KR20010038797A

KR20010038797A - 홍국을 이용한 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 이용한 약품 조성물

Info

Publication number: KR20010038797A
Application number: KR1019990046913A
Authority: KR
Inventors: 류미라; 김덕경; 김보경
Original assignee: 김길환; 한국식품개발연구원
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2001-05-15
Also published as: KR20020063170A; WO2001031048A1; AU1175601A

Abstract

본 발명은 생체 내에서 일산화질소를 생성시키는 일산화질소 생성제의 제조에 필요한 조성물 및 이를 이용한 약품 조성물에 관한 것으로서, 특히 진균속(Fungal genus)에 속하는 홍국균(Monascus, 紅麴菌)으로 발효된 쌀인 홍국(紅麴) 및/또는 그 분말 및/또는 그 수용성 추출물을 활성 성분으로 함유하는 일산화질소 생성제의 제조에 필요한 조성물 및 이를 이용하여 제조되는 약품의 조성물에 관한 것이다.

상기한 본 발명의 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명의 NO 생성제 조성물 및 이를 이용한 약품 조성물은 홍국 및/또는 그 분말 및/또는 그 추출물을 활성 성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 즉 종래부터 존재하고 있는 홍국 또는 그 분말 또는 그 추출물을 NO 생성제 조성물 용도 또는 이를 이용한 약품 조성물 용도로 이용함을 특징으로 한다. 그러므로 본 발명에 특정 용도에 관련되는 물질은 홍국 또는 그 분말 또는 그 추출물이다.

따라서 상기와 같은 본 발명의 WP/FRM 발명에 의하면 일반적인 쌀과 미생물인 홍국균주를 주원료로 하여 제조할 수 있으므로 인삼 등의 희귀식물에 의하는 종래의 발명에 비하여 생산비가 극히 저렴하고, 그 생산에 있어서 일반적으로 알려져 있는 발효 및 분쇄, 추출과정 등에 의하므로 생산 공정이 매우 간단하고 용이하고 대량생산에 적합하며, 혈관 내피에 대한 손상을 발생시키지 않고 용혈, 어독성 등 심각한 부작용이 없이 혈관을 강력히 이완시키는 작용을 나타내므로 생리적 활성의 안정성 및 안전성이 매우 크므로 순환기 계통의 장애로 인하여 발생하는 협심증, 심근경색, 심장병, 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화, 혈액순환 장애, 신경통, 당뇨병, 성기능 장애, 기억력 장애 등 질환에 대한 예방 및 치료에 있어서 필수적으로 처방될 수 있는 안전하고 우수하고 저렴한 NO 생성제 조성물 및 이를 이용한 혈관이완제 등의 약품을 제공할 수 있다.

Description

홍국을 이용한 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 이용한 약품 조성물 {Material for Nitric Oxide Doner using Fermented Rice with Monascus and Material for Medicine using it}

일반적으로 홍국균은 진균속에 속하는 미생물인데, 고래로부터 천연의 식품 착색제이며 동시에 방부제인 홍국(紅麴, 발효된 적미)을 제조하는데 사용되어 왔다. 또한 수세기 동안 동양의 여러 나라에서는 상기 홍국이 보양제 등 전통 약제로서도 사용되어 왔는데(Bau and Mo, 1975년), 이는 진균에서 분리된 성분이 여러 가지 생물학적 활성을 나타내고 있기 때문이다. 이러한 활성이 확인된 증세로는 주로 저콜레스테롤혈증(Endo, 1979, 1980년), 항독소 및 항종양 효과(Yasukawa et al., 1996년, Aniya et al., 1998년) 등이 보고되고 있다.

또한 최근에는 진균의 수용성 추출물이 전해질 대사 또는 안지오텐신-I-전환효소(angiotensin-I-converting enzyme)의 활성에 영향을 미치지 않으면서(Tsuji et al., 1992년), 생체 내에서 혈압을 강하시킨다는 것이 보고되었다(Kohama et al., 1987년, Kushiro et al., 1996년). 그러나 상기 보고에 있어서는 진균의 수용성 추출물이 어떠한 메커니즘을 통하여 혈압 강하 효과를 발생시키는지에 대하여 정확한 내용이 없으며, 오히려 그 혈압 강하는 단지 혈관의 평활근 장력의 직접적인 저하 때문일 수 있다.

상기 보양제, 저콜레스테롤혈증, 항독소 및 항종양 효과, 혈압 강하를 위한 홍국의 이용에 있어서는 일반적으로 홍국 그대로 또는 분말의 형태 등으로 제조하거나 분말을 캡슐에 봉입 제조하여 음용하고 있다.

한편, 일산화 질소(nitric oxide, 이하 'NO'라 함)에 관한 연구는 Furchgott와 Zawadszki에 의해 1980년에 길이 열린 이후 급속도로 발전된 연구분야 중 하나이다(Nature 288, 373, 1980). NO의 생합성 등에 대한 기본적인 사항은 1990년대 초에 이르러 많이 밝혀졌고, 최근 수년에 걸쳐서는 질병의 병태나 치료의 측면에서 NO 연구가 급격하게 증가하여, 현재는 의학연구가, 임상의들이 가장 큰 관심을 두고 있는 분야 중의 하나라 할 수 있다.

