JP2004250426A - プラバスタチンナトリウムの精製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】醗酵培養液からのプラバスタチンナトリウムの精製方法を提供する 。
【解決手段】下記の（ａ）〜（ｄ）の工程を有する、プラバスタチンナトリウムの精製方法である。（ａ）： プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液を遠心分離および／または濾過してプラバスタチンナトリウムを含有する溶液を得た後、該溶液のｐＨを１０〜１３の範囲に調整する工程（ｂ）： 前記溶液を非イオン性樹脂に吸着させ該樹脂を洗浄液で洗浄後、吸着したプラバスタチンナトリウムを水溶性有機溶剤で溶出してプラバスタチンナトリウム画分を得、該画分を濃縮してプラバスタチンナトリウム濃縮液を得る工程（ｃ）： 前記濃縮液を処理してプラバスタチンナトリウムの沈殿物を形成させる工程（ｄ）： 前記沈殿物を再結晶させることにより精製プラバスタチンナトリウムを得る工程。
【選択図】 なし
【解決手段】下記の（ａ）〜（ｄ）の工程を有する、プラバスタチンナトリウムの精製方法である。（ａ）： プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液を遠心分離および／または濾過してプラバスタチンナトリウムを含有する溶液を得た後、該溶液のｐＨを１０〜１３の範囲に調整する工程（ｂ）： 前記溶液を非イオン性樹脂に吸着させ該樹脂を洗浄液で洗浄後、吸着したプラバスタチンナトリウムを水溶性有機溶剤で溶出してプラバスタチンナトリウム画分を得、該画分を濃縮してプラバスタチンナトリウム濃縮液を得る工程（ｃ）： 前記濃縮液を処理してプラバスタチンナトリウムの沈殿物を形成させる工程（ｄ）： 前記沈殿物を再結晶させることにより精製プラバスタチンナトリウムを得る工程。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プラバスタチンナトリウムを精製する方法に関する。詳細には、塩基性条件下で非イオン性樹脂に吸着させることにより、プラバスタチンナトリウムを精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プラバスタチンは従来、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤として開示されている化合物であり（例えば、特許文献１を参照。）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、コレステロール合成の律速段階に関与している。現在では、プラバスタチンナトリウムが高脂血症治療剤として販売されている。ここで、プラバスタチンナトリウムは下記式（１）
【０００３】
【化１】
【０００４】
の構造を有している。
【０００５】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としては、プラバスタチンナトリウムの他にも多くの化合物が知られている。これらの化合物は類似の構造を有しているにもかかわらず、その製法は、完全に有機化学合成によって製造されるものから、醗酵によって製造されるものまで様々である。
【０００６】
これらのうち、醗酵により製造されるものには、プラバスタチンナトリウムのほか、ロバスタチンおよびシンバスタチンが知られている。しかしこれらの化合物についても、その製法は同一ではなく相違点を有している。すなわち、ロバスタチンおよびシンバスタチンは一段階の醗酵により製造されるのに対し、プラバスタチンナトリウムは、下記式（２）のように二段階にわたって変換培養されることにより製造される。すなわち、微生物（ペニシリウム・シトリナム）によって合成される中間体を経て、水酸化酵素を有する種々の微生物により該中間体が最終的にプラバスタチンナトリウムへと変換されるのである。
【０００７】
【化２】
【０００８】
ここで一般に、醗酵により化合物を合成しようとする場合には、有機化学合成と比較して、目的とする化合物の醗酵培養液中濃度は低い反面、予期せず同時に生成する不純物が多い。したがって、醗酵により化合物を製造する際には、各工程において精製を行い、不純物を可能な限り除去することが試みられている。
【０００９】
しかしながら、従来の方法により不純物を完全に除去することは極めて困難である。さらに場合によっては精製工程において収率が低下する場合もある。特に工業的に大規模培養する場合にはこれらの点を解決することが課題となっている。
【００１０】
また、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、血中コレステロール値を低下させて高脂血症を治療または予防するために投与されるものである。このため長期間投与されることが原則であり、この点で他の薬剤よりもさらに純度の高いものであることが必要とされている。さらに、上記のようにプラバスタチンナトリウムは二段階醗酵により製造されるものであるから、一段階醗酵により製造される化合物よりも不純物を多く含んでおり、この点においても、醗酵により製造されたプラバスタチンナトリウムを高収率で高純度に精製する方法の開発が望まれている。
【００１１】
従来、粗プラバスタチンを含む溶液からプラバスタチンを精製する方法がいくつか開示されている。
【００１２】
例えば、分取用高性能液体クロマトグラフィを用いて特定の溶媒で溶出させる工程と、目的化合物を含有する画分から該溶媒の一部を除去する工程と、その後に該化合物を晶出させる工程とを含む、粗ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害物質の精製方法が開示されている（例えば、特許文献２を参照。）。該文献２の方法によれば、再結晶化を行うことなく結晶化のみにより、プラバスタチンを含む種々のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を９９．５％以上の純度で得ることができるとしている。また該文献２の実施例によれば、純度９９．７％以上のロバスタチンを総収率９０％以上で回収できる旨が記載されている。一方プラバスタチンについては、純度９９．５％以上の結晶を得られる旨が記載されているが、総収率については記載がなく明らかではない。また、プラバスタチンの結晶が得られるという記載はあるが、ナトリウム塩として精製する方法についての記載は全くない。さらにそもそも、高性能液体クロマトグラフィを用いて目的の化合物を精製する方法は、操作が煩雑であるばかりか、大量の溶媒を必要とする。このため、使用する溶媒中に含まれる不純物が製品中に混入する場合や、環境を汚染する場合があり、さらに費用が高騰して不経済である。したがって高性能液体クロマトグラフィを用いる精製方法は、少なくとも工業的な大規模製造の場においては適当ではない。
【００１３】
ここで、高性能液体クロマトグラフィのような特別の装置を使用せず、醗酵培養液からプラバスタチンを精製する方法が開示されている。
【００１４】
例えば、菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いてプラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、式 ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用することを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法が開示されている（例えば、特許文献３を参照。）。ここで該文献３の方法によれば、特定の有機溶媒を使用することにより、工程生産性およびプラバスタチンの純度を損なうことなく、高純度のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩を得ることができるとしている。また実施例には、変換培養後のプラバスタチン培養液１０Ｌから、酢酸ｎ−ブチルによる抽出、リン酸による不純物の分解、結晶化および再結晶化により、純度９９．７％以上のプラバスタチンナトリウムの純結晶を３２ｇ得ることができる旨記載されている。しかしながら、当初培養液中のプラバスタチン量が記載されていないために、最終的な総収率は不明である。なお、当該実施例における酢酸ｎ−ブチルによる抽出の際には、２５％硫酸を添加して培養濃縮液のｐＨを５．７としている。
【００１５】
また、塩析により、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を精製する方法が開示されている（例えば、特許文献４を参照。）。該文献４の方法によれば、通常高分子化合物に適用される塩析法を低分子化合物であるプラバスタチンに適用することで、プラバスタチンを選択的に高純度で析出させることができるとしている。該文献４では、スケ−ルの小さい実施例において、プラバスタチンナトリウムを３７ｇ含有するプラバスタチンの培養濃縮液３００ｍＬをアルカリ処理してプラバスタチンナトリウムを３３ｇ含有するアルカリ処理液を得て、プラバスタチンナトリウムを５．３ｇ含有する該処理液７０ｍＬからプラバスタチンナトリウムを抽出後に塩析を行い、再結晶化することで、純度９９．８５％のプラバスタチンナトリウムを２．１４ｇ得ることができる旨が記載されている。したがって、該実施例における総収率は、
