JP2004331556A - ２”−ヒドロキシニコチアナミン、その製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び健康食品 - Google Patents
２”−ヒドロキシニコチアナミン、その製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び健康食品 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004331556A JP2004331556A JP2003128838A JP2003128838A JP2004331556A JP 2004331556 A JP2004331556 A JP 2004331556A JP 2003128838 A JP2003128838 A JP 2003128838A JP 2003128838 A JP2003128838 A JP 2003128838A JP 2004331556 A JP2004331556 A JP 2004331556A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hydroxynicotianamine
- producing
- extract
- extraction
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D205/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D205/02—Heterocyclic compounds containing four-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
- C07D205/04—Heterocyclic compounds containing four-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
【課題】ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質、該新規物質を製造する方法、並びに該新規物質を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤、及び該新規物質を含有する健康食品を提供すること。
【解決手段】２”−ヒドロキシニコチアナミン、及びそば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る抽出工程を行い、次いで、該抽出液に対して、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分を得る分離精製工程を行う２”−ヒドロキシニコチアナミンを製造する方法、並びに２”−ヒドロキシニコチアナミンを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤、及び健康食品。
【選択図】 なし
【解決手段】２”−ヒドロキシニコチアナミン、及びそば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る抽出工程を行い、次いで、該抽出液に対して、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分を得る分離精製工程を行う２”−ヒドロキシニコチアナミンを製造する方法、並びに２”−ヒドロキシニコチアナミンを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤、及び健康食品。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質、該新規物質又は該新規物質の含有物を製造する方法、並びに該新規物質を有効成分として含有する血圧降下剤、及び該新規物質を含有する健康食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内における昇圧系の一つであり、人の重要な血圧調節系として知られるレニンーアンジオテンシン系は、アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ 以下ＡＣＥと略記する。）が、アンジオテンシン−Ｉに作用して、強い血圧上昇作用を有するアンジオテンシン−ＩＩを生じさせるので、ＡＣＥの活性を抑制する作用を有する物質が、血圧降下剤として本態性高血圧症等の治療において、実用化されている。しかしながら、これらの薬剤は、めまい、立ちくらみ、悪心、口渇、過度の鎮静などの副作用が避けられないのが現状である。
【０００３】
１９７１年にノマら［Ｍ． Ｎｏｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｎｏ． ２２， ｐｐ２０１７−２０２０（１９７１）］によってタバコ葉中から抽出されたニコチアナミンは、下記式（２）；
【０００４】
【化２】
【０００５】
で表される天然の化合物であり、副作用の恐れが少ないとともに、ＡＣＥの活性を抑制する作用を有しており、血圧降下作用を有している可能性が高いものである。そこで、大豆を水又は熱水で抽出して抽出液を得て、該抽出液のニコチアナミンを合成吸着樹脂により、分別、採取するニコチアナミンの製造方法が、特開平５−２４６８６５号公報（特許文献１）において記載されている。
【０００６】
そばは古くより栄養価が高く、健康に良い食品と考えられているが、そばの栄養成分については、タンパク質含有量が他の穀類よりも高く、そのアミノ酸価は９２であり、精白米の６５や小麦粉の４１と比べて非常に高く、そばに含まれるタンパク質は良質タンパクである。また、そばは、食物繊維が他の穀物よりも多い他、そばタンパク質には食物繊維様の作用があり、コレステロール吸収の阻害などが報告されている。そばの機能成分では、古くよりビタミンＣとの協奏作用により毛細血管を強化するとされるルチンが知られているが、最近の研究成果ではルチンを含めた多くのポリフェノールが単離同定され、それらの抗酸化作用による機能性が注目されている。
【０００７】
レニンーアンジオテンシン系とそばとの関係については、そば熱水抽出物やそばタンパク質加水分解物がＡＣＥ阻害能を有することが報告され、そばの血圧降下作用はルチンやペプチド類によるものと考えられてきた。
【０００８】
そばについては、さらに、そば脱穀種子又はそば粉を、水又は熱水による抽出液を、ゲル濾過によるカラムクロマトグラフィーにより分画し、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を分取する操作を行い、得られた画分について、吸着カラムクロマトグラフィーによって分画し、ＡＣＥ阻害活性の強い画分を分取し、さらに該画分を、ゲル濾過によるカラムクロマトグラフィーにより分画し、ＡＣＥ阻害活性の強い画分を分取する操作を行って、下記式（３）；
【０００９】
【化３】
【００１０】
で表され、ＡＣＥ阻害活性を有しており、血圧降下作用を有する可能性が高い天然の新規物質が、特開平５−９７７９８号公報（特許文献２）において記載されている。
【００１１】
これらのＡＣＥ阻害活性を有する天然の化合物は、血圧降下剤、健康食品などに有用に用いられる可能性が高い化合物であるが、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質の探索は十分に行われているとは言えず、さらなるＡＣＥ阻害活性を有する新規物質の探索が必要とされている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質、該新規物質又は該新規物質の含有物を製造する方法、並びに該新規物質を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤、及び該新規物質を含有する健康食品を提供することをその目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、そば粉、そば玄穀、そば茎葉、そばの芽、ダッタンそば粉、ダッタンそば玄穀、ダッタンそば茎葉、そば湯等のそば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る抽出工程を行い、次いで、該抽出液に対して、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりＡＣＥ阻害活性を有する画分を得る分離精製工程を行うことにより得られた物質が、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質であること、及び該新規物質が２”−ヒドロキシニコチアナミンであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明（１）は、下記式（１）；
【００１５】
【化４】
【００１６】
で表される２”−ヒドロキシニコチアナミンを提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（１）は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質を提供することができるという効果を奏するものである。
【００１７】
また、本発明（２）は、そば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る抽出工程を行い、次いで、該抽出液に対して、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分を得る分離精製工程を行う２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（２）は、ＡＣＥ阻害活性を有する２”−ヒドロキシニコチアナミンを製造することができるという効果を奏するものである。
【００１８】
また、本発明（３）は、前記抽出用溶媒が、エタノール水溶液である前記発明（２）記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（３）は、前記発明（２）が奏する効果に加えて、抽出工程における抽出能を向上させることができるという効果を奏するものである。
【００１９】
また、本発明（４）は、前記抽出液を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程を行った後、該濃縮液に対して、前記分離精製工程を行う前記発明（２）又は（３）記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（４）は、前記発明（２）又は（３）が奏する効果に加えて、分離精製工程におけるサンプルの体積量を少なくすることができるという効果を奏するものである。
【００２０】
また、本発明（５）は、前記分離精製工程を２回以上行う前記発明（２）〜（４）のいずれかに記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（５）は、前記発明（２）〜（４）のいずれかが奏する効果に加えて、得られる生成物中に含まれる夾雑物を減少させることができるという効果を奏するものである。
【００２１】
また、本発明（６）は、前記抽出液又は前記濃縮液に対して、陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法により、陽イオン交換樹脂に滞留する滞留物を得て、該滞留物を溶出した溶出液を得る溶出工程を行い、次いで該溶出液に対して、前記分離精製工程を行う前記発明（２）〜（５）のいずれかに記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（６）は、前記発明（２）〜（５）のいずれかが奏する効果に加えて、陽イオン交換樹脂に滞留しない物質を除去することができるため、得られる生成物中に含まれる夾雑物を減少させることができるという効果を奏するものである。
【００２２】
