JP2004504451A - ヘパリンから誘導した多糖の混合物、その製造方法および、それらを含む医薬品組成 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヘパリンから誘導した多糖の混合物、それらの製造方法および、それらを含む医薬品の組成に関する。

Description

【０００１】
本発明は、ヘパリンから誘導された多糖の混合物、それらの製造方法および、それらを含む製薬組成物に関する。
【０００２】
ヘパリンは、動物に由来する硫酸化されたムコ多糖類の混合物であり、特にその抗凝固的および抗血栓的な性質のために利用される。
【０００３】
ヘパリンは、しかし、その使用の条件を制限する不都合を示す。特に、その高い抗凝固活性（抗ＩＩａ活性）は出血を引き起こしうる。
【０００４】
ヘパリンエステルのアルカリ解重合によって得られる低分子量のヘパリンが提案された（ＥＰ４０１４４）；しかし、これらの産物は、まだ、高い抗ＩＩａ活性を有している。
【０００５】
本発明は、活性化第Ｘ因子（第Ｘａ因子）および活性化第ＩＩ因子（第ＩＩａ因子）に対し、ヘパリンよりも、より選択的な活性を有する、ヘパリンから誘導された多糖の混合物に関係する。
【０００６】
本発明は、さらに詳細には、ヘパリンを構成する多糖の一般的な構造を持ち、１５００ダルトンないし３０００ダルトンの平均分子量と、１００ないし１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性と、０から１０ＩＵ／ｍｇの抗ＩＩａ活性と、１０より大きい抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比を持ち、
混合物を構成する多糖が、２から２６個の糖単位を含み、それらの末端の１つに２−Ｏ−硫酸４，５不飽和グルクロン酸単位（ｍｏｔｉｆ ａｃｉｄｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｑｕｅ−４，５ ｉｎｓａｔｕｒｅ ２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅ）を持つ、という特徴を示し、
アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩の形をとっている、硫酸化された多糖の混合物に関する。
【０００７】
アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩が好ましい。
【０００８】
平均分子量は、２つのカラム（たとえば、ＴＳＫ　Ｇ３０００　ＸＬおよびＴＳＫ　Ｇ２０００　ＸＬの名称で市販されているもの）を連続的に使用した高圧液体クロマトグラフィーによって決定される。検出は屈折計によって実施される。使用される溶離剤は硝酸リチウムであり、流量は０．６ｍｌ／ｍｉｎである。この系は、アガロース−ポリアクリルアミド・ゲル（ＩＢＦ）上でのクロマトグラフィーによるエノキサパリン（ＡＶＥＮＴＩＳ）の分画により調製された標準によって較正される。この調製はＢａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．，　１２，　２７−３６　（１９７７−７８）もしくはＤ．Ａ．　Ｌａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．，１２，　２５７−２７１（１９７７−７８）によって記述された技法に従って実施される。結果はＧＰＣ６ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて計算される。
【０００９】
抗Ｘａ活性は、標準として低分子量ヘパリンの第一国際標準（ｐｒｅｍｉｅｒ ｅｔａｌｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、Ｔｅｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．，　１０，　３９９−４１０　（１９７７）によって記述された発色基質のアミド分解法によって測定される。
【００１０】
抗ＩＩａ活性は、標準として低分子量ヘパリンの第一国際標準を用いて、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｌ．Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．，　１５，　５３１−５４１　（１９７９）によって記述された技法によって測定される。
【００１１】
好ましくは、上述されたような混合物は、１２５ＩＵ／ｍｇと１５０ＩＵ／ｍｇの間に含まれる抗Ｘａ活性を示す。
【００１２】
さらに詳細には、上に記述されたような混合物は、１４０ＩＵ／ｍｇと１５０ＩＵ／ｍｇの間に含まれる抗Ｘａ活性を示し、２０００ダルトンと３０００ダルトンの間に含まれる平均分子量を有する。
【００１３】
好ましくは、本発明に従う混合物は、０ないし５ＩＵ／ｍｇの抗ＩＩａ活性を有する。
【００１４】
さらになお詳細には、前記混合物は２５以上の抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比を示す。
【００１５】
本発明に従うオリゴ糖の混合物は、２０より大きいｐｋａの強有機塩基もしくはナトリウムイミダゾレート（ｉｍｉｄａｚｏｌａｔｅ ｄｅ ｓｏｄｉｕｍ）による、有機溶媒中のヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩の解重合、その解重合されたヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩のナトリウム塩への変換、そのエステルの鹸化および、場合によっては精製によって製造されうる。
【００１６】
ヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩は、好ましくは、ベンゼトニウム、セチルピリジニウムもしくはセチルトリメチルアンモニウムの塩である。
【００１７】
解重合は一般的に、塩素化溶媒（たとえば、ジクロロメタン）、テトラヒドロフラン、アニソールのような不活性有機溶媒の中で−２０℃ないし４０℃の温度で実施される。
【００１８】
