JP2003526376A - 相同組換えを改善する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、標的ＤＮＡ中、例えば細胞の染色体ＤＮＡ中の選択される部位での改変を促進する方法を特徴とする。該方法は、その部位で：（１）選択されるＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡ配列；（ｂ）相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タンパク質またはその機能する断片；および（ｃ）非相同端連結を阻害する剤、例えば抗Ｋｕ抗体またはＫｕ結合オリゴマーもしくはポリマーなどのＫｕを不活性化する剤を提供し、そして改変が起こるのを可能にすることを含む。非相同端連結を阻害する剤、例えば抗Ｋｕ抗体などのＫｕ不活性化剤は、好ましくは、局所で提供される。構成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、好ましくは共に投与してもよいし、または別個に投与してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 療法タンパク質を投与することによって疾患を治療する、現在のアプローチに
は、慣用的な薬剤搬送（例えば静脈内、皮下、または筋内注射）のための療法タ
ンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生が、そしてより最近は遺伝子治療が含まれる。

【０００２】 療法目的のタンパク質は、療法目的のタンパク質をコードする外因性ＤＮＡを
、適切な細胞に導入することによって、産生可能である。例えば、療法タンパク
質をコードする外因性ＤＮＡを含むベクターを細胞に導入し、そしてコードされ
るタンパク質を発現させることが可能である。ジーンターゲッティングによって
、内因性細胞遺伝子およびその発現が修飾可能であることもまた、示唆されてき
ている。例えば米国特許第５，２７２，０７１号、米国特許第５，６４１，６７
０号、ＷＯ ９１／０６６６６、ＷＯ ９１／０６６６７およびＷＯ ９０／１
１３５４を参照されたい。発明の概要 本発明は、部分的に、標的とされる部位で、ＤＮＡ配列に十分にごく近接して
、相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２、および非相同端連結を阻害する
剤、例えばＫｕ不活性化剤を提供することによって促進される、二本鎖ＤＮＡ配
列および選択される標的ＤＮＡ、例えば細胞中の染色体ＤＮＡ間の相同組換えの
使用に基づく。Ｒａｄ５２およびＫｕ不活性化剤両方の存在下では、非存在下よ
り、より高い率の相同組換えが起こると予測される。さらに、選択されるＤＮＡ
配列をテンプレートとして用いて、ＤＮＡ中の標的とされる部位、例えば細胞中
の染色体ＤＮＡ中の標的とされる部位を改変することを目的とするジーンターゲ
ッティングは、Ｒａｄ５２タンパク質およびＫｕ不活性化剤、例えば抗Ｋｕ抗体
を提供することによって、促進可能であると予測される。Ｒａｄ５２タンパク質
およびＫｕ不活性化剤を、選択されるＤＮＡ配列および標的部位にごく近接して
提供することによって、Ｒａｄ５２タンパク質およびＫｕ不活性化剤、例えば抗
Ｋｕ抗体の非存在下よりも、ジーンターゲッティングによる、より高い率の改変
が生じる。

【０００３】 したがって、１つの側面において、本発明は、標的ＤＮＡ、例えば細胞の染色
体ＤＮＡにおいて選択される部位の改変を促進する方法を特徴とする。該方法は
、その部位で：（ａ）選択されるＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡ配列；（ｂ）相
同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タンパク質または機能するその断片、
あるいはＲａｄ５２または機能するその断片をコードするＤＮＡ配列；および（
ｃ）非相同端連結を阻害する剤、例えばＫｕを不活性化する剤を提供し、そして
改変が起こるのを可能にすることを含む。好ましい態様において、部位の改変、
例えば選択されるＤＮＡ配列および標的ＤＮＡ間の相同組換えまたは遺伝子訂正
が、供給される相同組換え増進剤および非相同端連結阻害剤の非存在下で起こる
であろう率より高い率で起こるために、相同組換えを増進する剤の濃度および非
相同端連結を阻害する剤の濃度が、選択されるＤＮＡ配列および標的ＤＮＡ間の
相互作用部位で、十分であるように、構成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が
提供され、例えば細胞に導入される。非相同端連結を阻害する剤は、好ましくは
、局所に提供される。好ましくは、非相同端連結を阻害する剤は、抗Ｋｕ抗体な
どのＫｕ不活性化剤である。

【０００４】 構成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、好ましくは共に導入してもよいし
、または別個に導入してもよい。さらに、構成要素の２つを共に導入し、そして
第三の構成要素を別個に導入してもよい。例えば、ＤＮＡ配列および相同組換え
を増進する剤、例えばＲａｄ５２を共に導入してもよいし、またはＤＮＡ配列お
よび非相同端連結を阻害する剤、例えばＫｕ不活性化剤を共に導入してもよい。
別の好ましい態様において、相同組換えを増進する剤および非相同端連結を阻害
する剤を共に導入してもよい。

【０００５】 構成要素の２つ、または好ましくはすべてを、複合体として提供してもよい。
好ましい態様において、該方法は、標的ＤＮＡと：（ａ）選択されるＤＮＡ配列
を含む二本鎖ＤＮＡ配列；（ｂ）相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タ
ンパク質または機能するその断片；および（ｃ）非相同端連結を阻害する剤、例
えば抗Ｋｕ抗体またはＫｕ結合オリゴマーもしくはポリマーなどのＫｕ不活性化
剤を含む複合体とを、例えば該複合体を細胞内に導入することによって接触させ
ることを含む。

【０００６】 好ましい態様において、１つ、またはそれ以上、好ましくはすべての構成要素
は、局所搬送、例えばマイクロインジェクションによって提供され、そして標的
ゲノムまたは別の核酸から発現されない。特に好ましい態様において、非相同端
連結を阻害する剤、例えばＫｕ阻害剤は、局所搬送、例えばマイクロインジェク
ションによって提供され、そして標的ゲノムまたは別の核酸から発現されない。

【０００７】 好ましい態様において、非相同端連結を阻害する剤は：ｈＭｒｅ１１を不活性
化する剤、例えば抗ｈＭｒｅ１１抗体またはｈＭｒｅ１１結合オリゴマーもしく
はポリマー；ｈＲａｄ５０を不活性化する剤、例えば抗ｈＲａｄ５０抗体または
ｈＲａｄ５０結合オリゴマーもしくはポリマー；Ｎｂｓ１を不活性化する剤、例
えば抗Ｎｂｓ１抗体またはｈＮｂｓ１結合オリゴマーもしくはポリマー；ヒトリ
ガーゼ４（ｈＬｉｇ４）を不活性化する剤、例えば抗ｈＬｉｇ４抗体またはｈＬ
ｉｇ４結合オリゴマーもしくはポリマー；ｈＸｒｃｃ４を不活性化する剤、例え
ば抗ｈＸｒｃｃ４抗体またはｈＸｒｃｃ４結合オリゴマーもしくはポリマー；Ｒ
ａｐ１のヒト相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）を不活性化する剤、例えばＲａｐ１のヒ
ト相同体に対する抗体またはＲａｐ１のヒト相同体に結合するオリゴマーもしく
はポリマー；Ｓｉｒ２３０４のヒト相同体を不活性化する剤、例えばＳｉｒ２３
０４のヒト相同体に対する抗体またはＳｉｒ２３０４のヒト相同体に結合するオ
リゴマーもしくはポリマー；Ｋｕを不活性化する剤、例えば抗Ｋｕ抗体またはＫ
ｕ結合オリゴマーもしくはポリマーである。非相同端連結を阻害する剤のいずれ
も、単独で投与してもよいし、または非相同端連結を阻害する１以上の他の剤と
組み合わせて投与してもよい。

【０００８】 好ましい態様において、ＤＮＡ配列は直鎖ＤＮＡ配列である。好ましい態様に
おいて、直鎖ＤＮＡ配列は、１以上の一本鎖オーバーハング（類）を有すること
が可能である。

【０００９】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列には、ターゲッティング配列が
隣接する。ターゲッティング配列は、標的に相同であり、例えば標的ＤＮＡを改
変しようとする部位または選択されるＤＮＡ配列を組み込もうとする部位に隣接
するＤＮＡに相同である。こうした隣接配列は、選択されるＤＮＡ配列の１以上
の端、好ましくは両端に、存在することが可能である。２つの隣接配列が存在す
る場合、一方は標的の第一の領域に相同であるべきであり、そして他方は標的の
第二の領域に相同であるべきである。

【００１０】 好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、１以上の突出一本鎖端を有し、例えば
突出端の１つまたは両方が、３’端または５’端である。 好ましい態様において、相同組換えを増進する剤は：Ｒａｄ５２タンパク質ま
たは機能するその断片；Ｒａｄ５１タンパク質または機能するその断片；Ｒａｄ
５４タンパク質または機能するその断片；あるいはそれらの組み合わせである。

【００１１】 好ましい態様において、相同組換えを増進する剤は、ＤＮＡ配列に付着し、例
えばＤＮＡ配列上にコーティングされる。好ましい態様において、Ｒａｄ５２タ
ンパク質または機能するその断片は、ＤＮＡ配列に付着し、例えばＤＮＡ配列上
にコーティングされる。

【００１２】 好ましい態様において、Ｒａｄ５２タンパク質またはその断片はヒトＲａｄ５
２（ｈＲａｄ５２）である。 好ましい態様において、抗Ｋｕ抗体は：抗Ｋｕ７０抗体；抗Ｋｕ８０抗体であ
る。好ましい態様において、抗Ｋｕ抗体は：ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体断片、
例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）²またはＦ（ｖ）断片である。

【００１３】 好ましい態様において、少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体は：ＤＮＡ配列；Ｒａｄ
５２タンパク質またはその断片に共有結合している。別の好ましい態様において
、少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体は：ＤＮＡ配列；Ｒａｄ５２タンパク質またはそ
の断片に非共有結合している。

【００１４】 好ましい態様において、抗Ｋｕ７０抗体および抗Ｋｕ８０抗体は、例えば複合
体の構成要素として提供される。 好ましい態様において、細胞は：真核細胞である。好ましい態様において、細
胞は真菌、植物または動物起源、例えば脊椎動物起源のものである。好ましい態
様において、細胞は：哺乳動物細胞、例えば初代または二次哺乳動物細胞、例え
ば線維芽細胞、造血幹細胞、筋芽細胞、ケラチン形成細胞、上皮細胞、内皮細胞
、グリア細胞、神経細胞、血液の形成された要素を含む細胞、筋肉細胞およびこ
れらの体細胞の前駆体；形質転換または不死化細胞株である。好ましくは、細胞
はヒト細胞である。本方法に有用な不死化ヒト細胞株の例には、限定されるわけ
ではないが：Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ ９６０７）、Ｄ
ａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ２１３）、ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬ
ａ細胞派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２ ＣＣＬ２
．１、およびＣＣＬ ２．２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ２
４０）、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １２１）、Ｊｕｒｋａｔ
細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ １５２）、ＫＢ癌腫細胞（ＡＴＣＣ寄託番号Ｃ
ＣＬ １７）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ２４３）、Ｍ
ＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＢＴＨ ２２）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴ
ＣＣ寄託番号１５８２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ １４
３２）、Ｒａｆｊｉ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ８６）、ＲＰＭＩ ８２２
６細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ寄託番
号１５９３）、ＷＩ−２８ＶＡ１３下位株２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＬＬ
１５５）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １１９）および
２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ． ４８：５９２７−５９３２， １９８８）と共に、ヒト細胞および別の
種の細胞の融合によって産生されるヘテロハイブリドーマ細胞が含まれる。別の
態様において、不死化細胞株は、ヒト細胞株以外の細胞株、例えばＣＨＯ細胞株
、ＣＯＳ細胞株であってもよい。

【００１５】 好ましい態様において、構成要素、例えば複合体の構成要素は、マイクロイン
ジェクションによって、細胞に導入される。 １つの好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、１０、８、６、５、
４、３、２未満、または１ヌクレオチド、例えば置換、または欠失、または挿入
により、標的ＤＮＡと異なる。

【００１６】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、例えば標的配列は、約
１０、８、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド、野生型配列と異なる。
好ましくは、突然変異は点突然変異、例えば挿入、欠失または置換による突然変
異である。

【００１７】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は、疾
患または機能障害に関連し、例えば該疾患または機能障害を引き起こすか、それ
に貢献するか、それを左右するかまたは調節する。好ましくは、疾患または機能
障害は：嚢胞性線維症；鎌形赤血球貧血；血友病Ａ；血友病Ｂ；フォンウィルブ
ランド疾患３型；色素性乾皮症；地中海貧血症；レッシュ−ナイラン（Ｌｅｓｃ
ｈ−Ｎｙｌａｎ）症候群；プロテインＣ耐性；リソソーム貯蔵疾患、例えばゴシ
ェ病、ファブリー病；ムコ多糖症（ＭＰＳ）１型（ハーレー−シャイエ（Ｈｕｒ
ｌｅｙ−Ｓｃｈｅｉｅ）症候群）、ＭＰＳ ＩＩ型（ハンター症候群）、ＭＰＳ
ＩＩＩＡ型（サンフィリオ（Ｓａｎｆｉｌｉｏ）Ａ症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩ
Ｂ型（サンフィリオＢ症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩＣ型（サンフィリオＣ症候群）
、ＭＰＳ ＩＩＩＤ型（サンフィリオＤ症候群）、ＭＰＳ ＩＶＡ型（モルキオ
Ａ症候群）、ＭＰＳ ＩＶＢ型（モルキオＢ症候群）、ＭＰＳ ＶＩ型（マロト
ー−ラリー（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｒｒｙ）症候群）、ＭＰＳ ＶＩＩ型（
スライ症候群）である。

【００１８】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして選択されるＤＮ
Ａ配列は突然変異を訂正することが可能な正常野生型配列を含む。 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は嚢胞
性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は
、ＣＦＴＲタンパク質コード領域のコドン５０８のアミノ酸を改変するものであ
り、例えば突然変異は、ＣＦＴＲタンパク質のコドン５０８のフェニルアラニン
を除去する、３塩基対インフレーム欠失である。ＣＦＴＲタンパク質におけるフ
ェニルアラニン−５０８のこの欠失は、嚢胞性線維症を有する被験者に高い割合
で見られる。したがって、好ましい態様において、野生型ＣＦＴＲ遺伝子に見ら
れるようなフェニルアラニン−５０８をコードする配列を含む、選択されるＤＮ
Ａ配列を用いて、突然変異ＣＦＴＲ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可
能である。

【００１９】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異はヒト
β−グロビン遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、β−グロビン遺伝子の
六番目のコドンのアミノ酸を改変するものであり、例えば突然変異は、β−グロ
ビン遺伝子の六番目のコドンにおけるＡからＴの置換である。この突然変異は、
β−グロビンタンパク質において、鎌形赤血球貧血を有する被験者に見られる、
グルタミン酸からバリンへの変化を導く。したがって、好ましい態様において、
コドン６で野生型アミノ酸残基をコードする、選択されるＤＮＡ、例えば野生型
β−グロビン遺伝子の六番目のコドン内で見られるように、Ａを含む、選択され
るＤＮＡ配列を用いて、突然変異β−グロビン遺伝子を標的とし、そして訂正す
ることが可能である。

【００２０】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は因子
ＶＩＩＩ遺伝子中にある。例えば、突然変異は、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン
２３、２４、および／またはエクソン２５にある可能性がある。好ましくは、突
然変異は、因子ＶＩＩＩタンパク質コード領域のコード領域のコドン２２０９で
アミノ酸を改変するものであり、例えば突然変異は、因子ＶＩＩＩのアミノ酸２
２０９でアルギニンからグルタミンへの変化を導く、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエク
ソン２４におけるＧからＡの置換である。好ましくは、突然変異は、因子ＶＩＩ
Ｉタンパク質コード領域のコード領域のコドン２２２９でアミノ酸を改変するも
のであり、例えば突然変異は、因子ＶＩＩＩのアミノ酸２２２９でトリプトファ
ンからシステインへの変化を導く、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン２５における
ＧからＴの置換である。これらの突然変異は、中程度から重度の血友病Ａと関連
付けられてきている。したがって、好ましい態様において、因子ＶＩＩＩ遺伝子
のコード領域のコドン２２０９で野生型アミノ酸をコードするＤＮＡ、または因
子ＶＩＩＩ遺伝子のコード領域のコドン２２２９で野生型アミノ酸をコードする
ＤＮＡいずれか、あるいは両方を含む、選択されるＤＮＡの配列を用いて、突然
変異因子ＶＩＩＩ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可能である。

【００２１】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は因子
ＩＸ遺伝子中にある。例えば、血友病Ｂを有する被験者において、突然変異の大
部分は、因子ＩＸ遺伝子における点突然変異である。したがって、好ましい態様
において、選択されるＤＮＡ配列は、血友病Ｂに関連する因子ＩＸ遺伝子中の１
以上の点突然変異を標的とし、そして訂正するため、野生型因子ＩＸ遺伝子由来
の少なくとも１つのヌクレオチドを有する１以上のヌクレオチドを含むことが可
能である。

【００２２】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異はフォ
ンウィルブランド因子遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、フォンウィル
ブランド遺伝子のエクソン１８における位２６７９−２６８４の６シトシン伸長
中の単一シトシン欠失である。この突然変異は、フォンウィルブランド疾患３型
を有する被験者に、かなりの割合で見られる。フォンウィルブランド疾患３型に
関連する他の突然変異、例えば点突然変異もまた、本明細書に記載されるように
、改変可能である。したがって、好ましい態様において、野生型フォンウィルブ
ランド遺伝子に見られる配列、例えばフォンウィルブランド遺伝子の位２６７９
−２６８４の６つのシトシンを含む、選択されるＤＮＡ配列を用いて、突然変異
フォンウィルブランド遺伝子を標的とし、そして訂正することが可能である。

【００２３】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は色素
性乾皮症グループＧ（ＸＰ−Ｇ）遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、Ｘ
Ｐ−Ｇ遺伝子に見られる２４５塩基対エクソンの位１９−２１の３アデニン伸長
中の単一アデニン欠失である。この欠失は、色素性乾皮症を導く。したがって、
好ましい態様において、ＸＰ−Ｇ遺伝子の野生型配列、例えば２４５塩基対エク
ソンの位１９−２１の３つのアデニンを含む、選択されるＤＮＡを用いて、突然
変異ＸＰ−Ｇ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可能である。

【００２４】 好ましくは、Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ６、Ｍｓｈ３、Ｍ１ｈ１、Ｐｍｓ２、Ｍ１ｈ３
、Ｐｍｓ１などのミスマッチ修復タンパク質を不活性化する剤もまた、提供され
る。剤は、複合体中に含まれていてもよい。

【００２５】 別の好ましい態様において、改変は、選択されるＤＮＡ配列および標的ＤＮＡ
、例えば染色体間の相同組換えを含む。 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、１より多いヌクレオチドで
標的ＤＮＡと異なり、例えば標的、または選択されるＤＮＡ配列が、非対領域、
例えばループアウト領域を有するように、十分な数のヌクレオチドで、標的と異
なる。こうした適用において、Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ６、Ｍｓｈ３、Ｍ１ｈ１、Ｐｍ
ｓ２、Ｍ１ｈ３、Ｐｍｓ１もまた、例えば複合体の一部として提供してもよい。

【００２６】 好ましい態様において、改変は、標的ＤＮＡへの選択される配列の組込みを含
み、そして選択されるＤＮＡは、標的上のあらかじめ選択される要素と、あらか
じめ選択される関係にあるように組み込まれ、例えば一方が制御要素であり、そ
して他方がタンパク質をコードする配列である場合、制御要素が、タンパク質コ
ード配列の発現を制御するよう機能する。選択される組込みを促進する隣接配列
を用いてもよい。選択されるＤＮＡ配列は、選択される標的配列、例えば遺伝子
またはコード配列の５’、３’、または該配列内に組み込むことが可能である。

【００２７】 好ましい態様において、改変は、選択されるＤＮＡ配列の組込みを含み、そし
て選択されるＤＮＡ配列は制御配列、例えば外因性制御配列である。好ましい態
様において、制御配列は、１以上の：プロモーター、エンハンサー、上流活性化
配列（ＵＡＳ）、足場付着領域または転写因子結合部位を含む。好ましい態様に
おいて、制御配列は：メタロチオネイン−Ｉ遺伝子、例えばマウスメタロチオネ
イン−Ｉ遺伝子由来の制御配列、ＳＶ−４０遺伝子由来の制御配列、サイトメガ
ロウイルス遺伝子由来の制御配列、コラーゲン遺伝子由来の制御配列、アクチン
遺伝子由来の制御配列、免疫グロブリン遺伝子由来の制御配列、ＨＭＧ−ＣｏＡ
レダクターゼ遺伝子由来の制御配列、γアクチン遺伝子由来の制御配列、転写活
性化因子ＹＹ１遺伝子由来の制御配列、フィブロネクチン遺伝子由来の制御配列
、またはＥＦ−１α遺伝子由来の制御配列を含む。

【００２８】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列はエクソンを含む。好ましくは
、外因性エクソンは：ＣＡＰ部位、ヌクレオチド配列ＡＴＧ、および／または標
的とされる内因性遺伝子とインフレームのコードＤＮＡを含む。

【００２９】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列はスプライス−ドナー部位を含
む。 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、標的に組み込まれた際、内
因性コード配列を制御するよう作用する、外因性制御配列を含む。選択されるＤ
ＮＡ配列は、標的における内因性遺伝子のコード領域の上流、または標的におけ
る内因性遺伝子の内因性制御配列の上流に組み込むことが可能である。別の好ま
しい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、内因性遺伝子またはコード領域の
下流、あるいはイントロンまたは内因性遺伝子内に組み込むことが可能である。
別の好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、内因性遺伝子の内因性制
御配列が不活性である、例えば完全にまたは部分的に欠失されるように、組み込
むことが可能である。

【００３０】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は内因性遺伝子の上流であり、
そして内因性遺伝子の第二のエクソンに連結される。 好ましい態様において、内因性遺伝子は：ホルモン、サイトカイン、抗原、抗
体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、制御タンパク質、構造タンパク
質または転写因子をコードする。好ましい態様において、内因性遺伝子は、以下
のタンパク質：エリスロポエチン、カルシトニン、成長ホルモン、インスリン、
インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、α２−インタ
ーフェロン（ＩＦＮＡ２）、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、神
経増殖因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、グルカゴン、骨増殖因子
−２、骨増殖因子−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン１、インターロイキン２
、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１１、インター
ロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球（ＧＣＳＦ）、ＣＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ
−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性抗体類、プロテインキナ
ーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラス
ミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、アンチトロンビンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、
α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固
因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液
凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビ
ン類、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト
類、α−１−アンチトリプシン、免疫反応修飾剤類、β−グルコセラミダーゼ、
α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコサミン−Ｎ−スルファタ
ーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル補酵素Ａ：α−グルコサ
ミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スル
ファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン−６−スルファターゼ、および可溶性ＣＤ４のいずれかをコードする
。

