PT1311847E - Análise quantitativa de hexose-monofosfatos de amostras biológicas - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Análisis cuantitativo de hexosa-monofosfatos en muestras biológicas CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un método de detección de hexosa-monofosfatos (HMPs) en muestras biológicas y usos dei mismo. En una realización preferida, ei método de la invención puede utilizarse para exploración de recién nacidos por galactosemia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La galactosemia es un trastorno amenazante para la vida con sintomas graves en ei período neonatal. Está causada por deficiência de la enzima galactosa-1-fosfato-uridiltransferasa (GALT) (EC.2.7.7.12), (OMIM 230400).

En este trastorno, la ingestión de leche causa la acumulación de galactosa en sangre y orina y conduce a una concentración intracelular elevada de galactosa-1-fosfato (Gal-1-P). Gal-1-P está considerado tóxico para vários tejidos, especialmente ei hígado, ei cerebro, y los túbulos renales (12). Los principales sintomas aparecen poco después de la ingestión de leche e incluyen vómitos, fallos dei desarrollo, icterícia debida a lesión dei hígado, y letargo. Los pacientes llegan a ponerse comatosos, y si no se inicia pronto ei tratamiento, la muerte ocurre en muchos casos durante las primeras semanas de vida. EI tratamiento con una dieta exenta de galactosa causa regresión de los sintomas y signos en ei transcurso de una semana o dos. Sin embargo, debido a la baja frecuencia de la enfermedad (aproximadamente 1:35.000 en Dinamarca) y a concienciación clínica sub-óptima, la diagnosis se retrasa a menudo o los sintomas se interpretan erroneamente como septicemia o isoinmunización, causando secuelas debidas a intervención tardia. Si bien estas consideraciones parecen recomendar la exploración neonatal, esto es todavia objeto de controvérsia como se ilustra por dos revisiones exhaustivas recientes con conclusiones opuestas (11, 9). No existe controvérsia alguna en cuanto a las implicaciones graves de la galactosemia no tratada: muerte neonatal o retraso mental severo. Los mayores problemas en la discusión son la baja frecuencia de la enfermedad, que afecta a la ratio coste-beneficio, los tests de exploración sub-óptimos, y las secuelas en ei resultado a largo plazo a pesar de la diagnosis y ei tratamiento tempranos, tales como deterioro intelectual, trastornos en ei habla, cataratas, e hipogonadismo por hipergonadotrofia (13, 14, 5).

Existen vários métodos para la exploración neonatal por galactosemia. EI más sencillo de todos consiste en examinar la orina respecto a sustancias reductoras (es decir, utilizando la solución de Fehling y Benedict). Los ensayos empleados comúnmente para exploración neonatal utilizan muestras de manchas de sangre secas (DBSS). El test de Paigen (8) cuantifica galactosa y Gal-1-P por un ensayo microbiológico. Sin embargo, no es adecuado para automatización, es sensible ai tratamiento con antibióticos de los recién nacidos o sus madres, y se requieren procedimientos cuidadosos de mantenimiento respecto a bactérias. La medida de la actividad de GALT es la base del test de Beutler (1, 2). GALT es sensible a desactivación por calor o humedad, causando resultados positivos falsos de la exploración. Los ensayos de Paigon y Petler en combinación son utilizados por muchos laboratorios de exploración (11) y pueden detectar deficiências en GALT, galactoquinasa, y galactosa-epimerasa, pero tienen tasas relativamente altas de positivos falsos (11). Estos trastornos pueden ser detectados también por ei ensayo de fosfatasa alcalina-galactosa deshidrogenasa (3, 4).

Fenn et ai (2000) Journal of Mass Spectrometry, vol. 35 pp. 218-223) describen un método para medida de galactosa-l-p que requiere en primer lugar derivatización de galactosa, a fin de separar galactosa de glucosa utilizando cromatografía de gases, antes de someter la muestra a espectroscopia de masas en modo de iones positivos. Éste método es engorroso.

Feurie et ai. (1998), Journal of Chromatography, vol. 803, pp. 111-119 describen un método de detección de carbohidratos fosforilados que utiliza una columna de HPLC unida a ciclodextrina, seguida de ionización por electrospray y espectroscopia de masas. EI método no expone la detección de los carbohidratos fosforilados en una muestra biológica. Adicionalmente, no se expone doctrina alguna en Feurie dei análisis cuantitativo de hexosa-monofosfatos o ei uso de intensidades iónicas para hacer esto. Tampoco se expone un método de diagnóstico de la galactosemia. EI documento de Millington, C. et ai, International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 111 (1991), 211-228 describe el análisis de marcadores de diagnóstico de trastornos genéticos en sangre y orina humanas utilizando espectrometría de masas en tándem con espectrometría de masas secundaria de líquido para obtención de perfiles de acilcarnitina.

Hay necesidad de un método mejorado, más exacto, rápido, eficaz en costes y más sencillo para exploración por y diagnóstico de la galactosemia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han desarrollado un método de exploración sencillo, totalmente automático, rápido y eficaz en costes para detectar y cuantificar hexosa-monofosfatos (HMPs) como se define en la reivindicación 1. EI método puede utilizarse para detectar y cuantificar HMP en una muestra, preferiblemente una muestra biológica. Como tal, ei método puede utilizarse como indicador, v.g., para diagnóstico, exploración, o identificación de pacientes de riesgo por un trastorno relacionado con niveles anormales de HMP (sea relativos o absolutos). Tales trastornos incluyen, pero no están limitados necesariamente a: galactosemia, fructosuria, intolerância hereditaria a la fructosa, eficiência en fructosa-1,6-bifosfatasa, deficiência en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, deficiência en UDP-galactosa-4'-epimerasa (EC 5.1.3.2), y diabetes mellitus. En una aplicación preferida, ei método puede utilizarse como indicador de galactosemia en recién nacidos. En una realización de la invención, ei método puede utilizarse en ei diagnóstico de galactosemia en recién nacidos. En otra realización, ei método de la invención puede utilizarse en exploración por trastornos relacionados con HMP tales como galactosemia. En otra realización, la exploración puede ir seguida por o utilizarse en conjunción con otros métodos de diagnóstico, tales como análisis de genes.

Debe entenderse que la cuantificación, o análisis cuantitativo, como se utiliza en esta memória, abarca cualquier manera de determinación de la cantidad relativa o absoluta (por ejemplo, concentración) de hexosa-monofosfato y/o una especie de hexosa-monofosfato en una muestra. EI nível o niveles de HMP como se utiliza en esta memória, se refiere también a las cantidades tanto absolutas como relativas de HMP, cuando lo permite ei contexto.

En la realización preferida, la invención proporciona una técnica nueva rápida para analizar cuantitativamente niveles de HMP en una muestra de sangre, preferiblemente en manchas de sangre secas, preferiblemente sobre papel de filtro u otro medio adecuado, utilizando espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Este nuevo método puede ser utilizado en ei diagnóstico de trastornos relacionados con HMP, tales como los arriba indicados, y preferiblemente la galactosemia. EI nuevo método resuelve muchas de las limitaciones en los métodos de la técnica anterior utilizados para exploración de la enfermedad.

En otra realización preferida, la invención proporciona un método para detectar y cuantificar los niveles de HMP en una muestra biológica por obtención de un extracto de HMP de la muestra biológica en una forma adecuada para ionización. "Extracto de HMP", como se utiliza en esta memória, se refiere a un extracto de la muestra biológica con un disolvente adecuado para extracción de HMPs. EI extracto de HMP no contiene necesariamente cantidad alguna de HMPs. En una realización preferida, la muestra se extrae con un disolvente que es más hidrófilo que ei metanol. Disolventes adecuados podrían ser acetonitrilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua, acetato de etilo en agua o isopropanol en agua. Más preferiblemente, ei disolvente es o tiene propiedades similares a las de acetonitrilo en agua, y muy preferiblemente ei disolvente es 30-70% acetonitrilo (v/v) en agua.

En otra realización, la muestra biológica se seca antes de la extracción. En otra realización adicional, la muestra biológica se transfiere a un medio adecuado, tal como papel de filtro, se seca y se extrae luego como anteriormente.

En otra realización, pueden utilizarse varias muestras biológicas en ei método de la invención en caso aplicable, tales como sangre entera, componentes de sangre fraccionados, tejido (tal como especímenes de biopsia de hígado), orina, heces, bílis, saliva, sudor u otras secreciones glandulares. Preferiblemente, la muestra biológica es sangre entera que se transfiere a un medio adecuado, se seca y se extrae luego.

Subsiguientemente a la extracción, ei extracto de HMP se ioniza luego, preferiblemente utilizando técnicas tales como electrospray, o electrospray asistido neumáticamente (v.g. lonSpray), para formar una corriente de iones en fase gaseosa. Iones moleculares precursores, iones moleculares en fase gaseosa que tienen una ratio de masa a carga de HMP, a saber, 259,02 Da/e, se seleccionan y se fragmentan luego para obtener iones producto de HMP. Iones producto de interés, los más indicativos de los niveles de HMP o un HMP particular, tal como Gal-1-P o fructosa-1-P se seleccionan por sus ratios de masa a carga, se detectan luego y se obtienen sus intensidades iónicas. Las intensidades iónicas se registran preferiblemente en modo de iones negativos.

