JP2004344118A - Ｄｎａ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法 - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫原性の低い分泌型タンパク質の抗体産性法を提供する。
【解決手段】膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に免疫原として投与することを特徴とする、分泌型タンパク質に対する抗体の産生方法を見出した。
【選択図】 なし
【解決手段】膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に免疫原として投与することを特徴とする、分泌型タンパク質に対する抗体の産生方法を見出した。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
予防接種あるいは抗体産生（受動免疫、診断用または研究用試薬に用いられる。）を目的として動物を免疫化する場合には、典型的には、部分的に、あるいは完全に均質に精製された、天然あるいは組換えタンパク質を免疫原として注射する。タンパク質を均質に精製するためには陰イオン、陽イオン、分子ふるいクロマトグラフィーを含む複数の段階が必要である。これらの操作は、時間がかかり、最終産物の均質性についても確認しなければならない。
代替法として、動物細胞発現用ベクターに目的遺伝子を組み込み、プラスミドとして動物に投与し、体内で発現させ抗体を産生させる方法（ＤＮＡ免疫法）がある。本法は免疫原としてタンパク質を用いないため、タンパク質精製のための操作を必要とせず、迅速な抗体作製法として有用である。ＤＮＡ免疫で抗体産生される機序について、詳細は不明であるが、高免疫原性分泌型タンパク質（例えば、非特許文献１参照）、ファージに対する抗体（例えば非特許文献２参照）や膜結合型タンパク質（例えば非特許文献３、４参照）に対する抗体が作製可能であることが知られている。但し、報告例の多くは膜結合タンパク質に対する抗体の報告であり、分泌型タンパク質に対する抗体報告例は少ない（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特表平６−５１０５２４号公報
【特許文献２】特表２００１−５０１８３２号公報
【特許文献３】国際公開第００／１８９３３Ａ１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０５３５９２Ａ２号パンフレット
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ （１９９２） ３５６， １５２−１５４
【非特許文献２】Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９９９） ２３１， ８３−９１
【非特許文献３】Ｊ． ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００１） ２４９，１４７−１５４
【非特許文献４】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ． （２００１） ７６， ２５−３０
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
タンパク質の代わりにそれをコードしている遺伝子で動物に免疫を行うＤＮＡ免疫法は、迅速な抗体作製法である。しかし、該タンパク質に免疫原性がなかったり、免疫原性が低いこともある。
上記のような技術背景の中、分泌型タンパク質（特に、免疫原性の低い分泌型タンパク質）の抗体産生法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与することにより、分泌型タンパク質に対する抗体を産生することができることを見出した。特に、本発明は、免疫原性の低い分泌型タンパク質の抗体産生において有用である。
すなわち、
Ｉ）膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与することを特徴とする、分泌型タンパク質に対する抗体の産生方法、に関する。
【０００６】
さらには、以下のＩＩ）〜Ｘ）に関する。
ＩＩ）該融合タンパク質が、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質を配置させた融合タンパク質であることを特徴とするＩ）記載の抗体の産生方法。
ＩＩＩ）該融合タンパク質が、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質の膜結合領域を配置させた融合タンパク質であることを特徴とするＩ）またはＩＩ）の抗体の産生方法。
ＩＶ）該分泌型タンパク質の免疫原性が低いことを特徴とするＩ）からＩＩＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
Ｖ）該発現可能な遺伝子が、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドであることを特徴とするＩ（）またはＩＩ）記載の抗体の産生方法。
ＶＩ）該プラスミドが、ＣＭＶプロモーターを持つものであることを特徴とするＶ）記載の抗体の産生方法。
ＶＩＩ）該抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とするＩ）からＶＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
ＶＩＩＩ）該抗体がモノクローナル抗体であり、
（１）分泌型タンパク質の抗体産生細胞を得て、
（２）該抗体産生細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマを得て、
（３）該分泌型タンパク質に対する特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選択する、工程を含むＩ）からＶＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
ＩＸ）該分泌型タンパク質がＣ０７８３であるＩ）からＶＩＩＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
Ｘ）分泌型タンパク質と膜結合型タンパク質との融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、該分泌タンパク質に対する免疫応答を引き起こすために必要な量だけ哺乳動物に投与することを特徴とする免疫感作方法。
ＸＩ）Ｘ）記載の遺伝子を含有するワクチン用薬剤。
ＸＩＩ）Ｉ）記載の方法によって産生される分泌型タンパク質Ｃ０７８３に対する抗体。
【０００７】
本発明において使用される「遺伝子」は、一般にはＤＮＡの形で、発現可能なものを意味する。例えば、該遺伝子は遺伝子の発現と遺伝子にコードされている産物の分泌に必要な遺伝子調節エレメントと共に、プラスミドや転移性遺伝因子などの発現ベクターに組み込まれていてもよい。
本明細書中、「膜結合型タンパク質」とは膜貫通領域を持ち、細胞膜に結合するタンパク質である。一般に、膜結合型タンパク質は、そのＮ末端側を細胞外に、そのＣ末端を細胞膜内に配置する。本発明においては、いかなる膜結合型タンパク質も使用され得る。例えば、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＰＤＧＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター等が使用できる。特に、ＣＤ３０が好ましい。
本明細書中で「分泌型タンパク質」とは細胞外に分泌されるタンパク質である。本発明においては、いかなる分泌型タンパク質も使用され得る。すなわち、診断あるいは治療目的の為に抗体が必要とされる、いかなる分泌タンパク質であってもよい。例えば、Ｃ０７８３、レプチン、ＭＭＰ−２、エオタキシン等が使用できる。特に、低免疫原性を示す分泌性タンパク質が好ましい。具体的には、Ｃ０７８３、レプチンが好ましい。