【００３１】 好ましい態様において、内因性遺伝子は卵胞刺激ホルモンβ（ＦＳＨβ）をコ
ードし、そして選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＦＳＨβ遺伝子の制
御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮＡ配列には
、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング配列は、選
択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ましい態様に
おいて、ターゲッティング配列は、ＦＳＨβコード領域（配列番号１）の５’の
領域に相同である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＦＳＨβ
コード配列内で、またはＦＳＨβコード配列上流で、相同組換えを指示する。好
ましい態様において、ターゲッティング配列は、ヒトＦＳＨβ配列のヌクレオチ
ド−７４５４から−１４１７（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配
列番号２由来、またはヒトＦＳＨβ配列のヌクレオチド−６９６から−１５５に
対応する配列番号３由来の少なくとも２０、３０、５０、１００または１０００
の連続するヌクレオチドを含む。

【００３２】 好ましい態様において、内因性遺伝子はインターフェロンα２（ＩＦＮα２）
をコードし、そして選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＩＦＮα２遺伝
子の制御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮＡ配
列には、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング配列
は、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ましい
態様において、ターゲッティング配列は、ＩＦＮα２コード領域の５’の領域に
相同である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＩＦＮα２コー
ド配列上流の領域内で、相同組換えを指示する。好ましい態様において、ターゲ
ッティング配列は、ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−４０７４から−５１１
（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号４由来の少なくとも２
０、３０、５０、１００または１０００の連続するヌクレオチドを含む。例えば
、該配列は：ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−４０７４から−３７９６に対
応する配列番号７由来の少なくとも２０、３０、５０、または１００ヌクレオチ
ド；ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−５８２から−５１０に対応する配列番
号８由来の少なくとも２０、３０、または５０ヌクレオチド；ヒトＩＦＮα２配
列のヌクレオチド−３７９５から−５８３に対応する配列番号９由来の少なくと
も２０、３０、５０、１００、または１０００ヌクレオチドを含んでもよい。

【００３３】 好ましい態様において、内因性遺伝子は顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）
をコードし、そして選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＧＣＳＦ遺伝子
の制御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮＡ配列
には、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング配列は
、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ましい態
様において、ターゲッティング配列は、ＧＣＳＦコード領域の５’の領域に相同
である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＧＣＳＦコード配列
内で、またはＧＣＳＦコード配列上流で、相同組換えを指示する。好ましい態様
において、ターゲッティング配列は、ヒトＧＣＳＦ配列のヌクレオチド−６，５
７８から１０１（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号５由来
の少なくとも２０、３０、５０、１００または１０００の連続するヌクレオチド
を含む。例えば、標的配列は、ヒトＧＣＳＦ遺伝子のヌクレオチド−６，５７８
から−３６４に対応する配列番号６由来の２０、３０、５０、１００または１０
００ヌクレオチドを含んでもよい。

【００３４】 別の好ましい態様において、ＤＮＡ配列はコード領域を含み、例えば選択され
るＤＮＡ配列はタンパク質をコードする。好ましい態様において、コード領域は
：ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受
容体、制御タンパク質、構造タンパク質または転写因子をコードする。好ましい
態様において、コード領域は、以下のタンパク質：エリスロポエチン、カルシト
ニン、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子
、副甲状腺ホルモン、α２−インターフェロン（ＩＦＮＡ２）、β−インターフ
ェロン、γ−インターフェロン、神経増殖因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍
壊死因子、グルカゴン、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、ＴＳＨ−β、インタ
ーロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン６
、インターロイキン１１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球（ＧＣＳＦ）
、ＣＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン
類、触媒性抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパー
オキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、アン
チトロンビンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシ
ラーゼ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝
固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−
２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト類、α−１−アンチトリプシン、免疫反応修
飾剤類、β−グルコセラミダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダー
ゼ、グルコサミン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
、アセチル補酵素Ａ：α−グルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ
−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、および可
溶性ＣＤ４のいずれかをコードする。

【００３５】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列が内因性制御要素の調節下にあ
るように、該配列を標的内に組み込むことが可能である。選択されるＤＮＡは、
内因性制御配列の下流または内因性遺伝子のコード領域の上流および遺伝子の内
因性制御配列の下流に組み込むことが可能である。別の好ましい態様において、
選択されるＤＮＡは、内因性遺伝子のコード領域が不活性化される、例えば完全
にまたは部分的に欠失されるように、内因性制御配列の下流に組み込むことが可
能である。

【００３６】 好ましい態様において、該方法は、ミスマッチ修復タンパク質、例えばＭｓｈ
２、Ｍｓｈ６、Ｍｓｈ３、Ｍ１ｈ１、Ｐｍｓ２、Ｍ１ｈ３、Ｐｍｓ１、または他
のミスマッチ修復タンパク質、あるいはそれらの組み合わせを阻害する剤を導入
することをさらに含む。好ましくは、剤は、ミスマッチ修復タンパク質の発現を
阻害する剤であり、例えば剤はアンチセンスＲＮＡである。好ましい態様におい
て、剤はミスマッチ修復タンパク質に対する抗体である。好ましい態様において
、ミスマッチ修復タンパク質に対する抗体は、複合体に共有または非共有結合し
ている。

【００３７】 別の側面において、本発明は、選択されるＤＮＡ配列、例えば本明細書記載の
選択されるＤＮＡ配列をテンプレートとして用いて、標的ＤＮＡ、例えば染色体
、例えば本明細書記載の標的ＤＮＡでの改変を促進するための組成物、例えば構
成要素の複合体を特徴とする。組成物は：（ａ）選択されるＤＮＡ配列を含む二
本鎖ＤＮＡ配列；（ｂ）相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タンパク質
または機能するその断片；および（ｃ）非相同端連結を阻害する剤、例えばＫｕ
を不活性化する剤を含む。該組成物を用いて、例えば組込みによって標的ＤＮＡ
配列を改変可能である。

【００３８】 好ましい態様において、非相同端連結を阻害する剤は：ｈＭｒｅ１１を不活性
化する剤、例えば抗ｈＭｒｅ１１抗体またはｈＭｒｅ１１結合オリゴマーもしく
はポリマー；ｈＲａｄ５０を不活性化する剤、例えば抗ｈＲａｄ５０抗体または
ｈＲａｄ５０結合オリゴマーもしくはポリマー；Ｎｂｓ１を不活性化する剤、例
えば抗Ｎｂｓ１抗体またはｈＮｂｓ１結合オリゴマーもしくはポリマー；ヒトリ
ガーゼ４（ｈＬｉｇ４）を不活性化する剤、例えば抗ｈＬｉｇ４抗体またはｈＬ
ｉｇ４結合オリゴマーもしくはポリマー；ｈＸｒｃｃ４を不活性化する剤、例え
ば抗ｈＸｒｃｃ４抗体またはｈＸｒｃｃ４結合オリゴマーもしくはポリマー；Ｒ
ａｐ１のヒト相同体を不活性化する剤、例えばＲａｐ１のヒト相同体に対する抗
体またはＲａｐ１のヒト相同体に結合するオリゴマーもしくはポリマー；Ｓｉｒ
２３０４のヒト相同体を不活性化する剤、例えばＳｉｒ２３０４のヒト相同体に
対する抗体またはＳｉｒ２３０４のヒト相同体に結合するオリゴマーもしくはポ
リマー；Ｋｕを不活性化する剤、例えば抗Ｋｕ抗体またはＫｕ結合オリゴマーも
しくはポリマーである。非相同端連結を阻害する剤のいずれも、単独で投与して
もよいし、または非相同端連結を阻害する１以上の他の剤と組み合わせて投与し
てもよい。

【００３９】 好ましい態様において、ＤＮＡ配列は直鎖ＤＮＡ配列である。好ましい態様に
おいて、直鎖ＤＮＡ配列は、１以上の一本鎖オーバーハング（類）を有すること
が可能である。

【００４０】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列にはターゲッティング配列が隣
接する。ターゲッティング配列は、標的に相同であり、例えば標的ＤＮＡを改変
しようとする部位または選択されるＤＮＡ配列を挿入しようとする部位に隣接す
るＤＮＡに相同である。こうした隣接配列は、選択されるＤＮＡ配列の１以上の
端、好ましくは両端に、存在することが可能である。２つの隣接配列が存在する
場合、一方は標的の第一の領域に相同であるべきであり、そして他方は標的の第
二の領域に相同であるべきである。

【００４１】 好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、１以上の突出一本鎖端を有し、例えば
突出端の１つまたは両方が、３’端または５’端である。 好ましい態様において、相同組換えを増進する剤は：Ｒａｄ５２タンパク質ま
たは機能するその断片；Ｒａｄ５１タンパク質または機能するその断片；Ｒａｄ
５４タンパク質または機能するその断片；あるいはそれらの組み合わせである。

【００４２】 好ましい態様において、相同組換えを増進する剤は、ＤＮＡ配列に付着し、例
えばＤＮＡ配列上にコーティングされる。好ましい態様において、Ｒａｄ５２タ
ンパク質または機能するその断片は、選択されるＤＮＡ配列に付着し、例えば選
択されるＤＮＡ配列上にコーティングされる。

【００４３】 好ましい態様において、Ｒａｄ５２タンパク質またはその断片はヒトＲａｄ５
２（ｈＲａｄ５２）である。 好ましい態様において、抗Ｋｕ抗体は：抗Ｋｕ７０抗体；抗Ｋｕ８０抗体であ
る。好ましい態様において、抗Ｋｕ抗体は：ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体断片、
例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）²またはＦ（ｖ）断片である。

【００４４】 好ましい態様において、少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体は：選択されるＤＮＡ配
列；Ｒａｄ５２タンパク質またはその断片に共有結合している。別の好ましい態
様において、少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体は：選択されるＤＮＡ配列；Ｒａｄ５
２タンパク質またはその断片に非共有結合している。

【００４５】 好ましい態様において、組成物は、抗Ｋｕ７０抗体および抗Ｋｕ８０抗体を含
む。 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、１０、８、６、５、４、３
、２未満、または１ヌクレオチド、例えば置換、または欠失、または挿入により
、標的ＤＮＡと異なる。

【００４６】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、例えば標的配列は、約
１０、８、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド、野生型配列と異なる。
好ましくは、突然変異は点突然変異、例えば挿入、欠失または置換による突然変
異である。

【００４７】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は、疾
患または機能障害に関連し、例えば該疾患または機能障害を引き起こすか、それ
に貢献するか、それを左右するかまたは調節する。好ましくは、疾患または機能
障害は：嚢胞性線維症；鎌形赤血球貧血；血友病Ａ；血友病Ｂ；フォンウィルブ
ランド疾患３型；色素性乾皮症；地中海貧血症；レッシュ−ナイラン症候群；プ
ロテインＣ耐性；リソソーム貯蔵疾患、例えばゴシェ病、ファブリー病；ムコ多
糖症（ＭＰＳ）１型（ハーレー−シャイエ症候群）、ＭＰＳ ＩＩ型（ハンター
症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型（サンフィリオＡ症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩＢ型
（サンフィリオＢ症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩＣ型（サンフィリオＣ症候群）、Ｍ
ＰＳ ＩＩＩＤ型（サンフィリオＤ症候群）、ＭＰＳ ＩＶＡ型（モルキオＡ症
候群）、ＭＰＳ ＩＶＢ型（モルキオＢ症候群）、ＭＰＳ ＶＩ型（マロトー−
ラリー症候群）、ＭＰＳ ＶＩＩ型（スライ症候群）である。

【００４８】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして選択されるＤＮ
Ａ配列は突然変異を訂正することが可能な正常野生型配列を含む。 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は嚢胞
性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は
、ＣＦＴＲタンパク質コード領域のコドン５０８のアミノ酸を改変するものであ
り、例えば突然変異は、ＣＦＴＲタンパク質のコドン５０８のフェニルアラニン
を除去する、３塩基対インフレーム欠失である。ＣＦＴＲタンパク質におけるフ
ェニルアラニン−５０８のこの欠失は、嚢胞性線維症を有する被験者に高い割合
で見られる。したがって、好ましい態様において、野生型ＣＦＴＲ遺伝子に見ら
れるようなフェニルアラニン−５０８をコードする配列を含む、選択されるＤＮ
Ａ配列を用いて、突然変異ＣＦＴＲ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可
能である。

【００４９】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異はヒト
β−グロビン遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、β−グロビン遺伝子の
六番目のコドンのアミノ酸を改変するものであり、例えば突然変異は、β−グロ
ビン遺伝子の六番目のコドンにおけるＡからＴの置換である。この突然変異は、
β−グロビンタンパク質において、鎌形赤血球貧血を有する被験者に見られる、
グルタミン酸からバリンへの変化を導く。したがって、好ましい態様において、
コドン６で野生型アミノ酸残基をコードする、選択されるＤＮＡ、例えば野生型
β−グロビン遺伝子の六番目のコドン内で見られるように、Ａを含む、選択され
るＤＮＡ配列を用いて、突然変異β−グロビン遺伝子を標的とし、そして訂正す
ることが可能である。

【００５０】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は因子
ＶＩＩＩ遺伝子中にある。例えば、突然変異は、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン
２３、２４、および／またはエクソン２５にある可能性がある。好ましくは、突
然変異は、因子ＶＩＩＩタンパク質コード領域のコード領域のコドン２２０９で
アミノ酸を改変するものであり、例えば突然変異は、因子ＶＩＩＩのアミノ酸２
２０９でアルギニンからグルタミンへの変化を導く、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエク
ソン２４におけるＧからＡの置換である。好ましくは、突然変異は、因子ＶＩＩ
Ｉタンパク質コード領域のコード領域のコドン２２２９でアミノ酸を改変するも
のであり、例えば突然変異は、因子ＶＩＩＩのアミノ酸２２２９でトリプトファ
ンからシステインへの変化を導く、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン２５における
ＧからＴの置換である。これらの突然変異は、中程度から重度の血友病Ａと関連
付けられてきている。したがって、好ましい態様において、因子ＶＩＩＩ遺伝子
のコード領域のコドン２２０９で野生型アミノ酸をコードするＤＮＡ、または因
子ＶＩＩＩ遺伝子のコード領域のコドン２２２９で野生型アミノ酸をコードする
ＤＮＡいずれか、あるいは両方を含む、選択されるＤＮＡ配列を用いて、突然変
異因子ＶＩＩＩ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可能である。

【００５１】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は因子
ＩＸ遺伝子中にある。例えば、血友病Ｂを有する被験者において、突然変異の大
部分は、因子ＩＸ遺伝子における点突然変異である。したがって、好ましい態様
において、選択されるＤＮＡ配列は、血友病Ｂに関連する因子ＩＸ遺伝子中の１
以上の点突然変異を標的とし、そして訂正するため、野生型因子ＩＸ遺伝子由来
の少なくとも１つのヌクレオチドを有する１以上のヌクレオチドを含むことが可
能である。

【００５２】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異はフォ
ンウィルブランド因子遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、フォンウィル
ブランド遺伝子のエクソン１８における位２６７９−２６８４の６シトシン伸長
中の単一シトシン欠失である。この突然変異は、フォンウィルブランド疾患３型
を有する被験者に、かなりの割合で見られる。フォンウィルブランド疾患３型に
関連する他の突然変異、例えば点突然変異もまた、本明細書に記載されるように
、改変可能である。したがって、好ましい態様において、野生型フォンウィルブ
ランド遺伝子に見られる配列、例えばフォンウィルブランド遺伝子のエクソン１
８の位２６７９−２６８４の６つのシトシンを含む、選択されるＤＮＡ配列を用
いて、突然変異フォンウィルブランド遺伝子を標的とし、そして訂正することが
可能である。

【００５３】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は色素
性乾皮症グループＧ（ＸＰ−Ｇ）遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、Ｘ
Ｐ−Ｇ遺伝子に見られる２４５塩基対エクソンの位１９−２１の３アデニン伸長
中の単一アデニン欠失である。この欠失は、色素性乾皮症を導く。したがって、
好ましい態様において、ＸＰ−Ｇ遺伝子の野生型配列、例えばＸＰ−Ｇ遺伝子の
２４５塩基対エクソンの位１９−２１の３つのアデニンを含む、選択されるＤＮ
Ａを用いて、突然変異ＸＰ−Ｇ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可能で
ある。

【００５４】 別の好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、１より多いヌクレオチ
ドで標的ＤＮＡと異なり、例えば標的、または選択されるＤＮＡ配列が、非対領
域、例えばループアウト領域を有するように、十分な数のヌクレオチドで、標的
と異なる。好ましくは、Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ６、Ｍｓｈ３、Ｍ１ｈ１、Ｐｍｓ２、
Ｍ１ｈ３、Ｐｍｓ１、またはそれらの組み合わせなどのミスマッチ修復タンパク
質を不活性化する剤もまた、組成物に含んでもよく、例えば該剤を複合体に含ん
でもよい。

【００５５】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡ上のあらかじめ
選択される要素と、あらかじめ選択される関係にあるように組み込まれることが
可能であるように、隣接配列を有する。例えば、選択されるＤＮＡが制御配列で
あり、そして標的ＤＮＡがタンパク質をコードする場合、隣接配列は、制御要素
がタンパク質コード配列の発現を制御するよう機能するように、組み込むであろ
うものである。選択される組込みを促進する隣接配列を用いることが可能である
。選択されるＤＮＡ配列は、選択される標的配列、例えば標的中の遺伝子または
コード領域の５’、３’、または該領域内に組み込まれることが可能であるよう
な隣接配列を有することが可能である。

【００５６】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えば外因性制
御配列を含む。好ましい態様において、制御配列は、１以上の：プロモーター、
エンハンサー、ＵＡＳ、足場付着領域または転写因子結合部位を含む。好ましい
態様において、制御配列は：メタロチオネイン−Ｉ遺伝子、例えばマウスメタロ
チオネイン−Ｉ遺伝子由来の制御配列、ＳＶ−４０遺伝子由来の制御配列、サイ
トメガロウイルス遺伝子由来の制御配列、コラーゲン遺伝子由来の制御配列、ア
クチン遺伝子由来の制御配列、免疫グロブリン遺伝子由来の制御配列、ＨＭＧ−
ＣｏＡレダクターゼ遺伝子由来の制御配列、γアクチン遺伝子由来の制御配列、
転写活性化因子ＹＹ１遺伝子由来の制御配列、フィブロネクチン遺伝子由来の制
御配列、またはＥＦ−１α遺伝子由来の制御配列を含む。

【００５７】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列はエクソンを含む。好ましくは
、外因性エクソンは：ＣＡＰ部位、ヌクレオチド配列ＡＴＧ、および／または標
的とされる内因性遺伝子とインフレームのコードＤＮＡを含む。

【００５８】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列はスプライス−ドナー部位を含
む。 好ましい態様において、外因性制御配列を有する、選択されるＤＮＡ配列を含
む組成物は、選択されるＤＮＡ配列が、内因性配列の発現を制御するよう機能す
るように、標的内に組み込まれるような、隣接配列を有してもよい。選択される
ＤＮＡは、標的において、内因性遺伝子またはコード配列のコード領域上流の標
的に組み込むことが可能であるし、あるいは標的において、内因性遺伝子または
コード配列の内因性制御配列上流の標的に組み込むことが可能である。別の好ま
しい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、内因性遺伝子の内因性制御配列が
不活性である、例えば完全にまたは部分的に欠失されるように、標的中に組み込
むことが可能である。選択されるＤＮＡ配列は、内因性遺伝子またはコード領域
の下流の標的に組み込むことが可能であるし、あるいは内因性遺伝子のイントロ
ン内に組み込むことが可能である。

【００５９】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＦＳＨβ
遺伝子の制御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮ
Ａ配列には、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング
配列は、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ま
しい態様において、ターゲッティング配列は、ＦＳＨβコード領域（配列番号１
）の５’の領域に相同である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は
、ＦＳＨβコード配列内で、またはＦＳＨβコード配列上流で、相同組換えを指
示する。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ヒトＦＳＨβ配列の
ヌクレオチド−７４５４から−１４１７（番号付けは翻訳開始部位に対する）に
対応する配列番号２由来、またはヒトＦＳＨβ配列のヌクレオチド−６９６から
−１５５に対応する配列番号３由来の少なくとも２０、３０、５０、１００また
は１０００の連続するヌクレオチドを含む。

【００６０】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＩＦＮα
２遺伝子の制御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤ
ＮＡ配列には、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティン
グ配列は、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好
ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＩＦＮα２コード領域の５’の
領域に相同である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＩＦＮα
２コード配列上流の領域内で、相同組換えを指示する。好ましい態様において、
ターゲッティング配列は、ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−４０７４から−
５１１（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号４由来の少なく
とも２０、３０、５０、１００または１０００の連続するヌクレオチドを含む。
例えば、該配列は：ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−４０７４から−３７９
６に対応する配列番号７由来の少なくとも２０、３０、５０、または１００ヌク
レオチド；ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−５８２から−５１０に対応する
配列番号８由来の少なくとも２０、３０、または５０ヌクレオチド；ヒトＩＦＮ
α２配列のヌクレオチド−３７９５から−５８３に対応する配列番号９由来の少
なくとも２０、３０、５０、１００、または１０００ヌクレオチドを含んでもよ
い。

【００６１】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＧＣＳＦ
遺伝子の制御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮ
Ａ配列には、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング
配列は、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ま
しい態様において、ターゲッティング配列は、ＧＣＳＦコード領域の５’の領域
に相同である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は：ＧＣＳＦコー
ド配列内で；またはＧＣＳＦコード配列上流で、相同組換えを指示する。好まし
い態様において、ターゲッティング配列は、ヒトＧＣＳＦ配列のヌクレオチド−
６，５７８から１０１（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号
５由来の少なくとも２０、３０、５０、１００または１０００の連続するヌクレ
オチドを含む。例えば、標的配列は、ヒトＧＣＳＦ遺伝子のヌクレオチド−６，
５７８から−３６４（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号６
由来の２０、３０、５０、１００または１０００ヌクレオチドを含んでもよい。

