JP2004073199A - Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓ変異体、および血圧低下活性を有する発酵産物を調製する際のその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明の課題は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの新規変異体を使用して、少量のシトリニンを含有する、血圧低下活性を有する発酵産物を生成することである。
【解決手段】 本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体を提供し、この変異体は、コメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培地中で培養した場合に、１．０ｐｐｍ未満の量のシトリニンと共に、０．０３ｍｇ／ｍｌに達するＧＡＢＡ濃度で発酵産物を生成する。１つの実施形態において、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ＣＣＲＣ ３１４９９の変異体が提供される。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体を提供し、この変異体は、コメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培地中で培養した場合に、１．０ｐｐｍ未満の量のシトリニンと共に、０．０３ｍｇ／ｍｌに達するＧＡＢＡ濃度で発酵産物を生成する。１つの実施形態において、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ＣＣＲＣ ３１４９９の変異体が提供される。
【選択図】 なし
Description
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体；および血圧低下活性を有する発酵産物を調製する際のその使用を提供する。
近年、心血管疾患（例えば、高血圧症）は、主要な死亡原因の１つになっており、そしてこれらの疾患を有する集団は、毎年増加している。高血圧症は、慢性疾患であるので、患者は、抗高血圧薬を長期にわたって取らなければならない。日本の統計データに従って、抗高血圧薬の市場は、年間５００億円で安定し、そして、血圧制御に関する健康食品の市場は、１９９７年の１４億円から、１９９９年の７２億円へと増加した。従って、血圧低下活性を有する薬物および食品の需要は、世界中で毎年増加している。
歴史的に、Ｍｏｎａｓｃｕｓ属は、伝統的な中国の医薬および食品の調製の際に広く使用され、そして中国において食品添加物として使用されてきた。特許文献１は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属およびＭｏｎａｓｃｕｓ属由来の代謝産物が、高血圧症の症候群を改善し得ることを開示している。Ｋｏｈａｍａら（非特許文献１）は、発酵液体中のγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）およびアセチルコリン（Ａｃｈ）が、血圧を低下させる効果を有することを見出した。特許文献２は、血圧低下活性を有する物質を回収するための方法を開示する。特許文献３は、血圧低下活性を有する物質の生成を増加させる際の、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓについての改善された培養培地を提供する。特許文献４は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓから調製された、血圧低下活性を有する食品（これは、ＧＡＢＡおよびグルコサミンを含む）を開示する。特許文献５は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓを使用して、レッドライス（ｒｅｄ ｒｉｃｅ）を発酵することによって調製される、一酸化窒素供与組成物（これは、血管拡張および血圧低下に対して、効果を有する）を開示する。
Ｂｌａｎｃら（非特許文献２）は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓが、シトリニン（ｃｉｔｒｉｎｉｎ）と称される真菌毒素を生成することを見出しており、このことが、Ｍｏｎａｓｃｕｓ産物の安全性に対するかなりの注意を喚起した。特許文献６は、赤色色素の生成において、シトリニンの量を減少させる（１ｐｐｍ未満）ための変異方法を開示している。しかし、血圧低下活性は、この文献には開示されなかった。
Ｍｏｎａｓｃｕｓ属の微生物は、血圧低下のための物質を生成するために広く使用されているが、その産物は、多量のシトリニンを含有する。従って、発酵産物の安全性については、関心が持たれている。
ＪＰ ６１１９７５２４
ＪＰ ６２２９８５９８
ＪＰ ０３０９００３１
ＪＰ ２０００２７９１６３
ＷＯ ０１／３１０４８ Ａ１
ＪＰ ７２７４９７８
Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、３５、（１９８７）、２４８４−２４８９
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌｏｇｙ；２７、（１９９５）、２０１−２１３
