JP2004002284A

JP2004002284A - リウマチの症状改善用飲食品および医薬

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Publication number: JP2004002284A
Application number: JP2002342848A
Authority: JP
Inventors: Takashi Yonetani; 米谷　俊; Kyoko Sakai; 酒井　京子; Yoshio Kumazawa; 熊沢　義雄; Kiichiro Kawaguchi; 川口　基一郎
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Ezaki Glico Co Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2002-11-26
Publication date: 2004-01-08
Anticipated expiration: 2022-11-26
Also published as: JP4592249B2

Abstract

【課題】ヒトを含む哺乳動物のリウマチを予防し、かつ発症したリウマチ症状を、日常経口的に摂取でき、かつ、副作用がなく、迅速に改善治療できる飲食品および医薬を提供すること。
【解決手段】フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体を含有するリウマチの症状改善用飲食品および医薬。
【選択図】　　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリウマチの症状を予防ないし改善するための飲食品およびリウマチの予防ないし治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）は、全身の関節を中心とする慢性炎症性疾患で自己免疫現象が病態に深く関与している。臨床的症状は、慢性に経過する多発関節炎、全身倦怠感・微熱・筋肉痛、皮下結節が主なもので、寛解と憎悪を繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊と変形を来たし、やがて運動機能の障害を呈してくる。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも計り知れないほど大きな苦痛を生涯にわたって背負うことになる。
【０００３】
一方、我が国のＲＡ患者数は約６０〜１２０万人、人口の０．５〜１．０％を占め、男女比は１：４で女性に多く、年齢は２０〜６０才に発症することが多い。しかし、残念ながら現在の医学ではＲＡを完全に治癒させることも予防することもできない。したがって、現時点での治療目標はＲＡを早期に診断し、ＲＡ炎症を可及的速やかにかつ最大限に抑制して、非可逆的変化の出現を防止、ないしはその進展を阻止して、患者の身体的、精神的、社会的な生活の質（ＱＯＬ）の向上を図ることである。
【０００４】
ＲＡの原因は不明であるが、その発症のメカニズムについては、免疫機構の研究の進展にともない、徐々に明らかになりつつあり、それらの知見をもとに種々の治療法が開発されている。つまり、リンパ球やサイトカインなどの産生抑制や活性の中和、受容体への結合阻害などである。
【０００５】
サイトカインは、細胞から産生される分子量８０００〜１０００００の糖蛋白質で、細胞間の情報伝達を介して細胞間相互作用を調整する。したがって、生体の恒常性維持のためには非常に重要なものである。一方で、これらが過剰に産生されたり、産生のバランスが崩れると、免疫系にも影響がおよび、ＲＡなど慢性的な炎症を引き起こすことになる。とくに、炎症に強く関与する炎症性サイトカインと呼ばれるものには、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１）などが知られている。つまり、これらのサイトカインの発現を抑制することで炎症の改善が期待できるのである。
【０００６】
これらのサイトカインのなかでもＴＮＦ−αは、多くの炎症病態に関わっており、これが生体内に産生されると、引き続きＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８などが産生され、免疫系の亢進が起こる。また、ＲＡ滑膜からは大量のＴＮＦ−αが産生されていることも明らかになっている。さらに、ＴＮＦ−αトランスジェニックマウスは、ＲＡと酷似する関節炎を発症することもわかっている（たとえば、非特許文献１参照）。そこで、ＴＮＦ−αを抗体で中和する抗体療法が提唱され（たとえば、非特許文献２および３参照）、ｃＡ２（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ　Ｉｎｃ．）などが開発されている。
【０００７】
しかしながら、これらのマウスモノクロナール抗体は、人に対して異種タンパク質であるため、アレルギーの出現や抗マウス抗体の出現などが生じる可能性がある。このため、長期投与における有効性の検証、感染症やほかの免疫疾患への影響を含めた副作用の有無など解決すべき課題も非常に多い。
【０００８】
また、現在ＲＡに対する治療法としては、患部に対する直接投与が一般的であり、経口的な投与では、特に最近注目されているＴＮＦ−αの抗体やＩＬ−１受容体のアンタゴニストのようなタンパク質の場合、胃における低ｐＨ、消化酵素による加水分解などの影響があり、通常の薬剤においても治療薬の吸収が低いこと、薬物の希釈化などから、患部への直接投与に比べ、その治療効果はほとんど期待できないのが現状である。しかしながら、注射や点滴による治療は、経口投与に比べて患者に種々の負担を強いるものであるため、経口投与により効果を発揮することができる薬剤の開発が望まれている。
【０００９】
一方、フラボノイドは、広く植物に存在する２次代謝成分で、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６（それぞれＡ環、Ｃ環、Ｂ環）の骨格を有するポリフェノール化合物である。Ｂ環の結合位置、Ｃ環中の２重結合の有無、Ｃ環の開閉、各環に結合する水酸基の数や位置などにより、フラボン、フラボノール、イソフラボン、カテキン、カルコンなどに分類される。これらフラボノイドは植物からの抽出により容易に精製することができる。
【００１０】
フラボノイドは、柑橘類をはじめ、果物、野菜など植物全般に含まれており、通常の食事をすることにより体内に取りこまれている。また、欧州では２５．９〜２６．６ｍｇ／日のフラボノイドを摂取しているといった報告（たとえば、非特許文献４参照）や、米国では１１５ｍｇ／日のフラボノイドを摂取しているといった報告（たとえば、非特許文献５参照）もあり、これまでの食経験により安全であることは明らかであるので、飲食品または医薬品として安心して利用できる。
【００１１】
たとえば、ヘスペリジンは、温州みかんの主要なフラボノイドとして古くから知られている。ヘスペリジンはこれまで、温州みかんの缶詰や果汁製品の白濁物質として知られており、白濁防止のための研究が重ねられてきた（たとえば、非特許文献６、７および８参照）。
【００１２】