【００６２】 別の好ましい態様において、ＤＮＡ配列はコード領域を含み、例えばＤＮＡ配
列はタンパク質をコードする。好ましい態様において、コード領域は：ホルモン
、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、制御
タンパク質、構造タンパク質または転写因子をコードする。好ましい態様におい
て、コード領域は、以下のタンパク質：エリスロポエチン、カルシトニン、成長
ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺
ホルモン、α２−インターフェロン（ＩＦＮＡ２）、β−インターフェロン、γ
−インターフェロン、神経増殖因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、
グルカゴン、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン
１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン６、インター
ロイキン１１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球（ＧＣＳＦ）、ＣＳＦ−
マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性
抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジ
スムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、アンチトロンビ
ンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血
液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ
、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタ
ンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−２受容体、
ＩＬ−２アンタゴニスト類、α−１−アンチトリプシン、免疫反応修飾剤類、β
−グルコセラミダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコ
サミン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル
補酵素Ａ：α−グルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダ
ーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、および可溶性ＣＤ４
のいずれかをコードする。

【００６３】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列が、標的内に組み込まれる際、
内因性制御要素の調節下にあるように、隣接配列を有してもよい。選択されるＤ
ＮＡは、内因性制御配列の下流または内因性遺伝子のコード領域の上流および遺
伝子の内因性制御配列の下流に組み込むことが可能である。別の好ましい態様に
おいて、選択されるＤＮＡは、内因性遺伝子のコード領域が不活性化される、例
えば完全にまたは部分的に欠失されるように、内因性制御配列の下流に組み込む
ことが可能である。

【００６４】 好ましい態様において、組成物、例えば複合体は、細胞に導入する。好ましく
は、細胞は真核細胞である。好ましい態様において、細胞は真菌、植物または動
物起源、例えば脊椎動物起源のものである。好ましい態様において、細胞は：哺
乳動物細胞、例えば初代または二次哺乳動物細胞、例えば線維芽細胞、造血幹細
胞、筋芽細胞、ケラチン形成細胞、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞
、血液の形成された要素を含む細胞、筋肉細胞およびこれらの体細胞の前駆体；
形質転換または不死化細胞株である。好ましくは、細胞はヒト細胞である。本方
法に有用な不死化ヒト細胞株の例には、限定されるわけではないが：Ｂｏｗｅｓ
黒色腫細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ ９６０７）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ
寄託番号ＣＣＬ ２１３）、ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ細胞派生物（ＡＴＣＣ
寄託番号ＣＣＬ２ ＣＣＬ２．１、およびＣＣＬ ２．２）、ＨＬ−６０細胞（
ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ２４０）、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣ
Ｌ １２１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ １５２）、ＫＢ癌
腫細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １７）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ寄
託番号ＣＣＬ ２４３）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＢＴＨ ２２
）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号１５８２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（Ａ
ＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ １４３２）、Ｒａｆｊｉ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ８６）、ＲＰＭＩ ８２２６細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １５５）、Ｕ−
９３７細胞（ＡＴＣＣ寄託番号１５９３）、ＷＩ−２８ＶＡ１３下位株２Ｒ４細
胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＬＬ １５５）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ寄託
番号ＣＣＬ １１９）および２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｌｉ
ｃｋら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：５９２７−５９３２， １９８８）
と共に、ヒト細胞および別の種の細胞の融合によって産生されるヘテロハイブリ
ドーマ細胞が含まれる。別の態様において、不死化細胞株は、ヒト細胞株以外の
細胞株、例えばＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株であってもよい。

【００６５】 好ましい態様において、組成物は、ミスマッチ修復タンパク質、例えばＭｓｈ
２、Ｍｓｈ６、Ｍｓｈ３、Ｍ１ｈ１、Ｐｍｓ２、Ｍ１ｈ３、Ｐｍｓ１、または他
のミスマッチ修復タンパク質、あるいはそれらの組み合わせを阻害する剤をさら
に含む。好ましくは、剤は、ミスマッチ修復タンパク質の発現を阻害する剤であ
り、例えば剤はアンチセンスＲＮＡである。好ましい態様において、剤はミスマ
ッチ修復タンパク質に対する抗体である。好ましい態様において、ミスマッチ修
復タンパク質に対する抗体は、組成物の１つ以上の構成要素に共有または非共有
結合している。

【００６６】 別の側面において、本発明は、タンパク質を提供する方法を特徴とする。該方
法は：本明細書に記載される方法によって作成された細胞を提供し、そして細胞
がタンパク質を発現することを可能にすることを含む。

【００６７】 別の好ましい態様において：該方法は：改変のため、標的とされる部位に、以
下の構成要素：（ａ）選択されるＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡ配列；（ｂ）相
同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タンパク質または機能するその断片；
および（ｃ）非相同端連結を阻害する剤、例えばＫｕ不活性化剤が導入されてい
る細胞を提供し、そして細胞がタンパク質を発現することを可能にすることを含
む。タンパク質の発現は、例えば、ＤＮＡにコードされるタンパク質の発現を可
能にすることによって、またはタンパク質の発現を活性化することによって、起
こることが可能である。

【００６８】 好ましい態様において、部位の改変、例えば選択されるＤＮＡ配列および標的
ＤＮＡ間の相同組換えまたは遺伝子訂正が、供給される相同組換え増進剤および
非相同端連結阻害剤の非存在下で起こるであろう率より高い率で起こるために、
相同組換えを増進する剤の濃度および非相同端連結を阻害する剤の濃度が、選択
されるＤＮＡ配列および標的ＤＮＡ間の相互作用部位で、十分であるように、構
成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が提供され、例えば細胞に導入される。非
相同端連結を阻害する剤は、好ましくは、局所に提供される。

【００６９】 好ましい態様において、構成要素（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、共に導入
してもよいし、または別個に導入してもよい。さらに、構成要素の２つを共に導
入し、そして第三の構成要素を別個に導入してもよい。例えば、ＤＮＡ配列およ
び相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２を共に導入してもよいし、または
ＤＮＡ配列および非相同端連結を阻害する剤、例えばＫｕ不活性化剤を共に導入
してもよい。別の好ましい態様において、相同組換えを増進する剤および非相同
端連結を阻害する剤を共に導入してもよい。

【００７０】 構成要素の２つ、または好ましくはすべてを、複合体として提供してもよい。
好ましい態様において、該方法は、標的ＤＮＡと：（ａ）選択されるＤＮＡ配列
を含む二本鎖ＤＮＡ配列；（ｂ）相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タ
ンパク質または機能するその断片；および（ｃ）非相同端連結を阻害する剤、例
えばＫｕを不活性化する剤を含む複合体とを、例えば該複合体を細胞内に導入す
ることによって接触させることを含む。

【００７１】 好ましい態様において、１つ、またはそれ以上、好ましくはすべての構成要素
は、局所搬送、例えばマイクロインジェクションによって提供され、そして標的
ゲノムまたは他の核酸から発現されない。特に好ましい態様において、非相同端
連結を阻害する剤、例えば抗Ｋｕ抗体などのＫｕ不活性化剤は、局所搬送、例え
ばマイクロインジェクションによって提供され、そして標的ゲノムまたは他の核
酸から発現されない。

【００７２】 好ましい態様において、非相同端連結を阻害する剤は：ｈＭｒｅ１１を不活性
化する剤、例えば抗ｈＭｒｅ１１抗体またはｈＭｒｅ１１結合オリゴマーもしく
はポリマー；ｈＲａｄ５０を不活性化する剤、例えば抗ｈＲａｄ５０抗体または
ｈＲａｄ５０結合オリゴマーもしくはポリマー；Ｎｂｓ１を不活性化する剤、例
えば抗Ｎｂｓ１抗体またはｈＮｂｓ１結合オリゴマーもしくはポリマー；ヒトリ
ガーゼ４（ｈＬｉｇ４）を不活性化する剤、例えば抗ｈＬｉｇ４抗体またはｈＬ
ｉｇ４結合オリゴマーもしくはポリマー；ｈＸｒｃｃ４を不活性化する剤、例え
ば抗ｈＸｒｃｃ４抗体またはｈＸｒｃｃ４結合オリゴマーもしくはポリマー；Ｒ
ａｐ１のヒト相同体を不活性化する剤、例えばＲａｐ１のヒト相同体に対する抗
体またはＲａｐ１のヒト相同体に結合するオリゴマーもしくはポリマー；Ｓｉｒ
２３０４のヒト相同体を不活性化する剤、例えばＳｉｒ２３０４のヒト相同体に
対する抗体またはＳｉｒ２３０４のヒト相同体に結合するオリゴマーもしくはポ
リマー；Ｋｕを不活性化する剤、例えば抗Ｋｕ抗体またはＫｕ結合オリゴマーも
しくはポリマーである。非相同端連結を阻害する剤のいずれも、単独で投与して
もよいし、または非相同端連結を阻害する１以上の他の剤と組み合わせて投与し
てもよい。

【００７３】 好ましい態様において、ＤＮＡ配列は直鎖ＤＮＡ配列である。好ましい態様に
おいて、直鎖ＤＮＡ配列は、１以上の一本鎖オーバーハング（類）を有すること
が可能である。

【００７４】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列にターゲッティング配列が隣接
する。ターゲッティング配列は、標的に相同であり、例えば標的ＤＮＡを改変し
ようとする部位または選択されるＤＮＡ配列を組み込もうとする部位に隣接する
ＤＮＡに相同である。こうした隣接配列は、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端
、好ましくは両端に、存在することが可能である。２つの隣接配列が存在する場
合、一方は標的の第一の領域に相同であるべきであり、そして他方は標的の第二
の領域に相同であるべきである。

【００７５】 好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、１以上の突出一本鎖端を有し、例えば
突出端の１つまたは両方が、３’端または５’端である。 好ましい態様において、相同組換えを増進する剤は：Ｒａｄ５２タンパク質ま
たは機能するその断片；Ｒａｄ５１タンパク質または機能するその断片；Ｒａｄ
５４タンパク質または機能するその断片；あるいはそれらの組み合わせである。

【００７６】 好ましい態様において、相同組換えを増進する剤は、ＤＮＡ配列に付着し、例
えばＤＮＡ配列上にコーティングされる。好ましい態様において、Ｒａｄ５２タ
ンパク質または機能するその断片は、選択されるＤＮＡ配列に付着し、例えば選
択されるＤＮＡ配列上にコーティングされる。

【００７７】 好ましい態様において、Ｒａｄ５２タンパク質またはその断片はヒトＲａｄ５
２（ｈＲａｄ５２）である。 好ましい態様において、抗Ｋｕ抗体は：抗Ｋｕ７０抗体；抗Ｋｕ８０抗体であ
る。好ましい態様において、抗Ｋｕ抗体は：ヒト化抗体；ヒト抗体；抗体断片、
例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）²またはＦ（ｖ）断片である。

【００７８】 好ましい態様において、少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体は：選択されるＤＮＡ配
列；相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タンパク質またはその断片に共
有結合している。別の好ましい態様において、少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体は：
選択されるＤＮＡ配列；相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タンパク質
またはその断片に非共有結合している。

【００７９】 好ましい態様において、複合体は、例えば複合体の構成要素として提供される
、抗Ｋｕ７０抗体および抗Ｋｕ８０抗体を含む。 好ましい態様において、細胞は：真核細胞である。好ましい態様において、細
胞は真菌、植物または動物起源、例えば脊椎動物起源のものである。好ましい態
様において、細胞は：哺乳動物細胞、例えば初代または二次哺乳動物細胞、例え
ば線維芽細胞、造血幹細胞、筋芽細胞、ケラチン形成細胞、上皮細胞、内皮細胞
、グリア細胞、神経細胞、血液の形成された要素を含む細胞、筋肉細胞およびこ
れらの体細胞の前駆体；形質転換または不死化細胞株である。好ましくは、細胞
はヒト細胞である。本方法に有用な不死化ヒト細胞株の例には、限定されるわけ
ではないが：Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ ９６０７）、Ｄ
ａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ２１３）、ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬ
ａ細胞派生物（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ２ ＣＣＬ２．１、およびＣＣＬ ２．
２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ２４０）、ＨＴ１０８０細胞
（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １２１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号Ｔ
ＩＢ １５２）、ＫＢ癌腫細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １７）、Ｋ−５６２
白血病細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ２４３）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣ
Ｃ寄託番号ＢＴＨ ２２）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号１５８２）、
Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ １４３２）、Ｒａｆｊｉ細胞（
ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ ８６）、ＲＰＭＩ ８２２６細胞（ＡＴＣＣ寄託番号
ＣＣＬ １５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ寄託番号１５９３）、ＷＩ−２８
ＶＡ１３下位株２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＬＬ １５５）、ＣＣＲＦ−Ｃ
ＥＭ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ １１９）および２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（
Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：５９２７−
５９３２， １９８８）と共に、ヒト細胞および別の種の細胞の融合によって産
生されるヘテロハイブリドーマ細胞が含まれる。別の態様において、不死化細胞
株は、ヒト細胞株以外の細胞株、例えばＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株であっても
よい。

【００８０】 好ましい態様において、構成要素、例えば複合体の構成要素は、マイクロイン
ジェクションによって、細胞に導入される。 好ましい態様において、方法は、ミスマッチ修復タンパク質、例えばＭｓｈ２
、Ｍｓｈ６、Ｍｓｈ３、Ｍ１ｈ１、Ｐｍｓ２、Ｍ１ｈ３、Ｐｍｓ１、または他の
ミスマッチ修復タンパク質、あるいはそれらの組み合わせを阻害する剤を導入す
ることをさらに含む。好ましくは、剤は、ミスマッチ修復タンパク質の発現を阻
害する剤であり、例えば剤はアンチセンスＲＮＡである。好ましい態様において
、剤はミスマッチ修復タンパク質に対する抗体である。好ましい態様において、
ミスマッチ修復タンパク質に対する抗体は、複合体に共有または非共有結合して
いる。

【００８１】 好ましい態様において、タンパク質はｉｎ ｖｉｔｒｏで発現される。他の好
ましい態様において、細胞は被験者、例えばヒトにおいて提供され、そしてタン
パク質は被験者において発現される。好ましい態様において、タンパク質は被験
者において発現され、そして細胞は自己、同種異系、異種である。選択されるＤ
ＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入してもよいし、または細胞を被験者から除
去し、選択されるＤＮＡをｅｘ ｖｉｖｏで導入し、そして細胞を被験者に戻し
てもよい。

【００８２】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、１０、８、６、５、４、３
、２未満、または１ヌクレオチド、例えば置換、または欠失、または挿入により
、標的ＤＮＡと異なる。

【００８３】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、例えば標的配列は、約
１０、８、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド、野生型配列と異なる。
好ましくは、突然変異は点突然変異、例えば挿入、欠失または置換による突然変
異である。

【００８４】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は、疾
患または機能障害に関連し、例えば該疾患または機能障害を引き起こすか、それ
に貢献するか、それを左右するかまたは調節する。好ましくは、疾患または機能
障害は：嚢胞性線維症；鎌形赤血球貧血；血友病Ａ；血友病Ｂ；フォンウィルブ
ランド疾患３型；色素性乾皮症；地中海貧血症；レッシュ−ナイラン症候群；プ
ロテインＣ耐性；リソソーム疾患、例えばゴシェ病、ファブリー病；ムコ多糖症
（ＭＰＳ）１型（ハーレー−シャイエ症候群）、ＭＰＳ ＩＩ型（ハンター症候
群）、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型（サンフィリオＡ症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩＢ型（サ
ンフィリオＢ症候群）、ＭＰＳ ＩＩＩＣ型（サンフィリオＣ症候群）、ＭＰＳ
ＩＩＩＤ型（サンフィリオＤ症候群）、ＭＰＳ ＩＶＡ型（モルキオＡ症候群
）、ＭＰＳ ＩＶＢ型（モルキオＢ症候群）、ＭＰＳ ＶＩ型（マロトー−ラリ
ー症候群）、ＭＰＳ ＶＩＩ型（スライ症候群）である。

【００８５】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして選択されるＤＮ
Ａ配列は突然変異を訂正することが可能な正常野生型配列を含む。 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は嚢胞
性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は
、ＣＦＴＲタンパク質コード領域のコドン５０８のアミノ酸を改変するものであ
り、例えば突然変異は、ＣＦＴＲタンパク質のコドン５０８のフェニルアラニン
を除去する、３塩基対インフレーム欠失である。ＣＦＴＲタンパク質におけるフ
ェニルアラニン−５０８のこの欠失は、嚢胞性線維症を有する被験者に高い割合
で見られる。したがって、好ましい態様において、野生型ＣＦＴＲ遺伝子に見ら
れるようなフェニルアラニン−５０８をコードする配列を含む、選択されるＤＮ
Ａ配列を用いて、突然変異ＣＦＴＲ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可
能である。

【００８６】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異はヒト
β−グロビン遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、β−グロビン遺伝子の
六番目のコドンのアミノ酸を改変するものであり、例えば突然変異は、β−グロ
ビン遺伝子の六番目のコドンにおけるＡからＴの置換である。この突然変異は、
β−グロビンタンパク質において、鎌形赤血球貧血を有する被験者に見られる、
グルタミン酸からバリンへの変化を導く。したがって、好ましい態様において、
コドン６で野生型アミノ酸残基をコードする、選択されるＤＮＡ、例えば野生型
β−グロビン遺伝子の六番目のコドン内で見られるように、Ａを含む、選択され
るＤＮＡ配列を用いて、突然変異β−グロビン遺伝子を標的とし、そして訂正す
ることが可能である。

【００８７】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は因子
ＶＩＩＩ遺伝子中にある。例えば、突然変異は、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン
２３、２４、および／またはエクソン２５にある可能性がある。好ましくは、突
然変異は、因子ＶＩＩＩタンパク質コード領域のコード領域のコドン２２０９で
アミノ酸を改変するものであり、例えば突然変異は、因子ＶＩＩＩのアミノ酸２
２０９でアルギニンからグルタミンへの変化を導く、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエク
ソン２４におけるＧからＡの置換である。好ましくは、突然変異は、因子ＶＩＩ
Ｉタンパク質コード領域のコード領域のコドン２２２９でアミノ酸を改変するも
のであり、例えば突然変異は、因子ＶＩＩＩのアミノ酸２２２９でトリプトファ
ンからシステインへの変化を導く、因子ＶＩＩＩ遺伝子のエクソン２５における
ＧからＴの置換である。これらの突然変異は、中程度から重度の血友病Ａと関連
付けられてきている。したがって、好ましい態様において、因子ＶＩＩＩ遺伝子
のコード領域のコドン２２０９で野生型アミノ酸をコードするＤＮＡ、または因
子ＶＩＩＩ遺伝子のコード領域のコドン２２２９で野生型アミノ酸をコードする
ＤＮＡいずれか、あるいは両方を含む、選択されるＤＮＡ配列を用いて、突然変
異因子ＶＩＩＩ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可能である。

【００８８】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は因子
ＩＸ遺伝子中にある。例えば、血友病Ｂを有する被験者において、突然変異の大
部分は、因子ＩＸ遺伝子における点突然変異である。したがって、好ましい態様
において、選択されるＤＮＡ配列は、血友病Ｂに関連する因子ＩＸ遺伝子中の１
以上の点突然変異を標的とし、そして訂正するため、野生型因子ＩＸ遺伝子由来
の少なくとも１つのヌクレオチドを有する１以上のヌクレオチドを含むことが可
能である。

【００８９】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異はフォ
ンウィルブランド因子遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、フォンウィル
ブランド遺伝子のエクソン１８における位２６７９−２６８４の６シトシン伸長
中の単一シトシン欠失である。この突然変異は、フォンウィルブランド疾患３型
を有する被験者に、かなりの割合で見られる。フォンウィルブランド疾患３型に
関連する他の突然変異、例えば点突然変異もまた、本明細書に記載されるように
、改変可能である。したがって、好ましい態様において、野生型フォンウィルブ
ランド遺伝子に見られる配列、例えばフォンウィルブランド遺伝子のエクソン１
８の位２６７９−２６８４の６つのシトシンを含む、選択されるＤＮＡ配列を用
いて、突然変異フォンウィルブランド遺伝子を標的とし、そして訂正することが
可能である。

【００９０】 好ましい態様において、標的ＤＮＡは突然変異を含み、そして突然変異は色素
性乾皮症グループＧ（ＸＰ−Ｇ）遺伝子中にある。好ましくは、突然変異は、Ｘ
Ｐ−Ｇ遺伝子に見られる２４５塩基対エクソンの位１９−２１のアデニン伸長中
の単一アデニン欠失である。この欠失は、色素性乾皮症を導く。したがって、好
ましい態様において、ＸＰ−Ｇ遺伝子の野生型配列、例えばＸＰ−Ｇ遺伝子の２
４５塩基対エクソンの位１９−２１の３つのアデニンを含む、選択されるＤＮＡ
を用いて、突然変異ＸＰ−Ｇ遺伝子を標的とし、そして訂正することが可能であ
る。

【００９１】 別の好ましい態様において、改変は、選択されるＤＮＡ配列および標的ＤＮＡ
、例えば染色体間の相同組換えを含む。 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、１より多いヌクレオチドで
標的ＤＮＡと異なり、例えば標的、または選択されるＤＮＡ配列が、非対領域、
例えばループアウト領域を有するように、十分な数のヌクレオチドで、標的と異
なる。こうした適用において、Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ６、Ｍｓｈ３、Ｍ１ｈ１、Ｐｍ
ｓ２、Ｍ１ｈ３、Ｐｍｓ１、またはそれらの組み合わせもまた、例えば複合体の
一部として提供してもよい。

【００９２】 好ましい態様において、改変は、標的ＤＮＡへの選択される配列の組込みを含
み、そして選択されるＤＮＡは、標的上のあらかじめ選択される要素と、あらか
じめ選択される関係にあるように組み込まれ、例えば一方が制御要素であり、そ
して他方がタンパク質をコードする配列である場合、制御要素が、タンパク質コ
ード配列の発現を調節するよう機能する。選択される組込みを促進する隣接配列
を用いてもよい。選択されるＤＮＡ配列は、選択される標的配列、例えば遺伝子
またはコード配列の５’、３’、または該配列内に組み込むことが可能である。