Las intensidades iónicas de los iones producto pueden utilizarse para determinar por análisis espectral la abundancia cuantitativa de HMPs en la muestra biológica; y/o para determinar la concentración de HMPs, o una especie particular de los mismos, por comparación de las intensidades iónicas de la muestra con la de un control que contiene una cantidad o concentración conocida de HMP o una especie dei mismo; y/o para determinar las ratios de abundancia iónica (IAR) indicativas de la cantidad relativa de especies de HMP presentes en la muestra biológica.

En una realización adicional, ei método de la invención puede utilizarse para exploración de y/o diagnosis de trastornos relacionados con HMP, tales como galactosemia, en un paciente por comparación dei nível de HMP o una especie particular dei mismo en una muestra biológica, tal como una muestra de sangre, con ei de un nível de punto de corte para indivíduos normales como se define en la reivindicación 20.

En otra realización de la invención, pueden extraerse aminoácidos y acilcarnitinas de las muestras biológicas secas, preferiblemente muestras de sangre antes de la extracción de HMP, utilizando un disolvente adecuado, tal como metanol. EI extracto metanólico puede separarse luego para análisis ulterior y la muestra biológica restante puede secarse de nuevo y procesarse como anteriormente. La muestra biológica, preferiblemente muestra de sangre, además de ser analizada respecto a niveles de HMP, puede ser analizada también cuantitativamente respecto a aminoácidos y acilcarnitinas que pueden utilizarse para exploración por y/o diagnóstico de trastornos en el metabolismo de aminoácidos, ácidos orgânicos, y ácidos grasos en el paciente.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien son indicativos de realizaciones preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración, dado que diversos câmbios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La invención se describirá a continuación en relación con los dibujos, en los cuales:

La figura 1 muestra los tres iones fragmentários predominantes de glucosa-1-fosfato (panei 1 A), galactosa-1-fosfato (panel 1B), yfructosa-1-fosfato (panel 1C).

La figura 2 es una curva estándar a partir de medidas triplicadas de 9 manchas estándar de sangre diferentes, que van de 0 a 8 mmol/l de concentración anadida de Gal-1-P. La intensidad de senal de tres iones fragmentários diferentes de los iones precursores de HMP (259,02 Da/e) se muestra para cada concentración. Los iones fragmentários son 78,96 Da/e, 96,97 Da/e, y 138,98 Da/e. Se utilizo análisis por regresión lineal para derivar las pendientes (a), las ordenadas en el origen (b), y el error estándar de las estimaciones (SEE).

La figura 3 es un gráfico de dispersion que compara la concentración de hexosa-monofosfato y la ratio de abundancia iónica (IAR) en muestras de pacientes con galactosemia, un heterocigoto compuesto Q188R/N314D individual con actividad reducida de GALT, y la población de referencia. La misma ilustra que la IAR tiene una eficiência de exploración igual (sensibilidad 100% y especificidad 100%) que lo hace la concentración calculada de HMPs determinada a partir de una curva de estandarización externa que utiliza el fragmento de 78,96 Da/e. Debería indicarse que los tres fragmentos HMP podrían utilizarse para cuantificación por estandarización externa. Se seleccionó el fragmento de 78,96 Da/e debido a que proporciona la intensidad máxima de senal.

La figura 4 es un cromatograma de corriente iónica total (TIC) que representa las intensidades iónicas obtenidas por medida de una muestra de HMP que se inyecta en el espectrómetro de masas en tándem. El TIC se deriva por sumación de senales de medidas cíclicas de los tres fragmentos ionizados de HMP.

La figura 5 muestra una gráfica de histograma de la intensidad iónica media de cada uno de los tres iones fragmentários medidos en el marco de tiempo sombreado de la figura 4. Adicionalmente, la figura indica los ajustes de masa a carga utilizados para detectar los iones fragmentários de interés.

La figura 6 es una impresión de tres páginas que muestra los ajustes instrumentales del espectrómetro de masas en tándem en una realización de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención es un método para detección y análisis cuantitativo dei contenido de HMP en una muestra, preferiblemente una muestra biológica y muy preferiblemente una muestra de sangre. Los HMPs incluyen, pero sin carácter limitante: Gal-1-P, glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato, fructosa-1-fosfato, fructosa-3-fosfato, y fructosa-6-fosfato. La invención puede utilizarse para explorar y/o diagnosticar pacientes con o identificar indivíduos de riesgo por un trastorno relacionado con niveles anormales de HMPs (v.g. altos o bajos), tales como galactosa-, glucosa- o fructosa-1-monofosfatos. Preferiblemente, la invención puede utilizarse para explorar y/o diagnosticar pacientes con niveles elevados (o excesivos) de HMP. Más particularmente, las concentraciones de HMP o niveles de IAR elevados, en la medida en que están correlacionados con niveles elevados de Gal-1-P, pueden utilizarse como indicación de galactosemia. Otras enfermedades que pueden ser detectables, por medida de una muestra apropiada de sangre y/o tejido incluyen, pero sin carácter necesariamente limitante, intolerância hereditaria a la fructosa (OMIM 229600), fructosuria (deficiência en fructoquinasa hepática) (OMIM 229800), deficiência en fructosa-1,6-bisfosfatasa (OMIM 229700), deficiência en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (OMIM 305900), deficiência en UDP-galactosa-4'-epimerasa (EC 5.1.3.2), y diabetes mellitus.

El método de la invención comprende un método para determinación del nível de HMP en una muestra biológica, tal como sangre entera, componentes de sangre fraccionados, tejido (tal como especímenes de biopsia de hígado), orina, heces, bilis, saliva, sudor u otras secreciones glandulares. En un ejemplo del método, se obtiene sangre entera de un indivíduo y se transfiere a un sustrato o medio adecuado, tal como papel de filtro que está preferiblemente exento de hilas y que tiene preferiblemente una capacidad alta y homogénea para absorción de líquidos. El papel de filtro es preferiblemente papel de filtro celulósico. La muestra se seca luego. Muestras de sangre entera capilar aplicadas sobre papel de filtro son el espécimen preferido utilizado para exploración neonatal en todo el mundo. Una persona experta en la técnica estaria familiarizada con métodos adecuados de recogida de sangre. Una muestra puede recogerse de diversas maneras, por ejemplo con relación a una muestra de sangre, la muestra puede recogerse por: (a) transferencia directa de sangre capilar procedente de una incision en la piei, (b) recogida en tubos que contienen anticoagulante y aplicación subsiguiente sobre papel de filtro, (c) recogida en tubos con o sin anticoagulante, realizándose el secado y la extracción dentro de los tubos, (d) recogida en tubos que contienen anticoagulante y análisis subsiguiente de una parte alícuota.

De acuerdo con la realización preferida de la presente invención, las muestras se preparan por aplicación de una cantidad de la muestra biológica, es decir, sangre entera, sangre fraccionada, saliva, sudor, orina, heces, bilis, homogeneizado de tejido u otras secreciones glandulares, sobre papel de filtro u otro material adecuado y dejando secar con preferencia a aproximadamente 10-100°C, más preferiblemente a la temperatura ambiente, preferiblemente a 19-26°C. El papel de filtro es preferiblemente papel de filtro celulósico, pero pueden ser aplicables otros tipos de sustratos. Pueden ser aplicables también muestras líquidas en tubos, tales como sangre entera anticoagulada, fracciones de sangre, saliva, orina u homogeneizados de tejido. La cantidad transferida al papel de filtro está comprendida tipicamente en el intervalo de 50-100 pl, y con preferencia es aproximadamente 75 μΙ.

Después de secado, una cantidad fija (tipicamente un disco circular de 3,2 milímetros de diâmetro, que representa por lo general aproximadamente 3,5 microlitros de muestra) de la muestra de papel de filtro con sangre seca se corta con punzón dei papel de filtro y se pone en una placa de microtitulación u otra vehículo apropiado. El HMP de la muestra de sangre seca se extrae utilizando un disolvente adecuado para extracción de HMP, preferiblemente Gal-1-P. Un disolvente adecuado para extraer HMP en una realización es un disolvente polar. En otra realización, el disolvente es preferiblemente más hidrófilo que el metanol. Preferiblemente, el mismo es miscible en agua. El agua está presente preferiblemente para asegurar polaridad suficiente. Ejemplos de disolventes adecuados son, pero sin carácter limitante, disolventes con propiedades similares a: acetonitrilo en agua, preferiblemente 30:70 a 70:30 (v/v), preferiblemente 1:1 (v/v). Otros disolventes adecuados podrían comprender acetato de etilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua o isopropanol en agua. Muy preferiblemente, el tampón de extracción es acetonitrilo:agua (1:1) (v/v). El papel de filtro se incuba con aproximadamente 50-1000 μΙ y preferentemente con aproximadamente 150 μΙ de tampón de extracción durante aproximadamente 5-100 minutos, y preferiblemente 20 minutos, con preferencia aproximadamente a la temperatura ambiente. Una persona experta en la técnica apreciaria que podrían ser aplicables otras temperaturas; sin embargo, se prefiere la temperatura ambiente, dado que es cómoda y no crea problemas con la pérdida de disolvente por evaporación.