本発明の課題は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの新規変異体を使用して、少量のシトリニンを含有する、血圧低下活性を有する発酵産物を生成することである。
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体を提供し、この変異体は、コメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培地中で培養した場合に、１．０ｐｐｍ未満の量のシトリニンと共に、０．０３ｍｇ／ｍｌに達するＧＡＢＡ濃度で発酵産物を生成する。
１つの実施形態において、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ＣＣＲＣ ３１４９９の変異体が提供される。
１つの実施形態において、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８６で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２と同一の特徴を有するか、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８５で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ１０３３と同一の特徴を有する変異体が提供される。
１つの実施形態において、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８６で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２である変異体が提供される。
１つの実施形態において、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８５で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ１０３３である変異体が提供される。
別の局面において、本発明は、発酵産物を生成するための方法を提供し、この方法は、上記変異体を適切な条件下で培養することによって特徴付けられ、この発酵産物は、ＧＡＢＡを含み、そしてこの発酵産物に含まれるシトリニンの量は、１．０ｐｐｍ未満である。
１つの実施形態において、上記発酵産物が、血圧低下活性を有する方法が提供される。
１つの実施形態において、上記変異体が、固体培地または液体培地において培養される方法が提供される。
１つの実施形態において、上記培地のｐＨ値が、３〜９の間である方法が提供される。
１つの実施形態において、上記培地のｐＨ値が、５〜７の間である方法が提供される。
１つの実施形態において、上記発酵産物中のシトリニンの量が、０．５ｐｐｍ未満である方法が提供される。
１つの実施形態において、上記発酵産物中のシトリニンの量が、０．１５ｐｐｍ未満である方法が提供される。
１つの実施形態において、上記発酵産物が、薬学的組成物の活性成分または食品添加物として使用され得る方法が提供される。
１つの実施形態において、上記方法は、血圧低下活性を有する前記成分を精製して、精製された成分を得る精製工程をさらに包含する。
別の局面において、本発明は、上記変異体によって生成される発酵産物によって調製され、該発酵産物中のシトリニンの量が、１．０ｐｐｍ未満である、薬学的組成物を提供する。
１つの実施形態において、血圧を低下させる際の使用のための薬学的組成物が提供される。
１つの実施形態において、上記発酵産物中のシトリニンの量が、０．５ｐｐｍ未満である薬学的組成物が提供される。
１つの実施形態において、上記発酵産物中のシトリニンの量が、０．１５ｐｐｍ未満である薬学的組成物が提供される。
１つの実施形態において、上記方法によって生成される発酵産物によって調製される薬学的組成物が提供される。
１つの実施形態において、さらに精製された発酵産物により調製される薬学的組成物が提供される。
別の局面において、本発明は、上記変異体によって生成される発酵産物によって調製される食品添加物を提供し、この発酵産物中のシトリニンの量が、１．０ｐｐｍ未満である、食品添加物。
１つの実施形態において、血圧低下活性を有する食品添加物が提供される。
１つの実施形態において、上記発酵産物中のシトリニンの量が、０．５ｐｐｍ未満である食品添加物が提供される。
１つの実施形態において、上記発酵産物中のシトリニンの量が、０．１５ｐｐｍ未満である食品添加物が提供される。
１つの実施形態において、上記方法によって生成される発酵産物によって調製される食品添加物が提供される。
１つの実施形態において、さらに精製された発酵産物により調製される食品添加物が提供される。
（発明の要旨）
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの新規変異体を提供し、この変異体は、任意のさらなる処理工程なしに、安価な天然原材料を含む固体または液体の培地中で、血圧低下活性を有する発酵産物を生成し、そしてこの産物は、少量のシトリニンを含有する。