【００９３】 好ましい態様において、改変は、選択されるＤＮＡ配列の組込みを含み、そし
て選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えば外因性制御配列である。好ましい
態様において、制御配列は、１以上の：プロモーター、エンハンサー、ＵＡＳ、
足場付着領域または転写因子結合部位を含む。好ましい態様において、制御配列
は：メタロチオネイン−Ｉ遺伝子、例えばマウスメタロチオネイン遺伝子由来の
制御配列、ＳＶ−４０遺伝子由来の制御配列、サイトメガロウイルス遺伝子由来
の制御配列、コラーゲン遺伝子由来の制御配列、アクチン遺伝子由来の制御配列
、免疫グロブリン遺伝子由来の制御配列、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子由
来の制御配列、γアクチン遺伝子由来の制御配列、転写活性化因子ＹＹ１遺伝子
由来の制御配列、フィブロネクチン遺伝子由来の制御配列、またはＥＦ−１α遺
伝子由来の制御配列を含む。

【００９４】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列はエクソンを含む。好ましくは
、外因性エクソンは：ＣＡＰ部位、ヌクレオチド配列ＡＴＧ、および／または標
的とされる内因性遺伝子とインフレームのコードＤＮＡを含む。

【００９５】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列はスプライス−ドナー部位を含
む。 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、標的に組み込まれた際、内
因性遺伝子の発現を制御するよう作用する、外因性制御配列を含む。選択される
ＤＮＡは、標的において、内因性遺伝子のコード領域の上流、または標的におい
て、内因性遺伝子またはコード領域の内因性制御配列の上流に組み込むことが可
能である。別の好ましい態様において、選択されるＤＮＡは、内因性遺伝子また
はコード領域の下流、あるいはイントロンまたは内因性遺伝子内に組み込むこと
が可能である。別の好ましい態様において、内因性遺伝子の内因性制御配列は不
活性であり、例えば完全にまたは部分的に欠失される。

【００９６】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は内因性遺伝子の上流であり、
そして内因性遺伝子の第二のエクソンに連結される。 好ましい態様において、内因性遺伝子は：ホルモン、サイトカイン、抗原、抗
体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、制御タンパク質、構造タンパク
質または転写因子をコードする。好ましい態様において、内因性遺伝子は、以下
のタンパク質：エリスロポエチン、カルシトニン、成長ホルモン、インスリン、
インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、α２−インタ
ーフェロン（ＩＦＮＡ２）、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、神
経増殖因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、グルカゴン、骨増殖因子
−２、骨増殖因子−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン１、インターロイキン２
、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１１、インター
ロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球（ＧＣＳＦ）、ＣＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ
−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性抗体類、プロテインキナ
ーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラス
ミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、アンチトロンビンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、
α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固
因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液
凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビ
ン類、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト
類、α−１−アンチトリプシン、免疫反応修飾剤類、β−グルコセラミダーゼ、
α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコサミン−Ｎ−スルファタ
ーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル補酵素Ａ：α−グルコサ
ミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スル
ファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン−６−スルファターゼ、および可溶性ＣＤ４のいずれかをコードする
。

【００９７】 好ましい態様において、内因性遺伝子は卵胞刺激ホルモンβ（ＦＳＨβ）をコ
ードし、そして選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＦＳＨβ遺伝子の制
御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮＡ配列には
、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング配列は、選
択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ましい態様に
おいて、ターゲッティング配列は、ＦＳＨβコード領域（配列番号１）の５’の
領域に相同である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＦＳＨβ
コード配列内で、またはＦＳＨβコード配列上流で、相同組換えを指示する。好
ましい態様において、ターゲッティング配列は、ヒトＦＳＨβ配列のヌクレオチ
ド−７４５４から−１４１７（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配
列番号２由来、またはヒトＦＳＨβ配列のヌクレオチド−６９６から−１５５に
対応する配列番号３由来の少なくとも２０、３０、５０、１００または１０００
の連続するヌクレオチドを含む。

【００９８】 好ましい態様において、内因性遺伝子はインターフェロンα２（ＩＦＮα２）
をコードし、そして選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＩＦＮα２遺伝
子の制御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮＡ配
列には、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング配列
は、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ましい
態様において、ターゲッティング配列は、ＩＦＮα２コード領域の５’の領域に
相同である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＩＦＮα２コー
ド配列上流の領域内で、相同組換えを指示する。好ましい態様において、ターゲ
ッティング配列は、ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−４０７４から−５１１
（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号４由来の少なくとも２
０、３０、５０、１００または１０００の連続するヌクレオチドを含む。例えば
、該配列は：ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−４０７４から−３７９６に対
応する配列番号７由来の少なくとも２０、３０、５０、または１００ヌクレオチ
ド；ヒトＩＦＮα２配列のヌクレオチド−５８２から−５１０に対応する配列番
号８由来の少なくとも２０、３０、または５０ヌクレオチド；ヒトＩＦＮα２配
列のヌクレオチド−３７９５から−５８３に対応する配列番号９由来の少なくと
も２０、３０、５０、１００、または１０００ヌクレオチドを含んでもよい。

【００９９】 好ましい態様において、内因性遺伝子は顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）
をコードし、そして選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えばＧＣＳＦ遺伝子
の制御配列と配列が異なる制御配列を含む。好ましくは、選択されるＤＮＡ配列
には、ターゲッティング配列が隣接し、例えばこうしたターゲッティング配列は
、選択されるＤＮＡ配列の１以上の端、好ましくは両端に存在する。好ましい態
様において、ターゲッティング配列は、ＧＣＳＦコード領域の５’の領域に相同
である。好ましい態様において、ターゲッティング配列は、ＧＣＳＦコード配列
内で、またはＧＣＳＦコード配列上流で、相同組換えを指示する。好ましい態様
において、ターゲッティング配列は、ヒトＧＣＳＦ配列のヌクレオチド−６，５
７８から１０１（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号５由来
の少なくとも２０、３０、５０、１００または１０００の連続するヌクレオチド
を含む。例えば、標的配列は、ヒトＧＣＳＦ遺伝子のヌクレオチド−６，５７８
から−３６４（番号付けは翻訳開始部位に対する）に対応する配列番号６由来の
２０、３０、５０、１００または１０００ヌクレオチドを含んでもよい。

【０１００】 別の好ましい態様において、ＤＮＡ配列はコード領域を含み、例えばＤＮＡ配
列はタンパク質をコードする。好ましい態様において、コード領域は：ホルモン
、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、制御
タンパク質、構造タンパク質または転写因子をコードする。好ましい態様におい
て、コード領域は、以下のタンパク質：エリスロポエチン、カルシトニン、成長
ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺
ホルモン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、神経増殖因子類、Ｆ
ＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、グルカゴン、骨増殖因子−２、骨増殖因子
−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキ
ン３、インターロイキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、Ｃ
ＳＦ−顆粒球、ＣＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免
疫グロブリン類、触媒性抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダー
ゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキ
ナーゼ、アンチトロンビンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシ
ンヒドロキシラーゼ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩ
ＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタ
ンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、低密度リポタンパク質受
容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト類、α−１−アンチトリプシン
、免疫反応修飾剤類、β−グルコセラミダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−
イズロニダーゼ、グルコサミン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼ、アセチル補酵素Ａ：α−グルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフ
ェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファター
ゼ、および可溶性ＣＤ４のいずれかをコードする。

【０１０１】 好ましい態様において、選択されるＤＮＡ配列は、内因性制御配列の下流また
は内因性遺伝子のコード領域の上流および遺伝子の内因性制御配列の下流の標的
内に組み込むことが可能である。別の好ましい態様において、選択されるＤＮＡ
配列は、内因性遺伝子のコード領域が不活性である、例えば欠失されるように、
内因性制御配列の下流に組み込むことが可能である。

【０１０２】 別の側面において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかによって
作成される細胞を特徴とする。 別の側面において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかによって
、細胞において、遺伝子のタンパク質コード配列の発現を改変する方法を特徴と
する。

【０１０３】 好ましい態様において、該方法は、制御配列を含むＤＮＡ配列を有する、本明
細書記載の複合体を、細胞内に導入し；標的とされるゲノム配列の改変を可能に
して、相同組換え細胞を産生する条件下に、細胞を維持し；そして制御配列の調
節下、遺伝子のタンパク質コード配列の発現を可能にする条件下で、相同組換え
細胞を維持することを含む。

【０１０４】 制御配列の調節下、遺伝子のタンパク質コード配列の発現を可能にする条件下
で、相同組換え細胞を維持して、それにより、遺伝子のタンパク質コード配列の
発現を改変する。

【０１０５】 用語「相同」は、本明細書において、ターゲッティング配列および標的部位が
、相同組換えを経ることが可能であるように、標的部位、例えば染色体ＤＮＡ標
的部位と同一であるか、または十分に類似であるターゲッティング配列を指す。
相同組換えが有用な頻度で発生可能である限り、小さい割合の塩基対ミスマッチ
は許容可能である。

【０１０６】 本明細書において、用語「野生型」は、疾患または機能障害に関連しない、例
えば該疾患または機能障害を引き起こさず、それに貢献せず、それを左右せずま
たは調節しない配列を指す。

【０１０７】 本明細書において、「複合体」は、構成要素が共有または非共有結合によって
カップリングされる、安定な会合を指す。 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、そして請求項から明
らかであろう。発明の詳細な説明 相同組換えを増進する剤 選択されるＤＮＡ配列および標的ＤＮＡ、例えば染色体ＤＮＡ間の相同組換え
を促進するため、選択されるＤＮＡ配列と共に、相同組換えを増進する剤を提供
することが可能である。相同組換えを増進する剤は、１以上の以下の機能：１）
選択されるＤＮＡ配列および組込みに選択される部位間の相同認識を増加させる
機能；２）選択されるＤＮＡ配列および組込みに選択される部位間の相同対形成
を増加させる機能；３）組換えＤＮＡ配列間の鎖侵入および鎖交換の効率を増加
させる機能；４）組換えの成熟産物への中間構造のプロセシング効率を増加させ
る機能を有する。

【０１０８】 相同組換えを増進する剤は、二本鎖ＤＮＡ配列を含む混合物中で、細胞に導入
可能であるし、ＤＮＡ配列の投与直前または直後に導入可能であるし、またはＤ
ＮＡ配列上に付着させ、例えばコーティングすることが可能である。相同組換え
を増進する剤、例えばＲａｄ５２、例えばｈＲａｄ５２、またはその断片で、全
ＤＮＡ配列をコーティングすることが可能であるし、あるいはＤＮＡ配列の１以
上の端をコーティングすることが可能であり、例えばＤＮＡ配列の１以上の突出
一本鎖端をコーティングすることが可能である。好ましくは、相同組換えを増進
する剤は、ＤＮＡ配列の突出一本鎖３’端または５’端の少なくとも部分をコー
ティングする。

【０１０９】 相同組換えを増進する剤の例には：Ｒａｄ５２または機能するその断片；Ｒａ
ｄ５１または機能するその断片；Ｒａｄ５４または機能するその断片；あるいは
これらのタンパク質またはこれらのタンパク質の断片の２以上の組み合わせが含
まれる。相同組換えを増進する剤はまた、細胞内でも発現可能であるし、例えば
、上述の剤のいずれかをコードする核酸配列を細胞に導入することが可能である
。

【０１１０】 Ｒａｄ５１断片が機能的であるかどうかの決定は、既知の技術によって、行う
ことが可能である。例えば、Ｒａｄ５１断片の機能性は、例えばＢａｕｍａｎｎ
ら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８７：７５７−７６６に記載されるように、当該技術
分野に知られるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、相同対形成および鎖交換を
仲介する能力に基づいて、決定可能である。簡潔には、ｈＲａｄ５１をまず、環
状ｓｓＤＮＡとプレインキュベーションし、そしてその後、³²Ｐ標識直線二重鎖
ＤＮＡを添加する。連結分子の形成および鎖交換の量は、電気泳動によって、決
定可能である。さらに、Ｒａｄ５１断片の機能性は、Ｂｅｎｓｏｎら（１９９４
）ＥＭＢＯ Ｊ． １３：５７６４−５７７１に記載されるように、ＡＴＰの存
在下で、ニック形成された二重鎖に結合し、電子顕微鏡によって視覚化可能であ
る、らせん核タンパク質フィラメントを形成する能力に基づいて、決定可能であ
る。Ｒａｄ５１の機能性はまた、機能するＲａｄ５１タンパク質を欠く細胞にお
いて、ＤＮＡ修復および相同組換えにおける欠陥を軽減する能力に基づいても、
決定可能である。したがって、その非存在下に比較した際、上述のアッセイにお
いて、陽性の影響を与えるのであれば、Ｒａｄ５１断片が機能するかどうか、決
定可能である。さらに、Ｒａｄ５１断片によって与えられる陽性の影響の度合い
は、全長Ｒａｄ５１によって与えられる陽性の影響の度合いに比較可能である。

【０１１１】 Ｒａｄ５４断片の機能性は、当該技術分野に知られるアッセイ、例えばＳｗａ
ｇｅｍａｋｅｒｓら（１９９８）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２８
２９２−２８２９７に記載されるアッセイにおいて、ｄｓＤＮＡの存在下でＡＴ
Ｐを加水分解する能力に基づいて、決定可能である。さらに、Ｒａｄ５４断片の
機能性は、機能するＲａｄ５４タンパク質を欠く細胞において、ＤＮＡ修復およ
び相同組換えにおける欠陥を軽減する能力に基づいて、決定可能である。

【０１１２】 Ｒａｄ５２および機能するその断片 標的ＤＮＡにおける選択される部位、例えば染色体ＤＮＡにおける選択される
部位のＤＮＡ配列と共に提供されるＲａｄ５２は、その非存在下で生じるであろ
うより、より高い率の部位の改変、例えば相同組換えを提供することが可能であ
る。理論によって束縛されることは望ましくないが、Ｒａｄ５２は以下の機能：
１）ヌクレアーゼ分解から全ＤＮＡ配列を保護する機能；２）ヌクレアーゼ分解
から、ＤＮＡ配列の突出一本鎖端、例えば３’テールを保護する機能；３）ＤＮ
Ａ配列および組込みのため選択される部位間の相同認識を増加させる機能；並び
に４）ＤＮＡ配列および組込みのため選択される部位間の相同対形成を増加させ
る機能の１以上を提供することが可能であると考えられる。

【０１１３】 Ｒａｄ５２は、Ｒａｄ５２の単離または遺伝子操作法によるコード配列の発現
を含む、いくつかの方法で、得ることが可能である。例えばＶａｎ Ｄｙｋｅら
（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８：７２８は、Ｓｆ９細胞からのｈＲａｄ５２
の産生および精製を記載する。多様な種のＲａｄ５２のヌクレオチド配列が知ら
れる。例えばＳｈｅｎら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２５（１）：１９９−
２０６（ネズミおよびヒトＲａｄ５２）；Ｍｕｒｉｓら（１９９４）Ｍｕｔａｔ
． Ｒｅｓ． ３１５（３）：２９５−３０５（ネズミおよびヒトＲａｄ５２）
；Ｐａｒｋら（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０（２６）：１
５４６７−１５４７０（ヒトＲａｄ５２）を参照されたい。

【０１１４】 Ｒａｄ５２の断片は、例えばＲａｄ５２またはその部分をコードする配列の発
現によるか、あるいは遺伝子活性化による（好ましい方法）か、タンパク質分解
的消化によるか、あるいは化学的合成による、いくつかの方法で、産生可能であ
る。Ｒａｄ５２の内部または末端断片は、Ｒａｄ５２をコードする核酸の一端（
末端断片のため）または両端（内部断片のため）由来の１以上のヌクレオチドを
除去することによって、生成することが可能である。突然変異誘発ＤＮＡの発現
は、Ｒａｄ５２ポリペプチド断片を生じる。したがって、「末端噛み取り（ｅｎ
ｄ−ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」エンドヌクレアーゼまたは多様な制限酵素での消化は
、Ｒａｄ５２断片のアレイをコードするＤＮＡを生成することが可能である。Ｒ
ａｄ５２タンパク質の断片をコードするＤＮＡはまた、ランダム剪断、制限消化
または上に論じた方法の組み合わせによっても、生成することが可能である。

【０１１５】 Ｒａｄ５２断片はまた、慣用的メリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏ
ｃ化学反応などの、当該技術分野に知られる技術を用いて、化学的に合成するこ
とが可能である。例えば、Ｒａｄ５２ペプチドは、断片の重複を含まない望まし
い長さの断片に任意に分割するか、または望ましい長さの重複断片に分割するこ
とが可能である。

【０１１６】 Ｒａｄ５２断片が機能するかどうかの決定は、既知の技術によって、行うこと
が可能である。例えば、Ｒａｄ５２断片がヌクレアーゼ分解に対して保護するこ
とが可能であるかどうか決定するため、ヌクレアーゼ、例えばエクソヌクレアー
ゼまたはエンドヌクレアーゼの導入前に、末端標識直線化二本鎖ＤＮＡ配列、例
えば³²Ｐ標識直線化二本鎖ＤＮＡ配列をＲａｄ５２断片とインキュベーションす
ることが可能である。その後、放出された標識、例えば³²Ｐの量を決定すること
が可能である。放出された標識の量は、Ｒａｄ５２断片がヌクレアーゼ分解に対
して保護する能力の指標として役立つ。さらに、Ｒａｄ５２断片の機能性は、連
結分子形成を刺激する能力に基づいて、決定可能である。Ｒａｄ５２断片の機能
性は、Ｂｅｎｓｏｎら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：４０１−４０４に記
載されるようなｈＲａｄ５１駆動連結分子形成の刺激によって、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで解析可能である。簡潔には、ｈＲａｄ５１をまず、環状ｓｓＤＮＡとプレイ
ンキュベーションし、そしてその後、³²Ｐ標識直線二重鎖ＤＮＡを添加する。連
結分子の形成は、電気泳動によって決定可能である。Ｒａｄ５２の添加は、Ｒａ
ｄ５２の非存在下の連結分子形成に比較した際、連結分子の形成を刺激する。し
たがって、非存在下の連結分子形成に比較した際、連結分子形成を刺激するなら
ば、Ｒａｄ５２断片が機能するかどうか、決定可能である。さらに、Ｒａｄ５２
断片による刺激の度合いは、全長Ｒａｄ５２刺激の度合いに比較可能である。さ
らに、Ｒａｄ５２断片の機能性は、Ｐａｒｋ（１９９５）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２７０：１５４６７−１５４７０に記載されるように、培養サル細胞
で過剰発現させた際、電離放射線に対する耐性を増加させ、そして相同組換えの
率を増加させる能力に基づいて、決定可能である。

【０１１７】 非相同端連結を阻害する剤 非相同端連結を阻害する剤を用いて、非存在下で生じるであろうより、より高
い率で、標的ＤＮＡにおける選択される部位に、ＤＮＡ配列を提供することが可
能である。非相同端連結は、二本鎖端間での不正確な融合を導く可能性があり、
例えば再連結端は、挿入または欠失を有する可能性がある。非相同端連結を阻害
する剤は、非相同端連結経路に関与する分子の発現および／または活性を阻害す
るいかなる剤であってもよい。例えば、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０およびＮｂｓ１
の複合体は、非相同端連結に関与する。したがって、例えばこの複合体の形成を
阻害することによって、例えばこれらのタンパク質のいずれかに結合するか、ま
たはこれらのタンパク質のいずれかの発現を阻害することによって、非相同端連
結を阻害することが可能である。さらに、非相同端連結に関与する他のタンパク
質には、Ｋｕタンパク質、例えばＫｕ７０またはＫｕ８０、リガーゼ４（Ｌｉｇ
４）およびＸｒｃｃ４が含まれる。

【０１１８】 Ｋｕ不活性化剤 標的ＤＮＡ中の選択される部位、例えば染色体ＤＮＡ中の選択される部位で、
ＤＮＡ配列と共に、Ｋｕ不活性化剤を提供すると、その非存在下で生じるであろ
うより、より高い率の部位の改変、例えば相同組換えを提供することが可能であ
る。Ｋｕは、ＤＮＡ不連続点に結合するおよそ７０ｋＤａおよび８０ｋＤａのヘ
テロ二量体であり、そして非相同端連結による二本鎖切断修復に役割を果たす。
「Ｋｕ８０」はまた、「Ｋｕ８６」とも称される可能性がある。

【０１１９】 Ｋｕ不活性化剤は、Ｋｕ発現またはＫｕ活性を阻害することが可能である。好
ましくは、Ｋｕ不活性化剤は、ＫｕまたはＫｕをコードするヌクレオチド配列と
相互作用し、例えばそれと結合し、Ｋｕ発現またはＫｕ活性を阻害する。好まし
くは、Ｋｕ依存非相同端連結が阻害される。Ｋｕ阻害剤はＫｕ７０、Ｋｕ８０ま
たは両方を阻害することが可能である。

【０１２０】 Ｋｕを不活性化するのに使用可能な剤には、抗Ｋｕ抗体およびＫｕ結合分子、
例えばＫｕに結合するランダム生成ペプチド、Ｋｕ結合オリゴマーおよびポリマ
ー、並びにアンチセンスＫｕ核酸分子が含まれる。好ましくは、Ｋｕを不活性化
する剤は、抗Ｋｕ抗体およびＫｕ結合分子などの局所投与可能な剤、例えばＫｕ
に結合するランダム生成ペプチド、およびＫｕ結合オリゴマーまたはポリマーで
ある。

【０１２１】 好ましくは、Ｋｕ不活性化剤は、Ｋｕと相互作用し、例えば結合する。Ｋｕタ
ンパク質と相互作用する剤は、改変部位で、Ｋｕを局所的に不活性化することが
可能である。

【０１２２】 例えば、ＤＮＡ配列および標的とされるＤＮＡにごく近接して、Ｋｕ不活性化
剤を細胞に導入し、そしてそれにより、相同組換え部位で、局所的にＫｕを阻害
する。Ｋｕ不活性化剤は、二本鎖ＤＮＡ配列を含む混合物中で、細胞に導入可能
であるし、ＤＮＡ配列の投与直前または直後に導入可能であるし、あるいはＤＮ
Ａ配列またはＤＮＡ配列と関連するタンパク質、例えばＲａｄ５２またはその断
片に共有結合することが可能である。細胞はまた、抗Ｋｕ抗体またはアンチセン
スＫｕ核酸分子などのＫｕ不活性化剤とプレインキュベーションすることが可能
である。