Una muestra de la solución o extracto resultante, con preferencia aproximadamente 100-200 μΙ se centrífuga preferiblemente para separar resíduos (a saber, a aproximadamente 1800-10.000 g durante 10 minutos) y se somete luego a espectrometría de masas en tándem para análisis cuantitativo de HMP en la muestra, que ioniza la solución, se desolvatan los iones, y se aíslan y detectan luego los iones y sus fragmentos por su ratio de masa a carga. Antes de la ionización, la muestra puede someterse opcionalmente a cromatografía líquida para liberaria de resíduos particulados, o de los componentes de interferencia o supresión de serial contenidos en el extracto.

Debería indicarse que aunque se describe en esta memória un método específico de preparación de la muestra, una persona experta en la técnica apreciaria que cualquier forma de preparación de la muestra, adecuada para detección y análisis de HMP por un espectrómetro de masas utilizado para la realización del método, podría ser adecuada. Por ejemplo, el método para preparación de la muestra puede variar con la naturaleza de la muestra (a saber, sangre, saliva o tejido) y/o el tipo de espectrómetro de masas utilizado.

En una realización de la invención, la muestra biológica seca de la invención, preferiblemente sangre, antes de la extracción con un disolvente adecuado para extracción de HMPs, puede someterse a pre-extracción con otro disolvente adecuado para extraer componentes distintos de HMP, por ejemplo para extraer aminoácidos y acilcarnitinas (v.g. metanol). Este extracto resultante puede ser analizado en sí mismo para explorar trastornos asociados con ciertos niveles de aminoácidos o acilcarnitinas. Por ejemplo, niveles elevados de fenilalanina pueden indicar fenilcetonuria. Puede realizarse un análisis de acuerdo con Rashed et al (10), para explorar por fenilcetonuria. La misma mancha de sangre seca pre-extraída puede recuperarse luego, secarse, preferiblemente bajo nitrógeno, y extraerse con un disolvente adecuado para extraer HMPs como se ha indicado arriba, a fin de explorar por HMPs como se ha descrito arriba. Así, en una realización preferida, la presente invención proporciona también un método rápido en el cual una mancha de sangre seca puede utilizarse para exploración, tanto de trastornos relacionados con HMP, tales como galactosemia y enfermedades relacionadas con niveles anormales de aminoácidos y acilcarnitinas, como trastornos metabólicos de aminoácidos, ácidos orgânicos y ácidos grasos, v.g. fenilcetonuria.

Espectrometría de Masas EI método preferido de análisis de los niveles de HMP de la invención es por espectrometría de masas en tándem.

Un espectrómetro de masas en tándem ioniza primeramente las partículas y las separa luego basándose en su ratio de masa a carga (m/z). Un espectrómetro de masas en tándem tiene ai menos dos filtros de masa, preferiblemente filtros cuadripolo dispuestos en tándem. El primer filtro de masa (Q-ι) se ajusta para transmitir la ratio de ratio masa a carga de los iones precursores, que en el caso de los HMPs es aproximadamente 259,02 Da/e. Los iones transmitidos se conducen a una célula de colisión (Q2) que contiene un gas inerte, tal como nitrógeno. Cuando los iones seleccionados colisionan con las moléculas de gas, se fragmentan y generan iones producto. El segundo filtro de masa (Q3) se ajusta para transmitir las ratios de masa a carga del ion producto seleccionado ai detector [Selected Reaction Monitoring (SRM)]. La intensidad iónica del ion producto puede ser determinada luego utilizando métodos conocidos en la técnica. Los HMPs tienen tres iones producto predominantes, [PO3]', [H2PO4]', y [(C2H30)HP04]', con ratios respectivas de masa a carga de aproximadamente 78,96 Da/e, 96,97 Da/e, y 138,98 Da/e (15). Una persona experta en la técnica apreciará que los valores m/z proporcionados en esta memória pueden variar ligeramente dependiendo del modo de cálculo de la masa molecular o del modo de calibración del espectrómetro de masas en tándem.

Muchos espectrómetros de masas en tándem tienen también una sección de fragmentación o célula de colisión entre los filtros de masa primero y segundo. La sección de fragmentación es usualmente un filtro de masa cuadripolo operado en el modo de radiofrecuencia sólo (RF), como un dispositivo de contención de iones y que contiene un gas de colisión a una presión de aproximadamente 3 militorr. Los filtros de masa primero y segundo son entonces cuadripolos a cualquier lado de la sección de fragmentación. En un instrumento cuadripolo triple, los cuadripolos se designan comúnmente Q-ι, Q2, y Q3, siendo Q2 la sección de fragmentación o célula de colisión. Es posible también utilizar un instrumento denominado de tiempo de vuelo (TOF), en el que el tercer cuadripolo Q3 está reemplazado por una sección TOF. Sin embargo, se conocen muchos otros espectrómetros de masas en tándem o de otro tipo, que incluyen diversas combinaciones de analizadores y filtros cuadripolo, y podrían utilizarse para realizar el método de la presente invención. Configuraciones posibles incluyen trampas de iones, TOF-TOF, Q-TOF, TOF con decadência post-fuente, espectroscopia de energia cinética de iones analizada por masa (MIKES), trampa de iones cuadripolo, Resonancia Ciclotrónica de Iones - Espectrometría de Masas según la Transformada de Fourier (FT-ICR) y otros métodos capaces de generar espectros de iones producto después de preselección de iones precursores.

Existen diversos médios para analizar partículas, tales como electrospray (ESI), ionización por electrospray asistida neumáticamente (tal como lonSpray), ion secundário líquido (LSI), bombardeo de átomos rápidos (FAB), bombardeo de iones rápidos (FIB), y fuentes de ionización pulsantes tales como ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI). El método preferido de la presente invención es la ionización por electrospray (ESI), y la ionización por electrospray asistida neumáticamente (v.g., lonSpray).

Aunque, actualmente no es posible determinar en una muestra que contiene cantidades desconocidas de HMPs qué proporción de cada fragmento de ionización o ion producto representa Gal-1-P específicamente, se ha determinado que el fragmento [PO3]' es el más abundante, y es el más indicativo de los niveles de Gal-1-P en una muestra. Por tanto es el fragmento utilizado preferiblemente en la diagnosis de la galactosemia. El fragmento o ion producto [H2PO4]' es el más indicativo de los niveles de fructosa-1 -fosfato y es por tanto el fragmento utilizado preferiblemente en la diagnosis de trastornos relacionados con los niveles de fructosa-1-fosfato. Así, los iones producto preferidos de interés utilizados para explorar o diagnosticar un trastorno relacionado con HMP pueden variar dependiendo del trastorno. Adicionalmente, se ha encontrado que la alimentación de los bebés por via intravenosa con una mezcla milimolar de glucosa y fructosa no da lugar a concentraciones elevadas de HMPs como se miden por la invención.

En una realización de la invención, se ha encontrado que si el grupo fosfato está unido a un átomo de carbono que forma parte de la estructura anular de la hexosa, entonces predomina el ion producto de m/z 78,96 (ο [PO3]'). Esto podría ser cierto también para los aldohexosa-1-monofosfatos, tales como galactosa-1-fosfato y glucosa-1-fosfato. Si el grupo fosfato está unido a un átomo de la cadena lateral que no forma parte de la estructura del anillo, entonces predomina el ion producto de m/z 96,97 [ο [H2PO4]']. Esto podría ser cierto también para los aldohexosa-6-monofosfatos y los cetohexosa-1- o 6-monofosfatos, tales como glucosa-6-fosfato, fructosa-1-fosfato y fructosa-6-fosfato.

Por tanto, en una realización de la invención, un ion producto preferido de interés para la determinación de las concentraciones o niveles de aldohexosa-1-monofosfato, diagnóstico o exploración de trastornos de aldohexosa-1-monofosfato o cuando o se desarrolla una base de datos de concentraciones o niveles de HMP para exploración y/o diagnosis de un trastorno relacionado con una aldohexosa-1-monofosfato podría ser [PO3]' o el ion producto de m/z 78,96. En otra realización de la invención, un ion producto preferido de interés para determinación de las concentraciones o niveles de aldohexosa-6-monofosfatos y cetohexosa-1- o 6-monofosfatos, diagnóstico o exploración de aldohexosa-6-monofosfatos y cetohexosa-1- o 6-monofosfatos cuando se desarrolla una base de datos de concentraciones o niveles de HMP para exploración y/o diagnosis de un trastorno relacionado con aldohexosa-6-monofosfatos y cetohexosa-1- o 6-monofosfatos podría ser [H2PO4]'] o el ion producto de 96,97 m/z.