【００１６】
【数１】
【００１７】
となり、きわめて低いものである。また、変換培養後のプラバスタチン培養液１０Ｌからプラバスタチンを抽出後、塩化ナトリウムを用いて塩析を行い、再結晶化させることで、純度９９．８５％のプラバスタチンナトリウムの結晶を５５ｇ得ることができる旨記載されている。しかしながら、当初培養液中のプラバスタチン量が記載されていないために、最終的な総収率は不明である。なお、当該実施例においては酢酸プロピルを用いて抽出を行っているが、この際、２５％硫酸を添加して培養濃縮液のｐＨを５．７としている。
【００１８】
さらに、プラバスタチン等の化合物のナトリウム塩を醗酵ブロスから単離するための方法において、該化合物の濃縮溶液から該化合物の塩を得て精製し、その後、該塩から該化合物を遊離させ、該化合物に水酸化ナトリウムを接触させ、過剰のナトリウム塩を除去して、該塩をナトリウム塩に塩転換する工程を含む方法が開示されている（例えば、特許文献５を参照。）。より具体的には、まず醗酵培養液のｐＨを２〜４とし、有機溶媒であるイソブチルアセテートで抽出し、次いで塩基性として水で抽出し、再度酸性としてイソブチルアセテートで抽出し、乾燥させてプラバスタチン溶液を得る。その後該溶液にアンモニアガスを導入してプラバスタチンアンモニウムの結晶を得る。そしてプラバスタチンアンモニウム水溶液にイソブチルアセテートを添加後ｐＨ２〜４の酸性として抽出し、さらにこの有機溶媒相を、断続的に水酸化ナトリウムを添加している水相中に添加し、徐々にナトリウム塩に塩転換している。該文献５の方法によれば、９９％以上の純度のプラバスタチンナトリウムを総収率約５０〜７０％程度で得ることができるとしている。
【００１９】
【特許文献１】
特開昭５７−２２４０号公報
【特許文献２】
特表平０６−５０６２１０号公報
【特許文献３】
特開２００２−１２１１７４号公報
【特許文献４】
特開２００２−１２１１７２号公報
【特許文献５】
特表２００３−５１５３３４号公報
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
前記文献３〜５に記載の方法はいずれも、プラバスタチンナトリウムを精製する際に抽出工程を行う方法である。しかしながら、プラバスタチンナトリウムの精製の際に抽出工程を行うと、乳化現象が起こり、製品であるプラバスタチンナトリウムの純度が低下する場合がある。また抽出工程を何度も繰り返すことにより、収率が低下する場合もある。したがって、従来知られているプラバスタチンナトリウムの精製方法はいずれも、工業的な大規模生産には採用することが困難なものである。
【００２１】
そこで本発明が目的とするところは、高性能液体クロマトグラフィのような特別な装置を必要とせず、かつ抽出工程を行わなくとも高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で回収することができる、醗酵培養液からのプラバスタチンナトリウムの精製方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液より得られたプラバスタチンナトリウム溶液から、非イオン性樹脂を用いてプラバスタチンナトリウムを精製する際に、該溶液のｐＨを塩基性とすることにより、該樹脂へのプラバスタチンナトリウムの吸着効率が著しく上昇し、これによりプラバスタチンナトリウムを醗酵培養液から高収率かつ高純度で精製できることを見出し、本発明を完成させた。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、下記の（ａ）〜（ｄ）の工程を有する、プラバスタチンナトリウムの精製方法である。
（ａ）： プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液を遠心分離および／または濾過してプラバスタチンナトリウムを含有する溶液を得た後、該溶液のｐＨを１０〜１３の範囲に調整する工程
（ｂ）： 前記溶液を非イオン性樹脂に吸着させ該樹脂を洗浄液で洗浄後、吸着したプラバスタチンナトリウムを水溶性有機溶剤で溶出してプラバスタチンナトリウム画分を得、該画分を濃縮してプラバスタチンナトリウム濃縮液を得る工程
（ｃ）： 前記濃縮液を処理してプラバスタチンナトリウムの沈殿物を形成させる工程
（ｄ）： 前記沈殿物を再結晶させることにより精製プラバスタチンナトリウムを得る工程
プラバスタチンナトリウムの工業的な製法としては、微生物を用いた醗酵培養を利用する方法が知られている。ここで従来、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液からプラバスタチンナトリウムを精製する方法として、高性能液体クロマトグラフィを用いる方法や、有機溶媒を用いる抽出法が知られている。しかしながら、上述したように、高性能液体クロマトグラフィを用いた方法は工業的に大規模に製造されたプラバスタチンナトリウムの精製法としては好ましくない。また抽出法を採用する場合には、乳化現象が起こり製品であるプラバスタチンナトリウムの純度が低下する場合があり、さらに抽出工程を何度も繰り返すことにより、収率が低下する場合もあるため好ましくない。
【００２５】
一方、本発明者らは、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液より得られたプラバスタチンナトリウム溶液から、非イオン性樹脂を用いてプラバスタチンナトリウムを精製する際に、該溶液のｐＨを塩基性とすることにより、プラバスタチンナトリウムの安定化が図れることを見出した。また、該樹脂へのプラバスタチンナトリウムの吸着効率が著しく上昇し、これによりプラバスタチンナトリウムを醗酵培養液から高収率かつ高純度で精製できることを見出した。
【００２６】
すなわち、本発明の精製方法は、醗酵培養液より得られたプラバスタチンナトリウム含有溶液のｐＨを塩基性に調整した後、非イオン性樹脂を用いて精製を行うものである。本発明によれば、高性能液体クロマトグラフィのような装置を使用しないため操作が極めて簡便であり、また抽出法を用いていないために、高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で得ることが可能となる。
【００２７】
以下、本発明の精製方法の好ましい一の態様について詳細に説明する。
【００２８】
本発明の精製方法は、微生物の醗酵培養により得られた醗酵培養液であって、プラバスタチンナトリウムを含有するものであればいずれのものにも適用することが可能である。ここで醗酵培養に利用される微生物についても特に制限されず従来公知のものを利用することができ、例えば米国特許第４，３４６，２２７号公報に記載の微生物を利用することができる。
【００２９】
本発明においては、まず、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液を遠心分離または濾過することにより、上清または濾液をプラバスタチンナトリウム含有透明溶液として得る。ここで遠心分離および濾過を行う方法は特に限定されるものではなく、従来周知の方法を適宜利用することができる。また、遠心分離操作および濾過操作は、いずれかを単独で行ってもよいし、双方を組み合わせて行ってもよい。
【００３０】
その後、得られたプラバスタチンナトリウム含有溶液のｐＨを１０〜１３、好ましくは１１〜１２に調整する。このように塩基性に調整することにより、プラバスタチンナトリウム含有溶液中におけるプラバスタチンナトリウムの安定化が図れるのである。ここで、該溶液のｐＨを塩基性に調整する方法は特に制限されるものではないが、塩基を添加する方法が簡便であり好ましい。ここで用いられる塩基も特に制限されず、従来周知の塩基が適宜用いられうる。好ましくはアルカリ金属を含有する塩基が用いられ、特に好ましくは水酸化ナトリウムが用いられる。なお、この際、塩基の形態としては、そのまま用いるものであってもよいが、水溶液の形態が好ましく、該水溶液の濃度はプラバスタチンナトリウム含有溶液を所望のｐＨとすることができる濃度であれば特に制限されるものではない。
【００３１】
次いで、ｐＨを調整されたプラバスタチンナトリウム含有溶液を非イオン性樹脂に吸着させることにより不純物と分離する。ここで、非イオン性樹脂としては、プラバスタチンナトリウムを吸着でき、不純物と分離可能なものであれば特に制限されずに用いられうる。該非イオン性樹脂としては例えば、三菱化学（株）製のダイヤイオン系の各種ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ、各種セパビーズ（登録商標）ＳＰや、ローム・アンド・ハース社製のアンバーライト系の各種アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ等が例示される。これらは１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３２】
