MXPA02009044A - Metodos para mejorar una recombinacion homologa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para promover una alteracion en un sitio seleccionado en un ADN objetivo, por ejemplo, en el ADN del cromosoma de una celula. El metodo incluye, proporcionar en el sitio:(a) una secuencia de ADN de hilo doble la cual incluye una secuencia de ADN seleccionada; (b) un agente que mejora la recombinacion homologa, por ejemplo, una proteina Rad52 o un fragmento funcional de la misma; y (c) un agente que inhibe la union del extremo no homologo, por ejemplo, un agente que inactiva el Ku, tal como un anticuerpo anti-Ku o un oligomero o polimero de enlace de Ku, y permitir que ocurra la alteracion. El agente que inhibe la union del extremo no homologo, por ejemplo, se proporciona un agente desactivador del Ku, tal como un anticuerpo anti-Ku, de preferencia localmente. Los componentes (a),(b) y (c) pueden ser introducidos juntos, de preferencia, o separados.

Description

MÉTODOS PARA MEJORAR UNA RECOMBINACION HOMOLOGA Antecedentes del Invento Los métodos actuales para tratar enfermedades mediante la administración de proteínas terapéuticas, incluyen la producción in vitro de proteínas terapéuticas para la administración farmacéutica convencional (por ejemplo, inyección intravenosa , subcutánea o intramuscular) y más recientemente, la terapia genética . Las proteínas de interés terapéutico pueden ser producidas introduciendo ADN exógeno que codifica la proteína de interés terapéutico en células adecuadas. Por ejemplo, se puede introducir un vector que incluye ADN axógeno que codifica una proteína terapéutica en células y la proteína codificada expresada. También se ha sugerido que los genes celulares endógenos y su expresión, pueden ser modificados med ante dirección genética . Ver por ejemplo, la Patente Norteam ericana No. 5,272 , 071 , la Patente Norteamericana No. 5,641 ,670, los documentos WO 91 /06666, WO 91 /06667 y WO 90/1 1 354. Sumario del Invento La presente invención se basa en parte, en el uso de la recombinación homologa entre una secuencia de ADN de hilo doble y un ADN objetivo seleccionado ' por ejemplo, ADN cromosómico en una célula, promovido proporcionando un agente que aumenta la recombinación homologa , por ejemplo, Rad52 , y un agente que inhibe la unión de extremo no homologa, por ejemplo, un agente que inactiva el Ku , en una proximi dad lo suficientemente cercana a la secuencia de ADN en el sitio dirigido. Se anticipa que ocurrió un rango más alto de recombinación homologa en la presencia tanto de Rad52 como de un agente que inactiva el Ku , que en su ausencia, Además, se anticipa que la d irección genética , con el objeto de alterar un sitio dirigido en un ADN , por ejemplo, un sitio dirigido en el ADN cromosómico en una célu lia, utilizando una secuencia de ADN seleccionada como una plantilla, puede ser promovida proporcionando una proteína Rad52 y un agente que inactiva el Ku, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ku . Al proporcionar una proteína Rad52 y un agente que inactiva el Ku en una proximidad cercana a la secuencia de ADN seleccionada y al sitio objetivo, ocurre un rango más alto de alteración mediante la dirección genética que en la ausencia de una proteína Rad52 y un agente que inactiva el Ku, por ejemplo un anticuerpo anti-Ku. Por consiguiente, la presente invención presenta en un aspecto, un método para promover una alteración en un sitio seleccionado en un ADN O Djetivo, por ejemplo, en el ADN cromosómico de una célula. El método incluye proporcionar, en el sitio: (a) una secuencia de ADN de hilo doble que incluye una secuencia de ADN seleccionada; (b) un agente que aumenta la recombinación homologa, por ejemplo, una proteína Rad52 o un fragmento funcional de la misma , o una secuencia de ADN que codifica Rad52 o un fragmento funcional de la misma; (c) un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un agente que inactiva Ku, y que permite que ocurra la alteración. En una modalidad preferida, se propor cionan los componentes (a), (b), (c), por ejemplo, introducidos en léi célula, de modo que en el sitio de una interacción entre la secuencia de ADN seleccionada y el ADN objetivo, sea suficiente la concentración del agente que aumenta la recombinación homologa y del agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, para que ocurra, en un rango más alto de lo que podría ocurrir en al ause ncia de un agente suministrado que aumente la recombinación homologa y un agente que inhiba la unión del extremo no homólogo, una alteración del sitio, por ejemplo, una recombinación homologa o corrección genética entre la secuencia de ADN seleccionada y el ADN ob etivo. El agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, se proporciona preferentemente en forma local . Preferentemente, el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo es un agente que inactiva el Ku , tal como un anticuerpo anti-Ku . Se pueden introducir juntos los componentes (a), (b), y (c), lo cual es lo preferido, o se pu edén introducir en forma separada, Además, se pueden introducir juntos dos de los componentes y el tercero puede ser introducido 3n forma separada. Por ejemplo, la secuencia de ADN y el ag gnte que aumenta la combinación homologa, por ejemplo, Rad52 , pueden ser introducidos juntos o se pueden introducir juntos la secuencia de ADN y el agente que inhibe la unión del extremo no hor? ólogo, por ejemplo, un agente que inactiva el Ku . En otra modalidad preferida , el agente que aumenta la recombinación homologa y el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, pueden ser introducido juntos. Se pueden proporcionar dos, o preferentemente todos los componentes en la forma de un complejo. En una modalidad preferida, el método incluye cohtactar el ADN objetivo, por ejemplo, introduciendo en la célula un complejo que incluye: (a) una secuencia de ADN de hilo doble que incluye la secuencia de ADN seleccionada; (b) un agente que aumenta la recombinación homologa , por ejemplo, una proteína Rad52 o un fragmento funcional de la misma; y (c) un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un agente que inactiva el Ku tal como un anticuerpo Ku o un oligómero o polímero de enlace de Ku . En una modalidad prefe rida, se proporcionan uno o más, preferentemente todos los componentes en forma local , por ejemplo, microinyección , y no se expresan a partir del genoma objetivo u otro ácido nucleico. En una modalidad particularmente preferida , el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un agente que inhibe el Ku , se proporciona mediante administración local , por ejemplo, microinyección , y no se expresa a partir del genoma u otro ácido nucleico. En una modalidad preferic a , el agente que inhibe una unión del extremo no homólogo es un agente que inactiva hMre1 1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-hMre l 1 o un oligómero o polímero de enlace h Mre 1 1 ; un agente qu e inactiva hRad50, por ejemplo, un anticuerpo anti-hRad50 o un oligómero o pol ímero de enlace h RaddO, un agente que inactiva Nbs1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-N bs l o un oligómero o pol ímero de enllace h Nbsl ; un agente que inactiva la ligasa humana 4 (hLig4), por e emplo, un anticuerpo anti-hLig4 o un oligómero o polímero de enl ace hLig4; un agente que inactiva hXrcc4, por ejemplo, un anticuerpo anti-hXrcc4 o un oligómero o pol ímero de enlace hXrcc4; u n agente que inactiva un homólogo humano de Rap1 , por ejemplo, un anticuerpo para un homólogo humano de Rap 1 o un oligómero o polímero que enlaza un homólogo humano de Rap1 , un agente que inactiva un homólogo humano de Sir2304, por ejemplo, un anticuerpo para un homólogo humano de Sir2304 o un oligómero o polímero de enlace de un homólogo humano de Sir2304; un agente que inactiva Ku , por ejemplo, un anticuerpo anti-Ku o un olic ómero o polímero de enlace Ku . Cualesquiera de los enlaces c ue inhiben la unión del extremo no homólogo, se pueden administrar solos o pueden ser administrados en combinación con uno o más de otros agentes que inhiben la unión del extremo no homólogo. En una modalidad prefe rida, la secuencia de ADN es una secuencia de ADN lineal. En i na modalidad preferida , la secuencia de ADN lineal puede tener uno o más colgantes de un solo hilo. En una modalidad preferida , la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secue ncia de dirección . La secuencia de dirección es homologa al objetivo, por ejemplo, homologa al ADN adyacente al sitio en donde el ADN objetivo será alterado, o al sitio en donde la secuencia de ADN seleccionada será integrada. Tal secuencia de flanqueo puede estar presente en uno o más, preferentemente ambos extremos de la secuencia de ADN seleccionada. Si están presentes dos secuencias de flanqueo , una debe ser homologa con una prinera región del objetivo y la otra debe ser homologa con una segunda región del objetivo. En una modalidad preferí da, la secuencia de ADN tiene uno o más extremos de un solo hilo que sobresale, por ejemplo, uno o ambos de los extremos que sobresalen son extremos 3' o extremos 5'. En una modalidad preferida, el agente que aumenta la recombinación homologa es: una proteína Rad52 o un fragmento funcional de la misma ; una pro eína Rad51 o un fragmento funcional de la misma , una proteína Ra d54 o un fragmento funcional de la misma; o una combinación de éstas En una modalidad pre erida el agente que aumenta la recombinación homologa se adhiere por ejemplo a, se recubre en , la secuencia de ADN . En una modalidad preferida, la proteína Rad52 o fragmento funcional de la misma se adhiere a , por ejemplo, se recubre en la secuencia de A DN . En una modalidad preferida la funcional de la misma se adhiere a , por ejemplo, se recubre en la se cuencia de ADN . En una modalidad preferida, la proteína Rad52 o fragmento de la misma , es Rad52 humana (hRad52). En una modalidad prefe rida, el anticuerpo anti-Ku es: un anticuerpo anti-Ku70; un anticuerpo anti-Ku80. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-Ku es: un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un fragmepto de anticuerpo, o por ejemplo, un fragmento Fab, Fab' , F(ab')2 ó rf (v). En una modalidad prefer da, al menos un anticuerpo anti-Ku , está enlazado en forma covalente a: la secuencia de ADN , la proteína Rad52 o fragmento de la misma . En otra modalidad preferida, al menos un anticuerpo anti-Ku está enlazado en forma no covalente a: la secuencia de ADN ; la proteína Rad52 o fragmento de la misma. En una modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo anti-Ku70 y un anticuerpo anti-Ku80, por ejemplo, en la forma de componentes de un complejo. En una modalidad preferida, la célula es: una célula eucariótica. En una modalidé d preferida, la célula es de origen fúngico, de plantas o animales, por ejemplo de origen vertebrado.

En una modalidad preferida, la célula es: una célula mam ífera, por ejemplo, una célula mamífera p rimaría o secundaria, por ejemplo, un fibroblasto, una célula madre hematopoyética, un mioblasto, un ceratinocito, una célula epitelial , una célula endotelial , una célula glial , una célula neural , una célula que comprende un elemento formado a partir de la sangre, una célula de músculo y precursores de estas células somáticas; una línea celular transformada o inmortalizada. Preferentemente, la célula es una célula humana. Los ejemplos de la l ínea celul ar humana inmortalizada útiles en el método de la presente invención, incluyen pero no se limitan a: célula de melanoma de Bowes (Acceso ATCC No. CRL 9607), una célula de Daudi (Acceso ATCC No. CCL 21 3), una célula HeLa y un derivado de una célula HeLa (Acceso ATCC Nos. CCL2 CCL2.1 , y CCL 2.2), una célula H L-60 (Acceso ATCC No. CCL 240), una célula HT1 080 (Acceso ATCC No. CCL 1 21 ), una célula J urkat (Acceso ATCC No. TI B 1 52), una célula de carcinoma KB (Acceso ATCC No. CCL 1 7), una célula de leucemia K-562 (Acceso ATCC No. CCL 243), una célula de cáncer de seno MCF-7 (Acceso ATCC No. BTH 22), una célula MOLT-4 (Acceso A CC No. 1 582), una célula Namalwa (Acceso ATCC No. CRL 1432), una célula Rafji (Acceso ATCC No.

CCL 86), una célula RPM l 8226 (Acceso ATCC No. CCL 1 55), una célula U-937 (Acceso ATCC No 1 593), células de subl ínea 2R4 Wl- 28VA1 3 (Acceso ATCC No. CCÜ 1 55), una célula CCRF-CEM (Acceso ATCC No. CCL 1 1 9), y una cé ula de carcinoma de ovario 2780AD (Van Der Blick y asociados. , Cáncer Res. 48:5927-5932, 1 988), así como células de heterohibridorna producidas mediante la fusión de células humanas y células de otras especies. En otra modalidad , la l ínea celular inmortalizada puede ser una línea celular diferente a una línea celular humana, por ejemplo, una l ínea celular CHO, una línea celular COS. En una modalidad preferida , los componentes, por ejemplo los componentes de un complejo, se introducen en la célula mediante microinyección . En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada difiere del ADN objetivo por menos de 1 0, 8, 6, 5, 4, 3,2, o por un solo nucleótido, por ejemplo, por una substitución, una eliminación o una inserción. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación, por ejemplo, la secuencia objetivo difiere de la secuencia tipo natural por aproximadarr ente 10,8,6,5,4,3,2 o por un solo nucleótido. Preferentemente, la mutación es una mutación de punto, por ejemplo, una mutación debido a una inserción, eliminación o substitución. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está asociada con, por ejemplo, causa, contribuye a, condiciona o controla una enfermedad o una disfunción. Preferentemente, la enfermedad de disfunción es: fibrosis quística; anemia por células drepanocítícas; hemofilia A; hemofilia B; enfermedad de von Willebrand tipo 3; xeroderma pigmentosa; talassaemias; síndrome de Lesch-Nylan; resistencia a la proteína C; enfermedad de almacenamieinto de lisosomas, por ejemplo enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry; mucopolisacaridosis tipo 1(MPS) (síndrome de Hurley-Scheie), MPS tipo II (síndrome de Hunter), MPS tipo IIIA (síndrome de Sanfilio A), MPS tipo IIIB (síndrome de Sanfilio B), MPS tipo MIC (síndrome de Sanfilio C), MPS tipo MID (síndrome de Sanfilio D), MPS tipo IVA (síndrome de Morquio A), MPS tipo IVB (síndrome de Morquio B), MPS tipo VI (síndrome de Maroteaux-Larry), MPS tipo Vil (síndrome de Sly).

