存在する。＜１＞のアミノ酸残基についての好ましいコドンは、ｇｃｔ、ｇａｔ、ｇａｇ、ｔｔｔ、ｇｇｔ、ｃａｔ、ａｔｔ、ａａｇ、ｃｔｔ、ａｔｇ、ａａｔ、ｃｃｔ、ｃａｇ、ｃｇｔ、ｔｃｔ、ａｃｔ、ｇｔｔ、ｔｇｇおよびｔａｔである。もちろん、選択されたアミノ酸残基についての他のコドンもまた使用される。
【００４３】
多様性オリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、好ましくは、ＢｓｐＥＩからＢｓｔＸＩへと合成され（表１に示すように）、従って、重複ＯＮを使用するＰＣＲ合成によって組み込まれるか、またはＢｓｐＥＩ／ＢｓｔＸＩ切断されたフラグメントのライゲーションによって導入されるかのいずれかであり得る。表２は、本発明の好ましい長さ５のＨＣ ＣＤＲ１の特定の多彩性を具体化するオリゴヌクレオチドを示す。ＯＮ−Ｒ１Ｖ１ｖｇ、ＯＮ−Ｒ１ｔｏｐおよびＯＮ−Ｒｌｂｏｔを使用するＰＣＲは、７３塩基対のｄｓＤＮＡ産物を生じ、ＢｓｐＥＩおよびＢｓｐＸＩでの切断は、末端から１１塩基および１３塩基をトリミングし、そして表１に示される３−２３ドメインを有する、同様に切断されたベクターに連結され得る粘着末端を提供する。ＯＮＲ１Ｖ２ｖｇまたはＯＮＲ１Ｖ３ｖｇのいずれかでのＯＮ−Ｒ１Ｖ１ｖｇの置換（表２を参照のこと）は、２つの代替的な多様性パターン（７残基長および１４残基長のＨＣ ＣＤＲ１）の合成を可能にする。
【００４４】
本発明のより好ましいライブラリーは、３つの好ましいＨＣ ＣＤＲ１長さの多様性を含む。最も好ましくは、この３つの長さは、ＣＤＲの長さを参照せずに選択された抗体において観察されるおよその比率で組み込まれるはずである。例えば、１０９５個のＨＣ遺伝子の１つのサンプルは、以下の比率で存在する３つの長さを有する：Ｌ＝５：Ｌ＝７：Ｌ＝１４：：８２０：：１７５：：２３：：０．８０：：０．１７：：０．０２。これは、本発明に従う好ましい比率である。
【００４５】
（（ｉｉ）ＣＤＲ２）
ＨＣ ＣＤＲ２における多様性を、ＨＣ ＣＤＲ１：ＧＬＧ配列、成熟配列および３Ｄ構造についての考慮と同じ考慮を用いて設計した。ＣＤＲ２についての好ましい長さは、表１に示すように、１７である。この好ましい１７の長さのＣＤＲ２について、本発明に従う好ましい多彩性は、以下：＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであり、ここで＜２＞は、Ｙ、Ｒ、Ｗ、Ｖ、ＧおよびＳ（等モルの混合物）の群から選択される任意のアミノ酸残基を示し、＜３＞は、Ｐ、ＳおよびＧまたはＰおよびＳのみであり（等モルの混合物）、そして＜１＞は、Ｃ以外の任意の天然のアミノ酸残基である（等モルの混合物）。
【００４６】
表３に示されるＯＮ−Ｒ２Ｖ１ｖｇは、この多様性パターンを具体化する。これは、好ましくは、ＢｓｔＸＩ部位およびＸｂａＩ部位を含むｄｓＤＮＡのフラグメントが、ＰＣＲによって作製され得るように合成される。ＯＮ−Ｒ２Ｖ１ｖｇ、ＯＮ−Ｒ２ｔｏｐおよびＯＮＲ２ｂｏｔを用いるＰＣＲは、１２２塩基対のｄｓＤＮＡ産物を生じる。ＢｓｔＸＩおよびＸｂａＩによる切断は、各末端から約１０塩基を除去し、そして表１に示される３−２３遺伝子を含む、同様に切断されたベクターに連結され得る粘着末端を生じる。
【００４７】
１７の長さのＨＣ ＣＤＲ２についての代替の実施形態において、以下の多彩性：＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ、が使用され得；ここで、＜１＞は、ＨＣ ＣＤＲ２のより好ましい代替について上記された通りであり；＜４＞は、等モルのＤＩＮＳＷＹの混合物を示し；そして＜５＞は、等モルのＳＧＤＮの混合物を示す。この多様性パターンは、表３に示されるＯＮ−Ｒ２Ｖ２ｖｇにおいて具体化される。好ましくは、これら２つの実施形態は、本発明のライブラリーにおいて、等モル混合物で使用される。
【００４８】
他の好ましいＨＣ ＣＤＲ２は、長さ１６および１９を有する。長さ１６：＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧ；長さ１９：＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧ、ここで、＜１＞は、Ｃ以外の全ての天然のアミノ酸残基の等モルの混合物であり；＜４＞は、ＤＩＮＳＷＹの等モル混合物であり；＜５＞は、ＳＧＤＮの等モルの混合物であり；そして＜８＞は、Ｒが０．２７および残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＳＴＶＷＹの各々が０．０２７である。表３は、長さ１６の好ましいＣＤＲ２多彩性を具体化するＯＮ−Ｒ２Ｖ３ｖｇ、および長さ１９の好ましいＣＤＲ２多彩性を具体化するＯＮ−Ｒ２Ｖ４ｖｇを示す。これらの多彩性を調製するため、ＯＮ−Ｒ２Ｖ３ｖｇは、ＯＮ−Ｒ２ｔｏｐおよびＯＮ−Ｒ２ｂｏ３を用いてＰＣＲ増幅され得、そしてＯＮ−Ｒ２Ｖ４ｖｇは、ＯＮ−Ｒ２ｔｏｐおよびＯＮ−Ｒ２−ｂｏ４を用いてＰＣＲ増幅され得る。表３を参照のこと。本発明の最も好ましい実施形態において、ＨＣ ＣＤＲ２の３つ全ての長さが使用される。好ましくは、これらは、以下の比で存在する：１７：１６：１９：：５７９：４６４：３１：：０．５４：０．４３：０．０３。
【００４９】
（（ｉｉｉ）ＣＤＲ３）
本発明の好ましいライブラリーは、いくつかのＨＣ ＣＤＲ３成分を含む。これらのいくつかは、配列多様性のみを有する。その他は、長さを伸ばすために嵌め込まれたＤセグメントを含む配列多様性を有し、一方でまた、Ｉｇが折り畳まれるのを可能にする既知の配列を取り込む。本発明の好ましいライブラリーのＨＣ ＣＤＲ３成分およびその多様性は、表４：成分１〜８に示される。
【００５０】
この成分のセットを、１３８３個のヒトＨＣ配列の配列の研究後に選択した。
提案された成分は、以下の目的を満たすはずである：
１）ネイティブのＡｂ遺伝子において見られるのとほぼ同じ長さ分布；
２）ネイティブのＡｂ遺伝子において高い多様性を有する場所での高レベルの配列多様性；および
３）ネイティブのＡｂ遺伝子においてしばしば見られる定常配列の組み込み。
【００５１】
成分１は、長さ０〜８（ＦＲ３の末端のＹＹＣＡＲモチーフ〜Ｊ領域（すなわち、ＦＲ４）の開始点近くのＷＧジペプチドモチーフからなる）を有する全ての遺伝子を示す。成分２は、長さ９または１０を有する全ての遺伝子に対応する。成分３は、長さ１１または１２を有する遺伝子および長さ１３を有する遺伝子の半分に対応する。成分４は、長さ１４を有する遺伝子、および長さ１３を有する遺伝子の半分に対応する。成分５は、長さ１５を有する遺伝子、および長さ１６を有する遺伝子の半分に対応する。成分６は、長さ１７を有する遺伝子、および長さ１６を有する遺伝子の半分に対応する。成分７は、長さ１８を有する遺伝子に対応する。成分８は、長さ１９以上を有する遺伝子に対応する。表４を参照のこと。
【００５２】
多様性＜１＞を有する各ＨＣ ＣＤＲ３残基について、等モルの比率は、好ましくは使用されない。むしろ、以下の比率が使用される：０．０９５［ＧおよびＹ］および０．０４８［Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＷ］。従って、等モル比の他の残基と共に、二倍用量のＧおよびＹが存在する。他の多様性について、例えば、ＫＲまたはＳＧの残基が、等モルの混合物中に存在する。