Estándares v Aplicaciones de Diagnóstico:

La invención contempla técnicas de estandarización diferentes para calibrar los resultados y minimizar positivos y negativos falsos. Por ejemplo, puede utilizarse un estándar externo anadiendo cantidades conocidas de HMP, preferiblemente Gal-1-P, a una muestra de sangre entera recogida de un indivíduo sano y transfiriéndola sobre papel de filtro en condiciones (v.g., temperatura baja, es decir de 1 a 25°C, preferiblemente de 1 a 9°C) en las cuales se inhibe la actividad de GALT. Este sistema estándar externo puede procesarse idénticamente a las muestras de test en cada operación analítica.

Pueden utilizarse también estándares internos. Por ejemplo, los presentes inventores han analizado el potencial de la ratio de abundancia iónica (IAR) de las transiciones SRM 259,02-78,96 y 259-02-96,97, es decir, la ratio de la intensidad de serial del fragmento 78,96 Dale a la intensidad de serial del fragmento 96,97 Da/e, derivados ambos del ion precursor 259,02 Da/e. Esta IAR tiene una eficiência de exploración igual (100% sensibilidad y 100% especificidad) que la concentración calculada de HMPs determinada a partir de una curva de estandarización externa que utilice el fragmento de 78,96 Da/e.

Adicionalmente, un estándar interno marcado isotópicamente para Gal-1-P podría ser utilizado como estándar interno. En principio, podría ser adecuado cualquier HMP marcado con isótopos estables que den un aumento de masa, preferiblemente de 3 Da o mayor con respecto a Gal-1-P sin marcar. Para prevenir la interferencia de senates procedentes de un estándar de intervalo maçado, podría ser preferible posicionar el marcador en el grupo fosfato, dado que podrían obtenerse aumentos de masa tanto del ion precursor como del ion producto. Esto podría permitir también la evaluación de posibles hidrólisis del estándar interno, que podrían generar un grupo fosfato marcado.

Niveles elevados de HMP pueden determinarse por comparación de la concentración de HMPs (o iones parental o producto relevantes respectivos) o la IAR del paciente con la de un nivel de punto de corte característico del trastorno de HMP, a saber, galactosemia. Niveles de punto de corte apropiados pueden determinarse a partir de las concentraciones de HMP o niveles de IAR observados en indivíduos normales y aquéllos que presentan un trastorno HMP indicativo, tales como pacientes de galactosemia. Una base de datos de concentraciones e HMP o niveles de IAR normales y anormales puede desarrollarse a partir de análisis cuantitativo de muestras conforme ai método de la presente invención de indivíduos que se sabe presentan o no el trastorno. Se determinan las concentraciones de HMP o niveles de IAR característicos de indivíduos normales y pacientes de galactosemia y los valores de punto de corte de diagnóstico se determinan de acuerdo con ello. La base de datos puede actualizarse continuamente. Concentraciones elevadas de HMPs o niveles altos de IAR están correlacionados con niveles elevados de Gal-1-P y por tanto hacen posible el diagnóstico presunto de galactosemia.

Los presentes inventores han determinado que niveles de HMP superiores a 0,94 milimolar o 1,41 IAR son potencialmente indicativos de galactosemia. Sin embargo, los más indicativos son niveles de HPM entre 2-6 y 5,2 milimolar o IAR 1,69-1,76, dado que este intervalo contiene todas las concentraciones de pacientes promediadas en los ejemplos determinados por estandarización externa utilizando el fragmento de 78,96 Da/e. Por tanto, los puntos de corte para galactosemia de acuerdo con los ejemplos podrían estar comprendidos entre 0,95 y 2,5 mmol/l para concentración de HMP, e IAR 1,42 a 1,68, más preferiblemente desde 0,95 a 1,43 mmol/l para HMP e IAR 1,42 a 1,56, si se desea la detección de indivíduos que son heterocigotos compuestos para un alelo nulo de GALT y el alelo Duarte. Los inventores recomiendan que los puntos de corte preferidos para exploración neonatal determinada por análisis de datos podrían ser 1,2 milimolar o 2,0 milimolar HMP (IAR 1,49 ó 1,63), dependiendo de si tuvieran que detectarse o no heterocigotos compuestos para una mutación parcialmente disruptive en el gen GALT (mutación Duarte) y tuviera que detectarse o no una mutación totalmente disruptiva. La concentración de HMP y el valor de IAR inferiores deberían permitir la detección de pacientes de galactosemia así como heterocigotos compuestos que lleven un alelo GALT parcialmente disruptivo (alelo Duarte) y un alelo GALT totalmente disruptivo. La mayor concentración de HMP y el valor de IAR mayor permitirían la detección de indivíduos con genes GALT totalmente desactivados en ambos alelos, es decir pacientes de galactosemia.

Un método similar puede utilizarse para determinar niveles de punto de corte apropiados para otros trastornos relacionados con HMP.

Los métodos de exploración de la invención resenados en esta memória pueden utilizarse solos o preferiblemente en conjunción con otros indicadores de diagnóstico. El método de la invención puede utilizarse para exploración de indivíduos para seguimiento diagnóstico ulterior tal como análisis de genes. Los métodos resenados en esta memória pueden utilizarse también en un método para conducción de un asunto de diagnóstico de un trastorno relacionado con HMP.

Los ejemplos no limitantes siguientes son ilustrativos de la presente invención:

EJEMPLOS

Introducción

Los ejemplos que siguen describen un método para cuantificar el contenido de HMP en muestras en papel de filtro de sangre neonatal.

Instrumentos y Materiales

En los ejemplos que siguen se utilizaron los instrumentos y materiales siguientes.

Instrumentos: (a) Punzón Wallac, punzón de manchas de sangre seca Delfia 1296-071, n° de serie LR52500, diâmetro de la cabeza dei punzón: 3,2 mm (b) Pipeta de 8 canales, Labsystems P24449, n° de serie 4510 (c) Espectrómetro de masas en tándem API PE-Sciex 365, con fuente lonSpray (Perkin Elmer-Sciex, Toronto, Canadá, n° de serie 0029712 PT) (d) Tomamuestras automático Perkin-Elmer serie 200, The Perkin Elmer Corporation, Norwalk Connecticut, EE.UU., n° de serie 293N8040613). (e) Bomba Shimadzu LC-10Avdp. Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón, parte número 228-39000-92, n° de serie C20963502470.

(f) Computadora Power Macintosh G3, n° de serie XB81303HBBW (g) Software NeoChrom, version 1.0g. (h) Balanza analítica, Sartorius, n° de serie 31004423, Kebolab, Dinamarca.

Materiales (a) Galactosa-1-fosfato (Cat. n° G-0380, lote n° 32H7030). Glucosa-1-fosfato (Cat. n° G-6875), y fructosa-1-fosfato (Cat. n° F-1127) se adquirieron de Sigma Chemical Co. (b) Acetonitrilo, Aldrich, Cat. n° A/06227/15. (c) Agua de Calidad Ultra-Elevada (UHQ). De Millipore Milli-Q A10 (de la propia empresa). (d) Film de sellado para placas de microtitulación, Nunc, Cat. n° 236366. (e) Placas de microtitulación de poliestireno, pocillos de fondo cónico, Nunc, Cat. n° 245128. (f) Tampón de extracción/desplazamiento, 500 ml agua UHQ y 500 ml de acetonitrilo. Filtrado en filtros de 0,45 pm de nailon-66 (Varian Chromatography Systems) y desgasificado por borboteo con helio. (g) Papel de filtro, Schleicher y Schuell, Cat. n° 2992. (h) Viales de EDTA, Venoject, VT-100TK, 0,1 ml EDTA 0,47 M, lote n° 97I22L7. (i) Vasija de muestra, WR 1270, 145 x 100 mm. Thuringer Pharma Glass, Alemania.

Materiales v Métodos

Reactivos

Galactosa-1-fosfato, glucosa- y fructosa-1 -fosfato se adquirieron de Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, EE.UU.). La solución de extracción/fase móvil era una mezcla 1:1 de agua de calidad ultra-elevada de un sistema Milli-Q de la propia empresa (Millipore, EE.UU.) y acetonitrilo (Aldrich, EE.UU.). Antes de su utilización, la solución se filtro en filtros de nailon 66 de 0,45 pm (Varian Chromatography Systems) y se desgasificó por borboteo de helio.

Indivíduos v Muestras de Sangre

Veintidós pacientes diagnosticados con galactosemia en ei período 1984-1998 se identificaron de los registros médicos en ei Departamento de Genética Clínica, Hospital de la Universidad de Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca. Todos los diagnósticos fueron confirmados por análisis del genotipo GALT. EI programa de exploración neonatal danés utiliza muestras de manchas de sangre seca (DBSS) recogidas en papel de filtro Schleicher & Schuell 2992, obtenidas tipicamente 5 a 7 dias después dei nacimiento. Subsiguientemente ai análisis de rutina, las DBSS se guardan a 20°C en un banco de especímenes biológicos (7). Estaban disponibles resíduos de las DBSS primarias de 12 pacientes de galactosemia. Se estableció un grupo de referencia por recogida de 2055 resíduos de DBSS aleatórios desidentificados de bebés aparentemente sanos 7-10 dias después que se hubo analizado su muestra por ei programa de exploración neonatal de rutina. La información dei peso ai nacer y la edad posnatal en ei momento de la toma de muestras de sangre se retuvo dei impreso de datos de las muestras de sangre. Un grupo de infusion de carbohidratos estaba constituído por muestras de pacientes de cuidados intensivos neonatales que recibieron fluidos intravenosos que contenían 5% (p/v) de glucosa y 5% (p/v) de fructosa en combinación. Este grupo fue evaluado anonimamente por creación de DBSS de sangre con EDTA en exceso extraída para tests de química clínica rutinarios durante las infusiones de carbohidratos. Un grupo de estabilidad de hexosa-monofosfatos (HMP) estaba constituído por DBSS aleatórias que se habían guardado a 20°C durante 1, 2, 5 y 10 anos (160 muestras para cada duración de almacenamiento).