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの新規変異体を提供し、この変異体は、任意のさらなる処理工程なしに、安価な天然原材料を含む固体または液体の培地中で、血圧低下活性を有する発酵産物を生成し、そしてこの産物は、少量のシトリニンを含有する。
本発明はまた、本発明の新規変異体を使用することによって、血圧低下活性を有する発酵産物を生成するための方法を提供する。
本発明はさらに、本発明の新規変異体により生成される発酵産物によって調製される、薬学的組成物および食品添加物を提供する。
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ変異体に関し、この変異体は、非常に少量のシトリニンと共に、血圧低下活性を有する発酵産物の調製において有用である。
本発明はまた、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ変異体を使用して、血圧低下活性を有する発酵産物を調製するためのプロセス、および血圧を低下させる際のこの発酵産物の使用を提供する。
本発明によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの新規変異体を使用して、少量のシトリニンを含有する、血圧低下活性を有する発酵産物を生成する方法が提供される。
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓを変異させ、そしてそれらをスクリーニングすることによって得られたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体を提供する。この変異体は、６０ｇ／ｌのコメ粉末、３０ｇ／ｌのダイズ粉末およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培養培地中でインキュベートされ、発酵産物中のＧＡＢＡの量が０．０３ｍｇ／ｍｌまでの場合に、シトリニンの量が１ｐｐｍ未満、好ましくは０．５ｐｐｍ未満、そして最も好ましくは０．１５ｐｐｍ未満である。
本発明は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓを変異させ、そしてそれらをスクリーニングすることによって得られたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体を提供する。この変異体は、６０ｇ／ｌのコメ粉末、３０ｇ／ｌのダイズ粉末およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培養培地中でインキュベートされ、発酵産物中のＧＡＢＡの量が０．０３ｍｇ／ｍｌまでの場合に、シトリニンの量が１ｐｐｍ未満、好ましくは０．５ｐｐｍ未満、そして最も好ましくは０．１５ｐｐｍ未満である。
本発明によれば、全ての既知のＧＡＢＡ生成Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ株が、以下の変異体を調製するための親株として使用され得る：例えば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ＣＣＲＣ ３１４９７（ＡＴＣＣ １６３７５、ＣＢＳ ２８０．３４およびＩＦＯ ４４８９とも称される）、ＣＣＲＣ ３１４９８（ＡＴＣＣ １６３５８、ＣＢＳ ２８１．３４およびＩＦＯ ４４８６とも称される）、ＣＣＲＣ ３１４９９（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ａｎｋａ、ＡＴＣＣ １６３６０、ＣＢＳ ２８３．３４、ＩＦＯ ４４７８およびＫＦＣＣ １１８３２とも称される）、ＣＣＲＣ ３１５０１（ＡＴＣＣ １６３６２、ＣＢＳ ２８５．３４およびＩＦＯ ４４８５とも称される）、ＣＣＲＣ ３１５０４ （ＡＴＣＣ １６３６７、ＣＢＳ ２８８．３４およびＩＦＯ ４４８４とも称される）、ＣＣＲＣ ３１５４１（ＡＴＣＣ １６３７９およびＩＦＯ ５９６５とも称される）またはＣＣＲＣ ３１５４２（ＡＴＣＣ １６３６５、ＣＢＳ １０９．０７およびＩＦＯ ４１５３とも称される）。これらは、全て、Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）、Ｈｓｉｎ−Ｃｈｕ、Ｔａｉｗａｎから入手可能である。
本発明によれば、「変異体」とは、遺伝子組成が、その親株と比較して、少なくとも１ヌクレオチド異なる株をいい、そしてこの変異体ヌクレオチド配列は、細胞の生理学を変化させ得る。本発明の変異体は、親株のランダム変異誘発（例えば、化学的変異原、トランスポゾンもしくは照射によるか、または親株の遺伝子のヌクレオチド配列の１以上のヌクレオチドを、置換、欠失もしくは挿入するための組換え核酸技術を使用する）を含む、多数の方法によって生成され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．）。次いで、親株よりも、生成されるＧＡＢＡの量がより高く、かつ生成されるシトリニンがより低い変異体を、スクリーニングおよび単離し得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体は、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２およびＭ１０３３と同一の特性を有する。Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ株Ｍ０２０およびＭ１０３３は、Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｔａｉｗａｎによって、２００２年２月２０日に、それぞれ、受託番号ＣＣＲＣ ９３００５２およびＣＣＲＣ９３００５３で寄託され、そしてまた、ブダペスト条約に従って、２００２年６月２１日に、それぞれ、受託番号ＰＴＡ−４４８６およびＰＴＡ−４４８５でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ）に寄託された。