En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia de tipo natural normal la cual puede corregir la mutación . En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen regulador de la transmembrana de fibrosis qu stica (CFTR). Preferentemente, la mutación es una que altera e aminoácido en el codón 508 de la región que codifica la proteína CFTR, por ejemplo, la mutación es una eliminación en cuadro de 3 pares base que elimina una fenilalanina en el codón 508 de¡ la proteína CFTR. Esta eliminación de la fenilalanina-508 en la prc teína CFTR, se encuentra en un alto porcentaje en sujetos que tienen fibrosis qu ística . Por lo tanto, en una modalidad preferida, se p uede utilizar una secuencia de ADN seleccionada que incluye una secuencia que codifica fenilalanina-508 tal como se encuentra en el gen CFTR de tipo natural , para dirigir y corregir el gen CFTR mutado. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen ß-globina. Preferentemente, la mutación es una que altera el aminoácido en el sexto codón del gen ß-globina , por ejemplo, la mutación es una substitución de A a T en el sexto codón del gen ß-g obina. Esta mutación conduce a un cambio del ácido glutámico a valina en la proteína ß-globina, lo cual se encuentra en sujetos que tienen anemia por células drepanocíticas. Por lo tanto, en una modalidad preferida , un ADN seleccionado que codifica un residuo de aminoácido de tipo natural En una modalidad preferida , el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen de factor IX. Por ejemplo, en sujetos que tienen hemofilia B, la mayor parte de las mutaciones son mutaciones de punto en el gen de factor IX. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada puede incluir uno o más nucleótidos que tienen al menos un nucleótido procedente del gen de factor IX de tipo natural para dirigir y corregir una o más de las mutaciones de punto en el gen de factor IX asociado con hemofilia B. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen de factor von Willebrand . Preferentemente, la mutación es una sola eliminación de citocina en un estiramiento de 6 citocinas en las posiciones 2679-2684 en el exón 1 8 del gen von Willebrand. Esta mutación se encuentra en un porcentaje significativo de sujetos que tienen enfermedad de von Willebrand tipo 3. También se pueden alterar, tal como se describe en la presente invención , otras mutaciones, por ejemplo, mutaciones de punto asociadas con la enfermedad de von Willebrand tipo 3. Por lo tanto, en una modalidad preferida, se puede utilizar una secuencia de ADN seleccionada que ncluye secuencias que se encuentran en el gen von Willebrand de tipo natural , por ejemplo, las 6 citosinas en las posiciones 2679-2684 del gen von Willebrand para dirigir y corregir el gen von Willebrand mutado. En una modalidad prefe rida , el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está |en el gen del grupo de Xeroderma pigmentoso G (XP-G). Pre erentemente, la mutación es una eliminación de una sola adeniná en un estiramiento de tres adeninas en las posiciones 1 9-21 de un exón de 245 pares base encontrado en el gen XP-G. Esta eliminación conduce a xeroderma pigmentosa. Por lo tanto, en una modalidac preferida, se puede utilizar un ADN seleccionado que incluye la secuencia de tipo natural del gen XP-G , por ejemplo, tres adeninas en as posiciones 1 9-21 del exón de 245 pares base, para dirigir y correg ir el gen XP-G mutado. Preferentemente, tambié i i se proporciona un agente que inactiva una proteína de reparación mal emparejada tal como Msh2 , Msh6, Msh3, Mlh 1 , Pms2 , Mlh3 Pms 1 . El agente puede incluirse en un complejo. En otra modalidad preferida, la alteración incluye la recombinación homologa entre la secuencia de ADN seleccionada y el ADN objetivo, por ejemplo, u n cromosoma, En una modalidad preferí a, la secuencia de ADN seleccionada difiere del ADN objetivo por nás de un nucleótido, por ejemplo, difiere del objetivo por un núme ro suficiente de nucleótidos, de modo que el objetivo, o la secuencia de ADN seleccionado tiene una región dispareja, por ejemplo, de espiral . En tal aplicación , también se pueden proporcionar Msh2, Msh6, Msh3, Mlh 1 , Pms2 , Mlh3, Pms1 , como parte de un complejo. En una modalidad preferida, la alteración incluye la integración de la secuencia seleccionada en el ADN objetivo y el ADN seleccionado se integra de modo que esté en una relación seleccionada previamente con un elemento seleccionado previamente con el objetivo, por ejemplo, si uno es un elemento regulador y el otro es una secuencia que codifica una proteína, el elemento regulador funciona para regular la expresión de la secuencia que codifica la proteí na. Se pueden utilizar secuencias de flanqueo que promueven la integración seleccionada. La secuencia de ADN seleccionada puede ser 5', 3', integrados, o dentro, de una secuencia objetivo seleccionada, por ejemplo, un gen o secuencia de codificación. En una modalidad preferica, la alteración incluye la integración de la secuencia de ADN se eccionada y la secuencia de ADN seleccionada es una secue cia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora exógena En una modalidad preferida, la secuencia reguladora incluye uno o más de dos puntos, un promotor, un aumentador, una secuencia de activación de corriente ascendente (UAS), una región de adhesión de andamio o un sitio de enlace de factor de transcripción. En uria modalidad preferida, la secuencia reguladora incluye: una secuen icia reguladora procedente de un gen de metalotionein-l, por ejemplo », un gen de metalotionein-l de ratón, una secuencia reguladora procedente de un gen SV-40, una secuencia reguladora procedente de un gen de citomegalovirus, una secuencia reguladora de un gen de colágeno, una secuencia reguladora procedente de u in gen de actina, una secuencia reguladora procedente de un ge n de inmunoglobulina, una secuencia reguladora procedente del gen de reductasa HMG-CoA, una secuencia reguladora procedente del gen de actin ?, una secuencia reguladora procedente de un ge n YY1 activador de transcripción , una secuencia reguladora procedente de un gen de fibronectina, una secuencia reguladora procedente del gen de EF-1 a. En una modalidad preferida , la secuencia de ADN seleccionada incluye un exón . Preferentemente el exón exógeno incluye: un sitio CAP, la secuencia de nucleótidos ATG , y/o el ADN de codificación en cuadro con el gen endógeno dir gido. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye un sitio de empalme del donante En una modalidad preferí a , la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia regula dora exógena , la cual , cuando se integra en el objetivo funcio ?a para regular una secuencia de codificación endógena. La se :uencia de ADN seleccionada puede integrarse en la corriente ascer dente de la región de codificación de un gen endógeno en el objetiv D o en la corriente ascendente de la secuencia reguladora endógené de un gen endógeno en el objetivo, En otra modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada puede estar integrada en la corriente descendente de un gen endógeno o una región de codif cación o dentro de un intrón o un gen endógeno. En otra modalidé d preferida, la secuencia de ADN seleccionada puede estar integrada de modo que la secuencia reguladora endógena del gen endógeno esté inactiva, por ejemplo, esté completa o parcialmente eliminada .

En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada está en la corriente ascendente de un gen endógeno y está enlazada al segundo exón del gen endógeno. En una modalidad preferida , el gen endógeno codifica : una hormona , una citocina, un antígeno, un anticuerpo, una enzima , un factor de coagulación , una de proteína transporte, un receptor, una proteína reguladora , una proteína estructural o un factor de transcripción . En una modalidad preferida, el gen endógeno codifica cualesquiera de las siguientes proteínas: eritropoyetina, calcitronina , hormona de crecimiento, ine;ulina, insulinotropina , factores de crecimiento similares a insulina, hormona de tiroides, interferón-a2 (I FNA2), interferón-ß, interferón-?, factores de crecimiento nervioso, FSHß, TGF-ß, factor de necrosis de tumor, glucagón , factor de crecimiento de huesos-2, factor de crecimiento de huesos-7, TSH-ß, interleucina 1 , interleucina 2 , interleucina 3, interleucina 6, interleucina 1 1 , interleucina 12 granulocito-CSF (GCSF), macrófago- CSF, granulocito/macrófago-C F, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, cinasa de proteína C, glucocerebrosidasa, dismutasa de superóxido, activador de plasminogen de tejido, urocinasa, antitrombina l l l , ADNse, galactosidasa-a, hidroxilasa de tirosina, factor de Coagulación de sangre V, factor de Coagulación de sangre Vi l , factor de Coagulación de s angre VI I I , factor de Coagulación de sangre IX, factor de Coagulació >n de sangre X, factor de Coagulación de sangre XI I I , apolipoproteín í a E , apolipoproteína A-l , globinas, receptor de lipoproteína de baja densidad , receptor IL-2 , antagonistas I L-2, antitripsina-a-1 , modificadores de respuesta inmune, glucoceramidasa-ß, iduronidasa-a, iduronidasa-a-L, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoensimaA: a-glucosamina-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, galactosidasa-ß, glucuronidasa-ß, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa y CD4 soluble. En una modalidad preferida, el gen endógeno codifica la hormona ß de estimulación de fDlículo (FSHß) y la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora que d if i ere en secuencia de la secuencia reguladora del gen FSHß. Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada DOG una secuencia de dirección, por ejemplo, la secuencia de dirección está presente en uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada. En una modalida d preferida, la secuencia de dirección es homologa a una región 5' de la región de codificación FSHß (SEQ I D NO: 1 ). En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinación hom óloga dentro de la secuencia de codificación FSHß o corriente ascendente de la secuencia de codificación FSHß. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 100 ó 1000 nucleótidos contiguos de SEQ I D NO:2, que corresponde a -7454 a -1417 de la secuencia FSHß humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción), o SEQ I D NO: 3, que corresponde a los nucleótidos -696 a -1 55 de la secuencia FSHß humana . En una modalidad preferida, el gen endógeno codifica interferón a2 (I FNa2) y la secuencia ADN seleccionada incluye una secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora la cual difiere en secuencia de la secuencia reguladora del gen I FNa2. Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secuencia de dirección , por ejemplo, una secuencia que está presente en uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada . En una modalidad preferida, la secuencia de dirección es homologa a una región 5' de la región de codificación I FNa2. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinacion homologa dentro de una región de corriente ascendente de la secuencia de codificación I FNa2. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 1 00 Ó 1 000 nucleótido s contiguos de SEQ I D NO:4, que corresponde a los nucleótidos 4074 a -51 1 de la secuencia I FNa2 humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción).

Por ejemplo, puede incluir: al menos 20, 30, 50 ó 1 00 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO:7, que corresponde a los nucleótidos - 4074 a -3796 de la secuencia FNa2 humana; al menos 20, 30 ó 50 nucleótidos procedentes de SÉQ I D NO:8, que corresponde a los nucleótidos -582 a -51 0 de la secuencia I FNa2 humana; al menos 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO: 9, que corresponde a los nucleótidos -3795 a -583 de la secuencia I FNa2 humana. En una modalidad preferida, el gen endógeno codifica el factor de estimulación de colonia de granulocito (GCSF) y la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia reguladora , por ejemplo, una secuencia reguladora que difiere en secuencia de la secuencia reguladora del gen GCSF. Prsferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada oor una secuencia de dirección , por ejemplo una secuencia que está presente en uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada. En una modalida d preferida, la secuencia de dirección es homologa a la región 5' de la región de codificación GCSF. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinación homologa dentro de la secuencia de codificación GCSF o corriente ascendente d e la secuencia de codificación GCSF. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos contiguos procedentes de SEQ I D NO: 5, que corresponde a los nucleótidos -6, 578 a 1 01 de la secuencia GCSF humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción). Por ejemplo, le secuencia objetivo puede incluir 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO: 6, que corresponde a los nucleótidos - 3, 578 a -364 del gen GCSF humano.

En otra modalidad preferi da , la secuencia de ADN incluye una región de codificación , por ejemplo, la secuencia de ADN seleccionada que codifica una proteína. En una modalidad preferida, acetilcoensimaA: a-gluco samina-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa galactosidasa-ß, glucuronidasa-ß, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa. y CD4 soluble. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada puede estar integrada en el obj 3tivo para que esté bajo el control de un elemento regulador endógen o. El ADN seleccionado puede estar integrado en la corriente desce ndente de una secuencia reguladora endógena o corriente ascender te de una región de codificación de un gen endógeno de una corriente descendente de la secuencia reguladora endógena del gen. En otra modalidad preferida, el ADN seleccionado puede estar integ rado en la corriente descendente de una secuencia reguladora endógena, para que la región de codificación del gen endógeno sea inactivada, por ejemplo, sea completa o parcialmente eliminada. En una modalidad prefer da, el método incluye introducir un agente que inhibe una proteína de reparación de mal emparejamiento, por ejemplo, IV sh2, Msh6, Msh3, Mlh 1 , Pms2, Mlh3, Pms1 u otras proteínas de reparación de mal emparejamiento o combinaciones de las mismas. Preferentemente, el agente es un agente que inhibe la expresión de una proteína de reparación de mal emparejamiento, por ejemplo, e I agente es un ARN antisentido. En otra modalidad preferida, el a gente es un anticuerpo contra una proteína de reparación de mal emparejamiento. En una modalidad preferida, el anticuerpo contra la proteína de reparación de mal emparejamiento está enlazado en forma covalente o no covalente al complejo. En otro aspecto, la presente invención presenta una composición , por ejemplo, un complejo de componentes para promover una alteración en el ADN objetivo, por ejemplo, un cromosoma, por ejemplo un ADN objetivo descrito en la presente invención, que utiliza una secuencia de ADN seleccionada, por ejemplo una secuencia de ADN seleccionada descrita en la presente invención , tal como una plantil a. La composición incluye: (a) una secuencia de ADN de hilo doble que incluye una secuencia de ADN seleccionada; (b) un agente que aumenta la recombinación homologa por ejemplo, una proteína Rad52 o una proteína o un fragmento funcional de la misma; (c) un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un ejemplo que inactiva el Ku . La composición puede utilizarse, por ejemplo, para alterar la secuencia de ADN objetivo mediante integración . En una modalidad preferida, el agente que inhibe una unión del extremo no homólogo es un agente que inactiva hMre1 1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-hIV rel 1 o un oligómero o polímero de enlace hMre 1 1 ; un agente que inactiva h RaddO, por ejemplo, un anticuerpo anti-hRad50 o un oligómero o pol ímero de enlace h RaddO, un agente que inactiva Nbs 1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-Nbs l o un oligómero o pol ímero de enlace hN bs l ; un agente que inactiva la ligasa humana 4 (hLig4), por ejemplo, un anticuerpo anti-hLig4 o un oligómero o polímero de enlace hLig4; un agente que inactiva debe ser homologa con una primera región del objetivo y la otra debe ser homologa con una segunda egión del objetivo. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN tiene uno o más extremos de un solo hilo que sobresale, por ejemplo, uno o ambos de los extremos que so jresalen son extremos 3' o extremos 5'. En una modalidad preferida, el agente que aumenta la recombinación homologa es: t na proteína Rad52 o un fragmento funcional de la misma; una proteína Rad51 o un fragmento funcional de la misma , una proteína Rad54 o un fragmento funcional de la misma; o una combinación de éstas. En una modalidad preferida el agente que aumenta la recombinación homologa se adMere por ejemplo a , se recubre en , la secuencia de ADN . En una modalidad preferida, la proteína Rad52 o fragmento funcional de la mií;ma se adhiere a, por ejemplo, se recubre en la secuencia de ADN . En una modalidad preferida la proteína Rad52 o el fragmento funcional de la misma se adhiere a, por ejemplo, se recubre en la se cuencia de ADN. En una modalidad preferida, la proteína Rad52 o fragmento de la misma, es Rad52 humano (hRad52). En una modalidad prefe rida, el anticuerpo anti-Ku es: un anticuerpo anti-Ku70; un anticuerpo anti-Ku80. En una modalidad preferida , el anticuerpo anti-Ku es: un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un fragmento de anticuerpo, o por ejemplo, un fragmento Fab, Fab' , F(ab')2 ó F(v).

