CN115887341B - 一种红米酶解提取物及制备方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本申请提供了一种红米酶解提取物及制备方法，涉及酶解工艺技术领域。具体包括以下步骤：（1）将红米清洗干净后，加水浸泡，得到浸泡后的红米；（2）向浸泡后的红米中加复合酶，进行一次酶解，然后酶灭活后离心，保留上清液；（3）向上清液中再次加入复合酶，进行二次酶解，然后酶灭活，进行多级精滤浓缩，再次灭菌后，得到所述的水解红米提取物。本申请制备的红米酶解提取物中富含小分子活性肽产物和红米浆中的生理活性物质，如多糖、改性蛋白、氨基酸、维生素以及变形淀粉等，从而使得到的红米酶解提取物具有降低皮肤敏感和敏感度，综合调理营养作用，保湿、吸附油脂、收缩毛孔的作用。
Description
技术领域
本发明涉及酶解工艺技术领域，具体涉及一种红米酶解提取物及制备方法。
背景技术
老黑谷米来自世界最高海拔产稻区，因稻谷是黑色的，故被称为“黑谷”，碾出来的米，颜色淡红，味道醇香、米粒油红圆润饱满，被称为“红米”。黑谷中含有多种氨基酸和维生素。
中国专利申请201910780382.7中公开了红米发酵提取物在制备化妆品中的应用。本发明于含红米培养基中以植物乳杆菌 ( Lactobacillus plantarum )为发酵菌株制备的红米发酵提取物能够下调S.a/S.e值，修复并维持皮肤表面微生物菌群稳态；促进成纤维细胞和表皮细胞的增殖，增强皮肤修复活性；对抗皮肤衰老和损伤，可作为活性成分用于制备化妆品及化妆品用原料，应用前景广阔；该申请中还提供了一种具有皮肤微生态菌群调节活性和皮肤修复活性的化妆水，包含质量百分比的以下组份：以固形物计，0.01wt％-5wt％红米发酵提取物，以及：0-5wt％甘油、2wt％-5wt％丁二醇、0-4wt％羟乙基脲、0-2wt％烟酰胺、0-0.02wt％透明质酸钠或透明质酸钾、0-0.2wt％甘草酸二钾或甘草酸二钠、0-0.2wt％尿囊素、0-0.2wt％羟苯甲酯、0-0.1wt％EDTA二钠、0-0.5wt％苯氧乙醇、0-0.1wt％乙基己基甘油、0-可接受剂量香精，余量为去离子水，该申请中采用红米发酵液为原料，通过维持皮肤表面微生物菌群稳态及增强皮肤修复活性来对抗皮肤衰老和损伤。
再如中国专利申请202010232010.3中公开了红米发酵液在制备皮肤外用剂方面的应用，该发明红米发酵液通过促进基底膜稳固相关基因、细胞外基质相关基因和细胞抗衰老生长因子相关基因的表达，稳定皮肤结构、提高皮肤修复活性、延缓皮肤衰老、提升表皮细胞活性、增加表皮厚度，从而实现抗衰老；该发明红米发酵液在较低含量下即可产生显著的效果，原料来自天然食品红米，使用安全，可广泛应用于各种皮肤外用剂，对抗皮肤衰老。
而随着研究的深入，目前利用食源性蛋白质酶解获得生物活性肽成为热门课题，越来越多的研究者也将稻米蛋白作为研究对象，研究发现利用不同的蛋白酶酶解红米蛋白得到的活性肽产物表现出多种生物活性，发明人在实施过程中发现以红米蛋白为原料，利用各种蛋白酶酶切位点不同，通过控制酶解时间和温度，已达到不同程度的水解，在通过逐级分离纯化可以得到含有多种蛋白水解活性肽的红米复合酶水解液，使其具有特殊的美容护肤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红米酶解提取物的制备方法，所述的红米酶解提取物是根据蛋白酶催化反应动力学特性进行酶解处理后的一种生物活性混合物产品，其中富含小分子活性肽产物和红米浆中的生理活性物质，如多糖、改性蛋白、氨基酸、维生素以及变形淀粉等，从而使得到的红米酶解提取物具有降低皮肤敏感和敏感度，综合调理营养作用，保湿、吸附油脂、收缩毛孔的作用。
本申请的技术方案如下：
一种红米酶解提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将红米清洗干净后，加水浸泡，得到浸泡后的红米；
（2）向浸泡后的红米中加复合酶，进行一次酶解，然后酶灭活后离心，保留上清液；
（3）向上清液中再次加入复合酶，进行二次酶解，然后酶灭活，进行多级精滤浓缩，再次灭菌后，得到所述的水解红米提取物。
其中，步骤（2）-（3）中所述的复合酶为蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物；
所述的复合酶为质量比1-3:1-3:1-3:1-2:1-2蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物；