さらに、前記非イオン性樹脂にプラバスタチンナトリウムを吸着させ、該樹脂を洗浄液で洗浄後、該樹脂に吸着したプラバスタチンナトリウムを水溶性有機溶剤で溶出してプラバスタチンナトリウム画分を得る。この際、用いられる洗浄液としては、特に制限されないが、水および上記塩基の水溶液等が例示される。また、該洗浄液として塩基の水溶液を用いる場合の該水溶液の濃度については、非イオン性樹脂に吸着したプラバスタチンナトリウムを溶出させることなく洗浄できる濃度であれば特に制限されるものではない。
【００３３】
水溶性有機溶剤としては、吸着したプラバスタチンナトリウムを溶出できるものであれば特に制限されず、従来周知のものを適宜使用することができる。該溶剤として好ましくは、メタノール、アセトンおよびこれらの混合物並びにこれらの水溶液からなる群から選択されるいずれかのものが用いられる。ここで水溶性有機溶剤が水溶液の形態で使用される際の濃度は、非イオン性樹脂に吸着したプラバスタチンナトリウムを充分に溶出できる濃度であれば特に制限されるものではない。
【００３４】
本発明によれば、上記のような吸着および脱着工程を行うことにより、９３％以上という高いＨＰＬＣ純度を示すプラバスタチンナトリウムを９８％以上という高純度で得ることができる。
【００３５】
ここでＨＰＬＣ純度を測定するためのＨＰＬＣ条件は以下に示す通りである。
移動相；メタノール：水：酢酸：トリエチルアミン＝５００：５００：１：１
カラム；Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ−１８ｅ５．０μ、φ×Ｈ＝４．０ｍｍ×２５ｃｍ（メルク社製）
カラム温度；４０℃
流速；１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長；ＵＶ：２３８ｎｍ
また得られたプラバスタチンナトリウムの純度の測定方法は特に制限されず、従来周知の方法を用いて測定することができる。
【００３６】
上記のように本発明においては、塩基性条件下でプラバスタチンナトリウムの吸着および脱着を行うが、これにより高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で得ることができる。これは、本発明によれば、プラバスタチンナトリウムが安定に存在可能な塩基性条件の下で非イオン性樹脂に吸着させることで、プラバスタチンナトリウムと醗酵培養液中に存在する不純物とを高度に分離できることによる。特に本発明は、物理的および化学的特性がプラバスタチンナトリウムに極めて類似しているため従来の結晶化、クロマトグラフィまたは高性能液体クロマトグラフィを用いた方法によっても除去することが困難であった、プラバスタチンナトリウムのエピマーである６α−ヒドロキシコンパクチンナトリウムとプラバスタチンナトリウムとの分離能に優れている。
【００３７】
従来の精製方法ではこれらの不純物の混入を抑制することが比較的困難であったため、プラバスタチンナトリウムの工業的な大規模製造が悪影響を受けていた。しかし本発明によればこれらの不純物を確実に分離できるため、本発明の精製方法は工業的なプラバスタチンナトリウムの製造に好ましく適用される。
【００３８】
本発明においては、上記の工程によりプラバスタチンナトリウム画分を得た後、さらなる精製のために後処理工程を行う。該後処理工程においては、該画分を濃縮して濃縮液を得、その後プラバスタチンナトリウムを沈殿させて沈殿物を得、さらに該沈殿物中のプラバスタチンナトリウムを再結晶化させて、精製プラバスタチンナトリウムを得る。
【００３９】
ここで、上記後処理工程において用いられる濃縮法、沈殿法および再結晶法については、いずれも特に制限されずに従来周知の方法が適宜組み合わされることにより用いられうる。また、後処理工程においては、上記の各操作を行う回数は１回のみであってもよいが、必要であれば複数回行ってもよい。なお、後処理工程前に、得られたプラバスタチンナトリウム画分に塩酸等の酸を添加し、該画分のｐＨを弱塩基性（例えば、ｐＨ８〜１０）に調整してもよい。
【００４０】
前記後処理工程において濃縮液中のプラバスタチンナトリウムを沈殿させる方法としては、上述したように特に制限されないが、例えば該濃縮液に水溶性反溶剤を添加する方法が用いられうる。
【００４１】
ここで「反溶剤」とは、ある物質の溶液に添加した場合に該物質を沈殿させる性質を有する、該物質に対して良好でない溶剤をいう。本発明においては、前記濃縮液に反溶剤を添加することにより該濃縮液の極性が減少し、またプラバスタチンナトリウムは該反溶剤に溶解しないため、該濃縮液中のプラバスタチンナトリウムの沈殿が促進されるのである。なお、当該工程において使用される水溶性反溶剤は、上記の性質を有するものであれば特に制限されず従来周知のものが適宜用いられうる。ここで該反溶剤としては、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトンからなる群から選択される１種または２種以上のものであることが好ましい。
【００４２】
ここで、これらの水溶性反溶剤を添加することによりプラバスタチンナトリウムを沈殿させる際の処理方法は特に制限されるものではないが、例えば、濃縮液に水溶性反溶剤を添加し、その後攪拌することによりプラバスタチンナトリウムを沈殿させることができる。この際、攪拌操作は２段階で行ってもよく、この場合には、例えば第１段階においては２５〜３０℃で３〜５時間攪拌し、第２段階においては０〜５℃で１〜３時間攪拌する方法が例示される。
【００４３】
また、前記後処理工程において濃縮液中のプラバスタチンナトリウムを沈殿させる方法としては、例えば該濃縮液に無機塩を添加してプラバスタチンナトリウムを沈殿させる塩析法が用いられうる。
【００４４】
ここで、前記塩析法においてプラバスタチンナトリウム濃縮液に添加される無機塩としては、特に制限されるものではなく従来周知の無機塩が適宜用いられうる。該無機塩としては、好ましくは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群から選択される１種または２種以上が用いられ、特に好ましくは塩化ナトリウムが用いられる。
【００４５】
ここで、塩析法によりプラバスタチンナトリウムを沈殿させる際の処理方法は特に制限されるものではないが、例えば、濃縮液に無機塩を添加し、その後攪拌することによりプラバスタチンナトリウムを塩析沈殿させることができる。この際、攪拌操作は２段階で行ってもよく、この場合には、例えば第１段階においては２５〜３０℃で３〜５時間攪拌し、第２段階においては０〜５℃で１〜３時間攪拌する方法が例示される。
【００４６】
塩析法を用いて濃縮液中プラバスタチンナトリウムを沈殿させた場合には、必要であればその後に活性炭等を用いて脱色させてもよく、また、脱塩および濃縮を行ってから、再結晶工程を行ってもよい。ここで塩析後の脱塩および濃縮工程においては、特に制限されず従来周知の種々の方法が用いられる。ここで該脱塩工程においては、例えば上記に例示された非イオン性樹脂が用いられうる。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲をこれに限定するものではない。
【００４８】
実施例１
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清を１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加してｐＨ１２．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（φ×Ｈ＝５×６０ｃｍ、Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１．０Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００４９】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液７Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。該溶出液をＨＰＬＣ分析により評価し、純度９４．０％の粗プラバスタチンナトリウムを収率９９．５％で得た。
【００５０】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に３Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに減圧下で濃縮器を用いて濃縮し、３０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液にアセトン４Ｌを添加し、２５〜３０℃で４時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で２時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムの沈殿を得た。真空濾過によりプラバスタチンナトリウムを含有する濾過ケークを得た。
【００５１】
