JP2004505277A - 生物試料由来のヘキソースモノリン酸の定量分析 - Google Patents

Abstract

本発明は、タンデム質量分析計を用いて、生物試料、好ましくは乾燥血液試料のヘキソースモノリン酸（ＨＭＰ）組成を定量分析する方法、ならびに、乾燥血液スポット試料のような同じ生物試料からアミノ酸、アシルカルニチン、およびＨＭＰの存在量を定量分析する方法に関する。本方法は、ガラクトース血症に関して新生児をスクリーニングするのに有用であり、アミノ酸、有機酸、および脂肪酸の代謝障害に関してスクリーニングする方法と一体化することができる。

Description

【０００１】
関連発明
本出願は、２０００年７月２８日出願で発明の名称が「生物試料由来のヘキソースモノリン酸の定量分析」である米国特許出願第０９／６２７，９７８号（参照によってその明細書がこの中に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、生物試料中のヘキソースモノリン酸（ＨＭＰ）を検出する方法およびその使用に関する。好ましい実施形態において、ガラクトース血症に関して新生児をスクリーニングするために本発明の方法を用いることができる。
【０００３】
発明の背景
ガラクトース血症は、新生児の期間に重篤な症状をもたらす致命的な疾患である。ガラクトース血症は、ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ酵素（ＧＡＬＴ）（ＥＣ．２．７．７．１２）の欠損（ＯＭＩＭ ２３０４００）によって生じる。
【０００４】
この疾患において、乳の摂取は、血液および尿中へのガラクトースの蓄積を生じさせ、ガラクトース−１−リン酸（Ｇａｌ−１−Ｐ）の高い細胞内濃度につながる。Ｇａｌ−１−Ｐは、いくつかの組織、特に肝臓、脳、および尿細管に有毒であると考えられている（１２）。主な症状は乳の摂取後直ぐに現れ、嘔吐、成長障害、肝障害による黄疸、および昏睡を含む。患者は昏睡状態となり、治療が早期に開始されなければ、しばしば、生後数週間で死がおとずれる。ガラクトースフリーの食事での治療は、１または２週間内に症状および兆候の後退を生じさせる。しかしながら、その疾患の低い頻度（デンマークでは約１：３５０００）および次善の臨床的認識のため、診断がしばしば遅れ、または症状が敗血症または同種免疫と誤って解釈され、遅い介入のせいで後遺症を生じさせる。そのような検討事項は新生児スクリーニングを支持するように思われるが、対立する結論を有する最近の２つの包括的なレビュー（１１、９）に示されているように、そのような新生児スクリーニングは未だ賛否両論である。未処置のガラクトース血症の重大な影響：新生児死または重篤な精神薄弱：をめぐる議論は全くなされていない。議論における主な論点は、費用便益比率に影響する疾患の低い頻度、次善のスクリーニングテスト、および例えば知能障害、言語障害、白内障、および高ゴナドトロピン性腺機能低下症のような早期診断および治療にも関わらず生じた長期転帰における後遺症である（１３、１４、１５）。
【０００５】
ガラクトース血症に関する新生児スクリーニングのためのいくつかの方法が存在する。それらの中で最も簡単な方法は、還元物質に関して尿を調べることである（すなわち、フェーリング液およびベネディクト液を用いる）。新生児スクリーニングのために一般的に用いられる試験は、乾燥血液スポットサンプル（ＤＢＳＳ）を使用する。Ｐａｉｇｅｎの方法（８）は、生物学的測定法によって、ガラクトースおよびＧａｌ−１−Ｐを定量する。しかしながら、その方法は自動化に適さず、新生児またはその母親の抗生物質による治療に敏感であり、さらに慎重な細菌維持方法が要求される。ＧＡＬＴ活性の測定は、Ｂｅｕｔｌｅｒ試験の基本である（１、２）。ＧＡＬＴは、熱または湿気による不活化に敏感であり、偽陽性のスクリーニング結果を生じさせる。多くのスクリーニング実験室はＰａｉｇｅｎ測定法とＢｅｕｔｌｅｒ測定法とを組み合わせて用い、ＧＡＬＴ、ガラクトキナーゼ、およびガラクトースエピメラーゼの欠損を検出することができるが、相対的に高い擬陽性率を有する（１１）。そのような疾患は、アルカリホスファターゼ−ガラクトースデヒドロゲナーゼ測定法によっても検出され得る（３、４）。
【０００６】
ガラクトース血症をスクリーニングおよび診断するための、改善された、より正確で、迅速で、費用効果を有し、かつ容易な方法に対する必要性がある。
【０００７】
発明の概要
本発明は、簡単で、完全自動化され、迅速で、かつ費用効果を有する、ヘキソースモノリン酸（ＨＭＰ）を検出および定量するためのスクリーニング方法を開発した。本方法を用いて、試料、好ましくは生物試料中のＨＭＰを検出および定量することができる。従って、例えば、異常なＨＭＰレベル（相対値または絶対値の何れか）に関連する疾患の危険性がある患者を診断、スクリーニング、または特定するための指標としてそのような方法を用いることができる。そのような疾患として、必ずしも限定はされないが、ガラクトース血症、果糖尿症、遺伝性果糖不耐性、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ欠損、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損、ＵＤＰ−ガラクトース−４−プライム−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．２）欠損、および糖尿病が挙げられる。好ましい適用において、新生児におけるガラクトース血症の指標として本方法を用いることができる。本発明の１つの実施形態において、新生児におけるガラクトース血症の診断に本方法を用いることができる。別の実施形態において、例えばガラクトース血症のようなＨＭＰ関連疾患のスクリーニングに本発明の方法を用いることができる。別の実施形態において、本スクリーニングの後に例えば遺伝子分析のような他の診断方法を実施し、または他の診断方法と共に本スクリーニングを実施して差し支えない。
【０００８】
この中で用いられている定量または定量分析の用語は、試料中のヘキソースモノリン酸および／または特定種類のヘキソースモノリン酸の相対量または絶対量（例えば濃度）を特定する任意の方法を含むことが意図されている。この中で用いられているＨＭＰレベルも、その文脈に沿って、ＨＭＰの絶対量および相対量の両方を称する。
【０００９】
好ましい実施形態において、本発明は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を用いて、血液試料、好ましくは濾紙または他の適切な媒体上の乾燥血液スポットから、ＨＭＰレベルを定量的に分析するための新規で迅速な技術を提供する。その新規な方法は、上記のＨＭＰ関連疾患、好ましくはガラクトース血症の診断において用いることができる。その新規な方法は、疾患をスクリーニングするのに用いられる先行技術の方法における制限の多くを克服する。
【００１０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、イオン化に適した形態で生物試料のＨＭＰ抽出物を得ることによって生物試料中のＨＭＰレベルを検出および定量する方法を提供する。この中で用いられている「ＨＭＰ抽出物」は、ＨＭＰを抽出するのに適した溶媒での生物試料の抽出物を称する。好ましい実施形態において、メタノールよりも高親水性である溶媒を用いて試料を抽出する。適切な溶媒は、アセトニトリル／水、テトラヒドロフラン／水、メタノール／水、酢酸エチル／水、またはイソプロパノール／水であって差し支えない。より好ましくは、溶媒はアセトニトリル／水の特性に類似の特性を有し、最も好ましくは、溶媒は３０−７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水である。
【００１１】
別の実施形態において、抽出前に生物試料を乾燥させる。さらに別の実施形態では、生物試料を例えば濾紙のような適切な媒体上にブロットし、乾燥させ、その後上記のように抽出する。
【００１２】
別の実施形態において、適用できる場合には、例えば全血、分画血液成分、組織（例えば肝臓生検切片）、尿、便、胆汁、唾液、汗、または他の腺分泌物のような、多くの生物試料を本発明の方法において用いることができる。好ましくは、生物試料は、適切な媒体上にブロットし、乾燥させ、その後抽出した全血である。
【００１３】
抽出に続いて、例えばエレクトロスプレーまたは空圧補助エレクトロスプレー（ｐｎｅｕｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）（例えばＩｏｎＳｐｒａｙ）のような技術を用いてＨＭＰ抽出物をイオン化し、ガス相イオン流を形成する。プレカーサ分子イオン、ＨＭＰの質量電荷比（すなわち２５９．０２ Ｄａ／ｅ）を有する分子ガス相イオンを選択およびフラグメント化して、ＨＭＰのプロダクトイオンを得る。関心プロダクトイオン、すなわちＨＭＰレベルあるいは例えばＧａｌ−１−Ｐまたはフルクトース−１−Ｐのような特定ＨＭＰの最良の指標となるプロダクトイオンを、検出されたその質量電荷比および得られたそのイオン強度によって選択する。イオン強度は、好ましくは陰イオンモードで記録される。
【００１４】
プロダクトイオンのイオン強度を用いて、スペクトル分析によって生物試料中のＨＭＰの定量的存在量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を特定しおよび／または試料のイオン強度を既知量または濃度のＨＭＰまたは特定種類のＨＭＰを含む対照のイオン強度と比較することによってＨＭＰまたは特定種類のＨＭＰの濃度を特定しおよび／または生物試料中に存在する特定種類のＨＭＰの相対量を示唆するイオン存在量比（ｉｏｎ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｒａｔｉｏ）を特定することができる。
【００１５】