일반적으로 NO와 질환간의 관계를 말한다면 NO에 대한 연구의 시작이 혈관순환계에서 비롯된 것임에도 불구하고 현재 NO는 자율신경, 내분비계, 중추신경계, 면역관계 및 신생물을 망라한 의학의 전분야에서 연구 및 임상에의 응용이 시도되고 있다. 질환치료의 임상에서는 120년 이전부터 니트로글리세린(nitroglycerin)이 협심증의 치료약으로 유효하다는 보고(1879년, Murrell)가 있은 이래, 그 작용기전은 불명확하나 NO를 공급하는 약물을 심장병의 치료약으로 사용하여 왔다. 또한 NO 및 NO 관련물질은 사람의 본태성고혈압, 폐성고혈압과 신성고혈압을 경감시키는 작용을 하며, 사람의 관상동맥질환(허혈성 심질환)의 치료를 위해서는 필수적으로 조제되어지는 물질이다. 지금 현재 NO 생성약물(NO donor)이 치료 약물로 인정되고 있는 질환으로는 대표적으로 협심증, 심근경색, 고혈압(주사제) 등이 있으며, 내복약 이외에 주사제, 패치제(patch), 설하제, 스프레이제, 흡입제 등의 응용도 시도되고 있다. 그 외에도 남성의 임포턴스도 NO와 연관이 있는데, 최근에 파이자(社)에 의해 개발되어 사회의 이목을 집중시킨 바이아그라 또한 NO와 직접적으로 관련이 있는 약물이다.

따라서 현재의 NO에 대한 연구의 열기가 NO의 중요성을 말해 주고 있으며, NO에 대한 의학적 응용이 계속되고 있는 점으로 보아 NO 및 NO 관련 물질을 이용한 질환 치료의 범위는 한층 넓어질 것은 자명한 일이다. 그리고 앞으로의 연구 테마로서 점차 중요해지고 있는 분야는 이러한 NO를 생성시킬 수 있는 물질 중 저렴하고 안정성 및 안정성 높은 물질을 발견하는 방향으로 점차 집중되고 있다. 즉 상기와 같은 NO를 발생시키는 물질이 발견되면 이는 곧 그 물질의 용도가 협심증, 심근경색 등의 심장병 치료제, 고혈압 치료제, 혈관 이완제 등으로 사용될 수 있는 발명이 된다는 것을 의미하게 된다.

대표적인 경우가 혈관 이완제인데, 이를 예로 들면 일반적으로 순환기 계통의 장애로 인하여 발생하는 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화, 혈액순환 장애, 신경통, 성기능 장애, 기억력 장애 등 질환에 대한 예방 및 치료에 있어서 혈관 이완제는 가장 필수적 처방이다. 따라서 전세계적으로 지금까지 수많은 혈관 이완제가 개발되어 왔으며, 최근에는 이를 응용하여 바이아그라 등 성기능 장애를 극복하는 용도로만 한정하여 시판하는 약제도 다수 개발되어 있는 상태이다. 이러한 혈관 이완제는 크게 화학적 약품과 생약으로 크게 대별할 수 있다.

그러나 종래의 NO 생성제 또는 혈관 이완제는 생체 내에서 의도하지 않았던 부작용, 예를 들면 내피 손상, 용혈, 급성 독성이나 어독성 등과 급성 신장염, 심장마비 등을 발생시키는 경우가 많고, 생산 공정이 매우 까다로워서 대량 생산이 곤란한 점이 있었다. 특히 그 중 바이아그라 등 화학적 혈관 이완제 약품은 심장마비 등 몇 가지 생명에 치명적인 부작용이 보고되고 있는 형편이어서 현재로서는 안전한 사용을 보장할 수 있는 상태는 아니라 할 수 있다.

한편, NO 생성제 또는 혈관 이완제인 생약 중 전통 생약제의 경우에는 자연스레 오랜기간의 임상실험을 거친 결과가 되어 생명에 치명적인 부작용은 거의 없다고 할 수 있다. 그러나 그렇다 하더라도 인삼의 사포닌 성분을 주요 성분으로 하는 혈관 이완제 등에서 볼 수 있는 바와 같이 내피 손상, 용혈 등 부작용이 발생하는 경우도 있고, 대한민국 등록특허공보 99-201585호에 의한 인삼의 진세노사이드 Rg₃및 Rg₅를 주요 성분으로 하는 혈관 이완제 등에서와 같이 이러한 부작용이 없다고 보고된 경우도 있다. 상기와 같이 일반적으로 생약의 경우는 화학적 약품의 경우보다는 그 부작용을 많이 줄일 수 있겠으나, 이에 반해 NO 생성제 또는 혈관 이완제를 만들기 위하여 원재료로부터 추출할 수 있는 유의성 있는 유효 성분의 양이 대개의 경우에 매우 극소량이어서 산삼, 인삼이나 코뿔소 뼈, 호랑이 뼈, 웅담, 희귀 동식물 등 원재료를 구하는 것이 물리적 또는 사회적으로 곤란하거나 구할 수 있다 하더라도 그 가격이 매우 고가인 경우에는 그 추출물의 가격도 역시 고가가 되므로 일반인들이 이용하기에는 부담이 클 수 밖에 없다는 문제점이 있었다.