【００５３】
本発明の好ましいライブラリーにおいて、８つの成分は、以下の割合で存在する：１（０．１０）、２（０．１４）、３（０．２５）、４（０．１３）、５（０．１３）、６（０．１１）、７（０．０４）および８（０．１０）。表４を参照のこと。
【００５４】
本発明のより好ましい実施形態において、８つの成分の量は調整される。なぜなら、第１の成分は、それがライブラリーの１０％として含まれることを証明するには十分複雑でないからである。例えば、最終ライブラリーが、１×１０９のメンバーを含むとすると、１×１０８の配列が成分１から生じることになるが、たった２．６×１０５のＣＤＲ３配列しか生じず、その結果、各々の配列は、約３８５個のＣＤＲ１／２の状況で生じる。従って、８つの成分のより好ましい量は、１（０．０２）、２（０．１４）、３（０．２５）、４（０．１４）、５（０．１４）、６（０．１２）、７（０．０８）、８（０．１１）である。より好ましい実施形態に従って、成分１は、約７７個のＣＤＲ１／２の状況で生じ、そしてその他（より長いＣＤＲ３）が、より頻繁に生じる。
【００５５】
表５は、表４に示される８つのＨＣ ＣＤＲ３成分の各々を具体化するｖｇＤＮＡを示す。表５において、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）Ｃｔｏｐ２５、ＣｔｐｒｍＡ、ＣＢｐｒｍＢおよびＣＢｏｔ２５は、以下の多彩化ＯＮ（ｖｇＤＮＡ）の各々のＰＣＲ増幅を可能にする：Ｃ１ｔ０８、Ｃ２ｔ１０、Ｃ３ｔ１２、Ｃ４ｔ１４、Ｃ５ｔ１５、Ｃ６ｔ１７、Ｃ７ｔ１８およびＣ８ｔ１９。増幅後、ｄｓＤＮＡを、ＡｆｌＩＩおよびＢｓｔＥＩＩ（またはＫｐｎＩ）で切断し得、そして３−２３ドメインの残りを含む、同様に切断されたベクターに連結され得る。好ましくは、このベクターはすでに、本明細書中に開示されるようなＣＤＲ１およびＣＤＲ２の一方または両方において多様性を含む。最も好ましくは、これは、ＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域の両方において多様性を含む。もちろん、種々の多様性が、任意の順序でベクター中に組み込まれ得ることが理解されるべきである。
【００５６】
好ましくは、受容側のベクターは、元々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場所にスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を含み、その結果、得られたライブラリー中に続いて生じる親配列は存在しない。表６は、各ＣＤＲが、終止コドンおよびスタッファーが除去されていない任意のベクターの特異的な切断を可能にする制限部位の両方を含む短いセグメントによって置換された、Ｖ３−２３遺伝子セグメントのバージョンを示す。スタッファーは、短いか、最終ライブラリー中に生じない制限酵素部位を含むかのどちらでもよく、ＡｆｌＩＩおよびＢｓｔＥＩＩ（またはＫｐｎＩ）の両方によって切断されず、再連結されないベクターの除去を可能にする。あるいは、このスタッファーは、２００〜４００塩基長であり得、その結果、切断されないかまたは１回切断されたベクターは、二重に切断されたベクターから容易に分離され得る。
【００５７】
（ヒト抗体軽鎖：配列および長さの多様性）
（（ｉ）κ鎖）
（（ａ）フレームワーク）
本発明の好ましい実施形態において、κ軽鎖は、ＪＫ１領域と共にＡ２７フレームワークに構築される。これらは、ネイティブな遺伝子において最も一般的なＶ領域およびＪ領域である。しかし、他のフレームワーク（例えば、Ｏ１２、Ｌ１２およびＡ１１）および他のＪ領域（例えば、ＪＫ４）は、本発明の範囲から逸脱することなく使用され得る。
【００５８】
（（ｂ）ＣＤＲ１）
ネイティブなヒトκ鎖において、１１、１２、１３、１６および１７の長さを有するＣＤＲ１が観察され、長さ１１が優勢であり、そして長さ１２が十分に示される。従って、本発明の好ましい実施形態において、長さ１１および長さ１２のＬＣ ＣＤＲ１は、単独でか、またはネイティブな抗体において観察される混合と類似の混合で使用され、長さ１１が最も好ましい。長さ１１は、以下の配列：ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡを有し、そして長さ１２は、以下の配列：ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡを有する。ここで、＜１＞は、Ｃ以外のネイティブなアミノ酸残基全ての等モルの混合であり、＜２＞は、Ｓが０．２およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり、そして＜３＞は、Ｙが０．２およびＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹの各々が０．０４４である。本発明の最も好ましい実施形態において、両方のＣＤＲ１の長さが使用される。好ましくは、これらは、１１：１２：：１５４：７３：：０．６８：０．３２の比で存在する。
【００５９】
（（ｃ）ＣＤＲ２）
ネイティブのκにおいて、ＣＤＲ２は、長さ７のみを示す。この長さは、本発明の好ましい実施形態において使用される。これは、配列＜１＞ＡＳ＜２＞Ｒ＜４＞＜１＞を有し、ここで＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合であり；＜２＞は、Ｓが０．２およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．００４であり、そして＜４＞は、Ａが０．２およびＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＵＷＹの各々が０．０４４である。
【００６０】
（ｄ）ＣＤＲ３
ネイティブなκにおいて、ＣＤＲ３は、１、４、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１９の長さを示す。これらの長さのいずれかおよびこれらの混合物は、本発明において使用され得るが、長さ８、９および１０が好ましく、長さ９が最も好ましい。好ましい長さ９について、その配列は、ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔであり、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり、そして＜３＞は、Ｙが０．２およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷの各々が０．０４４である。長さ８は、好ましくは、ＱＱ３３１１１Ｐであり、そして長さ１０は、好ましくはＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔであり、ここで、１および３は、長さ９で規定されたものであり、そして２は、Ｓ（０．２）およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４である。３つの長さ全ての混合物が、最も好ましい（ネイティブな抗体における比）（すなわち、８：９：１０：：２８：１６６：６３：：０．１：０．６５：０．２５である）。