En una modalidad preferida, al menos un anticuerpo anti-Ku, está enlazado en forma cove lente a : la secuencia de ADN , la proteína Rad52 o fragmento de la misma. En otra modalidad preferida, al menos un anticuerpo anti-Ku está enlazado en forma no covalente a: la secuencia de ADN ; la proteína Rad52 o fragmento de la misma . En una modalidad preferida, la composición ¡ncluye un anticuerpo anti-Ku70 y un anticu erpo anti-KudO. En una modalidad preferic a, la secuencia de ADN seleccionada difiere del ADN objetivo por menos de 1 0, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o por un solo nucleótido, por ejemplo, por una substitución , o una eliminación o una inserción . En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación , por ejemplo, la secuencia objetivo difiere de la secuencia tipo natural por aproximadamer te 1 0, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o por un solo nucleótido. Preferentemente, le mutación es una mutación de punto, por ejemplo, una mutación debido a una inserción , eliminación o substitución . En una modalidad prefe rida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está asociada con , por ejemplo, causas, condiciones o controles que contribuyen a, una enfermedad o una disfunción . Preferentemente, la enfermedad de disfunción es: fibrosis qu ística; anemia por células drepanocíticas; hemofilia A; hemofilia B; enfermedad de von Willebrand tipo 3; xeroderma pigmentosa ; talassaemias; síndrome de Lesch-Nylan; resistencia a la proteína C; enfermedad de almacenamiento de lisosomas, por ejemplo enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry; mucopolisacaridosis tipo 1 (M PS) (síndrome de Hurley-Scheie), M PS tipo I I (síndrome de H unter), M PS tipo M ÍA (síndrome de Sanfilio A), M PS tipo M I B (síndrome de Sa nfilio B), M PS tipo M I C (síndrome de Sanfilio C), M PS tipo M I D (síndrome de Sanfilio D), M PS tipo IVA (síndrome de Morquio A), MPS tipo IVB (síndrome de Morquio B), M PS tipo VI (síndrome de Marc teaux-Larry), MPS tipo Vi l (síndrome de Sly). En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia de tipo natural normal la cual pi ede corregir la mutación . En una modalidad prefe rida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación es, tá en el gen regulador de la transmembrana de fibrosis qu stica (CFTR). Preferentemente, la mutación es una que altera el aminoácido en el codón 508 de la región que codifica la proteína CFTR, por ejemplo, la mutación es una eliminación en cuadro d e 3 pares base que elimina una fenilalanina en el codón 508 de la proteína CFTR. Esta eliminación de la fenilalanina-508 en la proteína CFTR, se encuentra en un alto porcentaje en sujetos que tienem fibrosis quística. Por lo tanto, en una modalidad preferida, se p jede utilizar una secuencia de ADN seleccionada que incluye una secuencia que codifica fenilalanina-508 tal como se encuentra en el gen CFTR de tipo natural, para dirigir y corregir el gen CFTR mutado.

En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está er el gen ß-globina . Preferentemente, la mutación es una que altera el aminoácido en el sexto codón del gen ß-globina, por ejemplo, la mutación es una substitución de A a T en el sexto codón del gen ß-g obina. Esta mutación conduce a un cambio del ácido glutámico a valina en la proteína ß-globina, lo cual se encuentra en sujetos que tienen anemia por células drepanocíticas. Por lo tanto, on una modalidad preferida , un ADN seleccionado que codifica un residuo de aminoácido de tipo natural en el codón 6, por ejemplo, una secuencia de ADN seleccionada que incluye una A como se encuent rr a dentro del sexto codón del gen ß-globina de tipo natural , se pued ee utilizar para dirigir y corregir el gen ß-globina mutado. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen de factor VI I I . Por ejemplo, una mutación puede estar en el exón 23, 24, y/o 25 del gen de factor VI I I . Preferentemente, la muta sión es una que altera el aminoácido en el codón 2209 de la regic n de codificación de la región que codifica la proteína de factor VI H , por ejemplo la mutación es una substitución de G a en el exón 24 del gen de factor VI I I que conduce a un cambio de una arginina a una glutamina en el aminoácido 2209 del factor VI I I . Preferentemente, la mutación es una que altera el aminoácido en el codón 2229 de la región de codificación de la región que codifica la proteína de factor VI I I , por ejemplo, la mutación es una substitución de G a T en el exón 25 del gen de factor VI I I que conduce a un cambio de triptofan a una cisteína en el aminoácido 2229 del factor VI I I . Estas mutaciones han sido asociadas con hemofilia A de moderada a severa. Por lo tanto, en una modalidad preferida, una secuencia de ADN seleccionada que incluye cualquier ADN que codifique un aminoácido de tipo natural en el codón 2209 de la región que codifica el gen de factor VI I I o ADN que codifica un aminoácido de tipo natural en el codón 2229 de la región de codificación del gen de factor VI I I o ambos, se pueden utilizar para dirigir y corregir el jen de factor VI I I mutado. En una modalidad prefe rida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen de factor IX. Por ejemplo, en sujetos que tienen hemofilia B, a mayor parte de las mutaciones son mutaciones de punto en el ger de factor IX. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada puede incluir uno o más nucleótidos que tienen al menos un nucleótido procedente del gen de factor IX de tipo natural para dirigir y corregir una o más de las mutaciones de punto e n el gen de factor IX asociado con hemofilia B. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está on el gen de factor von Willebrand . Preferentemente, la mutación e . una sola eliminación de citocina en una tensión de 6 citocinas en la s posiciones 2679-2684 en el exón 1 8 del gen von Willebrand. E sta mutación se encuentra en un porcentaje significativo de sujetos que tienen enfermedad de von Willebrand tipo 3. También se pueden alterar, tal como se escribe en la presente invención, otras mutaciones, por ejemplo, mutaciones de punto asociadas con la enfermedad de von Willebrand tipo 3. Por lo tanto, en una modalidad preferida , una secuencia de ADN seleccionada que incluye secuencias que se encuentran en el gen von Willebrand de tipo natural , por ejemplo, las 6 citosinas en las posiciones 2679-2684 del gen von Willebrand se pueden utilizar para dirigir y corregir el gen von Willebrand mutado. En una modalidad prefe rida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen del grupo de Xeroderma pigmentoso G (XP-G). Pre erentemente, la mutación es una eliminación de una sola adeniná en una tensión de tres adeninas en las posiciones 1 9-21 de un exón de 245 pares base encontrado en el gen XP-G . Esta eliminación co nduce a xeroderma pigmentosa . Por lo tanto, en una modalidad p referida, un ADN seleccionado que incluye la secuencia de tipo natural del gen XP-G , por ejemplo, tres adeninas en las posiciones 1 9 -21 del exón de 245 pares base, se puede utilizar para dirigir y corregir el gen XP-G mutado. En otra modalidad preferic a, la secuencia de ADN seleccionada difiere del ADN objetivo por más de un nucleótido, por ejemplo, difiere del objetivo por un núme ro suficiente de nucleótidos de modo que el objetivo, o la secuencia de ADN seleccionada tiene una región dispareja, por ejemplo, una región de espiral . Preferentemente también se incluye en la composición , un agente que inactiva una proteína de reparación de mal emparejamiento tal como Msh2 , Msh6, Msh3, Mlh 1 , Pms2, Mlh3, Pms1 , o combinaciones de las misma, por ejemplo, el agente puede incluirse en el complejo. En una modalidad preferic a, la secuencia de ADN seleccionada tiene una secuencia de flanqueo de modo que puede integrarse en una relación seleccionada previamente con un elemento seleccionado previamente en e ADN objetivo. Por ejemplo, el ADN seleccionado es una secuencia reguladora y el ADN objetivo codifica una proteína, la secuencia de flanqueo se integrará con el elemento regulador de modo que funcione para regular la expresión de la secuencia de codificación d e proteína. Se pueden utilizar secuencias de flanqueo que prpmuevan la integración seleccionada.

La secuencia de ADN seleccio nada puede tener una secuencia de flanqueo para que pueda es :ar integrada 5', 3' o dentro, una secuencia objetivo seleccionad a, por ejemplo, un gen o una región de codificación en el objetivo. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora exógena. En una modalidad preferida, la secuencia reguladora incluye uno o más de dos puntos, un promotor, un aumentador, una secuencia de activación de corriente ascendente (UAS), una región de adhesión de andamio o un sitio de enlace de factor de transcripción. En u a modalidad preferida, la secuencia reguladora incluye: una secuen cia reguladora procedente de un gen de metalotioneina-l , por ejempl o, gen de metalotioneina-l de ratón una secuencia reguladora p rocedente de un gen SV-40, una secuencia reguladora procedente de un gen de citomegalovirus, una secuencia reguladora de un gen de colágeno, una secuencia reguladora procedente de ui gen de actina, una secuencia reguladora procedente de un gen de inmunoglobulina, una secuencia reguladora procedente del cien de reductasa HMG-CoA, una secuencia reguladora proceden te del gen de actin ?, una secuencia reguladora procedente de un ge ¡n YY1 activador de transcripción, una secuencia reguladora procedente de un gen de fibronectina, una secuencia reguladora procedente del gen de EF-1a. En una modalidad preferica, la secuencia de ADN seleccionada incluye un exón. Preferentemente el exón exógeno incluye: un sitio CAP, la secuencia de nucleótidos ATG, y/o el ADN de codificación en cuadro con el gen endógeno din gido. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye un sitio de empalme del donante.

En una modalidad preferida, una composición que incluye una secuencia de ADN seleccionada que tiene una secuencia reguladora exógena puede, tener una secuencia de flanqueo, para que esté integrada en el objetivo de modo que funcione para tabular la expresión de una secuencia en dógena. El ADN seleccionado puede estar integrado en la corriente ascendente objetivo de la región de codificación de un gen endógen o o la secuencia de codificación en el objetivo, o estar integrada en la corriente ascendente objetivo de la secuencia reguladora endógena de un gen endógeno o secuencia de codificación en el objetivo. En otra modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionade puede estar integrada en el objetivo de modo que la secuencia reg uladora endógena del gen endógeno esté inactiva, por ejemplo, esté completa o parcialmente eliminada.

La secuencia de ADN selecci onada puede estar integrada en la corriente descendente objetiv o del gen endógeno o región de codificación, o integrada dentro de un intrón de un gen endógeno. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia regula dora, por ejemplo, una secuencia reguladora que difiere en secuencia de la secuencia reguladora del gen FSHß. Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secuenc ia de dirección, por ejemplo, la secuencia de dirección está presente en un o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección es homologa a una región 5' de la región de codificación FSHß (SEQ ID NO:1). En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinación homologa dentro de la secuencia de codificación FSHß o corriente ascendente d e la secuencia de codificación FSHß. En una modalidad preferida a secuencia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 100 ó 1000 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:2, que corresponde a -7454 a -1417 de la secuencia FSHß humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción), o SEQ ID NO: 3, que corresponde a los nucleótidos -696 a -155 de la secuencia FSHß humana.

En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia regule dora, por ejemplo, una secuencia reguladora que difiere en secu 3ncia de la secuencia reguladora del gen I FNa2. Preferentemente, a secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secuencia de dirección , por ejemplo, una secuencia que está presente e n uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada. En una modalidad preferida, la secuen cia de dirección es homologa a una región 5' de la región de cod ificación I FNa2. En una modalidad preferida , la secuencia de dirección dirige la recombinación homologa dentro de una reg ion de corriente ascendente de la secuencia de codificación I FN 2. En una modalidad preferida , la secuencia de dirección incluyo al menos 20, 30, 50, 1 00 Ó1 000 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:4, que corresponde a los nucleótidos-4074 a -51 1 de la secuencia I FNa2 humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción). Por ejemplo, puede incluir: al menos 20, 30, 50 ó 100 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO: 7, que corresponde a los nucleótidos -4074 a -3796 de la secuencia I FNa2 humana; al menos 20, 30 ó 50 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO: 8, que corresponde a los nucleótidos - 582 a -51 0 de la secuencia I FNa2 humana; al menos 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO: 9, que corresponde a los nucleótidos -3795 a -583 de la secuencia I FNa2 humana. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora que difiere en secu jencia de la secuencia reguladora del gen GCSF. Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secu sncia de dirección , por ejemplo una secuencia que está presente en uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección es homologa a la región 5' de la región de coc ificación GCSF. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinación homologa dentro de la secuencia de codificación GCSF o corriente ascendente de la secuencia de codificación GCSF . En una modalidad preferida, la secuencia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidc s contiguos procedentes de SEQ I D NO: 5, que corresponde a los nucleótidos -6,578 a 101 de la secuencia GCSF humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción ). Por ejemplo, la secuencia objetivo puede incluir 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidoü procedentes de SEQ I D NO: 6, que corresponde a los nucleótidos -6,578 a -364 del gen GCSF humano (la numeración es relativa al sitio de inicio de la traducción . En otra modalidad preferí da, la secuencia de ADN incluye una región de codificación , por ejemplo, la secuencia de ADN seleccionada que codifica una proteína. En una modalidad preferida, la región de codificación codifica: una hormona , una citocina, un antígeno, un anticuerpo, una enzima, un factor de coagulación , una proteína de transporte, un receptor, una proteína reguladora , una proteína estructural o un factor de transcripción . En una modalidad preferida, la región de codificación codifica cualesquiera de las siguientes proteínas, eritropoyetina, calcitonina, hormona de crecimiento, insulina, insulin otropina, factores de crecimiento similares a insulina, hormona paratiroides, interferón-a2 (IFNA2), interferón-ß, interferón-?, facto es de crecimiento de nervios, FSHß TGF-ß, factor de necrosis de tumor, glucagon, factor de crecimiento de huesos-2, factor de crecimiento de huesos-7, TSH-ß, interleucina 1 , interleucina 2, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 1 1 , interleucina 12, granulocito-CSF (GCSF), macrófago-CSF, granulocito/macrófago-CSF, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, cinasa de proteína C, glucocerebrosidasa, dismutasa de superóxido, activador de lasminogen de tejido, urocinasa, antitrombina l l l , ADNse, gala ptosidasa-a, hidroxilasa de tirosina, factor de Coagulación de sangre V, factor de Coagulación de sangre Vi l , factor de Coagulación de sangre VI I I , factor de Coagulación de sangre IX, factor de Coagulación de sangre X, factor de Coagulación de sangre XII I , apolipoproteína E, apolipoproteína A-l, globinas, receptor de lipoproteína de baja densidad, receptor I L-2, antagonistas I L-2 , antitripsin a-a-1 , modificadores de respuesta inmune, glucoceramidasa-ß, iduronidasa- , iduronidasa-a-L, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoensimaA: a-glucosamina-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, galactosidasa-ß, glucuronidasa-ß, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa, y CD4 soluble.