따라서 본 발명은 상기의 문제점을 해소하기 위하여 안출된 것으로서, 홍국 또는 그 분말 또는 그 추출물이 혈관 내피의 일산화질소(NO)의 생산을 매개로 하는 혈관 이완을 발생시킨다는 사실을 세계 최초로 발견하고, 이를 근거로 하여 원재료 및 그 생산 결과물의 가격이 저렴하면서도 생산 공정이 간단하고 용이하며, 용혈, 어독성 등 부작용을 발생시키지 않아 생리적 활성의 안정성 및 안전성이 큰 NO 생성제 조성물 및 이를 이용한 혈관 이완제 등 각종 약품을 제조할 수 있는 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명의 조성물의 내피 의존성을 설명하는 그래프

도 2는 본 발명의 조성물의 농도 의존성을 설명하는 그래프

도 3은 본 발명의 조성물에 대한 NO 합성 저해제의 효과를 설명하는 그래프

도 4는 GABA의 혈관 이완 효능과 아트로핀 하에서의 본 발명의 조성물의 혈관 이완 효능을 설명하는 그래프

도 5는 각 물질 존재 하에서의 혈관 내피의 NO 생산량을 비교하는 그래프

먼저 본 발명의 물질을 제조함에 있어서 홍국이 그대로 사용되거나 또는 이를 분쇄하여 분말을 사용하는 경우에는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 입수할 수 있는 미생물인 홍국균과 쌀을 주원료로 하여 일반적인 종래의 방법을 사용하며, 그 추출물을 사용하는 경우에는 일반적인 추출방법에 의하여 생산된다. 다만 상기의 사용 형태 중 홍국 그대로 또는 분말로 사용하는 경우에는 유효 성분의 함량이 적고 표준화되기 곤란하므로 예방 또는 치료 등 실제 임상에 적용시에는 이를 고려하여 그 사용량을 적절히 조절할 필요가 있을 것이며, 약품제조산업에 적용되어 대량 생산하는 경우 등을 고려할 때 실용적인 견지에서는 표준화된 함량을 가지도록 적절히 통제된 과정에 의하여 생산되는 분말 또는 추출물의 형태로 사용하는 것이 바람직하다 할 것이다.

여기서 상기 추출물 제조방법의 일실시예를 들면 분쇄된 쌀을 50℃의 물에 3시간 동안 담근 후 물을 빼고 압력솥에서 익힌 다음 홍국균인 모나스커스 루버 IF032318을 접종한다. 그 후 30℃에서 2일 동안 발효시키고, 호기성 조건하의 25℃에서 6일 동안 계속 발효시켜 홍국을 만든 후 90℃에서 20분간 가열하여 진균의 효소를 불활성화시킨다. 그리고 수분 함량이 10% 미만이 되도록 50℃에서 건조시킨 후 믹서로 갈아 분말로 만든다.

이렇게 홍국의 분말로부터 수용성 액상을 추출하기 위하여는 코하마 등(Kohama et al., 1987)에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 즉 홍국 분말 1㎏을 80℃에서 4배 부피의 에탄올에 1시간씩 3회 담그고, 그 추출물 5.21g을 증발시켜서 물에 현탁시킨 후 그 현탁액을 에틸아세테이트(AcOEt)와 혼합한다. 액상 물질을 에틸아세테이트로 먼저 세척한 다음 부탄올(BuOH)로 세척한다. 그리고 상기 액상 물질을 증발시킨 후 고형체 1.54g을 염수에 용해시킴으로써 본 발명의 수용성 추출물(Water Phase of Fermented Rice with Monascus, 이하 'WP/FRM'이라 함)을 얻을 수 있다. 참고로 상기 WP/FRM의 증명 견본은 대한민국 경기도의 한국식품개발연구원(KFRI)에 기탁번호 HG-0001호로 기탁되어 있다. 상기 코하마 등은 원래 접종 균주로서 홍국균인 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)를 이용하였으나, 실험에 의하면 홍국균 종류는 전반적으로 유사한 추출물을 얻을 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 물질은 홍국 그대로 또는 분말의 형태로 또는 추출물의 형태로 사용될 수 있는 것이나, 이하의 설명에서는 추출물의 형태로 사용되는 경우를 일실시예로 들어 상세히 설명하기로 한다.

상기와 같은 방법에 의하여 제조된 WP/FRM의 성질을 살펴보기 위하여 일련의 실험을 하였으며, 이하에서는 그 결과를 첨부된 도면을 참조하면서 설명하기로 한다.