また、本発明（７）は、前記抽出工程又は前記濃縮工程の後に、得られた抽出液又は濃縮液に対して、１種又は２種以上の有機溶媒による抽出を１回または２回以上行って、水層を抽出液又は濃縮液として得る前記発明（２）〜（６）のいずれかに記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（７）は、前記発明（２）〜（６）のいずれかが奏する効果に加えて、脱脂を行うことにより、得られる生成物中に含まれる夾雑物を減少させることができるという効果を奏するものである。
【００２３】
また、本発明（８）は、前記分離精製工程を行った後、さらに、前記アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分に対して再結晶操作を行い、結晶を単離する単離工程を行う前記発明（２）〜（７）のいずれか記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（８）は、前記発明（２）〜（７）のいずれかが奏する効果に加えて、純度の高い２”−ヒドロキシニコチアナミンを得ることができるという効果を奏するものである。
【００２４】
また、本発明（９）は、前記単離工程において、再結晶操作に用いる溶媒がエタノール水溶液である前記発明（８）に記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（９）は、前記発明（８）が奏する効果に加えて、再結晶操作で得られる２”−ヒドロキシニコチアナミン量を増加させることができるという効果を奏する。
【００２５】
また、本発明（１０）は、前記発明（１）の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供するものである。
【００２６】
また、本発明（１１）は、前記発明（１）の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有する血圧降下剤を提供するものである。
【００２７】
また、本発明（１２）は、前記発明（１）の２”−ヒドロキシニコチアナミンを含有する健康食品を提供するものである。
【００２８】
【実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を述べるが、本発明はこれら実施の形態により制限されない。本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミン（以下、新規物質とも言う）は、以下の理化学的性質を有する。
【００２９】
＜１Ｈ−ＮＭＲ＞｛重水液中中で（ＴＭＳＰ）を内部標準物質として測定、２７０ＭＨｚ カッコ内は多重度、結合定数、および帰属｝
本発明の新規物質の１Ｈ−ＮＭＲピークは、δ２．０５〜２．３ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’）、δ２．４〜２．８５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、δ３．２５〜３．５３ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１”ａｎｄＨ−１’）、δ３．８５ｐｐｍ （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７８Ｈｚ，Ｊ＝８．４２Ｈｚ，Ｈ−３’）、δ３．９２〜４．１５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、δ４．０１ｐｐｍ （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ−３”）、δ４．４２〜４．４８ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２”）、δ４．７７ｐｐｍ （１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５７Ｈｚ，Ｈ−２）であり、１Ｈ−ＮＭＲ測定スペクトルを図１に示す。
【００３０】
＜１３Ｃ−ＮＭＲ＞
｛重水液中で（ＴＭＳＰ）を内部標準物質として測定、６８ＭＨｚ カッコ内は帰属｝
本発明の新規物質の１３Ｃ−ＮＭＲピークは、δ２３．９ｐｐｍ（Ｃ−３ ）、δ２７．６ｐｐｍ（Ｃ−２’ ）、δ５１．２ｐｐｍ（Ｃ−１” ）、δ５３．４ｐｐｍ（Ｃ−４ ）、δ５４．１ｐｐｍ（Ｃ−１’）、δ６０．５ｐｐｍ（Ｃ−３” ）、δ６２．４ｐｐｍ（Ｃ−３’）、δ６８．３ｐｐｍ（Ｃ−２”）、δ６９．７ｐｐｍ（Ｃ−２）、δ１７３．３ｐｐｍ（Ｃ−４”）、δ１７４．９ｐｐｍ（Ｃ−４’）、δ１７６．０ｐｐｍ（Ｃ−１）であり、１３Ｃ−ＮＭＲ測定スペクトルを図２に示す。
【００３１】
＜１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ及び１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ＞
また、本発明の新規物質は、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹにより図３に示す１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルが、１３Ｃ −１Ｈ ＣＯＳＹにより図４に示す１３Ｃ −１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルが得られるものである。
【００３２】
＜ＭＳ＞
本発明の新規物質を、ＦＡＢ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）−ＭＳ、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−ＭＳによりマススペクトルを測定したところ、ＦＡＢ−ＭＳにおいて、ｍ／ｚ＝３２０に弱い（Ｍ＋Ｈ）のピークが認められた。また、ＥＳＩ−ＭＳにおいても、ｍ／ｚ＝３２０が（Ｍ＋Ｈ）のピークであることが確認された。
【００３３】
＜高分解能ＭＳ＞
また、高分解能ＦＡＢ−ＭＳにより（Ｍ＋Ｈ）イオンのピークはｍ／ｚ＝３２０．１４５８であり、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ７Ｎ３から計算される質量数３２０．１４５８と一致し、分子式がＣ１２Ｈ２１Ｏ７Ｎ３と決定された。
【００３４】
＜その他の理化学的性質＞
本発明の新規物質は、ニンヒドリン反応に陽性を示すが、Ｃｕ２＋イオンによりニンヒドリン反応が抑制される。また、本発明の新規物質は、水、（希酸）、（希アルカリ）などに溶解する性質を有する。また、本発明の新規物質を、６Ｎ ＨＣｌを用いて１１０℃、１６時間加水分解し、アミノ酸自動分析計を用いてアミノ酸を検出したところ、通常のアミノ酸はほとんど検出されず、複雑な組成の分解産物を示す。また、本発明の新規物質は、融点が２７５〜２８０℃である。比旋光度は、［α］Ｄ ２３．５＝−４０°（ｃ＝０．４ｇ／１００ｍｌ；溶媒は水）、［α］Ｄ ２３．５＝−３４．５°（ｃ＝０．２ｇ／１００ｍｌ；溶媒は１Ｎ ＨＣｌ溶液）である。また、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２の混合展開溶媒を用いたシリカゲル担体の薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ）による分析においてはＲｆ値０．０３、ｎ−プロパノール：アンモニア＝７：３の混合展開溶媒を用いたＴＬＣではＲｆ値０．０６の単一のスポットを示した。
【００３５】
本発明の新規物質は、ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳで得られたスペクトルにより分子量が３１９であることが明らかになり、高分解能ＭＳで得られたスペクトルよりＣ１２Ｈ２１Ｏ７Ｎ３の分子式であることが明らかである。ニンヒドリン反応に陽性を示すためアミノ酸またはペプチドであると推定され、アミノ酸検出において複雑な組成の分解産物を示したことからペプチドではなく非タンパク性のアミノ酸であると推定され、Ｃｕ２ ＋イオンによりニンヒドリン反応が抑制されるためα−アミノ酸であると推定された。本物質の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹで得られたスペクトルの解析と、上述の種々のデータを総合した解析の結果、本物質はニコチアナミンの２’または２”−ヒドロキシ誘導体であると推定された。ＦＡＢ−ＭＳのｍ／ｚ＝３２０（Ｍ＋Ｈ）正イオンよりのプロダクトイオンスペクトル（図５）には、アゼチジン環に由来するｍ／ｚ＝５６のピークの他に、ニコチアナミンと一致するｍ／ｚ＝１１４，１２８，１８６，２０１のピークが認められた。また、ｍ／ｚ＝２４５，１９１などのピークは２”位に水酸基が存在することを示している。これらのことより、本発明の新規物質は２”−ヒドロキシニコチアナミンであると構造決定された。
【００３６】
＜そば試料＞
以下に本発明の新規物質を製造する方法について述べる。原料となるそば試料としては、植物としてのそばから派生する天然の非加工試料のみならず、そばを用いた加工食品などの加工物も、本発明の新規物質を含有するものであれば使用可能であるが、天然の非加工試料としては、そば粉、そば玄穀、そば植物体茎葉、及びそばの芽、ダッタンそばなどを挙げることができ、加工物としては、そば湯等を挙げることができる。これらのうち、そば粉が好適に用いられる。これらのそば試料は、そのままの形状で抽出工程において用いることもできるが、粉砕してから抽出工程で用いることもできる。
【００３７】
＜抽出用溶媒＞
本発明の新規物質を製造する方法の抽出工程は、そば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る工程であるが、抽出用溶媒としては、水、温水、エタノール水溶液、メタノール水溶液、希酸などの溶媒を挙げることができる。これらのうちでエタノール水溶液が好ましく、さらに、該エタノール水溶液においては、エタノールの濃度は、６０〜８０容量％であると好ましい。
【００３８】
＜抽出工程の手順＞
抽出工程は、上記したそば試料を、上記した抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る工程であり、抽出方法としては公知の方法を用いることができ特に制限されないが、抽出用溶媒とそば試料とを混合して抽出し、濾過して濾液を抽出液として得る方法、抽出用溶媒と植物試料とを混合して抽出した後、遠心分離し、得られた上澄み液を抽出液として得る方法などを挙げることができる。抽出工程を行う際、抽出用溶媒の温度としては、特に制限されないが、例えば、エタノール水溶液の場合には、５０〜１００℃のものが、抽出能が良好となるため好ましい。また、そば試料の重量１ｋｇ当たりの抽出用溶媒の体積は、多いほど抽出効率がよいが、１０倍容程度が好ましい。抽出の条件・回数等は試料により適宜設定することができ、抽出用溶媒を加えて抽出を行い、抽出液を得る操作を複数回行うことも可能である。また、エタノール水溶液により抽出を行った後、さらに、得られた抽出液に対して、ヘキサン、酢酸エチル、ジエチルエーテルなどで抽出を行って水層を得、水層を抽出液として得る方法など、前記抽出用溶媒による抽出工程の後に、１種又は２種以上の有機溶媒による抽出を１回または２回以上行って、水層を抽出液として得ることも可能である。このような有機溶媒としては、ヘキサン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、石油エーテルなどを挙げることができる。
【００３９】
＜濃縮工程＞
本発明の新規物質を製造する方法は、上記の抽出工程で得られた抽出液を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程を行った後、該濃縮液に対して、下記する分離精製工程を行う方法とすることが可能である。濃縮工程においては、抽出液をロータリーエバポレーター等の濃縮手段により濃縮して濃縮液を得る。また、得られた濃縮液に対して、ジエチルエーテルまたはヘキサンで抽出を行って水層を得、ついで、該水層に対して酢酸エチルで抽出して、水層を濃縮液として得る方法など、濃縮工程に加えて、１種又は２種以上の有機溶媒を用いて抽出を行い、濃縮液を得ることも可能である。このような有機溶媒としては、＜抽出工程の手順＞に挙げた有機溶媒を用いることができる。
【００４０】
＜溶出工程＞