しかしながら、最近では、その生理活性に注目が集まり、健康志向の高まりとともに、機能素材としての用途が開発されている。これら生理作用には、古くから知られているビタミンＰ作用：毛細血管の強化（たとえば、非特許文献９参照）をはじめ、抗炎症作用（たとえば、非特許文献１０および１１参照）、コレステロールの低減作用（たとえば、非特許文献１２および１３参照）、中性脂質の低減作用（たとえば、非特許文献１４参照）、発ガンの抑制作用（非特許文献１５、１６、１７および１８参照）などがあるが、リウマチ症状の改善に関する知見は現在のところまったく知られていない。
【００１３】
【非特許文献１】
ケファー　ジェイ（Ｋｅｆｆｅｒ，　Ｊ．）ら著、“ＥＭＢＯ　Ｊ．”、１９９１年、第１０巻、ｐ．４０２５−４０３１
【非特許文献２】
エリオット　エム　ジェイ（Ｅｌｌｉｏｔ，　Ｍ．　Ｊ．）ら著、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」、１９９４年、第３４４巻、ｐ．１１０５‐１１４０
【非特許文献３】
マイニ　アール　エヌ（Ｍａｉｎｉ，　Ｒ．　Ｎ）著、“Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．”、１９９７年、第４０巻、Ｓ１２６
【非特許文献４】
ハートグ　エム　ジー　エル（Ｈｅｒｔｏｇ，　Ｍ．Ｇ．Ｌ．）著、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」、１９９３年、第３４２巻、ｐ．１００７−１０１１
【非特許文献５】
クーナウ　ジェイ（Ｋｕｈｎａｕ，　Ｊ．）著、“Ｗｏｒｌｄ　Ｒｅｖ．　Ｎｕｔｒ．　Ｄｉｅｔ”、１９７６年、第２４巻、ｐ．１１７−１９１
【非特許文献６】
紺野ら著、「日本食品工業学会誌」、１９８２年、第２９巻、ｐ．２２５−２５８
【非特許文献７】
三崎ら著、「日本食品工業学会誌」、１９８２年、第２９巻、ｐ．２２８−２３１
【非特許文献８】
三崎著、「澱粉科学」、１９８４年、第３１巻、ｐ．９８−１０６
【非特許文献９】
神谷著、「新ビタミン学（日本ビタミン学会）」、１９６９年
【非特許文献１０】
松田ら著、「薬学雑誌」、１９９１年、第１１１巻、ｐ．１９３−１９８
【非特許文献１１】
ダ　シルヴァ　エミム　ジェイ　エイ（Ｄａ　Ｓｉｌｖａ　Ｅｍｉｍ　Ｊ．　Ａ．）ら著、“Ｊ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．”、１９９４年、第４６巻、ｐ．１１８−１２２
【非特許文献１２】
モンフォルト　エム　ティー（Ｍｏｎｆｏｒｔｅ　Ｍ．　Ｔ．）ら著、“Ｉｌ　Ｆａｒｍａｃｏ”、１９９５年、第５０巻、ｐ．５９５−５９９
【非特許文献１３】
ボク　エス−エイチ（Ｂｏｋ　Ｓ−Ｈ．）ら著、“Ｊ．　Ｎｕｔｒ．”、１９９９年、第１２９巻、ｐ．１１８２−１１８５
【非特許文献１４】
カワグチ　ケイ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ　Ｋ．）ら著、“Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．”、１９９７年、第６１巻、ｐ．１０２−１０４
【非特許文献１５】
タナカ　ティー（Ｔａｎａｋａ　Ｔ．）ら著、「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９４年、第５４巻、ｐ．４６５３−４６５９
【非特許文献１６】
タナカ　ティー（Ｔａｎａｋａ　Ｔ．）ら著、「キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第５７巻、ｐ．２４６−２５２
【非特許文献１７】
タナカ　ティー（Ｔａｎａｋａ　Ｔ．）ら著、「発癌（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、１９９７年、第１８巻、ｐ．７６１−７６９
【非特許文献１８】
タナカ　ティー（Ｔａｎａｋａ　Ｔ．）ら著、「発癌（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、１９９７年、第１８巻、ｐ．９５７−９６５
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記課題を解決し、ヒトを含む哺乳動物のリウマチ症状を、日常経口的に摂取でき、かつ、副作用がなく、予防または迅速に改善することができる飲食品および医薬を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
前記状況に鑑み、鋭意研究を行なった結果、柑橘類に広く存在するフラボノイドおよび／またはこれらフラボノイド類にさらに糖を結合させた配糖体を生体に投与することにより、リウマチ症状を予防し、さらに罹患したのちにおいてもリウマチ症状が著しく改善することを見出し、それらを応用した飲食品および医薬を開発し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体を含有するリウマチの症状改善用飲食品に関する。
【００１７】
本発明はまた、フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体を含有するリウマチの予防ないし治療剤に関する。
【００１８】
本発明は、ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するリウマチの症状改善飲食品に関する。
【００１９】
また、本発明は、ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するリウマチの予防ないし治療のための経口製剤に関する。
【００２０】
本発明は、ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するＴＮＦ−αの発現を抑制するための飲食品に関する。
【００２１】
本発明はさらに、ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するＴＮＦ−αの発現を抑制するための経口製剤に関する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、この発明について詳細に述べる。
【００２３】
本発明のフラボノイドとしては、リウマチの症状に対して症状を緩和するまたは発症を予防する効果のあるものである限り、とくに限定されるものではない。具体的には、たとえばヘスペリジン、ナリンジン、ディオスミン、ルチンおよびこれらのアグリコンであるヘスペレチン、ナリンゲニン、ディオスメチン、クェルセチンなどが好ましく、単独または組み合わせて使用することができる。このなかでもヘスペリジンまたはナリンジンがさらに好ましい。
【００２４】
つぎにヘスペリジンとナリンジンとを用いて本発明を具体的に説明する。
【００２５】
ヘスペリジンは、水には難溶性であるが、アルカリには非常によく溶解するので、これを利用して温州みかんから効率的に抽出することができる（三宅ら、日本食品工業学会誌、３７，　６３１−６３６（１９９０）、稲葉ら、日本食品工業学会誌、４０，　８３３−８４０（１９９３））。具体的には、温州みかんを搾汁機で搾汁し、排出される搾汁粕に０．１〜１．０％の水酸化カルシウムを添加混合したのち、３０〜４０ｋｇ／ｃｍ^２で圧搾処理する。これにたとえばアスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）などの微生物由来のペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼなどの糖質加水分解酵素を添加し、２５〜５０℃で１０〜３６時間作用させる。この酵素液の遠心上清に１〜４倍の水を加え、水酸化カルシウムまたは水酸化ナトリウムを用いてｐＨ１１．０〜１２．５に調整し、約１時間撹拌したのち、遠心すると、上清としてヘスペリジン抽出液が得られる。これを濃塩酸でｐＨ４．５〜６．０に調整し、５０〜８０℃に加温して析出する結晶を遠心分離により収集し、粗ヘスペリジンを得ることができる。本発明においては、この粗ヘスペリジンをそのまま使用することもできるが、再結晶を行ない、より純度を高くして利用することもできる。