前記濾過ケークをごく少量のアセトンでわずかに洗浄し、１２０ｍＬの水に溶解させ、脱色するために活性炭１．０ｇを添加して２時間攪拌した。次いで該溶液を濾過し、濾液を濃縮して２５％（ｗ／ｗ）のプラバスタチンナトリウムとし、該濃縮液にアセトン４Ｌを添加して室温で３時間攪拌した。次いで、この溶液を０〜５℃に冷却し、２時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させ、この結晶を真空濾過し、乾燥させて、純度９８．５％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率６１％で１８．３ｇ得た。
【００５２】
実施例２
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清を１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加してｐＨ１１．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムアンバーライト（登録商標）ＡＤ−１６（φ×Ｈ＝５×６０ｃｍ、Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１．２Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００５３】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液８Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。
【００５４】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に３Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに減圧下で濃縮し、３．０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に塩化ナトリウム３００ｇを添加し、２５〜３０℃で４時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で２時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムの沈殿を塩析させた。濾過することによりプラバスタチンナトリウムを９９．３％の純度で含有する濾過ケークを得た。
【００５５】
前記塩析ケークを１２０ｍＬの水に溶解させ、脱色するために活性炭１．０ｇを添加して２時間攪拌した。次いで該溶液を濾過し、濾液をアンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−４またはダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０ｓｓを用いて脱塩した。このプラバスタチンナトリウム溶出液を減圧下で３０％（ｗ／ｗ）まで濃縮し、該濃縮液にアセトン４Ｌを添加して２５〜３０℃で４時間攪拌した。次いで、この溶液を０〜５℃に冷却し、２時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させ、この結晶を真空濾過し、乾燥させて、純度９９．５％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率５５％で１６．５ｇ得た。
【００５６】
実施例３
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清を１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加してｐＨ１１．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムダイヤイオン（登録商標）ＳＰ−２００（φ×Ｈ＝５×６０ｃｍ、Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１．０Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００５７】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液７Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。該溶出液をＨＰＬＣ分析により評価し、純度９５％の粗プラバスタチンナトリウムを収率９９％で得た。
【００５８】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に３Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに減圧下で濃縮器を用いて濃縮し、３．０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に塩化ナトリウム２８０ｇを添加し、２５〜３０℃で４時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で２時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムを沈殿させた。濾過を行いプラバスタチンナトリウムを含有する濾過ケークを得た。
【００５９】
前記濾過ケークを１２０ｍＬの水に溶解させ、脱色するために活性炭１．２ｇを添加して２時間攪拌した。次いで該溶液を濾過し、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０ｓｓを用いて脱塩させた。プラバスタチンナトリウム溶出液を減圧下で濃縮して３０％（ｗ／ｗ）のプラバスタチンナトリウムとし、該濃縮液にアセトン４Ｌを添加して２５〜３０℃で４時間攪拌した。次いで、この溶液を０〜５℃に冷却し、２時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させ、この結晶を濾過し、乾燥させて、純度９９．６％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率５６．７％で１７．０ｇ得た。
【００６０】
実施例４
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０００Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清に４５％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨ１２．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１００Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００６１】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液８００Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。該溶出液をＨＰＬＣ分析により評価し、純度９４．５％の粗プラバスタチンナトリウムを収率９８．５％で得た。
【００６２】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に６Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに濃縮し、３．０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に塩化ナトリウム３０ｋｇを添加し、２５〜３０℃で４〜６時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で３時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムの沈殿を得た。遠心分離を行い、プラバスタチンナトリウムを含有する濾過ケークを得た。該濾過ケークの純度をＨＰＬＣ法により測定した結果、９９．４％であった。
【００６３】