また、本発明の新規物質を製造する方法は、前記抽出工程で得られた抽出液又は前記濃縮工程で得られた濃縮液に対して、陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法により、陽イオン交換樹脂に滞留する滞留物を得て、該滞留物を溶出した溶出液を得る溶出工程を行い、次いで該溶出液に対して、下記する分離精製工程を行う方法とすることができる。溶出工程においては、陽イオン交換樹脂に滞留する滞留物が、陽イオン交換樹脂に吸着する吸着物であると好ましい。
【００４１】
＜溶出工程のカラム用樹脂＞
陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法を行うに際して、カラムに充填する陽イオン交換樹脂としては、特に制限されないが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ社製）やＤｏｗｅｘ ５０（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のような強陽イオン性交換樹脂が好ましい。
【００４２】
＜溶出用の溶離剤＞
溶出用の溶離剤としては、アンモニア、ピリジン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの電解質の水溶液を挙げることができる。これらの電解質のうちでは、アンモニアが特に好ましい。また、溶離液における、電解質の濃度としては、０．５〜２．０ ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００４３】
＜溶出工程の手順＞
溶出工程は、抽出工程を経て得られる抽出液又は濃縮工程を経て得られる濃縮液をシリンジ法、バルブループ法などの公知の方法により、陽イオン交換樹脂を充填したカラムに注入して、該抽出液又は該濃縮液に含有される陽イオンに荷電する物質をカラムに滞留させ、滞留物を得て、次いで、溶出用の溶離剤をカラムに通液し、滞留物を溶出し、溶出液を得る。この際、得られた溶出液に対してＡＣＥ阻害活性を測定し、該溶出液の複数の画分のうち、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を取り出して溶出液とすることもできる。このようにして得られた溶出液に対して、下記する分離精製工程を行うことにより、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を取り出すことができる。
【００４４】
＜分離精製工程＞
前記抽出液、前記濃縮液又は前記溶出液に含まれる新規物質は、陽イオン交換樹脂に滞留あるいは吸着する性質を有することから、陽イオンに荷電する物質であると判明した。本発明の新規物質を製造する方法の分離精製工程は、前記抽出液、前記濃縮液、又は溶出液に含まれる陽イオンに荷電する物質である本発明の新規物質を、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分を得る工程である。
【００４５】
＜カラム用樹脂＞
陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法を行うに際して、カラムに充填する陰イオン交換樹脂としては、特に制限されないが、Ｄｏｗｅｘ １（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）などの強陰イオン性イオン交換樹脂が好ましい。これらの陰イオン交換樹脂は酢酸型として用いる。
【００４６】
＜分離精製工程の溶離液＞
溶離液としては、酢酸、蟻酸、塩酸、アンモニア、ピリジンなどの電解質の水溶液を挙げることができる。
【００４７】
＜分離精製工程の手順＞
分離精製工程は、抽出工程を経て得られる抽出液を公知の方法により、陽イオン交換樹脂を充填したカラムおよび陰イオン交換樹脂を充填したカラムに注入して、水での洗浄や前記溶出用電解質水溶液で溶出し、得られた画分に対してＡＣＥ阻害活性を測定し、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を得ることにより行われる。ＡＣＥ阻害活性の測定は、Ｃｕｓｈｍａｎ ＆ Ｃｈｅｕｎｇの方法など公知の方法で行うことができる。
【００４８】
＜単離工程＞
本発明の新規物質を製造する方法においては、以上の工程を経て得られたＡＣＥ阻害活性を有する画分をロータリーエバポレーター、噴霧乾燥、凍結乾燥などの公知の乾燥手段で、乾固して粉末状の物質を得る方法など公知の方法により、ＡＣＥ阻害活性を有する画分から粉末状の本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを得ることができる。しかし、ＡＣＥ阻害活性を有する画分から得られた粉末状の新規物質は、さらに、再結晶操作を行い、結晶を単離する単離工程を行い、無色結晶の新規物質を得ることが好ましい。再結晶操作に用いる溶媒としては、アセトン水溶液、メタノール水溶液、水、エタノール水溶液などの本発明の新規物質を溶解させることができる溶媒を挙げることができるが、エタノール水溶液が、再結晶操作が行いやすいため好ましい。該エタノール水溶液においては、エタノールの濃度は、エタノール水溶液を１００重量％として、通常１０〜８０容量％であり、３０〜６０容量％であると好ましい。エタノール水溶液による再結晶操作の温度条件は特に制限されないが、７０〜１００℃で粉末状の２”−ヒドロキシニコチアナミンを溶解させ、−１０〜１０℃で再結晶させる方法を採用することができる。
【００４９】
以上のように説明した本発明の新規物質を製造する方法で得られた新規物質は、前記した＜１Ｈ−ＮＭＲ＞、＜１３Ｃ−ＮＭＲ＞、＜１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ及び１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ＞、＜ＭＳ＞、＜高分解能ＭＳ＞、＜その他の理化学的性質＞に記載された理化学的性質を有するものである。
【００５０】
本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、ＡＣＥ阻害剤の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを、賦形剤、潤沢剤、結合剤、賦香剤等の薬事的に認められる担体と共に、常法により、経口投与用の錠剤、カプセル剤、トローチ剤、粉末、または細粒・顆粒剤、水溶液に溶解させた溶剤などとし、ＡＣＥ阻害剤とすることができ、該ＡＣＥ阻害剤は、血圧降下剤として使用することが可能である。前記ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤は、経口投与するか、注射剤として静脈内投与するなどして活用することができる。
【００５１】
本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、各種の飲食品の加工材料として添加することによって、パン、ケーキ、ビスケット、クッキー、菓子類、そば、うどん、中華麺などの麺類、天ぷら、フライなどの惣菜類を、健康食品とすることができる。さらに、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを、ジュース、コーヒー、ココア、ウーロン茶、緑茶、健康飲料などの飲料類に溶解させて添加することにより、健康食品とすることができる。
【００５２】
本発明の健康食品への本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンの添加量は、特に制限されないが、パン、菓子、麺、惣菜類などの食品に対しては、１０ｍｇ以上／１００グラム、また、飲料に対しては５ｍｇ以上／１００グラム加えることが好ましい。また、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、健康食品、医薬品として、そのまま利用することもできる。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。
【００５４】
実施例１
＜抽出工程＞
そば粉２Ｋｇに７０％エタノール８ｌを加え、一夜室温に放置し抽出した。濾紙を用いて濾過し、第１抽出液とした。さらに、残渣に対して同量の７０％エタノールで抽出して、濾紙を用いて濾過して抽出液を得る操作を２回行い、第２抽出液及び第３抽出液を得た。
【００５５】
＜濃縮工程＞
第１抽出液、第２抽出液及び第３抽出液を集めて、抽出液とし、該抽出液をロータリーエバポレーターを用いて約２ｌに濃縮した。
【００５６】
濃縮液を分液ロートを用いてヘキサンで抽出し、ヘキサン層と水層１とを得た。ヘキサン層と水層１との下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＡＣＥ阻害活性は水層１に存在し、ヘキサン層には活性は認められず、水層１に活性が残存した。つぎに、この水層１を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル層と水層２とを得た。酢酸エチル層と水層２との下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＡＣＥ阻害活性は水層２に存在し、酢酸エチル層には活性は認められず、水層２に活性が残存した。該水層２を濃縮液として、以下の分離精製工程を行った。
【００５７】
＜溶出工程＞
陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ＋）をカラムに充填し、十分に水で洗浄し、平衡化した。溶離液として、濃度が１ｍｏｌ／／Ｌのアンモニア水溶液を調製した。阻害活性の存在した前記濃縮液を、サンプルとして、直接前記陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ＋）のカラムに注入し、非吸着画分を水洗して集めた。また、吸着画分は濃度１ｍｏｌ／ＬのＮＨ４ＯＨ水溶液を溶出用の溶離剤として溶出し、溶出液を得た。それぞれの画分をロータリーエバポレーターで乾固するまで濃縮し、一定量の水に溶解し、下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定したところ、溶出液にのみ活性が存在した。このことから、活性成分は陽イオンに荷電する物質と判明した。
【００５８】
＜分離精製工程＞
陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ１ｘ４をカラムに充填し、十分に水洗し、平衡化した。溶離液として、０．３ｍｏｌ／Ｌの酢酸水溶液を調製した。前記溶出液をアンモニア水を用いてｐＨ８に調整し、直接前記陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ１ｘ４のカラムに注入した。純水、ついで前記溶離液をカラムに通液して、複数の画分を得た。該複数の画分に対して、下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定し、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を得た。次いで該ＡＣＥ阻害活性を有する画分に対して、繰り返し２回陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ１ｘ４のカラムによるイオン交換クロマトグラフィーを行い、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を精製した。この結果、強いＡＣＥ阻害活性を持つ物質を含む画分が得られ、ロータリーエバポレーターにより乾固したところ、強いＡＣＥ阻害活性を持つ物質が８５ｍｇ得られた。
【００５９】
＜単離工程＞
前記強いＡＣＥ阻害活性を持つ物質８５ｍｇに対して、水―エタノール混液（エタノール（４０容量％含有）を用いた２回の再結晶操作を行うことにより、４４ｍｇの無色結晶が単離された。このように単離された無色結晶については、１Ｈ−ＮＭＲ測定、１３Ｃ−ＮＭＲ測定、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ測定、１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ測定、ＭＳ測定、高分解能ＭＳ測定等を行ったところ、前記した図１〜図５に示されるスペクトルが得られるとともに、該無色結晶は、前記＜その他の理化学的性質＞に記載された理化学的性質を有する新規物質であることがわかった。該新規物質は、２”−ヒドロキシニコチアナミンであると考えられる。