本発明によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ変異体を使用することによる、発酵産物の生成のための方法は、固体または液体の培養培地における発酵によって、実行され得る。
本発明によれば、全ての公知の炭素供給源および窒素供給源が、培養培地に添加され得る。天然材料が、本発明の好ましい実施形態であり、ここで、炭素供給源としては、コメ粉末、トウモロコシデンプン、コメデンプン、コムギデンプン、グルコース、マルトース、スクロース、グリセロールおよびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されず；そして窒素供給源としては、ダイズ粉末、ダイズ胚乳、消化胚乳、酵母抽出物、コーンスティープリカー、グルタミン酸、塩化アンモニウム、硝酸カリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好ましい生成方法によれば、培養培地のｐＨ値は、３〜９であり、好ましくは５〜７である。
本発明によれば、この変異体によって生成される発酵産物は、血圧低下活性を有する物質（例えば、ＧＡＢＡ、グルコサミンおよびアセチルコリン）を含む。ＧＡＢＡは、中枢神経系において神経伝達を阻害する主な物質であり、関連のレセプターとしては、ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＢが挙げられる。動物研究において、ＧＡＢＡＡの活性化は、血圧低下活性、鎮痙活性および抗不安活性の生理学的現象に関連することが見出された。また、ＧＡＢＡが高血圧症を処置する活性を有する場合、多くの抗高血圧薬の血圧低下活性は、ＧＡＢＡの量を制御することによって達成される。従って、ＧＡＢＡの量は、血圧低下活性の重要な指標である。
本発明によれば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓによって生成される発酵産物中のシトリニンの量は、１ｐｐｍ未満、好ましくは０．５ｐｐｍ未満、そして最も好ましくは０．１５ｐｐｍ未満である。
本発明によれば、血圧低下活性を有する発酵産物は、薬学的組成物の活性成分または食品添加物として直接使用され得る。発酵産物中の血圧低下活性を有する物質は、種々の従来技術（例えば、Ｋｏｈａｍａら（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、３５、（１９８７）、２４８４−２４８９）およびＪＰ ６２２９８５９８によって開示される精製方法および抽出方法）によってさらに精製され得る。
以下の実施例は、例示のために使用され、本発明を限定するためではない。
（一般的分析方法）
（１）ＧＡＢＡの定量的分析
この株の発酵液０．６ｍｌと０．６ｍｌ ＬａＣｌ３との混合物を、湯浴中にて６０℃で３０分間インキュベートした。この混合物を遠心分離し、そして０．１ｍｌの上清を、水８５０μｌ中の５０μｌのＫＯＨ（１Ｍ）と５分間反応させた。この反応産物を遠心分離し、そして上清を保存した。
（１）ＧＡＢＡの定量的分析
この株の発酵液０．６ｍｌと０．６ｍｌ ＬａＣｌ３との混合物を、湯浴中にて６０℃で３０分間インキュベートした。この混合物を遠心分離し、そして０．１ｍｌの上清を、水８５０μｌ中の５０μｌのＫＯＨ（１Ｍ）と５分間反応させた。この反応産物を遠心分離し、そして上清を保存した。
保存した上清サンプル（５５０μｌ）を、１５０μｌのＮＡＤＰ（４ｍＭ）、２００μｌのリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．６）および５０μｌのＧＡＢＡＳＥ（２単位／ｍｌ）と混合した。混合サンプルのＯＤ３４０の吸光度を、分光光度計で直ぐに測定し、そして記録した。この混合物に、５０μｌのα−ケトグルタル酸を添加して、６０分間反応させ、ＯＤ３４０の吸光度を再び測定した。反応の前および後で測定した２つのＯＤ３４０値間の差異を計算した。この差異を、ＧＡＢＡ標準値と比較して、発酵液体サンプル中のＧＡＢＡの濃度を計算した。
（２）シトリニンの定量的分析
以下のＨＰＬＣ分析手順を使用して、この株の発酵液中のシトリニンの量を決定した。７ｍｌの発酵液を、３．５のｐＨに調整し、次いで１時間インキュベートした。３ｍｌの酢酸エチルをこの液体に添加し、そして３０分後に、酢酸エチル層を回収した。添加工程および酢酸エチル回収工程を、２回繰り返し、次いで、回収した溶液を乾燥した。
以下のＨＰＬＣ分析手順を使用して、この株の発酵液中のシトリニンの量を決定した。７ｍｌの発酵液を、３．５のｐＨに調整し、次いで１時間インキュベートした。３ｍｌの酢酸エチルをこの液体に添加し、そして３０分後に、酢酸エチル層を回収した。添加工程および酢酸エチル回収工程を、２回繰り返し、次いで、回収した溶液を乾燥した。
