JPH04187092A - マイトマイシンｃの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、マイトマイシンＣの培養液からマイトマイシ
ンＣを精製する方法に関する。

従来の技術 マイトマイシンＣは、ストレプトミセス・ケスビトーズ
スの菌株を培養することによって得られる抗腫瘍性抗生
物質であり、広く臨床に供せられている。

従来、上記菌株を培養して得られる培養液からマイトマ
イシンＣを精製する方法としては、菌体を分離して得ら
れる培養Ｐ液に活性炭を加えて吸着させ、有機溶媒で溶
出させる活性炭吸着法、あるいは培養Ｐ液から有機溶媒
に転溶して得られるマイトマイシンＣの濃縮液を、アル
ミナクロマトグラフィー法もしくは向流分配法に付し精
製する方法が知られている（Ａ法；特公昭３５−１７８
９７号公報）。

また、その改良法として、培養Ｐ液を逆相吸着樹脂に吸
着させた後、アセトン、メタノールまたはエタノール等
の溶媒で溶出し、溶出液を濃縮して溶媒を除去し、食塩
を飽和してクロロホルムに転溶し、クロロホルム抽出液
をアルミナカラムクロマトグラフィーに付し、マイトマ
イシンＣの吸着帯をメタノールで溶出し、溶出液を濃縮
してエーテル、石油エーテル、ベンジンまたはりグロビ
ンを加えてマイトマイシンＣの結晶を得る方法が知られ
ている（Ｂ法；特公昭３６−９０９４号公報）。

発明が解決しようとする１ｌｌＨ 前記Ａ法においては、活性炭吸着後の溶出、あるいは有
機溶媒への転溶等の操作が非箭率的で、マイトマイシン
Ｃの回収率が低い等の問題点を有している。

さらに、Ｂ法においても例えば、逆相吸着樹脂として具
体的に例示されているデュオライ）Ｓ−３０（デュオラ
イト社）は、マイトマイシンＣの吸着力が低く、大量の
樹脂および溶媒を使用する必要がある。クロロホルムに
転溶する際、抽出率が低く多量のクロロホルムを使用し
、また抽出操作を繰り返す必要がある。また、クロマト
後アルミナ吸着帯からのマイトマイシンＣを溶出単離す
る工程は操作が煩雑であり、また作業環境上望ましいも
のではない。さらに、得られる溶出液の純度も良好なも
のではなく、該溶出液から晶析して得られる結晶は、再
結晶しなければ純度的に充分なものではなく、また精製
工程全体に要する時間が長い等の種々の問題点を有して
いる。

従って、該改良法においても工業的精製法としては、作
業性、生産性等の観点から必ずしも十分ではなく、さら
に有用な精製法の開発が望まれている。

課題を解決するための手段 本発明により、工業的規模でのマイトマイシンＣの有利
な精製法が提供される。すなわち、本発明は ａ、　マイトマイシンＣ生産菌の培養液を逆相吸着樹脂
で処理して、マイトイシンＣを該樹脂に吸着させる工程
、 ｂ、　該樹脂から酢酸エチルでマイトマイシンＣを溶出
させる工程、 Ｃ０溶出液にリン酸緩衝液を加えた後、蒸留して酢酸エ
チルを留去する工程、 ｄ、　蒸留残液を粒径の小さい逆相吸着剤を充填したカ
ラムに加圧下に通液し、マイトマイシンＣを該樹脂に吸
着させる工程、 ｅ、　該樹脂から加圧下に含水メタノールで溶出する工
程、 ｆ、　溶出液を逆相吸着樹脂で処理し、マイトマイシン
Ｃを該樹脂に吸着させる工程、 ｇ、　該樹脂からメタノールでマイトイシンＣを溶出さ
せる工程、 ｈ、　メタノール溶出液を濃縮してマイトマイシンＣを
晶析させる工程 から成ることを特徴とするマイトマイシンＣの精製法に
関する。

以下に、本発明の精製法についてより詳細に説明する。

公知の方法（例えば、特公昭３５−１７８９７号公報）
により得られるマイトマイシンＣの培養液かう菌体等を
分離して得られる培養Ｐ液を冷却し、ｐｕをリン酸で６
．８〜７．０に調整した後、逆相吸着樹脂に通液する。

ここで、逆相吸着樹脂としては、従来使用されていたフ
ェノール系樹脂であるデュオライト５−３０に代えて、
ポリスチレンジビニルベンゼン系樹脂が好適に用いられ
る。該樹脂の具体例としてはダイヤイオン５Ｐ−２０７
（三菱化成）があげられ、樹脂の使用量はマイトマイシ
ン１ｇに対して、従来、デュオライ）Ｓ−３０が３１必
要であるのに対して、ダイヤイオン５Ｐ−２０７では３
００〜５００ｍ１の範囲であり、通常４００ｍ１で充分
である。