必要であれば前記濾過ケークを脱色してもよい。該ケークを２０Ｌの水に溶解し、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０ｓｓを用いて脱塩させた。該プラバスタチンナトリウム溶出液を減圧下で濃縮し、３０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に４００Ｌのアセトンを添加し、２５〜３０℃で４〜６時間攪拌した。次いで、０〜５℃に冷却し、３時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させて、濾過し乾燥させて、純度９９．５７％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率５６％で１．６８ｋｇ得た。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、高性能液体クロマトグラフィのような装置を使用しない極めて簡便な操作により、高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で精製することができる。また抽出法を用いていないことから、乳化現象による収率の低下を防止でき、さらに環境に負荷を与える有害な有機溶媒を大量に使用する必要がない。したがって、本発明の精製方法によれば、環境を汚染せず安全であるばかりか、環境保全のためのコストも削減され、極めて経済的である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、プラバスタチンナトリウムを精製する方法に関する。詳細には、塩基性条件下で非イオン性樹脂に吸着させることにより、プラバスタチンナトリウムを精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プラバスタチンは従来、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤として開示されている化合物であり（例えば、特許文献１を参照。）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、コレステロール合成の律速段階に関与している。現在では、プラバスタチンナトリウムが高脂血症治療剤として販売されている。ここで、プラバスタチンナトリウムは下記式（１）
【０００３】
【化１】
の構造を有している。
【０００５】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としては、プラバスタチンナトリウムの他にも多くの化合物が知られている。これらの化合物は類似の構造を有しているにもかかわらず、その製法は、完全に有機化学合成によって製造されるものから、醗酵によって製造されるものまで様々である。
【０００６】
これらのうち、醗酵により製造されるものには、プラバスタチンナトリウムのほか、ロバスタチンおよびシンバスタチンが知られている。しかしこれらの化合物についても、その製法は同一ではなく相違点を有している。すなわち、ロバスタチンおよびシンバスタチンは一段階の醗酵により製造されるのに対し、プラバスタチンナトリウムは、下記式（２）のように二段階にわたって変換培養されることにより製造される。すなわち、微生物（ペニシリウム・シトリナム）によって合成される中間体を経て、水酸化酵素を有する種々の微生物により該中間体が最終的にプラバスタチンナトリウムへと変換されるのである。
【０００７】
【化２】
ここで一般に、醗酵により化合物を合成しようとする場合には、有機化学合成と比較して、目的とする化合物の醗酵培養液中濃度は低い反面、予期せず同時に生成する不純物が多い。したがって、醗酵により化合物を製造する際には、各工程において精製を行い、不純物を可能な限り除去することが試みられている。
【０００９】
しかしながら、従来の方法により不純物を完全に除去することは極めて困難である。さらに場合によっては精製工程において収率が低下する場合もある。特に工業的に大規模培養する場合にはこれらの点を解決することが課題となっている。
【００１０】
また、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、血中コレステロール値を低下させて高脂血症を治療または予防するために投与されるものである。このため長期間投与されることが原則であり、この点で他の薬剤よりもさらに純度の高いものであることが必要とされている。さらに、上記のようにプラバスタチンナトリウムは二段階醗酵により製造されるものであるから、一段階醗酵により製造される化合物よりも不純物を多く含んでおり、この点においても、醗酵により製造されたプラバスタチンナトリウムを高収率で高純度に精製する方法の開発が望まれている。
【００１１】
従来、粗プラバスタチンを含む溶液からプラバスタチンを精製する方法がいくつか開示されている。
【００１２】
例えば、分取用高性能液体クロマトグラフィを用いて特定の溶媒で溶出させる工程と、目的化合物を含有する画分から該溶媒の一部を除去する工程と、その後に該化合物を晶出させる工程とを含む、粗ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害物質の精製方法が開示されている（例えば、特許文献２を参照。）。該文献２の方法によれば、再結晶化を行うことなく結晶化のみにより、プラバスタチンを含む種々のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を９９．５％以上の純度で得ることができるとしている。また該文献２の実施例によれば、純度９９．７％以上のロバスタチンを総収率９０％以上で回収できる旨が記載されている。一方プラバスタチンについては、純度９９．５％以上の結晶を得られる旨が記載されているが、総収率については記載がなく明らかではない。また、プラバスタチンの結晶が得られるという記載はあるが、ナトリウム塩として精製する方法についての記載は全くない。さらにそもそも、高性能液体クロマトグラフィを用いて目的の化合物を精製する方法は、操作が煩雑であるばかりか、大量の溶媒を必要とする。このため、使用する溶媒中に含まれる不純物が製品中に混入する場合や、環境を汚染する場合があり、さらに費用が高騰して不経済である。したがって高性能液体クロマトグラフィを用いる精製方法は、少なくとも工業的な大規模製造の場においては適当ではない。
【００１３】
ここで、高性能液体クロマトグラフィのような特別の装置を使用せず、醗酵培養液からプラバスタチンを精製する方法が開示されている。
【００１４】
例えば、菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いてプラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、式 ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用することを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法が開示されている（例えば、特許文献３を参照。）。ここで該文献３の方法によれば、特定の有機溶媒を使用することにより、工程生産性およびプラバスタチンの純度を損なうことなく、高純度のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩を得ることができるとしている。また実施例には、変換培養後のプラバスタチン培養液１０Ｌから、酢酸ｎ−ブチルによる抽出、リン酸による不純物の分解、結晶化および再結晶化により、純度９９．７％以上のプラバスタチンナトリウムの純結晶を３２ｇ得ることができる旨記載されている。しかしながら、当初培養液中のプラバスタチン量が記載されていないために、最終的な総収率は不明である。なお、当該実施例における酢酸ｎ−ブチルによる抽出の際には、２５％硫酸を添加して培養濃縮液のｐＨを５．７としている。
【００１５】
また、塩析により、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を精製する方法が開示されている（例えば、特許文献４を参照。）。該文献４の方法によれば、通常高分子化合物に適用される塩析法を低分子化合物であるプラバスタチンに適用することで、プラバスタチンを選択的に高純度で析出させることができるとしている。該文献４では、スケ−ルの小さい実施例において、プラバスタチンナトリウムを３７ｇ含有するプラバスタチンの培養濃縮液３００ｍＬをアルカリ処理してプラバスタチンナトリウムを３３ｇ含有するアルカリ処理液を得て、プラバスタチンナトリウムを５．３ｇ含有する該処理液７０ｍＬからプラバスタチンナトリウムを抽出後に塩析を行い、再結晶化することで、純度９９．８５％のプラバスタチンナトリウムを２．１４ｇ得ることができる旨が記載されている。したがって、該実施例における総収率は、
【００１６】
【数１】
となり、きわめて低いものである。また、変換培養後のプラバスタチン培養液１０Ｌからプラバスタチンを抽出後、塩化ナトリウムを用いて塩析を行い、再結晶化させることで、純度９９．８５％のプラバスタチンナトリウムの結晶を５５ｇ得ることができる旨記載されている。しかしながら、当初培養液中のプラバスタチン量が記載されていないために、最終的な総収率は不明である。なお、当該実施例においては酢酸プロピルを用いて抽出を行っているが、この際、２５％硫酸を添加して培養濃縮液のｐＨを５．７としている。
【００１８】
さらに、プラバスタチン等の化合物のナトリウム塩を醗酵ブロスから単離するための方法において、該化合物の濃縮溶液から該化合物の塩を得て精製し、その後、該塩から該化合物を遊離させ、該化合物に水酸化ナトリウムを接触させ、過剰のナトリウム塩を除去して、該塩をナトリウム塩に塩転換する工程を含む方法が開示されている（例えば、特許文献５を参照。）。より具体的には、まず醗酵培養液のｐＨを２〜４とし、有機溶媒であるイソブチルアセテートで抽出し、次いで塩基性として水で抽出し、再度酸性としてイソブチルアセテートで抽出し、乾燥させてプラバスタチン溶液を得る。その後該溶液にアンモニアガスを導入してプラバスタチンアンモニウムの結晶を得る。そしてプラバスタチンアンモニウム水溶液にイソブチルアセテートを添加後ｐＨ２〜４の酸性として抽出し、さらにこの有機溶媒相を、断続的に水酸化ナトリウムを添加している水相中に添加し、徐々にナトリウム塩に塩転換している。該文献５の方法によれば、９９％以上の純度のプラバスタチンナトリウムを総収率約５０〜７０％程度で得ることができるとしている。