乾燥サンプルを、１ｍｌのメタノール中に溶解し、次いで、０．２μｍの孔サイズを有する膜を通過させた。１０μｌの濾液を、以下の条件下でＨＰＬＣ分析について適用した：
（本発明の変異体の変異誘発およびスクリーニング）
Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ株ＣＣＲＣ３１４９９を、ＰＤＡ（ジャガイモ由来の浸剤（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）２０％、Ｂａｃｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２％および寒天２％）の傾斜培地上に接種し、そして３０℃で７日間インキュベートした。この胞子を、滅菌水で洗浄して除いた。この収集した胞子懸濁物（１ｍｌ当たり、１×１０７を超える胞子を含む）に、ＵＶ光を２分間照射した。連続希釈後、希釈した胞子懸濁サンプルを、ＰＤＡプレート上に広げ、そして３０℃で２〜３日インキュベートした。次いで、コロニーを、コメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培地中に接種して、変異体の安定性を試験し、そして生成されたＧＡＢＡおよびシトリニンの量を決定した。
Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ株ＣＣＲＣ３１４９９を、ＰＤＡ（ジャガイモ由来の浸剤（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）２０％、Ｂａｃｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ２％および寒天２％）の傾斜培地上に接種し、そして３０℃で７日間インキュベートした。この胞子を、滅菌水で洗浄して除いた。この収集した胞子懸濁物（１ｍｌ当たり、１×１０７を超える胞子を含む）に、ＵＶ光を２分間照射した。連続希釈後、希釈した胞子懸濁サンプルを、ＰＤＡプレート上に広げ、そして３０℃で２〜３日インキュベートした。次いで、コロニーを、コメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培地中に接種して、変異体の安定性を試験し、そして生成されたＧＡＢＡおよびシトリニンの量を決定した。
安定な変異体を単離し、そしてＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２と命名した。この変異体をＰＤＡ傾斜培地上に接種し、そして３０℃で７日間インキュベートした。胞子を、滅菌水で洗浄して除いた。この胞子懸濁物（５×１０５胞子）を、コメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含有する培地の５０ｍｌを含む２５０ｍｌのフラスコに移し、そして１５０ｒｐｍで攪拌しながら、３０℃で５〜７日間インキュベートした。この変異体によって生成された発酵液を回収し、そしてＧＡＢＡおよびシトリニンの量を決定した。この結果は、ＧＡＢＡおよびシトリニンの量が、それぞれ、０．０３９ｍｇ／ｍｌおよび０．１５ｐｐｍ未満であったことを示す。同じ条件下で、親株Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ＣＣＲＣ ３１４９９により生成された発酵液中のＧＡＢＡおよびシトリニンの量は、それぞれ、０．０３１ｍｇ／ｍｌおよび２．１ｐｐｍであった。
上記の変異誘発方法により、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２を、再び変異させ、そして別の変異体（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ１０３３と称される）を単離した。小麦粉８０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌおよびグルタミン酸１０ｇ／ｌを含有する培地中でこの変異体によって生成される発酵液において、ＧＡＢＡおよびシトリニンの量は、それぞれ、２．０７ｍｇ／ｌおよび０．１５ｐｐｍ未満であった。同じ条件下で、Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２によって生成された発酵液中のＧＡＢＡおよびシトリニンの量は、それぞれ、０．８３４ｍｇ／ｍｌおよび０．１５ｐｐｍ未満であった。
Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２の形態学的特徴を以下に示す：
（ＣＹＡ培地（スクロース３０ｇ／ｌ、ＮａＮＯ３ ３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４ ０．０１ｇ／ｌ、酵母抽出物 １ｇ／ｌおよび寒天 １５ｇ／ｌを含有する））
７日間の培養後、コロニーは、黄みがかったオレンジ色を呈し、そして１１ｍｍ〜１４ｍｍの直径を有し、そして気菌糸の色は、白色であった。