Estándares de Concentración Externos

Se prepararon soluciones stock con concentraciones diferentes de Gal-1-P en 0,9% (p/v) NaCI en solución acuosa. Se recogió la sangre en viales de EDTA de una mujer adulta sana en ayunas. La sangre se enfrió a 4°C a fin de reprimir la actividad endógena de GALT. De cada solución stock de Gal-1-P, se anadieron 70 ml a 1930 ml de sangre preenfriada. Las mezclas se invirtieron cuidadosamente. Se prepararon estándares de concentración de manchas de sangre por pipeteado de 75 pl de sangre aditivada sobre papel de filtro (Schleicher & Schuell, Cat. n° 2992). Los estándares se secaron durante una noche a la temperatura ambiente y se guardaron posteriormente en bolsas de plástico con cierre de cremallera a 20°C. Los estándares contenían las concentraciones siguientes de Gal-1-P anadido: 0; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,50; 1,0; 2,0; 4,0; y 8,0 mM. La estabilidad de Gal-1-P durante la preparación de los estándares externos se examino por ensayo de DBSS creadas a partir de sangre-EDTA aditivada con 0,0625 mmol/l de Gal-1-P que se habían incubado previamente durante hasta 21 horas a 4°C o a la temperatura ambiente antes de ser aplicadas por puntos sobre papel de filtro.

Extracción de Galactosa-1-Fosfato

Para determinar la composición óptima del disolvente utilizado para extraer Gal-1-P de DBSS, se testaron diferentes mezclas de acetonitrilo y agua, metanol y agua, y metanol y acetonitrilo con cualquier disolvente en un par que variaba en concentración desde 10-90% v/v en pasos de 10%. Los disolventes de extracción se utilizaron para preparar extractos de un estándar de concentración de 0,5 mmol/l de Gal-1-P en placas de microtitulación, como se describe en la sección de preparación de las muestras, con la modificación siguiente: para eliminar los efectos de la composición del disolvente sobre la desolvatación y la formación de iones, todos los extractos se evaporaron a 45°C bajo una corriente suave de nitrógeno gaseoso y se redisolvieron en acetonitrilo:agua 1:1, se inyectaron en el instrumento MS en tándem, y se sometieron a recuento como se ha descrito.

Preparación de la Muestra A partir de cada DBSS, un disco con un diâmetro de 3,12 mm cortado con punzón se puso en un pocillo en blanco en una placa de microtitulación de fondo cónico. Se anadió a cada pocillo la solución de extracción (150 μΙ) utilizando una pipeta de 8 canales, y las placas se sellaron con film adhesivo (Nunc, cinta de sellado SI, cat. 236366). La extracción se llevó a cabo por rotación suave en una máquina de sacudidas orbital durante 20 min, y se transfirieron partes alícuotas de 100 μΙ a placas de microtitulación nuevas que se sellaron con film adhesivo. Se redujeron a pelets hilas de papel de filtro por centrifugación a 1800 g durante 10 min a fin de prevenir el bloqueo de la puerta dei autoinyector y el sistema de tubos.

Las placas de microtitulación se cargaron con el conjunto de estándares externos por triplicado. Las muestras de los pacientes de midieron por duplicado, y las muestras dei grupo de infusion de carbohidratos se midieron por triplicado. Cada medida dei conjunto de estándares, los pacientes, y el grupo de carga de carbohidratos fue precedida por una muestra en blanco (solución de extracción) a fin de evitar cualquier posibilidad de arrastre de las muestras. Las muestras dei grupo de referencia se ensayaron aisladamente sin separación por muestras en blanco. Cada vigésima muestra de un ensayo era una muestra de control que contenía 0,5 mmol/l de Gal-1-P. Las placas de microtitulación procesadas se cargaron en un tomamuestras automático Perkin-Elmer serie 200 (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, EE.UU.) provisto de un elemento de refrigeración Peltier ajustado a 4°C. La preparación de 300 muestras consumió tipicamente 1-1,5 horas con inclusion dei corte con punzón.

Espectrometría de Masas en Tándem

Todas las medidas se realizaron en un espectrómetro de masas en tándem API-365 (PE-Sciex, Toronto, Canadá) provisto de una fuente de electrospray (lonSpray). Se determino que todas los HMPs desprotonizadas (259,02 Dale estudiadas sufren disociación inducida por colisión en tres fragmentos predominantes de 138,98 Da le, 96,97 Da le, y 78,96 Da le, que se midieron como funciones de monitorización de reacción seleccionadas (SRM) entrelazadas en las aplicaciones siguientes: A) Para el estúdio de los patrones de fragmentación de Gal-1-P, glucosa-1-fosfato, y fructosa-1-fosfato, soluciones de 20 pmol/l de cada sustancia disuelta en fase móvil se infundieron a 15 μΙ/min en el instrumento MS en tándem. Se recogieron 20 escaneos de adición de canales múltiples con los ajustes dei instrumento indicados más adelante. (Por ejemplo como se indica en las figuras 4-6). B) Para el análisis de las DBSS procesadas, se inyectaron 8 μΙ de cada extracto de muestra en un flujo constante de 70 μΙ/min de fase móvil suministrado por una bomba Shimadzu LC-10 Advp (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japón), y las SRMs se monitorizaron durante el ciclo de inyección. La aplicación se realizo con un tiempo de ciclo de muestra a muestra dei orden de 1,5 min, pero este intervalo podría acortarse considerablemente si tuvieran que utilizarse tasas de flujo mayores.

El instrumento se operó en todos los casos en modo de iones negativos con un voltaje de aguja de -4,9 kV, energia de colisión de -25 eV, gas de colisión nitrógeno en el ajuste 2 ( dei fabricante) y tiempo de residência de 500 ms para cada SRM.

Procesamiento de los Patos

Las intensidades iónicas se extrajeron de los archivos de datos brutos utilizando Software Neochrom, version 1.0 (PE-Sciex) que operaba en una plataforma PC de Macintosh Power. Se utilizo Microsoft Excel version 5.0c para Windows a fin de generar curvas estándar por regresión lineal, utilizando la serial obtenida de la transición iónica 259.02/78.96 para estandarización, excepto donde se indica. Las ecuaciones que describen las curvas estándar se utilizaron para calcular el contenido de HMP en las muestras analizadas. Se calculo la ratio de abundancia iónica (IAR) de la transición 259,02/78,96 con relación a la transición 259,02/96,97 para cada muestra. Métodos Estadísticos

Se utilizo ei software de SPSS version 9. para análisis estadístico. Se utilizo el test Mann-Whitney U para comparar las variables entre grupos. Se utilizo el test de correlación de rangos de Spearman para investigar las correlaciones. Se empleó ANOVA de una sola via para determinar los coeficientes de variación (CVs) intra- e inter-ensayos. Se empleó análisis de regresión lineal para determinar los intervalos de confianza y ei error estándar de la estimación para las curvas de calibración. Todos los tests eran de dos colas y se consideraban estadísticamente significativos si p < 0,05 para las hipótesis nulas.

Precision Analítica

Una muestra de control (estándar de concentración 0,5 mmol/l de Gal-1-P) se cuantificó 57 veces en 8 ensayos separados, y los CVs se determinaron por ANOVA de una sola via.

Análisis dei Genotipo EI genotipo GALT de una muestra dei grupo de referencia que tenía una concentración extrema de HMP e IAR se determino por análisis de restricción de DNA extraído dei resíduo de DBSS, amplificado por reacción en cadena de polimerasa.

Resultados

Patrón de Fraamentación de los Hexosa-Monofosfatos EI análisis espectral de masas en tándem demostro que los HMPs desprotonizados (259,02 Da/e) se disocian en tres fragmentos predominantes de 138,98 Da/e, 96,97 Da/e, y 78,96 Da/e, en concordância con los hallazgos prévios (15). Las estructuras predichas de los fragmentos son [(C2H30)-HP04]‘, [H2PO4]', y [PO3]", respectivamente. Existen diferencias marcadas en la abundancia relativa de los fragmentos 78,96 Da/e y 96,97 Da/e dependiendo de la estructura dei HMP (figura 1). Para los aldosa-monofosfatos sustituidos en posición 1 (glucosa-1-fosfato y Gal-1-P), predomina la senal dei fragmento de 78,96 Da/e (figura 1, panel A y B), mientras que ei fragmento de 96,97 Da/e predomina para fructosa-1-fosfato, una cetosa-monofosfato (figura 1, panel C). EI fragmento de 96,97 Da/e predomina también para glucosa-6-fosfato, una aldosa-monofosfato sustituida en posición 6 (datos no presentados). Estos resultados sugerirían que si ei grupo fosfato está unido a un átomo de carbono que forma parte de la estructura dei anillo, entonces predomina el ion producto de m/z 78,96 [PO3]', y si ei grupo fosfato está unido a un carbono de la cadena lateral que no forma parte de la estructura dei anillo, entonces predomina el ion producto de m/z 96,97 [H2P04]'.