【００６１】
表７は、ｐｌａｃＺプロモーター（リボソーム結合部位およびシグナル配列（Ｍ１３ ＩＩＩシグナル））を含む本発明のκ鎖遺伝子を示す。ＤＮＡ配列は、ＧＬＧアミノ酸配列をコードするが、ＧＬＧ ＤＮＡ配列を含まない。制限部位は、各フレームワーク領域内に含まれるように設計され、その結果、多様性がＣＤＲ中にクローニングされ得る。ＸｍａＩおよびＥｓｐＩはＦＲ１内に、ＳｅｘＡＩはＦＲ２内に、ＲｓｒＩＩはＦＲ３内に、そしてＫｐｎＩ（またはＡｃｃ６５Ｉ）はＦＲ４内にある。さらなる部位が、この遺伝子の構築を容易にするために、定常κ鎖内に提供される。
【００６２】
表７はまた、κについての適切な多彩性（ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）スキームを示す。ＣＤＲ１において、最も好ましい長さ１１が示される。しかし、最も好ましい長さ１１および１２の両方が使用される。ＣＤＲ１中の長さ１２は、＜２＞（すなわち、Ｓｅｒバイアス混合物）としてコドン５１を導入することによって構築され得る。κのＣＤＲ２は、常に７コドンである。表７は、ＣＤＲ２について好ましい多彩性スキームを示す。表７は、最も好ましいＣＤＲ３（長さ９）についての多彩性スキームを示す。同様の多彩性が、長さ８および１０のＣＤＲについて使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、これら３つの長さ（８、９および１０）は、上記のように、ネイティブな比率で本発明のライブラリー中に含まれる。
【００６３】
表９は、表７に示されるκ鎖多様性を構築するために使用され得る、オリゴヌクレオチドおよびプライマーの一連の多様性を示す。
【００６４】
（ｉｉ）λ鎖
（ａ）フレームワーク
λ鎖は、好ましくはＬ２Ｊ領域を用いて２ａ２フレームワーク中に作製され得る。これらは、最も一般のネイティブな遺伝子におけるＶ領域およびＪ領域である。しかし、他のフレームワーク（例えば、３１、４ｂ、１ａおよび６ａ）および他のＪ領域（例えば、Ｌ１Ｊ、Ｌ３ＪおよびＬ７Ｊ）は、本発明の範囲から逸脱することなく使用され得る。
【００６５】
（ｂ）ＣＤＲ１
ネイティブなヒトλ鎖において、長さ１４を有するＣＤＲ１が優勢であるが、長さ１１、１２および１３もまた生じる。これらの長さのいずれかが本発明において使用され得るが、長さ１１および１４が好ましい。長さ１１について、その配列は：ＴＧ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞であり、そして長さ１４について、その配列は：ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳであり、ここで、＜１＞は、Ｔが０．２７、Ｇが０．２７およびＡＤＥＦＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜３＞は、Ｙが０．３６およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの各々が０．０３５５であり；そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物である。最も好ましくは、混合物（ネイティブな抗体中に生じるものと類似）（好ましくは、これら３つの長さの比が１１：１４：：２３：４６：：０．３３：０．６７である）が使用される。
【００６６】
（ｃ）ＣＤＲ２
ネイティブなヒトλ鎖において、長さ７を有するＣＤＲ２が、はるかに一般的である。この長さは、本発明において好ましい。この長さ７のＣＤＲ２の配列は、＜４＞＜４＞＜４＞＜２＞ＲＰＳであり、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物である。
【００６７】
（ｄ）ＣＤＲ３
ネイティブなヒトλ鎖において、長さ１０および１１のＣＤＲ３が優勢であるが、長さ９もまた一般的である。これら３つの長さのいずれかが本発明において使用され得る。長さ１１が好ましく、そして１０および１１の混合物がより好ましい。長さ１１の配列は：＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖであり、ここで、＜２＞および＜４＞は、λＣＤＲ１について規定したものであり、そして＜５＞は、Ｓが０．３６およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０３５５である。長さ１０の配列は：＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖであり、ここで、＜１＞は、ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、長さ１１について規定したものである。本発明の好ましい混合物としては、長さ１０および１１の等モル混合物が挙げられる。表８は、本発明に従う、好ましい重点的なλ軽鎖多様性を示す。
【００６８】
表９は、表７に示されたλ鎖多様性を構築するために使用され得る、一連の多様性オリゴヌクレオチドおよびプライマーを示す。
【００６９】
（遺伝的パッケージの構築方法）
別々のベクターに構築される重鎖ならびにκ軽鎖およびλ軽鎖の多様性が、最良である。第一に、合成遺伝子を設計して、合成可変ドメインの各々を具体化する。軽鎖は、ＡｐａＬＩ（シグナル配列のまさに末端に位置する）およびＡｓｃＩ（終止コドンの後ろに位置する）に対する制限部位によって結合される。重鎖は、ＳｆｉＩ（ＰｅｌＢシグナル配列内に位置する）およびＮｏｔＩ（ＣＨ１とアンカータンパク質との間のリンカー中に位置する）によって結合される。ＰｅｌＢ以外のシグナル配列（例えば、Ｍ１３ ｐＩＩＩシグナル配列）もまた必要であり得る。
【００７０】
最初の遺伝子を、所望のＣＤＲの代わりに「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列を用いて作成する。「スタッファー」は、裁断されて多様なＤＮＡによって置換されるべき配列であるが、機能的抗体遺伝子の発現を可能にしない。例えば、スタッファーは、正確に完成したライブラリーベクターを生じない、いくつかの終止コドンおよび制限部位を含み得る。例えば、表１０には、κＡ２７のＣＤＲ１についてのスタッファーは、ＳｔｕＩ部位を含む。ＣＤＲ１についてのｖｇＤＮＡは、ＥｓｐＩ、ＸｍａＩまたはＡｆｌＩＩ〜ＳｅｘＡＩまたはＫａｓＩのいずれかのカセットとして導入される。連結後、ＤＮＡは、ＳｔｕＩで切断され；所望のベクター中にはＳｔｕＩ部位は存在すべきではない。
【００７１】
スタッファーを有する重鎖遺伝子の配列が、表６に示される。スタッファーを有するκ軽鎖遺伝子の配列が、表１０に示される。スタッファーを有するλ軽鎖遺伝子の配列が、表１１に示される。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、重鎖およびκ軽鎖またはλ軽鎖の多様性は、これらの鎖のクローニングを可能にする適切な制限部位を有する単一のベクターまたは遺伝的パッケージ中に構築される（例えば、表示または表示および発現のために）。このようなベクターを構築するためのプロセスは、当該分野において周知であり、そして広範に用いられている。好ましくは、重鎖およびκ軽鎖のライブラリー、ならびに重鎖およびλ軽鎖のライブラリーは、単独に好ましい。次いで、最も好ましくは、２つのライブラリーを等モル量で混合して、最大の多様性を得る。