먼저 본 발명의 WP/FRM이 혈관을 이완시키는 작용을 하는지 여부와 그 혈관 이완 작용의 내피 의존성 여부를 살펴본다. 혈관의 내피는 혈류 및 혈관의 긴장도를 조절하고, 혈소판 응집을 억제하는 등 체내의 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 하는 부분이다. 만일 본 발명의 WP/FRM에 의한 혈관 이완이 내피에 의존적이라고 밝혀진다면 이는 내피를 손상시키지 않으면서 그 약효를 발휘한다는 의미이며, 이는 본 발명의 WP/FRM이 생체에 적용될 때 종래의 사포닌 등과 달리 내피 손상, 용혈, 급성 독성이나 어독성 등 심각한 부작용을 일으키지 않아서 안전하다는 것을 의미하게 된다.

실험과정을 설명하면, 무게 200 내지 250g의 수컷 스프라구-도울리(Sprague-Dawley) 쥐의 흉부 대동맥을 폭 2 내지 3㎜의 고리 형태로 분리하여 내피가 존재하는 샘플과 내피가 제거된 샘플을 각각 만들었다. 내피의 제거 시에는 NaCl 136.9mM, KCl 5.4mM, CaCl₂1.5mM, MgCl₂1.0mM, NaHCO₃23.8mM, 글루코즈 5.5mM 및 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 0.01mM이 포함된 생리식염수(PSS)를 적신 면사로 혈관의 내면을 부드럽게 문질러서 내피를 제거하였다. 그리고 상기 샘플을 10mM의 휴지장력 하에서 홀더에 부착하고 4㎖ 수평형 근육 배양조에서 20분 동안 평형을 유지시킨 다음 반응이 안정될 때까지 각 조각을 70mM KCl 용액에 반복적으로 노출시켰다. 그리고 NaCl을 동일한 몰수의 KCl로 치환함으로써 고농도의 K⁺용액으로 변화시켰다. 이 용액을 37℃, pH 7.4에서 95% 산소와 5% 이산화탄소 혼합물로 포화시킨 후 근 장력을 폴리그래프 시스템(polygraph system, RPS212, Grass, RI, USA)과 컴퓨터 분석기(computer analyser, Power Lab 400, MacLab system, Castle Hill, Australia)가 결합된 힘-변위 변환기(force-displacement transducer, FT03, Grass, RI, USA)로 같은 크기로 기록하였다.

여기서 혈관 내피의 기능적 활성은 1μM의 카르바콜(carbachol)이 300nM 노르에피네프린(norepinephrine, 이하 'NE'라 함)으로 자극된 샘플에서 거의 완전한 이완(＞ 90%)을 유도하였는지 여부를 측정함으로써 평가하였으며(Sudjarwo et al., 1992), 계속하여 혈관 수축을 자극하기 위하여 샘플을 300nM NE로 전처리하여 수축시킨 다음 본 발명의 WP/FRM 1㎎/㎖를 20분간 배양조에 첨가하였다.

상기 혈관 이완 효과 및 내피 의존성 실험의 대표적인 결과는 도 1의 그래프에 도시하였는 바, 도 1a는 혈관의 내피가 존재할 때의 그래프이고 도 1b는 내피가 제거되었을 때의 그래프이다. 상기 두 그래프의 비교에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 WP/FRM은 내피가 존재할 때만 작용한다. 즉 혈관 내피에 대한 손상이 없이 혈관을 이완시키는 작용을 나타내므로 용혈이나 어독성 등의 부작용이 없을 뿐만 아니라 피실험 생체에 대하여 급성독성을 나타내지 않아 안전하게 사용할 수 있다.

보다 상세히 설명하면, 휴지 상태의 샘플에 본 발명의 WP/FRM 0.1 내지 10㎎/㎖를 인가한 경우에는 내피의 존부에 무관하게 어떤 샘플에서도 장력이 발생되지 않았다(데이터는 미도시함).

그러나 도 1a에 도시된 바와 같이 내피가 존재하는 혈관 샘플을 300nM NE로 전처리하여 수축시킨 다음 본 발명의 WP/FRM 1㎎/㎖를 인가한 경우에는 샘플이 강력하게 이완되었다. 이렇게 이완된 샘플은 최대 이완반응에 이른 후 40분 이내에 자극 전 장력 수준의 60% 정도까지 점차 회복되었다.

한편, 도 1b에 도시된 바와 같이 내피가 제거된 혈관 샘플을 300nM NE로 전처리하여 수축시킨 다음 본 발명의 WP/FRM 1㎎/㎖를 인가한 경우에는 샘플이 전혀 이완되지 않았다. 따라서 본 발명의 WP/FRM은 혈관의 내피에 대한 의존성이 강한 것으로 판단된다. 상기 결과는 약 1μM 카르바콜에 의한 혈관 이완 효과와 유사한데, 이 물질은 NE에 의해 97.0±3.93%의 장력이 유도된 후에 적용될 때 90% 이상의 이완을 유도하는 것으로 알려져 있다.