２０より大きいｐｋａの強有機塩基としては、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デセ−５−エン（１，５，７−ｔｒｉａｚａｂｉｃｙｃｌｏ ［４．４．０］ ｄｅｃ−５−ｅｎｅ）、２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルペルヒドロ−１，３，２−ジアザホスフォリン、グアニジンおよびホスファゼンの族の塩基を使用できる。
【００１９】
グアニジン族の塩基は、好ましくは、式
【００２０】
【化３】

【００２１】
［式中、Ｒ_１は水素もしくはアルキル、同一もしくは異なるＲ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５は、それぞれアルキル基を表わす］を持つものである。
【００２２】
さらに詳しくは、Ｒ_１は水素であり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５はメチル基である。
【００２３】
ホスファゼン族に関連した強有機塩基は、たとえば、Ｒ．　Ｓｃｈｗｅｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｒｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　Ｅｎｇｌ．　２６，　１１６７−１１６９　（１９８７）、Ｒ．　Ｓｃｈｗｅｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｒｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　１０５，　１４２０　（１９９３）に従って特定される。
【００２４】
ホスファゼン族の塩基の中では、好ましくは、式
【００２５】
【化４】

【００２６】
［式中、Ｒ_１からＲ_７の基は同一もしくは異なっており、アルキル基を表わす］を有するものを使用する。
【００２７】
先の式中、アルキル基は直鎖状もしくは分枝状の１ないし６個の炭素原子を含む。
【００２８】
有利には、２０より大きいｐｋａの強有機塩基もしくはナトリウムイミダゾレート／ヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩のモル比は０．２と５の間、好ましくは、１と４の間に含まれる。
【００２９】
さらに詳細には、ヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩のエステル化率は５０％と１００％の間、好ましくは、７０％と９０％の間に含まれる。このエステル化率は、ヘパリンのウロン酸のエステル化のモル百分率に一致する。
【００３０】
解重合されたヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩のナトリウム塩への変換は一般的に、酢酸ナトリウムのアルコール溶液、好ましくは、メタノール中の１０％酢酸ナトリウム溶液（重量／体積）を用いて、１５℃と２５℃の間に含まれる温度で反応溶媒を処置することによって行われる。加えられるアセテートの重量当量は、好ましくは、解重合反応において使用されるヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩の質量より３倍大きい。
【００３１】
鹸化は一般的に、苛性ソーダ、苛性カリ、水酸化リチウムのようなアルカリ金属の水酸化物によって、水性溶媒中で０℃と２０℃の間、好ましくは、０℃と１０℃の間に含まれる温度で行われる。一般的には、１ないし５モル当量のアルカリ金属の水酸化物が使用されるであろう。好ましくは、鹸化は２ないし３モル当量のアルカリ金属水酸化物の存在下で実施されるであろう。
【００３２】
最終産物は、場合によっては、解重合されたヘパリンの精製について知られているいずれかの方法、とりわけ、ＥＰ　００３７３１９特許に記述されている方法に従って精製されうる。好ましくは、過酸化水素によって、水性溶媒中、１０ないし５０℃の温度で精製する。好ましくは、この操作は２０℃と４０℃の間で実施されるであろう。
【００３３】
ヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩は、以下の反応スキームに従って製造されうる：
ａ）ベンゼトニウムヘパリナート（ｈｅｐａｒｉｎａｔｅ ｄｅ ｂｅｎｚｅｔｈｏｎｉｕｍ）を得るための、塩化ベンゼトニウムによる、ナトリウム塩の形をとっているヘパリンの変換、
ｂ）塩化ベンジルによる、先に得られたベンゼトニウム塩のエステル化、およびヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩を得るための、酢酸ナトリウムのアルコール溶液による処置、
ｃ）ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩の、第四級アンモニウム塩、好ましくは、ベンゼトニウム、セチルピリジニウムもしくはセチルトリメチルアンモニウムの塩への塩交換反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。
【００３４】
段階ａ）の反応は、１５から２５℃付近の温度で、過剰の塩化ベンゼトニウムの作用により、ナトリウム塩の形をとったヘパリンに対して、水性溶媒中で実施される。有利には、塩化ベンゼトニウム／ナトリウム塩の形のヘパリンのモル比は２と３の間に含まれ、より詳細には２．５である。
【００３５】
出発原料に使用されるナトリウム塩の形をとったヘパリンは、好ましくは、ブタのヘパリンである。後者は、そのデルマタン硫酸の比率を減らすために、ＦＲ２６６３６３９特許に記述されている方法に従って、あらかじめ精製されてもよい。
【００３６】
段階ｂ）のエステル化は、好ましくは、塩素化有機溶媒（たとえば、クロロホルム、塩化メチレン）中、２５℃と４５℃の間、好ましくは、３０℃と４０℃の間に含まれる温度で行われる。ナトリウム塩の形をとったエステルは次に、メタノールのようなアルコール中に重量／体積で１０％とした酢酸ナトリウムによる沈殿によって回収される。一般的には、反応溶媒の体積あたり１から１．２体積のアルコールを使用する。塩化ベンジルの量および反応時間は、５０％と１００％の間、好ましくは、７０％と９０％の間に含まれるエステル化率を得るために調節される。好ましくは、ヘパリンのベンゼトニウム塩の重量１部分に対して、塩化ベンジルの重量で０．５から１．５部分を使用する。同様に、好ましくは、反応時間は１０時間と３５時間の間に含まれるであろう。
【００３７】