【００１９】
【特許文献１】
特開昭５７−２２４０号公報
【特許文献２】
特表平０６−５０６２１０号公報
【特許文献３】
特開２００２−１２１１７４号公報
【特許文献４】
特開２００２−１２１１７２号公報
【特許文献５】
特表２００３−５１５３３４号公報
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
前記文献３〜５に記載の方法はいずれも、プラバスタチンナトリウムを精製する際に抽出工程を行う方法である。しかしながら、プラバスタチンナトリウムの精製の際に抽出工程を行うと、乳化現象が起こり、製品であるプラバスタチンナトリウムの純度が低下する場合がある。また抽出工程を何度も繰り返すことにより、収率が低下する場合もある。したがって、従来知られているプラバスタチンナトリウムの精製方法はいずれも、工業的な大規模生産には採用することが困難なものである。
【００２１】
そこで本発明が目的とするところは、高性能液体クロマトグラフィのような特別な装置を必要とせず、かつ抽出工程を行わなくとも高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で回収することができる、醗酵培養液からのプラバスタチンナトリウムの精製方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液より得られたプラバスタチンナトリウム溶液から、非イオン性樹脂を用いてプラバスタチンナトリウムを精製する際に、該溶液のｐＨを塩基性とすることにより、該樹脂へのプラバスタチンナトリウムの吸着効率が著しく上昇し、これによりプラバスタチンナトリウムを醗酵培養液から高収率かつ高純度で精製できることを見出し、本発明を完成させた。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、下記の（ａ）〜（ｄ）の工程を有する、プラバスタチンナトリウムの精製方法である。
（ａ）： プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液を遠心分離および／または濾過してプラバスタチンナトリウムを含有する溶液を得た後、該溶液のｐＨを１０〜１３の範囲に調整する工程
（ｂ）： 前記溶液を非イオン性樹脂に吸着させ該樹脂を洗浄液で洗浄後、吸着したプラバスタチンナトリウムを水溶性有機溶剤で溶出してプラバスタチンナトリウム画分を得、該画分を濃縮してプラバスタチンナトリウム濃縮液を得る工程
（ｃ）： 前記濃縮液を処理してプラバスタチンナトリウムの沈殿物を形成させる工程
（ｄ）： 前記沈殿物を再結晶させることにより精製プラバスタチンナトリウムを得る工程
プラバスタチンナトリウムの工業的な製法としては、微生物を用いた醗酵培養を利用する方法が知られている。ここで従来、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液からプラバスタチンナトリウムを精製する方法として、高性能液体クロマトグラフィを用いる方法や、有機溶媒を用いる抽出法が知られている。しかしながら、上述したように、高性能液体クロマトグラフィを用いた方法は工業的に大規模に製造されたプラバスタチンナトリウムの精製法としては好ましくない。また抽出法を採用する場合には、乳化現象が起こり製品であるプラバスタチンナトリウムの純度が低下する場合があり、さらに抽出工程を何度も繰り返すことにより、収率が低下する場合もあるため好ましくない。
【００２５】
一方、本発明者らは、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液より得られたプラバスタチンナトリウム溶液から、非イオン性樹脂を用いてプラバスタチンナトリウムを精製する際に、該溶液のｐＨを塩基性とすることにより、プラバスタチンナトリウムの安定化が図れることを見出した。また、該樹脂へのプラバスタチンナトリウムの吸着効率が著しく上昇し、これによりプラバスタチンナトリウムを醗酵培養液から高収率かつ高純度で精製できることを見出した。
【００２６】
すなわち、本発明の精製方法は、醗酵培養液より得られたプラバスタチンナトリウム含有溶液のｐＨを塩基性に調整した後、非イオン性樹脂を用いて精製を行うものである。本発明によれば、高性能液体クロマトグラフィのような装置を使用しないため操作が極めて簡便であり、また抽出法を用いていないために、高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で得ることが可能となる。
【００２７】
以下、本発明の精製方法の好ましい一の態様について詳細に説明する。
【００２８】
本発明の精製方法は、微生物の醗酵培養により得られた醗酵培養液であって、プラバスタチンナトリウムを含有するものであればいずれのものにも適用することが可能である。ここで醗酵培養に利用される微生物についても特に制限されず従来公知のものを利用することができ、例えば米国特許第４，３４６，２２７号公報に記載の微生物を利用することができる。
【００２９】
本発明においては、まず、プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液を遠心分離または濾過することにより、上清または濾液をプラバスタチンナトリウム含有透明溶液として得る。ここで遠心分離および濾過を行う方法は特に限定されるものではなく、従来周知の方法を適宜利用することができる。また、遠心分離操作および濾過操作は、いずれかを単独で行ってもよいし、双方を組み合わせて行ってもよい。
【００３０】
その後、得られたプラバスタチンナトリウム含有溶液のｐＨを１０〜１３、好ましくは１１〜１２に調整する。このように塩基性に調整することにより、プラバスタチンナトリウム含有溶液中におけるプラバスタチンナトリウムの安定化が図れるのである。ここで、該溶液のｐＨを塩基性に調整する方法は特に制限されるものではないが、塩基を添加する方法が簡便であり好ましい。ここで用いられる塩基も特に制限されず、従来周知の塩基が適宜用いられうる。好ましくはアルカリ金属を含有する塩基が用いられ、特に好ましくは水酸化ナトリウムが用いられる。なお、この際、塩基の形態としては、そのまま用いるものであってもよいが、水溶液の形態が好ましく、該水溶液の濃度はプラバスタチンナトリウム含有溶液を所望のｐＨとすることができる濃度であれば特に制限されるものではない。
【００３１】
次いで、ｐＨを調整されたプラバスタチンナトリウム含有溶液を非イオン性樹脂に吸着させることにより不純物と分離する。ここで、非イオン性樹脂としては、プラバスタチンナトリウムを吸着でき、不純物と分離可能なものであれば特に制限されずに用いられうる。該非イオン性樹脂としては例えば、三菱化学（株）製のダイヤイオン系の各種ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ、各種セパビーズ（登録商標）ＳＰや、ローム・アンド・ハース社製のアンバーライト系の各種アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ等が例示される。これらは１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３２】
さらに、前記非イオン性樹脂にプラバスタチンナトリウムを吸着させ、該樹脂を洗浄液で洗浄後、該樹脂に吸着したプラバスタチンナトリウムを水溶性有機溶剤で溶出してプラバスタチンナトリウム画分を得る。この際、用いられる洗浄液としては、特に制限されないが、水および上記塩基の水溶液等が例示される。また、該洗浄液として塩基の水溶液を用いる場合の該水溶液の濃度については、非イオン性樹脂に吸着したプラバスタチンナトリウムを溶出させることなく洗浄できる濃度であれば特に制限されるものではない。
【００３３】
水溶性有機溶剤としては、吸着したプラバスタチンナトリウムを溶出できるものであれば特に制限されず、従来周知のものを適宜使用することができる。該溶剤として好ましくは、メタノール、アセトンおよびこれらの混合物並びにこれらの水溶液からなる群から選択されるいずれかのものが用いられる。ここで水溶性有機溶剤が水溶液の形態で使用される際の濃度は、非イオン性樹脂に吸着したプラバスタチンナトリウムを充分に溶出できる濃度であれば特に制限されるものではない。
【００３４】
本発明によれば、上記のような吸着および脱着工程を行うことにより、９３％以上という高いＨＰＬＣ純度を示すプラバスタチンナトリウムを９８％以上という高純度で得ることができる。
【００３５】
ここでＨＰＬＣ純度を測定するためのＨＰＬＣ条件は以下に示す通りである。
移動相；メタノール：水：酢酸：トリエチルアミン＝５００：５００：１：１
カラム；Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ−１８ｅ５．０μ、φ×Ｈ＝４．０ｍｍ×２５ｃｍ（メルク社製）