「Ｃ０７８３」とは、ＷＯ０２／０５３５９２の配列番号２にアミノ酸配列が記載されている分泌型タンパク質及び、当該アミノ酸配列に１残基以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列からなる分泌型タンパク質を意味する。なお、Ｃ０７８３をコードするＤＮＡ配列は、同明細書の配列番号１に記載されており、当該ＤＮＡ酸配列に１残基以上のＤＮＡの置換、欠失、挿入または付加を有するＤＮＡ酸配列からなるＤＮＡも本発明に使用することができる。
本明細書中で「融合タンパク質」とは、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質をコードした遺伝子から発現するタンパク質を意味する。一般に、膜結合型タンパク質は、そのＮ末端側を細胞外に、そのＣ末端を細胞膜内に配置する。従って、融合タンパク質は、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質を配置させた融合タンパク質であるものが好ましい。特に、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質の膜結合領域を配置させた融合タンパク質が好ましい。
本発明は、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を使用する。特に、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドが好ましい。すなわち、目的とするタンパク質（膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質）をコードした遺伝子を持つｃＤＮＡを組み込んだ、プロモーターを持ち、生体内で遺伝子を発現させる働きを持つプラスミドＤＮＡを使用することができる。
本明細書中、「プラスミド」とは染色体ＤＮＡとは独立して存在する環状ＤＮＡ分子である。本発明においては、いかなるプラスミドも使用され得る。例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン）、ｐＭ１−ＭＴ（ロシュ）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ（クロンテック）等が使用できる。特に、ｐｃＤＮＡ３．１が好ましい。
本明細書中、「プロモーター」とは、ｍＲＮＡへの転写開始時にＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ領域を意味する。本発明においては、いかなるプロモーターも使用され得る。例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ２−αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が使用できる。特に、ＣＭＶプロモーターが好ましい。
【０００８】
本発明により免疫された哺乳動物から、その分泌型タンパク質に対する特異的な抗血清の抗体価をイムノアッセイにより測定することができる。哺乳動物（たとえばマウス、ウサギ、ヤギ）に投与して、その免疫原性タンパク質あるいはポリペプチドに対する免疫応答（抗体、及び／あるいは、細胞性）を引き起こす。免疫された生物から採血し、その免疫原に対する特異的な抗血清を、常法によって得ることができる。この抗血清を評価する。評価の方法としては、液相抗原を用いたＥＩＡ、固相化抗原を用いたＥＩＡ、ウェスタン・ブロッティングによるＣ０７８３−Ｆｃの検出などがある。
【０００９】
本発明の方法は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体の産生にも利用できる。ポリクロ−ナル抗体の産生のためには膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子（特に、プラスミドに組み込まれたものが好ましい。）を、哺乳動物（たとえばマウス、ウサギ、ヤギ）に免疫原として投与して、分泌型タンパク質あるいはポリペプチドに対する免疫応答（抗体、及び／あるいは、細胞性）を引き起こさせる。このようにして免疫された生物から、当該分泌型タンパク質に対する特異的な抗血清を、常法によって得ることができる。
【００１０】
モノクローナル抗体の産生のためには、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子が組み込まれたプラスミド等で免疫された生物から、脾臓細胞、あるいはその他の抗体産生細胞を得る。これらの細胞を、ミエローマ等の適切な不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマを得る。そのハイブリドーマをスクリーニングし、分泌型タンパク質に特異的な抗体を産生するものを選択する。
【００１１】
本発明の抗体の産生方法は、種々の分泌型タンパク質の抗体の産生に利用可能であり、特に、免疫原性の低い分泌型タンパク質の抗体産生において有用である。すなわち、免疫原性の低い分泌型タンパク質については、単に該分泌型タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与するだけでは、該分泌型タンパク質を得ることができず、本発明の方法によって初めて抗体を得ることが可能となる。
【００１２】
本発明には、分泌型タンパク質と膜結合型タンパク質との融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、該分泌タンパク質またはそのポリペプチドに対する免疫応答を引き起こすために必要な量だけ哺乳動物に投与することを特徴とする免疫感作方法も包含される。本免疫感作方法は、哺乳動物（ヒトあるいはその他の哺乳動物）に予防接種するためにも利用される。
免疫応答を引き起こすために必要な量とは、マウスの場合、１匹当たり１回に１５μｇ、ウサギの場合、１羽あたり１回に３２０μｇである。
分泌型タンパク質と膜結合型タンパク質との融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子は、プラスミドに組み込まれたものであることが好ましい。
該遺伝子（特に、プラスミドに組み込まれたもの）を含有する組成物は、ワクチン用薬剤として使用できる。該ワクチン用薬剤も、本発明に包含される。
【００１３】
また、本発明により、分泌型タンパク質Ｃ０７８３に対する抗体を得ることができる。本抗体は、分泌型タンパク質Ｃ０７８３をコードする発現可能な遺伝子によるＤＮＡ免疫法では得ることができないが、本発明によって得ることができる。
本抗体はウエスタンブロッテイング、イムノアッセイに利用できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明である「ＤＮＡ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法」について、以下に説明する。
膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子の作成については、制限酵素で処理したプラスミドと、制限酵素で処理した該遺伝子を混合し、ライゲーションすることにより行うことができる。
制限酵素は、プラスミドや組み込む遺伝子により適宜選択すればよい。制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ａｏｒ５１ＨＩ等が使用できる。
ライゲーションには、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ロシュ）等を使用すればよい。
なお、本発明において、既に膜結合型タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドを使用することができる。すなわち、該プラスミドを制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理した分泌型タンパク質をコードする遺伝子を上記同様に組み込めばよい。膜結合型タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドとしては、例えば、ｐＤｉｓｐｌａｙ（インビトロゲン）等が市販されている。