さらに別の実施形態において、本発明の方法を用いて、例えば血液試料のような生物試料中のＨＭＰまたは特定種類のＨＭＰのレベルを、正常な個体のカットオフレベルと比較することによって、患者において例えばガラクトース血症のようなＨＭＰ関連疾患をスクリーニングおよび／または診断することができる。別の実施形態において、本発明は、ＨＭＰ関連疾患を有しない正常な個体およびＨＭＰ関連疾患を有する異常な個体またはＨＭＰ関連疾患を発症する危険性を有する個体のＨＭＰレベル（濃度および／またはＩＡＲ）のデータベースを作成する方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、スクリーニングおよび／または診断に有用である適切なＨＭＰ濃度および／またはＩＡＲのカットオフレベルを特定するためのデータベースの使用を提供する。１つの実施形態において、正常な個体におけるＨＭＰ濃度およびＩＡＲレベルの範囲を、異常な個体の範囲と比較することによって、適切なカットオフレベルを特定することができる。別の実施形態では、本発明の方法を用いて、生物試料中のＨＭＰまたは特定種類のＨＭＰのレベルを、データベース中のレベルおよび対応するＨＭＰ関連疾患の状態（正常または異常）と比較することによって、患者においてＨＭＰ関連疾患をスクリーニングおよび／または診断することができる。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、ＨＭＰレベルおよび対応するＨＭＰ関連疾患の状態のデータベースを作成する方法であって：（ａ）本発明の方法に従って個体のＨＭＰレベルを特定し；（ｂ）前記個体のＨＭＰ関連疾患の状態を特定し；（ｃ）（ａ）および（ｂ）からの情報を用いてデータベースを作成し；（ｄ）必要に応じて、他の個体からの生物試料を用いて工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し；（ｅ）（ｄ）からの情報を前記データベースに入力する；各工程を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、例えばメタノールのような適切な溶媒を使って、ＨＭＰ抽出前に、乾燥生物試料、好ましくは血液試料から、アミノ酸およびアシルカルニチンを抽出することができる。更なる分析のためにメタノール抽出物を除去し、残りの生物試料を上記のように再乾燥および処理して差し支えない。１つの生物試料、好ましくは血液試料を、ＨＭＰレベルに関して分析するのに加えて、患者においてアミノ酸、有機酸、および脂肪酸の代謝障害をスクリーニングおよび／または診断するのに用いることができるアミノ酸およびアシルカルニチンに関して定量的に分析することができる。
【００１８】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＨＭＰ関連疾患診断ビジネスを実施する方法であって：ＨＭＰ関連疾患の診断および／またはスクリーニングおよび／またはＨＭＰレベルのデータベースの開発において用いることができる、本発明の方法に従って生物試料からＨＭＰレベルを特定する方法を提供し；必要に応じて、ＨＭＰ関連疾患の診断に用いることができるＨＭＰレベルを特定する方法に対する権利を第三者にライセンス付与または売却する；ことを含んでなる方法を提供する。更なる実施形態において、ＨＭＰ関連疾患診断ビジネスを実施する方法は、ＨＭＰ関連疾患に関する適切なカットオフレベルを提供し、さらに必要に応じてそのカットオフレベルに対する権利を第三者にライセンス付与または売却することをさらにまたは代わりに含む。さらに他の実施形態では、本ビジネスを実施する方法は、ＨＭＰレベルおよび対応するＨＭＰ関連疾患の状態のデータベースを提供し、必要に応じてそのデータベースを第三者にライセンス付与または売却する。さらに別の実施形態において、本発明は、ＨＭＰ関連疾患診断ビジネスを実施する方法であって：第三者によって提供された生物試料のＨＭＰレベルを本発明の方法に従って特定し；例えば、ＨＭＰレベルを、ＨＭＰ関連疾患の指標となるカットオフレベルと比較することによって、そのＨＭＰレベルがＨＭＰ関連疾患を示唆するか否かを特定し；さらに、手数料を徴収してその結果を第三者に提供する：ことを含んでなる方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明のビジネス方法は、患者において、アミノ酸、有機酸、および脂肪酸の代謝障害を診断することをさらに含んでいて差し支えない。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい実施形態を示唆するが、単に例示によって与えられており、本発明の精神および範囲内に含まれる様々な変更および修飾がその詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【００２０】
図面の簡単な説明
ここで、図面に関連させて本発明を説明する：
図１は、グルコース−１−リン酸（パネル１Ａ）、ガラクトース−１−リン酸（パネル１Ｂ）、およびフルクトース−１−リン酸（パネル１Ｃ）の３つの優勢なフラグメントイオンを示す。
【００２１】
図２は、０から８ｍｍｏｌ／ｌまでのＧａｌ−１−Ｐの添加濃度範囲の９つの異なる標準血液スポットの３重測定からの標準曲線である。ＨＭＰプレカーサイオン（２５９．０２ Ｄａ／ｅ）の３つの異なるフラグメントイオン信号強度を各濃度に対して示す。フラグメントイオンは７８．９６ Ｄａ／ｅ、９６．９７ Ｄａ／ｅ、および１３８．９８ Ｄａ／ｅである。直線回帰分析を用いて、傾き（ａ）、切片（ｂ）、および推定値の標準偏差（ＳＥＥ）を導く。
【００２２】
図３は、ガラクトース血症の患者、ＧＡＬＴ活性が低下したＱ１８８Ｒ／Ｎ３１４Ｄ化合物ヘテロ接合体性の個体、および対照群からの、試料中のヘキソースモノリン酸濃度とイオン存在量比（ＩＡＲ）とを比較するスキャッチャープロットである。図３は、ＩＡＲが、７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントを用いた外部標準化曲線から特定されたＨＭＰの計算濃度と同等のスクリーニング能力（１００％感度および１００％特異性）を有することを示す。外部標準化による定量化のために３つ全てのＨＭＰフラグメントを用い得ることに注目すべきである。７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントが最も強いシグナル強度をもたらしたため、そのフラグメントを選択した。
【００２３】
図４は、タンデム質量分析計に注入されたＨＭＰの試料を測定することによって得られたイオン強度を表す全イオン電流クロマトグラム（ＴＩＣ）である。ＴＩＣは、ＨＭＰの３つのイオン化フラグメントの循環測定（ｃｙｃｌｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）からの信号の加算によって導かれる。
【００２４】
図５は、図４における斜線の時間枠において測定された３つのフラグメントイオンの各々の平均イオン強度のヒストグラムプロットを示す。さらに、図５は、関心フラグメントイオンを検出するのに用いられる質量／電荷設定（ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ ｓｅｔｔｉｎｇ）を示唆する。
【００２５】
図６は、本発明の１つの実施形態におけるタンデム質量分析計の機器設定を示す３ページプリントアウトである。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、試料、好ましくは生物試料、最も好ましくは血液試料中のＨＭＰ含有量を検出および定量分析する方法に関する。ＨＭＰとして、必ずしも限定はされないが、Ｇａｌ−１−Ｐ、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−１−リン酸、フルクトース−３−リン酸、およびフルクトース−６−リン酸が挙げられる。本発明を用いて、例えばガラクトース−１−リン酸、グルコース−１−リン酸、またはフルクトース−１リン酸等のＨＭＰの異常レベル（例えば高いまたは低い）に関連する疾患を有する患者をスクリーニングおよび／または診断し、またはそのような疾患の危険性を有する被験者を特定することができる。好ましくは、本発明を用いて、上昇した（または過剰な）ＨＭＰレベルを有する患者をスクリーニングおよび／または診断することができる。
【００２７】
より詳細には、上昇したＨＭＰ濃度またはＩＡＲレベルは、上昇したＧａｌ−１−Ｐレベルに相関する範囲で、ガラクトース血症の指標として用いることができる。適当な血液および／または組織試料を測定することによって検出可能な他の疾患として、必ずしも限定はされないが、遺伝性果糖不耐性（ＯＭＩＭ ２２９６００）、果糖尿症（肝フルクトキナーゼ欠損）（ＯＭＩＭ ２２９８００）、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ欠損（ＯＭＩＭ ２２９７００）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（ＯＭＩＭ ３０５９００）、ＵＤＰ−ガラクトース−４−プライム−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．２）欠損、および糖尿病が挙げられる。
【００２８】
本発明の方法は、例えば全血、分画血液成分、組織（例えば肝臓生検切片）、尿、便、胆汁、唾液、汗、または他の腺分泌物のような生物試料中のＨＭＰレベルを特定する方法を含む。その方法の例において、個体から全血を得て、例えば好ましくはリントフリーでかつ好ましくは高度に均質な液体吸収能を有する濾紙のような適切な基材または媒体上にブロットする。濾紙は、好ましくはセルロース濾紙である。次に試料を乾燥させる。濾紙上にブロットされた毛細血管全血試料は、世界的に、新生児スクリーニングに用いられる好ましい試料である。当業者は、試料採取の適切な方法に通じている。様々なやり方で試料を採取することができ、例えば、血液試料に関して、（ａ）皮膚への切込みからの毛細血管血の直接ブロッティング、（ｂ）抗凝血剤を含むチューブ内への採取および続く濾紙への添加、（ｃ）抗凝血剤を含むまたは含まないチューブへの採取、乾燥、およびチューブ内で実施される抽出、（ｄ）抗凝血剤を含むチューブ内への採取および続く一部の分析。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態に従って、ある量の生物試料、すなわち全血、分画血液、唾液、汗、尿、便、胆汁、組織ホモジネート、または他の腺分泌物を、濾紙または他の適切な物質上に置き、約１０−１００℃、より好ましくは室温、さらに好ましくは１９−２６度で乾燥させることによって、試料を調製する。濾紙は、好ましくはセルロース濾紙であるが、他のタイプの基材も適用できる。例えば抗凝血剤処理した全血、血液画分、唾液、尿または組織ホモジネートのような、チューブ中の液体試料も適用することができる。濾紙上にブロットされる量は、通常５０−１００μｌの範囲であり、好ましくは約７５μｌである。
【００３０】
