CN112107511B - 一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法及其应用。该制备方法中，利用长型双歧杆菌进行双发酵后破壁处理，配置形成发酵溶胞物，并溶胞物作为活性成分用于精华液。进一步地，以该溶胞物为原材料之一提供了一种精华液。本发明解决了现有工艺繁琐的问题，采用连续二次发酵的方式，配合破壁、离心过滤等简单工艺，实现发酵溶胞物的快速提取，大大降低了工艺复杂度，可控性强。

Description

一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物提取领域，具体涉及一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法及其应用。
背景技术
双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物。双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。作为新兴生物资源，双歧杆菌产业化的研究和开发具有更积极意义。然而，目前对双歧杆菌溶胞产物的工艺较为匮乏，且现有的工艺步骤较为复杂。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法。
本发明的技术方案是：
一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6％，培养温度为38-39℃，时间为20-30h，所述种子培养液的质量配比为脱脂奶粉5.0％、葡萄糖1.5％、酵母粉1.5％、硫酸铵1.3％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾1.1、异乳糖0.8％、水88.5％；
步骤2，将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；其中，所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6％，种子液的发酵初始pH为6.6-7.0，厌氧发酵的培养温度为38-39℃，时间为9-10h；所述巴氏灭菌的温度为 60-65℃；所述发酵培养液的质量配比为：葡萄糖2.0％、酪蛋白胨1.5％、酵母粉1.5％、牛肉蛋白胨1.0％、水解乳蛋白1.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸三铵0.2％、吐温-80 0.1％、MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％、K2HPO4 0.05％；
步骤3，将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0:1.0-6.0；
步骤4，在步骤3中破壁后的溶液加入助剂,得到发酵溶胞物。
所述步骤3中的破壁处理在冰浴条件下高速均质破壁处理，均质破壁压力为120-130bar，温度为-4～0℃。
所述步骤3中的破壁处理采用超声波分解处理，破碎细胞壁，超声5-6s/ 次，循环10-20次，且超声波分解处理在-4～0℃的冰浴条件下进行。
所述步骤4中的溶液在加入助剂前进行离心浓缩处理，所述离心的速度为8000r/min。
所述助剂采用防腐剂和悬浮剂，所述悬浮剂采用悬浮剂SF-1或者化妆品级卡波姆，所述悬浮剂加入量是溶液质量的1-2％，防腐剂采用对羟基苯乙酮或者苯酚磺酸锌，加入量是溶液质量的0.3-0.9％。
一种精华液，以上述发酵溶胞物配合羧甲基β-葡聚糖钠作为活性成分。
一种精华液，由A组分、B组分和C组分组成，所述A组分由去离子水、 EDTA二钠、尿囊素、甘油、羟苯甲酯、卡波姆、透明质酸钠、甜菜碱、小核菌胶、丁二醇组成，所述B组分为上述发酵溶胞物、羧甲基β-葡聚糖钠和精氨酸的混合物，C组分为苯氧乙醇。
所述精华液的质量百分比为：A组分：去离子水75.1％、EDTA二钠0.02％、尿囊素0.15％、甘油4.00％、羟苯甲酯0.15％、卡波姆3.00％、透明质酸钠0.05％、甜菜碱3.00％、小核菌胶0.05％、丁二醇4.00％，B组分：发酵溶胞物10.00％和0.10％、精氨酸0.08％，C组分为苯氧乙醇0.30％。
发酵溶胞物含有代谢产物、细胞质成分、细胞壁组分和多糖复合物活性成分，能阻止免疫抑制剂白介素的释放，同时防止白介素受到抑制。二裂酵母发酵产物溶胞物能帮助表皮细胞和真皮细胞对抗UVB射线的有害影响，保持细胞的完整性和活力皮细胞，不仅舒缓修复肌肤，还能对抗皮肤早衰。
羧甲基β-葡聚糖钠是一种有效的免疫系统调节剂，它能活化巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞的能力，刺激宿主非特异性防御机制。皮肤中具有免疫活性的朗格罕氏细胞能够被酵母葡聚糖钠活化，诱发其系统的免疫和修复功能，同时利用发酵溶胞物提供生物级的修复营养物质，形成配合效果，进一步提升修复、美白和防紫外伤害的效果。
透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的双糖单位重复连接构成的黏多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。HA其在医药、化妆品、食品等仪式有广泛而独特的应用价值。尤其在化妆品领域，HA以其无与伦比的肤感、独特的保湿活性和成膜性，在护肤品方面得到了广泛的应用。
从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
1.本发明解决了现有工艺繁琐的问题，采用连续二次发酵的方式，配合破壁、离心过滤等简单工艺，实现发酵溶胞物的快速提取，大大降低了工艺复杂度，可控性强。