【０１２３】 抗Ｋｕ抗体 抗Ｋｕ抗体またはその断片を用いて、Ｋｕに結合させ、そしてそれによりＫｕ
活性を減少させることが可能である。抗Ｋｕ抗体は、改変部位で、局所的にＫｕ
と相互作用するが、細胞において一般的にＫｕ発現を阻害しないように、投与す
ることが可能である。抗Ｋｕ抗体には抗Ｋｕ７０および抗Ｋｕ８０抗体が含まれ
る。

【０１２４】 Ｋｕタンパク質、またはその一部もしくは断片を免疫原として使用し、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、Ｋｕに
結合する抗体を生成することが可能である。全長Ｋｕタンパク質が使用可能であ
るし、あるいはＫｕの抗原性ペプチド断片が免疫原として使用可能である。

【０１２５】 典型的には、ＫｕまたはＫｕペプチドを用いて、適切な被験者（例えばウサギ
、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫することによって、抗体を
調製する。適切な免疫原性調製は、例えば、Ｋｕをコードする配列の発現によっ
て、または遺伝子活性化によって得られるＫｕタンパク質、あるいは化学的に合
成されたＫｕペプチドを含むことが可能である。例えば、明白に本明細書にその
全体が援用される、米国特許第５，４６０，９５９号；および係属米国出願ＵＳ
ＳＮ ０８／３３４，７９７；ＵＳＳＮ ０８／２３１，４３９；ＵＳＳＮ ０
８／３３４，４５５；およびＵＳＳＮ ０８／９２８，８８１を参照されたい。
Ｋｕのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が知られ、そして例えばＴａｋｉｇｕｃ
ｈｉら（１９９６） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５（１）：１２９−１３５に記載さ
れている。調製は、フロイントの完全または不完全アジュバントなどのアジュバ
ント、あるいは同様の免疫刺激性剤をさらに含むことが可能である。免疫原性Ｋ
ｕ調製を用いた適切な被験者の免疫は、ポリクローナル抗Ｋｕ抗体反応を誘導す
る。

【０１２６】 抗Ｋｕ抗体またはその断片は、Ｋｕ不活性化剤として使用可能である。抗Ｋｕ
抗体断片の例には、ペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって生成可能
な、Ｆ（ｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂断片が含まれる。用語「
モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書におい
て、Ｋｕの特定のエピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位の１つの
種のみを含む抗体分子集団を指す。したがってモノクローナル抗体組成物は、典
型的には、免疫反応する特定のＫｕタンパク質に対する単一の結合親和性を示す
。

【０１２７】 さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作成可能である、ヒトおよび非ヒト
部分両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの、遺伝的操作法
によって産生された抗Ｋｕ抗体が使用可能である。こうしたキメラおよびヒト化
モノクローナル抗体は、当該技術分野に知られる標準的ＤＮＡ技術、例えばＲｏ
ｂｉｎｓｏｎら、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａら、
欧州特許出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．、欧州特許出願１７
１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公報第ＷＯ ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら、
米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願１２５，０
２３；Ｂｅｔｔｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３， １
９８８；Ｌｉｕら， ＰＮＡＳ ８４ ：３４３９−３４４３， １９８７；Ｌ
ｉｕら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６， １９８７
；Ｓｕｎら， ＰＮＡＳ ８４：２１４−２１８， １９８７；Ｎｉｓｈｉｍｕ
ｒａら， Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５， １９８７；Ｗｏ
ｏｄら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９， １９８５；およびＳｈａ
ｗら， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５
５９， １９８８；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９
：１２０２−１２０７， １９８５；Ｏｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
４：２１４， １９８６；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊ
ｏｎｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５， １９８６；Ｖｅｒｈ
ｏｅｙａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４， １９８８；およびＢｅ
ｉｄｌｅｒら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０， １
９８８に記載される方法を用いた、遺伝子操作によって、産生可能である。

【０１２８】 さらに、標準的技術を用いて、Ｋｕに対して向けられるヒトモノクローナル抗
体が作成可能である。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック
マウスまたは抗体産生ヒト細胞を移植した免疫不全マウスにおいて、生成可能で
ある。こうしたマウスを生成する方法は、例えば、Ｗｏｏｄら、ＰＣＴ公報ＷＯ
９１／００９０６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９１／１
０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／０３９１８；Ｋａｙら、
ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／０３９１７；Ｋａｙら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９３／１２２
２７；Ｋａｙら、ＰＣＴ公報９４／２５５８５；Ｒａｊｅｗｓｋｙら、ＰＣＴ公
報ＷＯ ９４／０４６６７；Ｄｉｔｕｌｌｉｏら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９５／１７
０８５；Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．ら（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５
６−８５９；Ｇｒｅｅｎ， Ｌ．Ｌ．ら（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔ． ７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら（１９９４） Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５
；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら（１９９３） Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３−
４０；Ｃｈｏｉら（１９９３） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ４：１１７−１
２３；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３） ＰＮＡＳ ９０：３７２０−３７２４
；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら（１９９１） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１
３２３−１３２６；Ｄｕｃｈｏｓａｌら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９３／０５７９６；
米国特許第５，４１１，７４９号；ＭｃＣｕｎｅら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４１：１６３２−１６３９、Ｋａｍｅｌ−Ｒｅｉｄら（１９８８） Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４２：１７０６；Ｓｐａｎｏｐｏｕｌｏｕ（１９９４） Ｇｅｎ
ｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８：１０３０−１０４２；Ｓｈｉｎｋａｉ
ら（１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６８に記載される。ヒト抗体−ト
ランスジェニックマウスまたはヒト抗体産生細胞もしくは組織を移植した免疫不
全マウスを、Ｋｕまたは抗原性Ｋｕペプチドで免疫し、そしてその後、これらの
免疫マウス由来の脾臓細胞を用いて、ハイブリドーマを生成することが可能であ
る。ハイブリドーマ産生法は公知である。

【０１２９】 Ｋｕに対するヒトモノクローナル抗体はまた、被験者のリンパ球由来のｍＲＮ
Ａから調製される、免疫グロブリン軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを用いて、Ｆａｂフ
ァージディスプレーライブラリーまたはｓｃＦｖファージディスプレーライブラ
リーなどのコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築することによっ
ても、調製可能である。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９
２／０１０４７；Ｍａｒｋｓら（１９９１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２ ２２ ：５８１−５９７；およびＧｒｉｆｆｔｈｓら（１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ
１２：７２５−７３４を参照されたい。さらに、既知のヒト抗体を突然変異さ
せることによって、抗体可変領域のコンビナトリアルライブラリーが生成可能で
ある。例えば、Ｋｕに結合することが知られるヒト抗体の可変領域を、例えばラ
ンダムに改変された突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、突然変異可変領
域のライブラリーを生成することによって、突然変異させ、これをその後、Ｋｕ
に結合するかスクリーニングすることが可能である。免疫グロブリン重鎖および
／または軽鎖のＣＤＲ領域内にランダム突然変異誘発を誘導する方法、ランダム
化した重鎖および軽鎖を組み合わせて、対形成およびスクリーニング法を形成す
る方法は、例えばＢａｒｂａｓら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９６／０７７５４；Ｂａｒ
ｂａｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８９：４４５７−４４６１に見出すことが可能である。

【０１３０】 免疫グロブリンライブラリーは、好ましくは繊維状ファージ由来の、ディスプ
レーパッケージ集団によって発現させ、抗体ディスプレーライブラリーを形成す
ることが可能である。抗体ディスプレーライブラリーを生成するのに特に使用し
やすい方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３
，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、
ＰＣＴ公報ＷＯ ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／
２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／１５６７９；Ｂｒｅ
ｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら
、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９
２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９０／０２８０９；Ｆｕｃ
ｈｓら（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２
；Ｈａｙら（１９９２） Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３ ：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−
１２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓら（１９９３） 上記；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９
２） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（
１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）
ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１） Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１
９９１） Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７；およびＢａ
ｒｂａｓら（１９９１） ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２に見出すことが
可能である。ディスプレーパッケージ（例えば繊維状ファージ）表面上にディス
プレーしたら、抗体ライブラリーをスクリーニングし、Ｋｕに結合する抗体を発
現するパッケージを同定し、そして単離する。好ましい態様において、ライブラ
リーの一次スクリーニングは、固定Ｋｕを用いてパニングすることを伴い、そし
て固定Ｋｕに結合する抗体を発現するディスプレーパッケージを選択する。

【０１３１】 Ｋｕに対するモノクローナル抗体はまた、例えばＮｅｏｍａｒｋｅｒｓ（カリ
フォルニア州フレモント）からも商業的に入手可能である。 Ｋｕ結合分子 Ｋｕ結合ペプチド、例えばランダム生成ペプチド、およびＫｕ結合オリゴマー
またはポリマーなどのＫｕに結合する分子は、Ｋｕ不活性化剤として、使用可能
である。こうした分子は、Ｋｕタンパク質に結合し、そして非相同端連結などの
Ｋｕの少なくとも１つの活性を阻害することが可能である。

【０１３２】 Ｋｕ結合オリゴマーの例は、その内容が本明細書に援用されるＷＯ ９９／３
３９７１に示される。こうしたオリゴマーは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似
体（ａｎａｌｏｇ）、または組み合わせで構成可能である。好ましくは、オリゴ
マーはリボヌクレオチドで構成される。これらのＫｕオリゴマーを用いて、Ｋｕ
に結合させるか、またはＫｕと相互作用するタンパク質を同定することが可能で
ある。これらのオリゴマーを用いてＫｕ結合ペプチドを同定する方法は、ＷＯ
９９／３３９７１に記載される。

【０１３３】 さらに、ランダム生成ペプチドを、Ｋｕに結合する能力に関してスクリーニン
グすることが可能である。例えば、生成された突然変異遺伝子産物をスクリーニ
ングする多様な技術が当該技術分野に知られる。大きな遺伝子ライブラリーをス
クリーニングする技術は、しばしば、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクタ
ー内にクローニングし、生じたベクターライブラリーで、適切な細胞を形質転換
し、そして望ましい活性、例えばＫｕへの結合の検出が、その産物を検出する遺
伝子をコードするベクターの、比較的容易な単離を促進する条件下で、遺伝子を
発現させることを含む。以下に記載される技術の各々は、例えばランダム突然変
異誘発技術によって、生成された多数の配列をスクリーニングするための高処理
解析に受け入れられる。

【０１３４】 ディスプレーライブラリー Ｋｕ結合ペプチドをスクリーニングする別のアプローチにおいて、候補ペプチ
ドを細胞またはウイルス粒子表面上にディスプレーし、そして特定の細胞または
ウイルス粒子が、ディスプレーされた産物を介してＫｕタンパク質に結合する能
力を、「パニングアッセイ」で検出する。例えば、遺伝子ライブラリーを、細菌
細胞の表面膜タンパク質の遺伝子内にクローニングし、そして生じた融合タンパ
ク質をパニングによって検出することが可能である（Ｌａｄｎｅｒら、ＷＯ ８
８／０６６３０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
９：１３７０−１３７１；およびＧｏｗａｒｄら（１９９２） ＴＩＢＳ １８
：１３６−１４０）。同様の方式で、検出可能標識リガンドを用いて、潜在的に
機能するペプチド相同体に関してスコア付けが可能である。蛍光標識リガンドを
用いて、リガンド結合活性を保持する相同体を検出可能である。蛍光標識リガン
ドを使用すると、蛍光顕微鏡下で、細胞を視覚的に検査し、そして分離すること
が可能になるか、または細胞の形態が許す場合、蛍光活性化細胞分取によって、
分離することが可能になる。

【０１３５】 遺伝子ライブラリーは、ウイルス粒子表面上の融合タンパク質として発現させ
ることが可能である。例えば、繊維状ファージ系において、異質の（ｆｏｒｅｉ
ｇｎ）ペプチド配列を感染性ファージの表面上に発現させ、それにより２つの有
意な利点を与えることが可能である。まず、これらのファージは、１ミリリット
ルあたり、１０¹³ファージをはるかに越える濃度で、アフィニティーマトリック
スに適用可能であるため、多数のファージを一度にスクリーニングすることが可
能である。第二に、各感染性ファージは、その表面上に遺伝子産物をディスプレ
ーするため、特定のファージが低収量でアフィニティーマトリックスから回収さ
れたら、別の感染周期によって、そのファージを増幅することが可能である。ほ
ぼ同一の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）繊維状ファージ、Ｍ１３、ｆｄ、およびｆ１
の群が、ファージディスプレーライブラリーにおいて、最も頻繁に用いられる。
ファージｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩコートタンパク質いずれかを用いて、ウイル
ス粒子の最終的なパッケージングを乱すことなく、融合タンパク質を生成するこ
とが可能である。異質のエピトープをｐＩＩＩのＮＨ₂末端で発現させ、そして
こうしたエピトープを持つファージを、このエピトープを欠く多量の過剰なファ
ージから回収することが可能である（Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９０／
０２９０９；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／０９６９０；Ｍａｒｋ
ｓら（１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１６００７−１６
０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７
３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２
８；およびＢａｒｂａｓら（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：４４５７−４４６１
）。

【０１３６】 一般的なアプローチは、大腸菌のマルトース受容体（外膜タンパク質、Ｌａｍ
Ｂ）を、ペプチド融合パートナーとして用いる（Ｃｈａｒｂｉｔら（１９８６）
ＥＭＢＯ ５， ３０２９−３０３７）。ＬａｍＢ遺伝子をコードするプラス
ミドにオリゴヌクレオチドを挿入し、タンパク質の細胞外ループの１つに融合さ
せたペプチドを産生しておく。これらのペプチドは、リガンド、例えば抗体への
結合に利用可能であり、そして細胞を動物に投与する際、免疫反応を引き出すこ
とが可能である。他の細胞表面タンパク質、例えばＯｍｐＡ（Ｓｃｈｏｒｒら（
１９９１） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９１， ｐｐ．３８７−３９２），ＰｈｏＥ（
Ａｇｔｅｒｂｅｒｇら（１９９０） Ｇｅｎｅ ８８， ３７−４５）、および
ＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓら（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ９， １３６９−１３
７２）と共に、巨大細菌表面構造が、ペプチドディスプレー用のビヒクルとして
、利用されてきている。重合して、遺伝子情報の細菌間交換のための繊毛−導管
を形成するタンパク質であるピリンに、ペプチドを融合させてもよい（Ｔｈｉｒ
ｙら（１９８９） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５
５， ９８４−９９３）。他の細胞と相互作用する際の役割のため、繊毛は、細
胞外環境へのペプチドの提示に有用な支持体を提供する。ペプチドディスプレー
に用いられる別の巨大表面構造は、細菌輸送器官、鞭毛である。サブユニットタ
ンパク質、フラジェリンへのペプチドの融合は、宿主細胞上に多くのペプチドコ
ピーの高密度アレイを提供する（Ｋｕｗａｊｉｍａら（１９８８） Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈ． ６， １０８０−１０８３）。他の細菌種の表面タンパク質もまた、
ペプチド融合パートナーとして利用されてきている。例には、スタフィロコッカ
ス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡおよびナイセリア属（Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ）の外膜プロテアーゼＩｇＡが含まれる（Ｈａｎｓｓｏｎら（１
９９２） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４， ４２３９−４２４５および
Ｋｌａｕｓｅｒら（１９９０） ＥＭＢＯ Ｊ． ９， １９９１−１９９９）
。

【０１３７】 上述の繊維状ファージ系およびＬａｍＢ系において、ペプチドおよびそのコー
ドＤＮＡ間の物理的連結は、その表面上にペプチドを所持する粒子（細胞または
ファージ）内にＤＮＡを包含することによって起こる。ペプチド捕捉は、粒子お
よび内部のＤＮＡを捕捉する。別の計画は、ＤＮＡ結合タンパク質、ＬａｃＩを
用いて、ペプチドおよびＤＮＡ間の連結を形成する（Ｃｕｌｌら（１９９２）
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）。この系は、３’端にオリゴヌ
クレオチドクローニング部位を持つＬａｃＩ遺伝子を含むプラスミドを用いる。
アラビノースによる調節誘導下、ＬａｃＩペプチド融合タンパク質を産生する。
この融合は、ＬａｃＩがＬａｃＯオペレーター（ＬａｃＯ）として知られる短い
ＤＮＡ配列に結合する天然の能力を保持する。発現プラスミド上に２コピーのＬ
ａｃＯを備えることによって、ＬａｃＩ−ペプチド融合体は、これをコードする
プラスミドに緊密に結合する。各細胞内のプラスミドは、単一のオリゴヌクレオ
チド配列のみを含み、そして各細胞は、単一のペプチド配列のみを発現するため
、ペプチドは、その合成を指示するＤＮＡ配列と特異的にそして安定に会合する
。ライブラリーの細胞を穏やかに溶解し、そしてペプチド−ＤＮＡ複合体を固定
受容体のマトリックスに曝露し、活性ペプチドを含む複合体を回収する。その後
、会合プラスミドＤＮＡを、増幅のため、再度、細胞に導入し、そしてＤＮＡを
配列決定して、ペプチドリガンドの同一性を決定する。方法の実際的な有用性の
立証として、ドデカペプチドの大きなランダムライブラリーを作成し、そしてオ
ピオイドペプチド、ダイノルフィンＢに対して作成されたモノクローナル抗体上
で選択した。すべてダイノルフィンＢの６残基部分に対応するコンセンサス配列
によって関連する、ペプチドのコホートを回収した（Ｃｕｌｌら（１９９２）
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９−１８６
９）。

【０１３８】 この計画は、時に、ペプチド−オン−プラスミドと称され、ファージディスプ
レー法とは、２つの重要な点で異なる。まず、ペプチドは、融合タンパク質のＣ
末端に付着し、未結合（ｆｒｅｅ）カルボキシ末端を有するペプチドとして、ラ
イブラリーメンバーのディスプレーを生じる。繊維状ファージコートタンパク質
、ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩはどちらも、そのＣ末端を通じてファージに係留さ
れ；そして外側に伸長するＮ末端ドメイン内に、ゲストペプチドが置かれる。い
くつかの設計では、ファージにディスプレーされるペプチドは、融合タンパク質
のちょうどアミノ末端で提示される（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０） Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７， ６３７８−６３
８２）。第二の相違は、ライブラリーに実際存在するペプチド集団に影響を与え
る、一組の生物学的バイアスである。ＬａｃＩ融合分子は、宿主細胞の細胞質に
制限される。ファージコート融合体は、翻訳中に短時間、細胞質に曝露されるが
、内膜を通じて周辺質区画に迅速に分泌され、Ｃ末端疎水性ドメインによって膜
に係留されたまま、ペプチドを含むＮ末端は、ファージ粒子への組み立てを待つ
間、周辺質に突出している。ＬａｃＩおよびファージライブラリー中のペプチド
は、異なるタンパク質分解活性への曝露の結果、有意に異なる可能性がある。フ
ァージコートタンパク質は、ファージへの取り込みの序幕として、内膜を渡る輸
送およびシグナルペプチダーゼプロセシングを必要とする。特定のペプチドは、
これらの過程に有害な影響を発揮し、そしてライブラリー中で過少提示される（
Ｇａｌｌｏｐら（１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７（９）：１２
３３−１２５１）。これらの特定のバイアスは、ＬａｃＩディスプレー系の要因
ではない。

【０１３９】 組換えランダムライブラリーに利用可能な小ペプチドの数は莫大である。１０ ⁷ −１０⁹の独立クローンのライブラリーが日常的に調製される。１０¹¹組換え体
と同程度の大きさのライブラリーが生成されてきているが、この大きさは、クロ
ーンライブラリーの実際的な限界に近づいている。ライブラリーサイズのこの限
界は、ランダム化部分を含むＤＮＡを宿主細菌細胞に形質転換する工程で起こる
。この限界を回避するため、ポリソーム複合体中の新生ペプチドのディスプレー
に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ系が最近、開発されてきている。このディスプレーラ
イブラリー法は、現在利用可能なファージ／ファージミドまたはプラスミドライ
ブラリーより、３−６桁大きいライブラリーを産生する可能性を有する。さらに
、ライブラリーの構築、ペプチドの発現、およびスクリーニングは、完全に細胞
不含形式で行う。

【０１４０】 この方法の１つの適用において（Ｇａｌｌｏｐら（１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ
． Ｃｈｅｍ． ３７（９）：１２３３−１２５１）、１０¹²デカペプチドをコ
ードする分子ＤＮＡライブラリーを構築し、そして大腸菌Ｓ３０で発現したライ
ブラリーを、転写／翻訳系とｉｎ ｖｉｔｒｏカップリングした。リボソームを
ｍＲＮＡ上に引き止めるように条件を選択し、かなりの割合のＲＮＡをポリソー
ム中に集積させ、そしてコードＲＮＡにまだ連結している新生ペプチドを含む複
合体を生じた。ポリソームは、より慣用的な組換えペプチドディスプレーライブ
ラリーをスクリーニングするのとほとんど同じ方式で、固定受容体上でアフィニ
ティー精製するのに十分に丈夫である。結合複合体由来のＲＮＡを回収し、ｃＤ
ＮＡに変換し、そしてＰＣＲによって増幅して、合成およびスクリーニングの次
の周期のテンプレートを生じる。ポリソームディスプレー法をファージディスプ
レー系とカップリングしてもよい。数周期のスクリーニング後、ポリソームの濃
縮プール由来のｃＤＮＡを、ファージミドベクターにクローニングした。このベ
クターは、コートタンパク質に融合したペプチドをディスプレーするペプチド発
現ベクターとして、そしてまたペプチド同定のためのＤＮＡ配列決定ベクターと
して、役立つ。ファージ上でポリソーム由来ペプチドを発現させることによって
、この形式の親和性選択法を続けることが可能であるし、あるいはファージＥＬ
ＩＳＡにおける結合活性に関して、または完成ファージＥＬＩＳＡ（Ｂａｒｒｅ
ｔら（１９９２） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０４， ３５７−３６４）
における結合特異性に関して、個々のクローン上のペプチドをアッセイすること
が可能である。活性ペプチドの配列を同定するため、ファージミド宿主によって
産生されたＤＮＡを配列決定する。