乾燥後、固定量（通常３．２μｍ径の円板状であり、通常、約３．５μｌの試料を表す）の乾燥血液濾紙試料を濾紙からパンチし、マイクロプレートまたは他の適切な容器に入れる。ＨＭＰ、好ましくはＧａｌ−１−Ｐを抽出するのに適した溶媒を用いて、乾燥血液試料からＨＭＰを抽出する。１つの実施形態において、ＨＭＰを抽出するのに適した溶媒は極性溶媒である。別の実施形態では、溶媒はメタノールより高親水性であるものが好ましい。好ましくは、溶媒は水に混和性のものである。好ましくは、十分な極性を確保するため水が存在する。適切な溶媒の例は、限定はされないが、アセトニトリル／水、好ましくは３０：７０から７０：３０（ｖ／ｖ）まで、さらに好ましくは１：１（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水に類似の特性を有する溶媒である。他の適切な溶媒は、酢酸エチル／水、テトラヒドロフラン／水、メタノール／水、またはイソプロパノール／水であって差し支えない。最も好ましくは、抽出バッファーは、アセトニトリル：水（１：１）（ｖ／ｖ）である。約５０−１０００μｌ、好ましくは約１５０μｌの抽出バッファーと共に、約５−１００分間、好ましくは２０分間、好ましくは室温辺りで、濾紙をインキュベートする。当業者は他の温度も適用できることを理解するであろうが、室温は便利でかつ蒸発による溶媒損失を伴う問題を生じさせないため、室温が好ましい。
【００３１】
好ましくは約１００−２００μｌの、得られた溶液または抽出物の試料を好ましくは遠心して残骸を除去し（すなわち約１８０００−１００００ｇで１０分間）、その後、試料中のＨＭＰの定量分析のためにタンデム質量分析を行い、その際、溶液をイオン化し、イオンを脱溶媒和させ（ｄｅｓｏｌｖａｔｅ）、その後それらの質量電荷比によってイオンおよびそのフラグメントを単離および検出する。イオン化の前に、必要に応じて試料を液体クロマトグラフィーにかけて、抽出物中の粒子状の残骸または干渉もしくは信号抑制化合物を取り除いても差し支えない。
【００３２】
試料調製の特定方法がこの中に記載されているが、本方法を実施するのに用いられる質量分析計によるＨＭＰ検出および分析に適している試料調製の任意の形態が適切であることを当業者が理解することに注意すべきである。例えば、試料調製の方法は、試料の性質（すなわち、血液、唾液、または組織）および／または用いられる質量分析計の型によって変化するであろう。
【００３３】
本発明の１つの実施形態において、ＨＭＰの抽出に適した溶媒での抽出の前に、本発明の乾燥生物試料、好ましくは血液を、例えばアミノ酸およびアシルカルニチンの抽出等、ＨＭＰ以外の成分を抽出するのに適した別の溶媒（例えばメタノール）で予備抽出して差し支えない。そのようにして得られた抽出物自体を分析して、特定アミノ酸またはアシルカルニチンレベルに関連する疾患をスクリーニングすることができる。例えば、フェニルアラニンレベルの上昇は、フェニルケトン尿症を示唆するであろう。Ｒａｓｈｅｄらの方法に従って分析を実施して、フェニルケトン尿症をスクリーニングすることができる（１０）。その後、その予備抽出乾燥血液スポットを回収し、好ましくは窒素下で乾燥し、さらに上記のようにＨＭＰを抽出するのに適した溶媒で抽出して、上記のようにＨＭＰに関してスクリーニングすることができる。従って、好ましい実施形態において、本発明は、１つの乾燥血液スポットを用いて、例えばガラクトース血症のようなＨＭＰ関連疾患、ならびにアミノ酸、有機酸および脂肪酸の代謝障害（例えばフェニルケトン尿症）のようなアミノ酸およびアシルカルニチンの異常レベルに関連する疾患の両方をスクリーニングすることができる。
【００３４】
質量分析
本発明のＨＭＰレベルを分析する好ましい方法は、タンデム質量分析によるものである。
【００３５】
タンデム質量分析計は、最初に粒子をイオン化し、その後その質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてそれらを分離する。タンデム質量分析計は、タンデムに配置された、少なくとも２つのマスフィルター、好ましくは四重極フィルターを有する。第１のマスフィルター（Ｑ１）は、プレカーサイオン質量電荷比（ＨＭＰの場合約２５９．０２ Ｄａ／ｅ）を伝達するように設定される。伝達イオンは、窒素のような不活性ガスを含む衝突セル（Ｑ２）中に導かれる。選択されたイオンがガス分子と衝突した時、それらイオンがフラグメント化し、プロダクトイオンを生じる。第２のマスフィルター（Ｑ３）は、選択されたプロダクトイオン質量電荷比を検出器［Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＲＭ）］に伝達するように設定される。次に、当業界で公知の技術を用いて、プロダクトイオンのイオン強度を特定することができる。ＨＭＰは、各々対応する質量電荷比：約７８．９６ Ｄａ／ｅ、９６．９７ Ｄａ／ｅ、および１３８．９８ Ｄａ／ｅを有する３つの優勢なプロダクトイオン：［ＰＯ_３］⁻、［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻、および［（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ）ＨＰＯ_４］⁻を有する。当業者は、この中で提供されているｍ／ｚ値が、分子質量の計算の仕方またはタンデム質量分析計の校正の仕方に依存して僅かに変動し得ることを理解するであろう。
【００３６】
多くのタンデム質量分析計は、第１と第２のマスフィルターの間に、フラグメント化部分または衝突セルを有する。フラグメント化部分は、通常、イオン拘束装置（ｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｄｅｖｉｃｅ）としてラジオ周波数のみの形態で操作され、約３ミリトルの圧力で衝突ガスを含む四重極マスフィルターである。第１および第２のマスフィルターは、フラグメント化部分の何れかの側に置かれた四重極である。三重の四重極装置において、それら四重極は通常Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３と称され、Ｑ２はフラグメント化部分または衝突セルである。第３の四重極Ｑ３がＴＯＦ部分に置き換えられているいわゆる飛行時間（ＴＯＦ）装置を用いることも可能である。しかしながら、多くの他のタンデムまたは別の質量分析計が公知であり、分析および四重極フィルターの様々な組合せが挙げられ、本発明の方法を提供するのに用いることができる。可能な構成は、イオントラップ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、Ｑ−ＴＯＦ、ポスト−ソース分解を用いるＴＯＦ、質量分析イオン運動エネルギー分光計（ＭＩＫＥＳ）、四重極イオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＩ−ＩＣＲ）、およびプレカーサイオンの予備選択（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）後にプロダクトイオンスペクトルを作ることができる他の方法を含む。
【００３７】
例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、空圧補助エレクトロスプレーイオン化（例えばＩｏｎＳｐｒａｙ）、液体二次イオン（ＬＳＩ）、高速原子衝突（ＦＡＢ）、高速イオン衝突（ＦＩＢ）、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）のようなパルスイオン化ソース等、粒子をイオン化する様々な手段がある。本発明の好ましい方法は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および空圧補助エレクトロスプレーイオン化（例えばＩｏｎＳｐｒａｙ）である。
【００３８】
未知量のＨＭＰを含む試料から、各イオン化フラグメントまたはプロダクトイオンのどの程度が特異的にＧａｌ−１−Ｐを表すのかを現在は特定することはできないが、［ＰＯ_３］⁻フラグメントが最も大量に存在しかつ試料中のＧａｌ−１−Ｐの最良の指標となることが特定されている。［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻フラグメントまたはプロダクトイオンは、フルクトース−１−リン酸の最高の指標となり、従って、好ましくは、フルクトース−１−リン酸レベルに関連する疾患の診断においてそのフラグメントが用いられる。すなわち、ＨＭＰ関連疾患のスクリーニングまたは診断に用いられる好ましい関心プロダクトイオンは、その疾患に基づいて変化するであろう。さらに、グルコースとフルクトースとの等モル混合物を静脈投与によって乳児に与えた場合、本発明によって測定したＨＭＰの濃度の上昇を生じさせないことが認められた。
【００３９】
本発明の１つの実施形態において、リン酸基がヘキソースの環構造の一部である炭素原子に結合している場合、ｍ／ｚ ７８．９６プロダクトイオン（すなわち［ＰＯ_３］⁻が予想以上に優勢である。このことは、例えばガラクトース−１−リン酸およびフルコース−１−リン酸のようなアルドヘキソース−１−モノリン酸に関してそうである。リン酸基が環構造の一部ではない側鎖炭素原子に結合している場合には、ｍ／ｚ ９６．９７プロダクトイオン（すなわち［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻）が優勢である。このことは、例えばグルコース−６−リン酸、フルクトース−１−リン酸およびフルクトース−６−リン酸のような、ケトヘキソース−１−モノリン酸またはケトヘキトース−６−モノリン酸においてそうである。
【００４０】
従って、本発明の１つの実施形態において、アルドヘキソース−１−モノリン酸濃度またはレベルを特定するため、あるいはアルドヘキソース−１−モノリン酸関連疾患の診断またはスクリーニングのため、あるいはアルドヘキソース−１−モノリン酸関連疾患のスクリーニングおよび／または診断のためにＨＭＰ濃度またはレベルのデータベースを開発する際に、好ましい関心プロダクトイオンは、［ＰＯ_３］⁻、すなわち７８．９６ ｍ／ｚプロダクトイオンであろう。本発明の別の実施形態において、アルドヘキソース−６−モノリン酸およびケトヘキソース−１−または６−モノリン酸の濃度またはレベルを特定するため、あるいはアルドヘキソース−６−モノリン酸およびケトヘキソース−１−または６−モノリン酸に関連する疾患の診断またはスクリーニングのため、あるいはアルドヘキソース−６−モノリン酸およびケトヘキソース−１−または６−モノリン酸に関連する疾患のスクリーニングおよび／または診断のためにＨＭＰ濃度またはレベルのデータベースを開発する際に、好ましい関心プロダクトイオンは、［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻、すなわち９６．９７ ｍ／ｚプロダクトイオンであろう。