Extracción de Galactosa-1-Fosfato

Se determino que ei disolvente óptimo de extracción era 30-70% de acetonitrilo en agua (v/v) que, a todo lo largo dei intervalo de concentraciones indicado, producía intensidades iónicas 3 y 9 veces mayores que la senal óptima de las muestras extraídas con mezclas metanol-agua y metanohacetonitrilo, respectivamente (datos no presentados). Por ello, se utilizo acetonitrilo:agua 1:1 (v/v) para la extracción en todas las aplicaciones ulteriores.

Estandarización Externa

Se representaron gráficamente las intensidades iónicas de los tres fragmentos HMP predominantes contra las concentraciones de Gal-1-P anadidas (figura 2). En todos los experimentos, los tres fragmentos producían curvas estándar lineales (r2 = 0,994 a 1,000) dentro dei intervalo de 0 a 8 mmol/l de Gal-1-P anadido. Las curvas estándar derivadas dei fragmento de 96,97 Da/e exhibían eliminación de la tendencia hacia intensidades iónicas mayores en ei intervalo bajo (< 0,0625 mmol/l) de Gal-1-P anadido. Adicionalmente, las concentraciones de HMP computadas en las muestras de exploración neonatal eran 0,1 mmol/l mayores como promedio cuando se utilizo ei fragmento de 96,97 Da/e para la estandarización que cuando se utilizaron para estandarización los fragmentos de 78,96 Da/e o 138,98 Da/e. Esta diferencia se anulaba en ei intervalo de concentraciones bajo (< 0,0625 mmol/l) de HMP. Las diferencias en las concentraciones calculadas de HMP podrían ser debidas a una ratio mayor de cetosa-monofosfatos a aldosa-monofosfatos o niveles mayores de compuestos de interferencia en las muestras de exploración neonatal, con relación a la sangre adulta que se utilizaba para generar los estándares de concentración externos. No había diferencia significativa alguna entre las concentraciones de HMP determinadas por estandarización utilizando los fragmentos de 78,96 Da/e o 138,98 Da/e. La incubación durante una noche a 4°C a la temperatura ambiente de sangre con EDTA extraída recientemente aditivada con Gal-1-P no exhibía evidencia alguna de degradación de la serial (datos no presentados), como podría esperarse dado que Gal-1-P se anadía ai compartimiento extracelular y no estaria expuesto a GALT localizada intracelularmente. Para todas las categorias de muestras, la abundancia iónica del fragmento de 78,96 Dale era 7-9 veces mayor que la del fragmento de 138,98 D ale como promedio, mientras que la IAR del fragmento de 78,96 D ale con relación al fragmento de 96,97 D ale variaba con el estado de enfermedad, siendo máxima en los pacientes de galactosemia (figura 3). Se decidió utilizar la intensidad iónica del fragmento de 78,96 Da le para cuantificación de Gal-1-P dado que la misma estaba asociada con un patrón de fragmentación de Gal-1-P (figura 1) y proporcionaba la intensidad de senal máxima en las muestras que contenían exceso de Gal-1-P (estándares de concentración aditivados y muestras galactosémicas).

Precision Analítica

Se determino que los CVs intra- e interensayos a una concentración media de HMP de 0,54 mmol/l eran 11% y 13%, respectivamente. Para la IAR, los CVs intra- e interensayos a 1,44 unidades eran 15% y 4,1%, respectivamente. La precision analítica total derivada por sumación cuadrática de los CVs intra- e interensayos era por tanto 17% (concentración de HMP) y 4,4% (IAR).

Estabilidad de los Hexosa-Monofosfatos

El análisis de DBSS que se habían guardado durante vários períodos de tiempo a t -20°C revelo alteraciones menores pero estadísticamente significativas en el estado de HMP. Así, el contenido mediano de HMP disminuía desde 0,15 a 0,12 mmol/l (p = 0,001) durante el transcurso de 10,6 anos, mientras que la IAR aumentaba desde 0,80 a 0,84 (p = 0,01). Aparentemente no existia modelo alguno apropiado de ajuste de curvas para ninguna asociación, y se considero que los câmbios eran demasiado pequenos para precisar corrección de los resultados obtenidos a partir dei análisis de las muestras de pacientes de los archivos.

Grupo de Referencia

La concentración mediana de HMP en 2055 muestras de referencia era 0,15 mmol/l (-0,08 - 0,94 mmol/l) (figura 3). La IAR mediana dei fragmento de 78,96 Da/e con relación al fragmento de 96,97 Da/e era 0,80 (0,32-1,41). Ni la concentración de HMP ni la IAR se correlacionaban con la edad postnatal en el momento de la toma de muestras de sangre con pesos al nacer > 2500 g. Para bebés de peso bajo al nacer (< 2500 g) (n = 114), en cambio, tanto la concentración de HMP como la IAR estaban correlacionadas positivamente con el peso al nacer (p < 0,01 y p < 0,05, respectivamente). Por análisis mutacional de DNA se demostro que una muestra con una concentración extremada de HMP de 1,44 mmol/l y una IAR de 1,57 era un heterocigoto compuesto para las mutaciones Duarte (N314D) y Q188R en la enzima GALT, y se excluyó dei grupo de referencia.

Pacientes de Galactosemia

Las características de las muestras de los pacientes se exponen en la Tabla 1. Las concentraciones de HMP estaban comprendidas entre 2,6 y 52 mmol/l, y la IAR se encontraba entre 1,69 y 1,76. Había una correlación débil entre la edad post natal en el momento de la toma de muestra y la concentración de HMP (p < 0,05), pero no se encontro ninguna otra correlación entre los parâmetros enumerados en la Tabla 1.

Neonatos Infundidos con Carbohidratos

Los neonatos de cuidados intensivos recibieron infusiones de una solución de glucosa al 5% (p/v) y fructosa al 5% (p/v) a una tasa mediana de 191 (12-312) ml/24 horas. Comparado con el grupo de referencia, el grupo de carga de carbohidratos (n = 10) tenía niveles ligera pero significativamente reprimidos de HMP e IAR (medianas, 0,062 mmol/l y 0,42, respectivamente, p < 0,001 para ambas comparaciones). Por tanto, no existia diferencia alguna en la concentración de HMP cuando se utilizo el fragmento de 96,97 Da/e para estandarización. La tasa de infusion de carbohidratos estaba correlacionada negativamente con la IAR (p < 0,001), pero no con las concentraciones de HMP.

Exactitud de Diagnóstico

La figura 3 compara el grupo de pacientes con el heterocigoto compuesto y el grupo de referencia para concentración de HMP e IAR. Para la exploración neonatal, los puntos de corte en el intervalo de 0,92-2,5 milimol/l para la concentración de HMP y 1,42-1,68 para IAR producen sensibilidades y especificidades de 100%. Si se desea la detección de heterocigotos compuestos Q188R/N314D, pueden obtenerse sensibilidad y especificidad 100% con puntos de corte en el intervalo 0,95-1,43 mmol/l para HMP y 1,42-1,56 para IAR. Los últimos intervalos son ambos equivalentes a 2 desviaciones estándar de los tests respectivos, basadas en las precisiones analíticas totales.

Exploración de Aminoácidos. Acilcarnitinas v HMPs Utilizando la Misma Mancha de Sangre Seca

Los presentes inventores realizaron también con êxito dos extracciones secuenciales de la misma mancha de sangre seca. La primera extracción se realizo con metanol que contenía estándares internos de aminoácidos y acilcarnitinas como ha sido descrito por Rashed et ai (10). Los valores de aminoácidos y acilcarnitinas se midieron por espectrometría de masas en tándem, y se calcularon por un algoritmo de computadora. (Véase Tabla 1) Las manchas de sangre restantes se secaron en corriente de nitrógeno, y se sometieron directamente al segundo procedimiento de extracción descrito en esta memória para HMPs. Se ha demostrado que esta segunda extracción hidrófila da el mismo resultado que si la extracción se realizara sobre una mancha de sangre fresca.