【００６０】
＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞
ＡＣＥ活性の測定は、Ｃｕｓｈｍａｎ ＆ Ｃｈｅｕｎｇの方法に従い、以下に示すように行った。
（１）試薬の調製
（ｉ）本発明の新規物質、すなわち、前記無色結晶１．６０ｍｇ、０．８ｍｇ、０．４ｍｇを、水 １００ ｍｌに加えて、それぞれ本発明の新規物質の濃度が５０μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、１２．５μｍｏｌ／Ｌである試料液１、試料液２、試料液３を調製した。
（ｉｉ）ホウ酸濃度０．２ｍｏｌ／Ｌの緩衝液（ｐＨ８．３）を調製した。
（ｉｉｉ）Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ を７ｍｍｏｌ／Ｌ濃度となるように、前記緩衝液に溶解し、基質溶液を調製した。
（ｉｖ）２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ水溶液を調製した。
（ｖ）ＡＣＥはＳｉｇｍａ社のウサギ肺からの凍結乾燥品を使用し、該ＡＣＥ １ＩＵを、前記緩衝液６．６７ｍｌに加えて、ＡＣＥ活性 １５０ｍＩＵ／ｍｌの酵素溶液を調製した。
（２）反応組成液
（ｉ）基質溶液；５００μｌ
（ｉｉ）２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液；４００μｌ
（ｉｉｉ）試料液１〜３；それぞれ３０μｌ
（ｉｖ）水；４０μｌ
（ｖ）酵素溶液；３０μｌ
（３）反応条件
上記反応組成液の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を混和したのち、プレインキュベーションなしに、（ｖ）の酵素液を加え、３７℃で３０分反応（インキュベーション）させる。次いで１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を５００μｌ加え、反応を停止する。その後、酢酸エチル ３ｍｌで遊離した馬尿酸を抽出した。抽出液を、遠心エバポレーターで蒸発乾固し、水 １ｍｌに溶解して２２８ｎｍでの吸光度を分光光度計によって測定した。測定した吸光度をＯＤｓ（試料液１〜３を用いた反応についてそれぞれＯＤｓ１、ＯＤｓ２、及びＯＤｓ３）とした。
（４）コントロール測定
上記（３）の反応液の（ｉｉｉ）試料液の代わりに水３０μｌを用い、その他は（３）と全く同じ条件で反応を行い、得られた２２８ｎｍでの吸光度をＯｄｃとした。
（５）ブランク測定
上記反応組成液の（ｉ）〜（ｉｖ）を混和して、３７℃で３０分間反応させ、１ｍｏｌ／ＬＨＣｌで反応を停止させた後、（ｖ）の酵素液を加えた。これを（３）と同様に酢酸エチルで抽出した。それ以後の操作は（３）と同じである。得られた２２８ｎｍの吸光度をＯＤｂとした。
（６）ＡＣＥ阻害率５０％（ＩＣ５０）を示す本発明の新規物質の濃度の決定
Ｏｄｓ１，Ｏｄｓ２，Ｏｄｓ３の阻害率を下記式（４）；
ＡＣＥ阻害率（％）＝｛１−（Ｏｄｓ−ＯＤｂ）／（ＯＤｃ−ＯＤｂ）｝× １００ （４）
によって求め、グラフに外挿することにより阻害率５０％を示す本発明の新規物質の濃度を決定した。その結果、阻害率５０％（ＩＣ５０）を示すＡＣＥ阻害活性を示す本発明の新規物質の濃度は、０．０８μｍｏｌ／Ｌであった。
【００６１】
比較例１
（１）試薬の調製において、ニコチアナミン１．５１ｍｇ、０．７６ｍｇ、０．３８ｍｇを、水１００ｍｌに加えて、それぞれニコチアナミンの濃度が５０μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、１２．５μｍｏｌ／Ｌである試料液４、試料液５、試料液６を調製し、該試料液４〜６を、（２）反応組成液の（ｉｉｉ）試料液として、（３）反応条件において用いた以外には、すべて実施例１と同様に、＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞の測定を行った。その結果、試料液４〜６の吸光度ＯＤｓ（ＯＤｓ４、ＯＤｓ５、ＯＤｓ６）として、実施例１で求めたＯＤｃとＯＤｂと上記式（４）から、阻害率５０％（ＩＣ５０）を示すＡＣＥ阻害活性を示すニコチアナミンの濃度は、０．０８５μｍｏｌ／Ｌであった。
【００６２】
以上行われた実施例１及び比較例１の結果から、本発明の新規物質（２”−ヒドロキシニコチアナミン）のＡＣＥ阻害活性のＩＣ５０は０．０８μＭであり、同条件でのニコチアナミンのＩＣ５０、０．０８５μＭとほぼ同等かより強い阻害活性を持つことが示された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、ＡＣＥ阻害活性を有する。また、本発明の新規物質を製造する方法は、ＡＣＥ阻害活性を有する２”−ヒドロキシニコチアナミンを製造することができるという効果を奏するものである。さらに、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有させることによりアンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤とすることができ、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを含有させることにより健康食品とすることができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規物質の１Ｈ−ＮＭＲ測定スペクトルを示す図である。
【図２】本発明の新規物質の１３Ｃ−ＮＭＲ測定スペクトルを示す図である。
【図３】本発明の新規物質の１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルを示す図である。
【図４】本発明の新規物質の１３Ｃ −１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルを示す図である。
【図５】本発明の新規物質のＦＡＢ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）−ＭＳによる、ｍ／ｚ３２０（Ｍ＋Ｈ）＋よりのポジティブプロダクトイオンスペクトルを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質、該新規物質又は該新規物質の含有物を製造する方法、並びに該新規物質を有効成分として含有する血圧降下剤、及び該新規物質を含有する健康食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内における昇圧系の一つであり、人の重要な血圧調節系として知られるレニンーアンジオテンシン系は、アンジオテンシン変換酵素（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ 以下ＡＣＥと略記する。）が、アンジオテンシン−Ｉに作用して、強い血圧上昇作用を有するアンジオテンシン−ＩＩを生じさせるので、ＡＣＥの活性を抑制する作用を有する物質が、血圧降下剤として本態性高血圧症等の治療において、実用化されている。しかしながら、これらの薬剤は、めまい、立ちくらみ、悪心、口渇、過度の鎮静などの副作用が避けられないのが現状である。
【０００３】
１９７１年にノマら［Ｍ． Ｎｏｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｎｏ． ２２， ｐｐ２０１７−２０２０（１９７１）］によってタバコ葉中から抽出されたニコチアナミンは、下記式（２）；
【０００４】
【化２】
で表される天然の化合物であり、副作用の恐れが少ないとともに、ＡＣＥの活性を抑制する作用を有しており、血圧降下作用を有している可能性が高いものである。そこで、大豆を水又は熱水で抽出して抽出液を得て、該抽出液のニコチアナミンを合成吸着樹脂により、分別、採取するニコチアナミンの製造方法が、特開平５−２４６８６５号公報（特許文献１）において記載されている。
【０００６】
そばは古くより栄養価が高く、健康に良い食品と考えられているが、そばの栄養成分については、タンパク質含有量が他の穀類よりも高く、そのアミノ酸価は９２であり、精白米の６５や小麦粉の４１と比べて非常に高く、そばに含まれるタンパク質は良質タンパクである。また、そばは、食物繊維が他の穀物よりも多い他、そばタンパク質には食物繊維様の作用があり、コレステロール吸収の阻害などが報告されている。そばの機能成分では、古くよりビタミンＣとの協奏作用により毛細血管を強化するとされるルチンが知られているが、最近の研究成果ではルチンを含めた多くのポリフェノールが単離同定され、それらの抗酸化作用による機能性が注目されている。
【０００７】
レニンーアンジオテンシン系とそばとの関係については、そば熱水抽出物やそばタンパク質加水分解物がＡＣＥ阻害能を有することが報告され、そばの血圧降下作用はルチンやペプチド類によるものと考えられてきた。
【０００８】
そばについては、さらに、そば脱穀種子又はそば粉を、水又は熱水による抽出液を、ゲル濾過によるカラムクロマトグラフィーにより分画し、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を分取する操作を行い、得られた画分について、吸着カラムクロマトグラフィーによって分画し、ＡＣＥ阻害活性の強い画分を分取し、さらに該画分を、ゲル濾過によるカラムクロマトグラフィーにより分画し、ＡＣＥ阻害活性の強い画分を分取する操作を行って、下記式（３）；
【０００９】
【化３】
で表され、ＡＣＥ阻害活性を有しており、血圧降下作用を有する可能性が高い天然の新規物質が、特開平５−９７７９８号公報（特許文献２）において記載されている。
【００１１】
これらのＡＣＥ阻害活性を有する天然の化合物は、血圧降下剤、健康食品などに有用に用いられる可能性が高い化合物であるが、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質の探索は十分に行われているとは言えず、さらなるＡＣＥ阻害活性を有する新規物質の探索が必要とされている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質、該新規物質又は該新規物質の含有物を製造する方法、並びに該新規物質を有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤、及び該新規物質を含有する健康食品を提供することをその目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、そば粉、そば玄穀、そば茎葉、そばの芽、ダッタンそば粉、ダッタンそば玄穀、ダッタンそば茎葉、そば湯等のそば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る抽出工程を行い、次いで、該抽出液に対して、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりＡＣＥ阻害活性を有する画分を得る分離精製工程を行うことにより得られた物質が、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質であること、及び該新規物質が２”−ヒドロキシニコチアナミンであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明（１）は、下記式（１）；
【００１５】
【化４】
で表される２”−ヒドロキシニコチアナミンを提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（１）は、ＡＣＥ阻害活性を有する新規物質を提供することができるという効果を奏するものである。
【００１７】