【００４１】
標準化および診断適用
結果を校正し、偽陽性および偽陰性を最小化するための様々な標準化技術が本発明において考えられている。例えば外部標準を用いて、健康な個体から採取されかつＧＡＬＴ活性が阻害される条件下（例えば低温、すなわち１−２５℃、好ましくは１−９℃）で濾紙上にブロットされた全血試料に、既知量のＨＭＰ、好ましくはＧａｌ−１−Ｐを添加することができる。各分析の実施において、試験試料と同様にそのような一連の外部標準を処理することができる。
【００４２】
内部標準も使用できる。例えば、本発明者は、ＳＲＭ遷移２５９．０２−７８．９６と２５９．０２−９６．９７とのイオン存在量比（ＩＡＲ）の電位、すなわち、共にプレカーサイオン２５９．０２ Ｄａ／ｅから生じるフラグメント７８．９６ Ｄａ／ｅの信号強度対フラグメント９６．９７ Ｄａ／ｅの信号強度の比を分析した。そのＩＡＲは、７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントを用いた外部標準化曲線から特定されたＨＭＰの計算濃度と同等のスクリーニング能力（１００％感度および１００％特異性）を有する。
【００４３】
さらに、Ｇａｌ−１−Ｐの同位体標識内部標準を内部標準として用いることができる。基本的に、非標識Ｇａｌ−１−Ｐを越える質量増加、好ましくは３Ｄａ以上の質量増加をもたらす安定な同位体で標識した任意のＨＭＰが適している。リン酸基上に標識を配置させるとプレカーサイオンおよびプロダクトイオンの両方において質量増加が得られるため、標識内部標準からの信号干渉を防止するためにリン酸基上に標識を配置させるのが好ましい。このことは、標識リン酸基を作り出すような内部標準の潜在的加水分解の評価も可能にするであろう。
【００４４】
患者のＨＭＰ濃度またはＩＡＲを、ＨＭＰ疾患、すなわちガラクトース血症の指標となるカットオフレベルの値と比較することによって、ＨＭＰレベルの上昇を特定することができる。正常な個体および例えばガラクトース血症患者のようなＨＭＰ関連疾患を有する個体において認められるＨＭＰ濃度またはＩＡＲレベルから、適切なカットオフレベルを特定することができる。本発明の方法に従って、疾患を有するまたは有しないことが分かっている被験者の試料を定量分析することによって、正常なおよび異常なＨＭＰ濃度またはＩＡＲレベルのデータベースを開発することができる。正常な個体およびガラクトース血症患者の指標となるＨＭＰ濃度またはＩＡＲレベルを特定し、それに基づいて診断に用いるカットオフ値を特定する。データベースは継続的に更新することができる。そのようなデータベースを作成する方法も、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。ＨＭＰ濃度の上昇またはＩＡＲの上昇は、Ｇａｌ−１−Ｐのレベルの上昇に相関し、従ってガラクトース血症の仮診断を可能にする。
【００４５】
現在の発明者は、０．９４ｍＭを超えるＨＭＰレベルまたは１．４１ＩＡＲが、ガラクトース血症を潜在的に示唆することを特定した。しかしながら、最も指標となるのは、２．６ｍＭと５．２ｍＭの間のＨＭＰレベル、または１．６９−１．７６のＩＡＲであり、その範囲は、７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントを用いる外部標準化によって特定された実施例における全ての平均患者濃度を含む。従って、ＧＡＬＴ帰無遺伝子（ＧＡＬＴ ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ）およびデュアルテ遺伝子（Ｄｕａｒｔｅ ａｌｌｅｌｅ）に関して化合物ヘテロ接合体性の個体の検出が望まれている場合には、その実施例に基づくガラクトース血症に関するカットオフは、０．９５から２．５ｍｍｏｌ／ｌまでのＨＭＰ濃度および１．４２から１．６８までのＩＡＲであり、より好ましくは０．９５から１．４３ｍｍｏｌ／ｌまでのＨＭＰ濃度および１．４２から１．５６までのＩＡＥである。本発明者は、データの分析によって特定された新生児スクリーニングのための好ましいカットオフが、ＧＡＬＴ遺伝子（デュアルテ突然変異）における部分分断突然変異および完全分断突然変異に関する化合物へテロ接合体を検出すべきか否かに依存して、１．２ｍＭまたは２．０ｍＭのＨＭＰ（１．４９または１．６３のＩＡＲ）であることを推奨する。低い方のＨＭＰ濃度およびＩＡＲ値は、ガラクトース血症患者、ならびに部分的分断ＧＡＬＴ遺伝子（デュアルテ遺伝子）および完全分断ＧＡＬＴ遺伝子を担持する化合物へテロ接合体の検出を可能にするであろう。高い方のＨＭＰ濃度およびＩＡＲ値は、両方の対立遺伝子における完全不活化ＧＡＬＴ遺伝子を有する個体、すなわちガラクトース患者の検出をもたらすであろう。
【００４６】
類似の方法を用いて、他のＨＭＰ関連疾患に関する適切なカットオフレベルを特定することができる。
【００４７】
この中で概説された本発明のスクリーニング方法を、単独で、または他の診断指標と組み合わせて用いることができる。本発明の方法は、遺伝子解析のような更なる診断追跡のために個体をスクリーニングするのに用いることができる。この中に概説されている方法は、ＨＭＰ関連疾患診断ビジネスを実施するための方法においても用いることができる。
【００４８】
以下の非限定的実施例は、本発明を例証する：
実施例
初めに
以下の実施例は、新生児の血液濾紙試料中のＨＭＰの含有量を定量する方法について記載する。
【００４９】
装置および材料
以下の装置および材料を下記の実施例において用いた：
装置：
（ａ）Ｐｕｎｃｈｅｒ Ｗａｌｌａｃ， Ｄｅｌｆｉａ 乾燥血液スポットパンチャー１２９６−０７１、製造番号ＬＲ５２５００、パンチヘッドの直径：３．２ｍｍ
（ｂ）８−チャンネルピペット、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｆ ２４４４９、製造番号４５１０
（ｃ）ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ ３６５ タンデム質量分析器（ＩｏｎＳｐｒａｙソースを装備）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｓｃｉｅｘ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ、製造番号００２９７１２ＰＴ）
（ｄ）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒシリーズ２００オートサンプラー、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｗａｌｋ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ， ＵＳＡ、製造番号２９３Ｎ８０４０６１３）
（ｅ）Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０Ａｖｄｐポンプ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ， 品番２２８−３９０００−９２、製造番号Ｃ２０９６３５０２４７０
（ｆ）Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ３コンピューター、製造番号ＸＢ８１３０３ＨＢＢＷ
（ｇ）Ｎｅｏ Ｃｈｒｏｍソフトウェア、バージョン１．０ｇ
（ｈ）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｗｅｉｇｈｔ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、製造番号７１００４４２３、Ｋｅｂｏｌａｂ， Ｄｅｎｍａｒｋ
材料
（ａ）ガラクトース−１−リン酸（カタログ番号Ｇ−０３８０、ロット番号３２Ｈ７０３（１）；グルコース−１−リン酸（カタログ番号Ｇ−６８７５）；およびフルクトース−１−リン酸（カタログ番号Ｆ−１１２７）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した
（ｂ）アセトニトリル、Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ／０６２７／１５
（ｃ）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ａ１０（社内システム）からの超高品質（ＵＨＱ）水
（ｄ）マイクロプレート用のシーリングフィルム、Ｎｕｎｃ、カタログ番号２３６３６６
（ｅ）ポリスチレンマイクロタイタープレート、円錐底ウェル、Ｎｕｎｃ、カタログ番号２４５１２８
（ｆ）抽出／実施バッファー：５００ｍｌ ＵＨＱ−水および５００ｍｌのアセトニトリル、０．４５μｍナイロン−６６フィルター（Ｖａｒｉａｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍ）で濾過し、ヘリウムを噴霧することによって脱気した
（ｇ）濾紙、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、カタログ番号２９９２
（ｈ）ＥＤＴＡバイアル、Ｖｅｎｏｊｅｔ， ＶＴ−１００ＴＫ、０．１ｍｌ ＥＤＴＡ ０．４７Ｍ、ロット番号９７１２２Ｌ７
（ｉ）試料ガラス、ＷＲ １２７０、１４．５ｘ１００ｍｍ、Ｔｈｕｅｒｉｎｇｅｒ Ｐｈａｒｍａ ｇｌａｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ。
【００５０】
材料および方法
試薬
ガラクトース−１−リン酸、グルコース−１−リン酸、およびフルクトース−１−リン酸はＳｉｇｍａから購入した（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）。抽出液／移動相は、社内のＭｉｌｌ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ＵＳＡ）からの超高品質水とアセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）との１：１混合物であった。使用前に、その溶液を０．４５μｍナイロン−６６フィルター（Ｖａｒｉａｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で濾過し、さらにヘリウムを噴霧することによって脱気した。