【００１５】
このようにして得られた膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、哺乳動物に免疫原として投与する。該投与は、１回でもいいし、継続して行ってもよい。例えば、初回の免疫から、１０日後、２０日後に追加免疫を行ってもよい。
免疫完了後、該哺乳動物より採血を行い、得られた血液より抗血清を得る。このようにして分泌型タンパク質に対するポリクローナル抗体を得ることができる。
【００１６】
本発明は簡便で迅速な抗体作製法として特にゲノム創薬プロジェクトでの応用が今後、期待される。
【実施例】
【００１７】
以下の実施例を行うにあたり、以下の試薬を使用した。
▲１▼プラスミドＤＮＡ（免疫原）の構築に用いた試薬
プラスミドベクター
ｐＳｈｏｏｔｅｒＣ０７８３
ｐｃＤＮＡＣＤ３０
ｐｃＤＮＡ３．１ （インビトロゲン）
（プライマーＤＮＡ配列）
Ｃ０７８３Ｆ１：５’ − ｔｔｃ ｔｃａ ｇａａ ｔｔｃ ｃｃａ ｇｇｇ ａｔｔ ｃｃｃ ｔｃｃ ａｇｇ − ３’ （配列 番号：１）
Ｃ０７８３Ｒ１：５’ − ａｇａ ｔａｔ ｃｔｇ ｃｇｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ａｃｃ ｇｃｔ ｇｇｇ ｇａｃ − ３’ （配 列番号：２）
Ｃ０７８３Ｆ２：５’ − ｔｔｃ ｔｃａ ａａｇ ｃｔｔ ｃｃａ ｇｇｇ ａｔｔ ｃｃｃ ｔｃｃ ａｇｇ − ３’ （配 列番号：３）
Ｃ０７８３Ｒ２：５’ − ｔｔａ ｔｇｇ ｔａｇ ａｔａ ｔｃｃ ｔｔｔ ｔｃａ ｇｔｇ ｃａａ ａｔａ ｇｇ − ３’ （ 配列番号：４）
Ｅｘｐａｎｄ ＴＭ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （ロシュ）
Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ロシュ）
制限酵素
ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ａｏｒ５１ＨＩ（ＴａＫａＲａ）
▲２▼抗血清の評価（ＥＩＡ）に用いた試薬
第２抗体固相化９６ウェルプレート
プレートブロッキング用緩衝液： ２ ％ Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ （雪印）を含むＰＢＳ （ｐＨ７．４）
測定用緩衝液： ０．５ ％ ＢＳＡを含むＰＢＳ （ｐＨ７．４）
抗原：Ｃ０７８３−ＦｃおよびＣＤ３０ − Ｆｃ
洗浄液： ０．１ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ （ｐＨ７．４）
検出抗体： ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（ＳＩＧＭＡ）
酵素活性測定用基質： ＴＭＢ＋ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ （ＤＡＫＯ）
反応停止液：１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４
▲３▼抗血清の評価（ウェスタンブロッティング）に用いた試薬
電気泳動用ゲルプレート ＰＡＧミニ「第一」４／２０ （第一化学薬品）
検出抗体： Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｆｒｏｍ ｓｈｅｅｐ）
（アマシャム ファルマシア）
酵素活性測定用試薬： ＥＣＬ ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ （アマシャム ファルマシア）
【００１８】
その他の試薬は特級試薬あるいは分析用試薬を用いた。
マウスとしては、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ及びＢＡＬＢ／ｃの１０週齢の雌を用いた。
【００１９】
実施例１ 免疫原に用いるプラスミド ＤＮＡ の構築
マウスの免疫に用いたプラスミドＤＮＡは、
▲１▼全長のＣ０７８３を分泌型のタンパク質として発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３
▲２▼Ｃ０７８３のシステインリッチドメイン（ＣＲ１ − ＣＲ５）とＣＤ３０の膜貫通領域とを融合 させた膜結合型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ
▲３▼全長のＣＤ３０を発現するｐｃＤＮＡＣＤ３０（すでに抗体価が上昇することが明らかにされていて、今回はポジティブコントロールとして使用した）。
の３種類のプラスミドＤＮＡである。
▲１▼−▲３▼の作製手順を図１に示す。
まず▲１▼は、ｐＳｈｏｏｔｅｒＣ０７８３を鋳型として、Ｃ０７８３Ｆ１及びＣ０７８３Ｒ１を用いてＰＣＲにより増幅される全長のＣ０７８３の配列を、ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩで制限酵素消化したｐｃＤＮＡ３．１にライゲーションして得た（▲１▼：ｐｃＤＮＡＣ０７８３）。
次に▲２▼は、ｐＳｈｏｏｔｅｒＣ０７８３を鋳型としてＣ０７８３Ｆ２及びＣ０７８３Ｒ２を用いてＰＣＲにより増幅されるＣ０７８３のシステインリッチドメイン（ＣＲ１−ＣＲ５）の配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ，Ａｏｒ５１ＨＩで制限酵素消化したｐｃＤＮＡＣＤ３０にライゲーションして得た（▲２▼ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ − ＣＤ３０ＣＴ）。
▲３▼は，ｐｃＤＮＡＣＤ３０をそのまま使用した（▲３▼：ｐｃＤＮＡＣＤ３０）。
【００２０】
実施例２ 免疫 及び 採血
マウス１匹あたりプラスミド ＤＮＡ（１５ μｇ）を５０ μｌのＰＢＳに溶かし、マウスの尾に皮内投与した。プラスミド ＤＮＡ▲１▼−▲３▼をそれぞれ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（３匹）、ＢＡＬＢ／ｃ（３匹）に免疫した。初回の免役から１０日後、２０日後に追加免疫を行い、最終免疫から７，１４，２１，３５日後に採血を行った。
【００２１】
実施例３ 液相抗原を用いた ＥＩＡ によるマウス抗血清の評価
液相抗原に対する希釈曲線の作製は図２に示す方法で行った。まず、抗マウス ＩｇＧ抗体を固相化した９６ウェルプレートにマウス抗血清を希釈（５００ 〜 ５１２０００倍）して加え、一晩静置した。ウェルを洗浄後、Ｃ０７８３ − Ｆｃを、室温で２時間置く。洗浄後、検出抗体 （ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体） を加え、室温で２時間置いた。洗浄後、ＴＭＢを加え、室温で１０分間反応させた後、１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。
【００２２】
実施例４ 固相化抗原を用いた ＥＩＡ によるマウス抗血清の評価
固相化抗原に対する希釈曲線の作製は図３に示す方法で行った。まず、Ｃ０７８３ − Ｆｃを固相化（２５ ｎｇ／ｗｅｌｌ）した９６ウェルプレートをブロッキングした後、マウス抗血清を希釈（５００ − ５１２０００倍）して加えた。．ウェルを洗浄後、検出抗体 （ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体） を加え、室温で２時間置いた。洗浄後、ＴＭＢを加え、室温で１０分間反応させた後、１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。
【００２３】
実施例５ ウェスタンブロッティングによるＣ０７８３ − Ｆｃの検出