段階ｃ）の塩交換反応は、第四級アンモニウムの塩化物によって、好ましくは、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムもしくは塩化セチルトリメチルアンモニウムによって、水性溶媒中、１０℃と２５℃の間に含まれる温度で実施される。有利には、第四級アンモニウムの塩化物／ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩のモル比は２と３の間に含まれる。
【００３８】
ナトリウム塩の形をとった本発明に従う混合物は、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の別の塩に変換されうる。場合によっては、ＵＳ４１６８３７７特許に記述されている方法を利用して、ある塩から別のものに変換する。
【００３９】
本発明に従う混合物は有毒でなく、よって、医薬として使用されうる。
【００４０】
本発明の混合物は、抗血栓薬として使用されうる。特に、それらは静脈血栓症、動脈血栓事故の予防のため、とりわけ、心筋梗塞の場合において有用である。それらは同様に、平滑筋細胞の増殖、血管形成の予防および処置において、ならびにアテローム性動脈硬化症および動脈硬化症のための神経保護剤としても有用である。
【００４１】
本発明は同様に、場合によっては１つもしくは数種の不活性な賦形剤との組み合わせにおいて、有効成分として本発明に従う多糖の混合物を含む製薬組成物にも関する。
【００４２】
前記製薬組成物は、たとえば、皮下もしくは静脈内の経路によって注射可能な溶液である。それらは同様に肺の経路（吸入）によっても有用である。
【００４３】
その薬用量は患者の年齢、体重および健康状態に応じて変化しうる。成人に対しては、それは一般的に、筋肉内もしくは皮下の経路により、１日あたり２０ｍｇと１００ｍｇの間に含まれる。
【００４４】
【実施例】
以下の例は、本発明を具体的に説明する。
例Ａ：ヘパリンのベンジルエステルのベンゼトニウム塩の製造
ベンゼトニウムヘパリナート
１０ｇのナトリウム塩の形をとったヘパリンを１００ｍｌの水に溶かした溶液に、２０℃付近の温度で、２５ｇの塩化ベンゼトニウムを１２５ｍｌの水に溶かした溶液を加える。この産物は濾過され、水で洗浄され、乾燥される。
ヘパリンのベンジルエステル（ナトリウム塩）
２０ｇのベンゼトニウムヘパリナートを８０ｍｌの塩化メチレンに溶かした溶液に、１６ｍｌの塩化ベンジルを加える。溶液は１２時間、３０℃の温度で暖められる。それから、メタノールに溶かした１０８ｍｌの１０％酢酸ナトリウム溶液を加え、濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥させる。このようにして、７．６ｇのナトリウム塩の形をとったヘパリンのベンジルエステル（そのエステル化率は７７％である）が得られる。
ヘパリンのベンジルエステル（ベンゼトニウム塩）
２リットルのエルレンマイヤーフラスコＡ中に３６ｇ（０．０５４９モル）のヘパリンのベンジルエステル（ナトリウム塩）と５４０ｍｌの蒸留水を入れる。約２０℃の温度での均質化後、薄黄色の溶液が得られる。磁気による撹拌のもと、１リットルのエルレンマイヤーフラスコＢ中に６４．４５ｇ（０．１４３８モル）の塩化ベンゼトニウムと４５０ｍｌの水の溶液を調製する。エルレンマイヤーフラスコＢの溶液は撹拌のもと、約３５分かけてエルレンマイヤーフラスコＡの溶液中に流し込まれる。多量の白色沈殿の形成が観察される。エルレンマイヤーフラスコＢは２００ｍｌの蒸留水ですすがれ、その洗浄水はエルレンマイヤーフラスコＡの中に入れられる。その後、撹拌を止め、懸濁液を１２時間沈殿させる。上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される。沈積した沈殿物（スラリー状の外観）に５６０ｍｌの水を加え、２０分間撹拌する。約３０分かけて、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（５６０ｍｌ）。沈積した沈殿物に対し、約５６０ｍｌの蒸留水によって、この洗浄操作を２回繰り返す。最後の洗浄操作においては、沈殿物を懸濁液に残し、焼結ガラスの３番（Ｖｅｒｒｅ Ｆｒｉｔｔｅ ３）で濾過する。このケーキは次に、２００ｍｌの蒸留水４回によって洗浄される。湿った白色固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、８７．５ｇのヘパリンのベンジルエステル、ベンゼトニウム塩が得られる。得られる収率は９４．９％である。
例１
解重合およびナトリウム塩への変換：
５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコＡ中に２８ｍｌのジクロロメタンを入れる。撹拌のもと、例Ａに記述されているようにして得られた４ｇ（０．００２３８モル）のヘパリンのベンジルエステル（エステル化率：７７％、ベンゼトニウム塩）をゆっくりと加える。完全な溶解後、１．３２ｇ（０．００９４８モル）の１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デセ−５−エンを加える。２０℃付近の温度で３時間と３０分間撹拌する。この間に、エルレンマイヤーフラスコＢの中に４℃で１２ｇの酢酸ナトリウムを１２０ｍｌのメタノールに溶かした溶液を調製する。磁気による撹拌のもと、エルレンマイヤーフラスコＡの反応混合液は、酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に流し込まれる。ほぼ半透明の黄色いゼラチン状沈殿が生じる。その後、撹拌を止め、１時間、懸濁液を澄ませる。上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される（６２ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色いスラリー状の外観）に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（４９ｍｌ）。沈積した沈殿物に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの４番（Ｖｅｒｒｅ Ｆｒｉｔｔｅ ４）で濾過される。得られる黄金色のケーキは次に、２５ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、１．２１ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は７７．２％である。
鹸化：