상기와 같이 본 발명의 WP/FRM은 내피 의존성이 있으므로 이하의 실험에 있어서는 내피가 존재하는 혈관 샘플만을 대상으로 하여 실험하였다.

다음으로 본 발명의 WP/FRM의 농도 의존성을 살펴본다. 만일 본 발명의 WP/FRM이 농도에 의존적임이 밝혀진다면 이는 WP/FRM이 일정 농도 이상 NO 생성제 또는 혈관 이완제 등 약품에 함유되어야만 그 약효를 발휘한다는 것을 의미하게 된다.

실험과정에 있어서는 내피 의존성을 고려하여 내피가 존재하는 혈관 샘플을 여러 조에 분리하여 두고 이들을 각각 300nM NE로 전처리하여 수축시킨 다음 본 발명의 WP/FRM을 농도를 각각 달리하여 0.1㎎/㎖, 0.3㎎/㎖, 1㎎/㎖ 및 3㎎/㎖를 인가하였다.

상기 농도 의존성 실험의 대표적인 결과는 도 2의 그래프에 도시하였는 바, 그래프에서 용이하게 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 WP/FRM의 농도가 0.3㎎/㎖ 이하일 때는 이완의 효과가 미약하였고, 1㎎/㎖ 이상일 때는 이완의 효과가 현저하고 확연하였다. 따라서 본 발명의 WP/FRM에 의한 이완 효과는 농도 의존적 방식으로 증가함을 알 수 있다.

한편 상기 실험들과 다른 관점에서 실험을 하였는데, 본 발명의 WP/FRM에 의한 혈관 이완이 내피 의존적임은 이미 밝혀졌으나, 일반적으로 이러한 내피 의존성이 발생하는 메커니즘은 여러 가지 경로가 있다. 따라서 이제 본 발명의 WP/FRM에 의한 혈관 이완이 내피에서 생성되는 NO에 의해 매개되는 것인지를 판명하기 위하여 NO 합성효소 저해제인 N⁰-니트로-L-아르기닌(N⁰-nitro-L-arginine, 이하 'L-NNA'라 함)과 사이클로옥시게나제 저해제인 인도메타신(indomethacin)의 존재가 본 발명의 WP/FRM에 의한 혈관 이완에 미치는 영향을 조사하였다.

이를 상세히 설명하면, 혈관의 내피는 EDRF(endothelium-derived relaxing factor, 내피유리인자), 즉 NO를 유리시키며, 이 NO는 혈관 평활근에 작용함으로써 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화하며, 이에 의하여 조직 내 사이클릭 GMP를 증가시켜서 혈관을 이완시키는 것으로 널리 알려져 있다. 그리고 고혈압, 고콜레스테롤혈증 등의 순환기계 질환에 의하여 혈관 내피의 기능이 손상되면 NO의 유리가 감소되어 정상적인 혈관 이완 및 수축 조절 기능이 손상된다. 따라서 상기 NO의 합성을 저해시키는 물질을 투입한 상태에서 본 발명의 WP/FRM을 인가하였을 때 혈관 이완이 발생하지 않는다면 본 발명의 WP/FRM은 상기와 같이 혈관 내피의 NO 생산에 의하여 매개되는 과정을 거쳐서 혈관을 이완시킨다는 사실이 세계 최초로 증명되는 것이다. 참고로 화학적 약제인 바이아그라 등의 경우에도 혈관 내피의 NO 생산에 의해 매개되어 혈관 이완을 유도하는 것이지만, 그 자세한 경로는 본 발명의 WP/FRM에 있어서의 경우와는 다른 메커니즘을 통하여 기작되는 것임을 밝혀둔다.

실험과정을 설명하면, 먼저 10μM의 L-NNA로 30분간 처리한 후 300nM NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에 첫째로, 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우와 둘째로, 대조구로서 내피 의존성 혈관 이완을 유도하는 물질로 알려져 있는 카르바콜을 인가한 경우를 실험하였고, 셋째로 10μM의 인도메타신으로 60분간 처리한 후 300nM NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우를 실험하였다.

상기 NO 매개성 실험의 대표적인 결과는 도 3의 그래프에 도시하였는 바, 도 3a는 L-NNA로 처리한 후 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우에 대한 그래프이고, 도 3b는 이를 L-NNA로 처리하지 않은 경우와 비교한 그래프이다. 상기 두 그래프로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 WP/FRM은 내피의 NO 생산에 의하여 매개되는 혈관 이완을 발생시킨다.