Ｃ０７８３ − Ｆｃを還元条件及び非還元条件下で４ − ２０ ％グラジエント ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜へ転写した。ＰＶＤＦ膜を２ ％ Ｂｌｏｃｋ − Ａｃｅ／ＰＢＳでブロッキングした後に、５００倍に希釈したマウス抗血清を室温で２時間反応させた。その後、検出抗体 （ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体） を室温で２時間反応させ、検出はＥＣＬ法で行った。
【００２４】
以下に、上記実施例に対する考察を示す。
今回，３種類のプラスミド ＤＮＡ▲１▼ − ▲３▼をＣ３Ｈ／Ｈｅ，ＢＡＬＢ／ｃにそれぞれ３匹ずつ免疫を行い、最終免疫から１週間後に得た抗血清について評価を行った。最初にＥＩＡにより液相抗原に対する希釈曲線を作製した（図４、図５）．その結果、分泌型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３を免疫したマウスは抗体価が上昇せず（図４（ａ））、膜結合型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴを免疫したマウスは抗体価が上昇した（図４（ｂ））。抗体価は１００００ − ２００００倍程度であった。また、ポジティブコントロールとして用いたｐｃＤＮＡＣＤ３０を免疫したマウスも特異的な抗体価が上昇した（図５（ｃ））。いずれも，ＢＡＬＢ／ｃよりもＣ３Ｈ／Ｈｅの方が大きく抗体価が上昇することがわかった。
【００２５】
固相化抗原に対する抗体価も液相抗原の場合とほぼ同様であった（図６、図７）。ＣＤ３０のＤＮＡ免疫の場合と比較して膜結合型のＣ０７８３のＤＮＡ免疫による抗体価は低かったが、 これはＣ０７８３のアミノ酸配列の相同性がヒトとマウスの間で非常に高く、ＣＤ３０に比べＣ０７８３の抗原性が低いことによると予想される。
【００２６】
次に，抗体価の上昇が認められたｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴで免疫したマウスから得た抗血清（Ａｎｔｉ − Ｃ０７８３ＮＴ ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて、ウェスタンブロッティングによりＣ０７８３−Ｆｃの検出を試みた。その結果を図８に示した。非還元条件ではＣ０７８３−Ｆｃの特異的なバンドが検出されたが、還元条件ではその反応性のほとんどが消失したことから抗血清中の抗体のほとんどはシステインリッチドメインのジスルフィド結合を認識している可能性が示唆された。
【００２７】
【発明の効果】
膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与することにより、分泌型タンパク質に対する抗体を産生することができるを見出した。特に、本発明は、免疫原性の低い分泌型タンパク質の抗体産生において有用である。
【００２８】
【配列表】
【００２９】
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫原に用いるプラスミド ＤＮＡ の構築についての作業手順を示す図である▲１▼は全長のＣ０７８３を分泌型のタンパク質として発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３、▲２▼はＣ０７８３のシステインリッチドメイン（ＣＲ１ − ＣＲ５）とＣＤ３０の膜貫通領域とを融合させた膜結合型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ、▲３▼は全長のＣＤ３０を発現するｐｃＤＮＡＣＤ３０を示す。
【図２】液相抗原に対する希釈曲線の作製手順を示す。
【図３】固相化抗原に対する希釈曲線の作製手順を示す。
【図４】液相抗原（Ｃ０７８３−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られた血清を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図５】液相抗原（ＣＤ３０−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られたマウス抗血清の結果を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図６】固相抗原（Ｃ０７８３−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られた血清を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図７】固相抗原（ＣＤ３０−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られたマウス抗血清の結果を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図８】ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴで免疫したマウスから得た抗血清（Ａｎｔｉ − Ｃ０７８３ＮＴ ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて、ウェスタンブロッティングによりＣ０７８３−Ｆｃの検出を行った結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
予防接種あるいは抗体産生（受動免疫、診断用または研究用試薬に用いられる。）を目的として動物を免疫化する場合には、典型的には、部分的に、あるいは完全に均質に精製された、天然あるいは組換えタンパク質を免疫原として注射する。タンパク質を均質に精製するためには陰イオン、陽イオン、分子ふるいクロマトグラフィーを含む複数の段階が必要である。これらの操作は、時間がかかり、最終産物の均質性についても確認しなければならない。
代替法として、動物細胞発現用ベクターに目的遺伝子を組み込み、プラスミドとして動物に投与し、体内で発現させ抗体を産生させる方法（ＤＮＡ免疫法）がある。本法は免疫原としてタンパク質を用いないため、タンパク質精製のための操作を必要とせず、迅速な抗体作製法として有用である。ＤＮＡ免疫で抗体産生される機序について、詳細は不明であるが、高免疫原性分泌型タンパク質（例えば、非特許文献１参照）、ファージに対する抗体（例えば非特許文献２参照）や膜結合型タンパク質（例えば非特許文献３、４参照）に対する抗体が作製可能であることが知られている。但し、報告例の多くは膜結合タンパク質に対する抗体の報告であり、分泌型タンパク質に対する抗体報告例は少ない（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特表平６−５１０５２４号公報
【特許文献２】特表２００１−５０１８３２号公報
【特許文献３】国際公開第００／１８９３３Ａ１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０５３５９２Ａ２号パンフレット
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ （１９９２） ３５６， １５２−１５４
【非特許文献２】Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （１９９９） ２３１， ８３−９１
【非特許文献３】Ｊ． ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００１） ２４９，１４７−１５４
【非特許文献４】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ． （２００１） ７６， ２５−３０
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
タンパク質の代わりにそれをコードしている遺伝子で動物に免疫を行うＤＮＡ免疫法は、迅速な抗体作製法である。しかし、該タンパク質に免疫原性がなかったり、免疫原性が低いこともある。