【００２６】
ヘスペリジンの粉末は、淡い黄色を呈しており、独特の風味を帯びているが、それは弱いものであり、ほかの食品素材や食品に添加することや種々の加工により問題なく摂食することができる。
【００２７】
また、ナリンジンはミカン科のグレープフルーツ、夏みかん、ダイダイ、ザボンの果実や果皮、とくに未熟果に多く含まれており、通常、グレープフルーツ、夏みかんおよびダイダイの果皮から抽出して製造することができる。ナリンジンの苦味の程度は非常に強く、キニーネよりも強い苦みがあり、水で５００００倍に希釈しても苦みを感じるが、柑橘類などを摂取したときに感じられるように食欲を刺激する良質な苦みを呈する。
【００２８】
また、ナリンジンの調製についてもグレープフルーツ、夏みかんなどを温州みかんの代わりに使用すれば、前記ヘスペリジンとほぼ同様の方法でナリンジンを得ることが可能である。
【００２９】
ナリンジンの粉末は、淡い黄色を呈しており、苦みを帯びているが、それは良質なもの（すっきりとしたさわやかな苦み）であり、ほかの食品素材や食品に添加することや種々の加工により問題なく摂取することができる。
【００３０】
本明細書において「フラボノイド配糖体」とは、前記フラボノイドを人工的に配糖化したものを意味し、前記フラボノイドにグルコース、キシロース、ソルボース、ガラクトースなどの糖を１〜２０個、好ましくは１〜６個つけたものをいう。２０個より多いと、アミロース的な性質が現れ、水溶液中では容易に老化し、沈澱を生じる傾向がある。本発明においてフラボノイドに結合させる糖質としては、澱粉の構成成分として日常的に摂取している点からグルコースが好ましい。さらに、本発明に用いるフラボノイド配糖体は、モノグルコサイドであっても、ジグルコサイドであってもよい。さらには、モノグルコサイドとオリゴグルコサイドの混合物でも同様の効果を発揮する。
【００３１】
このようなフラボノイド配糖体としては、ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、さらにはディオスミン、ルチンなどの配糖体、およびヘスペレチン、ナリンゲニン、ディオスメチン、クェルセチンなどの配糖体が好ましく、単独または組み合わせて使用できる。このなかでもヘスペリジン配糖体およびナリンジン配糖体がさらに好ましい。
【００３２】
配糖体生成のための糖転移反応は通常の条件で行なうことができる。たとえば、糖転移反応は糖転移酵素であれば、シクロデキストリン合成酵素、アミラーゼなどいずれのものでも利用することができる（Ｔ．　Ｋｏｍｅｔａｎｉ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５８，　５１７−５２０（１９９４）、Ｔ．　Ｋｏｍｅｔａｎｉ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｅｍ．，　５８，１９９０−１９９４（１９９４）、Ｔ．　Ｋｏｍｅｔａｎｉ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６０，　６４５−６４９（１９９６））。また、このとき、酵素の起源などは問わない。これに加えて、有機化学的な反応や植物組織細胞を用いた配糖化反応によって、ヘスペリジンやナリンジンを配糖化することも可能である（Ｅ．　Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２５，　２５３１−２５３５（１９８６））。
【００３３】
また、フラボノイド配糖体溶液にラット小腸由来の酵素を作用させると、容易にフラボノイドに分解されるため、フラボノイド配糖体は、フラボノイドと同様非常に安全性の高い物質であると考えられる。
【００３４】
フラボノイド配糖体、たとえばヘスペリジンにグルコースが１〜２０個程度ついた配糖体は、たとえば、特開平５−２５６１４１号公報において記載された以下のような条件で調製される。
【００３５】
糖供与体として可溶性澱粉を０．５〜１０重量％および受容体としてヘスペリジンを０．１〜５．０重量％含有するｐＨ８．０〜１０．５の基質溶液に、たとえばアルカロフィリック　バチルス　スピーシーズ（Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）Ａ２−５ａ（産業技術総合研究所特許生物寄託センター　受託番号ＦＥＲＭＰ−１３８６４）の生産するアルカリ耐性のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下「ＣＧＴａｓｅ」という）、すなわち１，４−α−Ｄ−グルカン；４−α−Ｄ−（１，４−グルカノ）−トランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．１９）を０．１〜１０ユニット／ｍｌとなるように加えて、２５〜５０℃で反応を開始させる。４〜４８時間反応させたのち、９０〜１００℃で１０〜３０分間の加熱などにより、反応を停止させる。酵素反応を行なった後は、凍結乾燥、噴霧乾燥などの操作により粉末化でき、反応液に添加したヘスペリジンの７０〜８０％が配糖化された粗ヘスペリジン配糖体が得られる。
【００３６】
この粗ヘスペリジン配糖体におけるヘスペリジン配糖体の純度は、添加する酵素量、糖供与体および受容体濃度などで変わってくるが、通常２〜５０％程度であり、未反応のヘスペリジンおよびデキストリンを含んでいる。このようにして生成されたヘスペリジン配糖体は、ヘスペリジン１分子にグルコースが１〜２０程度結合した混合物である。
【００３７】
前記酵素反応においては、ｐＨ９．５というアルカリ性領域で反応を行なっているが、この方法以外に、ヘスペリジンの溶解性を上げて生産性を高める方法として、（ａ）β−シクロデキストリン（以下β−ＣＤという）などを反応液中に添加し、β−ＣＤとヘスペリジンを包接させる方法、（ｂ）メチルセルロースなどの増粘多糖類を添加して、ヘスペリジンを可溶化させる方法などがある。またこれらの方法を組み合わせることにより、ヘスペリジンの溶解度を高めることもできる。
【００３８】
このようにして得られた混合物は、そのまま本発明のヘスペリジン配糖体として使用してもよく、また必要に応じて、疎水性樹脂などを用いたカラムクロマトグラフィーにより、精製を行なってもよい。
【００３９】
精製の方法としては、たとえば、前記酵素反応終了後の反応液を、アンバーライトＸＡＤ−１６樹脂などを用いたカラムクロマトグラフィーに通し充分水洗して未反応のデキストリンなど非吸着画分を除去したのち、５０％エタノールで溶出してくる画分を得る。これを濃縮し液体状とし、あるいは乾燥し粉末状とすることができる。得られた試料には、約２０％の未反応のヘスペリジンが含まれており、ヘスペリジン配糖体としての純度は約８０％である。
【００４０】