【００７３】
最も好ましくは、表示が、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上に有される。最も好ましいベクターは、Ｍ１３の全ての遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、および表示カセットを含む。好ましいベクターは、カセットとして遺伝子の多様なファミリーのメンバーを導入および切除を可能にする制限部位を有して提供される。好ましいベクターは、増幅ファージに用いられる増殖条件下での再配列に対して安定である。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法によって捕捉される多様性は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を表示および／または発現するファージミドベクター（例えば、ｐＣＥＳ１）中で、表示および／または発現され得る。このようなベクターをまた使用して、他のベクターまたはファージを使用する次の表示および／または発現についての多様性を保存し得る。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、本発明の方法によって捕捉された多様性は、酵母ベクター中で表示および／または発現され得る。
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
Ｃｔｏｐ２５は、ＣｔｐｒｍＡの最も５’側の２５塩基と同一である。
ＣＢｐｒｍＢの最も３’側の２３塩基は、各ｖｇＤＮＡ分子の最も３’側の２３塩基の逆相補体である。
ＣＢｏｔ２５は、ＣＢｐｒｍＢの５’末端の２５塩基と同一である。
【００８１】
【表５Ａ】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
Claims (43)
- ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物である、＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５；
（２）（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｘ）７であって、ここで、（Ｓ／Ｔ）は、Ｓ残基およびＴ残基の１：１混合物であり、（Ｓ／Ｇ／Ｘ）は、Ｓが０．２０２５、Ｇが０．２０２５、ならびにアミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々が０．０３５の混合物である、（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｘ）７；
（３）Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物である、Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４；ならびに
（４）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。 - 請求項１に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、重鎖ＣＤＲ１（１）、（２）、および（３）が、比０．８０：０．１７：０．０２で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。
- ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；＜２＞は、アミノ酸残基Ｙ、Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｇ、およびＳの各々の等モル混合物であり；そして＜３＞は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、およびＧの各々の等モル混合物であるかまたはＰおよびＳの等モル混合物である、＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（２）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；＜４＞は、残基Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｗ、Ｙの等モル混合物であり；そして＜５＞は、残基Ｓ、Ｇ、Ｄ、およびＮの等モル混合物である、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞＜Ｇ＞＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（３）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記に規定される通りである、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧ；
（４）＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧでここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；そして＜８＞は、Ｒが０．２７、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＳＴＶＷＹの各々が０．０２７である、＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧ；ならびに
（５）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。 - 請求項３に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、重鎖ＣＤＲ２（１）／（２）（等モル）、（３）、および（４）の混合物が、比０．５４：０．４３：０．０３で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。
- ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（２）ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（３）ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（４）ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＹおよびＷの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（５）ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧ；