En una modalidad preferic a , la secuencia de ADN seleccionada puede tener una secuencia d flanqueo de modo que cuando se integra en el objetivo está baje el control de un elemento regulador endógeno. El ADN selección ado puede estar integrado en la corriente descendente de una secuencia reguladora endógena o corriente ascendente de una región de codificación de un gen endógeno y en la corriente des 5cendente de la secuencia reguladora endógena del gen . En otra modalidad preferida, el ADN seleccionado puede estar integrado en la corriente descendente de una secuencia reguladora endógena de modo que la región de codificación del gen endógeno está inactiva, por ejemplo, está completa o parcialmente eliminé da. En una modalidad preferida, la composición, por ejemplo, el complejo se introduce en una célula. Preferentemente, la célula es una célula eucariótica. En una modalidad preferida, la célula es: una célula mamífera, por ejemplo, una célula mamífera primaria o secundaria, por ejemplo, u n fibroblasto, una célula madre hematopoiética, un mioblasto, un ceratinocito, una célula epitelial , una célula endotelial , una célu a glial , una célula neural , una célula que comprende un elemento formado de la sangre, una célula de músculo y precursores de esta > células somáticas; una línea celular transformada o inmortalizada, Preferentemente, la célula es una célula humana. Los ejem Dios de la l ínea celular humana inmortalizada útiles en el método de la presente invención, incluyen pero no se limitan a: célula de melanoma de Bowes (Acceso ATCC No. CRL 9607), una célula de Daudi (Acceso ATCC No. CCL 21 3), una célula HeLa y un derivado de una célula HeLa (Acceso ATCC Nos. CCL2 CCL2.1 , y CCL 2.2) una célula HL-60 (Acceso ATCC No. CCL 240), una célula HT1 080 (Acceso ATCC No. CCL 1 21 ), una célula Jurkat (Acceso ATCC Np. TI B 1 52), una célula de carcinoma KB (Acceso ATCC No. CCL 1 7), una célula de leucemia K-562 (Acceso ATCC No. CCL 243), una célula de cáncer de seno MCF-7 (Acceso ATCC No. BTH 22), u ?a célula MOLT-4 (Acceso ATCC No. 1 582), una célula Námalwa (Acceso ATCC No. CRL 1432), una célula Rafji (Acceso ATCC No. CCL 86), una célula RPM l 8226 (Acceso ATCC No. CCL 1 55), una célula U-937 (Acceso ATCC No. 1 593), células de sublínea 2R4 WI-28VA1 3 (Acceso ATCC No. CCL 1 55), una célula CCRF-CEM (Acceso ATCC No. CCL 1 1 9), y una célula de carcinoma de ovario 2780AD i Van Der Blick y asociados. , Cáncer Res. 48:5927-5932, 1 988), a í como células de heterohibridoma producidas mediante la fusión c e células humanas y células de otras especies. En otra modalidad, la línea celular inmortalizada puede ser una l ínea celular diferente a una línea celular humana , por ejemplo, una l ínea celular HCO una línea celular COS. En una modalidad preferida, la composición incluye además un agente que inhibe una proteína de reparación de mal emparejamiento, por ejemplo M sh2 , Msh6, Msh3, Mlh 1 , Pms2 , Mlh3, Pms1 u otras proteínas de reparación de mal emparejamiento o combinaciones de las mismas Preferentemente, el agente es un agente que inhibe la expresión de una proteína de reparación de mal emparejamiento, por ejemplo, el agente es un ARN antisentido. En una modalidad preferida, el agente es un anticuerpo contra una proteína de reparación de mal emparejamiento. En una modalidad preferida, el anticuerpo contréi la proteína de reparación de mal emparejamiento está enlazado en forma covalente o no covalente a uno o más componentes de la composición. En otro aspecto, la presiente invención presenta un método para proporcionar una proteína, El método incluye: proporcionar una célula elaborada a través de un método descrito en la presente invención, y dejar que la célula exprese la proteína. En una modalidad prefe? ida: el método incluye: proporcionar una célula en la cual se hayan introducido los siguientes componentes en un sitio di -igido para la alteración: (a) una secuencia de ADN de hilo dobl e que incluye una secuencia de ADN seleccionada; (b) un agente que aumenta la recombinación homologa, por ejemplo, una proteína Rad52, o un fragmento funcional de la misma; (c) un a gente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un agente que inactiva el Ku; y que permite que la célula expreso la proteína. La expresión de la proteína puede ocurrir, por ejemplo, permitiendo la expresión de la proteína codificada por el ADN, o activando la expresión de la proteína. En una modalidad preferida, se proporcionan los componentes (a), (b), y (c), por ejemplo, int ducidos en la célula de modo que en el sitio de una interacción entre la secuencia de ADN seleccionada y el ADN objetivo, las concentraciones del agente que aumenta la recombinación homologa y del agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, son sufiicientes para que ocurra en un rango mayor al que podría ocurrir en la ausencia del agente suministrado una alteración del sitio, por ejemplo, recombinación homologa o corrección de gen, entre la secuencia de ADN seleccionada y el ADN objetivo, lo cual aumenta la recombinación homologa y el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo. El agente que inhibe la unión del extremo no homologó se proporciona preferentemente en forma local. En una modalidad prefer rida, los componentes (a), (b), y (c) pueden ser introducidos juntos o en forma separada. Además, se pueden introducir juntos dos de los componentes y el tercero puede ser introducido por separado. Por ejemplo, la secuencia de ADN y el agente que aumenta la recombinación homologa, por ejemplo, Rad52, pueden ser introducidos juntos o la secuencia de ADN y el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, el agente que inactiva el Ku, pueden ser introducidos juntos. En otra modalidad preferida, el agente que aumenta la recombinación homologa y el agente que inhi Dß la unión del extremo no homólogo pueden ser introducidos juntos Se pueden proporcionar dos, o preferentemente todos los componentes en la forma de un complejo. En una modalidad preferida, el método incluye contactar el ADN objetivo, por ejemplo, introduciendo en la célula un complejo que incluye: (a) una secuencia de ADN de hilo doble que incluye la secuencia de ADN seleccionada; (b) un agente que aumenta la recombinación homologa, por ejemplo, una proteína Rad52 o un fragmento funcional de la misma; y (c) un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un agen te que inactiva el Ku. En una modalidad preferic a, uno, o más, preferentemente todos os componentes se proporcionan para la administración local, por ejemplo, microinyección, y nq se expresan a partir del genoma objetivo y el otro ácido nucleico. En una modalidad particularmente preferida, se proporciona el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un agente que inactiva el Ku tal como un anticuerpo anti-Ku, para e dministración local, por ejemplo microinyección y no se expresa a partir del genoma objetivo u otro ácido nucleico. En una modalidad preferida, el agente que inhibe una unión del extremo no homólogo es un agente que inactiva hMre1 1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-hMre1 1 o un oligómero o polímero de enlace hMre1 1 ; un agente qu e inactiva hRad50, por ejemplo, un anticuerpo anti-hRad50 o un oligómero o polímero de enlace hRad50, un agente que inactiva Nbs1 , por ejemplo, un anticuerpo anti-Nbsl o un oligómero o polímero de enlace hNbsl ; un agente que inactiva la ligasa humana 4 (hLig4), por ejemplo, un anticuerpo anti-hLig4 o un oligómero o polímero de enlace hLig4; un agente que inactiva hXrcc4, por ejemplo, un antiouerpo anti-hXrcc4 o un oligómero o polímero de enlace hXrcc4; un agente que inactiva un homólogo humano de Rap1 , por ejempl p, un anticuerpo para un homólogo humano de Rap1 o un oligómerio o polímero que enlaza un homólogo humano de Rap 1 , un agente q ue inactiva un homólogo humano de Sir2304, por ejemplo, un anticuerpo para un homólogo humano de Sir2304 o un oligómero o p olímero de enlace de un homólogo humano de Sir2304; un agen e que inactiva Ku, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ku o un oligómero o polímero de enlace Ku. Cualesquiera de los enlaces que inhiben la unión del extremo no homólogo, se pueden administ ar solos o pueden ser administrados en combinación con uno o más de otros agentes que inhiben la unión del extremo no homólogo. En una modalidad prefe rida, la secuencia de ADN es una secuencia de ADN lineal . En una modalidad preferida , la secuencia de ADN lineal puede tener uno o más colgantes de un solo hilo. En una modalidad preferi da, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secuencia de dirección . La secuencia de dirección es homologa al obje tivo, por ejemplo, homologa al ADN adyacente al sitio en donde el ADN objetivo será alterado, o al sitio en donde la secuencia de ADN seleccionada será integrada. Tal secuencia de flanqueo pued e estar presente en uno o más, preferentemente ambos extr emos de la secuencia de ADN seleccionada . Si están presentes dos secuencias de flanqueo, una debe ser homologa con una primera región del objetivo y la otra debe ser homologa con una segunda región del objetivo.

En una modalidad preferida, la secuencia de ADN tiene uno o más extremos de un solo hilq que sobresale, por ejemplo, uno o ambos de los extremos que sobresalen son extremos 3' o extremos 5'. En una modalidad preferida, el agente que aumenta la recombi?ación homologa es: una proteína Rad52 o un fragmento funcional de la misma; una proteína Rad51 o un fragmento funcional de la misma, una proteína R.?d54 o un fragmento funcional de la misma; o una combinación de estas. En una modalidad preferida el agente que aumenta la recombinación homologa se ad iiere por ejemplo a, se recubre en, la secuencia de ADN. En una modalidad preferida, la proteína Rad52 o fragmento funcional de la mi sma se adhiere a, por ejemplo, se recubre en la secuencia de ADN . En una modalidad preferida la proteína Rad52 o el fragmento funcional de la misma se adhiere a, por ejemplo, se recubre en la secuencia de ADN. En una modalidad preferida, la proteína Rad52 o fragmento de la misma, es Rad52 humano (hRad52). En una modalidad preforida, el anticuerpo anti-Ku es: un anticuerpo anti-Ku70; un anticuerpo anti-Ku80. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-Ku es: un anticuerpo humanizado; un anticuerpo humano; un fragme nto de anticuerpo, o por ejemplo, un fragmento Fab, Fab', F(ab') ó F(v). En una modalidad prefe rida, al menos un anticuerpo anti-Ku está enlazado en forma covalente a: la secuencia de ADN una célula H L-60 (Acceso ATCC No. CCL 240), una célula HT1 080 (Acceso ATCC No. CCL 121 ), una célula Jurkat (Acceso ATCC No. TI B 1 52), una célula de carcin l oma KB (Acceso ATCC No. CCL 1 7), una célula de leucemia K-562 (Acceso ATCC No. CCL 243), una célula de cáncer de seno MCF:-7 (Acceso ATCC No. BTH 22), una célula MOLT-4 (Acceso ATCC No. 1 582), una célula Namalwa (Acceso ATCC No. CRL 1432) una célula Rafji (Acceso ATCC No.

CCL 86), una célula RPM l 8226 (Acceso ATCC No. CCL 1 55), una célula U-937 (Acceso ATCC No. 1 593), células de sublínea 2R4 Wl-28VA1 3 (Acceso ATCC No. CCl. 1 55), una célula CCRF-CEM (Acceso ATCC No. CCL 1 1 9), y una célula de carcinoma de ovario 2780AD (Van Der Blick y asociados. , Cáncer Res. 48:5927-5932, 1988), así como células de heterohibrido na producidas mediante la fusión de células humanas y células de otras especies. En otra modalidad , la línea celular inmortalizada puede ser una línea celular diferente a una línea celular humana, por ejemplo, una línea celular HCO, una línea celular COS. En una modalidad preferí da, los componentes, por ejemplo los componentes de un complejo, se introducen en la célula mediante microinyección . En una modalidad preferida, el método incluye introducir un agente que inhibe una proteína de protección de mal emparejamiento, por ejemplo, Msh2, Msh6, Msh3, Mlh 1 , Pms2, Mlh3, Pms1 u otras proteínas de r eparación de mal emparejamiento o combinaciones de las mismas Preferentemente, el agente es un agente que inhibe la expresión de una proteína de reparación de mal emparejamiento, por ejemplo, el agente es un ARN antisentido. En una modalidad preferida, el agente es un anticuerpo contra una proteína de reparación de mal emparejamiento. En una modalidad preferida, el anticuerpo contra la proteína de reparación de mal emparejamiento está enlazado en forma covalente o no covalente al complejo. En una modalidad preferida, la proteína se expresa in vitro. En otras modalidades preferidas, as células se proporcionan a un sujeto, por ejemplo, un huma no, y la proteína se expresa en el mismo. En una modalidad preferida , la proteína se expresa en un sujeto y la célula es autóloga, alogeneíca o xenogeneíca. El ADN seleccionado puede ser introducido en la célula in vivo o la célula puede ser removida del sujeto, el ADN seleccionado introducido ex vivo, y la célula regresada al sujeto. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada difiere del ADN objetivo por menos de 10, 8, 6, 5, 4, 3,2, o por un solo nucleótido, por ejemplo, por una substitución , o una eliminación o una inserción. En una modalidad preferida , el ADN objetivo incluye una mutación, por ejemplo, la secuencia objetivo difiere de la secuencia tipo natural por aproximadamente 1 0, 8,6, 5,4, 3,2 o por un solo nucleótido. Preferentemente, la mutación es una mutación de punto, por ejemplo, una mutación debido a una inserción , eliminación o substitución .