优选地，所述的复合酶为质量比2:2:2:1:1的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
步骤（2）中所述的复合酶的添加量为红米质量的5-8%；优选为6%。
步骤（3）中所述的复合酶的添加量为红米质量的3-6%；优选为4%。
步骤（2）中所述的酶解时间为8-10h，酶解温度为45-48℃。
步骤（3）中所述的酶解时间为5-6h，酶解温度为45-48℃。
步骤（3）中所述的多级精滤浓缩后得到的水解红米提取物的浓度为0.1-10%。优选为0.2%、2%或7%。
本申请采用多种复合酶对红米进行酶解，能够使红米中的蛋白质、多糖等成分转化为小分子多肽，氨基酸、改性蛋白、维生素、水溶性氨基酸等，并且采用复合酶能够有效地破坏细胞壁，使有效成分充分溶出，使制备的红米酶解提取物营养全面，易于吸收，其中：
蛋白酶能够将蛋白质降解为氨基酸；
淀粉酶能够将复杂的碳水化合物转化为单糖；
纤维素酶能够将纤维素降解为葡萄糖；
木聚糖上的测量与植物细胞中其他几种结构性多糖，如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等以共价键或非共价键连接，组成植物细胞的细胞壁，木聚糖酶能够将木聚糖转化为其他单糖；
β-葡聚糖是一类非淀粉性多糖，作为谷物类植物细胞壁成分之一，β-葡聚糖酶可以将β-葡聚糖转化为低分子糖，破坏细胞壁结构，使有限成分更多的溶出释放。
本申请还提供了上述方法制备的红米酶解提取物。
另外，本申请还提供了上述红米酶解提取物在化妆品中的应用；所述的化妆品包括但不局限于精华水、乳液、面霜、精华中的一种或几种。
与现有技术相比，本申请的有益效果在于：
（1）本发明采用食物源红米蛋白为原料，酶解工艺成熟，酶解产物安全性高；
（2）本发明采用生物酶解方法，反应条件温和，无化学试剂添加，无污染；
（3）本发明采用红米蛋白为底物在酶解过程中红米蛋白被降解为小分子多肽，氨基酸、改性蛋白、维生素、水溶性氨基酸等，多种小分子状态的营养物质，营养全面，易于吸收。
（4）本发明提供的红米酶解提取物富含小分子活性肽产物和红米浆中的生理活性物质，如多糖、改性蛋白、氨基酸、维生素以及变形淀粉等，从而使得到的红米酶解提取物具有降低皮肤敏感和敏感度，综合调理营养作用，保湿、吸附油脂、收缩毛孔的作用。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例中所使用的红米为攀天阁红米。
所使用的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶均为市售产品。
实施例1一种红米酶解提取物的制备方法
包括以下步骤：
（1）将红米清洗干净后，加水浸泡，得到浸泡后的红米；
（2）向浸泡后的红米中加入红米质量5%的复合酶，进行一次酶解，酶解时间为8h，温度为48℃，然后酶灭活后离心，保留上清液；
（3）向上清液中再次加入红米质量3%的复合酶，进行二次酶解，酶解时间为5h，温度为48℃，然后酶灭活，进行多级精滤浓缩，再次灭菌后，得到浓度为0.2%、2%或7%的水解红米提取物。
所述的复合酶为质量比1:1:1:1:1蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物。
实施例2一种红米酶解提取物的制备方法
包括以下步骤：
（1）将红米清洗干净后，加水浸泡，得到浸泡后的红米；
（2）向浸泡后的红米中加入红米质量8%的复合酶，进行一次酶解，酶解时间为10h，温度为45℃，然后酶灭活后离心，保留上清液；
（3）向上清液中再次加入红米质量6%的复合酶，进行二次酶解，酶解时间为6h，温度为45℃，然后酶灭活，进行多级精滤浓缩，再次灭菌后，得到浓度为0.2%、2%或7%的水解红米提取物。
所述的复合酶为质量比3:3:3:2:2蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物。
实施例3一种红米酶解提取物的制备方法
包括以下步骤：
（1）将红米清洗干净后，加水浸泡，得到浸泡后的红米；
（2）向浸泡后的红米中加入红米质量6%的复合酶，进行一次酶解，酶解时间为10h，温度为45℃，然后酶灭活后离心，保留上清液；
（3）向上清液中再次加入红米质量4%的复合酶，进行二次酶解，酶解时间为5h，温度为45℃，然后酶灭活，进行多级精滤浓缩，再次灭菌后，得到浓度为0.2%、2%或7%的水解红米提取物。