また、本発明（２）は、そば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る抽出工程を行い、次いで、該抽出液に対して、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分を得る分離精製工程を行う２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（２）は、ＡＣＥ阻害活性を有する２”−ヒドロキシニコチアナミンを製造することができるという効果を奏するものである。
【００１８】
また、本発明（３）は、前記抽出用溶媒が、エタノール水溶液である前記発明（２）記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（３）は、前記発明（２）が奏する効果に加えて、抽出工程における抽出能を向上させることができるという効果を奏するものである。
【００１９】
また、本発明（４）は、前記抽出液を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程を行った後、該濃縮液に対して、前記分離精製工程を行う前記発明（２）又は（３）記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（４）は、前記発明（２）又は（３）が奏する効果に加えて、分離精製工程におけるサンプルの体積量を少なくすることができるという効果を奏するものである。
【００２０】
また、本発明（５）は、前記分離精製工程を２回以上行う前記発明（２）〜（４）のいずれかに記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（５）は、前記発明（２）〜（４）のいずれかが奏する効果に加えて、得られる生成物中に含まれる夾雑物を減少させることができるという効果を奏するものである。
【００２１】
また、本発明（６）は、前記抽出液又は前記濃縮液に対して、陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法により、陽イオン交換樹脂に滞留する滞留物を得て、該滞留物を溶出した溶出液を得る溶出工程を行い、次いで該溶出液に対して、前記分離精製工程を行う前記発明（２）〜（５）のいずれかに記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（６）は、前記発明（２）〜（５）のいずれかが奏する効果に加えて、陽イオン交換樹脂に滞留しない物質を除去することができるため、得られる生成物中に含まれる夾雑物を減少させることができるという効果を奏するものである。
【００２２】
また、本発明（７）は、前記抽出工程又は前記濃縮工程の後に、得られた抽出液又は濃縮液に対して、１種又は２種以上の有機溶媒による抽出を１回または２回以上行って、水層を抽出液又は濃縮液として得る前記発明（２）〜（６）のいずれかに記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（７）は、前記発明（２）〜（６）のいずれかが奏する効果に加えて、脱脂を行うことにより、得られる生成物中に含まれる夾雑物を減少させることができるという効果を奏するものである。
【００２３】
また、本発明（８）は、前記分離精製工程を行った後、さらに、前記アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分に対して再結晶操作を行い、結晶を単離する単離工程を行う前記発明（２）〜（７）のいずれか記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（８）は、前記発明（２）〜（７）のいずれかが奏する効果に加えて、純度の高い２”−ヒドロキシニコチアナミンを得ることができるという効果を奏するものである。
【００２４】
また、本発明（９）は、前記単離工程において、再結晶操作に用いる溶媒がエタノール水溶液である前記発明（８）に記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法を提供するものである。かかる構成を採ることにより、本発明（９）は、前記発明（８）が奏する効果に加えて、再結晶操作で得られる２”−ヒドロキシニコチアナミン量を増加させることができるという効果を奏する。
【００２５】
また、本発明（１０）は、前記発明（１）の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供するものである。
【００２６】
また、本発明（１１）は、前記発明（１）の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有する血圧降下剤を提供するものである。
【００２７】
また、本発明（１２）は、前記発明（１）の２”−ヒドロキシニコチアナミンを含有する健康食品を提供するものである。
【００２８】
【実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を述べるが、本発明はこれら実施の形態により制限されない。本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミン（以下、新規物質とも言う）は、以下の理化学的性質を有する。
【００２９】
＜１Ｈ−ＮＭＲ＞｛重水液中中で（ＴＭＳＰ）を内部標準物質として測定、２７０ＭＨｚ カッコ内は多重度、結合定数、および帰属｝
本発明の新規物質の１Ｈ−ＮＭＲピークは、δ２．０５〜２．３ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２’）、δ２．４〜２．８５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、δ３．２５〜３．５３ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１”ａｎｄＨ−１’）、δ３．８５ｐｐｍ （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７８Ｈｚ，Ｊ＝８．４２Ｈｚ，Ｈ−３’）、δ３．９２〜４．１５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、δ４．０１ｐｐｍ （１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ−３”）、δ４．４２〜４．４８ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２”）、δ４．７７ｐｐｍ （１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５７Ｈｚ，Ｈ−２）であり、１Ｈ−ＮＭＲ測定スペクトルを図１に示す。
【００３０】
＜１３Ｃ−ＮＭＲ＞
｛重水液中で（ＴＭＳＰ）を内部標準物質として測定、６８ＭＨｚ カッコ内は帰属｝
本発明の新規物質の１３Ｃ−ＮＭＲピークは、δ２３．９ｐｐｍ（Ｃ−３ ）、δ２７．６ｐｐｍ（Ｃ−２’ ）、δ５１．２ｐｐｍ（Ｃ−１” ）、δ５３．４ｐｐｍ（Ｃ−４ ）、δ５４．１ｐｐｍ（Ｃ−１’）、δ６０．５ｐｐｍ（Ｃ−３” ）、δ６２．４ｐｐｍ（Ｃ−３’）、δ６８．３ｐｐｍ（Ｃ−２”）、δ６９．７ｐｐｍ（Ｃ−２）、δ１７３．３ｐｐｍ（Ｃ−４”）、δ１７４．９ｐｐｍ（Ｃ−４’）、δ１７６．０ｐｐｍ（Ｃ−１）であり、１３Ｃ−ＮＭＲ測定スペクトルを図２に示す。
【００３１】
＜１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ及び１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ＞
また、本発明の新規物質は、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹにより図３に示す１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルが、１３Ｃ −１Ｈ ＣＯＳＹにより図４に示す１３Ｃ −１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルが得られるものである。
【００３２】
＜ＭＳ＞
本発明の新規物質を、ＦＡＢ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）−ＭＳ、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−ＭＳによりマススペクトルを測定したところ、ＦＡＢ−ＭＳにおいて、ｍ／ｚ＝３２０に弱い（Ｍ＋Ｈ）のピークが認められた。また、ＥＳＩ−ＭＳにおいても、ｍ／ｚ＝３２０が（Ｍ＋Ｈ）のピークであることが確認された。
【００３３】
＜高分解能ＭＳ＞
また、高分解能ＦＡＢ−ＭＳにより（Ｍ＋Ｈ）イオンのピークはｍ／ｚ＝３２０．１４５８であり、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ７Ｎ３から計算される質量数３２０．１４５８と一致し、分子式がＣ１２Ｈ２１Ｏ７Ｎ３と決定された。
【００３４】
＜その他の理化学的性質＞
本発明の新規物質は、ニンヒドリン反応に陽性を示すが、Ｃｕ２＋イオンによりニンヒドリン反応が抑制される。また、本発明の新規物質は、水、（希酸）、（希アルカリ）などに溶解する性質を有する。また、本発明の新規物質を、６Ｎ ＨＣｌを用いて１１０℃、１６時間加水分解し、アミノ酸自動分析計を用いてアミノ酸を検出したところ、通常のアミノ酸はほとんど検出されず、複雑な組成の分解産物を示す。また、本発明の新規物質は、融点が２７５〜２８０℃である。比旋光度は、［α］Ｄ ２３．５＝−４０°（ｃ＝０．４ｇ／１００ｍｌ；溶媒は水）、［α］Ｄ ２３．５＝−３４．５°（ｃ＝０．２ｇ／１００ｍｌ；溶媒は１Ｎ ＨＣｌ溶液）である。また、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２の混合展開溶媒を用いたシリカゲル担体の薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ）による分析においてはＲｆ値０．０３、ｎ−プロパノール：アンモニア＝７：３の混合展開溶媒を用いたＴＬＣではＲｆ値０．０６の単一のスポットを示した。
【００３５】
本発明の新規物質は、ＦＡＢ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳで得られたスペクトルにより分子量が３１９であることが明らかになり、高分解能ＭＳで得られたスペクトルよりＣ１２Ｈ２１Ｏ７Ｎ３の分子式であることが明らかである。ニンヒドリン反応に陽性を示すためアミノ酸またはペプチドであると推定され、アミノ酸検出において複雑な組成の分解産物を示したことからペプチドではなく非タンパク性のアミノ酸であると推定され、Ｃｕ２ ＋イオンによりニンヒドリン反応が抑制されるためα−アミノ酸であると推定された。本物質の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ、１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹで得られたスペクトルの解析と、上述の種々のデータを総合した解析の結果、本物質はニコチアナミンの２’または２”−ヒドロキシ誘導体であると推定された。ＦＡＢ−ＭＳのｍ／ｚ＝３２０（Ｍ＋Ｈ）正イオンよりのプロダクトイオンスペクトル（図５）には、アゼチジン環に由来するｍ／ｚ＝５６のピークの他に、ニコチアナミンと一致するｍ／ｚ＝１１４，１２８，１８６，２０１のピークが認められた。また、ｍ／ｚ＝２４５，１９１などのピークは２”位に水酸基が存在することを示している。これらのことより、本発明の新規物質は２”−ヒドロキシニコチアナミンであると構造決定された。
【００３６】
＜そば試料＞
以下に本発明の新規物質を製造する方法について述べる。原料となるそば試料としては、植物としてのそばから派生する天然の非加工試料のみならず、そばを用いた加工食品などの加工物も、本発明の新規物質を含有するものであれば使用可能であるが、天然の非加工試料としては、そば粉、そば玄穀、そば植物体茎葉、及びそばの芽、ダッタンそばなどを挙げることができ、加工物としては、そば湯等を挙げることができる。これらのうち、そば粉が好適に用いられる。これらのそば試料は、そのままの形状で抽出工程において用いることもできるが、粉砕してから抽出工程で用いることもできる。