En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está asociada con , por ejemplo, causas, condiciones o controles que contribuyen a , una enfermedad o una disfunción . Preferentemente, la enfermedad de disfunción es: fibrosis quística; anemia por células drepanocíticas; hemofilia A; hemofilia B; enfermedad de von Willebrand tipo 3; xeroderma pigmentosa; talassaemias; sínd rome de Lesch-Nylan ; resistencia a la proteína C; enfermedad de almacenamiento de lisosomas, por ejemplo enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry; mucopolisacaridosis tipo 1 (MPS) (síndrome de H urley-Scheie), MPS tipo I I (síndrome de Hunter), M PS tipo M ÍA (síndrome de Sanfilio A), MPS tipo I M B (síndrome de Sa mfilio B), M PS tipo M I C (síndrome de Sanfilio C), MPS tipo M I D (sír drome de Sanfilio D), MPS tipo IVA (síndrome de Morquio A), MPS tipo IVB (síndrome de Morquio B), M PS tipo VI (síndrome de Marpteaux-Larry), M PS tipo Vi l (síndrome de Sly). En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la secuencia de AD M seleccionada incluye una secuencia de tipo natural normal la cual p iede corregir la mutación . En una modalidad preforida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen regulador de la transmembrana de fibrosis quística (CFTR). Preferentemente, la mutación es una que altera e I aminoácido en el codón 508 de la región que codifica la proteína CFTR, por ejemplo, la mutación es una eliminación en cuadro de 3 pares base que elimina una fenilalanina en el codón 508 de la proteína CFTR. Esta eliminación de la fenilalanina-508 en la proteína CFTR, se encuentra en un alto porcentaje en sujetos que tien sn fibrosis quística. Por lo tanto, en una modalidad preferida , se p luede utilizar una secuencia de ADN seleccionada que incluye una secuencia que codifica fenilalanina-508 tal como se encuentra en el gen CFTR de tipo natural , para dirigir y corregir el gen CFTR mutado. En una modalidad preferida , el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está ep el gen ß-globina. Preferentemente, la mutación es una que altera el aminoácido en el sexto codón del gen ß-globina, por ejemplo, la mutación es una substitución de A a T en el sexto codón del gen ß-g lobina. Esta mutación conduce a un cambio del ácido glutámico a v aliña en la proteína ß-globina, lo cual se encuentra en sujetos que tie nen anemia de célula S ÍCkl? . Por lo tanto, en una modalidad preferida, un ADN seleccionado que codifica un residuo de aminoácido de ti DO natural en el codón 6, por ejemplo, una secuencia de ADN seleccionada que incluye una A como se encuentra dentro del sexto coclón del gen ß-globina de tipo natural, se puede utilizar para dirigir y corregir el gen ß-globina mutado. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está e i el gen de factor VI I I . Por ejemplo, una mutación puede estar en e exón 23, 24, y/o 25 del gen de factor VI I I . Preferentemente, la mute ción es una que altera el aminoácido en el codón 2209 de la región de codificación de la región que codifica la proteína de factor VI I I , por ejemplo la mutación es una substitución de G a A en el exón 24 del gen de factor VI I I que conduce a un cambio de una arginina a una glutamina en el aminoácido 2209 del factor VI I I . Preferentemente, la mutación es una que altera el aminoácido en el codón 2229 de la región de codificación de la región que codifica la proteína de factor VI I I , por ejemplo, la mutación es una su bstitución de G a T en el exón 25 del gen de factor VI I I que condu ce a un cambio de triptofan a una cisteína en el aminoácido 2229 del factor VI I I . Estas mutaciones han sido asociadas con hemofilia A de moderada a severa. Por lo tanto, en una modalidad preferida, un a secuencia de ADN seleccionada que incluye cualquier ADN que codi ique un aminoácido de tipo natural en el codón 2209 de la región que codifica el gen de factor VI I I o ADN que codifica un aminoácido de tipo natural en el codón 2229 de la región de codificación del gen de factor VI I I o ambos, se pueden utilizar para dirigir y corregir el gen de factor VI I I mutado. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está er el gen de factor IX. Por ejemplo, en sujetos que tienen hemofilia B la mayor parte de las mutaciones son mutaciones de punto en el gen de factor IX. Por lo tanto, en una modalidad preferida , la secuencia de ADN seleccionada puede incluir íen al menos un nucleótido procedente del gen de factor IX de tipo natural para dirigir y corregir una o más de las mutaciones de punto pn el gen de factor IX asociado con hemofilia B.

En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está 3n el gen de factor von Willebrand. Preferentemente, la mutación es una sola eliminación de citocina en una tensión de 6 citocinas en le s posiciones 2679-2684 en el exón 1 8 del gen von Willebrand. Esta mutación se encuentra en un porcentaje significativo de sujetos que tienen enfermedad de von Willebrand tipo 3. También se pueden alterar, tal como se escribe en la presente invención , otras mutaciones, por ejemplo, mutaciones de punto asociadas con la enfe rmedad de von Willebrand tipo 3. Por lo tanto, en una modalidad preferida, una secuencia de ADN seleccionada que incluye secuencias que se encuentran en el gen von Willebrand de tipo natural, por ejemplo, las 6 citosinas en las posiciones 2679-2684 del gen von Willebrand se pueden utilizar para dirigir y corregir el gen von Willebrand mutado. En una modalidad preferida, el ADN objetivo incluye una mutación y la mutación está en el gen del grupo de Xeroderma pigmentoso G (XP-G). Preferentemente, la mutación es una eliminación de una sola adenin ía en una tensión de tres adeninas en las posiciones 1 9-21 de un exó >n de 245 pares base encontrado en el gen XP-G. Esta eliminación conduce a xeroderma pigmentosa. Por lo tanto, en una modalidad preferida , un ADN seleccionado que incluye la secuencia de tipo ne tural del gen XP-G , por ejemplo, tres adeninas en las posiciones 1 8 -21 del exón de 245 pares base, se puede utilizar para dirigir y corregir el gen XP-G mutado.

En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada difiere del ADN objetivo por más de un nucleótido, por ejemplo, difiere del objetivo por un núme ro suficiente de nucleótidos, de modo que el objetivo, o la secuencia de ADN seleccionado tiene una región dispareja, por ejemplo, de espiral. En tal solicitud, también se pueden proporcionar Msh2, Ms h6, Msh3, Mlh1 , Pms2, Mlh3, Pms1 , como parte de un complejo. En una modalidad preferida, la alteración incluye la integración de la secuencia seleccionada en el ADN objetivo y el ADN seleccionado se integra de moc o que está una relación seleccionada previamente con un elemento seleccionado previamente con el objetivo, por ejemplo, si uno es un elemento regulador y el otro es una secuencia que codifica una proteína, el elemento regulador funciona para controlar la expresión de la secuencia que codifica la proteína. Se pueden utilizar secuencias de flanqueo que promueven la integración seleccionada, La secuencia de ADN seleccionada puede ser 5', 3', integrados, o dentro, de una secuencia objetivo seleccionada, por ejemplo, un g en o secuencia de codificación, En una modalidad preferí da, la alteración incluye la integración de la secuencia de ADN se eccionada y la secuencia de ADN seleccionada es una secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora exógena. En una modalidad preferida, la secuencia reguladora incluye u no o más de dos puntos, un promotor, un aumentador, una (UAS), una región de adhesión de andamio o un sitio de enlace de factor de transcripción. En una modalidad preferida, la secuencia reguladora incluye: una secuencia reguladora procedente de un gen de metalotionein-l , por ejemplo, un gen de metalotionein-l de ratón, una secuencia reguladora procedente de un gen SV-40, una secuencia reguladora procedente de un gen de citomegalovirus, una secuenciéi reguladora de un gen de colágeno, una secuencia reguladora pre cedente de un gen de actina, una secuencia reguladora procedente de un gen de inmunoglobulina, una secuencia reguladora procedente del gen de reductasa HMG-CoA, una secuencia reguladora prDcedente del gen de actin ?, una secuencia reguladora procedente de un gen YY1 activador de transcripción, una secuencia r reguladora procedente de un gen de fibronectina, una secuencia reg µladora procedente del gen de EF-1 a.

En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye un exón. Preferenteme nte el exón exógeno incluye: un sitio CAP, la secuencia de nucleótid DS ATG, y/o el ADN de codificación en cuadro con el gen endógeno dirigido. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye un sitio de empalme del donante .

En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada incluye una secuencia regulé dora exógena, la cual, cuando se integra en el objetivo funcio ina para regular una secuencia de codificación endógena. La secuencia de ADN seleccionada puede integrarse en la corriente ascendente de la región de codificación de un gen endógeno en el objetivo o en la corriente ascendente de la secuencia reguladora endógena de un gen endógeno en el objetivo.

En otra modalidad preferida, a secuencia de ADN seleccionada puede estar integrada en la corriente descendente de un gen endógeno o una región de codificación o dentro de un intrón o un gen endógeno. En otra modalidad preferida, la secuencia reguladora endógena del gen endógeno está inactiva, por ejemplo, está completa o parcialmente eliminada. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada está en la corriente ascendente de un gen endógeno y está enlazada al segundo exón del gen endógeno. En una modalidad preferida, el gen endógeno codifica: una hormona, una citocina, un ant geno, un anticuerpo, una enzima, un factor de coagulación, una de proteína transporte, un receptor, una proteína reguladora, una prbteína estructural o un factor de transcripción. En una modalidad preferida, el gen endógeno codifica cualesquiera de las siguientes proteínas: eritropoyetina, calcitronina, hormona de crecimiento, in sulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a insuline , hormona para tiroides, interferón-a2 (I FNA2), interferón-ß, interferó i-?, factores de crecimiento nervioso, FSHß, TGF-ß, factor de necrosis de tumor, glucagon, factor de crecimiento de huesos-2, facto r de crecimiento de huesos-7, TSH-ß, interleucina 1 , interleucina 2, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 1 1 , interleucina 12 , granulocito-CSF (GCSF), macrófago- CSF, granulocito/macrófago-GSF, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, cinasa de proteína C, glucocerebrosidasa, dismutasa de superóxido, activador de plasminogen de tejido, urocinasa, antitrombina l l l , ADNse, galactosidasa-a, hidroxilasa de tirosina, factor de Coagulación de sangre V, factor de Coagulación de sangre Vi l , factor de Coagulación de sangre VI I I , factor de Coagulación de sangre IX, factor de Coagulación de sangre X, factor de Coagulación de sangre XI II , apolipoproteína E, apolipoproteína A-l, globinas, receptor de lipoproteína d 13 baja densidad, receptor IL-2, antagonistas I L-2, antitripsin ?a-a-1 , modificadores de respuesta inmune, glucoceramidasa-ß, iduronidasa-a, iduronidasa-a-L, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoensimaA: a-glucósamina-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, galactosidasa-ß, glucuronidasa-ß, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa , y CD4 soluble. En una modalidad preferida, el gen endógeno codifica la hormona ß de estimulación de olículo (FSHß) y la secuencia de ADN seleccionada incluye una sec uencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora que difiere en secuencia de la secuencia reguladora del gen FSHß. Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secuencia de dirección, por ejemplo, la secuencia de dire cción está presente en uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada. En una modalidéid preferida, la secuencia de dirección es homologa a una región 5' de la región de codificación FSHß (SEQ I D NO: 1 ). En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinación homologa dentro de la secuencia de codificación FSHß o corriente ascendente de la secuencia de codificación FSHß. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 100 ó 1000 nucleótidos contiguos de SEQ I D NO:2, qu o corresponde a -7454 a -1417 de la secuencia FSHß humana (la ni meración es relativa al sitio de inicio de traducción), o SEQ ID NO: 2 , que corresponde a los nucleótidos - 696 a -155 de la secuencia FS H ß humana. En una modalidad prefe rida, el gen endógeno codifica interferón a2 (I FNa2) y la sec jencia ADN seleccionada incluye una secuencia reguladora, por ejerr pío, una secuencia reguladora la cual difiere en secuencia de la secu encia reguladora del gen IFNa2.

Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secuencia de dirección por ejemplo, una secuencia que está presente en uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccior ada. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección es homologa a una región 5' de la región de codificación IFNa2. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinaci ón homologa dentro de una región de corriente ascendente de la secuencia de codificación IFNa2. En una modalidad preferida, la secuen cia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 100 Ó1000 nucleótidps contiguos de SEQ I D NO:4, que corresponde a los nucleótidos 4074 a -51 1 de la secuencia I FNa2 humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción).