【０１４１】 アンチセンスＫｕ核酸配列 Ｋｕをコードするヌクレオチドに対してアンチセンスである核酸分子は、Ｋｕ
発現を阻害する不活性化剤として使用可能である。「アンチセンス」核酸には、
Ｋｕをコードする「センス」核酸に相補的である、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子の
コード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である、ヌクレオチド配
列が含まれる。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成
することが可能である。アンチセンス核酸は、全Ｋｕコード鎖に相補的であって
もよいし、またはその部分だけに相補的であってもよい。例えば、Ｋｕをコード
するヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」にアンチセンスであるアンチ
センス核酸分子が使用可能である。

【０１４２】 Ｋｕをコードするコード鎖配列が、例えば、Ｔａｋｉｇｕｃｈｉら（１９９６
） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５（１）：１２９−１３５およびＧｅｎｂａｎｋ寄託
番号Ｌ３５９３２に開示されることを考慮し、ワトソンおよびクリック塩基対形
成の規則にしたがって、アンチセンス核酸を設計することが可能である。アンチ
センス核酸分子は、Ｋｕ ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であってもよいが、
より好ましくは、Ｋｕ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の部分に対しての
みアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、Ｋｕ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り巻く領域に相補的であっ
てもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５
、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであってもよい
。アンチセンス核酸は、当該技術分野に知られる方法を用いた、化学合成および
酵素連結を用いて、構築可能である。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチ
センスオリゴヌクレオチド）は、天然存在ヌクレオチドを用いて、あるいは分子
の生物学的安定性を増加させるか、またはアンチセンスおよびセンス核酸間に形
成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計した、多様な修飾ヌクレ
オチドを用いて、化学的に合成可能であり、例えばホスホロチオエート誘導体お
よびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。アンチセンス核酸を生成す
るのに使用可能な修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロ
モウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサ
ンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル
、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチ
ルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシ
ン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチ
ルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグア
ニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチル
グアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−
チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメ
チルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル
アデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラ
シル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオ
ウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸
メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラ
シル、３−（３−アミノー３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃ
ｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。あるいは、アンチセンス
核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを
用いて、生物学的に産生可能である（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡ
は、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のものであろう）。

【０１４３】 外因性ＤＮＡ配列 細胞に提供しようとする、例えば導入しようとするＤＮＡ配列は、細胞におい
て、標的配列を改変させることが可能である。例えば、１０、８、５、４、３、
２未満、または１ヌクレオチド、例えば置換、欠失、または挿入により、標的Ｄ
ＮＡと異なる、選択されるＤＮＡ配列を導入することが可能である。選択される
ＤＮＡ配列はまた、１より多いヌクレオチド、標的配列と異なってもよく、例え
ば選択されるＤＮＡ配列が、非対領域、例えばループアウト領域を有するよう、
いくつかのヌクレオチド、標的配列と異なる。これらの改変は、標的配列発現を
修飾することが可能である。修飾される配列発現は：細胞において、通常サイレ
ントである（発現されない）配列、例えばコードＤＮＡ配列、例えば細胞に通常
見られるコード配列を活性化し；細胞において、正常レベルより低く発現される
配列、例えばコードＤＮＡ配列、例えば細胞に通常見られるコード配列の発現を
増加させ；細胞において、通常、欠損型で発現される配列、例えばコードＤＮＡ
配列、例えば細胞に通常見られるコード配列を発現させ；細胞の通常のパターン
と異なるように、配列、例えばコードＤＮＡ配列、例えば細胞に通常見られるコ
ード配列の制御または誘導パターンを変化させ；配列、例えばコードＤＮＡ配列
、例えば細胞に通常見られるコード配列の発現を、細胞における通常の発現レベ
ルより減少させることを含む。

【０１４４】 １０、８、５、４、３、２未満、または１ヌクレオチド、例えば置換、欠失、
または挿入により、標的ＤＮＡと異なる、選択されるＤＮＡ配列を導入すること
が可能である。例えば、標的とされる配列は、野生型配列と、１０、８、５、４
、３、２未満、または１ヌクレオチド、異なる可能性がある。好ましくは、標的
とされる配列は、点突然変異、例えば挿入、欠失または置換から生じる突然変異
により、野生型配列と異なる。好ましくは、標的配列、例えば遺伝子中の突然変
異は、疾患または機能障害に関連し、例えば該疾患または機能障害を調節する。
突然変異、例えば点突然変異が、疾患または機能障害に関連付けられている遺伝
子の例には、限定されるわけではないが、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴ
Ｒ）遺伝子、β−グロビン遺伝子、因子ＶＩＩＩ遺伝子、因子ＩＸ遺伝子、フォ
ンウィルブランド因子遺伝子、色素性乾皮症グループＧ（ＸＰ−Ｇ）遺伝子が含
まれる。標的配列を改変させるため、選択されるＤＮＡ配列は、突然変異を訂正
することが可能な正常野生型配列を含んでもよい。本明細書に記載される方法に
したがって改変可能な、いくつかの遺伝子障害および遺伝子がある。

【０１４５】 別の側面において、選択されるＤＮＡ配列はまた、１より多いヌクレオチド、
標的配列と異なってもよく、例えば選択されるＤＮＡ配列が、非対領域、例えば
ループアウト領域を有するよう、いくつかのヌクレオチド、標的配列と異なる。
例えば、選択されるＤＮＡ配列は、標的のあらかじめ選択される要素と相同組換
えされることが可能であり、例えば一方が制御要素であり、そして他方がタンパ
ク質をコードする配列である場合、制御要素が、タンパク質コード配列の発現を
制御する。選択されるＤＮＡ配列は、制御配列、例えば外因性制御配列であって
もよい。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ＵＡＳ、足場付着領域およ
び転写因子結合部位を含む。さらに、選択されるＤＮＡ配列はまた、エクソン、
イントロン、ＣＡＰ部位、ヌクレオチド配列ＡＴＧ、マーカー、例えば選択マー
カー、スプライス−ドナー部位および／または標的配列とインフレームのコード
ＤＮＡも含むことが可能である。選択されるＤＮＡ配列はまた、コード領域、例
えばタンパク質をコードするＤＮＡ配列も含むことが可能である。

【０１４６】 コード配列が内因性であってもよく、例えば選択されるＤＮＡ配列は制御配列
であるか、または選択されるＤＮＡ配列がコード領域を含んでもよく、すなわち
コード領域は外因性である。コード領域は、多様なタンパク質をコードしていて
もよい。こうしたタンパク質の例には：エリスロポエチン、カルシトニン、成長
ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺
ホルモン、α２−インターフェロン（ＩＦＮＡ２）、β−インターフェロン、γ
−インターフェロン、神経増殖因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、
グルカゴン、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン
１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン６、インター
ロイキン１１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球（ＧＣＳＦ）、ＣＳＦ−
マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性
抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジ
スムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、アンチトロンビ
ンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血
液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ
、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタ
ンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−２受容体、
ＩＬ−２アンタゴニスト類、α−１−アンチトリプシン、免疫反応修飾剤類、β
−グルコセラミダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコ
サミン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル
補酵素Ａ：α−グルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダ
ーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、および可溶性ＣＤ４
が含まれる。これらのタンパク質をコードする配列は既知である。

【０１４７】 用語、外因性は、本明細書に記載される方法によって、細胞に導入される配列
を指す。外因性配列は、細胞に存在する内因性配列と同一の配列または異なる配
列を有することが可能である。

【０１４８】 好ましくは、ＤＮＡ配列は直鎖配列である。 ターゲッティング配列または配列類 ターゲッティング配列または配列類は、標的とされる配列、例えば標的とされ
る遺伝子を含む細胞のゲノム内への相同組換えを可能にするＤＮＡ配列である。
用語「ターゲッティング配列」および「隣接配列」は、本明細書において、交換
可能に用いられる。ターゲッティング配列は、一般的に、得られるような細胞ゲ
ノムに通常存在するＤＮＡ配列に相同である（すなわち細胞ＤＮＡに同一である
か、またはターゲッティング配列および細胞ＤＮＡが相同組換えを経ることが可
能であるように十分に類似である）ＤＮＡ配列である。例えば、ターゲッティン
グ配列は：コードまたは非コードＤＮＡ、目的の遺伝子の転写開始部位上流にあ
る配列、目的の遺伝子内にある配列、または目的の遺伝子の転写停止部位の下流
にある配列、あるいは先の修飾を通じてゲノムに存在する配列に、十分に相同で
あってもよい。用いるターゲッティング配列または配列類は、選択されるＤＮＡ
配列を挿入しようとする部位または標的とされる配列を改変しようとする部位に
照合して選択する。

【０１４９】 １以上のターゲッティング配列が使用可能である。好ましくは、選択されるＤ
ＮＡ配列には、２つのターゲッティング配列が隣接する。ターゲッティング配列
は、遺伝子またはコード配列内に（エクソンおよび／またはイントロンの配列な
ど）、遺伝子のコード配列にすぐ隣接して（例えばターゲッティング配列および
遺伝子のコード領域間に１０、５、４、３、２、１未満のヌクレオチドを含み、
またはさらなるヌクレオチドをまったく含まず）、遺伝子のコード配列上流に（
上流非コード領域の配列または内因性プロモーター配列など）、または遺伝子の
コード配列の上流でそして少し離れて（内因性プロモーターの上流の配列など）
存在してもよい。ターゲッティング配列または配列類は、現在知られるかまたは
配列決定された、標的とされる配列の領域、および／または構造的に性質決定さ
れていないが、当業者によって、制限酵素を用いてマッピングし、そして決定す
ることが可能な、さらに上流の領域を含むことが可能である。

【０１５０】 ターゲッティング配列を用いて、内因性遺伝子のコード配列にすぐ隣接して、
その上流に、またはかなり離れて、制御配列を含むＤＮＡ配列を挿入することが
可能である。あるいはまたはさらに、産生されるＲＮＡまたはタンパク質の構造
または安定性に影響を与える配列を、ターゲッティングによって、置換するか、
除去するか、付加するか、または別の方式で修飾することが可能である。例えば
、ＲＮＡ分子のＲＮＡ安定性要素、スプライス部位、および／またはリーダー配
列を修飾し、ＲＮＡ分子の機能、安定性、および／または翻訳可能性を改善する
かまたは改変することが可能である。タンパク質の輸送、分泌、または機能特性
を増進するかまたは修飾するため、シグナル配列、プロペプチド配列、活性部位
、および／または構造配列などのタンパク質配列もまた、改変することが可能で
ある。タンパク質配列はまた、突然変異、例えば点突然変異を含むタンパク質を
コードする遺伝子における部位を標的とすることによっても、改変、例えば訂正
可能である。

【０１５１】 １つの側面において、ターゲッティング配列は、ヒト卵胞刺激ホルモンβ（Ｆ
ＳＨβ）の部分に相同であってもよい。ＦＳＨは、正常な生殖生理において、卵
母細胞および精子の維持および発生に必須の役割を果たす性腺刺激ホルモンであ
る。ＦＳＨは２つのサブユニット、αおよびβを含み、後者は、ＦＳＨの生物学
的特異性に関与している。既定のターゲッティング配列が相同である標的部位は
、ＦＳＨβ遺伝子のエクソンおよび／またはイントロン内に、ＦＳＨβコード領
域の上流にそしてすぐ隣接して、またはＦＳＨβコード領域の上流にそして少し
離れて存在していてもよい。例えば、２つのターゲッティング配列の第一のもの
（または構築物中に１つのターゲッティング配列しかない場合、全ターゲッティ
ング配列）は、ＦＳＨβコード配列の上流のゲノム領域由来であってもよい。例
えば、このターゲッティング配列は、配列番号１の部分、例えば位−７，４５４
から−１，４１７（配列番号２）または位−６９６から−１５５（配列番号３）
に対応する配列由来の少なくとも２０、３０、５０、１００、または１０００の
連続するヌクレオチドを含んでもよい。２つのターゲッティング配列の第二のも
のは、コード配列上流のゲノム領域を標的としてもよいし（例えば、やはり配列
番号２または３の部分を含んでもよい）、あるいは遺伝子のエクソンまたはイン
トロンを標的としてもよい。ＦＳＨβを標的とするのに使用可能な配列は、その
内容が完全に本明細書に援用される、米国特許出願第０９／３０５，６３９号に
さらに記載される。

【０１５２】 ターゲッティング配列は、ヒトインターフェロン−α２（ＩＦＮα２）の部分
に相同であってもよい。インターフェロン−αは、染色体９の短腕にクラスター
を形成する１４の遺伝子を含む複雑な遺伝子ファミリーを構成する。ＩＦＮα２
遺伝子を含む、これらの遺伝子のいずれも、イントロンを持たない。インターフ
ェロン−αは、マクロファージ、Ｔ細胞およびＢ細胞と共に、多くの他の細胞種
によって産生される。インターフェロン−αは、かなりの抗ウイルス効果を有し
、そしてパピローマウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス、ワクシニア、単純
疱疹ウイルス、帯状水痘疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｚｏｓｔｅｒ ｖａｒｉ
ｃｅｌｌｏｓｕｓ ｖｉｒｕｓ）およびライノウイルスによる感染を治療するの
に有効であることが示されてきている。

【０１５３】 既定のターゲッティング配列が相同である標的部位は、ＩＦＮα２遺伝子のコ
ード領域内に、コード領域の上流にそしてすぐ隣接して、またはコード領域の上
流にそして少し離れて存在していてもよい。例えば、２つのターゲッティング配
列の第一のもの（または構築物中に１つのターゲッティング配列しかない場合、
全ターゲッティング配列）は、ＩＦＮα２コード配列の上流のゲノム領域由来で
あってもよい。例えば、このターゲッティング配列は、ＩＦＮα２遺伝子のヌク
レオチド−４０７４から−５１１に対応する、配列番号４の部分（例えば少なく
とも２０、５０、１００または１０００の連続するヌクレオチド）を含んでもよ
い。２つのターゲッティング配列の第二のものは、コード配列自体の上流のゲノ
ム領域を標識としてもよい。例えば、第二のターゲッティング配列は、その３’
端に、ＩＦＮα２コード配列の最初の数コドンに同一の外因性コード領域を含ん
でもよい。相同組換えに際して、外因性コード領域を、内因性ＩＦＮα２コード
配列の標的とされる部分と組み換える。ＩＦＮα２を標的とするのに使用可能な
配列は、その内容が完全に本明細書に援用される、米国特許出願第０９／３０５
，６３８号にさらに記載される。

【０１５４】 別の側面において、ターゲッティング配列は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（
ＧＣＳＦ）の部分に相同であってもよい。ＧＣＳＦは、好中球／顆粒球細胞系譜
に関係付けられる造血前駆細胞の増殖および分化を刺激するサイトカインである
。ＧＣＳＦは、化学療法が誘導する好中球減少の予防に、そして骨髄移植と関連
して、日常的に用いられる。慢性特発性および先天性好中球減少障害もまた、Ｇ
ＣＳＦ注射後、改善を示す。既定のターゲッティング配列が相同である標的部位
は、ＧＣＳＦ遺伝子のエクソンおよび／またはイントロン内に、ＧＣＳＦコード
領域の上流にそしてすぐ隣接して、またはＧＣＳＦコード領域の上流にそして少
し離れて存在していてもよい。

【０１５５】 例えば、構築物中の２つのターゲッティング配列の第一のもの（または構築物
中に１つのターゲッティング配列しかない場合、全ターゲッティング配列）は、
ＧＣＳＦコード配列の上流のゲノム領域由来であってもよい。例えば、このター
ゲッティング配列は、ヒトＧＣＳＦ遺伝子のヌクレオチド−６，５７８から１０
１に対応する、配列番号５の部分（例えば位−６，５７８から−３６４（配列番
号６）に対応する配列由来の少なくとも２０、５０、１００、または１０００の
連続するヌクレオチド）を含んでもよい。構築物中の２つのターゲッティング配
列の第二のものは、コード配列上流のゲノム領域を標的としてもよいし（例えば
、やはり配列番号６の部分を含んでもよい）、あるいは遺伝子のエクソンまたは
イントロンを標的としてもよい。ＧＣＳＦを標的とするのに使用可能な配列は、
その内容が完全に本明細書に援用される、米国特許出願第０９／３０５，３８４
号にさらに記載される。

【０１５６】 制御配列 ＤＮＡ配列は制御配列を含むことが可能である。制御配列は、１以上のプロモ
ーター（構成または誘導性プロモーター）、エンハンサー、ＵＡＳ、足場付着領
域またはマトリックス付着部位、陰性制御要素、転写因子結合部位、またはこれ
らの配列の組み合わせを含んでもよい。

【０１５７】 制御配列は、産生される際、または個体に導入される際、細胞が、産物を発現
するよう誘導可能であるように、誘導性プロモーターを含むことが可能であり、
例えば細胞は該産物を発現しないが、発現するように誘導することが可能である
。制御配列は、制御配列の導入に際して、産物が発現されるように、誘導性プロ
モーターを含むことが可能である。制御配列は、細胞性またはウイルス配列であ
ってもよい。こうした制御配列には、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期
または後期遺伝子、アデノウイルス主要後期遺伝子、マウスメタロチオネイン−
Ｉ遺伝子、伸長因子−１α遺伝子、サイトメガロウイルス遺伝子、コラーゲン遺
伝子、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、γアクチン遺伝子、転写活性化
因子ＹＹ１遺伝子、フィブロネクチン遺伝子、またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクター
ゼ遺伝子の発現を制御するものが含まれる。制御配列は、ＴＡＴＡボックス、Ｃ
ＣＡＡＴボックス、ＡＰ１、Ｓｐ１またはＮＦ−κＢ結合部位などの転写因子結
合部位を、さらに含むことが可能である。

【０１５８】 さらなるＤＮＡ配列要素 ＤＮＡ配列はさらに、１以上のエクソンを含むことが可能である。エクソンは
、ＲＮＡにコピーされ、そして成熟ｍＲＮＡ分子に存在するＤＮＡ配列である。
エクソンは、１以上のアミノ酸をコードし、そして／またはアミノ酸を部分的に
コードする（すなわちコドンの１または２塩基）ＤＮＡを含むことが可能である
。あるいは、エクソンは、非コード領域、例えば５’非コード領域に対応するＤ
ＮＡを含む。外因性エクソンまたはエクソン類が１以上のアミノ酸および／また
はアミノ酸の部分をコードする場合、ＤＮＡ配列は、転写およびスプライシング
に際して、読み枠が第二のエクソンまたは標的とされる遺伝子のコード領域とイ
ンフレームであるように、設計することが可能である。本明細書において、イン
フレームは、第一のエクソンおよび第二のエクソンのコード配列が、融合した際
、第二のエクソンに由来するｍＲＮＡの部分の適切な読み枠を変化させない方式
で、共にヌクレオチドに連結されることを意味する。

【０１５９】 標的とされる遺伝子の第一のエクソンが、翻訳を開始する配列ＡＴＧを含むな
らば、外因性エクソンは、好ましくはＡＴＧを含む。さらに、ＡＴＧを含む外因
性エクソンは、第二のエクソンおよび標的とされる遺伝子の続くエクソンを含む
ｍＲＮＡの生じたコード領域がインフレームであるように、１以上のヌクレオチ
ドをさらに含んでもよい。第一のエクソンがＡＴＧを含む、こうした標的とされ
る遺伝子の例には、ヒトエリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、ヒトコロニー刺
激因子−顆粒球／マクロファージ（ｈＧＭ−ＣＳＦ）、およびヒトコロニー刺激
因子−顆粒球（ｈＧ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子が含まれる。

【０１６０】 スプライス−ドナー部位は、１つのエクソンから別のエクソンへのスプライシ
ングを指示する配列である。典型的には、第一のエクソンは、第二のエクソンの
５’にあり、そして第一のエクソンの３’側で、第一のエクソンと重複し、そし
て隣接するスプライス−ドナー部位が、第二のエクソンの５’側にある第二のエ
クソンに隣接するスプライス−アクセプター部位を認識する。スプライス−ドナ
ー部位は：第四および第五位にあるＧＵが必要とされる、（Ａ／Ｃ）ＡＧ ＧＵ
ＲＡＧＵ（Ｒはプリンヌクレオチドを示す）と示される特徴的なコンセンサス配
列を有する可能性がある（Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３７１５−３７９８）。スプライス−ドナーコンセン
サス部位の最初の３塩基は、エクソンの最後の３塩基である。スプライス−ドナ
ー部位は、ｍＲＮＡスプライシング経路内で、適切な反応を達成する能力によっ
て、機能的に定義可能である。

【０１６１】 非対スプライス−ドナー部位は、標的とされる配列に存在し、そしてＤＮＡ配
列において、非対スプライス−ドナー部位の３’に配置されるスプライス−アク
セプター部位が付随していない、スプライス−ドナー部位である。非対スプライ
ス−ドナー部位は、内因性スプライス−アクセプター部位へのスプライシングを
生じることが可能である。

【０１６２】 スプライス−アクセプター部位は、スプライス−ドナー部位同様、１つのエク
ソンから別のエクソンへのスプライシングを指示する配列である。スプライシン
グ装置は、スプライス−ドナー部位と組み合わせて作用し、スプライス−アクセ
プター部位を用いて、イントロンの除去を達成する。スプライス−アクセプター
部位は：ＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＮＹＡＧ、ここでＹはピリミジンいずれかを示し
、そしてＮはヌクレオチドいずれかを示す、として示される特徴的な配列を有す
る可能性がある（Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ． １９：３７１５−３７９８）。

【０１６３】 イントロンは、２つのエクソン間にあり、そしてｍＲＮＡ分子の形成に際して
、前駆体ＲＮＡ分子から、スプライシングによって除去される、１以上のヌクレ
オチドの配列として定義される。

【０１６４】 制御配列は、翻訳を開始するため、ＡＴＧ開始コドンに連結することが可能で
ある。所望により、ＣＡＰ部位（制御領域と関連し、そして該領域に利用される
、特定のｍＲＮＡ開始部位）を制御配列およびＡＴＧ開始コドンに連結すること
が可能である。あるいは、制御配列に関連し、そして該配列に利用されるＣＡＰ
部位は、標的配列に含まれず、そして転写装置が新規ＣＡＰ部位を提供する。Ｃ
ＡＰ部位は、通常、ＴＡＴＡボックスのおよそ２５ヌクレオチド３’に見出すこ
とが可能である。スプライス−ドナー部位は、ＡＴＧにすぐ隣接して、例えば標
的とされる遺伝子の第二のエクソンとインフレームであるために、外因性エクソ
ンに、１以上のヌクレオチドの存在が必要とされない箇所に配置可能である。標
的とされる遺伝子のコード配列とインフレームである、１以上のアミノ酸または
アミノ酸の部分をコードするＤＮＡは、ＡＴＧの３’側にすぐ隣接して配置して
もよい。こうしたものとして、スプライス−ドナー部位は、コードＤＮＡの３’
側にすぐ隣接して配置してもよい。