【００３７】
＜抽出用溶媒＞
本発明の新規物質を製造する方法の抽出工程は、そば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る工程であるが、抽出用溶媒としては、水、温水、エタノール水溶液、メタノール水溶液、希酸などの溶媒を挙げることができる。これらのうちでエタノール水溶液が好ましく、さらに、該エタノール水溶液においては、エタノールの濃度は、６０〜８０容量％であると好ましい。
【００３８】
＜抽出工程の手順＞
抽出工程は、上記したそば試料を、上記した抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る工程であり、抽出方法としては公知の方法を用いることができ特に制限されないが、抽出用溶媒とそば試料とを混合して抽出し、濾過して濾液を抽出液として得る方法、抽出用溶媒と植物試料とを混合して抽出した後、遠心分離し、得られた上澄み液を抽出液として得る方法などを挙げることができる。抽出工程を行う際、抽出用溶媒の温度としては、特に制限されないが、例えば、エタノール水溶液の場合には、５０〜１００℃のものが、抽出能が良好となるため好ましい。また、そば試料の重量１ｋｇ当たりの抽出用溶媒の体積は、多いほど抽出効率がよいが、１０倍容程度が好ましい。抽出の条件・回数等は試料により適宜設定することができ、抽出用溶媒を加えて抽出を行い、抽出液を得る操作を複数回行うことも可能である。また、エタノール水溶液により抽出を行った後、さらに、得られた抽出液に対して、ヘキサン、酢酸エチル、ジエチルエーテルなどで抽出を行って水層を得、水層を抽出液として得る方法など、前記抽出用溶媒による抽出工程の後に、１種又は２種以上の有機溶媒による抽出を１回または２回以上行って、水層を抽出液として得ることも可能である。このような有機溶媒としては、ヘキサン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、石油エーテルなどを挙げることができる。
【００３９】
＜濃縮工程＞
本発明の新規物質を製造する方法は、上記の抽出工程で得られた抽出液を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程を行った後、該濃縮液に対して、下記する分離精製工程を行う方法とすることが可能である。濃縮工程においては、抽出液をロータリーエバポレーター等の濃縮手段により濃縮して濃縮液を得る。また、得られた濃縮液に対して、ジエチルエーテルまたはヘキサンで抽出を行って水層を得、ついで、該水層に対して酢酸エチルで抽出して、水層を濃縮液として得る方法など、濃縮工程に加えて、１種又は２種以上の有機溶媒を用いて抽出を行い、濃縮液を得ることも可能である。このような有機溶媒としては、＜抽出工程の手順＞に挙げた有機溶媒を用いることができる。
【００４０】
＜溶出工程＞
また、本発明の新規物質を製造する方法は、前記抽出工程で得られた抽出液又は前記濃縮工程で得られた濃縮液に対して、陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法により、陽イオン交換樹脂に滞留する滞留物を得て、該滞留物を溶出した溶出液を得る溶出工程を行い、次いで該溶出液に対して、下記する分離精製工程を行う方法とすることができる。溶出工程においては、陽イオン交換樹脂に滞留する滞留物が、陽イオン交換樹脂に吸着する吸着物であると好ましい。
【００４１】
＜溶出工程のカラム用樹脂＞
陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法を行うに際して、カラムに充填する陽イオン交換樹脂としては、特に制限されないが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ社製）やＤｏｗｅｘ ５０（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のような強陽イオン性交換樹脂が好ましい。
【００４２】
＜溶出用の溶離剤＞
溶出用の溶離剤としては、アンモニア、ピリジン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの電解質の水溶液を挙げることができる。これらの電解質のうちでは、アンモニアが特に好ましい。また、溶離液における、電解質の濃度としては、０．５〜２．０ ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００４３】
＜溶出工程の手順＞
溶出工程は、抽出工程を経て得られる抽出液又は濃縮工程を経て得られる濃縮液をシリンジ法、バルブループ法などの公知の方法により、陽イオン交換樹脂を充填したカラムに注入して、該抽出液又は該濃縮液に含有される陽イオンに荷電する物質をカラムに滞留させ、滞留物を得て、次いで、溶出用の溶離剤をカラムに通液し、滞留物を溶出し、溶出液を得る。この際、得られた溶出液に対してＡＣＥ阻害活性を測定し、該溶出液の複数の画分のうち、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を取り出して溶出液とすることもできる。このようにして得られた溶出液に対して、下記する分離精製工程を行うことにより、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を取り出すことができる。
【００４４】
＜分離精製工程＞
前記抽出液、前記濃縮液又は前記溶出液に含まれる新規物質は、陽イオン交換樹脂に滞留あるいは吸着する性質を有することから、陽イオンに荷電する物質であると判明した。本発明の新規物質を製造する方法の分離精製工程は、前記抽出液、前記濃縮液、又は溶出液に含まれる陽イオンに荷電する物質である本発明の新規物質を、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分を得る工程である。
【００４５】
＜カラム用樹脂＞
陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法を行うに際して、カラムに充填する陰イオン交換樹脂としては、特に制限されないが、Ｄｏｗｅｘ １（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）などの強陰イオン性イオン交換樹脂が好ましい。これらの陰イオン交換樹脂は酢酸型として用いる。
【００４６】
＜分離精製工程の溶離液＞
溶離液としては、酢酸、蟻酸、塩酸、アンモニア、ピリジンなどの電解質の水溶液を挙げることができる。
【００４７】
＜分離精製工程の手順＞
分離精製工程は、抽出工程を経て得られる抽出液を公知の方法により、陽イオン交換樹脂を充填したカラムおよび陰イオン交換樹脂を充填したカラムに注入して、水での洗浄や前記溶出用電解質水溶液で溶出し、得られた画分に対してＡＣＥ阻害活性を測定し、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を得ることにより行われる。ＡＣＥ阻害活性の測定は、Ｃｕｓｈｍａｎ ＆ Ｃｈｅｕｎｇの方法など公知の方法で行うことができる。
【００４８】
＜単離工程＞
本発明の新規物質を製造する方法においては、以上の工程を経て得られたＡＣＥ阻害活性を有する画分をロータリーエバポレーター、噴霧乾燥、凍結乾燥などの公知の乾燥手段で、乾固して粉末状の物質を得る方法など公知の方法により、ＡＣＥ阻害活性を有する画分から粉末状の本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを得ることができる。しかし、ＡＣＥ阻害活性を有する画分から得られた粉末状の新規物質は、さらに、再結晶操作を行い、結晶を単離する単離工程を行い、無色結晶の新規物質を得ることが好ましい。再結晶操作に用いる溶媒としては、アセトン水溶液、メタノール水溶液、水、エタノール水溶液などの本発明の新規物質を溶解させることができる溶媒を挙げることができるが、エタノール水溶液が、再結晶操作が行いやすいため好ましい。該エタノール水溶液においては、エタノールの濃度は、エタノール水溶液を１００重量％として、通常１０〜８０容量％であり、３０〜６０容量％であると好ましい。エタノール水溶液による再結晶操作の温度条件は特に制限されないが、７０〜１００℃で粉末状の２”−ヒドロキシニコチアナミンを溶解させ、−１０〜１０℃で再結晶させる方法を採用することができる。
【００４９】
以上のように説明した本発明の新規物質を製造する方法で得られた新規物質は、前記した＜１Ｈ−ＮＭＲ＞、＜１３Ｃ−ＮＭＲ＞、＜１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ及び１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ＞、＜ＭＳ＞、＜高分解能ＭＳ＞、＜その他の理化学的性質＞に記載された理化学的性質を有するものである。
【００５０】
本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、ＡＣＥ阻害剤の有効成分とすることができる。すなわち、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを、賦形剤、潤沢剤、結合剤、賦香剤等の薬事的に認められる担体と共に、常法により、経口投与用の錠剤、カプセル剤、トローチ剤、粉末、または細粒・顆粒剤、水溶液に溶解させた溶剤などとし、ＡＣＥ阻害剤とすることができ、該ＡＣＥ阻害剤は、血圧降下剤として使用することが可能である。前記ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤は、経口投与するか、注射剤として静脈内投与するなどして活用することができる。
【００５１】
本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、各種の飲食品の加工材料として添加することによって、パン、ケーキ、ビスケット、クッキー、菓子類、そば、うどん、中華麺などの麺類、天ぷら、フライなどの惣菜類を、健康食品とすることができる。さらに、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを、ジュース、コーヒー、ココア、ウーロン茶、緑茶、健康飲料などの飲料類に溶解させて添加することにより、健康食品とすることができる。
【００５２】
本発明の健康食品への本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンの添加量は、特に制限されないが、パン、菓子、麺、惣菜類などの食品に対しては、１０ｍｇ以上／１００グラム、また、飲料に対しては５ｍｇ以上／１００グラム加えることが好ましい。また、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、健康食品、医薬品として、そのまま利用することもできる。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。
【００５４】
実施例１
＜抽出工程＞
そば粉２Ｋｇに７０％エタノール８ｌを加え、一夜室温に放置し抽出した。濾紙を用いて濾過し、第１抽出液とした。さらに、残渣に対して同量の７０％エタノールで抽出して、濾紙を用いて濾過して抽出液を得る操作を２回行い、第２抽出液及び第３抽出液を得た。
【００５５】
＜濃縮工程＞
第１抽出液、第２抽出液及び第３抽出液を集めて、抽出液とし、該抽出液をロータリーエバポレーターを用いて約２ｌに濃縮した。
【００５６】
濃縮液を分液ロートを用いてヘキサンで抽出し、ヘキサン層と水層１とを得た。ヘキサン層と水層１との下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＡＣＥ阻害活性は水層１に存在し、ヘキサン層には活性は認められず、水層１に活性が残存した。つぎに、この水層１を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル層と水層２とを得た。酢酸エチル層と水層２との下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＡＣＥ阻害活性は水層２に存在し、酢酸エチル層には活性は認められず、水層２に活性が残存した。該水層２を濃縮液として、以下の分離精製工程を行った。