上記のような技術背景の中、分泌型タンパク質（特に、免疫原性の低い分泌型タンパク質）の抗体産生法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与することにより、分泌型タンパク質に対する抗体を産生することができることを見出した。特に、本発明は、免疫原性の低い分泌型タンパク質の抗体産生において有用である。
すなわち、
Ｉ）膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与することを特徴とする、分泌型タンパク質に対する抗体の産生方法、に関する。
【０００６】
さらには、以下のＩＩ）〜Ｘ）に関する。
ＩＩ）該融合タンパク質が、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質を配置させた融合タンパク質であることを特徴とするＩ）記載の抗体の産生方法。
ＩＩＩ）該融合タンパク質が、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質の膜結合領域を配置させた融合タンパク質であることを特徴とするＩ）またはＩＩ）の抗体の産生方法。
ＩＶ）該分泌型タンパク質の免疫原性が低いことを特徴とするＩ）からＩＩＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
Ｖ）該発現可能な遺伝子が、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドであることを特徴とするＩ（）またはＩＩ）記載の抗体の産生方法。
ＶＩ）該プラスミドが、ＣＭＶプロモーターを持つものであることを特徴とするＶ）記載の抗体の産生方法。
ＶＩＩ）該抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とするＩ）からＶＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
ＶＩＩＩ）該抗体がモノクローナル抗体であり、
（１）分泌型タンパク質の抗体産生細胞を得て、
（２）該抗体産生細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマを得て、
（３）該分泌型タンパク質に対する特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選択する、工程を含むＩ）からＶＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
ＩＸ）該分泌型タンパク質がＣ０７８３であるＩ）からＶＩＩＩ）のいずれかに記載の抗体の産生方法。
Ｘ）分泌型タンパク質と膜結合型タンパク質との融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、該分泌タンパク質に対する免疫応答を引き起こすために必要な量だけ哺乳動物に投与することを特徴とする免疫感作方法。
ＸＩ）Ｘ）記載の遺伝子を含有するワクチン用薬剤。
ＸＩＩ）Ｉ）記載の方法によって産生される分泌型タンパク質Ｃ０７８３に対する抗体。
【０００７】
本発明において使用される「遺伝子」は、一般にはＤＮＡの形で、発現可能なものを意味する。例えば、該遺伝子は遺伝子の発現と遺伝子にコードされている産物の分泌に必要な遺伝子調節エレメントと共に、プラスミドや転移性遺伝因子などの発現ベクターに組み込まれていてもよい。
本明細書中、「膜結合型タンパク質」とは膜貫通領域を持ち、細胞膜に結合するタンパク質である。一般に、膜結合型タンパク質は、そのＮ末端側を細胞外に、そのＣ末端を細胞膜内に配置する。本発明においては、いかなる膜結合型タンパク質も使用され得る。例えば、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＰＤＧＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター等が使用できる。特に、ＣＤ３０が好ましい。
本明細書中で「分泌型タンパク質」とは細胞外に分泌されるタンパク質である。本発明においては、いかなる分泌型タンパク質も使用され得る。すなわち、診断あるいは治療目的の為に抗体が必要とされる、いかなる分泌タンパク質であってもよい。例えば、Ｃ０７８３、レプチン、ＭＭＰ−２、エオタキシン等が使用できる。特に、低免疫原性を示す分泌性タンパク質が好ましい。具体的には、Ｃ０７８３、レプチンが好ましい。
「Ｃ０７８３」とは、ＷＯ０２／０５３５９２の配列番号２にアミノ酸配列が記載されている分泌型タンパク質及び、当該アミノ酸配列に１残基以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を有するアミノ酸配列からなる分泌型タンパク質を意味する。なお、Ｃ０７８３をコードするＤＮＡ配列は、同明細書の配列番号１に記載されており、当該ＤＮＡ酸配列に１残基以上のＤＮＡの置換、欠失、挿入または付加を有するＤＮＡ酸配列からなるＤＮＡも本発明に使用することができる。
本明細書中で「融合タンパク質」とは、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質をコードした遺伝子から発現するタンパク質を意味する。一般に、膜結合型タンパク質は、そのＮ末端側を細胞外に、そのＣ末端を細胞膜内に配置する。従って、融合タンパク質は、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質を配置させた融合タンパク質であるものが好ましい。特に、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質の膜結合領域を配置させた融合タンパク質が好ましい。
本発明は、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を使用する。特に、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドが好ましい。すなわち、目的とするタンパク質（膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質）をコードした遺伝子を持つｃＤＮＡを組み込んだ、プロモーターを持ち、生体内で遺伝子を発現させる働きを持つプラスミドＤＮＡを使用することができる。
本明細書中、「プラスミド」とは染色体ＤＮＡとは独立して存在する環状ＤＮＡ分子である。本発明においては、いかなるプラスミドも使用され得る。例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン）、ｐＭ１−ＭＴ（ロシュ）、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ（クロンテック）等が使用できる。特に、ｐｃＤＮＡ３．１が好ましい。
本明細書中、「プロモーター」とは、ｍＲＮＡへの転写開始時にＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ領域を意味する。本発明においては、いかなるプロモーターも使用され得る。例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ２−αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が使用できる。特に、ＣＭＶプロモーターが好ましい。
【０００８】
本発明により免疫された哺乳動物から、その分泌型タンパク質に対する特異的な抗血清の抗体価をイムノアッセイにより測定することができる。哺乳動物（たとえばマウス、ウサギ、ヤギ）に投与して、その免疫原性タンパク質あるいはポリペプチドに対する免疫応答（抗体、及び／あるいは、細胞性）を引き起こす。免疫された生物から採血し、その免疫原に対する特異的な抗血清を、常法によって得ることができる。この抗血清を評価する。評価の方法としては、液相抗原を用いたＥＩＡ、固相化抗原を用いたＥＩＡ、ウェスタン・ブロッティングによるＣ０７８３−Ｆｃの検出などがある。
【０００９】