2.本发明利用冰浴条件下进行破壁处理，能够有效的降低溶胞物内活性成分的氧化，大幅度提升溶胞物的稳定性，特别是超声分散过程中，冰浴能够一直活性物质的变化。
具体实施方式
结合实施例详细说明本发明，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1
一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6％，培养温度为38℃，时间为20h，所述种子培养液的质量配比为脱脂奶粉5.0％、葡萄糖1.5％、酵母粉1.5％、硫酸铵1.3％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾1.1、异乳糖0.8％、水88.5％；
步骤2，将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；其中，所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6％，种子液的发酵初始pH为6.6，厌氧发酵的培养温度为38℃，时间为9h；所述巴氏灭菌的温度为60℃；所述发酵培养液的质量配比为：葡萄糖2.0％、酪蛋白胨1.5％、酵母粉1.5％、牛肉蛋白胨1.0％、水解乳蛋白1.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸三铵0.2％、吐温-800.1％、 MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％、K2HPO4 0.05％；
步骤3，将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0:1.0，破壁处理在冰浴条件下高速均质破壁处理，均质破壁压力为120bar，温度为-4℃；
步骤4，在步骤3中破壁后的溶液加入溶液质量1％的悬浮剂SF-1和溶液质量0.3％的对羟基苯乙酮,得到发酵溶胞物-长型双歧杆菌的发酵产物产品。
一种精华液，其质量百分比为：A组分：去离子水75.1％、EDTA二钠0.02％、尿囊素0.15％、甘油4.00％、羟苯甲酯0.15％、卡波姆3.00％、透明质酸钠0.05％、甜菜碱3.00％、小核菌胶0.05％、丁二醇4.00％，B组分：上述的发酵溶胞物 10.00％和0.10％、精氨酸0.08％，C组分为苯氧乙醇0.30％。
实施例2
一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6％，培养温度为39℃，时间为30h，所述种子培养液的质量配比为脱脂奶粉5.0％、葡萄糖1.5％、酵母粉1.5％、硫酸铵1.3％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾1.1、异乳糖0.8％、水88.5％；
步骤2，将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；其中，所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6％，种子液的发酵初始pH为7.0，厌氧发酵的培养温度为39℃，时间为10h；所述巴氏灭菌的温度为65℃；所述发酵培养液的质量配比为：葡萄糖2.0％、酪蛋白胨1.5％、酵母粉1.5％、牛肉蛋白胨1.0％、水解乳蛋白1.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸三铵0.2％、吐温-800.1％、 MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％、K2HPO4 0.05％；
步骤3，将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0:6.0，破壁处理在冰浴条件下高速均质破壁处理，均质破壁压力为130bar，温度为0℃；
步骤4，在步骤3中破壁后的溶液加入溶液质量2％的悬浮剂SF-1和溶液质量0.9％的对羟基苯乙酮,得到发酵溶胞物-长型双歧杆菌的发酵产物产品。
一种精华液，其质量百分比为：A组分：去离子水75.1％、EDTA二钠0.02％、尿囊素0.15％、甘油4.00％、羟苯甲酯0.15％、卡波姆3.00％、透明质酸钠0.05％、甜菜碱3.00％、小核菌胶0.05％、丁二醇4.00％，B组分：上述的发酵溶胞物 10.00％和0.10％、精氨酸0.08％，C组分为苯氧乙醇0.30％。
实施例3
一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6％，培养温度为39℃，时间为20h，所述种子培养液的质量配比为脱脂奶粉5.0％、葡萄糖1.5％、酵母粉1.5％、硫酸铵1.3％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾1.1、异乳糖0.8％、水88.5％；
步骤2，将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；其中，所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6％，种子液的发酵初始pH为6.8，厌氧发酵的培养温度为39℃，时间为9h；所述巴氏灭菌的温度为63℃；所述发酵培养液的质量配比为：葡萄糖2.0％、酪蛋白胨1.5％、酵母粉1.5％、牛肉蛋白胨1.0％、水解乳蛋白1.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸三铵0.2％、吐温-800.1％、 MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％、K2HPO4 0.05％；