２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に、先に得られた１．２１ｇ（０．００１８モル）の解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）と１１ｍｌの水を入れる。磁気による撹拌のもと、０．１８ｍｌ（０．００１８モル）の３０％苛性ソーダ洗剤を入れる。添加後、混合液は４℃に冷まされ、２時間撹拌される。１．４３ｇのＮａＣｌを加え、１モル／ｌ（１４ｍｌ）のＨＣｌの追加により、溶液を中和する。この混合液は１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移し換えられ、５２ｍｌのメタノールが加えられる。黄色沈殿の形成が観察される。その後、撹拌を止め、１２時間、２０℃付近の温度で懸濁液を沈積させる。次に上清が取り除かれ、それから、廃棄される（４４ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色いスラリー状の外観）に２５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（２１ｍｌ）。沈積した沈殿物に２５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの３番で濾過される。得られる明るい黄色のケーキは次に、１０ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、０．６６ｇの未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は６０％である。
精製：
１０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に、先に得られた０．６６ｇの未精製の解重合されたヘパリンと５．９ｍｌの蒸留水を入れる。この混合液は磁気による撹拌のもと、４０℃にされる。０．１モル／ｌの苛性ソーダの添加により、ｐＨを９と１０の間にし、３３マイクロリットルの３０％過酸化水素水溶液を加える。約２時間の撹拌後、０．６５ｇの塩化ナトリウムを加える。この混合液は次に、０．１モル／ｌのＨＣｌの添加によって中和される。この溶液は次に濾過され、２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移し換えられる。２３．３ｍｌのメタノールを流し込む。白色沈殿の形成が観察される。その後、撹拌を止め、１２時間、２０℃付近の温度で懸濁液を沈積させる。次に上清が取り除かれ、それから、廃棄される（５ｍｌ）。沈積した沈殿物（スラリー状の外観）に５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（５ｍｌ）。沈積した沈殿物に５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの３番で濾過される。得られる白色のケーキは次に、５ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、０．５１ｇの精製された多糖の混合物（ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は７７．２％である。
【００４５】
この混合物の特質は、以下のとおりである：
平均分子量：１６００ダルトン
抗Ｘａ活性：９４ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：＜０．１ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比：＞１００
例２
解重合およびナトリウム塩への変換：
１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコＡ中に７０ｍｌのジクロロメタンを入れる。撹拌のもと、例Ａに記述されているようにして得られた１０ｇ（０．００５９５モル）のヘパリンのベンジルエステル（エステル化率：７７％、ベンゼトニウム塩）をゆっくりと加える。完全な溶解後、１．７ｍｌ（０．００５８７モル）の２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチル−ぺルヒドロ−１，３，２−ジアザホスフォリンを加える。２０℃付近の温度で約３時間と３０分間、反応を続行させる。この間に、エルレンマイヤーフラスコＢ中に４℃で３０ｇの酢酸ナトリウムを３００ｍｌのメタノール中に溶かした溶液を調製する。磁気による撹拌のもと、エルレンマイヤーフラスコＡの反応混合液は、酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に流し込まれる。ほぼ半透明の黄色いゼラチン状沈殿が生じる。その後、撹拌を止め、１時間、懸濁液を澄ませる。上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される（２０４ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色いスラリー状の外観）に１２５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（１６２ｍｌ）。沈積した沈殿物に１２５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中のゼラチン状沈殿物は次に、焼結ガラスの３番で濾過される。得られる黄色のゼラチン状ケーキは次に、２部分の６３ｍｌのメタノールによって洗浄される。ゼラチン状の固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、３．３４ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）を得る。得られる収率は８５．３％である。
鹸化：
先に得られた１．６７ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）を、例１に記述されている鹸化の方法に従って鹸化する。０．９４ｇの明黄色粉末が得られる。未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）の収率は６１％である。
精製：
先に得られた０．９４ｇの未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）を、例１に記述されている精製の方法に従って精製する。０．７１ｇの白色粉末が得られる。収率は７５．５％である。