보다 상세히 설명하면, 10μM의 L-NNA로 30분간 처리한 후 300nM NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우에는 도 3a에 도시된 바와 같이 혈관 이완이 전혀 발생되지 않았다. 또한 동일하게 수축된 혈관 샘플에 카르바콜을 인가한 경우에도 혈관은 전혀 이완되지 않았다(결과는 미도시함). 이와 대조적으로 10μM의 인도메타신으로 60분간 처리한 후 300nM NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우에는 혈관이 강력하게 이완되었다(결과는 미도시함). 따라서 본 발명의 WP/FRM은 혈관 내피의 NO 합성이 저해되면 그 효력이 상실됨을 고려할 때 내피의 NO 생산에 의하여 매개되는 혈관 이완임을 알 수 있다. 이는 본 실험에 의하여 세계에서 최초로 발견한 사실이며, 이에 대한 상세한 보고서는 세계적으로 인정받고 있는 민간의학 전문지인 Journal of Ethnopharmacology(received 15 June 1999, accepted 28 July 1999)에 "Nitric oxide-mediated endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta induced by aqueous extract of red rice fermented with Monascus ruber"라는 주제의 논문으로 기고된 바 있다.

다음으로 아트로핀의 존재가 본 발명의 WP/FRM의 효력에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 감마아미노부틸산(γ-Aminobutyric acid, 이하 'GABA'라 함)을 단독으로 인가하였을 때 혈관 이완이 발생되는지를 조사하였다. 상기 두 실험은 홍국균인 모나스커스 필로서스의 수용성 추출물에 주성분이 GABA와 아세틸콜린(acetylcholine, 이하 'Ach'라 함)인 혈압 강하 화합물이 있다는 종래의 실험 보고서(Kohama et al., 1987) 내용을 확인하고, 상기 GABA는 말초작용을 통하여 신장 혈관의 기능에 대한 신경조절 효과를 매개하기 때문에(Giuliani et al., 1986, Abe et al., 1995) 혈관 이완에 영향이 없다는 종래의 실험 보고서(Perusquia et al., 1996) 내용을 확인하며, 이들 중 어느 성분이 혈관 이완에 비교적 유의성 있는 영향을 미치는 유효 성분인지를 판단하기 위함이다.

실험과정을 설명하면, 우선 대조구로서 아트로핀이 없는 상태에서의 본 발명의 WP/FRM이 혈관 샘플에 인가된 경우에 대한 결과는 상기 내피 의존성 실험에 의한 데이터(도 1a 및 도 2)가 그대로 원용된다고 할 때, 본 실험에서는 1μM의 아트로핀으로 전처리하고 300μM의 NE로 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM이 인가된 경우를 실험하였다. 한편 상기와 동일하게 300μM의 NE로 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM의 주성분 중 하나로 알려져 있는 GABA가 인가된 경우를 실험하였다.

상기 본 발명의 WP/FRM에 대한 아트로핀의 영향에 대한 실험의 대표적인 결과는 도 4a의 그래프에 도시하였는 바, 본 발명의 WP/FRM 3㎎/㎖를 인가한 경우의 최대 이완율을 비교할 때 아트로핀 부존재시의 그래프인 도 2의 백분율 87.9±6.21%와 아트로핀 존재시의 백분율 93.0±3.25%를 비교해 보면 아트로핀 존재시에 혈관 이완의 정도가 크다는 것을 알 수 있고, 아트로핀 부존재시의 그래프인 도 1a와 아트로핀 존재시의 그래프인 도 4a를 비교할 때 혈관 이완 후 다시 수축 상태로 복귀하는 속도는 아트로핀 존재시에 더 빠른 속도를 보이고 있다. 이로부터 본 발명의 WP/FRM에 의하여 유도되는 혈관 이완에 있어서 Ach가 부분적으로 관련이 있다는 것을 알 수 있다.

한편 300μM의 NE로 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM의 주성분 중 하나로 알려져 있는 GABA가 인가된 경우에는 도 4b에 도시된 바와 같이 혈관 이완이 전혀 발생하지 않았다. 따라서 이로부터 GABA는 혈관 이완과 무관한 물질임을 알 수 있다. 그리고 이는 종래의 실험 보고서의 결과와도 일치하는 것이다.

마지막으로 본 발명의 WP/FRM에 의하여 배양된 내피 세포의 NO 생산량을 측정하였다. 이는 본 발명의 WP/FRM이 혈관 내피의 NO 생산을 직접적으로 자극하는 것인지를 알기 위한 것이다.

실험과정을 설명하면, 사람의 제대 혈관에서 내피 세포를 효소에 의해 분리하였다. 이때 효소 혼합물은 0.2% 글루코즈-PBS(glucose-phosphate-buffered saline)에 0.2% 콜라겐 분해효소(collagenase) 타입 II를 포함하였다.

상기 사람의 제대 혈관은 0.2% 글루코즈-PBS로 세척한 다음 효소 혼합물 10㎖로 채웠다. 제대 세포는 37℃에서 5 내지 7분간 배양하였다. 그리고 콜라겐성 배출물을 모아 FCS(fetal calf serum)로 최종농도가 30%가 되도록 불활성화시켰다. 그 혈관을 다시 50㎖의 0.2% 글루코즈-PBS로 세척하였다. 그리고 유리된 내피 세포를 포함하는 모여진 배출물을 1,000rpm에서 5분간 원심분리하였다.