Por ejemplo, puede incluir: al menos 20, 30, 50 ó 100 nucleótidos procedentes de SEQ ID NO:7, que corresponde a los nucleótidos -4074 a -3796 de la secuencia IFN 2 humana; al menos 20, 30 ó 50 nucleótidos procedentes de SÉQ I D NO:8, que corresponde a los nucleótidos -582 a -51 0 de la secuencia I FNa2 humana; al menos 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO: 9, que corresponde a los nucleótidos -3795 a -583 de la secuencia I FNa2 humana. En una modalidad preferi da, el gen endógeno codifica el factor de estimulación de colonia de granulocito (GCSF) y la secuencia de ADN seleccionada incluye une secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora que difiere en secuencia de la secuencia reguladora del gen GCSF. Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por una secuencia de dirección , por ejemplo una secuencia qi e está presente en uno o más, preferentemente ambos de los extremos de la secuencia de ADN seleccionada. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección es homologa a la región 5' de la región de codificación GCSF. En una modalidad preferida, la secuencia de dirección dirige la recombinación homologa dentro de la secuencia de codificación GCSF o corriente ascendente c e la secuencia de codificación GCSF. En una modalidad preferida, a secuencia de dirección incluye al menos 20, 30, 50, 1 00 ó 1000 nucleótidos contiguos procedentes de SEQ I D NO : 5, que correspondo a los nucleótidos -6, 578 a 1 01 de la secuencia GCSF humana (la numeración es relativa al sitio de inicio de traducción). Por ejemplo, l a secuencia objetivo puede incluir 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos procedentes de SEQ I D NO: 6 , que corresponde a los nucleótidos -6,578 a -364 del gen GCSF humano (la numeración es relativa al sit o de inicio de la traducción). En otra modalidad preferí da, la secuencia de ADN incluye una región de codificación, por ejemplo, la secuencia de ADN seleccionada que codifica una proteína. En una modalidad preferida, la región de codificación codi fica: una hormona, una citocina, un antígeno, un anticuerpo, una e nzima, un factor de coagulación, una proteína de transporte, un receptor, una proteína reguladora, una proteína estructural o un factor de transcripción. En una modalidad preferida, la región de codifi cación codifica cualesquiera de las siguientes proteínas, eritrop oyetina, calcitonina, hormona de crecimiento, insulina, insulir otropina, factores de crecimiento similares a insulina, hormona paratiroides, interferón-a2 (I FNA2), interferón-ß, interferón-?, facto res de crecimiento de nervios, FSHß TGF-ß, factor de necrosis de t jmor, glucagon, factor de crecimiento de huesos-2, factor de crecimionto de huesos-7, TSH-ß, interleucina 1 , interleucina 2, interleucine 3, interleucina 6, interleucina 1 1 , interleucina 12, granuloci :o-CSF (GCSF), macrófago-CSF, granulocito/macrófago-CSF, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, cinasa de proteína C, glucocerebrosidasa, dismutasa de superóxido, activador de plasminogen de tejido, urocinasa, antitrombina l l l , ADNse, gala aictosidasa-a, hidroxilasa de tirosina, factor de Coagulación de sangre V, factor de Coagulación de sangre Vi l , factor de Coagulación de sangre VI I I , factor de Coagulación de sangre IX, factor de Coagulación de sangre X, factor de Coagulación de sangre XI I I , apolipoproteína E, apolipoproteína A-l , globinas, receptor de lipoproteína d e baja densidad , receptor I L-2, antagonistas I L-2 , antitripsin a-a-1 , modificadores de respuesta inmune, glucoceramidasa-ß, iduronidasa-a, iduronidasa-a-L, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa , acetilcoensimaA: a-glucpsamina-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa , galactosidasa-ß, glucuronidasa-ß, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa , y CD4 soluble. En una modalidad preferida, la secuencia de ADN seleccionada puede integrarse en la corr ente descendente objetivo de una secuencia reguladora endógen ía o la corriente ascendente de una región de codificación de un gen endógeno y la corriente descendente de la secuencia reguladora del gen . En otra modalidad preferida , la secuencia de AD seleccionada puede integrarse en la corriente descendente de una secuencia reguladora endógena, de modo que la región de codific4ción del gen endógeno está inactivo, por ejemplo, es eliminado. En otro aspecto, la presente invención presenta una célula elaborada mediante cualesquiera de los métodos aquí descritos. En otro aspecto, la pre senté invención presenta un método para alterar la expresión de una secuencia de codificación de proteína de un gen en una cé lula, a través de cualesquiera de los métodos aquí descritos. En una modalidad prefe ida , el método incluye introducir un complejo descrito en la presen te invención , que tiene una secuencia de ADN que incluye una secuencia reguladora en la célula; mantener la célula bajo condiciones q ue permiten alterar una secuencia genómica dirigida para producir una célula recombinante en forma homologa; y mantener la célu la recombinante en forma homologa bajo condiciones que permita n la expresión de la secuencia de codificación de proteína del gen bajo el control de la secuencia reguladora. Se debe mantener la cé ula recombinante en forma homologa bajo condiciones que permita n la expresión de la secuencia de codificación de proteína del gen bajo el control de la secuencia reguladora , alterando de este modo la expresión de la secuencia que codifica la proteína del gen . El término "homólogo" tal como se utiliza en la presente invención , se refiere a una secuencia de dirección que es idéntica o lo suficientemente similar a un sitio objetivo, por ejemplo, un sitio objetivo de ADN cromosómic o, de modo que la secuencia de dirección del sitio objetivo p >uede pasar por una recombinación homologa. Es aceptable un pequeño porcentaje de mal emparejamiento de pares be jse, siempre que pueda ocurrir la recombinación homologa con una frecuencia útil . Tal como se utiliza en l.i presente invención , el término "tipo natural", se refiere a una seci encia que no está asociada con , por ejemplo, causa, contribuye a, condiciona o controla una enfermedad o disfunción.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término 'complejo" se refiere a una asociación estable en la cual los componentes se acoplan mediante enlaces covalentes o no covalentes. Se apreciarán otras características y ventajas de la presente invención a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones Descripción Detallada dei Invento Agentes que Aumentan la Reco mbinación Homologa Los agentes que aumentan la recombinación homologa se pueden abastecer con una secuencia de ADN seleccionada con el objeto de promover una recombinación homologa entre la secuencia de ADN seleccionada y el ADN objetivo, por ejemplo, ADN cromosómico. Los agentes que aumentan la recombinación homologa tienen una o má 3 de las siguientes funciones: 1 ) incrementar el conocimiento h omólogo entre la secuencia de ADN seleccionada y el sitio seleccionado para la integración; 2) incrementar el emparejamiento homólogo entre la secuencia de ADN seleccionada y el sitio seleccionado para la integración; 3) incrementar la eficacia de la invasión del hilo y el intercambio del hilo entre las secuencias de ADN recombinante; 4) incrementar la eficacia de procesamiento de las estructuras intermedias en productos de recombinación ma duros. Se puede introducir un a gente que aumente la recombinación homologa en una mezcla que incluye la secuencia de ADN de hilo doble, puede ser introducido en forma inmediata antes o después de la administración de la secuencia de ADN o puede ser adherido, por ejemplo, recubierto en la secue ncia de ADN. Se puede recubrir toda la secuencia de ADN con un agente que aumente la recombinación homologa, por ejemplo, Rad52 por ejemplo, hRad52 , o un fragmento del mismo, o se pueden recub irir uno o más de los extremos de la secuencia de ADN , por ejemplo i, uno o más de un extremo de un solo hilo que sobresale de la secuencia de ADN que será recubierta . Preferentemente, el agente que aumenta la recombinación homologa cubre al menos una parte de jn extremo 3' o un extremo 5' de un solo hilo que sobresale de la secuencia de ADN. Los ejemplos de agentes que aumentan la recombinación homologa incluyen : Rad52 o un fragmento funcional del mismo; Rad51 o un fragmento función íal del mismo; Rad54 o un fragmento funcional del mismo; o una combinación de dos o más de estas proteínas o fragmentos de estas proteínas. El agente que aumenta la recombinación homologa t también puede expresarse en forma intercelular, por ejemplo, se puede introducir en una célula una secuencia de ácido nucleico que codifica cualesquiera de los agentes antes descritos. Se puede hacer una determinación de sí un fragmento Rad51 es funcional a través de té únicas conocidas. Por ejemplo, la funcionalidad de un fragmento Rad51 se puede determinar con base en su capacidad de mediar el emparejamiento homólogo y el intercambio de hilo en un ensa yo in vitro conocido en la técnica , por ejemplo, tal como se describe en la publicación de Baumann y asociados (1 996) Cell 87:757-766. En síntesis h Rad51 primero se incuba previamente con ssADN circular y posteriormente se agregan ADN dúplex lineal marcado-32P La formación de las moléculas de unión y la cantidad de intercambio de hilos se puede determinar mediante electroforesis. Además, se puede determinar la funcionalidad de un fragmento Rad51 con base en su capacidad de enlazar ADN dúplex de constricción en la presencia de ATP para formar un filamento de núcleo proteína helicoidal el cual puede ser visualizado mediante microsoopia de electrones, tal como se describe en la publicación de Benson y asociados ( 1 994) EM BO J . 1 3:5764-5771 . También se p uede determinar la funcionalidad de Rad51 con base en su capacidad de aliviar defectos en la reparación de ADN y recombinación hom lóloga en células que carecen de la proteína funcional Rad51 . Por lo tanto, se puede determinar si un fragmento Rad51 es funcional si confiere un efecto positivo en los ensayos antes mencionados, comparado con su ausencia. Además, la extensión del efecto positivo conferido por un fragmento Rad51 puede ser comparado con la extensión de efecto positivo conferido por Rad51 completo. La funcionalidad de un fragmento de Rad54 se puede determinar con base en su capacidad de hidrolizar ATP en la presencia de dsADN en un onsayo conocido en la técnica, por ejemplo, como el descrito en la publicación de Swagemakers y asociados (1998) J. Biol. Ch em. 273:28292-28297. Además, se puede determinar la funcionalic ad del fragmentos Rad54 con base en su capacidad de aliviar defectos en la reparación de ADN y recombinación homologa en células que carecen de la proteína funcional Rad54. Rad52 y Fragmentos Funcionales de la M isma Se abastece Rad52 con una secuencia de ADN en un sitio seleccionado en un ADN objetivo, por ejemplo, un sitio seleccionado en el ADN cromosómico, puede proporcionar un alto rango de alteración del sitio, por ejemplo, recombinación homologa de lo que puede ocurrir en su ausencia. Aunque no se pretende estar limitados por la teoría se considera que Rad52 puede proporcionar una o más de las siguientes funciones: 1 ) proteger toda la secuencia de ADN de la degradación de nucleasa; 2) proteger un extremo de un solo hilo que sobresale de la secuencia de ADN , por ejemplo, una cola 3' , de la degradación de nucleasa; 3) implementar el reconocimiento homólogo entre la secuencia de ADN y el sitio seleccionado para la integración ; 4) incrementar el emparejamiento homólogo entre la secuencia de ADN y el sitio seleccionado para la integración . Se puede obtener Rad52 en varias formas, incluyendo el aislamiento de Rad52 o la exp resión de una secuencia codificada a través de métodos de ingenierí a genética . Por ejemplo, Van Dyke y asociados ( 1 999) Nature 398: 728, describe la producción y purificación h Rad52 a partir de células Sf9. Se conocen secuencias de nucleótidos de Rad52 de v arias especies. Ver por ejemplo, la publicación de Shen y asocie dos ( 1 995) Genomics 25( 1 ): 1 99-206 (Rad52 de múrido y humano); Muris y asociados ( 1 994) Mutat. Res. 31 5(3):295-305 (Rad52 múrido y humano); Park y asociados (1 995) J . Biol . Chem . 270 (26(: 1 5467- 1 5470)(Rad52 humano)). Se pueden producir fragmentos de Rad52 en varias formas, por ejemplo, mediante la expresión de la secuencia que codifica Rad52 o una parte de la misma , o mediante activación genética (el método preferido), mediante digestió n proteol ítica o mediante síntesis qu ímica . Se pueden generar fragmentos internos o terminales de Rad52 removiendo uno o más nucleótidos de un extremo (para un fragmento terminal) o ambos extremos (para un fragmento interno) de un ácido nucleico que cod ifica Rad52. La expresión del ADN mutagenizado produce fragm 3ntos del polipéptido Rad52. La digestión con endonucleasas " de extremo roído " o con varias enzimas de restricción , puede generar de este modo ADN's que codifican una formación de fragmentos Rad52. Los ADN's que codifican fragmentos de una proteína Rad52 , también se pueden generar mediante corte aleatorio, digestión por restricción o una combinación de los métodos antes descritos. Los fragmentos de Rad52 también se pueden sintetizar en forma qu ímica utilizando técnicas conocidas en el arte, tales como química f-Moc o t-Boc de fase sólida de Merrifield . Por ejemplo, los péptidos Rad52 pueden dividirse en forma arbitraria en fragmentos de longitud deseada sin traslape de los fragmentos, o dividirse en fragmentos de traslape de una ongitud deseada. Se puede realizar una determinación de sí el fragmentos Rad52 es funcional a través de técnicas conocidas. Por ejemplo, para determinar si un fragmento Rad52 puede proteger contra degradación de nucleasa, se r. uede incubar una secuencia de ADN de hilo doble linealizada de extremo marcado, por ejemplo, una secuencia de ADN de hilo do ble, linealizada marcada-32P, con un frag mento de Rad52 antes de la introducción de una nucleasa , por ejemplo, una exonucleasa o endonucleasa. Posteriormente se puede determinar la cantidad de marca liberada, por ejemplo, 32P. La cantidad de marca sirve como un indicador de la capacidad del fragmento Rad52 para proteger contra degradación de nucleasa . Además, se puede determina r la funcionalidad de un fragmento Rad52 con base en su capacidad de estimular la formación de moléculas de unión . Se puede analizar in vitro la funcionalidad de un fragmento Rad52 mediante el estímulo de una formación de moléculas de unión operadas por hRad51 , tal como se describe en la publicación de Benson y asociados ( 1 998) Nature 391 :401 -404. En síntesis, h Rad51 primero se incuba previamente con ssADN y posteriormente se agrega ADN dúplex lineal marcado-32P. Se puede determinar la formación de moléculas de unión mediante electroforesis. La adición de Rad52 estimula la formación de moléculas de unión comparada con la formación de molécula de unión en la ausencia de Rad52. Por lo tanto, se puede determinar si un fragmento Rad52 es funcional , si se estimula la formación de molécula de unión comparada con la formación de molécula de unión en su ausencia. Además, la extensión de la estimulación mediante un fragmento Rad52 se puede comparar con la extensión de la estimulación Rad52 de longituc total. Además, se puede determinar la funcionalidad de un fragmento Rad52 con base en su capacidad de incrementar la resistencia a radiación por ionización y para incrementar los rangos de reco mbinación homologa cuando se sobre expresan en células de mono cultivadas, tal como se describe en la publicación de Park ( 1 995) J . B ol. Chem . 270: 1 5467- 1 5470. Agentes que I nhiben la Unión del Extremo no Homólogo Se puede utilizar un agen te que inhibe la unión del extremo no homólogo para proporcionar una secuencia de ADN en un sitio seleccionado en ADN objetivo, en un rango mayor de lo que podría ocurrir en su ausencia. La unión del extremo no homólogo puede conducir a una fusión imprecisa entre extremos de hilo doble, por ejemplo, los extremos unidos nuevamente pueden tener inserciones o eliminaciones. Un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo puede ser cualquier agente que inhiba la expresión de y/o una cavidad de una molécula involucrada en una trayectoria de unión del extremo no homólogo. Por ejemplo, un complejo de Mre1 1 , Rad50 y N bs1 se involucra en una unión de extremo no homólogo.