【００４６】
得られる精製された多糖の混合物（ナトリウム塩）は、以下の特質を示す：
平均分子量：２５００ダルトン
抗Ｘａ活性：１４６．６ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：２．１５ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比：６８
例３
解重合およびナトリウム塩への変換：
５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコＡ中に２８ｍｌのジクロロメタンを入れる。撹拌のもと、例Ａに従って得られた４ｇ（０．００２３８モル）のヘパリンのベンジルエステル（エステル化率：７７％、ベンゼトニウム塩）をゆっくりと加える。完全な溶解と２℃への冷却後、０．３３３ｇ（０．００２３９モル）の１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デセ−５−エンを加える。２０℃付近の温度で約３時間と３０分間、反応を続行させる。この間に、エルレンマイヤーフラスコＢの中に４℃で１２ｇの酢酸ナトリウムを１２０ｍｌのメタノールに溶かした溶液を調製する。磁気による撹拌のもと、エルレンマイヤーフラスコＡの反応混合液は、酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に流し込まれる。黄色い沈殿が生じる。その後、撹拌を止め、１時間、懸濁液を澄ませる。上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される（９０ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色いスラリー状の外観）に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（６１ｍｌ）。沈積した沈殿物に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの４番で濾過される。得られるケーキは次に、２５ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、１．１９ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）が得られる。この固体は濃い黄色である。得られる収率は７５．９％である。
鹸化：
先に得られた１．１９ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）を、例１に記述されている鹸化の方法に従って鹸化する。０．７８ｇの明黄色粉末が得られる。未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）の収率は７１．５％である。
精製：
先に得られた０．７８ｇの未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）を、例１に記述されている精製の方法に従って精製する。０．５８ｇの白色粉末が得られる。収率は７２．５％である。
【００４７】
得られる精製された多糖の混合物（ナトリウム塩）は、以下の特質を示す：
平均分子量：２７００ダルトン
抗Ｘａ活性：１００．１ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：３．３ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比：２７，３
例４
解重合およびナトリウム塩への変換：
５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコＡ中に２８ｍｌのジクロロメタンを入れる。撹拌のもと、例Ａに記述されているようにして得られた４ｇ（０．００２３８モル）のヘパリンのベンジルエステル（エステル化率：７７％、ベンゼトニウム塩）をゆっくりと加える。完全な溶解後、２℃で０．６ｍｌ（０．００２２２モル）の２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−トリス（ジメチルアミノ）ホスフォランを加える。０℃付近の温度で約３時間と３０分間、反応を続行させる。この間に、エルレンマイヤーフラスコＢの中に４℃で１２ｇの酢酸ナトリウムを１２０ｍｌのメタノールに溶かした溶液を調製する。磁気による撹拌のもと、エルレンマイヤーフラスコＡの反応混合液は、酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に流し込まれる。ほぼ半透明の黄色いゼラチン状沈殿が生じる。その後、撹拌を止め、１時間、懸濁液を澄ませる。上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される（１０８ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色っぽいスラリー状の外観）に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（６０ｍｌ）。沈積した沈殿物に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中の黄色っぽい白色の沈殿物は次に、焼結ガラスの４番で濾過される。得られるケーキは次に、２５ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。この固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、１．２２ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は７７．８％である。
鹸化：
先に得られた１．２２ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）を、例１に記述されている鹸化のプロトコールに従って鹸化する。０．６９ｇの非常に明るい黄色の粉末が得られる。未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）の収率は６１．６％である。
精製：
先に得られた０．６９ｇの未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）を、例１に記述されている精製のプロトコールに従って精製する。０．６７ｇの白色粉末が得られる。収率は９７．１％である。