Los inventores han desarrollado un nuevo test aplicable a la exploración neonatal para galactosemia. El principio del test es el análisis cuantitativo de HMP o uno o más iones fragmentários de HMP indicativo(s) de Gal-1-P por MS en tándem. El método de la invención puede adaptarse para exploración de otros trastornos relacionados con HMP, a saber, por detección y cuantificación de iones HMP indicativos del trastorno. Para resultados óptimos, a fin de determinar si el indivíduo sufre un problema en el metabolismo de Gal-1-P conforme al método de exploración galactosémica de la presente invención, los indivíduos tienen que exponerse a una dieta que contenga galactosa antes de la exploración. Así, la nutrición parenteral, que no contiene galactosa, o la toma de muestras anterior a una lactación eficaz pueden crear resultados de exploración negativos falsos como lo pueden hacer las transfusiones de sangre y otras medidas que reducen el contenido en sangre de Gal-1-P. Estas limitaciones, sin embargo, están presentes también con otros ensayos para Gal-1-P y para galactosa. El presente ensayo es insensible a los problemas de desactivación enzimática.

Las concentraciones de HMP se calcularon por estandarización externa utilizando el fragmento de 78,96 Dale correlacionado con las concentraciones de Gal-1-P (figura 2) y con galactosemia (figura 3). No existia superposición alguna en las concentraciones de HMP entre un grupo de 2055 muestras de referencia y 12 pacientes, produciendo una sensibilidad y especificidad de diagnóstico de 100%. Las infusiones de carbohidrato no causaban elevaciones de HMP o IAR en los pacientes neonatales de cuidados intensivos. Una muestra procedente del grupo de referencia original contenía una concentración elevada de HMP a 1,44 mmol/l, fácilmente separable tanto del grupo de referencia como del grupo de pacientes. La determinación del genotipo revelaba heterocigosidad del compuesto para una mutación totalmente desactivadora de GALT (Q188R) y para la mutación Duarte parcialmente disruptiva (N314D). Los indivíduos con este genotipo tienen sólo 5% de la actividad normal de GALT, y se les recomienda que se sometan a tratamiento dietético durante su primer ano de vida (12). Por esta razón se sugiere un punto de corte de 1,2 mmol/l de HMP para exploración neonatal. Esto podría detectar los pacientes de galactosemia con una especificidad y sensibilidad de 100%, y probablemente incluye la mayoría de los heterocigotos compuestos recomendados para tratamiento.

Adicionalmente, la IAR entre los fragmentos de 78,96 y 96,97 Da le era capaz de distinguir claramente entre el grupo de referencia, el heterocigoto compuesto, y el grupo de pacientes, con aumentos marcados en los últimos grupos. En la figura 3, es evidente que la población de referencia tiene gran variación en la IAR, mientras que la población galactosémica tiene valores IAR agrupados estrechamente, que se aproximan a IAR de Gal-1-P puro (figura 1). Una posible explicación es que los HMPs interferentes contribuyen a la variabilidad en la IAR en la población de referencia, que tiene concentraciones de HMP bajas. En las muestras de galactosemia, predominará el patrón de fragmentación de Gal-1-P por razones cuantitativas, y se predecirá por tanto que la IAR se aproximará a la de Gal-1-P puro. El uso de la IAR hace posible la exploración sin el uso de estándares de concentración externos, lo cual simplifica la preparación de las muestras y el procesamiento de los datos, y elimina variaciones de serial causadas por heterogeneidad de la muestra, dado que las intensidades de ambos iones en la IAR se verán afectadas en el mismo grado. Se sugiere el punto de corte de 1,5 para la IAR, lo cual detectará heterocigotos compuestos y pacientes con una sensibilidad y especificidad de 100%. Sin embargo, debe indicarse que el valor óptimo de la IAR puede diferir entre los laboratorios de exploración dependiendo de la configuración del instrumento MS en tándem.

Como actividad al margen, las muestras de galactosemia en este estúdio procedían de pacientes descubiertos clínicamente y diagnosticados con un promedio de 18 (6-36) dias de edad (Tabla 1). Suponiendo un retardo de información de dos dias enteros desde el momento de la toma de muestras, la exploración neonatal podría haber acortado el tiempo de diagnóstico en 10-12 pacientes en un promedio de 13 dias.

Dado que el método de la invención cuantifica el contenido total de HMP, no de Gal-1-P, el mismo puede utilizarse en el diagnóstico y la monitorización de otros trastornos con metabolismo afectado de los hexosa-fosfatos. Y un potencial para interferencia analítica. Además de otros HMPs, los analitos detectables podrían incluir hexosas multifosforiladas. Por ejemplo, los bifosfatos podrían interferir si los mismos producen HMPs por decadência post-fuente en el análisis espectral de masas. Las muestras podrían incluir también otros médios distintos de sangre, como se ha mencionado anteriormente en esta memória, v.g. orina u homogeneizados de tejido. Enfermedades relevantes para estas consideraciones incluyen intolerância hereditaria a la fructosa (OMIM 229600), fructosuria (deficiência en fructoquinasa hepática) (OMIM 229800), deficiência en fructosa-1,6-bisfosfatasa (OMIM 229700), deficiência en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (OMIM 305900), deficiência en UDP-galactosa-4'-epimerasa (EC 5.1.3.2), y diabetes mellitus.

En una realización preferida, la invención proporciona un nuevo método de exploración para galactosemia. El método utiliza una cantidad minúscula de las muestras obtenidas para uso rutinario por los servidos de exploración neonatal. La preparación de las muestras es simple. Se requieren únicamente reactivos comunes. El método cuantifica un analito estable, Gal-1-P. El análisis y la interpretation son totalmente automáticos, y la exactitud del diagnóstico no está superada aparentemente. Dado que un número creciente de instalaciones de diagnóstico tienen MS en tándem para exploration de trastornos, por ejemplo en el metabolismo de los aminoácidos, ácidos orgânicos, y ácidos grasos (10, 6), la utilization de la MS en tándem para exploration adicional de la galactosemia resultaria económica.

Adicionalmente, los presentes inventores han realizado con êxito dos extracciones diferentes de la misma mancha de sangre seca. Las extracciones se realizaron para analizar cuantitativamente dos componentes diferentes. La primera extraction fue para aminoácidos y acilcarnitinas, que se analizaron cuantitativamente y pueden utilizarse para explorar trastornos afines, tales como fenilcetonuria. El segundo procedimiento de extraction fue para HMPs, como se describe en esta memória. Se ha demostrado que la segunda extraction hidrófila proporciona el mismo resultado que si la extraction se Nevara a cabo sobre una mancha de sangre fresca.

Este método es rápido, del orden de 1,5 min por muestra (que puede acortarse aumentando el flujo del sistema de suministro de disolvente), económico y fácil de aplicar en un laboratorio normal de rutina con un espectrómetro de masas en tándem.

Si bien la presente invention se ha descrito con referencia a lo que se considera actualmente como los ejemplos preferidos, debe entenderse que la invention no se limita a los ejemplos descritos. Por el contrario, la invention está pensada para abarcar diversas modificaciones y disposiciones equivalentes incluídas dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en esta memória por referencia en su totalidad en la misma extension que si se indicara específica e individualmente que cada publication, patente o solicitud de patente individual se incorporase por referencia en su totalidad.

CITAS COMPLETAS DE LAS REFERENCIAS MENCIONADAS EN LA MEMÓRIA DESCRIPTIVA 1. Beutler E and Baluda MC. A simple spot screening test for galactosemia. J Lab Clin Med 1966;84:331-335 2. Fujimoto A, Okano Y, Miyagi T, Isshiki G, Oura T. Clin Chem 2000;46:806-10 3. Fujimura Y, Ishii S, Kawamura M, Naruse H. Microdetermination og galactose and galactose-1-phosphate in dried blood spots. Anal Biochem 1981;117:187-96 4. Hill G, O'Reilly D, Robertson E. A simple screening test for galactosemia based on accumulation of galactose and galactose-1-phosphate. In: Naruse H, Irie M (eds.). Proceedings International Symposium on Neonatal Screening for Inborn En ors of Metabolism. Amsterdam: Excerpta Medica 1983;252-3. 5. Komrower GM. Galactosemia - Thirty years on. The experience of a generation. J Inher Metab Dis 1982;5 Suppl 2:96-104 6. Naylor EW, Chace DH. Automated tandem mass spectrometry for mass newborn screening for disorders in fatty acid, organic acid, and amino acid metabolism. J Child Neurol 1999;14 Suppl 1:S4-8 7. Norgaard-Pedersen B, Simonsen H. Biological specimen banks in neonatal screening. Acta Paediatr Suppl 1999;88(432):106-9. 8. Paigen K, Pacholec F, Levy HL. A new method of screening for inherited disorders of galactose metabolism. J Lab Clin Med 1982;99:895-907 9. Pollitt RJ, Green A, McCabe I J, Booth A, Cooper NJ, Leonard JV et al. Neonatal screening for inborn errors of metabolism: cost, yield and outcome. Health technology assessment 1997;1:49-51 10. Rashed MS, Bucknall MP, Little D, Awad A, Jacob M, Alamoudi M, et al. Screening blood spots for inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry with a microplate batch process and a computer algorithm for automated flagging of abnormal profiles. Clin Chem 1997;43:71129-1141 11. Schweitzer S. Newborn mass screening for galactosemia. Eur J Pediatr 1995; 154, suppl 2:S37-S39 12. Seal S, Berry GT. In: Scriver CR, Beandet AL, Sly WS, Valle D. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 7. ed. 1995;1:967-1000 13. Waggoner DD, Buist NR, Donnel GN. Long-term prognosis in galactosemia: results of a survey of 350 cases. J Inherit Metab Dis 1990;13:802-818 14. Walter JH, Collins JE and Leonard JV. Recommendations for the management of galactosemia. Arch Dis Child 1999;80:93-96 15. Wolucka BA, Rush JS, Waechter CJ, Shibaev VN and Hoffmann E. An electrospray-ionization tandem mass spectrometry method for determination of the anomeric configuration of glycosyl 1-phosphate derivatives. Analytical Biochemistry 1998;255:244-251