步骤3，将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0:4.0，破壁处理在冰浴条件下高速均质破壁处理，均质破壁压力为125bar，温度为-2℃；
步骤4，在步骤3中破壁后的溶液加入溶液质量1.5％的悬浮剂SF-1和溶液质量0.6％的对羟基苯乙酮,得到发酵溶胞物-长型双歧杆菌的发酵产物产品。
一种精华液，其质量百分比为：A组分：去离子水75.1％、EDTA二钠0.02％、尿囊素0.15％、甘油4.00％、羟苯甲酯0.15％、卡波姆3.00％、透明质酸钠0.05％、甜菜碱3.00％、小核菌胶0.05％、丁二醇4.00％，B组分：上述的发酵溶胞物 10.00％和0.10％、精氨酸0.08％，C组分为苯氧乙醇0.30％。
实施例4
一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6％，培养温度为39℃，时间为20-30h，所述种子培养液的质量配比为脱脂奶粉5.0％、葡萄糖1.5％、酵母粉1.5％、硫酸铵1.3％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾1.1、异乳糖0.8％、水88.5％；
步骤2，将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；其中，所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6％，种子液的发酵初始pH为7.0，厌氧发酵的培养温度为39℃，时间为10h；所述巴氏灭菌的温度为65℃；所述发酵培养液的质量配比为：葡萄糖2.0％、酪蛋白胨1.5％、酵母粉1.5％、牛肉蛋白胨1.0％、水解乳蛋白1.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸三铵0.2％、吐温-800.1％、 MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％、K2HPO4 0.05％；
步骤3，将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0:6.0，破壁处理采用超声波分解处理，破碎细胞壁，超声6s/次，循环20次，且超声波分解处理在0℃的冰浴条件下进行；
步骤4，在步骤3中破壁后的溶液加入溶液质量2％的化妆品级卡波姆和溶液质量0.9％的苯酚磺酸锌,得到发酵溶胞物-长型双歧杆菌的发酵产物产品。
一种精华液，其质量百分比为：A组分：去离子水75.1％、EDTA二钠0.02％、尿囊素0.15％、甘油4.00％、羟苯甲酯0.15％、卡波姆3.00％、透明质酸钠0.05％、甜菜碱3.00％、小核菌胶0.05％、丁二醇4.00％，B组分：上述的发酵溶胞物 10.00％和0.10％、精氨酸0.08％，C组分为苯氧乙醇0.30％。
实施例5
一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6％，培养温度为39℃，时间为30h，所述种子培养液的质量配比为脱脂奶粉5.0％、葡萄糖1.5％、酵母粉1.5％、硫酸铵1.3％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾1.1、异乳糖0.8％、水88.5％；
步骤2，将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；其中，所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6％，种子液的发酵初始pH为7.0，厌氧发酵的培养温度为39℃，时间为10h；所述巴氏灭菌的温度为65℃；所述发酵培养液的质量配比为：葡萄糖2.0％、酪蛋白胨1.5％、酵母粉1.5％、牛肉蛋白胨1.0％、水解乳蛋白1.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸三铵0.2％、吐温-800.1％、 MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％、K2HPO4 0.05％；
步骤3，将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0:6.0，破壁处理采用超声波分解处理，破碎细胞壁，超声5s/次，循环10次，且超声波分解处理在-4℃的冰浴条件下进行；
步骤4，在步骤3中破壁后的溶液加入溶液质量1％的化妆品级卡波姆和溶液质量0.3％的苯酚磺酸锌,得到发酵溶胞物-长型双歧杆菌的发酵产物产品。
一种精华液，其质量百分比为：A组分：去离子水75.1％、EDTA二钠0.02％、尿囊素0.15％、甘油4.00％、羟苯甲酯0.15％、卡波姆3.00％、透明质酸钠0.05％、甜菜碱3.00％、小核菌胶0.05％、丁二醇4.00％，B组分：上述的发酵溶胞物 10.00％和0.10％、精氨酸0.08％，C组分为苯氧乙醇0.30％。
实施例6
一种二裂酵母发酵溶胞物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6％，培养温度为39℃，时间为20-30h，所述种子培养液的质量配比为脱脂奶粉5.0％、葡萄糖1.5％、酵母粉1.5％、硫酸铵1.3％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾1.1、异乳糖0.8％、水88.5％；