カラム温度；４０℃
流速；１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長；ＵＶ：２３８ｎｍ
また得られたプラバスタチンナトリウムの純度の測定方法は特に制限されず、従来周知の方法を用いて測定することができる。
【００３６】
上記のように本発明においては、塩基性条件下でプラバスタチンナトリウムの吸着および脱着を行うが、これにより高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で得ることができる。これは、本発明によれば、プラバスタチンナトリウムが安定に存在可能な塩基性条件の下で非イオン性樹脂に吸着させることで、プラバスタチンナトリウムと醗酵培養液中に存在する不純物とを高度に分離できることによる。特に本発明は、物理的および化学的特性がプラバスタチンナトリウムに極めて類似しているため従来の結晶化、クロマトグラフィまたは高性能液体クロマトグラフィを用いた方法によっても除去することが困難であった、プラバスタチンナトリウムのエピマーである６α−ヒドロキシコンパクチンナトリウムとプラバスタチンナトリウムとの分離能に優れている。
【００３７】
従来の精製方法ではこれらの不純物の混入を抑制することが比較的困難であったため、プラバスタチンナトリウムの工業的な大規模製造が悪影響を受けていた。しかし本発明によればこれらの不純物を確実に分離できるため、本発明の精製方法は工業的なプラバスタチンナトリウムの製造に好ましく適用される。
【００３８】
本発明においては、上記の工程によりプラバスタチンナトリウム画分を得た後、さらなる精製のために後処理工程を行う。該後処理工程においては、該画分を濃縮して濃縮液を得、その後プラバスタチンナトリウムを沈殿させて沈殿物を得、さらに該沈殿物中のプラバスタチンナトリウムを再結晶化させて、精製プラバスタチンナトリウムを得る。
【００３９】
ここで、上記後処理工程において用いられる濃縮法、沈殿法および再結晶法については、いずれも特に制限されずに従来周知の方法が適宜組み合わされることにより用いられうる。また、後処理工程においては、上記の各操作を行う回数は１回のみであってもよいが、必要であれば複数回行ってもよい。なお、後処理工程前に、得られたプラバスタチンナトリウム画分に塩酸等の酸を添加し、該画分のｐＨを弱塩基性（例えば、ｐＨ８〜１０）に調整してもよい。
【００４０】
前記後処理工程において濃縮液中のプラバスタチンナトリウムを沈殿させる方法としては、上述したように特に制限されないが、例えば該濃縮液に水溶性反溶剤を添加する方法が用いられうる。
【００４１】
ここで「反溶剤」とは、ある物質の溶液に添加した場合に該物質を沈殿させる性質を有する、該物質に対して良好でない溶剤をいう。本発明においては、前記濃縮液に反溶剤を添加することにより該濃縮液の極性が減少し、またプラバスタチンナトリウムは該反溶剤に溶解しないため、該濃縮液中のプラバスタチンナトリウムの沈殿が促進されるのである。なお、当該工程において使用される水溶性反溶剤は、上記の性質を有するものであれば特に制限されず従来周知のものが適宜用いられうる。ここで該反溶剤としては、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトンからなる群から選択される１種または２種以上のものであることが好ましい。
【００４２】
ここで、これらの水溶性反溶剤を添加することによりプラバスタチンナトリウムを沈殿させる際の処理方法は特に制限されるものではないが、例えば、濃縮液に水溶性反溶剤を添加し、その後攪拌することによりプラバスタチンナトリウムを沈殿させることができる。この際、攪拌操作は２段階で行ってもよく、この場合には、例えば第１段階においては２５〜３０℃で３〜５時間攪拌し、第２段階においては０〜５℃で１〜３時間攪拌する方法が例示される。
【００４３】
また、前記後処理工程において濃縮液中のプラバスタチンナトリウムを沈殿させる方法としては、例えば該濃縮液に無機塩を添加してプラバスタチンナトリウムを沈殿させる塩析法が用いられうる。
【００４４】
ここで、前記塩析法においてプラバスタチンナトリウム濃縮液に添加される無機塩としては、特に制限されるものではなく従来周知の無機塩が適宜用いられうる。該無機塩としては、好ましくは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群から選択される１種または２種以上が用いられ、特に好ましくは塩化ナトリウムが用いられる。
【００４５】
ここで、塩析法によりプラバスタチンナトリウムを沈殿させる際の処理方法は特に制限されるものではないが、例えば、濃縮液に無機塩を添加し、その後攪拌することによりプラバスタチンナトリウムを塩析沈殿させることができる。この際、攪拌操作は２段階で行ってもよく、この場合には、例えば第１段階においては２５〜３０℃で３〜５時間攪拌し、第２段階においては０〜５℃で１〜３時間攪拌する方法が例示される。
【００４６】
塩析法を用いて濃縮液中プラバスタチンナトリウムを沈殿させた場合には、必要であればその後に活性炭等を用いて脱色させてもよく、また、脱塩および濃縮を行ってから、再結晶工程を行ってもよい。ここで塩析後の脱塩および濃縮工程においては、特に制限されず従来周知の種々の方法が用いられる。ここで該脱塩工程においては、例えば上記に例示された非イオン性樹脂が用いられうる。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲をこれに限定するものではない。
【００４８】
実施例１
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清を１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加してｐＨ１２．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（φ×Ｈ＝５×６０ｃｍ、Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１．０Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００４９】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液７Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。該溶出液をＨＰＬＣ分析により評価し、純度９４．０％の粗プラバスタチンナトリウムを収率９９．５％で得た。
【００５０】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に３Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに減圧下で濃縮器を用いて濃縮し、３０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液にアセトン４Ｌを添加し、２５〜３０℃で４時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で２時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムの沈殿を得た。真空濾過によりプラバスタチンナトリウムを含有する濾過ケークを得た。
【００５１】
前記濾過ケークをごく少量のアセトンでわずかに洗浄し、１２０ｍＬの水に溶解させ、脱色するために活性炭１．０ｇを添加して２時間攪拌した。次いで該溶液を濾過し、濾液を濃縮して２５％（ｗ／ｗ）のプラバスタチンナトリウムとし、該濃縮液にアセトン４Ｌを添加して室温で３時間攪拌した。次いで、この溶液を０〜５℃に冷却し、２時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させ、この結晶を真空濾過し、乾燥させて、純度９８．５％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率６１％で１８．３ｇ得た。
【００５２】
実施例２
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清を１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加してｐＨ１１．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムアンバーライト（登録商標）ＡＤ−１６（φ×Ｈ＝５×６０ｃｍ、Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１．２Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００５３】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液８Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。