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar y analizar cuantitativamente hexosa-monofosfatos en una muestra biológica, que com prende: (a) obtener un extracto de la muestra biológica en una forma adecuada para ionización, en donde el extracto de hexosa-monofosfato de la muestra biológica adecuada para ionización se obtiene por extracción de la muestra con un disolvente seleccionado del grupo constituído por acetonitrilo en agua, acetato de etilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua, e isopropanol en agua; b) ionizar el extracto para formar una corriente de iones en fase gaseosa; (c) seleccionar iones moleculares precursores que tienen una ratio de masa a carga de hexosa-monofosfato; (d) fragmentar los iones moleculares precursores para obtener iones producto de hexosa-monofosfato; (e) seleccionar los iones producto de interés de otros iones producto por su ratio de masa a carga; (f) detectar los iones producto de interés y obtener sus intensidades iónicas; y (g) utilizar las intensidades iónicas de los iones producto para: (i) determinar por análisis espectral la abundancia cuantitativa de hexosa-monofosfatos en la muestra biológica; y/o (ii) determinar la concentración de hexosa-monofosfatos o una especie particular de los mismos por comparación de las intensidades iónicas de una muestra o muestras de control que tiene(n) una concentración conocida de hexosa-monofosfatos y/o la especie particular de los mismos; y/o (iii) determinar las ratios de abundancia iónica (IAR) que indican la cantidad relativa de una especie de hexosa-monofosfato presente en la muestra biológica.
2. 2. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra biológica se seca antes de la extracción.
3. 3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica se transfiere a un medio adecuado y se seca luego.
4. 4. El método de la reivindicación 3 en donde el medio adecuado es papel de filtro.
5. 5. El método de la reivindicación 1 en donde el disolvente es 30:70 a 70:30 (v/v) de acetonitrilo en agua.
6. 6. El método de la reivindicación 5 en donde el disolvente es 1:1 (v/v) de acetonitrilo en agua.
7. 7. El método de la reivindicación 1 en donde la muestra biológica se selecciona del grupo constituído por: sangre entera, componentes de sangre fraccionados, tejido, orina, heces, bilis, saliva, sudor u otras secreciones glandulares.
8. 8. El método de la reivindicación 7 en donde la muestra biológica es una muestra de sangre entera.
9. 9. El método de la reivindicación 8 en donde la muestra de sangre se transfiere a un medio adecuado, se seca y se extrae luego utilizando un disolvente adecuado para extracción de hexosa-monofosfatos.
10. 10. El método de la reivindicación 9 en donde el medio adecuado es papel de filtro.
11. 11. El método de la reivindicación 1, en donde los pasos (b) a (e) se realizan en un espectrómetro de masas en tándem.
12. 12. El método de la reivindicación 11, en donde las intensidades iónicas se registran en modo de iones negativos.
13. 13. El método de la reivindicación 1, en donde el paso (b) comprende formar la corriente de iones por ionización de electrospray o electrospray asistido neumáticamente.
14. 14. El método de la reivindicación 1, en donde la ratio de masa a carga de los iones moleculares precursores de HMP es 259,02 Da/e.
15. 15. El método de la reivindicación 1, en donde los iones producto de interés son: [PO3]'; [H2PO4]'; y [(C2H3O)-HP04]'.
16. 16. El método de la reivindicación 15, en donde las ratios de masa a carga de los iones producto de interés son: 78,96 Da/e para [P03]'; 96,97 Da/e para [H2P04]'; y 138,98 para [(C2H30)HP04]'.
17. 17. El método de la reivindicación 16, en donde el ion producto [PO3]" es el más indicativo de la aldohexosa-1-monofosfato y en donde el ion producto [H2PO4]" es el más indicativo de aldohexosa -6-monofosatos 0 cetohexosa-1- 0 6-monofosfatos.
18. 18. EI método de la reivindicación 17, en donde Gal-1-P es una aldohexosa-1-monofosfato y la intensidad iónica del fragmento [PO3]' se utiliza para determinar la concentración de aldohexosa-1-monofosfatos indicativa de la de Gal-1-P en la muestra biológica, por comparación de las intensidades iónicas dei fragmento [PO3]' en la muestra biológica con la de una muestra de control que tiene una concentración conocida de Gal-1-P.
19. 19. EI método de la reivindicación 16, en el que la ratio de abundancia iónica de los iones producto 78,96 Dale a 96,97 Da le se utiliza como indicador de la concentración de Gal-1-P en la muestra biológica.
20. 20. Un método de exploración y/o diagnóstico de galactosemia por comparación de la concentración de hexosa-monofosfato y/o el nivel de IAR en una muestra biológica de un paciente de test como se determina por la reivindicación 18 ó 19 con la de un nivel de punto de corte indicativo de galactosemia.
21. 21. El método de la reivindicación 20, en donde el nivel de punto de corte de hexosa-monofosfato está comprendido entre 0,95 y 2,6 mmol/l de la concentración de HMP y/o 1,41-1,68 IAR, en donde los niveles superiores al punto de corte son indicativos de galactosemia.
22. 22. El método de la reivindicación 21, en donde el nivel de punto de corte es 1,2 mmol/l de concentración de hexosa-monofosfato y/o 1,5 IAR.
23. 23. El método de la reivindicación 20, en donde la muestra biológica es una muestra de sangre entera extraída con un disolvente seleccionado del grupo constituído por acetonitrilo en agua, acetato de etilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua, e isopropanol en agua.
24. 24. El método de la reivindicación 23, en donde el disolvente es 30:70 a 70:30 v/v de acetonitrilo en agua.
25. 25. Un método para diagnóstico de un trastorno de hexosa-monofosfato en un indivíduo por determinación del nivel de hexosa-monofosfato en el paciente utilizando el método de la reivindicación y comparando el mismo con el nivel de punto de corte de hexosa-monofosfato indicativo del trastorno.
26. 26. El método de la reivindicación 25, en donde el trastorno de hexosa-monofosfato se selecciona del grupo constituído por: galactosemia (OMIM 230400), intolerância hereditaria a la fructosa (OMIM 229600), fructosuria (deficiência en fructoquinasa hepática) (OMIM 229800), deficiência en fructosa-1,6-bisfosfatasa (OMIM 229700), deficiência en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (OMIM 305900), deficiência en UDP-galactosa-4'-epimerasa (EC 5.1.3.2), y diabetes mellitus.
27. 27. El método de la reivindicación 4, en donde antes de extraer la muestra biológica con un disolvente seleccionado del grupo constituído por acetonitrilo en agua, acetato de etilo en agua, tetrahidrofurano en agua, metanol en agua, e isopropanol en agua, se extraen aminoácidos y acilcarnitinas de la muestra biológica seca utilizando un disolvente adecuado que forma un extracto inicial que se retira para análisis cuantitativo, y la muestra biológica original se vuelve a secar posteriormente.
28. 28. El método de la reivindicación 27, en el que la muestra biológica es sangre entera.
29. 29. El método de la reivindicación 27, en donde el disolvente adecuado es metanol.
30. 30. El método de la reivindicación 27 para exploración tanto de trastornos metabólicos de aminoácidos, ácidos orgânicos, y ácidos grasos como de trastornos metabólicos de hexosa-monofosfatos.
31. 31. El método de la reivindicación 30 para exploración de fenilcetonuria y de galactosemia.
32. 32. El método de la reivindicación 1, en el que el ion producto de interés es [PO3]'.
33. 33. El método de la reivindicación 32, en donde se utiliza la intensidad iónica de [P03]- para determinar la concentración o nivel de aldohexosa-1-monofosfatos en la muestra biológica.
34. 34. El método de la reivindicación 33 para diagnosticar un trastorno relacionado con la aldohexosa-1-monofosfato en donde la concentración o nivel de la aldohexosa-1-monofosfato se compara con una concentración o nivel de punto de corte de la aldohexosa-1-monofosfato que es indicativo del trastorno.
35. 35. El método de la reivindicación 34, en donde el trastorno es galactosemia.
36. 36. El método de la reivindicación 1, en donde el ion producto de interés es [H2PO4]'.
37. 37. El método de la reivindicación 36, en donde la intensidad iónica de [H2PO4]' se utiliza para determinar la concentración o nivel de aldohexosa-6-monofosfatos, y/o cetosa hexosa-1-monofosfatos y/o cetosa hexosa-6-monofosfatos en la muestra biológica.