（ＣＹＡ培地（スクロース３０ｇ／ｌ、ＮａＮＯ３ ３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４ ０．０１ｇ／ｌ、酵母抽出物 １ｇ／ｌおよび寒天 １５ｇ／ｌを含有する））
７日間の培養後、コロニーは、黄みがかったオレンジ色を呈し、そして１１ｍｍ〜１４ｍｍの直径を有し、そして気菌糸の色は、白色であった。
１０日間の培養後、コロニーは、黄みがかったオレンジ色を呈し、そして３０ｍｍ〜３２ｍｍの直径を有し、そして気菌糸の色は、白色であった。
分生子柄の柄は、無色であり、そして不規則な分枝を有した。
分生子柄は、滑らかな洋ナシ型の形状であった。各分生子柄の直径は、３〜４×９．５〜１２．５μｍであり、そして壁の厚さは、２μｍであった。
ＣＹＡ培地中での２１日間の培養後、子嚢果は見出されなかった。
（ＭＥＡ培地（マルトース抽出物２０ｇ／ｌ、ペプトン １ｇ／ｌ、グルコース ２０ｇ／ｌおよび寒天 １５ ｇ／ｌを含有する））
７日間の培養後、コロニーは、赤みがかったオレンジ色を呈し、そして２８〜３０ｍｍの直径を有した。
７日間の培養後、コロニーは、赤みがかったオレンジ色を呈し、そして２８〜３０ｍｍの直径を有した。
１０日間の培養後、コロニーは、赤みがかったオレンジ色を呈し、そして３４〜３７ｍｍの直径を有した。
分生子柄の柄は、赤色であり、そして不規則な分枝を有した。
ＭＥＡ培地での２１日間の培養後、子嚢果は完全には成熟しておらず、そしてこの子嚢果は、卵型の形状（４．５〜５×５〜６μｍ）であった。
Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ１０３３の形態学的特徴を、以下に示す：
（ＣＹＡ培地（スクロース ３０ｇ／ｌ、ＮａＮＯ３ ３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４ ０．０１ｇ／ｌ、酵母抽出物 １ｇ／ｌおよび寒天 １５ ｇ／ｌを含有する））
７日間の培養後、コロニーは、黄みがかったオレンジ色を呈し、そして１３ｍｍ〜１４ｍｍの直径を有し、そして気菌糸は、短く、小さく、そして非常に少ししか見出されなかった。
（ＣＹＡ培地（スクロース ３０ｇ／ｌ、ＮａＮＯ３ ３ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４ ０．０１ｇ／ｌ、酵母抽出物 １ｇ／ｌおよび寒天 １５ ｇ／ｌを含有する））
７日間の培養後、コロニーは、黄みがかったオレンジ色を呈し、そして１３ｍｍ〜１４ｍｍの直径を有し、そして気菌糸は、短く、小さく、そして非常に少ししか見出されなかった。
１０日間の培養後、コロニーは、黄みがかったオレンジ色を呈し、そして１７ｍｍ〜１８ｍｍの直径を有し、そして気菌糸は、短く、小さく、そして非常に少ししか見出されなかった。
分生子柄の柄は、無色であり、「Ｚ」型の不規則な分枝を有し、そして壁は滑らかであった。
分生子柄は、洋ナシ型または楕円型であり、そして６〜１２×８．５〜１３μｍの直径を有した。
子嚢果の直径は、３０〜３５μｍであった。この子嚢果は、４．５〜５×５．５〜６μｍの直径を有する卵型の形状であった。
（ＭＥＡ培地（マルトース抽出物 ２０ｇ／ｌ、ペプトン １ｇ／ｌ、グルコース ２０ｇ／ｌおよび寒天 １５ｇ／ｌを含有する））
７日間の培養後、コロニーは、赤みがかったオレンジ色を呈し、そして２９〜３０ｍｍの直径を有し、そして気菌糸は、短く、小さく、そして非常に少ししか見出されなかった。
７日間の培養後、コロニーは、赤みがかったオレンジ色を呈し、そして２９〜３０ｍｍの直径を有し、そして気菌糸は、短く、小さく、そして非常に少ししか見出されなかった。
１０日間の培養後、コロニーは、赤みがかったオレンジ色を呈し、そして４１〜４２ｍｍの直径を有し、そして気菌糸は、短く、小さく、そして非常に少ししか見出されなかった。
分生子柄の柄は、無色であり、不規則な分枝を有した。
ＭＥＡ培地での２１日間の培養後、子嚢果は、完全には成熟していなかった。
Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ変異株Ｍ０２２、Ｍ１０３３と親株ＣＣＲＣ ３１４９９との間の比較を、表１に示す。
ｂコメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含有する培養培地で培養した。
ｃ小麦粉８０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌおよびグルタミン酸１０ｇ／ｌを含有する培地中で培養した。
（ＧＡＢＡの生成のためのｐＨ値）
実施例２に記載される方法に従って、異なるｐＨ値の下で、コメ粉末８０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌおよびグルタミン酸１０ｇ／ｌを含有する培地中で培養した変異株の発酵液サンプルのＧＡＢＡおよびシトリニンの量を分析した。結果を表２に示し、これは、異なるｐＨ条件下で培養した変異株Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２およびＭ１０３３が、非常に少量（０．１５ｐｐｍ未満）のシトリニンと共に、多量のＧＡＢＡを生成できたことを実証する。