【００５１】
被験者および血液試料
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ， Ｄｅｎｍａｒｋでの医療記録から、１９８４年から１９９８年の期間にガラクトース血症を有すると診断された２２名の患者を同定した。全ての診断は、ＧＡＬＴ遺伝型分析によって確認された。デンマーク新生児スクリーニングプログラムは、通常生後５から７日までに得られた、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ ２９９２フィルター上に採取された乾燥血液スポット試料（ＤＢＳＳ）を利用する。ルーチン分析の後、生物試料バンクにおいてＤＢＳＳを２０℃で保存する（７）。初期のＤＢＳＳの残留物が１２人のガラクトース血症患者から利用できた。ルーチン新生児スクリーニングプログラムによって分析された後にガラクトース血症とは同定されなかった生後７−１０日の明らかに健康な乳児からのＤＢＳＳ残留物を無作為に２０５５個集めることによって、参照群を確立した。出生時体重および血液採取が行われた時の生後年齢に関する情報は、血液試料データ形式から得られた。糖質注入群は、５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび５％（ｗ／ｖ）フルクトースを混合して含む静脈内輸液を受けた新生児集中治療患者の試料から構成される。その群は、糖質注入の間のルーチン臨床化学検査のために使用して余ったＥＤＴＡ−血液からＤＢＳＳを作ることによって、匿名で評価した。ヘキソースモノリン酸（ＨＭＰ）安定性群は、２０℃で１、２、５、および１０年間（各保存期間について１６０試料）の間保存した無作為ＤＢＳＳから構成される。
【００５２】
外部濃度標準
異なる濃度のＧａｌ−１−Ｐを含むストック溶液を、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ／水で調製した。健康な空腹時の成人女性からＥＤＴＡ−バイアル中に血液を採取した。内因性ＧＡＬＴ活性を抑制するため、４℃に血液を冷却した。１９３０ｍｌの予め冷却した血液に、Ｇａｌ−１−Ｐの各ストック溶液から７０ｍｌを加えた。混合物を穏やかに反転させた。濾紙（Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、カタログ番号２９９２）上に、Ｇａｌ−１−Ｐを混入した血液７５μｌをピペットで取ることによって、血液スポット濃度標準を調製した。室温で１晩標準試料を乾燥させ、続いて、ジップロックプラスチックバッグ中において２０℃で保存した。標準試料は以下の濃度の添加Ｇａｌ−１−Ｐを含む：０；０．０６２５；０．１２５；０．２５；０．５０；１．０；２．０；４．０；８．０ｍＭ。濾紙上にスポッティングする前に４℃または室温で２１時間までの間プレインキュベートしておいた０．０６２５ｍｍｏｌ／ｌのＧａｌ−１−Ｐを混入したＥＤＴＡ−血液から作られたＤＢＳＳを測定することによって、外部標準の調製の間におけるＧａｌ−１−Ｐの安定性を評価した。
【００５３】
ガラクトース−１−リン酸の抽出
ＤＢＳＳからＧａｌ−１−Ｐを抽出するのに用いられる溶媒の最適組成を特定するため、一連の溶媒の何れかの溶媒を１０％ずつ１０−９０％（ｖ／ｖ）の濃度範囲で変化させて、アセトニトリルと水、メタノールと水、およびメタノールとアセトニトリルの様々な混合物を試験した。以下の変更を加えて、試料調製部分に記載のように、抽出溶媒を用いてマイクロタイタープレート中の０．５ｍｍｏｌ／ｌのＧａｌ−１−Ｐ濃度標準の抽出物を調製した：脱溶媒和およびイオン形成に対する溶媒組成の影響を評価するため、穏やかな窒素ガスの流れの下、４５℃で全ての抽出物を蒸発させ、さらにアセトニトリル：水（１：１）中に再溶解させ、タンデムＭＳ装置に注入し、記載のようにカウントした。
【００５４】
試料調製
各ＤＢＳＳから、直径３．２ｍｍの１つのディスクをパンチして、円錐底マイクロタイタープレート中のブランクウェルに入れた。８−チャンネルピペットを用いて各ウェルに抽出溶液（１５０μｌ）を添加し、そのプレートを接着性フィルム（Ｎｕｎｃ， Ｓｅａｌｉｎｇ ｔｙｐｅ ＳＩ、カタログ番号２３６３６６）で密閉した。オービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）上で２０分間穏やかに回転させることによって抽出を実施し、１００μｌを新しいマイクロタイタープレートに写し、そのプレートを接着性フィルムで密封した。１８００ｇで１０分間遠心することによって濾紙の糸屑を沈降させて、自動注入口およびチューブ系の詰まりを防止した。
【００５５】
三重で外部標準群をマイクロタイタープレートに装填した。患者試料は二重で測定し、糖質注入群からの試料は三重で測定した。標準群、患者群、糖質注入群からの各測定の前に、ブランク試料（抽出溶液）を装填し、試料の残留の可能性を完全に回避した。ブランクによって分けることなく、参照群からの試料を１つずつ測定した。測定の２０番目の試料は全て、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＧａｌ−１−Ｐを含む対照試料であった。処理されたマイクロタイタープレートを、４℃に設定したペルチエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）冷却素子を取り付けたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ２００オートサンプラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＵＳＡ）に装填した。パンチングを含めて、３００試料の調製に通常１−１．５時間要した。
【００５６】
タンデム質量分析計
エレクトロスプレーソース（ＩｏｎＳｐｒａｙ）を備えたＡＰＩ−３６５タンデム質量分析計（ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ）において全ての測定を実施した。検討した全ての脱プロトン化ＨＭＰ（２５９．０２ Ｄａ／ｅ）が、以下の適用における飛越し選択反応モニタリング（ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）（ＳＲＭ）機能として測定された１３８．９８ Ｄａ／ｅ、９６．９７ Ｄａ／ｅ、および７８．９６ Ｄａ／ｅの３つの優勢なフラグメントへの衝突−誘導解離を受けることが特定された：
Ａ）Ｇａｌ−１−Ｐ、グルコース−１−リン酸、およびフルクトース−１−リン酸のフラグメント化パターンの研究のため、移動相中に溶解させた各物質の２０μｍｏｌ／ｌ溶液を１５μｌ／分でタンデム質量分析計に注入した。以下に指示する装置設定（例えば図４−６に指示されている）を用いて、２０の複数チャンネル加算スキャン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｈａｎｎｅｌ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓｃａｎ）を集めた；
Ｂ）処理されたＤＢＳＳの分析のため、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ Ａｄｖｐポンプ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）によって運ばれる７０μｌ／分移動相の一定の流速で８μｌの各試料抽出物を注入し、注入サイクルの間にＳＲＭをモニタリングした。１．５分の試料から試料へのサイクル時間で試料注入を行ったが、より早い流速が用いられる場合には、その間隔をかなり短縮させることができる。
【００５７】
全体に亘り、−４．９ｋＶのニードル電圧、−２５ｅＶの衝突エネルギー、２（製造元単位）に設定した窒素衝突ガス、および各ＳＲＭに関して滞留時間５００ｍｓを用いて、陰イオンモードで装置を操作した。
【００５８】
データ加工
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣプラットフォームにおいて動くＮｅｏｃｈｒｏｍソフトウェア、バージョン１．０（ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ）を用いて生データファイルからイオン強度を抽出した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌバージョン５．０ｃを用いて、気付く部分を除いて、標準化のために２５９．０２／７８．９６イオン遷移から得られた信号を用いて、直線回帰によって標準曲線を作った。標準曲線を表す方程式を用いて、分析試料中のＨＭＰの含有量を計算した。遷移２５９．０２／９６．９７に対する遷移２５９．０２／７８．９６のイオン存在量比（ＩＡＲ）を各試料について計算した。
【００５９】
統計方法
ＳＰＳＳバージョン９．０ソフトウェアを統計解析に用いた。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕテストを用いて群間の変数を比較した。スピアマンの順位相関テストを用いて相関性を調べた。一元配置の分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて、測定内および測定間の変動計数（ＣＶ）を特定した。直線回帰分析を用いて、校正曲線に関して推定値の信頼区間および標準偏差を特定した。全てのテストは両側検定であり、帰無仮説に関してｐ＜０．０５である場合に統計的に有意であると考えられた。
【００６０】
分析精度
対照資料（０．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｇａｌ−１−Ｐ濃度標準）を８つの別個の測定において５７回定量し、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによってＣＶを特定した。
【００６１】
遺伝子型解析
ＤＢＳＳ残留物から抽出されたポリメラーゼ連鎖反応−増幅ＤＮＡの制限分析によって、極端なＨＭＰ濃度およびＩＡＲを有する参照群からの試料のＧＡＬＴ遺伝子型を特定した。
【００６２】
結果
ヘキソースモノリン酸のフラグメント化パターン