（６）ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（７）ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＤおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＳおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（８）ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、Ｔ、ＤおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧ；ならびに
（９）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。 - 請求項５に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）のうちの１つまたはすべてにおける１が、ＧおよびＹの各々が０．０９５、ならびにＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷの各々が０．０４８である、焦点を合わせたライブラリー。
- 請求項５または請求項６に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、以下の比：
（１）０．１０
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１３
（５）０．１３
（６）０．１１
（７）０．０４および
（８）０．１０
で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。 - 請求項５または請求項６に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、以下の比：
（１）０．０２
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１４
（５）０．１４
（６）０．１２
（７）０．０８および
（８）０．１１
で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。 - ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ
（２）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜３＞は、Ｙが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷおよびＹの各々が０．０４４である、ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。 - 請求項９に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、ＣＤＲ１（１）および（２）が、比０．６８：０．３２で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。
- ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、κ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられ、該κ軽鎖ＣＤＲ１は、配列：
＜１＞ＡＳ＜２＞Ｒ＜４＞＜１＞
を有し、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜４＞は、Ａが０．２、ならびにＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０４４である、焦点を合わせたライブラリー。 - ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜３＞は、Ｙが０．２、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷの各々が０．０４４である、ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔ；
（２）ＱＱ３３１１１Ｐであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りである、ＱＱ３３１１１Ｐ；
（３）ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りであり、そして２は、Ｓが０．２、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４である、ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔ；ならびに （４）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。 - 請求項１２に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、ＣＤＲ３（１）、（２）、および（３）が、比０．６５：０．１：０．２５で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。
- ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳであって、ここで、＜１＞は、Ｔが０．２７、Ｇが０．２７、およびＡＤＥＦＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷＹの各々が０．０２７であり、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜３＞は、Ｙが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの各々が０．０３６である、ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳ；
（２）Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞であって、ここで、＜２＞は、上記（１）に規定される通りであり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物である、Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。 - 請求項１４に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、ＣＤＲ１（１）および（２）が、比０．６７：０．３３で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。
- ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、λ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられ、該λ軽鎖ＣＤＲ２は、配列：
＜４＞＜４＞＜４＞＜２＞ＲＰＳ
を有し、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物である、