【０１６５】 ＤＮＡ配列のコード部分（例えばＤＮＡ配列のエクソン１）は、内因性タンパ
ク質のものと同一の、１以上のアミノ酸、および／またはアミノ酸の部分をコー
ドしてもよい。例えば、コードＤＮＡ配列は、目的の遺伝子の第一のエクソンに
対応してもよい。あるいは、例えば、目的のタンパク質の第一のエクソンのアミ
ノ酸が、該タンパク質の活性または活性類に重要でない場合、コードＤＮＡは、
目的のタンパク質の第一のエクソンと異なる、１以上のアミノ酸またはアミノ酸
の部分をコードしてもよい。例えば、内因性ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）遺
伝子への融合体を構築する場合、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の第一のエクソン
をコードする配列が使用可能である。この例では、ｈＧＨエクソン１のＥＰＯエ
クソン２への融合は、機能するハイブリッドシグナルペプチドの形成を生じる。
しかし、コードされるアミノ酸がハイブリッドシグナルペプチドの機能を妨げな
い、ヒトまたは非ヒト起源のいかなるエクソンも使用可能である。

【０１６６】 望ましい産物が、内因性タンパク質およびＤＮＡ配列中のコード配列の融合タ
ンパク質である場合、細胞に取り込まれる外因性コードＤＮＡは、内因性の標的
とされる遺伝子の産物に融合しようとする、翻訳または転写産物に対応するｃＤ
ＮＡの１以上のエクソンまたは配列をコードするＤＮＡを含んでもよい。したが
って、ターゲッティングを用いて、２以上のタンパク質の構造的、酵素的あるい
はリガンドまたは受容体結合特性を１つのポリペプチドに合併させる、キメラま
たは多機能タンパク質を調製することが可能である。例えば、外因性ＤＮＡ配列
は、例えば標的とされるタンパク質の膜への係留、あるいは細胞分泌を提供する
かまたは改善するシグナルペプチド、リーダー配列、酵素領域、膜貫通ドメイン
領域、補助因子結合領域または他の機能領域をコードしてもよい。通常分泌され
ないが、シグナルタンパク質に融合させて、分泌を提供することが可能なタンパ
ク質の例には、ドーパ・デカルボキシラーゼ、転写制御タンパク質およびチロシ
ンヒドロキシラーゼが含まれる。

【０１６７】 ＤＮＡ配列は、天然に存在するか、あるいは遺伝子操作技術または合成法を用
いて産生可能である供給源から得ることが可能である。 標的配列 初代、二次または不死化細胞などの細胞にトランスフェクションした際、ＤＮ
Ａ配列は、望ましい産物、例えばタンパク質またはＲＮＡの活性または機能部分
の発現を調節することが可能である。ＤＮＡ配列はまた、望ましい産物をコード
してもよい。産物は、例えば、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝
固因子、輸送タンパク質、受容体、制御タンパク質、構造タンパク質、転写因子
、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムであってもよい。さらに、産物は、天
然に生じないタンパク質または核酸（すなわち融合タンパク質または核酸）であ
ってもよい。

【０１６８】 こうした産物には、エリスロポエチン、カルシトニン、成長ホルモン、インス
リン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インタ
ーフェロンβおよびインターフェロンγ、神経増殖因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−
β、腫瘍壊死因子、グルカゴン、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、ＴＳＨ−β
、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロ
イキン６、インターロイキン１１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球、Ｃ
ＳＦ−マクロファージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、
触媒性抗体類、プロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキ
シドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、アンチト
ロンビンＩＩＩ、ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラー
ゼ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因
子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅまたは
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−
２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト類、アルファ−１−アンチトリプシン、免疫
反応修飾剤類、β−グルコセラミダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−イズロ
ニダーゼ、グルコサミン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼ、アセチル補酵素Ａ：α−グルコサミド−Ｎ−アセチルトランスフェラー
ゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、お
よび可溶性ＣＤ４が含まれる。

【０１６９】 選択可能マーカーおよび増幅 ターゲッティング事象の同定は、１以上の選択可能マーカー遺伝子の使用によ
って、容易にすることが可能である。これらのマーカーは、ＤＮＡ配列内に含ま
れてもよいし、または異なる構築物上に存在してもよい。選択可能マーカーは、
２つのカテゴリー：陽性選択可能および陰性選択可能（言い換えると、陽性選択
または陰性選択いずれかのためのマーカー）に分割可能である。陽性選択では、
陽性選択可能マーカーを発現する細胞は、選択剤（ｎｅｏ、キサンチン−グアニ
ン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ｄｈｆｒ、アデニンデアミ
ナーゼ（ａｄａ）、ピューロマイシン（ｐａｃ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇ）
、カルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およ
びジヒドロオロターゼグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードするＣＡＤ、多
剤耐性１（ｍｄｒ１）並びにヒスチジンＤ（ｈｉｓＤ）など）での処理を生き抜
くことが可能であり、ターゲッティング構築物が、宿主細胞ゲノムに組み込まれ
た細胞の選択を可能にする。陰性選択では、陰性選択可能マーカーを発現する細
胞は、選択剤の存在下で破壊される。ターゲッティング事象の同定は、陰性選択
可能マーカーが、外因性ＤＮＡ配列に連結されるが、ターゲッティング配列に隣
接するように、そして宿主細胞ゲノム中の配列との正しい相同組換え事象が陰性
選択可能マーカーの安定な組込みを生じないように配置されるような、陰性選択
の特性を示す１以上のマーカー遺伝子の使用によって、容易にすることが可能で
ある（Ｍａｎｓｏｕｒら（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２
）。この目的に有用なマーカーには、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ
）遺伝子、細菌ｇｐｔ遺伝子、ジフテリア毒素、および細胞生存に必須な遺伝子
をコードするｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムが含まれる。

【０１７０】 多様な選択可能マーカーを、初代、二次または不死化細胞に取り込んでもよい
。例えば、薬剤耐性、栄養素要求性、細胞傷害剤に対する耐性または表面タンパ
ク質の発現などの選択可能表現型を与える選択可能マーカーを用いてもよい。使
用可能な選択可能マーカー遺伝子には、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐ
ａｃ、ｈｙｇ、ＣＡＤ、ＧＳ、ｍｄｒ１およびｈｉｓＤが含まれる。与えられた
選択可能表現型は、レシピエント細胞を同定し、そして単離することを可能にす
る。

【０１７１】 選択可能マーカーをコードする遺伝子（例えばａｄａ、ＧＳ、ｄｈｆｒおよび
多機能ＣＡＤ遺伝子）は、増加したコピーの選択可能マーカーおよび隣接するゲ
ノム配列を含む細胞の選択を可能にする、付加された特性を有する。この特徴は
、増加したコピーが望ましい、隣接または連結遺伝子のコピー数を有意に増加さ
せるための機構を提供する。改善された選択特性を示すこれらの配列の突然変異
型および増加したコピーを導く他の配列もまた、使用可能である。

【０１７２】 ＤＮＡ配列中の構成要素の順序および数は、多様である可能性がある。例えば
、順序は：第一のターゲッティング配列――選択可能マーカー――制御配列――
エクソン――スプライス−ドナー部位――第二のターゲッティング配列であって
もよいし、または代替物において、第一のターゲッティング配列――制御配列―
―エクソン――スプライス−ドナー部位――選択可能マーカーをコードするＤＮ
Ａ――第二のターゲッティング配列であってもよい。構築物を安定に組み込む細
胞は、選択剤での処理を生き抜くであろうし；安定にトランスフェクションされ
た細胞のサブセットは、相同組換え細胞であろう。相同組換え細胞は、ＰＣＲ、
サザンハイブリダイゼーションおよび表現型スクリーニングを含む、多様な技術
によって、同定可能である。構築物の順序は：第一のターゲッティング配列――
選択可能マーカー――制御配列――エクソン――スプライス−ドナー部位――イ
ントロン――スプライス−アクセプター部位――第二のターゲッティング配列で
あってもよい。

【０１７３】 あるいは、ＤＮＡ配列中の構成要素の順序は、例えば：第一のターゲッティン
グ配列――選択可能マーカー１――制御配列――エクソン――スプライス−ドナ
ー部位――第二のターゲッティング配列――選択可能マーカー２であってもよい
し、あるいは、第一のターゲッティング配列――制御配列――エクソン――スプ
ライス−ドナー部位――選択可能マーカー１――第二のターゲッティング配列―
―選択可能マーカー２であってもよい。この配置では、選択可能マーカー２は、
陰性選択の特性を示してもよい。すなわち、選択可能マーカー２の遺伝子産物は
、選択可能マーカー２を発現している細胞を殺す剤（典型的には薬剤または代謝
産物類似体）を含む適切な培地処方中の増殖によって、反対に選択可能である。
選択可能マーカー１に隣接するターゲッティング配列と宿主細胞ゲノム中の相同
配列間の組換えは、選択可能マーカー１の標的とされる組込みを生じ、一方、選
択可能マーカー２は組み込まれない。こうした組換え事象は、選択可能マーカー
１で安定にトランスフェクションされているが、選択可能マーカー２で安定にト
ランスフェクションされていない細胞を生成し、そしてこうした細胞は、選択可
能マーカー１を支持して選択する選択剤および選択可能マーカー２に反対して選
択する選択剤を含む培地中の増殖によって、選択可能である。

【０１７４】 ＤＮＡ配列はまた、そのマーカーの増加したコピーを含む細胞の選択を可能に
する、陽性選択可能マーカーも含むことが可能である。こうしたマーカーの増加
したコピーは、隣接するＤＮＡ配列の同時増幅を生じる。例えば、構成要素の順
序は：第一のターゲッティング配列――コピー数を増加させる陽性選択可能マー
カー――第二の選択可能マーカー（所望による）――制御配列――エクソン――
スプライス−ドナー部位――第二のターゲッティングＤＮＡ配列であってもよい
。活性化される遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子の増加したコピーを含む細胞
が、適切な選択可能剤の存在下で、細胞を培養することによって、選択可能であ
る特性を有する、選択可能マーカー遺伝子の包含によって、さらに増加させるこ
とが可能である。活性化される内因性遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子とタン
デムに増加されるであろう。活性化される内因性遺伝子を多コピー含む細胞は、
非常に高レベルの望ましいタンパク質を産生することが可能であり、そしてｉｎ
ｖｉｔｒｏタンパク質産生および遺伝子治療に有用である。

【０１７５】 選択可能および他のマーカー遺伝子は、互いにすぐ隣接している必要はない。 ＤＮＡ配列／相同組換え増進剤／非相同端連結阻害剤複合体 二本鎖ＤＮＡ配列および選択される標的ＤＮＡ、例えば細胞中の染色体ＤＮＡ
間の相同組換えは、相同組換えを増進する剤、例えばＲａｄ５２タンパク質、お
よび非相同端連結を阻害する剤、例えばＫｕ不活性化剤（例えば抗Ｋｕ抗体）を
、ＤＮＡ配列および標的とされる部位に十分にごく近接して提供することによっ
て、促進可能である。「十分にごく近接」は、本明細書において、相同組換え増
進剤および／または非相同端連結を阻害する剤の濃度が、標的とされる部位の改
変、例えばＤＮＡ配列および標的配列間の相同組換えを、より高い率で提供する
のに十分である、相同組換え増進剤または非相同端連結を阻害する剤、あるいは
両方の導入を指す。いくつかの方法を用いて、ＤＮＡ配列、相同組換え増進剤、
および非相同端連結を阻害する剤の、互いにごく近接した導入を提供することが
可能である。これらの化合物を互いに、そして標的ＤＮＡに、ごく近接して投与
することによって、Ｒａｄ５２およびＫｕ不活性化分子、例えば抗Ｋｕ抗体など
の化合物の活性を、相同組換え部位に局在させる。例えば、Ｋｕ活性の局所阻害
は、Ｋｕ活性の全細胞阻害より好ましい可能性がある。

【０１７６】 ＤＮＡ配列、相同組換え増進剤、および非相同端連結を阻害する剤の近接は、
これらの要素を複合体の一部として導入することによって、維持可能である。例
えば、ＤＮＡ−タンパク質複合体が使用可能である。ＤＮＡ−タンパク質複合体
の中心は、標的ＤＮＡの選択される部位に導入しようとする二本鎖ＤＮＡ配列で
構成されていてもよい。相同組換え増進剤、例えばＲａｄ５２タンパク質または
その断片は、ＤＮＡ配列上、例えばＤＮＡ配列の全配列または端のみに、例えば
ＤＮＡ配列の一本鎖突出端の少なくとも部分上に、付着して、例えばコーティン
グされていてもよい。ＤＮＡ−タンパク質複合体は、ＤＮＡ配列または相同組換
え増進剤いずれかに共有結合している、非相同端連結を阻害する剤、例えば抗Ｋ
ｕ抗体などのＫｕ不活性化剤をさらに含むことが可能である。非相同端連結を阻
害する剤はまた、ＤＮＡ配列または相同組換え増進剤に非共有結合していてもよ
い。

【０１７７】 化合物はまた、ＤＮＡ配列、相同組換え増進剤および非相同端連結を阻害する
剤を、リポソームまたは小胞中に提供することによって、互いにごく近接して維
持することも可能である。例えば、リポソーム懸濁物はまた、これらの要素の薬
学的に許容しうるキャリアーとしても、使用可能である。リポソーム懸濁物は、
例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られ
る方法にしたがって、調製可能である。

【０１７８】 ＤＮＡ配列、相同組換え増進剤および非相同端連結を阻害する剤はまた、細胞
にマイクロインジェクションすることが可能な混合溶液の一部であってもよいし
、またはこれらの化合物３つすべてが、細胞に同時に存在するように、これらの
化合物各々を、他のものに続いて、迅速に導入してもよい。１以上のこれらの化
合物を導入する他の方法には、受容体仲介搬送、エレクトロポレーションおよび
リン酸カルシウム沈殿が含まれる。

【０１７９】 細胞 トランスフェクションしようとする初代および二次細胞は、多様な組織から得
ることが可能であり、そして培養中で維持および増殖可能な細胞種を含む。例え
ば、トランスフェクション可能な初代および二次細胞には、線維芽細胞、ケラチ
ン形成細胞、上皮細胞（例えば乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア
細胞、神経細胞、血液の形成された要素（例えばリンパ球、骨髄細胞）、筋細胞
およびこれらの体細胞種の前駆体が含まれる。初代細胞は、好ましくは、トラン
スフェクション初代または二次細胞が投与される個体から得られる（すなわち自
己細胞）。しかし、初代細胞は、同一種（すなわち同種異系細胞）または別の種
（すなわち異種細胞）（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウ
シ、小鳥、ヒツジ、ヤギ、ウマ）のドナー（レシピエント以外）から得てもよい
。

【０１８０】 脊椎動物、好ましくは哺乳動物起源の初代または二次細胞は、外因性ＤＮＡ配
列、例えば療法タンパク質をコードする外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクショ
ンされ、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方で、延長された期間
、コードされる療法タンパク質を、安定に、そして再現可能に産生することが可
能である。さらに、トランスフェクション初代および二次細胞は、生理学的に適
切なレベルで、ｉｎ ｖｉｖｏで、コードされる産物を発現可能であり、移植後
に細胞を回収し、そして再培養に際して、増殖させ、そしてその移植前特性を示
すことが可能である。

【０１８１】 あるいは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物起源の初代または二次細胞は、制御
配列を含む外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクション可能である。こうした制御
配列の例には、１以上の：プロモーター、エンハンサー、ＵＡＳ、足場付着領域
または転写結合部位が含まれる。ターゲッティング事象は、ＤＮＡ配列の制御配
列の挿入を生じ、標的とされる内因性遺伝子をその調節下に置くことが可能であ
る（例えば、プロモーターまたはエンハンサー、あるいは両方を、内因性遺伝子
または制御領域の上流に挿入することによって）。所望により、ターゲッティン
グ事象は、遺伝子の組織特異的陰性制御配列の欠失などの、内因性制御配列の欠
失を、同時に生じることが可能である。ターゲッティング事象は、存在する制御
配列を置換することが可能であり；例えば組織特異的エンハンサーを、天然存在
要素より、より広いかまたはそれと異なる細胞種特異性を有するエンハンサー、
あるいは対応する非トランスフェクション細胞と異なる制御または誘導パターン
を示すエンハンサーで置換することが可能である。これに関連し、天然存在配列
が欠失され、そして新規配列が付加される。あるいは、内因性制御配列は、除去
または置換されないが、内因性制御要素内に外因性配列をターゲッティングする
ことによるなど、ターゲッティング事象によって、破壊されるかまたは無能にさ
れる。相同組換えによる制御配列の導入は、通常発現しない療法タンパク質を発
現する初代または二次細胞を生じる可能性がある。さらに、制御配列のターゲッ
ティングされる導入は、療法タンパク質を作成するかまたは含むが、正常より少
量（生理学的に正常な、より低いレベル未満の量）であるか、または欠損型であ
る細胞に、そして生理学的に正常なレベルで療法タンパク質を作成するが、その
含量または産生を増大させるかまたは増進しようとする細胞に、使用可能である
。

【０１８２】 トランスフェクション初代または二次細胞はまた、選択可能表現型を与え、そ
の同定および単離を容易にする、選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列もま
た、含んでもよい。安定にＤＮＡ配列を発現する、トランスフェクション初代、
二次細胞を産生する方法、こうしたトランスフェクション細胞のクローン性細胞
株および不均質細胞株、クローン性および不均質細胞株を産生する方法、並びに
トランスフェクション初代または二次細胞の集団の使用を通じて、異常なまたは
望ましくない状態を治療するかまたは予防する方法が、本発明の一部である。

【０１８３】 初代または二次細胞のトランスフェクション、相同組換えおよびクローン性ま たは不均質細胞株の産生 脊椎動物組織は、パンチ生検または目的の初代細胞種の組織供給源を得る、他
の手術法などの標準的方法によって、得ることが可能である。例えば、パンチ生
検は、線維芽細胞またはケラチン形成細胞の供給源として皮膚を得るのに用いる
。初代細胞の混合物は、酵素消化または外植などの既知の方法を用いて、組織か
ら得る。酵素消化を用いた場合、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ディスパー
ゼ、プロナーゼ、トリプシン、エラスターゼおよびキモトリプシンなどの酵素が
使用可能である。

【０１８４】 生じた初代細胞混合物を直接トランスフェクションしてもよいし、またはトラ
ンスフェクションを行う前に、まず培養し、培養プレートから除去し、そして再
懸濁してもよい。初代細胞または二次細胞は、所望により選択可能マーカーをコ
ードするＤＮＡを含む、ゲノムに導入しようとするＤＮＡと合わせ、そしてトラ
ンスフェクションを達成するために処理する。さらに、単独でまたは複合体の一
部として、Ｒａｄ５２タンパク質またはその断片、およびＫｕ不活性化分子、例
えば抗Ｋｕ抗体と、初代または二次細胞を合わせる。

【０１８５】 トランスフェクション初代または二次細胞は、エレクトロポレーションによっ
て、作成可能である。エレクトロポレーションは、適切な電位および電気容量（
および対応する時定数）で行い、初代または二次細胞へのＤＮＡ構築物（類）の
進入を生じる。エレクトロポレーションは、広い範囲の電位（例えば５０から２
０００ボルト）および対応する電気容量に渡って実行可能である。通常、およそ
０．１から５００μｇの総ＤＮＡを用いる。

【０１８６】 好ましくは、初代または二次細胞は、マイクロインジェクションを用いてトラ
ンスフェクションする。あるいは、リン酸カルシウム沈殿、修飾リン酸カルシウ
ム沈殿およびポリブレン沈殿、リポソーム融合および受容体仲介遺伝子搬送など
の既知の方法を用いて、細胞をトランスフェクションすることが可能である。安
定なトランスフェクション細胞を単離し、そして培養条件下で、そして十分な時
間、培養し、そして継代培養して、安定なトランスフェクション二次細胞を増殖
させ、そしてトランスフェクション二次細胞のクローン性細胞株を産生する。あ
るいは、１より多いトランスフェクション細胞を培養し、そして継代培養し、不
均質な細胞株の産生を生じる。

【０１８７】 トランスフェクション後、当該技術分野に知られるように（Ｃａｐｅｃｃｈｉ
（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）、相同組換えを
可能にする条件下で、細胞を維持する。

【０１８８】 相同組換え初代または二次細胞は、十分な数の倍加を経て、有効量で、個体に
療法タンパク質を提供するのに十分なサイズのクローン性細胞株または不均質細
胞株いずれかを生じることが可能である。一般的に、例えば、０．１ｃｍ²の皮
膚を生検で得て、そしてこれは１００，０００細胞を含むと考えられ；１つの細
胞を用いて、クローン性細胞株を産生し、そしておよそ２７の倍加を経て、１億
の相同組換え二次細胞を産生する。不均質細胞株を、およそ１００，０００細胞
の元来の相同組換え集団から産生しようとする場合、１億の細胞を産生するのに
１０の倍加しか必要とされない。

【０１８９】 相同組換えクローン性または不均質細胞株に必要とされる細胞の数は多様であ
り、そして限定されるわけではないが、相同組換え細胞の使用、細胞における外
因性ＤＮＡ配列の機能レベル、細胞における改変されたＤＮＡ配列の機能レベル
、相同組換え細胞の移植部位（例えば使用可能な細胞数は、移植の解剖学的部位
によって制限される）、並びに患者の年齢、表面面積、および臨床的状態を含む
、多様な要因に応じる。これらの要因を視野に置くと、成長ホルモン単独欠損症
を有する、そうでなければ健康な１０ｋｇの患者にヒト成長ホルモンの療法レベ
ルを搬送するため、およそ１から５億の相同組換え線維芽細胞が必要であろう（
これらの細胞の体積は、ほぼ、患者の親指のごく先端程度である）。