タンデム質量分析は、以前の所見（１５）と一致して、脱プロトン化ＨＭＰ（２５９．０２ Ｄａ／ｅ）が、１３８．９８ Ｄａ／ｅ、９６．９７ Ｄａ／ｅ、および７８．９６ Ｄａ／ｅの３つの優勢なフラグメントに解離することを示した。フラグメントの予想構造は、それぞれ［（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ）ＨＰＯ_４］⁻、［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻、および［ＰＯ_３］⁻である。ＨＭＰの構造に依存して、フラグメント７８．９６ Ｄａ／ｅおよび９６．９７ Ｄａ／ｅの相対的存在量に顕著な差がある（図１）。１−置換アルドース−モノリン酸（グルコース−１−リン酸およびＧａｌ−１−Ｐ）に関して７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントの信号が優勢である（図１、パネルＡおよびＢ）が、ケトースモノリン酸のフルコース−１−リン酸に関しては９６．９７ Ｄａ／ｅフラグメントが優勢であった（図１、パネルＣ）。６−置換アルドースモノリン酸のグルコース−６−リン酸に関しても９６．９７ Ｄａ／ｅフラグメントが優勢であった（データは示されていない）。それら結果は、リン酸基が環構造の一部である炭素原子に結合している場合にｍ／ｚ７８．９６ プロダクトイオン［ＰＯ_３］⁻が優勢であり、リン酸基が環構造の一部ではない側鎖炭素原子に結合している場合にｍ／ｚ９６．９７プロダクトイオン［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻が優勢であることを示唆する。
【００６３】
ガラクトース−１−リン酸の抽出
最適な抽出溶媒は、指示された濃度範囲に亘りメタノール：水混合物およびメタノール：アセトニトリル混合物で抽出した試料からの最適信号よりもそれぞれ３倍および９倍高いイオン強度をもたらす３０−７０％アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）であることが特定された（データは示していない）。従って、アセトニトリル：水（１：１）（ｖ／ｖ）を全ての適用において抽出のために用いた。
【００６４】
外部標準化
３つの優勢ＨＭＰフラグメントを添加Ｇａｌ−１−Ｐの濃度に対してプロットした（図２）。全ての実験において、０から８ｍｍｏｌ／ｌまでの添加Ｇａｌ−１−Ｐの範囲内において、３つ全てのフラグメントが直線標準曲線を作成した（ｒ^２＝０．９９４から１．０００）。９６．９７ Ｄａ／ｅフラグメントから誘導された標準曲線は、添加Ｇａｌ−１−Ｐの低濃度範囲（＜０．０６２５ｍｍｏｌ／ｌ）において高いイオン強度の傾向を示した。さらには、新生児スクリーニング試料中の計算ＨＭＰ濃度は、７８．９６ Ｄａ／ｅまたは１３８．９８ Ｄａ／ｅフラグメントが標準化に用いられた場合よりも、９６．９７ Ｄａ／ｅフラグメントが標準化に用いられた場合に、平均で０．１ｍｍｏｌ／ｌ高かった。この差は、低い（＜０．０６２５ｍｍｏｌ／ｌ）ＨＭＰ濃度範囲において排除された。計算ＨＭＰ濃度における差は、アルドースモノリン酸に対するケトースモノリン酸の比が高いこと、または、外部濃度標準を作成するのに用いられる成人血液に比べて新生児スクリーニング試料中の干渉化合物のレベルが高いことによるものであろう。７８．９６ Ｄａ／ｅまたは１３８．９８ Ｄａ／ｅフラグメントを用いた標準化によって特定されたＨＭＰ濃度の間に有意差は無かった。Ｇａｌ−１−Ｐを混入した新鮮に採取したＥＤＴＡ−血液の４℃または室温での１晩のインキュベートは、Ｇａｌ−１−Ｐは細胞外コンパートメントに加えられかつ細胞内に存在するＧＡＬＴに曝されないため、予想されたような信号の低下の証拠を全く示さなかった。全てのカテゴリーの試料に関して、７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントのイオン存在量は、１３８．９８ Ｄａ／ｅフラグメントの存在量よりも平均で７−９倍高かったが、９６．９７ Ｄａ／ｅフラグメントに対する７８．９８ Ｄａ／ｅフラグメントのＩＡＲは疾患の状態によって変化し、ガラクトース血症患者において最も高かった（図３）。７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントのイオン強度はＧａｌ−１−Ｐフラグメント化パターンに関連しかつ過剰なＧａｌ−１−Ｐを含有する試料（Ｇａｌ−１−Ｐを混入した濃度標準およびガラクトース血症試料）において最も高い信号強度をもたらすことから、Ｇａｌ−１−Ｐの定量のために７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントのイオン強度を用いることが決定された。
【００６５】
分析精度
０．５４ｍｍｏｌ／ｌの平均ＨＭＰ濃度での測定内および測定間ＣＶがそれぞれ１１％および１３％であることを特定した。ＬＡＲに関して、１．４４ユニットでの測定内および測定間ＣＶはそれぞれ１．５％および４．１％であった。従って、測定内および測定間ＣＶの二乗累積（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｓｕｍｍａｔｉｏｎ）によって誘導された全分析精度は、１７％（ＨＭＰ濃度）および４．４％（ＬＡＲ）であった。
【００６６】
ヘキソースモノリン酸の安定性
様々な期間−２０℃で保存されたＤＢＳＳの分析は、僅かではあるが統計的に有意なＨＭＰの状態の変化を示した。ＨＭＰ含有量の中間値は、１０．６年の経過の間に０．１５から０．１２ｍｍｏｌ／ｌまで低下した（Ｐ＝０．００１）が、一方、ＩＡＲは０．８０から０．８４まで上昇した（Ｐ＝０．０１）。いずれの関連性についても適当なカーブフィッティングモデルは明らかでなく、その変化は、記録文書の患者試料の分析から得られた結果の修正を要請するにはあまりに僅かであると考えられた。
【００６７】
参照群
２０５５の参照試料におけるＨＭＰの中間濃度は０．１５ｍｍｏｌ／ｌ（−０．０８−０．９４ｍｍｏｌ／ｌ）であった（図３）。９６．９７ Ｄａ／ｅフラグメントに対する７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントのＩＡＲの中間値は０．８０（０．３２−１．４１）であった。ＨＭＰ濃度およびＩＡＲのいずれも、血液採取時の生後年齢または出生時体重（≧２５００ｇ）に相関しなかった。しかしながら、低出産体重児（＜２５００ｇ）（ｎ＝１１４）に関して、ＨＭＰ濃度およびＩＡＲの両方が、出生時体重と正に相関した（それぞれＰ＜０．０１およびｐ＜０．０５）。１．４４ｍｍｏｌ／ｌの極端なＨＭＰ濃度および１．５７のＩＡＲを有する１つの試料が、ＤＮＡ突然変異解析によって、ＧＡＬＴ酵素におけるデュアルテ（Ｄｕａｒｔｅ）（Ｎ３１４Ｄ）およびＱ１８８Ｒ突然変異に関する化合物へテロ接合体性であることが示され、参照群から除かれた。
【００６８】
ガラクトース血症患者
患者試料の特徴を表１に示す。ＨＭＰ濃度は２．６から５．２ｍｍｏｌ／ｌまでの範囲に亘り、ＩＡＲは１．６９−１．７６の範囲であった。血液採取時の生後年齢とＨＭＰ濃度との間に弱い相関性があった（Ｐ＜０．０５）が、表１に挙げられたパラメーターとの間で他の相関性は無かった。
【００６９】
糖質−注入新生児
集中治療新生児は、１９１（１２−３１２）ｍｌ／２４時間の中間速度で５％グルコース（ｗ／ｖ）および５％フルクトース（ｗ／ｖ）溶液の注入を受けた。参照群と比較して、糖質負荷群（ｎ＝１０）は、僅かではあるが、有意に抑制されたレベルのＨＭＰおよびＩＡＲを有していた（中間値はそれぞれ０．０６２ｍｍｏｌ／ｌおよび０．４２であり、比較において共にｐ＜０．００１であった）。しかしながら、９６．９７ Ｄａ／ｅフラグメントが標準化に用いられた場合、ＨＭＰ濃度に差は全く無かった。糖質注入の速度は、ＩＡＲと負に相関した（ｐ＜０．００１）が、ＨＭＰ濃度とは相関しなかった。
【００７０】
診断精度
図３は、ＨＭＰ濃度およびＩＡＲに関して、化合物へテロ接合体群および参照群と患者群とを比較する。新生児スクリーニングに関して、ＨＭＰ濃度について０．９５−２．５ｍｍｏｌ／ｌの範囲のカットオフおよびＩＡＲについて１．４２−１．６８の範囲のカットオフを用いることによって、１００％の感度および特異性をもたらした。Ｑ１８８Ｒ／Ｎ３１４Ｄ化合物へテロ接合体の検出が望ましい場合には、ＨＭＰについて０．９５−１．４３ｍｍｏｌ／ｌの範囲のカットオフおよびＩＡＲについて１．４２−１．５６の範囲のカットオフを用いることによって１００％の感度および特異性を得ることができる。後者のカットオフの範囲は、共に、全分析精度に基づいて、対応するテストの２標準偏差に等しい。
【００７１】
同じ乾燥血液スポットを用いたアミノ酸、アシルカルニチン、およびＨＭＰに関するスクリーニング
本発明は、同じ乾燥血液スポットの２つの連続抽出を首尾よく行った。第１の抽出は、Ｒａｓｈｅｄ ｅｔ ａｌ．（１０）に記載されているように、アミノ酸およびアシルカルニチンの内部標準を含むメタノールを用いて実施した。タンデム質量分析によってアミノ酸およびアシルカルニチン値を測定し、コンピューターアルゴリズムによって計算した（表１を参照）。残りの血液スポットを窒素流によって乾燥させ、ＨＭＰに関してこの中に記載されている第２の抽出法を直接実施した。この第２の親水性抽出は、新鮮な血液スポットにおいて抽出が実施された場合と同じ結果をもたらすことが証明されている。
【００７２】
本発明は、ガラクトース血症の新生児スクリーニングに適用可能な新規な検査を開発した。その検査の本質は、タンデムＭＳによるＧａｌ−１−Ｐを示唆するＨＭＰまたはＨＭＰフラグメントイオンの定量分析である。本発明の方法を適応させて（すなわち、各疾患を示唆するＨＭＰイオンを検出および定量することによって）、他のＨＭＰ関連疾患をスクリーニングすることができる。最適の結果を得るためには、本発明のガラクトース血症スクリーニング方法に基づいて被験者がＧａｌ−１−Ｐの代謝に問題を有するか否かを特定するため、スクリーニング前に被験者はガラクトースを含む食事に曝されなければならない。従って、ガラクトースを含まない非経口的栄養法、または有効な授乳の前のサンプリングは、偽陰性のスクリーニング結果をもたらす可能性があり、Ｇａｌ−１−Ｐの血液含有量を減らす輸血および他の対策も同様である。しかしながら、そのような制限は、Ｇａｌ−１−Ｐおよびガラクトースの他の測定法でも存在する。本測定法は酵素不活化の問題に影響を受けない。
【００７３】