このようにして得たヘスペリジン配糖体は、元のヘスペリジンにグルコースが１〜２０個程度結合しており、さらにβ−アミラーゼなどで処理したのちにセファデックスＬＨ２０などのゲルろ過カラムを用いて分離し、ヘスペリジンにグルコースがそれぞれ１個、２個および３個結合したものを得ることができる。これらの純度は１００％である。
【００４１】
本発明で用いるヘスペリジン配糖体とヘスペリジンとの混合物において、ヘスペリジン配糖体の含有量は混合物全体に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上である。
【００４２】
試料の色調は粉末でわずかに黄色を帯びているが、ほとんど無味無臭である。またｐＨ３〜１３のあいだで安定である。加熱に対しては中性では１２０℃、１５分間安定である。
【００４３】
また、ヘスペリジン配糖体溶液にラット小腸由来の酵素を作用させると、容易にヘスペリジンに分解されるため、ヘスペリジン配糖体は、ヘスペリジンと同様非常に安全性の高い物質であると考えられる。
【００４４】
さらに、ラットに対する急性毒性試験においても死亡例は皆無であり、生化学血液検査および病理組織学的検査においても異常が認められていないため、本発明のヘスペリジン配糖体は無毒性のものである。また、ヘスペリジン配糖体のＬＤ_５０は２０００ｍｇ／ｋｇラットであり、変異原性も認められていない。
【００４５】
また、ナリンジン配糖体もヘスペリジン配糖体と同様にして生成され、その構造も同様にナリンジン１分子にグルコースが１〜２０個程度結合したものである。さらに、配糖体として期待される性質もヘスペリジン配糖体と同様であるため、本発明の目的で利用するに際してもヘスペリジン配糖体と同様に使用できる。
【００４６】
活性成分としてのフラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体の投与量は、使用するフラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体の種類、２種以上使用する場合はその組み合わせ、対象となる疾患の種類、程度により異なるが、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で用いるのが望ましい。投与量が１ｍｇ／ｋｇ／日より少ないと効果が現れにくくなる傾向があり、１０００ｍｇ／ｋｇ／日より多いと副作用などの心配はないが、粉体であれば、飲みにくくなり、液体であれば、濃度の高いものの摂取または多量摂取が必要となる傾向がある。濃度の高いものはそのフラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体独特の風味が表れてくる可能性があり、飲みにくくなる傾向がある。
【００４７】
フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体を飲食品に含有させる場合には、フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体の含有量は、好ましくは１〜１００重量％、さらに好ましくは１０〜８０重量％の溶液とすることが望ましい。含有量が１重量％より小さいと必要量摂取するためには、やや多めの量が必要となり、８０重量％より大きいとその独特の風味が表れてくる可能性がある。
【００４８】
また、本発明において、難溶性のフラボノイドを可溶化させるという点から、フラボノイドとフラボノイド配糖体を共存させることが好ましい。この場合、フラボノイド単独で使用する場合より、相加的あるいは相乗的な効果が得られ投与量を大幅に減じ生体にかかる負担を減らすことできる。
【００４９】
フラボノイド配糖体は、難溶性のフラボノイドを可溶化させるため、フラボノイド配糖体とフラボノイドの混合物を投与すると、吸収性が向上する。すなわち、フラボノイド単独投与に比べて、早く吸収され、かつ吸収効率も高い。たとえば、ヘスペリジンとヘスペリジン配糖体の混合物ではヘスペリジンの単独投与に比べ、１／１０量で同等、またはそれ以上の効果を発揮することが可能である。さらに、小腸で吸収されなかったフラボノイド配糖体とフラボノイドの混合物は、大腸に移行し、腸内細菌叢でアグリコンにまで分解されて吸収される。この時には、フラボノイド配糖体よりフラボノイドの方が有利である。したがって、これらの混合物を用いると、生体への吸収性が向上し、生理効果も向上すると考えられる。
【００５０】
フラボノイドおよびフラボノイド配糖体を組み合わせて使用する場合、フラボノイドおよびフラボノイド配糖体の総重量に対するフラボノイド配糖体の割合は、５重量％以上が好ましく、２０重量％以上がより好ましい。フラボノイド配糖体の割合が５重量％より小さいと難溶性のフラボノイドが析出する傾向にある。
【００５１】
また、活性成分としてのフラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体は、そのまま溶液、粉末顆粒、錠剤、乳剤、ゼリー状などの任意の形態で単独投与することもできるが、種々の飲食品に添加することができる。
【００５２】
さらに、フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体は、前述のように熱安定性やｐＨ安定性が高いので、広範囲のさまざまな飲食品に利用することができる。
【００５３】
本発明における飲食品とは、経口摂取できるものであればどのようなものでもよく、具体的には、和菓子、洋菓子、氷菓、飲料、スプレッド、ペースト、調味料、漬物、ビン缶詰、蓄肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、果実加工品、穀類加工品などがあげられる。このなかでも、ヘスペリジン配糖体との風味のなじみの面から野菜加工品、果実加工品、野菜や果実の風味を有する食品、さらにはヘスペリジン配糖体は、苦味や嫌味などを改善する効果が明らかにされているので、野菜飲料の青臭味、酸味または渋味を低減すること、生薬類含有飲食品の苦味、渋味または薬臭を低減すること、カカオ製品の酸味または渋味を低減すること、ハチミツ製品のエグ味またはいがらっぽい味を低減することを目的とし、果実、野菜、カカオ、ハチミツなど健康イメージを有するが、やや嫌味などがあり飲みにくい健康志向の飲食品に添加して、風味を改善することも可能である。
【００５４】
本発明における医薬の剤形は、前述のように溶液、粉末顆粒、錠剤、乳剤、ゼリー状などの任意の形態をとり得、活性成分としてのフラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体に加えて、薬学的に許容し得る担体そのほか添加剤を配合することができる。
【００５５】
本発明のリウマチの予防またはリウマチの症状改善に有効なフラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体の投与経路としては、経口投与、腹腔内投与などがあげられるが、最も高い効果を示すという理由から経口投与が最も好ましい。
【００５６】
【実施例】
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００５７】
製造例１　＜ヘスペリジン配糖体の製造＞