步骤2，将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；其中，所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6％，种子液的发酵初始pH为7.0，厌氧发酵的培养温度为39℃，时间为10h；所述巴氏灭菌的温度为65℃；所述发酵培养液的质量配比为：葡萄糖2.0％、酪蛋白胨1.5％、酵母粉1.5％、牛肉蛋白胨1.0％、水解乳蛋白1.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸三铵0.2％、吐温-800.1％、 MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％、K2HPO4 0.05％；
步骤3，将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0:6.0，破壁处理采用超声波分解处理，破碎细胞壁，超声5s/次，循环10次，且超声波分解处理在-4℃的冰浴条件下进行；
步骤4，在步骤3中破壁后的溶液进行8000r/min的离心处理，浓缩至原来的20％，然后加入溶液质量1％的化妆品级卡波姆和溶液质量0.7％的苯酚磺酸锌,得到发酵溶胞物-长型双歧杆菌的发酵产物产品。
一种精华液，其质量百分比为：A组分：去离子水75.1％、EDTA二钠0.02％、尿囊素0.15％、甘油4.00％、羟苯甲酯0.15％、卡波姆3.00％、透明质酸钠0.05％、甜菜碱3.00％、小核菌胶0.05％、丁二醇4.00％，B组分：上述的发酵溶胞物 10.00％和0.10％、精氨酸0.08％，C组分为苯氧乙醇0.30％。
以实施例1为例进行皮肤美白、修复方面的功效检测。检测周期为56 天，使用方法：每天早晚清洁面部后，使用3-5滴，按摩吸收，测试周期为 2周一次，测试方法：皮肤测试仪对面部皱纹、纹理、斑点、红色区、水分等指标测试。
皮肤美白效果
以皮肤黑色素测试仪、皮肤色差测试仪为测试仪器，在测试周期内，受试部位的黑色素含量的相对变化率呈降低趋势，且一直为负值，皮肤黑色素相对降低率为5.96-8.94％。深层色斑也有一定的减少。受试部位皮肤亮度的相对变化率一直为正值。皮肤亮度相对提升率为5.10-6.75％。
修复皮肤敏感和损伤效果
以皮肤色差测试仪为测试仪器，通过测试脸部的红色区域，面部红色区域总体降低幅度在20-45.6％。结果分析表明，本技术产品在舒缓敏感和修复红血丝方面有较好的效果。
祛除皱纹和持平细纹效果
以皮肤色差测试仪为测试仪器，通过测试脸部的皱纹，脸部在皱纹数量和细纹数量方面均有明显下降。56天时，皱纹下降幅度为38.9％，细纹下降幅度为47.3％。结果分析表明，本产品在祛除皱纹和细纹方面有良好的效果。
皮肤水合度和皮肤弹性
以皮肤水份测试仪为测试仪器，通过测试测试皮肤水合度，皮肤水含水量即有提升明显，且测试期间水合度呈上升趋势，在第28天时皮肤水合度提升约47％。
综上检测效果显示，该产品在淡斑、提亮肤色、祛除皱纹和细纹、舒敏修复、保水等方面均有良好的效果，尤其是在舒缓敏，修复皮肤损伤、保水及祛除细纹方面效果更突出。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种精华液，其特征在于，由A组分、B组分和C组分组成，所述A组分由去离子水75.1%、EDTA二钠0.02%、尿囊素0.15%、甘油4.00%、羟苯甲酯0.15%、卡波姆3.00%、透明质酸钠0.05%、甜菜碱3.00%、小核菌胶0.05%、丁二醇4.00%组成，所述B组分为二裂酵母发酵溶胞物10.00%、羧甲基β-葡聚糖钠0.10%、精氨酸0.08%的混合物，C组分为苯氧乙醇0.30%；
其中，所述二裂酵母发酵溶胞物的制备方法包括如下步骤：
步骤1：将长型双歧杆菌接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；所述种子培养基的质量配比为脱脂奶粉5.0%、葡萄糖1.5%、酵母粉1.5%、硫酸铵1.3%、磷酸二氢钾0.3%、磷酸氢二钾1.1%、异乳糖0.8%、水88.5%；
步骤2：将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，然后巴氏灭菌30min，低温离心收集菌体；所述发酵培养基的质量配比为：葡萄糖2.0%、酪蛋白胨1.5%、酵母粉1.5%、牛肉蛋白胨1.0%、水解乳蛋白1.5%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.2%、吐温-80 0.1%、MgSO40.05%、MnSO4 0.02%、K2HPO4 0.05%；
步骤3：将蒸馏水加入至菌体中混合，破壁处理释放出营养物质；所述菌体与蒸馏水的体积比为1.0：1.0～6.0；
步骤4：在步骤3中破壁后的溶液加入助剂，得到发酵溶胞物；
步骤1所述长型双歧杆菌的接种量是种子培养基质量的6%，培养温度为38～39℃，时间为20～30h；
步骤2所述厌氧发酵的种子液发酵接种量是发酵培养基质量的6%，种子液的发酵初始pH为6.6～7.0，厌氧发酵的培养温度为38～39℃，时间为9～10h；所述巴氏灭菌的温度为60～65℃；
步骤3所述破壁处理为在冰浴条件下高速均质破壁处理，均质破壁压力为120～130bar，温度为-4～0℃；或为在冰浴条件下超声波分解处理，破碎细胞壁，超声5～6s/次，循环10～20次。
2.根据权利要求1所述精华液，其特征在于，步骤4所述助剂为防腐剂和悬浮剂。
3.根据权利要求2所述精华液，其特征在于，所述悬浮剂采用悬浮剂SF-1或者化妆品级卡波姆，所述悬浮剂加入量是溶液质量的1～2%；所述防腐剂采用对羟基苯乙酮或者苯酚磺酸锌，所述防腐剂加入量是溶液质量的0.3～0.9%。
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