【００５４】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に３Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに減圧下で濃縮し、３．０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に塩化ナトリウム３００ｇを添加し、２５〜３０℃で４時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で２時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムの沈殿を塩析させた。濾過することによりプラバスタチンナトリウムを９９．３％の純度で含有する濾過ケークを得た。
【００５５】
前記塩析ケークを１２０ｍＬの水に溶解させ、脱色するために活性炭１．０ｇを添加して２時間攪拌した。次いで該溶液を濾過し、濾液をアンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−４またはダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０ｓｓを用いて脱塩した。このプラバスタチンナトリウム溶出液を減圧下で３０％（ｗ／ｗ）まで濃縮し、該濃縮液にアセトン４Ｌを添加して２５〜３０℃で４時間攪拌した。次いで、この溶液を０〜５℃に冷却し、２時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させ、この結晶を真空濾過し、乾燥させて、純度９９．５％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率５５％で１６．５ｇ得た。
【００５６】
実施例３
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清を１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液に添加してｐＨ１１．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムダイヤイオン（登録商標）ＳＰ−２００（φ×Ｈ＝５×６０ｃｍ、Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１．０Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００５７】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液７Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。該溶出液をＨＰＬＣ分析により評価し、純度９５％の粗プラバスタチンナトリウムを収率９９％で得た。
【００５８】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に３Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに減圧下で濃縮器を用いて濃縮し、３．０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に塩化ナトリウム２８０ｇを添加し、２５〜３０℃で４時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で２時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムを沈殿させた。濾過を行いプラバスタチンナトリウムを含有する濾過ケークを得た。
【００５９】
前記濾過ケークを１２０ｍＬの水に溶解させ、脱色するために活性炭１．２ｇを添加して２時間攪拌した。次いで該溶液を濾過し、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０ｓｓを用いて脱塩させた。プラバスタチンナトリウム溶出液を減圧下で濃縮して３０％（ｗ／ｗ）のプラバスタチンナトリウムとし、該濃縮液にアセトン４Ｌを添加して２５〜３０℃で４時間攪拌した。次いで、この溶液を０〜５℃に冷却し、２時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させ、この結晶を濾過し、乾燥させて、純度９９．６％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率５６．７％で１７．０ｇ得た。
【００６０】
実施例４
プラバスタチンナトリウムを含有する培養液１０００Ｌを遠心分離（１００００ｇ）し、微生物の細胞塊を除去した。上清に４５％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨ１２．０の塩基性とし、次いで樹脂カラムダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（Ｂｅｄ ｖｏｌ＝１００Ｌ、Ｓ．Ｖ．＝３．０）に定速で注入して分離した。
【００６１】
次いで前記樹脂を０．１％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム溶液８００Ｌで洗浄し、５０％（ｗ／ｗ）メタノールを溶離液として溶出し、プラバスタチンナトリウム溶出液を得た。該溶出液をＨＰＬＣ分析により評価し、純度９４．５％の粗プラバスタチンナトリウムを収率９８．５％で得た。
【００６２】
前記プラバスタチンナトリウム溶出液に６Ｎ塩酸を添加してｐＨ９．０に調節し、さらに濃縮し、３．０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に塩化ナトリウム３０ｋｇを添加し、２５〜３０℃で４〜６時間攪拌した。さらに続けて０〜５℃の冷却温度で３時間攪拌し、プラバスタチンナトリウムの沈殿を得た。遠心分離を行い、プラバスタチンナトリウムを含有する濾過ケークを得た。該濾過ケークの純度をＨＰＬＣ法により測定した結果、９９．４％であった。
【００６３】
必要であれば前記濾過ケークを脱色してもよい。該ケークを２０Ｌの水に溶解し、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０ｓｓを用いて脱塩させた。該プラバスタチンナトリウム溶出液を減圧下で濃縮し、３０％（ｗ／ｗ）プラバスタチンナトリウムとした。該濃縮液に４００Ｌのアセトンを添加し、２５〜３０℃で４〜６時間攪拌した。次いで、０〜５℃に冷却し、３時間攪拌してプラバスタチンナトリウムを結晶化させて、濾過し乾燥させて、純度９９．５７％の精製プラバスタチンナトリウムを総収率５６％で１．６８ｋｇ得た。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によれば、高性能液体クロマトグラフィのような装置を使用しない極めて簡便な操作により、高純度のプラバスタチンナトリウムを高収率で精製することができる。また抽出法を用いていないことから、乳化現象による収率の低下を防止でき、さらに環境に負荷を与える有害な有機溶媒を大量に使用する必要がない。したがって、本発明の精製方法によれば、環境を汚染せず安全であるばかりか、環境保全のためのコストも削減され、極めて経済的である。
Claims (6)
- 下記の（ａ）〜（ｄ）の工程を有する、プラバスタチンナトリウムの精製方法。
（ａ）： プラバスタチンナトリウムを含有する醗酵培養液を遠心分離および／または濾過してプラバスタチンナトリウムを含有する溶液を得た後、該溶液のｐＨを１０〜１３の範囲に調整する工程
（ｂ）： 前記溶液を非イオン性樹脂に吸着させ該樹脂を洗浄液で洗浄後、吸着したプラバスタチンナトリウムを水溶性有機溶剤で溶出してプラバスタチンナトリウム画分を得、該画分を濃縮してプラバスタチンナトリウム濃縮液を得る工程
（ｃ）： 前記濃縮液を処理してプラバスタチンナトリウムの沈殿物を形成させる工程
（ｄ）： 前記沈殿物を再結晶させることにより精製プラバスタチンナトリウムを得る工程 - 前記（ｂ）工程における水溶性有機溶剤は、メタノール、アセトンおよびこれらの混合物並びにこれらの水溶液からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
- 前記（ｃ）工程における濃縮液の処理は、前記濃縮液に水溶性反溶剤を添加する工程を含むものである、請求項１または２に記載の方法。
- 前記水溶性反溶剤は、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトンからなる群から選択される１種または２種以上のものである、請求項３に記載の方法。
- 前記（ｃ）工程における濃縮液の処理は、前記濃縮液に無機塩を添加してプラバスタチンナトリウムを塩析させる工程を含むものである、請求項１または２に記載の方法。
- 前記無機塩は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項５に記載の方法。
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