次いで、マイトマイシンＣを吸着させた樹脂を洗浄後、
酢酸エチルで溶出する。溶出に使用される酢酸エチルの
量は、通常樹脂１１に対し１．５〜２１である。

吸着樹脂としてデュオライ）Ｓ−３０に代えてダイヤイ
オン５Ｐ−２０７を使用することにより、マイトマイシ
ンＣの樹脂への吸着力の向上および溶出溶媒の使用量の
大幅な減少がはかられる。

次に、得られた酢酸エチル溶出液に対して１〜２倍量の
ｐＨが６，５〜８．０のリン酸緩衝液（０，０１モル／
１　リン酸す）　ＩＪウム）を加え、減圧下に酢酸エチ
ルを留去することによりマイトマイシンを含有したリン
酸緩衝液が得られる。なお、該処理方法は従来のクロロ
ホルムへの転溶法に比べ、大量の有機溶媒を使用するこ
となく操作も簡便であり、緩衝液を使用することにより
濃縮中にマイトマイシンＣの分解を防止することもでき
る。

このようにして調製されたマイトマイシンＣを含有した
リン酸緩衝液は、粒径の小さい逆相吸着剤を充填したカ
ラムに通液し、水で洗浄後吸着したマイトマイシンＣを
含水メタノールで溶出させる。通常、該操作は、多量の
試料を短時間に分離性良く、かつ高収率にマイトマイシ
ンＣを得るために加圧下に処理する方法（いわゆる、高
速液体クロマトグラフィー法；以下、ＨＰＬＣ法という
）が効率的である。

該ＨＰＬＣ法において、工業的規模で、多量の試料を処
理するのに好適な逆相吸着剤としては、例えばオクタデ
シル化シリカゲルが使用され、該シリカゲルの具体例と
しては、０ＤＳ−ＡＱ６０あるいは０ＤＳ−ＡＱＩ　２
０　（山村化学）などがあげられる。

充填剤（吸着剤）は、試料の処理量、分離性などの観点
より粒径１０〜２００μ、望ましくは５０μ練度であり
、通常マイトマイシンｃ、ｇに対して２００〜３００ｍ
使用される。マイトマイシンＣの吸着および溶出時の圧
力は１０〜５０ｋｇ／ｃ＋ｎ”であり、溶出に用いられ
る含水メタノールの濃度は２０〜４０％が好ましく、溶
出時の流速はｓＶ１〜５である。

ＨＰＬＣ法は、従来のアルミナカラムクロマトグラフィ
ー法に比べて精製度、操作性あるいは作業理境等におい
て優れた方法である。

次に、クロマト分離で希釈されたマイトマイシンＣを濃
縮するため、マイトマイシンＣの溶出画分を含むメタノ
ール水溶液のメタノール濃度を１０％以下に調製し、再
度少量の逆相吸着樹脂に通液する。吸着樹脂としては、
前記と同様のポリスチレンジビニルベンゼン系樹脂が好
ましく、例えばダイヤイオン５Ｐ−２０７が用いられ、
使用量はマイトマイシンｃ、ｇに対して８０〜１００ｍ
１である。溶出はメタノールで行い、通常樹脂１１に対
して２〜３１使用される。

マイトマイシンＣの両分を含むメタノール溶出液は、減
圧下に約２００〜２５０ｇ／ｊ！に濃縮し、５〜１０℃
で５〜１０時間放置することにより晶析させる。析出し
た結晶をｐ取、乾燥することにより高純度のマイトマイ
シンＣを得ることができる。

従来、クロマト処理後さらに再結晶することにより高純
度の製品としていたのに対して、本晶析法においては、
再結晶することな〈従来品と同等の高純度のマイトマイ
シンＣを得ることが可能である。

本発明の精製法は上記した特徴の他に、精製収率の向上
、操作時間の短縮等の特徴をあげることができる。

以下の実施例および比較例で本発明の詳細な説明する。

なお、実施例および比較例中のマイトマイシンＣの純度
は下記条件下のＨＰＬＣで分析した。

カラム、ＹＭＣＡＭ−３１２・０ＤＳ ６φＸ１５０ｍｍＬ 溶出液；２０％メタノール二８０％Ｏ，０１Ｍ酢酸アン
モニウム　ＰＩＩ６．５ 溶出速度；１ｍｌ／分 温度；３５℃ 検出：　ＵＶ　（２５４％ｍ） 実施例 マイトマイシンＣ５００ｇを含む培養液４３００矛に、
濾過助剤ラジトライト＃５００（昭和化学工業）を３０
０ｋｇ加え、フィルタープレスで濾過した。得られたｐ
液５０００ｆにリン酸を加えｐＨを７に調整したのち、
ダイヤイオン５Ｐ−２０７２００Ｉ！を充填したカラム
へ１００ＯＪ／時の流速で通液した。カラムを水洗後、
酢酸二チル４００１を２００１７時の流速で流し、溶出
液４００１を得た。溶出液はマイトイシンＣ４３６ｇを
含有していた。ｐ　Ｈ７，５のリン酸緩衝液４００１を
加え、減圧下に濃縮し酢酸エチルを留去した。得られた
水溶液３００１を○ＤＳ−Ａ１２０−５５０８０１！を
充填した工業用）ＩＰＬＣカラムに２０ｋｇ／工２の圧
力下に２００１７時の流速で通液した。