可溶性澱粉（メルク社製）５重量％、ヘスペリジン（シグマ社製）３重量％およびメチルセルロース（和光純薬工業株式会社製）０．１％を含有するｐＨ９．５のトリス塩酸緩衝液に、従来の方法によりバチルス属の菌体から精製したＣＧＴａｓｅ（方法特開平７−１０７９７２号明細書）を２ユニット／ｍｌとなるように加えて、４０℃で１６時間反応させた。ついで、１００℃で１０分間加熱し、酵素反応を停止させた。得られた反応混合液を、アンバーライトＸＡＤ−１６樹脂（ファルツ　バウア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、未反応のデキストリンおよびメチルセルロースを除去した。ついで噴霧乾燥を行ない、ヘスペリジン配糖体の粉末を得た。得られた粉末試料の純度はヘスペリジン配糖体として８０％であった。
【００５８】
試料の色調は粉末でわずかに黄色を帯びているが、ほとんど無味無臭であった。またｐＨ３〜１３のあいだで安定であった。加熱に対しては中性では１２０℃、１５分間安定であった。
【００５９】
このようにして生成されたヘスペリジン配糖体は、ヘスペリジン１分子にグルコースが１〜１０数個結合した混合物であった。
【００６０】
ここで得られたヘスペリジン配糖体混合物粉末試料を、以下の実施例におけるヘスペリジン配糖体として用いた。
【００６１】
製造例２　＜ナリンジン配糖体の製造＞
ヘスペリジン３重量％をナリンジン（シグマ社製）３重量％とした以外は製造例１と全く同様の方法で反応を行ない、ナリンジン配糖体の粉末を得た。
【００６２】
このようにして生成されたナリンジン配糖体は、ナリンジン１分子にグルコースが１〜１０数個結合した混合物であった。得られた粉末試料の純度は約８０％であった。
【００６３】
試料の色調は粉末でわずかに黄色を帯びている。ほとんど無臭であり、配糖化しても元のさわやかな苦味は保持されていた。またｐＨ３〜１１のあいだで安定であった。加熱に対しては中性では１２０℃、１５分間安定であった。
【００６４】
ここで得られたナリンジン配糖体混合物粉末試料を、以下の実施例におけるナリンジン配糖体として用いた。
【００６５】
実施例１〜１０
実験動物として９週齢の雄ＤＢＡ／１Ｊマウスを用いた。飼育条件は、湿度５０±１０％、室温２３±２℃、１２時間の明暗サイクルで、飲料水と基本食（商品名：ＣＥ−２、日本クレア社製）は自由に摂食させた。ＣＥ−２の組成は、炭水化物４５．５％、蛋白質２４．８％、脂肪４．６％、灰分７．２％、セルロース４．２％、ミネラル３．９％、ビタミン混合物１％、水分８．８％でありフラボノイドおよびフラボノイド配糖体はまったく含んでいない。
【００６６】
ＲＡのモデルとして一般的に使用されるコラーゲン誘発関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、以下、ＣＩＡという）は以下のように誘導した。ＩＩ型コラーゲン（シグマ社製、ｃｈｉｃｋｅｎ　ｓｔｅｒｎａｌｌ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ由来）８ｍｇを１０ｍＭ酢酸４ｍｌに溶解した。この溶液と完全フロイントアジュバントとを等量混合してＷ／Ｏエマルジョンを作製し、これを１週間予備飼育したマウスの尾基部に１００μｌ投与した（これを０日目として以下の日数を規定する）。同様の処置を２１日目に再び行なった。
【００６７】
このようにしてＣＩＡが誘導されたマウスに表１の組成で配合した組成物の経口投与を２１日目より開始し、３ｍｇ／マウス（体重２０ｇ）の用量で週３回行なった。投与は、たとえば実施例１および２では２週間にわたって計６回、実施例４では６週間にわたって計１８回行なった。陽性対照群には注射用蒸留水（大塚製薬株式会社製）のみを経口投与した。マウスに現れる関節炎の症状を監視し、週３回臨床スコアを測定した。症状に応じて臨床スコアを０＝正常、１＝発赤、２＝軽い腫れ、３＝中程度の腫れ、４＝重篤な腫れ、５＝関節の硬直／機能の消失、とした。４本の肢にそれぞれスコアを与え、その合計を臨床スコアとした。
【００６８】
【表１】

【００６９】
実施例１〜１０の各投与群において、臨床スコアはＣＩＡ陽性対照群に対して有意に抑制されていた。実施例１、２および４について結果を図１、２、および３に示す。ＣＩＡ陽性対照群は２３日目以降、臨床スコアが顕著に増加することを確認した。一方、ヘスペリジン、ナリンジンおよびヘスペリジン配糖体投与群では臨床スコアが陽性対照群に対して有意に減少した（図１〜３）。また、ＣＩＡ陽性対照群では、発症群が１００％であったのに対し、ヘスペリジン投与およびナリンジン投与では５０％であった（実施例１および２）。
【００７０】
実施例１１
実施例１と同様にしてＣＩＡ誘導マウスを作製した。
【００７１】
ＣＩＡが誘導されたマウス５匹にヘスペリジンの経口投与を、発症が認められる２８日目より開始し、３ｍｇ／マウス（体重２０ｇ）の用量で週３回、３週間にわたって計９回行なった。陽性対照群にはＣＩＡが誘導されたマウス６匹に生理食塩水のみを経口投与した。マウスに現れる関節炎の症状を監視し、週３回、実施例１と同様にして臨床スコアを測定した。結果を図４に示す。
【００７２】
投与群において、投与開始直後は、臨床スコアがＣＩＡ陽性対照群と同様であったが、３２日〜３５日付近から陽性対照群に対して減少傾向を示した（図４）。
【００７３】
実施例１２
ＣＩＡ誘導マウスは実施例１と同様にして作製した。
【００７４】
ＣＩＡが誘導されたマウス５匹にナリンジンの経口投与を、発症が認められた３１日目より開始し、３ｍｇ／マウス（体重２０ｇ）の用量で週３回、３週間にわたって計８回行なった。陽性対照群の５匹には注射用蒸留水のみを経口投与した。マウスに現れる関節炎の症状を監視し、週３回、実施例１と同様にして臨床スコアを測定した。結果を図５に示す。
【００７５】
投与群において、投与開始直後は、臨床スコアがＣＩＡ陽性対照群と同様であったが、３５日付近からＣＩＡ陽性対照群に対して減少傾向を示した（図５）。さらに、４０日以降では有意な差が認められた（図５）。
【００７６】
実施例１３
ＣＩＡ誘導マウスは実施例１と同様にして作製した。
【００７７】
２回目のＩＩ型コラーゲン投与（２１日目）と同時にヘスペリジンの経口投与を開始し、各投与量（０．３ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ／マウス（体重２０ｇ））で週３回、３週間にわたって計１１回行なった。マウスの数は、各投与量でそれぞれ５匹、５匹、９匹とした。陽性対照群の１８匹には注射用蒸留水のみを経口投与した。マウスに現れる関節炎の症状を監視し、週３回、実施例１と同様にして臨床スコアを測定した。投与群において、臨床スコアはＣＩＡ陽性対照群に対して用量依存的に減少した（図６）。
【００７８】
実施例１４
ＣＩＡ誘導マウスは実施例１と同様にして作製した。
【００７９】
ＣＩＡが誘導されたマウス（各群６匹）にヘスペリジン（３ｍｇ／体重２０ｇ）、またはヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体の等モル混合物（ヘスペリジン０．３ｍｇ相当モル／体重２０ｇ）の経口投与を、それぞれ発症が認められた２８日目より開始し、週３回、４週間にわたって計１２回行なった。陽性対照群の６匹には注射用蒸留水のみを経口投与した。マウスに現れる関節炎の症状を監視し、週３回、実施例１と同様にして臨床スコアを測定した。結果を図７に示す。
【００８０】