그리고 세포 펠렛을 배지 199(Medium 199), FCS 20%, 페니실린 / 스트렙토마이신(100U/㎖ 및 100㎍/㎖), ECGS(endothelial cell growth supplement) 50㎍/㎖ 및 헤파린 15U/㎖를 포함한 성장 배지에 분산시켰다. 그리고 세포를 T25㎠ 플라스크에 도포하고 5% 이산화탄소의 습기찬 대기 하에서 37℃에서 배양하였다. 세포를 합류점까지 성장시킨 후, 0.01% 트립신과 0.004% EDTA를 포함한 PBS 내 실온에서 1 내지 2분 배양하여 분리하고, 배지로 세척한 다음 원심분리하고 24조 플레이트에 재접종하였다. 실험에는 제1계대접종과 제2계대접종 사이의 세포가 사용되었다.

그리고 NO의 배출을 측정하기 위하여 합류점까지 성장한 내피 세포를 pH 7.4이고 NaCl 99.0mM, KCl 4.69mM, CaCl₂1.87mM, MgSO₄1.2mM, NaHCO₃25mM, K₂HPO₄1.03mM, Hepes 20mM, D-글루코즈 11.1mM로 구성된 크렙스-헤페스 버퍼(Krebs-Hepes buffer)로 3회 세척하였다. 그리고 크렙스-헤페스 버퍼에 용해된 히스타민 또는 본 발명의 WP/FRM을 배양조에 첨가하고 세포를 37℃에서 10분간 배양하였다. 그리고 세포는 L-NNA로 10분간 전처리하였다. 배양 후 각 조에서 상등액을 모으고 세포를 제거하기 위하여 12,000rpm으로 5분간 원심분리하였다.

NO의 생산량은 제조자의 안내에 따라 NO 분석키트를 사용하여 아질산염(NO₂ ^-)과 질산염(N0₃ ^-)을 결합시킴으로써 측정하였다. 간단히 말해서, 샘플 50㎕를 25㎕ NADPH와 25㎕ 질산환원효소(nitrate reductase)로 37℃에서 30분간 배양함으로써 효소에 의해 질산염이 먼저 아질산염으로 환원되었다. 아질산염 농도를 정량하기 위하여, 분석될 환원된 샘플 100㎕를 HCl 용액을 포함하는 술퍼닐산 50㎕와 혼합하였다. 10분간 혼합한 후, 디아조화합물을 만들기 위하여 50㎕의 N-(1-나프틸)에틸렌디아민{N-(1-naphthyl)ethylenediamine} 용액을 첨가하여 자주색 아조염료를 만들었다. 발색된 아조염료는 10분 후 540㎚에서 ELISA 판독기(enzyme-linked immunosorbent assay reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.

상기 본 발명의 WP/FRM이 내피의 NO 생산량에 미치는 영향에 대한 실험의 대표적인 결과는 도 5의 그래프에 도시하였는 바, 사람의 제대 혈관에서 일차 배양된 내피를 본 발명의 WP/FRM로 자극하면 아질산염과 질산염의 함량이 대조구(첫째 자료)에 비하여 약 2배까지 증가된다(둘째 자료). 그리고 혈관 샘플이 10 μM의 히스타민으로 처리된 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. 한편 10 μM의 L-NNA를 첨가하면 아질산염과 질산염의 함량 증가는 약화되었다(셋재 자료). 따라서 본 발명의 WP/FRM은 혈관 내피의 NO 생산에 직접적인 영향을 미치는 것으로 판단되며, 이러한 사실도 본 실험에 의하여 세계에서 최초로 밝혀진 것으로서 자세한 내용은 상기 논문에 함께 기재되어 있다.

따라서 상기 일련의 실험 결과를 종합하면 본 발명의 WP/FRM은 내피 의존성과 농도 의존성 혈관 이완을 유도하며, 상기 혈관 이완은 본 발명의 WP/FRM이 내피의 NO 생산을 직접 자극함으로써 발생한다는 사실을 알 수 있다. 이는 본 발명의 WP/FRM이 추출물의 형태로 사용되는 경우 뿐만 아니라 홍국 그대로 또는 분말의 형태로 사용되는 경우에도 마찬가지이다. 따라서 본 발명의 WP/FRM이 NO 생성제의 조성물로서 사용될 수 있음은 물론이고, 이를 기반으로 하여 혈관 이완제 조성물로서 사용될 수 있음은 실험에 의하여 뒷받침되고 있으며, 그 이외에도 NO 생성 메카니즘에 의하여 고혈압 치료제, 임포텐스 치료제, 심근경색 치료제, 협심증 치료제, 기억력 장애 개선제 등을 제조할 때 조성물로서 사용될 수 있다.

상기와 같은 성질을 가지는 본 발명의 WP/FRM은 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 배합됨으로써 약제학 분야의 통상의 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로치제, 약제, 현탁제, 설하제 등의 경구투여(내복)용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제, 연고제, 크림제, 파스제, 패치제(patch), 액제, 스프레이제, 흡입제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제 형태로 만들어 생산할 수 있다.