焦点を合わせたライブラリー。 - ヒト抗体関連ペプチド、ヒト抗体関連ポリペプチド、およびヒト抗体関連タンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示するか、提示しかつ発現するか、または含み、かつ該抗体ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示するか、提示しかつ発現するか、または含む、ベクターまたは遺伝的パッケージの焦点を合わせたライブラリーであって、該ベクターまたは遺伝的パッケージは、以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列により特徴付けられる、焦点を合わせたライブラリー：
（１）＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖであって、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物であり；そして＜５＞は、Ｓが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０３５５である、＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖ；
（２）＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖであって、ここで＜１＞は、ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記（１）にて規定される通りである、＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物。 - 請求項１７に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、ＣＤＲ３（１）および（２）が、等モル混合物の状態で該ライブラリー中に存在する、焦点を合わせたライブラリー。
- 請求項１または請求項２に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、以下：
（１）請求項３または請求項４にて規定される重鎖ＣＤＲ２のうちの１つ以上；
（２）請求項５、請求項６、請求項７、または請求項８にて規定される重鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（３）（１）および（２）により特徴付けられるベクターまたは遺伝的パッケージの混合物；
からなる群より選択される重鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、焦点を合わせたライブラリー。 - 請求項３に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、請求項５、請求項６、請求項７、または請求項８にて規定される群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、焦点を合わせたライブラリー。
- 請求項１９または２０に記載の焦点を合わせたライブラリーであって、以下：
（１）請求項９または請求項１０にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（２）請求項１１にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ２；
（３）請求項１２または請求項１３にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；
（４）請求項１４または請求項１５にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（５）請求項１６にて規定されるλ軽鎖ＣＤＲ２；
（６）請求項１７または請求項１８にて規定されるλ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（７）（１）〜（６）のうちの１つ以上により特徴付けられるベクターおよび遺伝的パッケージの混合物；
からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、焦点を合わせたライブラリー。 - 以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団：
（１）＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物である、＜１＞１Ｙ２＜１＞３Ｍ４＜１＞５；
（２）（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｘ）７であって、ここで、（Ｓ／Ｔ）は、Ｓ残基およびＴ残基の１：１混合物であり、（Ｓ／Ｇ／Ｘ）は、Ｓが０．２０２５、Ｇが０．２０２５、ならびにアミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々が０．０３５の混合物である、（Ｓ／Ｔ）１（Ｓ／Ｇ／Ｘ）２（Ｓ／Ｇ／Ｘ）３Ｙ４Ｙ５Ｗ６（Ｓ／Ｇ／Ｘ）７；
（３）Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４であって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物である、Ｖ１Ｓ２Ｇ３Ｇ４Ｓ５Ｉ６Ｓ７＜１＞８＜１＞９＜１＞１０Ｙ１１Ｙ１２Ｗ１３＜１＞１４；ならびに
（４）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物。 - 請求項２２に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、重鎖ＣＤＲ１（１）、（２）、および（３）が、比０．８０：０．１７：０．０２で該集団中に存在する、集団。
- 以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団：
（１）＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；＜２＞は、アミノ酸残基Ｙ、Ｒ、Ｗ、Ｖ、Ｇ、およびＳの各々の等モル混合物であり；そして＜３＞は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、およびＧの各々の等モル混合物であるかまたはＰおよびＳの等モル混合物である、＜２＞Ｉ＜２＞＜３＞ＳＧＧ＜１＞Ｔ＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（２）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；＜４＞は、残基Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｗ、Ｙの等モル混合物であり；そして＜５＞は、残基Ｓ、Ｇ、Ｄ、およびＮの等モル混合物である、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞＜Ｇ＞＜５＞＜１＞＜１＞＜１＞ＹＡＤＳＶＫＧ；