ヘスペリジン投与群、ならびにヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体の等モル混合物投与群では、ＣＩＡ陽性対照群と比較し臨床スコアの顕著な減少を示したが、さらに、ヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体の等モル混合物投与群では、１０倍量のヘスペリジン投与群と比較しても、より低い臨床スコアを示した（図７）。
【００８１】
実施例１５および１６
通常の搾汁、殺菌、充填工程を経て作製したオレンジジュース（果汁１００％）に０．１％ヘスペリジンまたは０．２％ヘスペリジン配糖体を添加したジュースを作製した。ヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体を添加してもともに、味、香りにほとんど影響のないオレンジジュースを作ることができた。
【００８２】
実施例１７および１８
凍結された濃縮オレンジジュースを還元した濃縮還元オレンジジュース（商品名：バレンシアオレンジ５倍濃縮果汁＃４０００Ｎ、輸入元；雄山商事株式会社）、これに０．２％ヘスペリジンまたは０．２％ヘスペリジン配糖体を添加してジュースを作製した。ヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体を添加してもともに、味、香りにほとんど影響のないオレンジジュースを作ることができた。
【００８３】
実施例１９および２０
グラニュー糖７０部、水飴３０部、水２０部、酸味料１部、香料および着色料を適量配合したキャンディを作製した。グラニュー糖は水に完全溶解しながら１１０℃まで加熱し、水飴を加えて１２５℃まで温度を上げた。さらに、１４５℃で煮詰めたのち、冷却板上に流し、酸味料、続いて香料および着色料、０．２部のヘスペリジンまたは０．２部のヘスペリジン配糖体を混合し、キャンディとして成形した。ヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体を添加しても味、香りにほとんど影響のないキャンディを作ることができた。
【００８４】
実施例２１および２２
全卵３００部、薄力粉２００部、砂糖２００部、食用油脂８０部、乳化油脂３０部、食塩０．６部、ベーキングパウダー４部、ヘスペリジン０．５部またはヘスペリジン配糖体０．５部を常法により混合し、その生地を生地比重０．５０に調整した。これを１８０℃で３０分焼成してスポンジケーキを作製した。ヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体を添加しても味、香りにほとんど影響のないケーキを作ることができた。
【００８５】
実施例２３および２４
サラダ油７５部、酢２５部、食塩１部、香辛料適量を１０００ｒｐｍでよく撹拌し、通常のフレンチドレッシングを得た。一方、この配合にヘスペリジン０．３部またはヘスペリジン配糖体０．３部を添加し、ヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体を添加したフレンチドレッシングを得た。
【００８６】
野菜サラダにかけて食したところ従来品と同等の食味、食感と物性が得られた。
【００８７】
実施例２５および２６
卵黄５個、卵４個、グラニュー糖１５０ｇ、牛乳７００ｇの配合で、常法にしたがい通常のプリンを作製した。前記配合にヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体を２ｇ添加したヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体添加プリンも作製した。
【００８８】
パネラー１５名について前記通常のプリンとヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体添加プリンの食味を調べた結果、ヘスペリジンまたはヘスペリジン配糖体を添加したプリンも通常のプリンと同等の食味が得られた。
【００８９】
試験例１　＜ヘスペリジン配糖体の消化性＞
ラットの小腸のアセトンパウダー（シグマ社製）１００ｍｇから、酵素を１ｍｌの蒸留水で抽出し、抽出液を５０００ｇで５分遠心し、上清を消化酵素液とした。ヘスペリジン配糖体はヘスペリジンモノグルコサイドとヘスペリジンジグルコサイドがほぼ１：１含まれる混合物を２０ｍｇ／ｍｌで蒸留水に溶解したものを用いた。酵素液５０μｌにヘスペリジン配糖体溶液５０μｌを加え、３７℃でインキュベートし、経時的にＨＰＬＣで分析した。その結果ヘスペリジンモノグルコサイドは１時間で、ヘスペリジンジグルコサイドは４時間で完全に分解され消失した。
【００９０】
このようにヘスペリジン配糖体溶液にラット小腸由来の酵素を作用させたところ、容易にヘスペリジンに分解されたため、ヘスペリジン配糖体は、ヘスペリジンと同様非常に安全性の高い物質であると考えられる。
【００９１】
試験例２
実施例１の処置を行なったヘスペリジン投与群のマウスと、ＣＩＡ陽性対照群のマウスをそれぞれ１回目のＩＩ型コラーゲン投与から３５日目に解剖した。心採血で得た血液を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を再度１００００ｒｐｍで１分間遠心分離して得た血漿を（１）抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価の測定に用いた。また、リンパ節を採取し、得られた細胞をＲＰＭＩ　１６４０培地に懸濁し、２×１０^６細胞個／ｍｌに調整し、２４穴プレートに１ｍｌ／穴で分注し、１０ｍＭに溶解したＩＩ型コラーゲン５０μｇ／ｍｌまたは結核菌（Ｈ３７Ｒａ）の脱脂死菌体から調製した精製ツベルクリン（ＰＰＤ）５０μｇ／ｍｌを添加し、７２時間刺激した。培養上清を回収し、これを被験試料として（２）ＴＮＦ−α濃度を測定した。さらに、関節組織は（３）病理学的解析および（４）ｍＲＮＡの解析に用いた。各実験操作は、以下の通りである。
【００９２】
（１）抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価の測定
ＩＩ型コラーゲンでコートしたＥＬＩＳＡプレートに段階希釈した被験試料を加え、１時間放置後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ　ｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を１時間反応させた。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を基質として発色させたのち、４５０ｎｍの吸光度を測定した。血漿中の抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価を比較したところ、ヘスペリジン投与群では、抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価はわずかに抑制されていたが、有意な差ではなかった。
【００９３】
（２）ＴＮＦ−α濃度の測定
９６穴プレートにＬ９２９（Ｃ５Ｆ６）細胞を分注し４時間培養し、アクチノマイシンＤ、および希釈した被験試料を加え、さらに１６時間培養した。組換えマウスＴＮＦ−αを標準試料として、５０％細胞傷害活性を示す被験試料の希釈倍率および標準試料の濃度から被験試料のＴＮＦ−αを算出した。ＴＮＦ−α産生はＣＩＡ陽性対照群に対してほとんど抑制されていなかった。
【００９４】
（３）関節組織の病理学的解析