【００４８】
得られる精製された多糖の混合物（ナトリウム塩）は、以下の特質を示す：
平均分子量：２９００ダルトン
抗Ｘａ活性：１４５．２ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：４．５ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比：３２．６
例５
解重合およびナトリウム塩への変換：
５０ｍｌの丸底フラスコＡ中に２８ｍｌのジクロロメタンを入れる。撹拌のもと、４ｇ（０．００２３８モル）のベンジルヘパリナート（エステル化率：７７％、ベンゼトニウム塩）をゆっくりと加える。完全な溶解後、４０℃で０．９５ｇ（０．００９４９モル）のナトリウムイミダゾレートを加える。ジクロロメタンの還流温度で、約４時間、反応を続行させる。この間に、エルレンマイヤーフラスコＢの中に４℃で１２ｇの酢酸ナトリウムを１２０ｍｌのメタノールに溶かした溶液を調製する。磁気による撹拌のもと、エルレンマイヤーフラスコＡの反応混合液は、酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に流し込まれる。ほぼ半透明の黄色いゼラチン状沈殿が生じる。その後、撹拌を止め、１時間、懸濁液を澄ませる。オレンジ色の上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される（８８ｍｌ）。沈積した沈殿物（オレンジ色のスラリー状の外観）に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（５１ｍｌ）。沈積した沈殿物に５０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中のオレンジ色の沈殿物は次に、焼結ガラスの４番で濾過される。得られるケーキは次に、２５ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。この固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、１．３４ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は７６．６％である。
鹸化：
先に得られた１．２ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）を、例１に記述されている鹸化のプロトコールに従って鹸化する。０．６３ｇのベージュ色の粉末が得られる。未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）の収率は５２．５％である。
精製：
先に得られた０．６３ｇの未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）を、例１に記述されている精製の方法に従って精製する。０．４２ｇの白っぽいベージュ色の粉末が得られる。収率は６６．７％である。
【００４９】
得られる精製された多糖の混合物（ナトリウム塩）は、以下の特質を示す：
平均分子量：２２５０ダルトン
抗Ｘａ活性：１３４．５ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．５ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比：９０．５
例６
解重合およびナトリウム塩への変換：
５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコＡ中に２８ｍｌのジクロロメタンを入れる。撹拌のもと、例Ａに記述されているようにして得られた４ｇ（０．００２３８モル）のヘパリンのベンジルエステル（エステル化率：７７％、ベンゼトニウム塩）をゆっくりと加える。完全な溶解後、１．３３ｇ（０．００９５６モル）の１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デセ−５−エンを加える。２０℃付近の温度で３時間と３０分間撹拌する。この間に、エルレンマイヤーフラスコＢの中に４℃で１２ｇの酢酸ナトリウムを１２０ｍｌのメタノールに溶かした溶液を調製する。磁気による撹拌のもと、エルレンマイヤーフラスコＡの反応混合液は、酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に流し込まれる。ほぼ半透明の黄色いゼラチン状沈殿が生じる。その後、撹拌を止め、１時間、懸濁液を澄ませる。上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される（５６ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色いスラリー状の外観）に６０ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約３０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（７０ｍｌ）。沈積した沈殿物に５０ｍｌのメタノールを加え、１５分間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの４番で濾過される。得られる黄金色のケーキは次に、５０ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、０．９２ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は６４％である。
鹸化：