（３）＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記に規定される通りである、＜１＞Ｉ＜４＞＜１＞＜１＞Ｇ＜５＞＜１＞＜１＞ＹＮＰＳＬＫＧ；
（４）＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧでここで、＜１＞は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々の等モル混合物であり；そして＜８＞は、Ｒが０．２７、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＳＴＶＷＹの各々が０．０２７である、＜１＞Ｉ＜８＞Ｓ＜１＞＜１＞＜１＞ＧＧＹＹ＜１＞ＹＡＡＳＶＫＧ；ならびに
（５）上記ＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物。 - 請求項２４に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、重鎖ＣＤＲ２（１）／（２）（等モル）、（３）、および（４）の混合物が、比０．５４：０．４３：０．０３で該集団中に存在する、集団。
- 以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団：
（１）ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（２）ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（３）ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（４）ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＹおよびＷの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１Ｓ２Ｓ３１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（５）ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１１ＣＳＧ１１ＣＹ１ＹＦＤＹＷＧ；
（６）ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；そして２は、ＫおよびＲの等モル混合物である、ＹＹＣＡ２１１Ｓ１ＴＩＦＧ１１１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（７）ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；２は、ＤおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、ＳおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１ＹＹ２Ｓ３３４４１１１ＹＦＤＹＷＧ；
（８）ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧであって、ここで、１は、アミノ酸残基Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹの各々等モル混合物であり；２は、ＳおよびＧの等モル混合物であり；そして３は、Ｔ、ＤおよびＧの等モル混合物である、ＹＹＣＡＲ１１１１ＹＣ２２３１ＣＹ１１１ＹＦＤＹＷＧ；ならびに
（９）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物。 - 請求項２６に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）のうちの１つまたはすべてにおける１が、ＧおよびＹの各々が０．０９５であり、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、およびＷの各々が０．０４８である、集団。
- 請求項２６または請求項２７に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、以下の比：
（１）０．１０
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１３
（５）０．１３
（６）０．１１
（７）０．０４および
（８）０．１０
で該集団中に存在する、集団。 - 請求項２６または請求項２７に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、重鎖ＣＤＲ３（１）〜（８）が、以下の比：
（１）０．０２
（２）０．１４
（３）０．２５
（４）０．１４
（５）０．１４
（６）０．１２
（７）０．０８および
（８）０．１１
で該集団中に存在する、集団。 - 以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団：
（１）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ
（２）ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜３＞は、Ｙが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷおよびＹの各々が０．０４４である、ＲＡＳＱ＜１＞Ｖ＜２＞＜２＞＜２＞＜３＞ＬＡ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物。 - 請求項３０に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、ＣＤＲ１（１）および（２）が、比０．６８：０．３２で該集団中に存在する、集団。
- κ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団であって、該κ軽鎖ＣＤＲ１は、配列：
＜１＞ＡＳ＜２＞Ｒ＜４＞＜１＞
を有し、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜２＞は、Ｓが０．２、ならびにＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４であり；そして＜４＞は、Ａが０．２、ならびにＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０４４である、集団。 - 以下からなる群より選択されるκ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団：
（１）ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔであって、ここで、＜１＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；＜３＞は、Ｙが０．２、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷの各々が０．０４４である、ＱＱ＜３＞＜１＞＜１＞＜１＞Ｐ＜１＞Ｔ；
（２）ＱＱ３３１１１Ｐであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りである、ＱＱ３３１１１Ｐ；