７８．９６ Ｄａ／ｅフラグメントを用いる外部標準化によって計算されたＨＭＰの濃度は、Ｇａｌ−１−Ｐ濃度（図２）およびガラクトース血症（図３）と相関した。２０５５の参照試料群と１２の患者試料群との間にＨＭＰ濃度の重複は全くなく、１００％の診断感度および特異性をもたらした。糖質注入は、新生児集中治療患者において、ＨＭＰまたはＩＡＲの上昇を生じさせなかった。最初の参照群からの試料は、１．４４ｍｍｏｌ／ｌの上昇したＨＭＰ濃度を有しており、明らかに参照群および患者群の両方から分離可能である。遺伝子型の特定は、完全なＧＡＬＴ不活化突然変異（Ｑ１８８Ｒ）および部分分断デュアルテ（Ｄｕａｒｔｅ）突然変異（Ｎ３１４Ｄ）に関する化合物へテロ接合体を示した。その遺伝子型を有する被験者は正常ＧＡＬＴ活性の僅か５％しか持たず、生まれた年に食事療法を受けるように薦められる（１２）。従って、新生児スクリーニングに関して１．２ｍｍｏｌ／ｌ ＨＭＰのカットオフ値が主張された。そのカットオフ値は、１００％の感度および特異性でガラクトース血症患者を検出し、おそらく、治療が求められるほとんどの化合物へテロ接合体を含むであろう。
【００７４】
さらには、７８．９６ Ｄａ／ｅと９６．９７ Ｄａ／ｅとの間のＩＡＲは、参照群と、化合物へテロ接合体群と、患者群との間を明らかに区別することができた（後者の群において顕著な上昇が認められた）。図３において、参照群はＩＡＲの大きな変動を有するが、ガラクトース血症群はしっかりと集団化したＩＡＲ値（純水なＧａｌ−１−ＰのＩＡＲに近い）を有することが明らかである。可能性のある説明は、低いＨＭＰ濃度を有する参照群において、干渉ＨＭＰがＩＡＲの可変性に寄与するという説明である。ガラクトース血症試料において、Ｇａｌ−１−Ｐフラグメントパターンは定量的理由のため優位であり、ＩＡＲは純水なＧａｌ−１−Ｐの値に近づくことが予測されるであろう。ＩＡＲにおいて両方のイオン強度が同程度影響を受けるため、ＩＡＲの使用は外部濃度標準を使用することなくスクリーニングを可能にし、それによって試料調製およびデータプロセッシングが簡素化され、試料の不均質性によって生じる信号の変動が排除される。化合物ヘテロ接合体および患者を１００％の感度および特異性で検出すると考えられる１．５のカットオフ値が提案される。しかしながら、ＩＡＲの最適値は、タンデムＭＳ装置の構成に依存して、スクリーニング実験室の間で異なるであろう。
【００７５】
本研究におけるガラクトース血症試料は、臨床的に発見されかつ平均１８（６−３６）日の年齢で診断された患者に由来するものである（表１）。試料採取の時から丸２日間の報告までの期間を想定して、新生児スクリーニングは平均１３日まで、１０／１２の患者において診断時間を早めることができた。
【００７６】
本発明の方法は、Ｇａｌ−１−Ｐではなく全ＨＭＰ含有量を定量するため、ヘキソースリン酸の代謝に問題のある他の疾患の診断およびモニタリングにおいて本方法を用いることができる。他のＨＭＰに加えて、検出可能な分析物として、多リン酸化ヘキソースが挙げられる。例えば、質量分析においてポストソース分解によってそれら２リン酸ヘキソースがＨＭＰを生じさせる場合、２リン酸ヘキソースは干渉するであろう。試料は、前述したように、例えば尿または組織ホモジネートのような、血液以外の媒体を含んでいて差し支えない。そのような検討材料に関連する疾患として、遺伝性果糖不耐性（ＯＭＩＭ ２２９６００）、果糖尿症（肝フルクトキナーゼ欠損）（ＯＭＩＭ ２２９８００）、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ欠損（ＯＭＩＭ ２２９７００）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（ＯＭＩＭ ３０５９００）、ＵＤＰ−ガラクトース−４−プライム−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．２）欠損、および糖尿病が挙げられる。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明はガラクトース血症をスクリーニングする新規な方法を提供する。本方法は新生児スクリーニングサービスによるルーチンでの使用のために採取された試料の微量を用いる。試料調製は簡単である。一般的試薬のみが必要とされる。本方法は、安定な分析物、Ｇａｌ−１−Ｐを定量する。分析および解釈は完全に自動化されており、診断精度は卓越しているように思われる。増加する数の診断設備は、例えばアミノ酸、有機酸、および脂肪酸（１０、６）の代謝における疾患をスクリーニングするためのタンデムＭＳを有するため、ガラクトース血症をスクリーニングするためにもタンデムＭＳを用いることは経済的であろう。
【００７８】
さらに、本発明は、同じ乾燥血液スポットの２つの異なる抽出物を首尾よく作成する。その抽出物を用いて、２つの異なる成分を定量的に分析した。第１の抽出はアミノ酸およびアシルカルチニンに関して行われ、それを定量的に分析し、さらに例えばフェニルケトン尿症のような関連疾患をスクリーニングするのに用いることができる。上記のように第２の抽出法はＨＭＰに関するものである。その第２の親水性抽出は、新鮮な血液スポットにおいて抽出が実施された場合と同じ結果をもたらすことが証明されている。
【００７９】
本発明の方法は、試料当り１．５分（溶媒輸送システムの流速を高めることによって短縮できる）のように迅速であり、タンデム質量分析計を用いる通常のルーチン検査に加えるのに経済的でかつ容易である。
【００８０】
本発明は、現在好ましい実施例であると考えられているものを参照して記載されているが、その開示された実施例に本発明は限定されないことを理解すべきである。それとは逆に、本発明は、添付請求項の精神および範囲内に含まれる様々な変更および等価な構成を対象にすることが意図されている。全ての文献、特許、および特許出願は、各文献、特許または特許出願のそれぞれが特異的かつ個別的にその全体が参照によって組み込まれることが示唆されているのと同様に、その全体が参照によってこの中に組み込まれる。
【００８１】
【表１】

【表２】

【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、グルコース−１−リン酸（パネル１Ａ）、ガラクトース−１−リン酸（パネル１Ｂ）、およびフルクトース−１−リン酸（パネル１Ｃ）の３つの優勢なフラグメントイオンを示す
【図２】
図２は、０から８ｍｍｏｌ／ｌまでのＧａｌ−１−Ｐの添加濃度範囲の９つの異なる標準血液スポットの３重測定からの標準曲線である
【図３】
図３は、ガラクトース血症の患者、ＧＡＬＴ活性が低下したＱ１８８Ｒ／Ｎ３１４Ｄ化合物ヘテロ接合体性の個体、および対照群からの試料中のヘキソースモノリン酸濃度とイオン存在量比（ＩＡＲ）とを比較するスキャッチャープロットである
【図４】
図４は、タンデム質量分析計に注入されたＨＭＰ試料を測定することによって得られたイオン強度を表す全イオン電流クロマトグラム（ＴＩＣ）である
【図５】
図５は、図４における斜線の時間枠において測定された３つのフラグメントイオンの各々の平均イオン強度のヒストグラムプロットを示す
【図６】
図６は、本発明の１つの実施形態におけるタンデム質量分析計の機器設定を示す３ページプリントアウトである

Claims (48)

1. 生物試料中のヘキソースモノリン酸を検出および定量分析する方法において：
   （ａ）イオン化に適した形態の生物試料抽出物を得る；
   （ｂ）前記抽出物をイオン化してガス相イオン流を形成する；
   （ｃ）ヘキソースモノリン酸の質量電荷比を有するプレカーサ分子イオンを選択する；
   （ｄ）前記プレカーサ分子イオンをフラグメント化してヘキソースモノリン酸のプロダクトイオンを得る；
   （ｅ）質量電荷比によって他のプロダクトイオンから関心プロダクトイオンを選択する；
   （ｆ）前記関心プロダクトイオンを検出し、そのイオン強度を得る；
   （ｇ）前記プロダクトイオンのイオン強度を用いて、
   （ｉ）前記生物試料中のヘキソースモノリン酸の定量的存在量をスペクトル分析によって特定する；および／または
   （ｉｉ）対照試料または既知濃度のヘキソースモノリン酸および／または特定種類のヘキソースモノリン酸を含む試料のイオン強度と比較することによって、前記生物試料中のヘキソースモノリン酸または特定種類のヘキソースモノリン酸の濃度を特定する；および／または
   （ｉｉｉ）前記生物試料中に存在する特定種類のヘキソースモノリン酸の相対量を示唆するイオン存在量比（ＩＡＲ）を特定する；
   各工程を含むことを特徴とする方法。
2. 前記工程（ａ）において、分析すべき生物試料を得て、該生物試料を乾燥させ、さらに該試料からヘキソースモノリン酸を抽出するのに適した溶媒で前記乾燥試料を抽出することによって、イオン化に適した生物試料のヘキソースモノリン酸抽出物を得ることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 前記生物試料を適切な媒体上にブロットし、その後乾燥することを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 前記適切な媒体が濾紙であることを特徴とする請求項３記載の方法。
5. 前記ヘキソースモノリン酸を抽出するのに適した溶媒が、メタノールより高親水性の溶媒であることを特徴とする請求項２記載の方法。
6. 前記溶媒が、アセトニトリル／水、酢酸エチル／水、テトラヒドロフラン／水、メタノール／水、およびイソプロテレノール／水、ならびにそれらと同様の特性を有する溶媒よりなる群から選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 前記溶媒が、３０：７０から７０：３０（ｖ／ｖ）までのアセトニトリル／水であることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 前記溶媒が、１：１（ｖ／ｖ）のアセトニトリル／水であることを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 前記生物試料が、全血、分画血液成分、組織、尿、便、胆汁、唾液、汗、およびその他の腺分泌物よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
10. 前記生物試料が全血試料であることを特徴とする請求項９記載の方法。
11. 前記血液試料を適切な媒体上にブロットし、乾燥し、その後ヘキソースモノリン酸の抽出に適した溶媒を用いて抽出することを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 前記適切な媒体が濾紙であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 前記工程（ｂ）から（ｃ）までがタンデム質量分析計において行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