Por lo tanto, inhibiendo de este modo la formación de este complejo, por ejemplo, enlazando cualesq uiera de estas proteínas o inhibiendo la expresión de cualesquiera de estas proteínas, se puede inhibir la unión del extremo no hom ólogo. Además, otras proteínas involucradas en la unión del ex remo no homólogo incluyen proteínas Ku , por ejemplo, Ku70 ó Ku80, Ligasa 4 (Li4) y Xcrr4 Agentes gue I nactivan el Ku El proporcionar un agente que inactiva el Ku con una secuencia de ADN en un sitio seleccionado en un ADN objetivo, por ejemplo, un sitio seleccionado en el ADN cromosómico, puede proporcionar un mayor rango de alteración del sitio, por ejemplo, recombinación homologa, de lo que podría ocurrir en su ausencia. Ku es un heterod ímero de aproximadame nte 70 kDa y 80 kDa que enlaza a las discontinuidades del ADN y juega un papel importante en la reparación del rompimiento del hilo doble mediante la unión del extremo no homólogo. "Ku80" también puede ser referido como "Ku86". U n agente que inactiva el Ku puede inhibir la expresión de Ku y una actividad de Ku . Preferentemente, un agente que inactiva el Ku interactúa , por ejemplo, enlaza,, Ku o una secuencia de nucleótidos que codifica Ku , para inhibir la expresión Ku o la actividad Ku. Preferentemente, se inhibe la unión del extremo no homólogo que depende de Ku . Un agente que inhibe Ku puede inhibir Ku70, Ku80 o ambos. Los agentes que se pued en utilizar para inactivar Ku incluyen anticuerpos anti-Ku y molécu as de enlace de Ku , por ejemplo, péptidos generados en forma al eatoria , que enlacen a Ku , oligómeros y polímeros de enlace de Ku y moléculas de ácido nucleico Ku antisentido. Preferentemente, el agente que inactiva Ku es un agente que se pueda admi nistrar en forma local , tal como anticuerpos anti-Ku y molécu as de enlace de Ku , por ejemplo péptidos generados en forma aleatoria que enlazan a Ku, y oligómeros y polímeros de enlace de Ku . Preferentemente, el agente de inactivación de Ku interactúa con , por ejemplo, enlaza a, Ku . Los agentes que interactúan con la proteína Ku , pueden inactivar Ku en forma local en el sitio de alteración . Por ejemplo, una agente que inactiva el Ku se introduce en una célula en una proximidad cerce na a la secuencia de ADN , y el ADN dirigido para inhibir de este modo Ku en forma local en los sitios de recombinación homologa. Se puede introducir un agente que inactiva el Ku en una célula en una mezcla que incluye la secuencia de ADN de hilo doble, y se puede introducir en forma inmediata a o después de la administración de la secuencia de ADN o se puede enlazar en forma covalente a la secuencia de ADN o proteínas asociadas con la secuencia de ADN , por ejemplo, Rad52 o un fragmento del mismo. Las células también pueden ser incubadas previamente con un agente que inactiva el Ku , tal como un anticuerpo anti-Ku o una molécula de ácido nucleico Ku antisentido. Anticuerpos Anti-Ku Un anticuerpo anti-Ku o fragmento de la misma se puede utilizar para enlazar Ku , y reducir de este modo una actividad Ku . Los anticuerpos anti-Ku se pueden administrar de manera que interactúen con Ku en forma local en el sitio de alteración pero no inhiban la expresión Ku genera Imente en la célula. Los anticuerpos anti-Ku incluyen anticuerpos an?i-Ku70 y anti-Ku80.

U na proteína Ku, una parte o fragmento de la misma , se pueden utilizar como un inmu nogen para generar anticuerpos que enlazan a Ku , utilizando técni cas estándar para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se puede utilizar la proteína Ku de longitud completa, o en forma alternativa, se pueden utilizar fragmentos del péptido antigénico de Ku como inmunogenes.

Normalmente, se utiliza Ku o un péptido Ku para preparar anticuerpos inmunizando a un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mam ífero) con el inmunogen . La preparación inmunogénica adecuada, puede contener, por ejemplo, una proteína Ku obtenida mediante la expresión de la secuencia que codifica Ku o mediante activación genética, o un péptido Ku sintetizado en forma química. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 5,460,959; y las solicitudes Norteameric mas también pendientes Nos. USSN 08/334,797; USSN 08/231 ,4 139; USSN 08/334,455; y USSN 08/928, 881 las cuales están in corporadas de manera expresa en su totalidad a la presente invenci ón como referencia. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de Ku son conocidas y se describen , por ejemplo en la publicación de Takiguchi y asociados ( 1 996) Genomics 35( 1 ): 1 29-1 35. La preparación puede incluir además un adyuvante completo o incompleto de Freund's, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de Ku in munogénico, induce a una respuesta del anticuerpo policlonal ant¡-K? Los anticuerpos anti-Ku o fragmentos de los mismos se pueden utilizar como un agente que inactiva el Ku . Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo anti -Ku incluyen F(v), Fab, Fab' y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como una pepsina. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en la presente invención , se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen únicamente una especie de un antígeno que enlaza al sitio con la capacidad de inmunoreaccionar con un epítope particular de Ku . Una composición de anticuerpo monoclonal muestra normalmente de este modo, una sola afinidad de enlace para una proteína Ku en particu ar con la cual inmunoreacciona. Además, se pueden util izar anticuerpos anti-Ku producidos mediante métodos de ingeniería genética , tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y huir anizados, que comprenden porciones tanto humanas como no human as, que pueden elaborarse utilizando técnicas de ADN recombinahte estándar. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y h µmanizados pueden ser producidos mediante ingeniería genética utilizando técnicas de ADN estándar conocidas en el arte, por ejem pío, utilizando los métodos descritos en la publicación de Robinson y asociados, solicitud internacional No. PCT/US86/02269; Akira y asociados solicitud de Patente Europea No. 1 84, 1 87; Taniguc ?i, M. , solicitud de Patente Europea 1 71 ,496; Morrison y asociados solicitud de Patente Europea 1 73,494; Neuberger y asociados, pub cación internacional PCT No. WO Green, L.L. y asociados (1994) Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. y asociados (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855: Bruggeman y asociados (1993) Year Immunol 7:33-40; Choi y asociados (1993) Nature Genet. 4:117-123; Tuaillon y asociados (1993) PNAS 90:3720-3724; Bruggeman y asociados (1991) Eur J Immunol 21_: 1323-1326; Duchosal y asociados publicación PCT WO 93/05796; Patente Norteamer íicana Número 5,411,749; McCune y asociados (1998) Science 24 L!_:1632-1639, Kamel-Reid y asociados (1988) Science 242:1706; Spanopoulou (1994) Genes & Development 8:1030-1042; Shinkai y asociados (1992) Cell 68:855-868). Se puede inmunizar un ratón transgénico con anticuerpos humanos o un ratón con deficiencia inmunolpgica injertado con célula o tejido que produce anticuerpos humanos con un Ku o un péptido Ku antigénico y posteriormente se pueden u tilizar los esplenocitos procedentes de estos ratones inmunizados para crear hibridomas. Son bien conocidos los métodos de prod ucción de hibridomas. Los anticuerpos monoclc nales humanos contra Ku, también se pueden preparar construyend o una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria, tal como una b¡ blioteca de despliegue de fago Fab o una biblioteca de despliegue de fago scFv, utilizando cADNs de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina preparados a partir de mARN derivado de linfocítos de un sujeto. Ver la publicación de McCafferty y asociados publ icación PCT WO 92/01047; Marks y asociados (1991) J. Mol. Biol 222:581-597: y Griffths y asociados (1993) EMBO J 12:725-734 Además, se puede generar una biblioteca de combinación de regiones variables de anticuerpos mutando un anticuerpo humano conocido. Por ejemplo, se puede mutar una región variable de un anticuerpo humano conocido para enlazar a Ku , utilizando por ej emplo oligonucleótidos mutagenizados alterados en forma aleatoria, para generar una biblioteca de regiones variables mutadas, que posten ormente pueden ser clasificadas para enlazar a Ku . Los métodos para inducir la mutagénesis aleatoria dentro de las regiones CDR de cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulina, los métodos Dará cruzar cadenas pesadas y ligeras en forma aleatoria para formar métodos de emparejamientos y clasificación, se pueden encor trar por ejemplo, en la publicación de Barbas y asociados publica ción PCT WO 96/07754 ; Barbas y asociados ( 1 992) Proc. Nat'l Acad. Sci . EUA 89:4457-4461 . Se puede expresar la biblioteca de inmunoglobulina a través de una población de empa ques de despliegue, derivados preferentemente de fago filamentoso, para formar una biblioteca de despliegue de anticuerpos. Los ejemplos de métodos y reactivos receptores particularmente pa ra utilizarse en la generación de una biblioteca de despliegue de anticuerpos, se pueden encontrar por ejemplo en Ladner y asociados, Patente Norteamericana No. 5,223,409; Kang y asociados p (ublicación PCT WO 92/1 861 9; Dower y asociados publicación PCT WO 91 /17271 ; Winter y asociados publicación PCT WO 92/207S 1 ; Markland y asociados publicación PCT WO 92/1 5679; Breitlinc y asociados publicación PCT WO 93/01 288; McCafferty y asociados publicación PCT WO 92/01 047; Garrard y asociados publicación PCT WO 92/09690; Ladner y asociados publicación PCT WO 90/02809; Fuchs y asociados (1991) Bio/Technology 9¡.1370-1372; Hay y asociados (1992) Hum Antibod Hibridomas 3:81-85; Huse y asociados (1989) Science 246:1275-1281; Griffths y asociados (1993) supra; Hawkins y asociados (1992) j Mol Biol. 226:889-896; Claxo n y asociados (1991) Nature 352:624- 628; Gram y asociados (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad y asociados (1991) Bio/Techn plogy 9.1373-1377; Hoogenboom y asociados (1991) Nuc Acid Res 1_9:4133-4137; y Barbas y asociados (1991) PNAS 88:7978-7982. Una vez que se despliega en la superficie de un paquete de despliegue (por ejemplo fago filamentoso), se clasifica la biblioteca de anticuerpos para identificar y aislar paquetes que expresa n un anticuerpo que enlaza a Ku. En una modalidad preferida, la clasificación primaria de la biblioteca comprende lavado en charola con un Ku inmovilizado y seleccionan paquetes de despliegue que e xpresan anticuerpos que enlazan a Ku inmovilizado. Los anticuerpos mon íoclonales de Ku también están comercialmente disponibles, por ejemplo en Neomarkers (Fremont, CA). Moléculas de Enlace de Ku Se pueden utilizar mole culas que enlazan a Ku, tales como péptidos de enlace de Ku, por ejemplo, péptidos generados en forma aleatoria, y oligómeros y polímeros de enlace de Ku como agentes que inactivan el Ku. Tales m léculas pueden enlazar a la proteína Ku , e inhibir de este modo al menos una actividad de Ku , tal como la unión del extremo no homólogo. Los ejemplos de oligóme iros de enlace de Ku se establecen en la publicación WO 99/33971 cuyo contenido está incorporado a la presente invención como referencia. Tales oligómeros pueden estar compuestos de nucleótidos, análogos de nucleótidos o una combinación . Preferentemente, los oligómeros están compuestos de ribonucleótidos. Estos oligómeros Ku se pueden utilizar para enlazar Ku o para identificar proteínas que interactúan con Ku . Los métodos para identificar péptidos de en ace Ku utilizando estos oligómeros, se describen en la publicación WO 99/33971 . Además, se pueden cía sificar péptidos generados en forma aleatoria según la capacidad de enlazar a Ku. Por ejemplo, se conocen varias técnicas en el arte para clasificar productos de gen mutantes generados. Las técnicas para clasificar bibliotecas genéticas grandes, con frecuencia incluyen clonación de la biblioteca de gen en vectores de expresión replicables, transformación de células adecuadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresión de genes bajo condiciones en los cuales la detección de una actividad deseada, por ejemplo, que enlace a Ku , facilita en forma relativa el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. Cad la una de las técnicas descritas más adelante, es receptiva a análisis de alto rendimiento para clasificar grandes números de secuencias creadas, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis aleatoria .

Bibliotecas de Despliegue En otro método para clasificar péptidos de enlace de Ku, los péptidos candidatos se despliogan en la superficie de una célula o partícula viral , y se detecta la capacidad de las células particulares o partículas virales para enlazar a una proteína Ku mediante el producto desplegado en un " ensayo de lavado en charola". Por ejemplo, la biblioteca genética puede ser clonada en el gen para una proteína de membrana de sup erficie de una célula bacteriana, y la proteína de fusión resultante puede ser detectada mediante de lavado en charola (Ladner y asociados, WO 88/06630; Fuchs y asociados (1991 ) Bio/Techr ology 9: 1 370-1371 ; y Goward y asociados ( 1 992) TI BS 1 8: 1 36-140). En forma similar, se puede utilizar un ligando marcado e n forma detectable para calificar los homólogos de péptido poten cialmente funcionales. El uso de ligandos marcados en forma fluorescente permite que las células sean inspeccionadas en forma visual y separadas bajo un microscopio de fluorescencia, o, cuando la morfología de la célula lo permite, pueden ser separadas mediante un clasificador celular activado por fluorescencia. Se puede expresar una biblioteca genética como una proteína de fusión en la superficie de u ina partícula viral. Por ejemplo, en el sistema de fago filamentoso se pueden expresar secuencias de péptido externas en la superfi icie del fago infectoso, confiriendo de este modo dos beneficios signi '¡cativos. Primero, ya que estos fagos se pueden aplicar a matrices de afinidad en concentraciones arriba de 1 0 de fagos por mililitro, se pueden clasificar a la vez un gran número de fagos. Segundo, ya que cada fago infeccioso despliega un producto genético en su superficie, si un fago en particular se recupera de una matriz de afi nidad en un bajo rendimiento, el fago puede ser amplificado mediante otra vuelta de infección . El grupo de fagos filamentosos E. coli casi idénticos, M 1 3, fd , y f1 son los que se utilizan con más frecuencia en bibliotecas de despliegue de fagos.