【０１９０】 いくつかの方法を用いて、本明細書に記載される方法が、細胞において相同組
換えを増進する有効性を決定することが可能である。例えば、細胞、例えばヒト
細胞における非保存的置換を検出するため、実験系を設計することが可能である
。置換は、ＸｈｏＩ部位の一部である、ＨＰＲＴ遺伝子のエクソン３のＣＧＡコ
ドンでのＣからＴの置換であってもよい。この突然変異は、ＴＧＡ終結シグナル
を生成し、これは、６−チオグアニン（６−ＴＧ）に耐性とスコア付けされる、
ＨＰＲＴ陰性表現型を生じる。この突然変異はまた、対応するＸｈｏＩ部位の欠
失を伴う。簡潔には、ＣからＴの置換を含むＤＮＡ配列は、相同組換えを増進す
る剤およびＫｕを不活性化する剤を含む複合体の一部として、ヒト線維芽細胞に
マイクロインジェクションすることによって、導入可能である。細胞を培養し、
そして６−ＴＧを含む培地上に細胞を導入する前に、増殖させる。その後、６−
ＴＧ耐性クローンをスコア付けし、突然変異ＤＮＡ配列の存在を決定する。相同
組換え事象の存在は、ＨＰＲＴ特異的プローブを用いて、ＸｈｏＩ消化ゲノムＤ
ＮＡをサザンブロット解析することによって、検出可能である。結果はまた、突
然変異ＤＮＡ配列が、相同組換えを増進する剤およびＫｕを不活性化する剤の非
存在下に導入される、対照細胞と比較することも可能である。

【０１９１】 相同組換え二次細胞のクローン性細胞株または不均質細胞株の移植 上述のように産生された相同組換え細胞は、既知の方法を用いて、療法タンパ
ク質を搬送しようとする個体に導入可能である。その後、クローン性細胞株また
は不均質細胞株を、既知の方法を用いて、多様な投与経路および多様な部位（例
えば腎被膜下、皮下、中枢神経系（クモ膜下腔内を含む）、血管内、肝臓内、内
臓内、腹腔内（大網内を含む）、または筋内移植）を用い、個体に導入する。個
体に移植されたら、相同組換え細胞は、外因性合成ＤＮＡにコードされる療法産
物を産生するか、または相同組換え細胞は、外因性制御配列調節下で、内因性Ｄ
ＮＡ配列にコードされる療法タンパク質を発現する。例えば、血液に通常見られ
る因子ＩＸの欠損によって引き起こされる出血障害である、血友病Ｂと診断され
ている個体は、遺伝子治療の候補である。患者に小皮膚生検を行う；これは、外
来に基づいて行うことが可能な、単純な処置である。ほぼマッチの頭の大きさの
皮膚片を、例えば腕の下から取り、そしてこれは除去するのに約１分を要する。
試料をプロセシングし、患者細胞（この場合、線維芽細胞）を単離し、そして失
われた因子ＩＸを産生するように、遺伝子操作する。患者の年齢、体重、および
臨床的状態に基づいて、必要とされる数の細胞を、大規模培養で増殖させる。全
過程は、４−６週間を要するはずであり、そしてこの期間の終わりに、再び外来
で（例えば患者の皮膚下に、これらを注入して戻すことによって）、遺伝子操作
された適切な数の細胞を、個体に導入する。患者はここで、自身の因子ＩＸを産
生することが可能であり、そしてもはや血友病患者ではない。

【０１９２】 同様のアプローチを用いて、他の異常または疾患を治療することが可能である
。例えば、低身長は、ヒト成長ホルモンを発現する初代または二次細胞を移植す
ることにより、個体にヒト成長ホルモンを投与することによって、治療可能であ
る。

【０１９３】 この例が示唆するように、使用する細胞は、一般的に、患者特異的に遺伝子操
作された細胞であろう。しかし、同一種の別の個体または異なる種から細胞を得
ることが可能である。こうした細胞の使用は、免疫抑制剤の投与、組織適合性抗
原の改変、または移植細胞の拒絶を防ぐ障壁装置の使用を要する可能性がある。

【０１９４】 多くの疾患では、これは、単回治療であろうし、そして他のものでは、多数の
遺伝子治療措置が必要とされるであろう。 トランスフェクション初代または二次細胞は、単独で、またはレシピエント被
験者における細胞に対する免疫反応を阻害するための障壁または剤と組み合わせ
て、投与可能である。例えば、免疫抑制剤を被験者に投与し、被験者における正
常反応を阻害するか、または該反応と干渉することが可能である。好ましくは、
免疫抑制剤は、被験者において、Ｔ細胞／またはＢ細胞活性を阻害する免疫抑制
薬剤である。こうした免疫抑制薬剤の例が商業的に入手可能である（例えばシク
ロスポリンＡは、Ｓａｎｄｏｚ Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州イーストハノ
ーバーから商業的に入手可能である）。

【０１９５】 免疫抑制剤、例えば薬剤は、望ましい療法効果（例えば細胞の拒絶の阻害）を
達成するのに十分な投薬量で、被験者に投与可能である。免疫抑制剤の投薬範囲
は、当該技術分野に知られる。例えばＦｒｅｅｄら（１９９２） Ｎ． Ｅｎｇ
ｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４９；Ｓｐｅｎｃｅｒら（１９９２） Ｎ
． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４１；Ｗｉｄｎｅｒら（１９９
２） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５５６を参照されたい。
投薬値は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因にしたがって、
多様である可能性がある。

【０１９６】 被験者においてＴ細胞活性を阻害するのに使用可能な別の剤は、抗体、あるい
はその断片または誘導体である。ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞を枯渇させるかまたは
隔絶することが可能な抗体が当該技術分野に知られる。ポリクローナル抗血清、
例えば抗リンパ球血清が使用可能である。あるいは、１以上のモノクローナル抗
体が、使用可能である。好ましいＴ細胞枯渇抗体には、細胞表面上のＣＤ２、Ｃ
Ｄ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンドに結合するモノクローナル
抗体が含まれる。こうした抗体が当該技術分野に知られ、そして例えばアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションから商業的に入手可能である。ヒトＴ細
胞上のＣＤ３に結合する好ましい抗体は、ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００
１）である。

【０１９７】 レシピエント被験者内でＴ細胞を枯渇させるか、隔絶するかまたは阻害する抗
体は、移植に際して細胞の拒絶を阻害する用量で、適切な期間、投与することが
可能である。抗体は、好ましくは、薬学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤
（例えば生理食塩水溶液）中で、静脈内投与する。

【０１９８】 レシピエント被験者において、細胞に対する免疫反応と干渉するか、または該
反応を阻害する別の方法は、免疫障壁を使用することである。「免疫障壁」は、
本明細書において、被験者における投与された細胞および免疫反応に関与する細
胞間の障壁として役立つ装置を指す。例えば、細胞は、移植可能装置中で、投与
することが可能である。移植可能装置は、半透性障壁、すなわち栄養素および産
物が障壁内および障壁外に拡散するが、より大きい免疫系構成要素、例えば抗体
または補体の進入を妨げる障壁の内部に含まれる細胞を含んでもよい。移植可能
装置は、典型的には、マトリックス、例えばヒドロゲル、または細胞を配置する
コアを含む。所望により、半透性コーティングは、ゲルを封入してもよい。ゲル
コア内に配置される場合、投与される細胞は、免疫系の細胞から隔絶されている
はずであり、そして宿主の細胞および細胞傷害性抗体から覆い隠されているはず
である。好ましくは、ＰＬＬまたはＰＬＯなどの選択透過性コーティングを用い
る。コーティングはしばしば、レシピエントの免疫系構成要素が進入して、そし
て移植可能装置内の細胞を破壊するのを妨げる、小孔を有する。

【０１９９】 細胞を被包する多くの方法が当該技術分野に知られる。例えば、産生用の細胞
を被包するため、水可溶性ゴム（ｇｕｍ）を用いて、半透性水不溶性ゲルを得る
被包および他の被包法が、米国特許第４，３５２，８８３号に開示される。使用
可能な他の移植可能装置は、米国特許第５，０８４，３５０号、米国特許第５，
４２７，９３５号、１９９５年７月２７に公表されたＷＯ ９５／１９７４３、
米国特許第５，５４５，４２３号、米国特許第４，４０９，３３１号、米国特許
第４，６６３，２８６号、および欧州特許第３０１，７７７号に開示される。

【０２００】 相同組換え初代および二次細胞および細胞株の使用 相同組換え初代および二次細胞または細胞株は、酵素、ホルモン、サイトカイ
ン、抗原、抗体、凝固因子、アンチセンスＲＮＡ、制御タンパク質、転写タンパ
ク質、受容体、構造タンパク質、新規（非最適化）タンパク質および核酸産物、
並びに操作ＤＮＡなどの、療法タンパク質のためのビヒクルまたは搬送系として
、広い適用可能性を有する。例えば、相同組換え初代または二次細胞を用いて、
限定されるわけではないが、エリスロポエチン、カルシトニン、成長ホルモン、
インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、
α２−インターフェロン（ＩＦＮＡ２）、β−インターフェロン、γ−インター
フェロン、神経増殖因子類、ＦＳＨβ、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、グルカゴン
、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、ＴＳＨ−β、インターロイキン１、インタ
ーロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１
１、インターロイキン１２、ＣＳＦ−顆粒球（ＧＣＳＦ）、ＣＳＦ−マクロファ
ージ、ＣＳＦ−顆粒球／マクロファージ、免疫グロブリン類、触媒性抗体類、プ
ロテインキナーゼＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ
、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、アンチトロンビンＩＩＩ、
ＤＮアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、血液凝固因子
Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固
因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ
−Ｉ、グロビン類、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２ア
ンタゴニスト類、α−１−アンチトリプシン、免疫反応修飾剤類、β−グルコセ
ラミダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコサミン−Ｎ
−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル補酵素Ａ：
α−グルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン−６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−
アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、および可溶性ＣＤ４を含む療法
タンパク質を供給することが可能である。

【０２０１】 本明細書に引用されるすべての特許および参考文献は、その全体が本明細書に
援用される。他の態様が請求項の範囲内である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA08 AA10 AA20 BA14 BA23 BA30 BA80 CA01 CA02 DA01 DA02 DA03 DA05 DA11 DA12 FA02 FA06 FA20 GA11 HA17 HA20 4B065 AA01X AA58X AA72X AA93X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA16 BA30 CA24 CA43 CA44 CA46 CA53

Claims (75)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞における標的配列の改変を促進する複合体であって：
   二本鎖ＤＮＡ配列、相同組換え増進剤、および非相同端連結を阻害する剤を含む
   、前記複合体。
2. 【請求項２】 相同組換え増進剤が：Ｒａｄ５２タンパク質または機能す
   るその断片、Ｒａｄ５１タンパク質または機能するその断片、Ｒａｄ５４タンパ
   ク質または機能するその断片、およびそれらの組み合わせからなる群より選択さ
   れる、請求項１の複合体。
3. 【請求項３】 相同組換え増進剤がＲａｄ５２タンパク質または機能する
   その断片である、請求項１の複合体。
4. 【請求項４】 非相同端連結を阻害する剤が、ｈＭｒｅ１１を不活性化す
   る剤、ｈＲａｄ５０を不活性化する剤、Ｎｂｓ１を不活性化する剤、ｈＬｉｇ４
   を不活性化する剤、ｈＸｒｃｃ４を不活性化する剤、およびＫｕを不活性化する
   剤からなる群より選択される、請求項１の複合体。
5. 【請求項５】 非相同端連結を阻害する剤がＫｕ不活性化剤である、請求
   項１の複合体。
6. 【請求項６】 Ｋｕ不活性化剤が：抗Ｋｕ抗体、Ｋｕ結合オリゴマー、お
   よびＫｕ結合ポリペプチドからなる群より選択される、請求項５の複合体。
7. 【請求項７】 Ｋｕ不活性化剤が抗Ｋｕ抗体である、請求項５の複合体。
8. 【請求項８】 ＤＮＡ配列が直鎖ＤＮＡ配列を含む、請求項１の複合体。
9. 【請求項９】 ＤＮＡ配列に少なくとも１つのターゲッティング配列が隣
   接する、請求項１の複合体。
10. 【請求項１０】 ＤＮＡ配列が外因性制御配列を含む、請求項１の複合体
    。
11. 【請求項１１】 制御配列がプロモーター、エンハンサー、上流活性化配
    列、足場付着領域または転写因子結合部位である、請求項１０の複合体。
12. 【請求項１２】 制御配列がプロモーターおよびエンハンサーである、請
    求項１１の複合体。
13. 【請求項１３】 制御配列がプロモーターおよび上流活性化配列である、
    請求項１１の複合体。
14. 【請求項１４】 Ｒａｄ５２タンパク質または機能するその断片が、ＤＮ
    Ａ配列上にコーティングされている、請求項３の複合体。
15. 【請求項１５】 Ｒａｄ５２タンパク質またはその断片がヒトＲａｄ５２
    である、請求項３の複合体。
16. 【請求項１６】 抗Ｋｕ抗体が抗Ｋｕ７０抗体である、請求項７の複合体
    。
17. 【請求項１７】 抗Ｋｕ抗体が抗Ｋｕ８０抗体である、請求項７の複合体
    。
18. 【請求項１８】 少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体が、ＤＮＡ配列に共有結合
    している、請求項７の複合体。
19. 【請求項１９】 少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体が、相同組換えを増進する
    剤に共有結合している、請求項７の複合体。
20. 【請求項２０】 複合体が抗Ｋｕ７０抗体および抗Ｋｕ８０抗体を含む、
    請求項７の複合体。
21. 【請求項２１】 ＤＮＡ配列が制御配列を含み、そしてターゲッティング
    配列がＦＳＨβ遺伝子タンパク質コード領域の５’の配列に由来する、請求項９
    の複合体。
22. 【請求項２２】 ＤＮＡ配列が制御配列を含み、そしてターゲッティング
    配列がＩＦＮα遺伝子タンパク質コード領域の５’の配列に由来する、請求項９
    の複合体。
23. 【請求項２３】 ＤＮＡ配列が制御配列を含み、そしてターゲッティング
    配列がＧＣＳＦ遺伝子タンパク質コード領域の５’の配列に由来する、請求項９
    の複合体。
24. 【請求項２４】 ミスマッチ修復タンパク質を阻害する剤をさらに含む、
    請求項１の複合体。
25. 【請求項２５】 細胞の標的ＤＮＡにおいて、選択される部位での改変を
    促進する方法であって： 細胞に、二本鎖ＤＮＡ配列、相同組換えを増進する剤、および非相同端連結を
    阻害する剤を導入し、それによって、染色体ＤＮＡの改変を促進し、それによっ
    て、染色体ＤＮＡにおいて、選択される部位での改変を促進する ことを含む、前記方法。
26. 【請求項２６】 ＤＮＡ配列が直鎖ＤＮＡ配列を含む、請求項２５の方法
    。
27. 【請求項２７】 ＤＮＡ配列に少なくとも１つのターゲッティング配列が
    隣接する、請求項２５の方法。
28. 【請求項２８】 ＤＮＡ配列が外因性制御配列を含む、請求項２５の方法
    。
29. 【請求項２９】 制御配列が：プロモーター、エンハンサー、上流活性化
    配列、足場付着領域および転写因子結合部位からなる群より選択される、請求項
    ２８の方法。
30. 【請求項３０】 制御配列がプロモーターおよびエンハンサーである、請
    求項２８の方法。
31. 【請求項３１】 制御配列がプロモーターおよび上流活性化配列である、
    請求項２８の方法。
32. 【請求項３２】 相同組換えを増進する剤が：Ｒａｄ５２タンパク質また
    は機能するその断片、Ｒａｄ５１タンパク質または機能するその断片、Ｒａｄ５
    ４タンパク質または機能するその断片、およびそれらの組み合わせからなる群よ
    り選択される、請求項２５の方法。
33. 【請求項３３】 相同組換えを増進する剤がＲａｄ５２タンパク質または
    機能するその断片である、請求項２５の方法。
34. 【請求項３４】 Ｒａｄ５２タンパク質または機能するその断片が、ＤＮ
    Ａ配列上にコーティングされている、請求項３３の方法。
35. 【請求項３５】 Ｒａｄ５２タンパク質または機能するその断片がヒトＲ
    ａｄ５２である、請求項３３の方法。
36. 【請求項３６】 非相同端連結を阻害する剤が、ｈＭｒｅ１１を不活性化
    する剤、ｈＲａｄ５０を不活性化する剤、Ｎｂｓ１を不活性化する剤、ｈＬｉｇ
    ４を不活性化する剤、ｈＸｒｃｃ４を不活性化する剤、およびＫｕを不活性化す
    る剤からなる群より選択される、請求項２５の方法。
37. 【請求項３７】 非相同端連結を阻害する剤がＫｕ不活性化剤である、請
    求項２５の方法。
38. 【請求項３８】 Ｋｕを不活性化する剤が、抗Ｋｕ抗体、Ｋｕ結合オリゴ
    マー、およびＫｕ結合ポリペプチドである、請求項３７の方法。
39. 【請求項３９】 Ｋｕを不活性化する剤がＫｕアンチセンス分子である、
    請求項３７の方法。
40. 【請求項４０】 Ｋｕを不活性化する剤が抗Ｋｕ抗体である、請求項３７
    の方法。
41. 【請求項４１】 抗Ｋｕ抗体が抗Ｋｕ７０抗体である、請求項４０の方法
    。
42. 【請求項４２】 抗Ｋｕ抗体が抗Ｋｕ８０抗体である、請求項４０の方法
    。
43. 【請求項４３】 少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体が、ＤＮＡ配列に共有結合
    している、請求項４０の方法。
44. 【請求項４４】 少なくとも１つの抗Ｋｕ抗体が、Ｒａｄ５２タンパク質
    またはその断片に共有結合している、請求項４０の方法。
45. 【請求項４５】 細胞が真菌、植物または動物起源のものである、請求項
    ２５の方法。
46. 【請求項４６】 細胞が脊椎動物起源のものである、請求項４５の方法。
47. 【請求項４７】 細胞が初代または二次哺乳動物細胞である、請求項４６
    の方法。
48. 【請求項４８】 細胞が初代または二次ヒト細胞である、請求項４６の方
    法。
49. 【請求項４９】 細胞が不死化哺乳動物細胞である、請求項４６の方法。
50. 【請求項５０】 細胞が不死化ヒト細胞である、請求項４６の方法。
51. 【請求項５１】 ＤＮＡ配列、相同組換えを増進する剤および非相同端連
    結を阻害する剤を、複合体として細胞に導入する、請求項２５の方法。
52. 【請求項５２】 ミスマッチ修復タンパク質を阻害する剤を導入すること
    をさらに含む、請求項２５の方法。
53. 【請求項５３】 ミスマッチ修復タンパク質が：Ｍｓｈ２、Ｍｓｈ６、Ｍ
    ｓｈ３、Ｍ１ｈ１およびＰＭＳ２からなる群より選択される、請求項５２の方法
    。
54. 【請求項５４】 剤がミスマッチ修復タンパク質の発現を阻害する剤であ
    る、請求項５２の方法。
55. 【請求項５５】 剤が抗ミスマッチ修復タンパク質抗体である、請求項５
    ４の方法。
56. 【請求項５６】 少なくとも１つの抗ミスマッチ修復タンパク質抗体が、
    ＤＮＡ配列に共有結合されている、請求項５４の方法。
57. 【請求項５７】 少なくとも１つの抗ミスマッチ修復タンパク質抗体が、
    Ｒａｄ５２タンパク質またはその断片に共有結合されている、請求項５５の方法
    。
58. 【請求項５８】 ＤＮＡ配列が制御配列を含み、そしてターゲッティング
    配列がＦＳＨβコード領域の５’の領域に由来する、請求項２７の方法。
59. 【請求項５９】 ＤＮＡ配列が制御配列を含み、そしてターゲッティング
    配列がＩＦＮαコード領域の５’の領域に由来する、請求項２７の方法。
60. 【請求項６０】 ＤＮＡ配列が制御配列を含み、そしてターゲッティング
    配列がＧＣＳＦコード領域の５’の領域に由来する、請求項２７の方法。
61. 【請求項６１】 標的ＤＮＡが、野生型配列と異なる１０未満の塩基対を
    有する突然変異を含む、請求項２５の方法。
62. 【請求項６２】 突然変異が点突然変異である、請求項６１の方法。
63. 【請求項６３】 ＤＮＡ配列が、突然変異を訂正することが可能な野生型
    配列を含む、請求項６２の方法。
64. 【請求項６４】 標的ＤＮＡが嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）
    遺伝子である、請求項６３の方法。
65. 【請求項６５】 突然変異が、ＣＦＴＲ遺伝子コード領域のコドン５０８
    にコードされるアミノ酸を変化させる、請求項６４の方法。
66. 【請求項６６】 標的ＤＮＡがβ−グロビン遺伝子である、請求項６３の
    方法。
67. 【請求項６７】 突然変異が、β−グロビン遺伝子コード領域のコドン６
    にコードされるアミノ酸を変化させる、請求項６６の方法。
68. 【請求項６８】 標的ＤＮＡが因子ＶＩＩＩ遺伝子である、請求項６３の
    方法。
69. 【請求項６９】 突然変異が、因子ＶＩＩＩ遺伝子コード領域のコドン２
    ２０９にコードされるアミノ酸を変化させる、請求項６８の方法。
70. 【請求項７０】 突然変異が、因子ＶＩＩＩ遺伝子コード領域のコドン２
    ２２９にコードされるアミノ酸を変化させる、請求項６８の方法。
71. 【請求項７１】 標的ＤＮＡが因子ＩＸ遺伝子である、請求項６３の方法
    。
72. 【請求項７２】 標的ＤＮＡがフォンウィルブランド因子遺伝子である、
    請求項６３の方法。
73. 【請求項７３】 標的ＤＮＡが色素性乾皮症グループＧ遺伝子である、請
    求項６３の方法。
74. 【請求項７４】 請求項２５の方法によって作成される相同組換え細胞。
75. 【請求項７５】 細胞において、遺伝子のタンパク質コード配列の発現を
    改変する方法であって： 細胞に、ＤＮＡ配列が制御配列を含む請求項１の複合体を導入し； 標的とされるゲノム配列の改変を可能にして相同組換え細胞を産生する条件下
    で、細胞を維持し；そして 制御配列の調節下、遺伝子のタンパク質コード配列の発現を可能にして、それ
    により遺伝子のタンパク質コード配列の発現を改変する条件下で、相同組換え細
    胞を維持する ことを含む、前記方法。