本発明の方法は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体の産生にも利用できる。ポリクロ−ナル抗体の産生のためには膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子（特に、プラスミドに組み込まれたものが好ましい。）を、哺乳動物（たとえばマウス、ウサギ、ヤギ）に免疫原として投与して、分泌型タンパク質あるいはポリペプチドに対する免疫応答（抗体、及び／あるいは、細胞性）を引き起こさせる。このようにして免疫された生物から、当該分泌型タンパク質に対する特異的な抗血清を、常法によって得ることができる。
【００１０】
モノクローナル抗体の産生のためには、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子が組み込まれたプラスミド等で免疫された生物から、脾臓細胞、あるいはその他の抗体産生細胞を得る。これらの細胞を、ミエローマ等の適切な不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマを得る。そのハイブリドーマをスクリーニングし、分泌型タンパク質に特異的な抗体を産生するものを選択する。
【００１１】
本発明の抗体の産生方法は、種々の分泌型タンパク質の抗体の産生に利用可能であり、特に、免疫原性の低い分泌型タンパク質の抗体産生において有用である。すなわち、免疫原性の低い分泌型タンパク質については、単に該分泌型タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与するだけでは、該分泌型タンパク質を得ることができず、本発明の方法によって初めて抗体を得ることが可能となる。
【００１２】
本発明には、分泌型タンパク質と膜結合型タンパク質との融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、該分泌タンパク質またはそのポリペプチドに対する免疫応答を引き起こすために必要な量だけ哺乳動物に投与することを特徴とする免疫感作方法も包含される。本免疫感作方法は、哺乳動物（ヒトあるいはその他の哺乳動物）に予防接種するためにも利用される。
免疫応答を引き起こすために必要な量とは、マウスの場合、１匹当たり１回に１５μｇ、ウサギの場合、１羽あたり１回に３２０μｇである。
分泌型タンパク質と膜結合型タンパク質との融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子は、プラスミドに組み込まれたものであることが好ましい。
該遺伝子（特に、プラスミドに組み込まれたもの）を含有する組成物は、ワクチン用薬剤として使用できる。該ワクチン用薬剤も、本発明に包含される。
【００１３】
また、本発明により、分泌型タンパク質Ｃ０７８３に対する抗体を得ることができる。本抗体は、分泌型タンパク質Ｃ０７８３をコードする発現可能な遺伝子によるＤＮＡ免疫法では得ることができないが、本発明によって得ることができる。
本抗体はウエスタンブロッテイング、イムノアッセイに利用できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明である「ＤＮＡ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法」について、以下に説明する。
膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子の作成については、制限酵素で処理したプラスミドと、制限酵素で処理した該遺伝子を混合し、ライゲーションすることにより行うことができる。
制限酵素は、プラスミドや組み込む遺伝子により適宜選択すればよい。制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ａｏｒ５１ＨＩ等が使用できる。
ライゲーションには、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ロシュ）等を使用すればよい。
なお、本発明において、既に膜結合型タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドを使用することができる。すなわち、該プラスミドを制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理した分泌型タンパク質をコードする遺伝子を上記同様に組み込めばよい。膜結合型タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドとしては、例えば、ｐＤｉｓｐｌａｙ（インビトロゲン）等が市販されている。
【００１５】
このようにして得られた膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、哺乳動物に免疫原として投与する。該投与は、１回でもいいし、継続して行ってもよい。例えば、初回の免疫から、１０日後、２０日後に追加免疫を行ってもよい。
免疫完了後、該哺乳動物より採血を行い、得られた血液より抗血清を得る。このようにして分泌型タンパク質に対するポリクローナル抗体を得ることができる。
【００１６】
本発明は簡便で迅速な抗体作製法として特にゲノム創薬プロジェクトでの応用が今後、期待される。
【実施例】
【００１７】
以下の実施例を行うにあたり、以下の試薬を使用した。
▲１▼プラスミドＤＮＡ（免疫原）の構築に用いた試薬
プラスミドベクター
ｐＳｈｏｏｔｅｒＣ０７８３
ｐｃＤＮＡＣＤ３０
ｐｃＤＮＡ３．１ （インビトロゲン）
（プライマーＤＮＡ配列）
Ｃ０７８３Ｆ１：５’ − ｔｔｃ ｔｃａ ｇａａ ｔｔｃ ｃｃａ ｇｇｇ ａｔｔ ｃｃｃ ｔｃｃ ａｇｇ − ３’ （配列 番号：１）
Ｃ０７８３Ｒ１：５’ − ａｇａ ｔａｔ ｃｔｇ ｃｇｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ａｃｃ ｇｃｔ ｇｇｇ ｇａｃ − ３’ （配 列番号：２）
Ｃ０７８３Ｆ２：５’ − ｔｔｃ ｔｃａ ａａｇ ｃｔｔ ｃｃａ ｇｇｇ ａｔｔ ｃｃｃ ｔｃｃ ａｇｇ − ３’ （配 列番号：３）
Ｃ０７８３Ｒ２：５’ − ｔｔａ ｔｇｇ ｔａｇ ａｔａ ｔｃｃ ｔｔｔ ｔｃａ ｇｔｇ ｃａａ ａｔａ ｇｇ − ３’ （ 配列番号：４）
Ｅｘｐａｎｄ ＴＭ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （ロシュ）
Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ロシュ）
制限酵素
ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ａｏｒ５１ＨＩ（ＴａＫａＲａ）
▲２▼抗血清の評価（ＥＩＡ）に用いた試薬
第２抗体固相化９６ウェルプレート
プレートブロッキング用緩衝液： ２ ％ Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ （雪印）を含むＰＢＳ （ｐＨ７．４）
測定用緩衝液： ０．５ ％ ＢＳＡを含むＰＢＳ （ｐＨ７．４）
抗原：Ｃ０７８３−ＦｃおよびＣＤ３０ − Ｆｃ
洗浄液： ０．１ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ （ｐＨ７．４）
検出抗体： ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（ＳＩＧＭＡ）
酵素活性測定用基質： ＴＭＢ＋ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ （ＤＡＫＯ）
反応停止液：１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４
▲３▼抗血清の評価（ウェスタンブロッティング）に用いた試薬
電気泳動用ゲルプレート ＰＡＧミニ「第一」４／２０ （第一化学薬品）