여기서 본 발명의 WP/FRM과 함께 사용될 수 있는 담체로는 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 있을 수 있고, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제, 안정화제 등이 있을 수 있으며, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 있을 수 있다.

상기와 같이 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여되거나, 또는 비경구적으로 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내에 투여되거나 또는 국소에 바로 적용할 수도 있다. 또한 경구투여시에는 위산에 의하여 약제가 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나 정제 등의 경구투여용 고형 제제를 장용피로 피복된 제제로 만들어 투여할 수도 있다. 그리고 상기 각 담체 및 본 발명의 WP/FRM은 혼합되어 예를 들면 타정기에서 압축 성형하여 정제로 제조할 수도 있고, 조립기를 이용하여 조립하고 충전기에 의해 충전하여 캅셀제로 제조할 수도 있으며, 주사용 증류수와 글리세린 용액을 가하여 유화시켜 주사제로 제조할 수도 있고, 습포제 또는 파스제로 응용되어 제조될 수도 있다.

따라서 상기와 같은 본 발명의 WP/FRM에 의하면 일반적인 쌀과 미생물인 홍국균주를 주원료로 하여 제조할 수 있으므로 인삼 등의 희귀식물에 의하는 종래의 발명에 비하여 생산비가 극히 저렴하고, 그 생산에 있어서 일반적으로 알려져 있는 발효 및 분쇄, 추출과정 등에 의하므로 생산 공정이 매우 간단하고 용이하고 대량생산에 적합하다. 또한 혈관 내피에 대한 손상을 발생시키지 않고 용혈, 어독성 등 심각한 부작용이 없이 혈관을 강력히 이완시키는 작용을 나타내므로 생리적 활성의 안정성 및 안전성이 매우 크다. 따라서 본 발명에 의하면 순환기 계통의 장애로 인하여 발생하는 협심증, 심근경색, 심장병, 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화, 혈액순환 장애, 신경통, 당뇨병, 성기능 장애, 기억력 장애 등 질환에 대한 예방 및 치료시에 처방될 수 있는 안전하고 우수하고 저렴한 NO 생성제 조성물 및 이를 이용한 혈관이완제 등의 약품 조성물을 제공할 수 있다.

Claims

활성 성분으로서 홍국 및/또는 그 분말 및/또는 그 추출물을 함유함을 특징으로 하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물
상기 제1항에 있어서, 혈관 이완제를 제조하는데 사용됨을 특징으로 하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물
상기 제1항에 있어서, 고혈압 치료제를 제조하는데 사용됨을 특징으로 하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물
상기 제1항에 있어서, 임포텐스 치료제를 제조하는데 사용됨을 특징으로 하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물
상기 제1항에 있어서, 심근경색 치료제를 제조하는데 사용됨을 특징으로 하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물
상기 제1항에 있어서, 협심증 치료제를 제조하는데 사용됨을 특징으로 하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물
상기 제1항에 있어서, 기억력 장애 개선제를 제조하는데 사용됨을 특징으로 하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물
상기 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서, 홍국으로부터 추출된 추출물은 분쇄된 쌀을 50℃의 물에 3시간 동안 담근 후 물을 빼고 압력솥에서 익힌 다음 홍국균인 모나스커스 루버 IF032318을 접종하고, 그 후 30℃에서 2일 동안 발효시키고, 호기성 조건 하의 25℃에서 6일 동안 계속 발효시킨 후 90℃에서 20분간 가열하여 진균의 효소를 불활성화시키고, 수분 함량이 10% 미만이 되도록 50℃에서 건조시킨 후 믹서로 갈아 분말로 만들고, 적발효미 분말 1㎏을 80℃에서 4배 부피의 에탄올에 1시간씩 3회 담그고, 그 추출물 5.21g을 증발시켜서 물에 현탁시킨 후 그 현탁액을 에틸아세테이트(AcOEt)와 혼합하고, 액상 물질을 에틸아세테이트로 먼저 세척한 다음 부탄올(BuOH)로 세척하고, 상기 액상 물질을 증발시킨 후 고형체 1.54g을 염수에 용해시켜서 제조됨을 특징으로 하는 일산화질소 생성제 조성물
상기 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조제되어 단위별로 혈관 이완에 적용될 수 있는 단위형태로 조제됨을 특징으로 하는 일산화질소 생성제 조성물
상기 제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서, 홍국 및/또는 그 분말 및/또는 그 추출물의 유의성 있는 유효 성분 농도가 0.3㎎/㎖ 이상임을 특징으로 하는 일산화질소 생성제 조성물
제9항에 있어서, 단위별로 혈관 이완에 적용될 수 있는 단위형태로 조제될 때 그 형태가 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 과립제, 액제, 현탁제, 주사용 용액, 현탁액 또는 습포제임을 특징으로 하는 일산화질소 생성제 조성물