所述的复合酶为质量比2:2:2:1:1蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物。
对比例1
与实施例3的区别在于，仅进行了一次酶解，具体为：
（1）将红米清洗干净后，加水浸泡，得到浸泡后的红米；
（2）向浸泡后的红米中加入红米质量10%的复合酶，进行一次酶解，酶解时间为15h，温度为45℃，然后酶灭活，进行多级精滤浓缩，再次灭菌后，得到浓度为2%的水解红米提取物。
所述的复合酶为质量比2:2:2:1:1蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物。
对比例2
与实施例3的区别在于，复合酶为质量比2:2:2蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，制备得到浓度为2%的水解红米提取物，其他操作和步骤与实施例3相同。
对比例3
与实施例3的区别在于，复合酶为质量比2:2:2:1蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶，制备得到浓度为2%的水解红米提取物，其他操作和步骤与实施例3相同。
效果验证
以下记载的检测方法均为现有技术中公开的方法
1、水解红米提取物-安全性测试
1.1、实验方法：
鸡胚尿囊膜实验主要分为鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（CAMVA）和鸡胚绒毛尿
囊膜试验（HET-CAM）。鸡胚尿囊膜具有丰富的血管网络，与眼结膜的结构相似，鸡胚尿囊膜试验是一种灵敏度很高的刺激实验体外代替方法。本实验操作严格按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2329—2009执行，详见此标准。
2、实验结果：
实验结果判断选择反应时间法。
将水解红米提取液浓缩至不同梯度，最高为10%（原料与滤液之比），滴加0.3ml提取液于绒毛尿囊膜表面，范围约为1.5cm直径，接触30S后用生理盐水轻轻冲洗，然后观察5min内CAM血管变化，并记录出现出血、溶血和凝血的初始时间，根据观察结果应用式(1)计算刺激评分（IS），结果保留小数点后两位：
IS=++（1）
式中：
sec H（出血时间）-CAM 膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒(s)；
sec L（血管融解时间）-CAM 膜上观察到开始发生血管融解的平均时间，单位为秒(s)；
sec C（凝血时间）-CAM 膜上观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒(s)。
ps：出血：血液从 CAM 膜血管内流出血管外，可以表现为血管外出现点状出血或絮状的弥漫性出血等多种形式。
凝血：血管内和血管外蛋白的变性，表现为血管内血流变慢或血栓形成，血管呈现棕黑色，血管外出现混浊和不透明。
血管融解：CAM 膜上小血管壁破裂，小血管融解消失。
根据计算的IS数值按下表1对受试物眼刺激性进行分类。
表1 刺激评分法结果评价
实验结果显示各浓度下均IS＜1，显示出了实施例1-3以及对比例1-3制备的水解红米提取液均无刺激性，说明本发明提供的水解红米提取液均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
2、羟自由基清除能力的测定
在0.40mL 6mmol/L硫酸亚铁溶液中，加入1mL 8.8mmol/L的过氧化氢溶液，再加入1mL 9 mmol/L水杨酸溶液和1.60mL蒸馏水，混合均匀，37℃下水浴加热15min（蒸馏水为空白对照），在510nm波长下测定吸光度值Ac。Ai为以10 mg/mL 的红米酶解提取物（分别取实施例1-3制备的浓度为0.2%、2%、7%以及对比例1-3制备的浓度为2.0%的提取物10mg溶于1mL去离子水中）的样品代替1.60mL蒸馏水测得的吸光度值，平行测定3次，取1 mL蒸馏水代替过氧化氢溶液测定吸光度值为Aj。Vc溶液作为阳性对照，计算样品对羟自由基的清除率。
清除率（%）=×100%
检测结果见下表2。
表2