【００５７】
＜溶出工程＞
陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ＋）をカラムに充填し、十分に水で洗浄し、平衡化した。溶離液として、濃度が１ｍｏｌ／／Ｌのアンモニア水溶液を調製した。阻害活性の存在した前記濃縮液を、サンプルとして、直接前記陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ＋）のカラムに注入し、非吸着画分を水洗して集めた。また、吸着画分は濃度１ｍｏｌ／ＬのＮＨ４ＯＨ水溶液を溶出用の溶離剤として溶出し、溶出液を得た。それぞれの画分をロータリーエバポレーターで乾固するまで濃縮し、一定量の水に溶解し、下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定したところ、溶出液にのみ活性が存在した。このことから、活性成分は陽イオンに荷電する物質と判明した。
【００５８】
＜分離精製工程＞
陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ１ｘ４をカラムに充填し、十分に水洗し、平衡化した。溶離液として、０．３ｍｏｌ／Ｌの酢酸水溶液を調製した。前記溶出液をアンモニア水を用いてｐＨ８に調整し、直接前記陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ１ｘ４のカラムに注入した。純水、ついで前記溶離液をカラムに通液して、複数の画分を得た。該複数の画分に対して、下記する＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞に従ってＡＣＥ阻害活性を測定し、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を得た。次いで該ＡＣＥ阻害活性を有する画分に対して、繰り返し２回陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ１ｘ４のカラムによるイオン交換クロマトグラフィーを行い、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を精製した。この結果、強いＡＣＥ阻害活性を持つ物質を含む画分が得られ、ロータリーエバポレーターにより乾固したところ、強いＡＣＥ阻害活性を持つ物質が８５ｍｇ得られた。
【００５９】
＜単離工程＞
前記強いＡＣＥ阻害活性を持つ物質８５ｍｇに対して、水―エタノール混液（エタノール（４０容量％含有）を用いた２回の再結晶操作を行うことにより、４４ｍｇの無色結晶が単離された。このように単離された無色結晶については、１Ｈ−ＮＭＲ測定、１３Ｃ−ＮＭＲ測定、１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹ測定、１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ測定、ＭＳ測定、高分解能ＭＳ測定等を行ったところ、前記した図１〜図５に示されるスペクトルが得られるとともに、該無色結晶は、前記＜その他の理化学的性質＞に記載された理化学的性質を有する新規物質であることがわかった。該新規物質は、２”−ヒドロキシニコチアナミンであると考えられる。
【００６０】
＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞
ＡＣＥ活性の測定は、Ｃｕｓｈｍａｎ ＆ Ｃｈｅｕｎｇの方法に従い、以下に示すように行った。
（１）試薬の調製
（ｉ）本発明の新規物質、すなわち、前記無色結晶１．６０ｍｇ、０．８ｍｇ、０．４ｍｇを、水 １００ ｍｌに加えて、それぞれ本発明の新規物質の濃度が５０μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、１２．５μｍｏｌ／Ｌである試料液１、試料液２、試料液３を調製した。
（ｉｉ）ホウ酸濃度０．２ｍｏｌ／Ｌの緩衝液（ｐＨ８．３）を調製した。
（ｉｉｉ）Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ を７ｍｍｏｌ／Ｌ濃度となるように、前記緩衝液に溶解し、基質溶液を調製した。
（ｉｖ）２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ水溶液を調製した。
（ｖ）ＡＣＥはＳｉｇｍａ社のウサギ肺からの凍結乾燥品を使用し、該ＡＣＥ １ＩＵを、前記緩衝液６．６７ｍｌに加えて、ＡＣＥ活性 １５０ｍＩＵ／ｍｌの酵素溶液を調製した。
（２）反応組成液
（ｉ）基質溶液；５００μｌ
（ｉｉ）２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液；４００μｌ
（ｉｉｉ）試料液１〜３；それぞれ３０μｌ
（ｉｖ）水；４０μｌ
（ｖ）酵素溶液；３０μｌ
（３）反応条件
上記反応組成液の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を混和したのち、プレインキュベーションなしに、（ｖ）の酵素液を加え、３７℃で３０分反応（インキュベーション）させる。次いで１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を５００μｌ加え、反応を停止する。その後、酢酸エチル ３ｍｌで遊離した馬尿酸を抽出した。抽出液を、遠心エバポレーターで蒸発乾固し、水 １ｍｌに溶解して２２８ｎｍでの吸光度を分光光度計によって測定した。測定した吸光度をＯＤｓ（試料液１〜３を用いた反応についてそれぞれＯＤｓ１、ＯＤｓ２、及びＯＤｓ３）とした。
（４）コントロール測定
上記（３）の反応液の（ｉｉｉ）試料液の代わりに水３０μｌを用い、その他は（３）と全く同じ条件で反応を行い、得られた２２８ｎｍでの吸光度をＯｄｃとした。
（５）ブランク測定
上記反応組成液の（ｉ）〜（ｉｖ）を混和して、３７℃で３０分間反応させ、１ｍｏｌ／ＬＨＣｌで反応を停止させた後、（ｖ）の酵素液を加えた。これを（３）と同様に酢酸エチルで抽出した。それ以後の操作は（３）と同じである。得られた２２８ｎｍの吸光度をＯＤｂとした。
（６）ＡＣＥ阻害率５０％（ＩＣ５０）を示す本発明の新規物質の濃度の決定
Ｏｄｓ１，Ｏｄｓ２，Ｏｄｓ３の阻害率を下記式（４）；
ＡＣＥ阻害率（％）＝｛１−（Ｏｄｓ−ＯＤｂ）／（ＯＤｃ−ＯＤｂ）｝× １００ （４）
によって求め、グラフに外挿することにより阻害率５０％を示す本発明の新規物質の濃度を決定した。その結果、阻害率５０％（ＩＣ５０）を示すＡＣＥ阻害活性を示す本発明の新規物質の濃度は、０．０８μｍｏｌ／Ｌであった。
【００６１】
比較例１
（１）試薬の調製において、ニコチアナミン１．５１ｍｇ、０．７６ｍｇ、０．３８ｍｇを、水１００ｍｌに加えて、それぞれニコチアナミンの濃度が５０μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、１２．５μｍｏｌ／Ｌである試料液４、試料液５、試料液６を調製し、該試料液４〜６を、（２）反応組成液の（ｉｉｉ）試料液として、（３）反応条件において用いた以外には、すべて実施例１と同様に、＜ＡＣＥ阻害活性の測定＞の測定を行った。その結果、試料液４〜６の吸光度ＯＤｓ（ＯＤｓ４、ＯＤｓ５、ＯＤｓ６）として、実施例１で求めたＯＤｃとＯＤｂと上記式（４）から、阻害率５０％（ＩＣ５０）を示すＡＣＥ阻害活性を示すニコチアナミンの濃度は、０．０８５μｍｏｌ／Ｌであった。
【００６２】
以上行われた実施例１及び比較例１の結果から、本発明の新規物質（２”−ヒドロキシニコチアナミン）のＡＣＥ阻害活性のＩＣ５０は０．０８μＭであり、同条件でのニコチアナミンのＩＣ５０、０．０８５μＭとほぼ同等かより強い阻害活性を持つことが示された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンは、ＡＣＥ阻害活性を有する。また、本発明の新規物質を製造する方法は、ＡＣＥ阻害活性を有する２”−ヒドロキシニコチアナミンを製造することができるという効果を奏するものである。さらに、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有させることによりアンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤とすることができ、本発明の２”−ヒドロキシニコチアナミンを含有させることにより健康食品とすることができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規物質の１Ｈ−ＮＭＲ測定スペクトルを示す図である。
【図２】本発明の新規物質の１３Ｃ−ＮＭＲ測定スペクトルを示す図である。
【図３】本発明の新規物質の１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルを示す図である。
【図４】本発明の新規物質の１３Ｃ −１Ｈ ＣＯＳＹスペクトルを示す図である。
【図５】本発明の新規物質のＦＡＢ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）−ＭＳによる、ｍ／ｚ３２０（Ｍ＋Ｈ）＋よりのポジティブプロダクトイオンスペクトルを示す図である。
Claims (12)
- 下記式（１）；
- そば試料を抽出用溶媒により抽出して抽出液を得る抽出工程を行い、次いで、該抽出液に対して、陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法による分離精製によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分を得る分離精製工程を行うことを特徴とする２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 前記抽出用溶媒が、エタノール水溶液であることを特徴とする請求項２記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 前記抽出液を濃縮して濃縮液を得る濃縮工程を行った後、該濃縮液に対して、前記分離精製工程を行うことを特徴とする請求項２又は３記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 前記分離精製工程を２回以上行うことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 前記抽出液又は前記濃縮液に対して、陽イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー法により、陽イオン交換樹脂に滞留する滞留物を得て、該滞留物を溶出した溶出液を得る溶出工程を行い、次いで該溶出液に対して、前記分離精製工程を行うことを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 前記抽出工程又は前記濃縮工程の後に、得られた抽出液又は濃縮液に対して、１種又は２種以上の有機溶媒による抽出を１回または２回以上行って、水層を抽出液又は濃縮液として得ることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 前記分離精製工程を行った後、さらに、前記アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する画分に対して再結晶操作を行い、結晶を単離する単離工程を行うことを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 前記単離工程において、再結晶操作に用いる溶媒がエタノール水溶液であることを特徴とする請求項８に記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンの製造方法。
- 請求項１記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
- 請求項１記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンを有効成分として含有する血圧降下剤。