２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に、先に得られた０．９２ｇ（０．００１４モル）の解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）と１７．５ｍｌの水を入れる。磁気による撹拌のもと、０．３８ｍｌ（０．００３７９モル）の３０％苛性ソーダを入れる。添加後、混合液は２０℃付近の温度に保たれ、５時間撹拌される。１．８ｇのＮａＣｌを加え、濃ＨＣｌの追加（溶液の最終体積は約１８ｍｌ）により、溶液を中和する。この混合液は１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移し換えられ、４６ｍｌのメタノールが加えられる。黄色沈殿の形成が観察される。その後、撹拌を止め、１２時間、２０℃付近の温度で懸濁液を沈積させる。次に上清が取り除かれ、それから、廃棄される（５２ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色いスラリー状の外観）に２５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。約１時間、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（２７ｍｌ）。沈積した沈殿物に２５ｍｌのメタノールを加え、約１時間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの４番で濾過される。得られるケーキは次に、１０ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。３時間の乾燥後、０．４２ｇの未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は４５．６％である。
精製：
１０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に、先に得られた０．４２ｇの未精製の解重合されたヘパリンと３．８ｍｌの蒸留水を入れる。この混合液は磁気による撹拌のもと、３８℃にされる。０．１モル／ｌの苛性ソーダの添加により、ｐＨを９と１０の間にし、２５マイクロリットルの３０％過酸化水素水溶液を加える。約２時間３０分の撹拌後、０．５ｇの塩化ナトリウムを加える。この混合液は次に、０．１モル／ｌのＨＣｌの追加によって中和される。この溶液は次に濾過され、２５ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移し換えられる。１１．３ｍｌのメタノールを流し込む。白色沈殿の形成が観察される。その後、撹拌を止め、１２時間、２０℃付近の温度で懸濁液を沈積させる。次に上清が取り除かれ、それから、廃棄される（９．８ｍｌ）。沈積した沈殿物（スラリー状の外観）に５ｍｌのメタノールを加え、１５分間撹拌する。約３時間、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（６．２ｍｌ）。沈積した沈殿物に５ｍｌのメタノールを加え、２０分間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの３番で濾過される。得られる白色のケーキは次に、５ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。約２時間２０分の乾燥後、０．３９ｇの純粋な解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は９２．８％である。
【００５０】
このようにして得られる解重合されたヘパリンの特質は、以下のとおりである：
平均分子量：１９５０ダルトン
抗Ｘａ活性：１１５．６ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：＜２ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比：＞５７
例７
解重合およびナトリウム塩への変換：
４００ｍｌの反応器Ａ中に１４０ｍｌのジクロロメタンを入れる。撹拌のもと、例Ａに記述されているようにして得られた２０ｇ（０．０１１９モル）のヘパリンのベンジルエステル（エステル化率：７７％、ベンゼトニウム塩）をゆっくりと加える。完全な溶解後、Ｋａｒｌ　Ｆｉｓｈｅｒ法によって、反応溶媒の水分含有度を測定する。得られる値は０．１％の水である。それから、３．５ｍｌ（０．０１２１モル）の２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチル−ペルヒドロ−１，３，２−ジアザホスフォリンを加える。２５℃付近の温度で約２４時間、反応を続行させる。この間に、エルレンマイヤーフラスコＢ中に４℃で３０ｇの酢酸ナトリウムを３００ｍｌのメタノール中に溶かした溶液を調製する。磁気による撹拌のもと、反応器Ａの反応混合液の半分が、酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に流し込まれる。ほぼ半透明の黄色いゼラチン状沈殿が生じる。撹拌は１時間維持され、４℃で約１２時間、懸濁液を澄ませる。上清の透明な部分が取り除かれ、廃棄される（２２０ｍｌ）。沈積した沈殿物（黄色いスラリー状の外観）に２２０ｍｌのメタノールを加え、５０分間撹拌する。約４０分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（２０４ｍｌ）。沈積した沈殿物に２０４ｍｌのメタノールを加え、４０分間撹拌する。懸濁液中のゼラチン状沈殿物は次に、焼結ガラスの３番で濾過される。得られる黄色のゼラチン状ケーキは次に、２部分の１００ｍｌのメタノールによって洗浄される。ゼラチン状の固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。約１２時間の乾燥後、２．６ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は７０．６％（処置された反応溶媒の半分に基づき計算）である。
鹸化：
先に得られた２．６ｇの解重合されたヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）を、例１に記述されている鹸化の方法に従って鹸化する。１．４８ｇの明黄色粉末が得られる。未精製の解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）の収率は６２．９％である。
精製：