検出抗体： Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ Ｉｇ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｆｒｏｍ ｓｈｅｅｐ）
（アマシャム ファルマシア）
酵素活性測定用試薬： ＥＣＬ ＴＭ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ （アマシャム ファルマシア）
【００１８】
その他の試薬は特級試薬あるいは分析用試薬を用いた。
マウスとしては、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ及びＢＡＬＢ／ｃの１０週齢の雌を用いた。
【００１９】
実施例１ 免疫原に用いるプラスミド ＤＮＡ の構築
マウスの免疫に用いたプラスミドＤＮＡは、
▲１▼全長のＣ０７８３を分泌型のタンパク質として発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３
▲２▼Ｃ０７８３のシステインリッチドメイン（ＣＲ１ − ＣＲ５）とＣＤ３０の膜貫通領域とを融合 させた膜結合型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ
▲３▼全長のＣＤ３０を発現するｐｃＤＮＡＣＤ３０（すでに抗体価が上昇することが明らかにされていて、今回はポジティブコントロールとして使用した）。
の３種類のプラスミドＤＮＡである。
▲１▼−▲３▼の作製手順を図１に示す。
まず▲１▼は、ｐＳｈｏｏｔｅｒＣ０７８３を鋳型として、Ｃ０７８３Ｆ１及びＣ０７８３Ｒ１を用いてＰＣＲにより増幅される全長のＣ０７８３の配列を、ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩで制限酵素消化したｐｃＤＮＡ３．１にライゲーションして得た（▲１▼：ｐｃＤＮＡＣ０７８３）。
次に▲２▼は、ｐＳｈｏｏｔｅｒＣ０７８３を鋳型としてＣ０７８３Ｆ２及びＣ０７８３Ｒ２を用いてＰＣＲにより増幅されるＣ０７８３のシステインリッチドメイン（ＣＲ１−ＣＲ５）の配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ，Ａｏｒ５１ＨＩで制限酵素消化したｐｃＤＮＡＣＤ３０にライゲーションして得た（▲２▼ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ − ＣＤ３０ＣＴ）。
▲３▼は，ｐｃＤＮＡＣＤ３０をそのまま使用した（▲３▼：ｐｃＤＮＡＣＤ３０）。
【００２０】
実施例２ 免疫 及び 採血
マウス１匹あたりプラスミド ＤＮＡ（１５ μｇ）を５０ μｌのＰＢＳに溶かし、マウスの尾に皮内投与した。プラスミド ＤＮＡ▲１▼−▲３▼をそれぞれ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（３匹）、ＢＡＬＢ／ｃ（３匹）に免疫した。初回の免役から１０日後、２０日後に追加免疫を行い、最終免疫から７，１４，２１，３５日後に採血を行った。
【００２１】
実施例３ 液相抗原を用いた ＥＩＡ によるマウス抗血清の評価
液相抗原に対する希釈曲線の作製は図２に示す方法で行った。まず、抗マウス ＩｇＧ抗体を固相化した９６ウェルプレートにマウス抗血清を希釈（５００ 〜 ５１２０００倍）して加え、一晩静置した。ウェルを洗浄後、Ｃ０７８３ − Ｆｃを、室温で２時間置く。洗浄後、検出抗体 （ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体） を加え、室温で２時間置いた。洗浄後、ＴＭＢを加え、室温で１０分間反応させた後、１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。
【００２２】
実施例４ 固相化抗原を用いた ＥＩＡ によるマウス抗血清の評価
固相化抗原に対する希釈曲線の作製は図３に示す方法で行った。まず、Ｃ０７８３ − Ｆｃを固相化（２５ ｎｇ／ｗｅｌｌ）した９６ウェルプレートをブロッキングした後、マウス抗血清を希釈（５００ − ５１２０００倍）して加えた。．ウェルを洗浄後、検出抗体 （ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体） を加え、室温で２時間置いた。洗浄後、ＴＭＢを加え、室温で１０分間反応させた後、１ Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。
【００２３】
実施例５ ウェスタンブロッティングによるＣ０７８３ − Ｆｃの検出
Ｃ０７８３ − Ｆｃを還元条件及び非還元条件下で４ − ２０ ％グラジエント ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜へ転写した。ＰＶＤＦ膜を２ ％ Ｂｌｏｃｋ − Ａｃｅ／ＰＢＳでブロッキングした後に、５００倍に希釈したマウス抗血清を室温で２時間反応させた。その後、検出抗体 （ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体） を室温で２時間反応させ、検出はＥＣＬ法で行った。
【００２４】
以下に、上記実施例に対する考察を示す。
今回，３種類のプラスミド ＤＮＡ▲１▼ − ▲３▼をＣ３Ｈ／Ｈｅ，ＢＡＬＢ／ｃにそれぞれ３匹ずつ免疫を行い、最終免疫から１週間後に得た抗血清について評価を行った。最初にＥＩＡにより液相抗原に対する希釈曲線を作製した（図４、図５）．その結果、分泌型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３を免疫したマウスは抗体価が上昇せず（図４（ａ））、膜結合型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴを免疫したマウスは抗体価が上昇した（図４（ｂ））。抗体価は１００００ − ２００００倍程度であった。また、ポジティブコントロールとして用いたｐｃＤＮＡＣＤ３０を免疫したマウスも特異的な抗体価が上昇した（図５（ｃ））。いずれも，ＢＡＬＢ／ｃよりもＣ３Ｈ／Ｈｅの方が大きく抗体価が上昇することがわかった。
【００２５】
固相化抗原に対する抗体価も液相抗原の場合とほぼ同様であった（図６、図７）。ＣＤ３０のＤＮＡ免疫の場合と比較して膜結合型のＣ０７８３のＤＮＡ免疫による抗体価は低かったが、 これはＣ０７８３のアミノ酸配列の相同性がヒトとマウスの間で非常に高く、ＣＤ３０に比べＣ０７８３の抗原性が低いことによると予想される。
【００２６】
次に，抗体価の上昇が認められたｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴで免疫したマウスから得た抗血清（Ａｎｔｉ − Ｃ０７８３ＮＴ ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて、ウェスタンブロッティングによりＣ０７８３−Ｆｃの検出を試みた。その結果を図８に示した。非還元条件ではＣ０７８３−Ｆｃの特異的なバンドが検出されたが、還元条件ではその反応性のほとんどが消失したことから抗血清中の抗体のほとんどはシステインリッチドメインのジスルフィド結合を認識している可能性が示唆された。
【００２７】
【発明の効果】
膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与することにより、分泌型タンパク質に対する抗体を産生することができるを見出した。特に、本発明は、免疫原性の低い分泌型タンパク質の抗体産生において有用である。
【００２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫原に用いるプラスミド ＤＮＡ の構築についての作業手順を示す図である▲１▼は全長のＣ０７８３を分泌型のタンパク質として発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３、▲２▼はＣ０７８３のシステインリッチドメイン（ＣＲ１ − ＣＲ５）とＣＤ３０の膜貫通領域とを融合させた膜結合型のＣ０７８３を発現するｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ、▲３▼は全長のＣＤ３０を発現するｐｃＤＮＡＣＤ３０を示す。