14. イオン強度が陰イオンモードで記録されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
15. 前記工程（ｂ）が、エレクトロスプレーまたは空圧補助エレクトロスプレーイオン化によってイオン流を形成することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
16. 前記ヘキソースモノリン酸のプレカーサ分子イオンの質量電荷比が２５９．０２ Ｄａ／ｅであることを特徴とする請求項１記載の方法。
17. 前記関心プロダクトイオンが、［ＰＯ_３］⁻、［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻、および［（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ）ＨＰＯ_４］⁻であることを特徴とする請求項１記載の方法。
18. 前記関心プロダクトイオンの質量電荷比が、［ＰＯ_３］⁻に関して７８．９６ Ｄａ／ｅ、［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻に関して９６．９７ Ｄａ／ｅ、［（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ）ＨＰＯ_４］⁻に関して１３８．９８ Ｄａ／ｅであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
19. ［ＰＯ_３］⁻プロダクトイオンがアルドヘキソース−１−モノリン酸の最良の指標となり、かつ［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻プロダクトイオンがアルドヘキソース−６−モノリン酸あるいはケトヘキソース−１−モノリン酸またはケトヘキソース−６−モノリン酸の何れかの最良の指標となることを特徴とする請求項１８記載の方法。
20. Ｇａｌ−１−Ｐがアルドヘキソース−１−モノリン酸であり、かつ生物試料中の［ＰＯ_３］⁻フラグメントのイオン強度を既知濃度のＧａｌ−１−Ｐを含む対照試料のイオン強度と比較することによって、［ＰＯ_３］⁻フラグメントを用いて生物試料中のＧａｌ−１−Ｐの濃度の指標となるアルドヘキソース−１−モノリン酸の濃度を特定することを特徴とする請求項１９記載の方法。
21. 質量電荷比が７８．９６ Ｄａ／ｅから９６．９７ Ｄａ／ｅまでのプロダクトイオンのイオン存在量比を、生物試料中のＧａｌ−１−Ｐ濃度の指標として用いることを特徴とする請求項１８記載の方法。
22. それぞれ請求項２０または２１記載の方法を用いて編成された、正常およびガラクトース血症の患者のＧａｌ−１−Ｐ濃度および／またはＩＡＲレベルのデータベース。
23. ガラクトース血症の指標となるヘキソースモノリン酸濃度およびＩＡＲレベルのカットオフレベルを特定するための請求項２２記載のデータベース。
24. 請求項２０または２１記載の方法によって特定された試験患者の生物試料中のヘキソースモノリン酸濃度および／またはＩＡＲレベルを、ガラクトース血症の指標となるカットオフレベルの値と比較することによって、ガラクトース血症をスクリーニングおよび／または診断する方法。
25. ヘキソースモノリン酸のカットオフレベルが０．９５−２．６ｍｍｏｌ／ｌヘキソースモノリン酸濃度および／または１．４１−１．６８ ＩＡＲであり、カットオフ値を越えるレベルがガラクトース血症の指標となることを特徴とする請求項２４記載の方法。
26. カットオフレベルが１．２ｍｍｏｌ／ｌヘキソースモノリン酸濃度および／または１．５ ＩＡＲであることを特徴とする請求項２５記載の方法。
27. 前記生物試料が、ヘキソースモノリン酸を抽出するのに適した溶媒で抽出された全血試料であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
28. 前記溶媒が、３０：７０から７０：３０（ｖ／ｖ）までのアセトニトリル／水であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
29. 請求項１記載の方法を用いて開発された、正常個体およびヘキソースモノリン酸関連疾患を有する個体のヘキソースモノリン酸濃度および／またはＩＡＲレベルのデータベース。
30. ヘキソースモノリン酸関連疾患の指標となるカットオフレベルを特定するための請求項２９記載のデータベースの使用。
31. 請求項１記載の方法を用いて患者におけるヘキソースモノリン酸レベル特定し、さらに、疾患の指標となるヘキソースモノリン酸のカットオフレベルと前記患者のヘキソースモノリン酸レベルとを比較することによって、個体におけるヘキソースモノリン酸関連疾患を診断する方法。
32. 前記ヘキソースモノリン酸関連疾患が、ガラクトース血症（ＯＭＩＭ ２３０４００）、遺伝性果糖不耐性（ＯＭＩＭ ２２９６００）、果糖尿症（肝フルクトキナーゼ欠損）（ＯＭＩＭ ２２９８００）、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ欠損（ＯＭＩＭ ２２９７００）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（ＯＭＩＭ ３０５９００）、ＵＤＰ−ガラクトース−４−プライム−エピメラーゼ（ＥＣ ５．１．３．２）欠損、および糖尿病よりなる群から選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
33. ヘキソースモノリン酸を抽出するのに適した溶媒で生物試料を抽出する前に、適切な溶媒を用いて乾燥生物試料からアミノ酸およびアシルカルニチンを抽出し、最初の抽出物を形成してそれを定量分析のために除去し、さらに残りの生物試料を再乾燥させることを特徴とする請求項３記載の方法。
34. 前記生物試料が全血であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
35. 前記適切な溶媒がメタノールであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
36. アミノ酸、有機酸、および脂肪酸の代謝障害、ならびにヘキソースモノリン酸の代謝障害の両方をスクリーニングするための方法であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
37. フェニルケトン尿症およびガラクトース血症の両方をスクリーニングするための方法であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
38. 前記関心プロダクトイオンが［ＰＯ_３］⁻であることを特徴とする請求項１記載の方法。
39. ［ＰＯ_３］⁻のイオン強度を用いて、生物試料中のアルドヘキソース−１−モノリン酸の濃度またはレベルを特定することを特徴とする請求項３８記載の方法。
40. アルドヘキソース−１−モノリン酸の濃度またはレベルを、疾患の指標となるアルドヘキソース−１−モノリン酸のカットオフ濃度またはレベルと比較することを特徴とする、アルドヘキソース−１−モノリン酸関連疾患を診断するための請求項３９記載の方法。
41. 前記疾患がガラクトース血症であることを特徴とする請求項４０記載の方法。
42. 前記関心プロダクトイオンが、［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻であることを特徴とする請求項１記載の方法。
43. ［Ｈ_２ＰＯ_４］⁻のイオン強度を用いて、生物試料中のアルドヘキソース−６−モノリン酸および／またはケトヘキソース−１−モノリン酸および／またはケトヘキソース−６−モノリン酸の濃度またはレベルを特定することを特徴とする請求項４２記載の方法。
44. ヘキソースモノリン酸レベルおよび対応するヘキソースモノリン酸関連疾患の状態のデータベースを作成する方法において：
    （ａ）請求項１記載の方法に従って個体のヘキソースモノリン酸レベルを特定する；
    （ｂ）前記個体のヘキソースモノリン酸関連疾患の状態を特定する；
    （ｃ）前記工程（ａ）および（ｂ）からの情報を用いてデータベースを作成する；
    （ｄ）必要に応じて、他の個体からの生物試料を用いて前記工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す；
    （ｅ）前記工程（ｄ）からの情報を前記データベースに入力する；
    各工程を含んでなる方法。
45. ヘキソースモノリン酸関連疾患を有する個体と有さない個体とのヘキソースモノリン酸レベルを比較することを含んで成る、ヘキソースモノリン酸関連疾患の指標となるヘキソースモノリン酸カットオフレベルを特定するための請求項４４記載の方法によって作成されたデータベースの使用。
46. 請求項１記載の方法に従ってヘキソースモノリン酸レベルを特定し、該ヘキソースモノリン酸レベルを、データベースのヘキソースモノリン酸レベルおよび対応するヘキソースモノリン酸関連疾患の状態と比較し、前記特定されたヘキソースモノリン酸レベルがヘキソースモノリン酸関連疾患を示唆するか否かを特定することを含んで成る、ヘキソースモノリン酸関連疾患の診断における請求項４４記載の方法によって作成されたデータベースの使用。
47. ヘキソースモノリン酸関連疾患診断ビジネスを実施する方法において：
    ヘキソースモノリン酸関連疾患の診断および／またはスクリーニングおよび／またはヘキソースモノリン酸レベルのデータベースの開発において用いることができる、請求項１記載の方法に従って生物試料からヘキソースモノリン酸レベルを特定する方法を提供する；
    ヘキソースモノリン酸関連疾患の診断に用いることができるヘキソースモノリン酸レベルを特定する方法に対する権利を第三者にライセンス付与または売却する；
    各工程を含むことを特徴とする方法。
48. ヘキソースモノリン酸関連疾患診断ビジネスを実施する方法において：
    第三者によって提供された生物試料のヘキソースモノリン酸レベルを請求項１記載の方法に従って特定する；
    前記ヘキソースモノリン酸レベルがヘキソースモノリン酸関連疾患を示唆するか否かを特定する；
    手数料を徴収してその結果を第三者に提供する：
    各工程を含むことを特徴とする方法。

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