由上表2的检测数据可知，本发明实施例1-3制备的水解红米提取物对羟自由基都有较好的清除能力，对比例1改变酶解次数，即仅进行一次酶解，得到的水解红米提取物清除羟自由基的能力较实施例1-3有一定程度的降低，对比例2-3改变复合酶的种类，即便酶解方法相同，得到的水解红米提取物清除羟自由基的能力也会出现一定程度的降低，表明只有通过本申请请求保护的水解红米提取物，具有较好的对羟自由基清除效果。
3、稳定性检测
分别取浓度为2%的实施例3，以及对比例1-3制备的水解红米提取物，按照上述效果实验2中羟自由基清除能力的测定的方法，测定不同时间的吸光度值，分别观察各个时间段的羟自由基清除能力（具体操作方法与上述羟自由基清除能力的测定的方法相同），计算清除率%，检测结果见下表3。
表3
根据上表3的检测结果可以看出，本发明实施例3制备的水解红米提取物具有较好的羟自由基清除稳定性，96小时后依然具有较高强的清除率；对比例1改变酶解次数，即仅进行一次酶解，得到的水解红米提取物清除羟自由基强度随着时间的延长有一定程度的降低，对比例2-3改变复合酶的种类，即便酶解方法相同，得到的水解红米提取物清除羟自由基的能力也会出现一定程度的降低，由此可知只有本申请提供的方法制备的水解红米提取物才能达到较好、较稳定的清除羟自由基的效果。
以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性
的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏
离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，
但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种红米酶解提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将红米清洗干净后，加水浸泡，得到浸泡后的红米；
（2）向浸泡后的红米中加复合酶，进行一次酶解，然后酶灭活后离心，保留上清液；
（3）向上清液中再次加入复合酶，进行二次酶解，然后酶灭活，进行多级精滤浓缩，再次灭菌后，得到所述的水解红米提取物；
步骤（2）-（3）中所述的复合酶为质量比1-3:1-3:1-3:1-2:1-2蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物；步骤（2）中所述的复合酶的添加量为红米质量的5-8%；步骤（3）中所述的复合酶的添加量为红米质量的3-6%；步骤（2）中所述的酶解时间为8-10h，酶解温度为45-48℃；步骤（3）中所述的酶解时间为5-6h，酶解温度为45-48℃；
所述红米为老黑谷米。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的复合酶为质量比2:2:2:1:1的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的复合酶的添加量为红米质量的6%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的复合酶的添加量为红米质量的4%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的多级精滤浓缩后得到的水解红米提取物的浓度为0.1-10%。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的多级精滤浓缩后得到的水解红米提取物的浓度为0.2%、2%或7%。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的红米酶解提取物。
8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的红米酶解提取物在化妆品中的应用，其特征在于：所述的化妆品包括乳液、面霜、精华中的一种或几种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Qian Deyu Inventor after: Zhang Honglian Inventor after: Liu Jianxin Inventor before: Qian Deyu Inventor before: Zhang Honglian Inventor before: Liu Shi |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |