KR20020063170A

KR20020063170A - 홍국을 이용한 일산화질소 생성제 조성물 및 이를포함하는 제약 조성물

Info

Publication number: KR20020063170A
Application number: KR1020027005439A
Authority: KR
Inventors: 류미라; 김덕경; 김보경
Original assignee: 한국식품개발연구원
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2002-08-01
Also published as: AU1175601A; WO2001031048A1; KR20010038797A

Abstract

본 발명은 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다. 일산화질소 생성제 조성물은 홍국균으로 발효된 쌀인 홍국, 그 분말, 그 추출물 또는 이들의 조합물을 사용하여 제조된다. 본 발명에 따른 조성물은 혈관계에 유해한 부작용을 발생시키지 않으면서 혈관을 이완시키는 작용을 보인다.

Description

홍국을 이용한 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 포함하는 제약 조성물 {Nitric Oxide Donor Composition Using Red Rice Fermented with Monascus and a Pharmaceutical Composition Containing the Same}

일반적으로, 혈관 평활근은 교대로 이완 및 수축함으로써 혈액 이동을 조절한다. 고혈압, 고콜레스테롤혈증 등의 순환계 질병 환자의 혈관은 적절하게 이완 및 수축하지 못한다. 이러한 혈관의 기능 이상은 혈관 내피에서 방출되는 일산화질소 (이하 'NO'라 함)와 관련된다. 혈관 내피는 혈류 및 혈관의 긴장도를 조절하고, 혈소판 응집을 억제하는 등 체내의 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 수행한다. 혈관 내피가 손상될 경우, 내피로부터의 NO 방출이 감소하고, 이에 따라 혈관의 정상적인 이완 및 수축을 방해한다.

혈관 이완 메카니즘은 널리 공지되어 있다. 그 메카니즘을 요약하면, 혈관내피는 내피 유래 이완 인자 (EDRF), 즉 NO를 방출시키며, 방출된 NO는 혈관 평활근에 작용하여 가용성 구아닐레이트 사이클라제를 활성화시킨다. 활성화된 구아닐레이트 사이클라제는 조직내 사이클릭 GMP 수준을 증가시키고, 증가된 사이클릭 GMP는 혈관을 이완시킨다.

일산화질소에 관한 연구는 Furchgott와 Zawadszki에 의해 1980년에 길이 열린 이후 급속도로 발전된 연구분야 중 하나이다(Nature, 288: 373, 1980). NO 생합성 등에 대한 기본적인 사항은 1990년대 초에 이르러 많이 밝혀졌고, 최근 수년에 걸쳐서는 관련 질병의 병태나 치료의 측면에서 NO 연구가 급격하게 증가하여, 현재는 의학연구가 및 임상의들이 가장 큰 관심을 두고 있는 분야 중의 하나라 할 수 있다.

따라서, 혈관 순환계에 대한 NO 연구는 공지되어 있다. 현재, NO 연구는 자율신경계, 내분비계, 중추신경계, 면역관계 등을 망라한 의학의 전분야에서 연구 및 임상에의 응용이 시도되고 있다. 질환 치료의 임상에서는 120년 이전부터 니트로글리세린이 협심증의 치료약으로 유효하다는 보고가 있은 이래, 그 작용기전은 불명확하나 NO 생성제(NO donor)를 심장병의 치료약으로 사용하여 왔다.

또한, NO 및 NO 관련 물질은 사람의 본태성 고혈압, 폐성 고혈압과 신성 고혈압을 경감시키는 작용을 하며, 사람의 관상동맥질환(허혈성 심질환)의 치료를 위해서는 필수적으로 조제되는 물질이다. 현재 NO 생성제가 치료 약물로 사용되고 있는 질환으로는 대표적으로 협심증, 심근경색, 고혈압 등이 있다. NO 생성제는 주사제, 설하제, 패치제, 스프레이제, 흡입제 등으로 투여될 수 있다. 또한, 남성의임포텐스도 NO와 연관이 있는데, 최근에 화이자 인크에 의해 개발되어 사회의 이목을 집중시킨 비아그라 또한 NO와 직접적으로 관련이 있다.

NO 및 NO 관련 물질이 치료제로서 사용될 수 있는 질병의 범위가 장차 확대될 수 있다는 것은 자명하다. 상기 NO 생성제는 순환계 질병, 즉 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화증, 혈액순환 장애, 신경통, 당뇨병, 성기능 장애, 기억력 장애 등의 예방 및(또는) 치료를 위한 혈관이완제로서 사용될 수 있다. 따라서, 전세계의 많은 제약회사는 효과적인 혈관이완제 개발에 심혈을 기울이고 있으며, 비아그라를 포함하여 많은 시판되는 약제도 다수 개발되어 있는 상태이다.

혈관이완제(NO 생성제)는 화학적 약물과 생약으로 크게 대별할 수 있다. 종래의 화학적 약물은 생체 내에서 의도하지 않았던 부작용, 예를 들면 혈관내피 손상, 용혈, 급성 독성이나 아독성 등과 급성 신장염, 심장마비 등을 발생시키는 경우가 많고, 생산 공정이 매우 까다로워서 대량 생산이 곤란한 점이 있었다. 특히 그 중 비아그라 등 화학적 혈관 이완제는 심장마비 등 몇 가지 생명에 치명적인 부작용이 보고되고 있는 형편이어서 현재로서는 안전한 사용을 보장할 수 있는 상태는 아니라 할 수 있다.

한편, 생약 중 전통 생약제의 경우에는 오랜 기간의 사용에 의해 자연적으로 임상실험을 거친 결과가 되어 생명에 치명적인 부작용은 거의 없다고 할 수 있다. 예를 들어, 대한민국 등록 특허 공보 1999-201585호에는 인삼의 진세노사이드 Rg₃및 Rg₅를 주요 성분으로 포함하는 생약 (혈관 이완제)은 이러한 부작용이 없다고 보고된 바 있다.

상기와 같이, 일반적으로 생약의 경우는 화학적 약품의 경우보다는 그 부작용을 많이 줄일 수 있겠으나, 산삼, 인삼이나 코뿔소뼈, 호랑이뼈, 웅담, 희귀 동식물 등 생약의 원재료를 구하는 것이 물리적 또는 사회적으로 곤란하거나 구할 수 있다 하더라도 일반적으로 그 가격이 매우 고가이다. 또한 대부분의 경우에 원재료는 신뢰할 수 있는 혈관 이완제 제조에 필요한 유효 성분을 매우 소량 함유하고 있다는 문제점이 있었다.

따라서, 협심증, 심근경색, 심장병, 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화증, 혈액순환 장애, 신경통, 당뇨병, 성기능 장애, 기억력 장애 등의 질병의 예방 및(또는) 치료를 위해 사용될 수 있고, 부작용이 없으며, 그 제조 비용이 저렴한 신규 혈관이완제 (NO 생성제)에 대한 필요성이 상존하였다.

발명의 요약

본 발명은 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 진균속에 속하는 홍국균으로 발효된 쌀인 홍국 및(또는) 그 분말 및(또는) 그 추출물을 활성 성분으로 함유하는 일산화질소 생성제 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 저비용의 간단한 공정에 의해 부작용이 없는 혈관이완제 제조에 사용될 수 있는 일산화질소 생성제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 저비용의 간단한 공정에 의해 협심증, 심근경색, 고혈압, 성기능 장애, 기억력 장애 등의 질병의 치료제 제조에 사용될 수 있는 일산화질소생성제 조성물을 제공한다.

본 발명은 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 진균속(Fungal genus)에 속하는 홍국균 (Monascus, 紅麴菌)으로 발효된 쌀인 홍국(紅麴) 및(또는) 그 분말 및(또는) 그 수용성 추출물을 활성 성분으로 함유하는 조성물 및 이를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 조성물의 내피 의존성을 보여주는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 조성물의 농도 의존성을 보여주는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 조성물에 대한 NO 합성 저해제의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 조성물에 의해 유도되는 혈관 이완에 대한 감마-아미노부틸산(이하 'GABA'라 함)과 아트로핀의 효과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 본 발명의 조성물 및 L-NNA, 히스타민의 존재 하에서 혈관 내피의 NO 생산량을 비교하는 그래프이다.

본 발명은 홍국, 그 분말 또는 그 추출물이 NO 생성제, 즉 혈관이완제로서 작용할 수 있다는 발견에 기초한 것이다.

따라서, 본 발명은 일산화질소 생성제 조성물 및 이를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 본 발명에 따른 일산화질소 생성제 조성물은 활성 성분으로서 홍국균으로 발효된 쌀인 홍국, 홍국 분말 및 홍국 추출물을 개별적으로 또는 이들의 조합물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 홍국 및 그의 유도체의 활성 성분으로서의 새로운 용도를 제공한다.

한 특징에서, 본 발명의 일산화질소 생성제 조성물은 홍국 분말을 포함한다. 홍국은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 입수할 수있는 발효 미생물인 홍국균과 쌀을 주원료로 하여 제조된다. 예를 들어, 홍국은 (a) 분쇄된 쌀을 50℃의 물에 3시간 동안 담그는 단계, (b) 물을 빼내고 쌀을 압력솥에서 익힌 다음 냉각시키는 단계 및 (c) 냉각된 쌀에 모나스커스 루버(Monascus ruber) IF032318을 접종하여 30℃에서 2일 동안 발효시킨 후, 호기성 조건 하에 25℃에서 6일 동안 계속 발효시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

다른 예에서, 홍국 분말은 (a) 분쇄된 쌀을 50℃의 물에 3시간 동안 담그는 단계, (b) 물을 빼내고 쌀을 압력솥에서 익힌 다음 냉각시키는 단계, (c) 냉각된 쌀에 모나스커스 루버 IF032318을 접종하여 30℃에서 2일 동안 발효시킨 후, 호기성 조건 하에 25℃에서 6일 동안 계속 발효시키는 단계, (d) 발효된 홍국을 90℃에서 20분간 가열하여 진균의 효소를 불활성화시키는 단계, (e) 가열된 홍국을 수분 함량이 10% 미만이 되도록 50℃에서 건조시키는 단계 및 (f) 건조된 홍국을 믹서로 연마하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 특징에서, 일산화질소 생성제 조성물은 홍국의 추출물을 포함할 수 있다. 상기 추출물은 당업계에 통상 사용되는 추출법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어 홍국 추출물은 (a) 홍국 분말을 80℃에서 4배 부피의 에탄올에 1시간씩 3회 침지시키는 단계, (b) 단계 a)에서 수득한 추출물을 증발시켜 물에 현탁시키는 단계, (c) 현탁액을 에틸아세테이트와 혼합하는 단계, (d) 액상 물질을 에틸아세테이트로 세척한 다음 부탄올로 세척하는 단계, (e) 상기 액상 물질을 증발시키는 단계 및 (f) 고형체를 염수에 용해시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

홍국 또는 그의 분말을 사용하는 경우에는 활성 성분의 함량이 적을 수 있고 표준화가 어려울 수 있기 때문에 질병의 예방 또는 치료 등 실제 임상에 적용시에는 이를 고려하여 그 사용량을 적절히 조절할 필요가 있다. 약품 제조 산업에 적용되어 대량생산하는 경우 등을 고려할 때 실용적인 견지에서는 적절히 통제된 과정에 의하여 활성 화합물의 함량을 표준화하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같은 본 발명의 NO 생성제 조성물은 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 배합됨으로써 약제학 분야의 통상의 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로치제, 현탁제, 설하제 등의 경구투여(내복)용 제제, 정맥내 또는 근내 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제, 연고제, 크림제, 패치제, 액상 로션제, 스프레이제, 흡입제 등의 국소적용형 제제 등의 다양한 제제 형태로 만들어 생산할 수 있다.

본 발명의 수용성 홍국 추출물 (Water Phase of Fermented Rice with Monascus, 이하 'WP/FRM' 칭함)과 함께 사용될 수 있는 적합한 담체로는 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제, 안정화제, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다.

상기와 같이 제조된 약제학적 제제는 경구적으로 투여되거나, 또는 비경구적으로, 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내에 투여되거나 또는 국소에 바로 적용할 수도 있다. 또한 경구 투여시에는 위산에 의하여 약제가 분해되는 것을 방지하기 위하여제산제를 병용하거나 정제 등의 경구투여용 고형 제제를 장용피로 피복된 제제로 만들어 투여할 수도 있다.

본 발명의 NO 생성제 조성물 및 담체는 혼합되어 압축 성형하여 정제로 제조할 수 있다. 또한, 과립화한 후 충전하여 캅셀제로 제조할 수도 있으며, 주사용 증류수와 글리세린을 가하여 주사제로 제조할 수도 있고, 습포제 또는 패치제로 제조될 수도 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 NO 생성제 조성물은 일반적인 쌀과 미생물인 홍국균주를 주원료로 하여 제조할 수 있으므로 인삼 등의 희귀식물에 의하는 종래의 약제에 비하여 생산비가 극히 저렴하다. 또한, 그 생산에 있어서 일반적으로 알려져 있는 발효, 분쇄 및 추출 등에 의하므로 생산 공정이 매우 간단하고 용이하고 대량생산에 적합하다. 또한, 본 발명의 NO 생성제 조성물은 혈관 내피에 대한 손상을 발생시키지 않고 용혈 및 독성 등의 심각한 부작용이 없이 현저한 혈관 이완 작용을 나타내므로 생리적 활성의 안정성 및 사용상의 안전성이 매우 높다.

또한, 본 발명의 NO 생성제 조성물은 순환계의 장애로 인하여 발생하는 협심증, 심근경색, 심장병, 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화, 혈액순환 장애, 신경통, 당뇨병, 성기능 장애, 기억력 장애 등의 질환에 대한 예방 및 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있다.

아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 NO 생성제 조성물은 내피 의존적 및 농도 의존적 혈관 이완을 유도한다. 혈관 이완은 본 발명의 NO 생성제조성물이 내피의 NO 생성을 직접 자극함으로써 발생한다. 이것은 홍국, 그의 분말 또는 그의 추출물의 경우에도 동일하게 적용된다.

홍국, 홍국 분말 또는 추출물을 포함하는 본 발명의 NO 생성제 조성물이 혈관이완제 제조에 어떻게 사용가능한지를 이하에서 상세하게 설명한다. 편의상, 본 발명을 홍국 추출물을 적용한 일실시예를 통하여 설명하지만, 이것은 홍국 또는 그의 분말에도 동일하게 적용될 수 있다. 또한, 본원에서 설명하는 구체적인 공정 및 방법은 본 발명의 실시를 위해 단지 예시하고자 한 것으로서, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 이와 유사한 공정 및 기술을 본 발명에 동일하게 적용할 수 있음을 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 분명하게 알 수 있을 것이다.

<실시예 1> 홍국균을 사용하여 발효시킨 홍국, 그의 분말 및 추출물의 제조

분쇄된 쌀을 50℃의 물에 3시간 동안 담근 후 물을 빼고 압력솥에서 익힌 다음 홍국균인 모나스커스 루버 IF032318을 접종하였다. 그 후, 30℃에서 2일 동안 발효시키고, 호기성 조건하의 25℃에서 6일 동안 계속 발효시켜 홍국을 만든 후 90℃에서 20분간 가열하여 진균의 효소를 불활성화시켰다. 그리고 수분 함량이 10% 미만이 되도록 50℃에서 건조시킨 후 믹서로 갈아 분말로 만들었다.

코하마 등(Kohama et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 35:2484-2489, 1987)에 기재된 방법을 사용하여 홍국으로부터 수용성 액상을 추출하였다. 즉, 홍국 1 ㎏을 80℃에서 4배 부피의 에탄올에 1시간씩 3회 담그고, 그 추출물 5.21g을 증발시켜서 물에 현탁시킨 후 그 현탁액을 에틸아세테이트(AcOEt)와 혼합하였다. 이를 에틸아세테이트로 먼저 세척한 다음 부탄올(BuOH)로 세척하였다. 액상 물질을 증발시킨 후 고형체 1.54 g을 염수에 용해시킴으로써, 상기한 바와 같이 본 발명의 수용성 추출물(WP/FRM)을 얻을 수 있었다. 참고로 상기 WP/FRM의 증명 견본은 대한민국 경기도의 한국식품개발연구원(KFRI)에 기탁번호 HG-0001호로 기탁되어 있다.

<실시예 2> WP/FRM의 혈관이완 활성 및 그의 내피 의존성

본 실시예는 WP/FRM이 혈관을 이완시키는 작용을 하는지 여부와 그 혈관 이완 작용의 내피 의존성 여부를 살펴보기 위한 것이다.

체중 200 내지 250 g의 수컷 스프라그-도울리 (Sprague-Dawley) 쥐의 흉부 대동맥을 폭 2 내지 3 ㎜의 고리 형태로 분리하여 내피가 존재하는 샘플과 내피가 제거된 샘플을 각각 만들었다. 내피의 제거시에는 NaCl 136.9 mM, KCl 5.4 mM, CaCl₂1.5 mM, MgCl₂1.0 mM, NaHCO₃23.8 mM, 글루코즈 5.5 mM 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 0.01 mM이 포함된 생리식염수(PSS)를 적신 면사로 혈관의 내면을 부드럽게 문질러서 내피를 제거하였다. 그리고 상기 샘플을 10 mN의 휴지장력 하에서 홀더에 부착하고 4 ㎖ 수평형 근육 배양조에서 20분 동안 평형을 유지시킨 다음 반응이 안정될 때까지 각 조각을 70 mM KCl 용액에 반복적으로 노출시켰다. 그리고 NaCl을 등몰의 KCl로 치환함으로써 고농도의 K⁺용액으로 변화시켰다. 이 용액을 37℃, pH 7.4에서 95% 산소와 5% 이산화탄소 혼합물로 포화시킨 후 근장력을 폴리그래프 시스템 (polygraph system, RPS212, Grass, RI, USA)과 컴퓨터분석기(computer analyser, Power Lab 400, MacLab system, Castle Hill, Australia)가 결합된 힘-변위 변환기(force-displacement transducer, FT03, Grass, RI, USA)로 같은 크기로 기록하였다.

여기서 혈관 내피의 기능적 활성은 1 μM의 카르바콜(carbachol)이 300 nM 노르에피네프린(norepinephrine, 이하 'NE'라 함)으로 자극된 대동맥에서 거의 완전한 이완(＞90%)을 유도하였는지 여부를 측정함으로써 평가하였다(Sudjarwo et al., European Journal of Pharmacology, 229:137-142, 1992). 이어서, 혈관 수축을 자극하기 위하여 대동맥 샘플을 300 nM NE로 전처리하여 수축시킨 다음, 이완제 (WP/FRM, 카르바콜 또는 GABA)를 20분간 배양조에 첨가하였다. NE에 의해 장력을 자극하기 전에 30분 동안 NO 합성효소 저해제인 N0-니트로-L-아르기닌(N0-nitro-L-arginine, 이하 'L-NNA'라 함), 아트로핀 또는 사이클로옥시게나제 저해제인 인도메타신(indomethacin)을 전처리에 사용하였다. 약물의 의해 유도된 이완을 NE에 의해 유도된 장력의 백분율로서 표현하였다.

실시예 2의 결과를 도 1에 도시하였다. 도 1A는 혈관의 내피가 존재할 때의 그래프이고 도 1B는 내피가 제거되었을 때의 그래프이다. 상기 두 그래프의 비교에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 WP/FRM은 내피가 존재할 때만 혈관 이완 효과를 보인다. 이들 실험 결과는 본 발명의 WP/FRM이 혈관 내피에 대한 손상이 없이 혈관을 이완시키는 작용을 나타낸다는 것을 의미한다. 즉, WP/FRM은 용혈, 급성 또는 아급성의 독성 등과 같은 부작용이 없이 혈관이완제로서 안전하게 사용할 수 있음이 입증되었다.

보다 상세히 설명하면, 휴지 상태의 샘플에 본 발명의 WP/FRM 0.1 내지 10 ㎎/㎖를 인가한 경우에는 내피의 존부에 무관하게 어떤 래트 대동맥에서도 장력이 발생되지 않았다(n=4, 데이터는 미도시함). 도 1A는 내피가 존재하는 래트 대동맥에서 300 nM NE로 자극한 근육 장력에 대한 WP/FRM의 효과를 보여준다. WP/FRM (1 ㎎/㎖)는 NE로 수축시킨 내피가 존재하는 대동맥 샘플을 일시적으로 이완시켰다. 이렇게 이완된 샘플은 최대 이완반응에 도달한 후 40분 이내에 자극전 장력 수준의 60% 정도까지 점차 회복되었다. 이와 대조적으로, WP/FRM 1 ㎎/㎖를 인가한 경우에는 300 nM NE로 수축시킨 내피가 제거된 대동맥 샘플이 전혀 이완되지 않았다 (도 1B). 따라서 본 발명의 WP/FRM은 혈관의 내피에 대한 의존성이 강한 것으로 판단된다. 상기 WP/FRM의 억제 효과는 약 1 μM 카르바콜에 의한 혈관 이완 효과와 유사한데, 카르바콜은 NE에 의해 97.0 ±3.93%의 장력이 유도된 후에 적용될 때 90% 이상의 이완을 유도하는 것으로 알려져 있다.

<실시예 3> WP/FRM의 혈관이완 활성의 농도 의존성

본 실시예는 본 발명의 WP/FRM이 농도 의존적 방식으로 혈관이완 활성을 보이는지를 조사하기 위한 것이다.

내피가 존재하는 혈관 샘플에 0.1 ㎎/㎖, 0.3 ㎎/㎖, 1.0 ㎎/㎖ 및 3.0 ㎎/㎖의 WP/FRM을 인가하였다. WP/FRM에 대한 이완 반응의 평균 크기를 도 2에 도시하였다. 도 2는 본 발명의 WP/FRM의 농도가 0.3 ㎎/㎖ 이하일 때는 이완의 효과가 미약하였고, 1.0 ㎎/㎖ 이상일 때는 이완의 효과가 현저함을 보여준다. 따라서, 본 발명의 WP/FRM에 의한 이완 효과는 농도 의존적 방식으로 증가함을 알 수 있다.

<실시예 4> WP/FRM에 의해 유도된 이완에 대한 일산화질소 합성 저해제의 효과

본 실시예는 WP/FRM에 의한 혈관 이완이 내피에서 생성되는 NO에 의해 매개되는 것인지를 판명하기 위한 것이다. 이를 위해, L-NNA (NO 합성효소 저해제) 및 인도메타신(사이클로옥시게나제 저해제)의 카르바콜 또는 WP/FRM (3 mg/ml)에 의한 혈관 이완에 미치는 영향을 조사하였다.

먼저, 10 μM의 L-NNA로 30분간 처리한 후 300 nM NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에, 본 발명의 WP/FRM 및 내피 의존성 혈관 이완을 유도하는 물질로 알려져 있는 카르바콜을 인가하였다. 또한, 10 μM의 인도메타신으로 60분간 처리한 후 300 nM NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM을 인가하여 실험하였다.

상기 NO 매개 실험 결과는 도 3의 그래프에 도시하였다. 도 3A는 L-NNA로 전처리한 후 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우에 대한 그래프이고, 도 3B는 L-NNA로 전처리한 후 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우의 실험 결과와 L-NNA로 처리하지 않고 WP/FRM을 인가한 경우의 실험 결과의 비교 그래프이다. 도 3은 L-NNA로 처리한 후 NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우에는 혈관 이완이 전혀 발생되지 않았음을 보여준다. 카르바콜 처리 실험에서도 혈관은 전혀 이완되지 않았다 (결과 미도시). 이와 대조적으로, 인도메타신으로 처리한 후 NE로 처리하여 수축된 혈관 샘플에 본 발명의 WP/FRM을 인가한 경우에는 혈관이 강력하게 이완되었다 (결과 미도시). 따라서, 본 발명의 WP/FRM은 내피의 NO 생산에 의하여 매개되는 혈관 이완임을 알 수 있다. 이는 본원에서 최초로 개시된 사실이다.

<실시예 5> WP/FRM에 의해 유도된 이완에 대한 GABA 또는 Ach의 효과

본 실시예는 홍국균인 모나스커스 필로서스로 발효된 홍국의 수용성 분획에서 발견되는, 혈압강하 화합물로 알려진(Kohama et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 35:2484-2489, 1987) GABA와 아세틸콜린 (이하 'Ach'라 함) 중에서 어느 화합물이 혈관이완 활성을 갖는지를 조사하기 위한 것이다.

혈관 샘플에 무스카린 수용체 길항제인 1 μM의 아트로핀으로 전처리하고 300 nM의 NE로 처리한 후, 본 발명의 WP/FRM를 처리하였다 (도 4A). 또한, 별개의 혈관 샘플을 300 nM의 NE로 처리하고, GABA를 추가로 처리하였다 (도 4B).

상기 실험 결과를 도 4에 도시하였다. WP/FRM에 의해 유도된 이완은 1 μM 아트로핀 처리시와 비처리시에 크게 상이하지 않았다 (도 4A). 3 mg/ml의 WP/FRM에 의해 유도된 최대 이완은 아트로핀 존재시에 93.0 ±3.25% (도 2 참조), 부재시에 87.9 ±6.21%이었다. 그러나, WP/FRM에 의하여 유도되는 혈관 이완 후 다시 수축 상태로 복귀하는 속도는 아트로핀 부재시(도 1A)의 경우보다 아트로핀 존재시(도 4A)에 더 빠른 속도를 보였다. 이것은 본 발명의 WP/FRM에 의하여 유도되는 NO 매개된 내피 의존적 이완에 Ach가 부분적으로 관련이 있다는 것을 의미한다. 또한, 350 nM의 GABA가 인가된 경우에는 내피가 존재하는 대동맥의 NE에 의해 유도된 장력의 증가에 영향을 주지 않았다 (도 4B).

<실시예 6> WP/FRM에 의한 일산화질소 생성

본 실시예는 본 발명의 WP/FRM이 혈관 내피의 NO 생산을 직접적으로 자극하는 것인지를 조사하기 위한 것이다.

1. 세포 배양

사람의 제대 정맥에서 내피 세포를 효소에 의해 분리하였다. 이때 효소 혼합물은 0.2% 글루코즈-인산염 완충 염수 (PBS)에 0.2% 콜라겐 분해효소(collagenase) 타입 II를 포함하였다. 상기 사람의 제대 정맥을 0.2% 글루코즈-PBS로 세척한 다음 효소 혼합물 10 ㎖로 채웠다. 제대 세포는 37℃에서 5 내지 7분간 배양하였다. 그리고 콜라겐성 배출물을 모아 최종농도가 30%가 되도록 우태아 혈청 (FCS)을 첨가하여 불활성화시켰다. 이 정맥을 다시 50 ㎖의 0.2% 글루코즈-PBS로 세척하였다. 그리고 유리된 내피 세포를 포함하는 배출물을 수집하여 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다.

세포 펠렛을 배지 199(Medium 199), FCS 20%, 페니실린/스트렙토마이신(100 U/㎖ 및 100 ㎍/㎖), ECGS(endothelial cell growth supplement) 50 ㎍/㎖ 및 헤파린 15 U/㎖를 포함한 성장 배지에 분산시켰다. 그리고 세포를 T25 ㎠ 플라스크에 도포하고 5% 이산화탄소의 가습 대기 하에서 37℃에서 배양하였다. 세포를 합류점까지 성장시킨 후, 0.01% 트립신과 0.004% EDTA를 포함한 PBS에서 실온에서 1 내지 2분 배양하여 분리하고, 배지로 세척한 다음 원심분리하고 24조 플레이트에 재접종하였다. 실험에는 제1 계대접종과 제2 계대접종 사이의 세포가 사용되었다.

2. 일산화질소 방출의 측정

합류점까지 성장한 내피 세포를 pH 7.4이고 NaCl 99.0 mM, KCl 4.69 mM, CaCl₂1.87 mM, MgSO₄1.2 mM, NaHCO₃25 mM, K₂HPO₄1.03 mM, Hepes 20 mM, D-글루코즈 11.1 mM로 구성된 크렙스-헤페스 버퍼(Krebs-Hepes buffer)로 3회 세척하였다. 그리고 크렙스-헤페스 버퍼에 용해된 히스타민 또는 본 발명의 WP/FRM을 배양조에 첨가하고 세포를 37℃에서 10분간 배양하였다. 그리고 세포는 L-NNA로 10분간 전처리하였다. 배양 후 각 조에서 상등액을 모으고 세포를 제거하기 위하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. NO의 생산량은 제조자의 지시에 따라 NO 분석 키트를 사용하여 아질산염(NO₂ ^-)과 질산염(N0₃ ^-)을 결합시킴으로써 측정하였다.

간단히 설명하면, 샘플 50 ㎕를 25 ㎕ NADPH와 25 ㎕ 질산염 환원효소 (nitrate reductase)로 37℃에서 30분간 배양함으로써 효소에 의해 질산염을 먼저 아질산염으로 환원시켰다. 아질산염 농도를 정량하기 위하여, 분석될 환원된 샘플 100 ㎕를 HCl 용액을 포함하는 술퍼닐산 50 ㎕와 혼합하였다. 10분간 혼합한 후, 디아조 화합물을 만들기 위하여 50 ㎕의 N-(1-나프틸)에틸렌디아민 용액을 첨가하여 자주색 아조 염료를 만들었다. 발색된 아조 염료는 10분 후 540 ㎚에서 ELISA 판독기(enzyme-linked immunosorbent assay reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 WP/FRM이 혈관 내피의 NO 방출을 직접적으로 자극하는지를 조사하기 위해, WP/FRM으로 자극시킨 배양된 내피 세포에서 NO 생산량을 측정하였다. 측정 결과를 도 5에 도시하였다. 사람의 제대 정맥에서 일차 배양된 내피를 30 ㎍/㎖의 WP/FRM으로 자극하면 아질산염과 질산염의 함량이 약 2배까지 증가되었다. WP/FRM에 의해 유도된 아질산염과 질산염의 함량 증가는 10 μM의 L-NNA를 첨가하면 약화되었다 (도 5). 10 μM의 히스타민으로 처리한 내피로부터 아질산염과 질산염 생성을 시험한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다.

상기 결과로부터, 본 발명의 WP/FRM이 혈관 내피의 NO 생산에 직접적인 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 이러한 발견은 본 발명에서 처음으로 밝혀진 것이다.

본 발명을 상기 구체적인 실시예를 참고로 하여 설명하였다. 그러나, 본 발명의 기술 분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자라면 본원 명세서를 기초로 하여 본 발명의 상이한 많은 변형을 실시할 수 있으며, 이러한 모든 변형은 첨부되는 본 발명의 특허 청구 범위에 포함된다.

Claims

쌀을 홍국균(Monascus)으로 발효시킨 홍국, 그의 분말, 그의 추출물 및 이들의 조합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 활성 성분을 포함하는 일산화질소(NO) 생성제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 발효가 모나스커스 루버 (Monascus ruber) IFO32318을 사용하여 실시되는 것인 일산화질소 생성제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍국이

(a) 분쇄된 쌀을 50℃의 물에 3시간 동안 담그는 단계,

(b) 물을 빼내고 쌀을 압력솥에서 익힌 다음 냉각시키는 단계, 및

(c) 냉각된 쌀에 모나스커스 루버 IF032318을 접종하여 30℃에서 2일 동안 발효시킨 후, 호기성 조건 하에 25℃에서 6일 동안 계속 발효시키는 단계

를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 일산화질소 생성제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍국 분말이

(a) 분쇄된 쌀을 50℃의 물에 3시간 동안 담그는 단계,

(b) 물을 빼내고 쌀을 압력솥에서 익힌 다음 냉각시키는 단계,

(c) 냉각된 쌀에 모나스커스 루버 IF032318을 접종하여 30℃에서 2일 동안발효시킨 후, 호기성 조건 하에 25℃에서 6일 동안 계속 발효시키는 단계,

(d) 발효된 홍국을 90℃에서 20분간 가열하여 진균의 효소를 불활성화시키는 단계,

(e) 가열된 홍국을 수분 함량이 10% 미만이 되도록 50℃에서 건조시키는 단계 및

(f) 건조된 홍국을 믹서로 연마하는 단계

를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 일산화질소 생성제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍국 추출물이

(a) 홍국 분말을 80℃에서 4배 부피의 에탄올에 1시간씩 3회 침지시키는 단계,

(b) 단계 a)에서 수득한 추출물을 증발시켜 물에 현탁시키는 단계,

(c) 현탁액을 에틸아세테이트와 혼합하는 단계,

(d) 액상 물질을 에틸아세테이트로 먼저 세척한 다음 부탄올로 세척하는 단계,

(e) 상기 액상 물질을 증발시키는 단계 및

(f) 고형체를 염수에 용해시키는 단계

를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 일산화질소 생성제 조성물.
제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혈관 이완에 적용될 수있는 단위 투여 형태로 조제됨을 특징으로 하는 일산화질소 생성제 조성물.
제1항에 있어서, 활성 성분의 농도가 0.3 ㎎/㎖ 이상인 일산화질소 생성제 조성물.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관이완제 제조를 위한 일산화질소 생성제 조성물.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 고혈압 치료제, 임포텐스 치료제, 심근경색 치료제, 협심증 치료제 또는 기억력 장애 개선제 제조를 위한 일산화질소 생성제 조성물.