後部膝関節を４％パラホルムアルデヒド緩衝液で固定後、ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で脱灰して薄切後、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色し顕微鏡観察した。結果を図８（ａ）および（ｂ）に示す。関節組織については、ＣＩＡ陽性対照群では滑膜組織の増殖２ａ、および多層化が著明であり、滑膜下組織にはリンパ球６、好中球、類上皮細胞８などの細胞浸潤が著しく、フィブリン７の析出も認められた（図８（ａ））。一方、ヘスペリジン投与群では、このような所見は抑制されていた（図８（ｂ））。
【００９５】
（４）ＴＮＦ−αｍＲＮＡの解析
関節組織細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成したのち、ＴＮＦ−α特異的プライマーを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル電気泳動を行ない確認した。結果を図９に示す。ヘスペリジン投与群の関節組織でのＴＮＦ−αｍＲＮＡの発現はＣＩＡ陽性対照群に対して抑制されていた。
【００９６】
以上（１）〜（４）の実験の結果から、ヘスペリジンを経口投与することにより、ＣＩＡを抑制できることが明らかとなった。ヘスペリジン投与群では、関節組織において細胞浸潤や滑膜炎症が抑制されていた。また、関節組織におけるＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現が抑制されていた。インビトロにおけるリンパ節細胞のＴＮＦ−α産生能および抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価においてはＣＩＡ陽性対照群とのあいだに差が見られなかった。これらのことから、ヘスペリジンの投与はＴ細胞には作用せず、炎症部位に浸潤したマクロファージに作用しＴＮＦ−α産生を抑制することで、ＣＩＡの発症を抑制したものと考えられる。
【００９７】
試験例３
実施例１１および１２の処置を行なったマウスと、ＣＩＡ陽性対照群のマウスをそれぞれ１回目のＩＩ型コラーゲン投与から４９日目に解剖した。心採血で得た血液を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を再度１００００ｒｐｍで１分間遠心分離して得た血漿を（１）抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価の測定に用いた。また、関節組織は（２）病理組織学的観察、（３）ＴＮＦ−α　ｍＲＮＡの解析および（４）ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）の測定に用いた。各実験操作は、以下の通りである。
【００９８】
（１）抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価の測定
試験例２の抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価の測定と同様に行なった。血漿中の抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価は、ヘスペリジンおよびナリンジン投与群では、陽性対照群と比較してわずかに抑制されていたが、有意な差ではなかった。
【００９９】
（２）関節組織の病理組織学的観察
＜試料の調製および染色＞
後部膝関節を４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定後、ＥＤＴＡ−ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）で脱灰して、厚さ３μｍの連続切片を作製した。染色は、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色、線維素染色のＰＴＡＨ（リンタングステン酸ヘマトキシリン）染色、膠原線維染色のＡＺＡＮ染色を行ない、顕微鏡観察した。また、ＴＮＦ−α産生細胞の局在を調べるために免疫組織化学解析をＡＢＣ（アビジン−ビオチン複合体）法を用いて行なった。対比染色としてメチルグリーン染色を行なった。
【０１００】
＜観察結果＞
ＣＩＡ発症の判定を各マウスの組織学的な所見により行なった。その結果は以下の組織学的基準に沿ってスコア０〜４とした。
（ａ）関節軟骨の障害：関節軟骨の破壊と膠原線維増生の頻度
（ｂ）滑膜増生：滑膜増生の範囲と程度
（ｃ）炎症細胞浸潤：炎症細胞出現の頻度とリンパ濾胞の形成
（ｄ）パンヌスの増生：パンヌス形成、脂肪組織消失の程度
【０１０１】
結果を図１０に示す。
【０１０２】
ＣＩＡ陽性対照群と比較して、ヘスペリジンおよびナリンジン投与群では滑膜ひだ部位に脂肪組織が残っているものが多く、関節組織の軟骨障害、滑膜増生、滑膜面炎症細胞浸潤、パンヌスの増生がいずれも抑制されていた。とくにヘスペリジン投与群では滑膜増生（Ｐ＜０．０５）、炎症細胞浸潤（Ｐ＜０．０５）およびパンヌスの増生（Ｐ＜０．００１）が有意に抑制されていた。同様に、ナリンジン投与群においては、軟骨障害、炎症細胞浸潤、パンヌスの増生（Ｐ＜０．０５）の抑制が有意であった（図１０）。
【０１０３】
ＡＢＣ法によるＴＮＦ−α産生細胞の染色では、ＣＩＡ陽性対照群では関節包のリンパ濾胞形成周辺部にＴＮＦ−α産生細胞が認められたが、同じ部分のヘスペリジン、ナリンジン投与群では炎症細胞浸潤とリンパ濾胞形成が認められず、ＴＮＦ−α産生細胞は確認できなかった。
【０１０４】
（３）ＴＮＦ−α　ｍＲＮＡの解析
試験例２のＴＮＦ−α　ｍＲＮＡの解析と同様に行なった。
【０１０５】
ヘスペリジン投与群およびナリンジン投与群の関節組織でのＴＮＦ−αｍＲＮＡの発現はＣＩＡ陽性対照群に対して抑制されていた。
【０１０６】
（４）ＣＯＸ−２測定
各投与群および陽性対照群のマウスの足関節（約２００ｍｇ）を砕いたのち、２０μｌヘパリン含有トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１ｍｌ冷緩衝液（０．１Ｍ　トリス・塩酸、ｐＨ７．８、１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２５０ｍＭ　マンニトール、０．３ｍＭ　ジエチルジチオカルバミン酸）を加えて、ポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。４℃、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心後の上清をマイクロコン　３０（アミコン社製）で濃縮し、ＣＯＸ−２のレベルをＣＯＸ−２活性アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて測定した。
【０１０７】
４９日目の組織においてＣＯＸ−２のレベルに有意な差は見られなかった。
【０１０８】
以上（１）〜（４）の実験の結果から、ＣＩＡが発症してから、ヘスペリジンまたはナリンジンを経口投与することにより、ＣＩＡを治療できることが明らかとなった。ヘスペリジン投与群では、関節組織において細胞浸潤や滑膜炎症が抑制されていた。また、関節組織におけるＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現が抑制されていた。インビトロにおける抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ価においてはＣＩＡ陽性対照群とのあいだに差が見られなかった。また、組織におけるＣＯＸ−２のレベルに有意な差は見られなかった。これらのことから、ヘスペリジンとナリンジンは、アスピリンなどの通常の抗炎症剤とは異なる機構で炎症を抑制していることが推察された。