（３）ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔであって、ここで、１および３は、上記（１）に規定される通りであり、そして２は、Ｓが０．２、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々が０．０４４である、ＱＱ３２１１ＰＰ１Ｔ；ならびに
（４）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物。 - 請求項３３に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、ＣＤＲ３（１）、（２）、および（３）が、比０．６５：０．１：０．２５で該集団中に存在する、集団。
- 以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ１をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団：
（１）ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳであって、ここで、＜１＞は、Ｔが０．２７、Ｇが０．２７、およびＡＤＥＦＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＶＷＹの各々が０．０２７であり、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜３＞は、Ｙが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの各々が０．０３６である、ＴＧ＜１＞ＳＳ＜２＞ＶＧ＜１＞＜３＞＜２＞＜３＞ＶＳ；
（２）Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞であって、ここで、＜２＞は、上記（１）に規定される通りであり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物である、Ｇ＜２＞＜４＞Ｌ＜４＞＜４＞＜４＞＜３＞＜４＞＜４＞；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物。 - 請求項３５に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、ＣＤＲ１（１）および（２）が、比０．６７：０．３３で該集団中に存在する、集団。
- λ軽鎖ＣＤＲ２をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団であって、該λ軽鎖ＣＤＲ２は、配列：
＜４＞＜４＞＜４＞＜２＞ＲＰＳ
を有し、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり、そして＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物である、
集団。 - 以下からなる群より選択されるλ軽鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列の集団：
（１）＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖであって、ここで、＜２＞は、Ｄが０．２７、Ｎが０．２７、およびＡＥＦＧＨＩＫＬＭＰＱＲＳＴＶＷＹの各々が０．０２７であり；＜４＞は、アミノ酸残基ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷの等モル混合物であり；そして＜５＞は、Ｓが０．３６、およびＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＴＶＷＹの各々Ｓが０．０３５５である、＜４＞＜５＞＜４＞＜２＞＜４＞Ｓ＜４＞＜４＞＜４＞＜４＞Ｖ；
（２）＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖであって、ここで＜１＞は、ＡＤＥＦＧＨＩＫＬＭＮＰＱＲＳＴＶＷＹの等モル混合物であり；そして＜４＞および＜５＞は、上記＜１＞にて規定される通りである、＜５＞ＳＹ＜１＞＜５＞Ｓ＜５＞＜１＞＜４＞Ｖ；ならびに
（３）上記のＤＮＡ配列のいずれかにより特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物。 - 請求項３８に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、ＣＤＲ３（１）および（２）が、等モル混合物の状態で該集団中に存在する、集団。
- 請求項２２または請求項２３に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、以下：
（１）請求項２４または請求項２５にて規定される重鎖ＣＤＲ２のうちの１つ以上；
（２）請求項２６、請求項２７、請求項２８、または請求項２９にて規定される重鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（３）（１）および（２）により特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物；からなる群より選択される重鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、集団。 - 請求項２４に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、請求項２６、請求項２７、請求項２８、または請求項２９にて規定される群から選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲ３をコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、集団。
- 請求項４０または４１に記載の多彩なＤＮＡ配列の集団であって、以下：
（１）請求項３０または請求項３１にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（２）請求項３２にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ２；
（３）請求項３３または請求項３４にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；
（４）請求項３５または請求項３６にて規定されるκ軽鎖ＣＤＲ１のうちの１つ以上；
（５）請求項３７にて規定されるλ軽鎖ＣＤＲ２；
（６）請求項３８または請求項３９にて規定されるλ軽鎖ＣＤＲ３のうちの１つ以上；ならびに
（７）（１）〜（６）のうちの１つ以上により特徴付けられる多彩なＤＮＡ配列の混合物；
からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲをコードする多彩なＤＮＡ配列をさらに含む、集団。 - 請求項２２〜４２のうちのいずれか１項に記載の多彩なＤＮＡ配列を含む、ベクターの集団。
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