５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中に、先に得られた１．４８ｇの未精製の解重合されたヘパリンと１５ｍｌの蒸留水を入れる。この混合液は磁気による撹拌のもと、４０℃にされる。１モル／ｌの苛性ソーダの添加により、ｐＨを９と１０の間にする。この溶液は１μｍの孔径の濾過膜上で濾過される。次に、７６マイクロリットルの３０％過酸化水素水溶液を加える。約２時間の撹拌後、１．５ｇの塩化ナトリウムを加える。この混合液は次に、１モル／ｌのＨＣｌの追加によって中和される。この溶液は１μｍの孔径の濾過膜上で濾過される。３８ｍｌのメタノールを流し込む。白色沈殿の形成が観察される。その後、撹拌を止め、１時間、２０℃付近の温度で懸濁液を沈積させる。次に上清が取り除かれ、それから、廃棄される（３７ｍｌ）。沈殿物に３７ｍｌのメタノールを加え、４５分間撹拌する。約４５分、沈殿物を再沈積させる。上清が取り除かれ、廃棄される（３４ｍｌ）。沈積した沈殿物に３４ｍｌのメタノールを加え、１５分間撹拌する。懸濁液中の沈殿物は次に、焼結ガラスの３番で濾過される。得られる白色のケーキは次に、２５ｍｌのメタノール２回によって洗浄される。湿った固体は水分を絞り取られ、それから、減圧下（２．７ｋＰａ）、６０℃付近の温度で乾燥される。１２時間の乾燥後、１．２９ｇの純粋な解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）が得られる。得られる収率は８７．２％である。
【００５１】
得られる精製された解重合されたヘパリン（ナトリウム塩）は、以下の特質を示す：
平均分子量：２２５０ダルトン
抗Ｘａ活性：１４９．６ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：＜０．８５ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比：１７６

Claims (20)

1. ヘパリンを構成する多糖の一般的な構造を有し、かつ、
   １５００から３０００ダルトンの平均分子量と、１００ないし１５０ＩＵ／ｍｇの抗Ｘａ活性と、０から１０ＩＵ／ｍｇの抗ＩＩａ活性と、１０より大きい抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比を持ち、
   混合物を構成する多糖が、２ないし２６個の糖単位を含み、そしてその末端の１つに２−Ｏ−硫酸４，５−不飽和グルクロン酸単位を持つ、という特徴を示し、
   アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩の形をとっている、硫酸化された多糖の混合物。
2. 抗Ｘａ活性が１２５ＩＵ／ｍｇと１５０ＩＵ／ｍｇの間に含まれることを特徴とする、請求項１記載の混合物。
3. 抗Ｘａ活性が１４０ＩＵ／ｍｇと１５０ＩＵ／ｍｇの間に含まれ、平均分子量が２０００ダルトンと３０００ダルトンの間に含まれることを特徴とする、請求項１もしくは２記載の混合物。
4. ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムの塩の形をとっている、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の混合物。
5. ０から５ＩＵ／ｍｇの抗ＩＩａ活性を持つ、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の混合物。
6. ２５より大きい抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性比を示す、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の混合物。
7. ２０より大きいｐｋａの強有機塩基もしくはナトリウムイミダゾレートによって、有機溶媒中でヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩を解重合し、その解重合されたヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩をナトリウム塩に変換し、そのエステルを鹸化し、場合によってはその産物を精製することを特徴とする、請求項１の混合物の製造方法。
8. ヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩が、ベンゼトニウム、セチルピリジニウムもしくはセチルトリメチルアンモニウムの塩である、請求項７記載の方法。
9. ２０より大きいｐｋａの強有機塩基が、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デセ−５−エン、２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルペルヒドロ−１，３，２−ジアザホスフォリン、グアニジンおよびホスファゼンの族の塩基の中より選ばれる、請求項７記載の方法。
10. グアニジンの族の塩基が式
    

    

    ［式中、Ｒ_１は水素もしくはアルキルであり、同一もしくは異なるＲ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５はそれぞれアルキル基、直鎖状もしくは分枝状の１ないし６個の炭素原子をもつアルキル基を表わす］を有する、請求項９記載の方法。
11. Ｒ_１が水素であり、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４およびＲ_５がメチル基である、請求項１０記載の方法。
12. ホスファゼンの族の塩基が式
    

    

    ［式中、Ｒ_１からＲ_７の基は同一もしくは異なっており、直鎖状もしくは分枝状の１ないし６個の炭素原子を含むアルキル基を表わす］を有する、請求項９記載の方法。
13. ２０より大きいｐｋａの強有機塩基もしくはナトリウムイミダゾレート／ヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩のモル比が、０．２と５の間に含まれる、請求項７ないし１２の１つに記載の方法。
14. ヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩が５０％と１００％の間に含まれるエステル化率を有する、請求項７ないし１３の１つに記載の方法。
15. 解重合されたヘパリンのベンジルエステルの第四級アンモニウム塩の、ナトリウム塩への変換が、酢酸ナトリウムのアルコール溶液による反応溶媒の処置によって実施される、請求項７ないし１４の１つに記載の方法。
16. 鹸化がアルカリ金属の水酸化物によって行われる、請求項７ないし１５の１つに記載の方法。
17. 精製が過酸化水素によって行われる、請求項７ないし１６の１つに記載の方法。
18. 医薬品としての、請求項１ないし６のいずれか１つに定義されるような混合物。
19. 抗血栓薬としての、請求項１ないし６のいずれか１つに定義されるような混合物。
20. 請求項１ないし６の１つに記載の混合物を有効成分として含む製薬組成物。