【図２】液相抗原に対する希釈曲線の作製手順を示す。
【図３】固相化抗原に対する希釈曲線の作製手順を示す。
【図４】液相抗原（Ｃ０７８３−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られた血清を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図５】液相抗原（ＣＤ３０−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られたマウス抗血清の結果を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図６】固相抗原（Ｃ０７８３−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られた血清を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図７】固相抗原（ＣＤ３０−Ｆｃ）に対する、マウス抗血清の希釈曲線を示す。（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ順に、ｐｃＤＮＡＣ０７８３、ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴ 、ｐｃＤＮＡＣＤ３０によりＤＮＡ免疫された後に選られたマウス抗血清の結果を示す。（ｄ）は免疫を行わなかった場合を示す。
【図８】ｐｃＤＮＡＣ０７８３ＮＴ−ＣＤ３０ＣＴで免疫したマウスから得た抗血清（Ａｎｔｉ − Ｃ０７８３ＮＴ ｍｏｕｓｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて、ウェスタンブロッティングによりＣ０７８３−Ｆｃの検出を行った結果を示す。
Claims (12)
- 膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を哺乳動物に投与することを特徴とする、分泌型タンパク質に対する抗体の産生方法。
- 該融合タンパク質が、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質を配置させた融合タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の抗体の産生方法。
- 該融合タンパク質が、Ｎ末端側に分泌型タンパク質、Ｃ末端側に膜結合型タンパク質の膜結合領域を配置させた融合タンパク質であることを特徴とする請求項１または２記載の抗体の産生方法。
- 該分泌型タンパク質の免疫原性が低いことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の抗体の産生方法。
- 該発現可能な遺伝子が、膜結合型タンパク質と分泌型タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドであることを特徴とする請求項１または２記載の抗体の産生方法。
- 該プラスミドが、ＣＭＶプロモーターを持つものであることを特徴とする請求項５記載の抗体の産生方法。
- 該抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の抗体の産生方法。
- 該抗体がモノクローナル抗体であり、
（１）分泌型タンパク質の抗体産生細胞を得て、
（２）該抗体産生細胞を不死化細胞と融合させてハイブリドーマを得て、
（３）該分泌型タンパク質に対する特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選択する、工程を含む請求項１から６のいずれかに記載の抗体の産生方法。 - 該分泌型タンパク質がＣ０７８３である請求項１から８のいずれかに記載の抗体の産生方法。
- 分泌型タンパク質と膜結合型タンパク質との融合タンパク質をコードする発現可能な遺伝子を、該分泌タンパク質に対する免疫応答を引き起こすために必要な量だけ哺乳動物に投与することを特徴とする免疫感作方法。
- 請求項１０記載の遺伝子を含有するワクチン用薬剤。
- 請求項１記載の方法によって産生される分泌型タンパク質Ｃ０７８３に対する抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003147105A JP2004344118A (ja) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | Ｄｎａ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003147105A JP2004344118A (ja) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | Ｄｎａ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003147105A Pending JP2004344118A (ja) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | Ｄｎａ免疫法による分泌型タンパク質の抗体産生法 |
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|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008220212A (ja) * | 2007-03-09 | 2008-09-25 | Univ Of Tokyo | 分泌制御型プローブ |
| JP5615169B2 (ja) * | 2008-03-17 | 2014-10-29 | 株式会社リブテック | ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002053592A1 (fr) * | 2000-12-28 | 2002-07-11 | Shionogi & Co., Ltd. | Nouveau polypeptide et son adn |
-
2003
- 2003-05-26 JP JP2003147105A patent/JP2004344118A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002053592A1 (fr) * | 2000-12-28 | 2002-07-11 | Shionogi & Co., Ltd. | Nouveau polypeptide et son adn |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DNA, 1989, VOL.8, NO.10, PP.753-758, JPN6009001169, ISSN: 0001224012 * |
| J. VIROL. METHODS, 2003.APR, VOL.109, NO.1, PP.55-61, JPN6009001168, ISSN: 0001224011 * |
| J. VIROLOGY, 1999, VOL.73, NO.7, PP.6104-6110, JPN6009001170, ISSN: 0001224013 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008220212A (ja) * | 2007-03-09 | 2008-09-25 | Univ Of Tokyo | 分泌制御型プローブ |
| JP5615169B2 (ja) * | 2008-03-17 | 2014-10-29 | 株式会社リブテック | ｉｎｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体 |
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