実施例２に記載される方法に従って、異なるｐＨ値の下で、コメ粉末８０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌおよびグルタミン酸１０ｇ／ｌを含有する培地中で培養した変異株の発酵液サンプルのＧＡＢＡおよびシトリニンの量を分析した。結果を表２に示し、これは、異なるｐＨ条件下で培養した変異株Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２およびＭ１０３３が、非常に少量（０．１５ｐｐｍ未満）のシトリニンと共に、多量のＧＡＢＡを生成できたことを実証する。
ａＧＡＢＡの単位は、ｍｇ／ｍｌである。
＊全てのサンプル中のシトリニンの量は、検出可能な値（０．１５ｐｐｍ）よりも低かった。
Claims (26)
- Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの変異体であって、コメ粉末６０ｇ／ｌ、ダイズ粉末３０ｇ／ｌおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌを含む培地中で培養した場合に、１．０ｐｐｍ未満の量のシトリニンと共に、０．０３ｍｇ／ｍｌに達するＧＡＢＡ濃度で発酵産物を生成する、変異体。
- Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ＣＣＲＣ ３１４９９の変異体である、請求項１に記載の変異体。
- 請求項２に記載の変異体であって、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８６で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２と同一の特徴を有するか、またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８５で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ１０３３と同一の特徴を有する、変異体。
- Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８６で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ０２２である、請求項３に記載の変異体。
- Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＰＴＡ−４４８５で寄託されたＭｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ Ｍ１０３３である、請求項３に記載の変異体。
- 発酵産物を生成するための方法であって、該方法は、請求項１に記載の変異体を適切な条件下で培養することによって特徴付けられ、該発酵産物は、ＧＡＢＡを含み、そして該発酵産物に含まれるシトリニンの量は、１．０ｐｐｍ未満である、方法。
- 前記発酵産物が、血圧低下活性を有する、請求項６に記載の方法。
- 前記変異体が、固体培地または液体培地において培養される、請求項６に記載の方法。
- 前記培地のｐＨ値が、３〜９の間である、請求項８に記載の方法。
- 前記培地のｐＨ値が、５〜７の間である、請求項９に記載の方法。
- 前記発酵産物中のシトリニンの量が、０．５ｐｐｍ未満である、請求項６に記載の方法。
- 前記発酵産物中のシトリニンの量が、０．１５ｐｐｍ未満である、請求項１１に記載の方法。
- 前記発酵産物が、薬学的組成物の活性成分または食品添加物として使用され得る、請求項７に記載の方法。
- 血圧低下活性を有する前記成分を精製して、精製された成分を得る精製工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
- 請求項１に記載の変異体によって生成される発酵産物によって調製され、該発酵産物中のシトリニンの量が、１．０ｐｐｍ未満である、薬学的組成物。
- 血圧を低下させる際の使用のための、請求項１５に記載の薬学的組成物。
- 前記発酵産物中のシトリニンの量が、０．５ｐｐｍ未満である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
- 前記発酵産物中のシトリニンの量が、０．１５ｐｐｍ未満である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
- 請求項６に記載の方法によって生成される発酵産物によって調製される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
- さらに精製された発酵産物により調製される、請求項１９に記載の薬学的組成物。
- 請求項１に記載の変異体によって生成される発酵産物によって調製される、食品添加物であって、該発酵産物中のシトリニンの量が、１．０ｐｐｍ未満である、食品添加物。
- 血圧低下活性を有する、請求項２１に記載の食品添加物。
- 前記発酵産物中のシトリニンの量が、０．５ｐｐｍ未満である、請求項２１に記載の食品添加物。
- 前記発酵産物中のシトリニンの量が、０．１５ｐｐｍ未満である、請求項２３に記載の食品添加物。
- 請求項６に記載の方法によって生成される発酵産物によって調製される、請求項２１に記載の食品添加物。
- さらに精製された発酵産物により調製される、請求項２５に記載の食品添加物。
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