- 請求項１記載の２”−ヒドロキシニコチアナミンを含有する健康食品。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003128838A JP2004331556A (ja) | 2003-05-07 | 2003-05-07 | ２”−ヒドロキシニコチアナミン、その製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び健康食品 |
| KR1020057020993A KR20060008987A (ko) | 2003-05-07 | 2004-03-22 | 2”-히드록시 니코틴아민, 그 제조방법 및 앤지오텐신변환효소 저해제, 혈압 강하제 및 건강식품 |
| EP04722438A EP1623974A1 (en) | 2003-05-07 | 2004-03-22 | 2"-hydroxynicotianamine, process for producing the same and angiotensin converting enzyme inhibitor, hypotensive drug and health food |
| US10/555,316 US20070043018A1 (en) | 2003-05-07 | 2004-03-22 | 2"-Hydroxynicotianamine, process for producing the same and angiotensin converting enzyme inhibitor, hypotensive drug and health food |
| CNA2004800117876A CN1780816A (zh) | 2003-05-07 | 2004-03-22 | 2＂－羟基烟草胺及其制造方法,及血管紧张素转换酶抑制剂、降压剂及健康食品 |
| PCT/JP2004/003868 WO2004099133A1 (ja) | 2003-05-07 | 2004-03-22 | ２”－ヒドロキシニコチアナミン、その製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び健康食品 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003128838A JP2004331556A (ja) | 2003-05-07 | 2003-05-07 | ２”−ヒドロキシニコチアナミン、その製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び健康食品 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004331556A true JP2004331556A (ja) | 2004-11-25 |
Family
ID=33432057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003128838A Pending JP2004331556A (ja) | 2003-05-07 | 2003-05-07 | ２”−ヒドロキシニコチアナミン、その製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び健康食品 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070043018A1 (ja) |
| EP (1) | EP1623974A1 (ja) |
| JP (1) | JP2004331556A (ja) |
| KR (1) | KR20060008987A (ja) |
| CN (1) | CN1780816A (ja) |
| WO (1) | WO2004099133A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100261883A1 (en) * | 2007-11-01 | 2010-10-14 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Bone resorption inhibitory food material for inhibiting bone resorption |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2943666B1 (fr) | 2009-03-31 | 2011-04-15 | Commissariat Energie Atomique | Metallophore derive de nicotianamine et ses procedes de fabrication |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0740950B2 (ja) * | 1986-10-02 | 1995-05-10 | 三菱化学株式会社 | 微生物によるニコチアナミンの製造法 |
| JPH05246865A (ja) * | 1992-03-04 | 1993-09-24 | Kikkoman Corp | ニコチアナミンの製造法及びそれを含有する健康食品 |
| GB2344504B (en) * | 1998-12-08 | 2002-10-16 | Masterfoods S A Nv | Puffed cereal cakes |
| JP2002179647A (ja) * | 2000-12-11 | 2002-06-26 | Kikkoman Corp | ニコチアナミン又はニコチアナミン含有物の製造法 |
| JP2003231675A (ja) * | 2002-02-04 | 2003-08-19 | Kikkoman Corp | ニコチアナミン又はニコチアナミン含有物の製造法 |
-
2003
- 2003-05-07 JP JP2003128838A patent/JP2004331556A/ja active Pending
-
2004
- 2004-03-22 US US10/555,316 patent/US20070043018A1/en not_active Abandoned
- 2004-03-22 WO PCT/JP2004/003868 patent/WO2004099133A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2004-03-22 CN CNA2004800117876A patent/CN1780816A/zh active Pending
- 2004-03-22 KR KR1020057020993A patent/KR20060008987A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-03-22 EP EP04722438A patent/EP1623974A1/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100261883A1 (en) * | 2007-11-01 | 2010-10-14 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Bone resorption inhibitory food material for inhibiting bone resorption |
| US8580740B2 (en) * | 2007-11-01 | 2013-11-12 | Megmilk Snow Brand Co., Ltd. | Bone resorption inhibitory food material for inhibiting bone resorption |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1780816A (zh) | 2006-05-31 |
| KR20060008987A (ko) | 2006-01-27 |
| WO2004099133A1 (ja) | 2004-11-18 |
| EP1623974A1 (en) | 2006-02-08 |
| US20070043018A1 (en) | 2007-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107141336B (zh) | 具有dpp-iv抑制活性的牦牛骨蛋白肽及制备方法 | |
| CN104450839B (zh) | 具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法 | |
| AU625531B2 (en) | Dietary fiber, its process and physiologically active composition containing the same as an active ingredient | |
| JP3195937B2 (ja) | アミラーゼ阻害物質の取得方法 | |
| JP5717317B2 (ja) | 化合物の医薬品的使用 | |
| WO2005012542A1 (ja) | カゼイン加水分解物、その製造法及びその用途 | |
| EP3308781A1 (en) | Blood pressure-lowering agent | |
| WO2015147251A1 (ja) | 発酵食品抽出組成物 | |
| JPH09316091A (ja) | アルギニルフラクトシルグルコース類の製造法 | |
| CN110305929B (zh) | 一种具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的麦芽根蛋白水解物及其制备方法 | |
| JP2022543794A (ja) | テトラガロイルグルコースの製造方法 | |
| JP6910639B2 (ja) | アンジオテンシン変換酵素阻害剤、組成物およびその製造方法 | |
| WO2005118619A1 (ja) | 血圧降下作用を有するジペプチド | |
| JP2004331556A (ja) | ２”−ヒドロキシニコチアナミン、その製造方法、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害剤、血圧降下剤及び健康食品 | |
| JP2000095792A (ja) | ゲニスチンから成るイソフラボン組成物の取得方法 | |
| JPH08268903A (ja) | 医薬と補助栄養食品の製造のためのベンゾジアゼピン型の活性を有するデカペプチドの使用 | |
| JPH05246865A (ja) | ニコチアナミンの製造法及びそれを含有する健康食品 | |
| JP2006056793A (ja) | ポリフェノール含有生成物の製造方法、ポリフェノール含有生成物、α−アミラーゼ阻害剤、抗酸化剤および食用組成物 | |
| CN113100320A (zh) | 一种具有缓解亚健康疲劳功能的核桃低聚肽糖果及其制备方法 | |
| JP4490547B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| KR101756362B1 (ko) | 혈압강하용 조성물 및 이의 제조방법 | |
| JPH05339166A (ja) | アンジオテンシン変換酵素阻害物質およびその製造法 | |
| JP3480965B2 (ja) | アミラーゼ阻害物質の調製方法 | |
| KR101898397B1 (ko) | 컬럼 추출 기술을 이용한 고함량의 대두 이소플라본 추출물 및 그 제조방법 | |
| JP5585958B2 (ja) | 血圧低下作用を呈するカフェ酸誘導体の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050318 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081126 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090326 |