【０１０９】
試験例４
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１３匹）を用い、背中に０．２２μｍフィルターで滅菌した空気を５ｍｌ注入した。この日からヘスペリジンを７匹のマウスに、毎日１回当たりの用量として３ｍｇ／マウスで７日間経口投与した。陽性対照群（６匹のマウス）には注射用蒸留水を経口投与した。ついで、空気を注入してから３日後に再び３ｍｌの滅菌空気を注入した。さらに３日後に１％（ｗ／ｖ）のＺｙｍｏｓａｎ　Ａ（和光純薬工業株式会社製）懸濁液／生理食塩水０．３ｍｌで刺激し、１２および２４時間後にＡｉｒ−ｐｏｕｃｈ内に浸潤してきた細胞の１部を３ｍＭ　ＥＤＴＡ含有ＰＲＭＩ１６４０培地を用いて回収し、細胞数はチュルク液で染色して血球計算板で測定し、細胞構成はスメアーをメイグリュンワルド　ギムザ染色液で染色して調べた。同様に、心採血により得た末梢血白血球の細胞構成をスメアーで調べた。
【０１１０】
Ｚｙｍｏｓａｎ刺激１２時間後の末梢血白血球の細胞構成は、単球がわずかに減少していたが、有意差はなかった（陽性対照群ｎ＝３：２２．３±４．２％、ヘスペリジン投与群ｎ＝３：１３．３±４．５％）。また、Ａｉｒ−ｐｏｕｃｈ内に浸潤してきた細胞は、陽性対照群（６．７２×１０^７）とヘスペリジン投与群（６．９８×１０^７）でほぼ同数であったが、マクロファージの割合がヘスペリジン投与群では陽性対照群に比べて有意に少なかった（陽性対照群ｎ＝３：３１．３±４．２％、ヘスペリジン投与群ｎ＝３：２０．０±２．６％；Ｐ＜０．０２）。
【０１１１】
なお、Ｚｙｍｏｓａｎ刺激２４時間後の陽性対照群（ｎ＝３）とヘスペリジン投与群（ｎ＝４）における末梢血白血球の細胞構成、Ａｉｒ−ｐｏｕｃｈ内への浸潤細胞数と細胞構成には有意な差は認められなかった。
【０１１２】
Ａｉｒ−ｐｏｕｃｈの実験の結果および、関節組織の病理学的解析から、ヘスペリジンあるいはナリンジンの投与により関節炎の炎症局所へのマクロファージの浸潤が抑制されると推察された。マクロファージの浸潤が特異的に抑制されたことから、ＭＣＰ−１などマクロファージに対して特異的に働くケモカインの産生が抑制されると推察された。
【０１１３】
【発明の効果】
図１〜３によりフラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体（たとえば、ヘスペリジン、ナリンジン、ヘスペリジン配糖体）の経口投与により、ＣＩＡの発症を予防、抑制することができることが示された。また、図４および５より、ＣＩＡの発症したのちにフラボノイドの投与を開始しても、その症状を改善し治療できることが示された。これにより、臨床におけるＲＡに対する新しい予防法および治療法の可能性が示唆された。つまり、フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体を経口投与することによって、有意にリウマチを予防することができ、さらに発症後のリウマチの症状を抑制・改善することができる。
【０１１４】
図６および７から、ヘスペリジンおよびヘスペリジン配糖体との混合物がヘスペリジンと比較して約１０分の１用量で充分に効果を発揮することが示された。
【０１１５】
また、フラボノイドおよびフラボノイド配糖体は安全であることから、ヒトを含む哺乳動物のリウマチを予防するため、またはリウマチの症状を改善するための、日常経口的に摂取でき、かつ、副作用がなく、迅速に改善治療できる飲食品および医薬となり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘスペリジン投与群の臨床スコアを示す図である。
【図２】ナリンジン投与群の臨床スコアを示す図である。
【図３】ヘスペリジン配糖体投与群の臨床スコアを示す図であり、―▲―はＩＩ型コラーゲン処理を行なっていない陰性対照を示す。
【図４】ＣＩＡ発症後にヘスペリジンを投与した場合の臨床スコアを示す図である。
【図５】ＣＩＡ発症後にナリンジンを投与した場合の臨床スコアを示す図である。
【図６】ヘスペリジンの投与量に対する臨床スコアを示す図である。
【図７】ヘスペリジン（３ｍｇ）投与およびヘスペリジンとヘスペリジン配糖体との等モル混合物（ヘスペリジン０．３ｍｇに相当するモル数）投与に対する臨床スコアを示す図である。
【図８】陽性対照群（ａ）およびヘスペリジン投与群（ｂ）の関節薄片のＨＥ染色顕微鏡写真であり、（ａ）におけるＹはＸ領域の拡大図である。
【図９】関節組織細胞におけるＴＮＦ−αｍＲＮＡの発現抑制を示す電気泳動写真である。
【図１０】ＣＩＡ発症後にヘスペリジンまたはナリンジンの投与を開始したマウスの、関節組織の病理組織学的観察結果を示す図である。
【符号の説明】
１　　滑膜表面
２　　滑膜組織
２ａ　増殖した滑膜組織
３　　滑液
４　　軟骨
５　　骨組織
６　　リンパ球の浸潤
７　　フィブリン
８　　好中球、類上皮細胞の浸潤
９　　関節包

Claims

フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体を含有するリウマチの症状改善用飲食品。
フラボノイドがヘスペリジンおよび／またはナリンジンである請求項１記載の飲食品。
フラボノイド配糖体がヘスペリジン配糖体および／またはナリンジン配糖体である請求項１記載の飲食品。
少なくとも１種のフラボノイドおよび少なくとも１種のフラボノイド配糖体を含有する請求項１記載の飲食品。
フラボノイドおよび／またはフラボノイド配糖体を含有するリウマチの予防ないし治療剤。
フラボノイドがヘスペリジンおよび／またはナリンジンである請求項５記載の予防ないし治療剤。
フラボノイド配糖体がヘスペリジン配糖体および／またはナリンジン配糖体である請求項５記載の予防ないし治療剤。
少なくとも１種のフラボノイドおよび少なくとも１種のフラボノイド配糖体を含有する請求項５記載の予防ないし治療剤。
ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するリウマチの症状改善用飲食品。
ヘスペリジン、ナリンジン、ディオスミンおよび／またはルチンを含有する請求項９記載の飲食品。
ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するリウマチの予防ないし治療のための経口製剤。
ヘスペリジン、ナリンジン、ディオスミンおよび／またはルチンを含有する請求項１１記載の経口製剤。
投与量が０．１〜３０ｇ／成人／日である請求項１１記載の経口製剤。
ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するＴＮＦ−αの発現を抑制するための飲食品。
ヘスペリジン、ナリンジン、ディオスミンおよび／またはルチンを含有する請求項１４記載の飲食品。
ヘスペリジン配糖体、ナリンジン配糖体、ディオスミン配糖体および／またはルチン配糖体を含有するＴＮＦ−αの発現を抑制するための経口製剤。
ヘスペリジン、ナリンジン、ディオスミンおよび／またはルチンを含有する請求項１６記載の経口製剤。
投与量が０．１〜３０ｇ／成人／日である請求項１６記載の経口製剤。