次いで、１０％メタノール水溶液８０Ｊで洗浄したのち
、３０％メタノール水溶液６００１でＳ■３の流速で溶
出した。マイトマイシンＣ４０６ｇを含有した溶出画分
８０１へ水１６０βを加え、ダイヤイオン５Ｐ−２０７
３０Ｊを充填したカラムへＩ　５０１／時の流速で通液
した。樹脂内の水を押出したのち、メタノールで溶出し
、マイトマイシンＣ３８０ｇ（純度９７．６％）を含有
したメタノール溶液６０１を得た。減圧下に１．９１ま
で濃縮し、５℃で１０時間熟成した。析出した結晶を戸
数し、真空乾燥することによりマイトマイシンＣ３５０
ｇ（純度　９９．７％）を得た。

参考例 実施例と同様にして得られる培養Ｐ液５０００１にリン
酸を加えてｐＨを７に調整したのちデュオライト５−３
０　１５００１を充填したカラムへ２０００１７時の流
速で通液した。カラムを水洗後、アセトン２０００１／
時の流速で流し、溶出液２０００１を得た。溶出液はマ
イトマイシンＣ４３４ｇを含有していた。水５００１を
加え、減圧下に濃縮しアセトンを留去し、３００１の水
溶液を得た。食塩３５ｋｇを加え溶解したのち、クロロ
ホルＡ３００１を加え攪拌した。クロロボルム層を分離
したのち、水層へ再度クロロポルムを添加し、攪拌後ク
ロロホルム層を分離した。この操作を５回纏り返し、ク
ロロホルム抽出液１５００１を得た。マイトマイシンＣ
の含有量は４１５ｇであった。抽出液を１５Ｏ１ずつに
分割し、あらかじめ１２０℃で２０時間乾燥して活性化
したアルミナ３１を充填したカラム１ｏ本へ、それぞれ
通液した。次いで各々のカラムに３％のメタノールを含
有したクロロホルム４ノを流した。

溶媒を抜き取ったのち、アルミナ層をカラムより抜き取
り、１０本分のマイトマイシンＣの吸着帯を切り取り、
５０１のメタノール中で３０分間攪拌し濾過することに
よりマイトマイシン０３３６ｇ（純度８０．４％）を含
有したＰ液を得た。減圧下に１．７１まで濃縮し、５０
℃で１０時間熟成した。析出した結晶を戸数し、真空乾
燥することによりマイトマイシンＣ２９６ｇ（Ｋ度９７
．４％）を得た。

この結晶を９０１のメタノールに溶解し、減圧下に１．
５１まで濃縮し、５℃で１０時間熟成した。

析出した結晶を戸取し、真空乾燥することによりマイト
マイシンＣ２７２ｇ（純度９９．７％）を得た。

発明の効果 本発明により、マイトマイシンＣの工業的規模での効率
的精製法が提供される。

特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社代表者　　
加　藤　幹　夫、？ぞさ、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ、マイトマイシンＣ生産菌の培養液を逆相吸着樹
   脂で処理して、マイトマイシンＣを 該樹脂に吸着させる工程、 ｂ、該樹脂から酢酸エチルでマイトマイシンＣを溶出さ
   せる工程、 ｃ、溶出液にリン酸緩衝液を加えた後、蒸留して酢酸エ
   チルを留去する工程、 ｄ、蒸留残液を粒径の小さい逆相吸着剤を充填したカラ
   ムに加圧下に通液し、マイトマ イシンＣを該樹脂に吸着させる工程、 ｅ、該樹脂から加圧下に含水メタノールで溶出する工程
   、 ｆ、溶出液を逆相吸着樹脂で処理し、マイトマイシンＣ
   を該樹脂に吸着させる工程、 ｇ、該樹脂からメタノールでマイトイシンＣを溶出させ
   る工程、 ｈ、メタノール溶出液を濃縮してマイトマイシンＣを晶
   析させる工程 から成ることを特徴とするマイトマイシンＣの精製法。 ２）マイトマイシンＣ生産菌の培養液および含水メタノ
   ールでの溶出液を処理しマイトマイシンＣを吸着させる
   逆相吸着樹脂が、ポリスチレンジビニルベンゼン系樹脂
   である請求項（１）記載の精製法。 ３）リン酸緩衝液のｐＨが、６．５〜８．０である請求
   項（１）記載の精製法。 ４）加圧処理時のカラムの充填剤として使用される粒径
   の小さい逆相吸着剤が、オクタデシル化シリカゲルであ
   る請求項（１）記載の精製法。 ５）オクタデシル化シリカゲルの粒径が、１０〜２００
   μである請求項（４）記載の精製法。 ６）マイトマイシンＣ含有のリン酸緩衝液の通液時およ
   び含水メタノールで溶出時の圧力が、１０〜５０ｋｇ／
   ｃｍ＾２である請求項（１）記載の精製法。 ７）溶出用含水メタノール濃度が、２０〜５０％である
   請求項（１）記載の精製法。