Cualesquiera de las proteínas de recubrimiento g l l l o g VI 11 de fago se pueden utilizar para genera r proteínas de fusión sin interrumpir el empaque final de la partícula viral . Se pueden expresar epítopes externos en el extremo de term1 inal-NH2 de pl l l y el fago soporta tales epítopes recuperados de un g ran exceso de fagos que carecen de este epítope (Ladner y asoci dos, publicación PCT WO 90/02909; Garrard y asociados, publicación PCT WO 92/09690; Marks y asociados ( 1 992) J . Biol.C hem 267: 16007- 1601 0; Griffiths y asociados ( 1 993) EMBO J 12 :725-734; Clackson y asociados (1 991 ) Nature 352 :624-628; y Barbad y asociados ( 1 992) PNAS 89:4457- 4461 ). Un método común utiliza el receptor de maltosa de E. coli (la proteína de membrana externa LamB) como una parte de fusión de péptido (Charbit y asociados( 1 986) EMBO 5, 3029-3037). Se han insertado oligonucleótidos en Dlásmidos que codifican el gen LamB para producir péptidos fusi onados en uno de los espirales extracelulares de la proteína . Estos péptidos están disponibles para enlazar a ligandos, por ejemplo, a anticuerpos, y pueden provocar una respuesta inmune cuando las células se administran a animales. Otras proteínas de superficie celular, por ejemplo, OmpA (Schorr y asociados ( 1 991 ) Bacines 9 , pp. 387-392), PhoE (Agterberg , y asociados ( 1 990) Gene 88 , 37 ' -45), y PAL (Fuchs y asociados ( 1 991 ) Bio/Tech 9, 1 369-1 372), así ce rno grandes estructuras de superficies bacterianas, han servido como vehículos para desplegar péptidos.

Los péptidos pueden ser fusiionados a pilín , una proteína que se polimeriza para formar el C Dnducto pilus-a para el intercambio ínterbacteriano de información genética (Thiry y asociados ( 1 989) Appl. Environ. Microbio. 55, 984-993). Debido a su papel de interacción con otras células el pilus proporciona un soporte útil para la presentación de péptidos al ambiente extracelular. Otra estructura de superficie grande que se utiliza para el despliegue de péptidos, es el órgano de motivo bacteriano, el flagelo. La fusión de péptidos para la flagelina de proteína de subunidad ofrece una formación densa de copias de péptidos en las células huésped (Kuwajima y asociados ( 1 98 8) Bio/Tech . 6, 1 080-1 083). Las proteínas de superficie de otras especies bacterianas, también han servido como partes de fusión de péptidos. Los ejemplos incluyen la proteína A de Staphylococcus y la proteasa de membrana externa IgA de Neisseria (Hansson y asociados (1 992) J . Bacteriol. 1 74, 4239-4245 y Klauster y asociad os ( 1 990) EMBOJ . 9, 1 991 -1 999). En los sistemas de fago >s filamentosos y en el sistema LamB descrito anteriormente, el enlace físico entre el péptido y su ADN de codificación ocurre mediante el contenido del ADN dentro de una partícula (célula o fago) que lleva el péptido en su superficie. Al capturar el péptido se captura dentro la partícula y el ADN . Un esquema alternativo utiliza la proteína de enlace a ADN Lacl para formar un enlace entre el péptido y el ADN (Culi y asociados ( 1 992) PNAS EUA 89: 1 865-1 869). Este sistema utiliza un plasmido que contiene el gen Lacl con un sitio de clonación de oligonucleótido en su extremo 3' . Bajo la inducción controlada mediante arabinosa, se produce una proteína de fusión de péptido-Lacl . Esta fusión retiene la capacidad natural de Lacl para enlazar una secuencia de ADN corta conocida como operador LacO (LacO). Al instalar dos copias de LacO en el plasmido de expresión, la fusión del péptido-Lacl se enlaza fuertemente al plasmido que lo codifica. Debido a que los plasmidos en cada célula contienen únicamente una sola secuencia de oligonucleótidos y cada célula expresa únicamente una sola secuencia de péptidos, los péptidos se vuelven asociados de manera específica y estable con la secuencia de ADN que dirige su síntesis.

Las células de la biblioteca son usadas en forma suave y los complejos de ADN-péptidos son expuestos a una matriz de receptor inmovilizado para recuperar los complejos que contienen los péptidos activos. Posteriormente se re introduce el plasmido asociado en las células para la amplificacic n y secuenciación de ADN , para determinar la identidad de los ligandos del péptido. Como una demostración de la utilidad práctica del método, se elaboró una biblioteca aleatoria grande de dodecapéptidos y se seleccionó en un anticuerpo monoclonal surgido contra la dinorfina de péptido opioide B. Se recuperó un cohorto de péptidos, todos relacionados mediante una secuencia de consenso que corresponde a una porción de seis residuos de dinorfin B. (Culi y asociados ( 1 992) Proc. Nati . Acad. Sci . EUA 89-1 869). Este esquema, algunas veces referido como péptidos en plasmidos, difiere en dos formas importantes de los métodos que despliegue de fagos. Primero, los péptidos se adhieren al término-C de la proteína de fusión , dando como resultado el despliegue de elementos de biblioteca en la orma de péptidos que tienen términos carboxi libres. Ambas de las proteínas de recubrimiento de fagos filamentosos, pl l l y pVI I I , son ancladas a los fagos a través de su término-C, y los péptidos invi tados se colocan en los dominios de terminal-N que se extienden hacia fuera. En algunos diseños, los péptidos desplegados por fag os se presentan a la derecha en el término amino de la proteína de fusión (Cwirla, y asociados ( 1 990) Proc. Nati . Acad . Sci . E. U . A. 87, 6378-6382). U na segunda diferencia es el grupo de incl ¡naciones biológicas que afecta en la población de péptido que están realmente presentes en las bibliotecas. Las moléculas de fusión Lacl están confinadas al citoplasma de las células hués oed . Las fusiones de recubrimiento de fagos se exponen brevemente al citoplasma durante la traducción , aunque son segregadas ráp damente a través de la membrana interna en el compartimiento periplásmico, permaneciendo ancladas en la membrana mediante sus dominios hidrofóbicos de terminal-C, con el término-N , que contie he los péptidos, sobresaliendo en el periplasma mientras espera en el ensamble en las partículas de fagos. Los péptidos en las bibliotecas de Lacl y fagos, pueden diferir significativamente como resultado de su exposición a diferentes actividades proteolí ticas. Las proteínas de recubrimiento de fagos requieren el transportle a través de la membrana interna y el procesamiento de peptidasa de señal como un preludio de la incorporación en los fagos. Ciertos péptidos ejercen un efecto perjudicial en estos procesos y están subrepresentados en las bibliotecas (Gallop y asociados (1994) J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 ). Estas inclinaciones pa rticulares no son un factor importante en el sistema de despliegue La cl . El número de péptidos pequeños disponibles en las bibliotecas aleatorias recombinantes, es enorme. Se preparan de manera rutinaria bibliotecas de 107-' O9 clones independientes. Se han creado bibliotecas tan grandes como recombinantes 101 1 , aunque este tamaño alcanza el límite práctico para bibliotecas de clones.

Esta limitación en el tamaño de biblioteca ocurre en el paso de transformar el ADN que contiene segmentos aleatorizados en las células bacterianas huésped. Para evitar esta limitación, recientemente se ha desarro lado un sistema in vitro a base del despliegue de péptidos naciente en complejos de polisomas. Este método de biblioteca de despliegue tiene el potencial de producir bibliotecas con de 3 a 6 órdenes de magnitud mayores que las bibliotecas de fago/fagémido o plasmido normalmente disponible. Además, se realiza la construcción de las bibliotecas, expresión de los péptidos y clasificación en un formato de célula completamente libre . E n u na aplicación de este m étodo (Gallop y asociados ( 1 994) J . M ed . Chem . 37(9): 1 233-1 251 ), se construyó u na biblioteca de AD N molecu lar q ue cod ifica decapéptidos 1 012 y la biblioteca se expresó en un sistema de transcripción/traducción acoplado de E. coli S30 in vitro. Las condiciones se eligie sron para paralizar los ribosomas en el mARN , originando la acumulac ¡ón de una proporción substancial del ARN en polisomas y produciendo complejos que tienen péptidos nacientes aún enlazados a su ARN de codificación . Los polisomas son suficientemente robustos para tener una afinidad purificada en los receptores inmovilizados, en mucho en la misma forma que se seleccionan las bibliotecas de despliegue de péptidos recombinantes más convencionales. Se recupera el ARN procedente de los complejos enlazados, convertidos en cADN , y amplificado mediante PCR para producir una plantilla, para la siguiente vuelta de síntesis y clasificación. El método d e despliegue de liposomas puede acoplarse al sistema de despl iegue de fagos. Después de varias vueltas de clasificación , el cADN procedente del conjunto de polisomas enriquecido se clonó en un vector de fagemido. Este vector sirve tanto para un vector de expresión de péptido, desplegando péptidos fusionad os a las proteínas de recubrimiento, como un vector de secuencia ción de ADN para identificación de péptidos. Al expresar péptidos derivados de polisomas en fagos, se puede ya sea continuar con el procedimiento de selección de selección de afinidad en este formato o ensayar los péptidos en clones individuales para la actividad de enlace en una ELISA, de fago o para la especificidad de enlace en una ELISA de fagos de término (Barret, y asociados (1992) Anal. Biochem 204,357-364). Para identificar las secuencias de los péptidos activos, se secuencia el ADN producido mediante el huésped fagemido. Secuencias de Ácido Nucleico Antisentido Ku Las moléculas de ácido nucleico que son antisentido para un nucleótido que codifica Ku, se pueden utilizar como un agente de inactivación que inhibe la ex Dresión de Ku. Un ácido nucleico "antisentido" incluye una secuencia de nucleótidos la cual es complementaria a un ácido nucleico de sentido que codifica Ku, por ejemplo, complementario al hilo de codificación de una molécula de cADN de hilo doble o complementaria para una secuencia de mARN. Por consiguiente, un ácido nucleico de antisentido puede formar enlaces de hidrógeno con un acido nucleico de sentido. Un ácido nucleico antisentido puede ser complementario a un hilo de codificación Ku completo, o únicamente a una parte del mismo. Por ejemplo, se puede utilizar una molécula de ácido nucleico antisentido la cual antipercibe para la " región de codificación" del hilo de codificación de una secuencia d e nucleótidos que codifica Ku. Debido a las secuencias de hilo de codificación que codifican Ku descritas por ejemplo, en la publicación de Takiguchi y asociados (1996) Genomics 35(1 ): 129-135 y el número de acceso Genbank L35932, los ácidos nucleicos antisentido pueden ser diseñados de acuerdo con las reglas del emparejamiento base de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria para toda la región de codificación de mARN Ku, aunque más preferentemente es un oligonuc leótido que es antisentido únicamente para una parte de la región de codificación o no codificación de mARN Ku. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido puede ser complementario para la región que rodea el sitio de inicio de traducción de mARN Ku. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido puede tener aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido puede ser construido utilizando síntesis química y reacciones de ligadura enzimática utilizando procedim entos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido) puede ser sin etizado en forma química utilizando nucleótidos que surgen de man era natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñad os para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos substituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utiliz arse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorou?acil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-yodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitocina, (carboxihidroxilmetil)uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D- galactosilqueosina, inosina , N6-isopenteniladenina, 1 -metilguanina, 1 -metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina , 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina , 5-metilaminometiluracil , 5-me :oxiaminometil-2-tiouracil , beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil , 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil , 2-tiouracil , 4-tiouraci I, 5-metiluracil , metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido urac ?l-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil , 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropM)üracil , (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. De manera alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir en forma biológica uti lizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico ha sido subclonado en una orientación antisentido (ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido hacia el ácido nucleico objetivo de interés). Secuencias de ADN Exógeno La secuencia de ADN q ue será proporcionada, por ejemplo introd ucida en la célula puede alterar una secuencia objetivo en una célula . Por ejemplo, la secue cia de ADN seleccionada que puede ser introducida que difiere del AD N objetivo por menos de 1 0, 8, 5 , 4, 3, 2, o por un solo nucleóti do, mediante una substitución , una eliminación o una inserción, La secuencia de ADN seleccionada también puede diferir de la secuencia objeto por más de un nucleótido, por ejemplo, difiere de la secuencia objetivo por un número de nucleótidos, de modo que la secuencia de ADN seleccionada tiene una región dispareja, por ejemplo, una región de espiral . Estas alteraciones pueden modificar la expresión de secuencia objetivo. La exprés ion de secuencia modificada incluye: activar una secuencia, por ejemplo, una secuencia de ADN de codificación , por ejemplo una secuencia de codificación que se encuentra normalmente en una célula, la cual es normalmente silente (no expresada) en la célula; incremento de expresión de una secuencia, por ejemplo, una secuencia de ADN de codificación , por ejemplo, una secuencia de codificación que se encuentra normalmente en una célula, la cual se expresa en forma inferior que los niveles normales en la célula; expresión de una secuencia, por ejemplo, una secuencia de ADN de codificación por ejemplo una secuencia de codificación que se encuentra normalmente en una célula, la cual se expresa de manera normal en una forma defectuosa en la célula; cambiando el patrón de reg ulación o inducción de una secuencia, per ejemplo, una secuencia de ADN de codificación , por ejemplo, unéi secuencia de codificación que se encuentra normalmente en una célula, de modo que difiere al patrón normal de la célula ; reduciendo la expresión de una secuencia , por ejemplo, una secuencia de ADN de codificación , por ejemplo, una secuencia de codificación que se encuentra normalmente en una cél ula, a partir de niveles de ex Dresión normales en la célula , Se puede introducir una secuencia de ADN seleccionada , que difiere del ADN objetivo por me nos de 1 0, 8 , 5, 4 , 3 , 2 , o por un solo nucleótido, por ejemplo, media nte una substitución , una eliminación o una inserción . Por ejemplo, la secuencia dirigida puede diferir de la secuencia de tipo natural po r menos de 1 0, 8, 5, 4, 3, 2 , o por un solo nucleótido. Preferentemente, la secuencia dirigida difiere de la secuencia de tipo natural por una mutación de punto, por ejemplo, una mutación que surge de una inserción , eliminación o substitución.

Preferentemente, la mutación en la secuencia objetivo, por ejemplo un gen , se asocia con , contro a una enfermedad o una disfunción .

Los ejemplos de genes en los cuales una mutación, por ejemplo una mutación de punto ha sido asociada con una enfermedad o disfunción , incluyen pero nc se limitan a, gen regulador de transmembrana de fibrosis quística (CFTR), gen de globina-ß, gen de factor VI I I , gen de factor IX, ge n de factor de von Willebrand , gen del grupo de xeroderma pigmentoso G (XP-G). La secuencia de ADN seleccionada para alterar la s ecuencia objetivo, puede incluir una secuencia normal de tipo natural la cual puede corregir la mutación. Existen varios desórdenes genéticos y genes que pueden ser alterados de acuerdo con los; métodos aqu í descritos. En otro aspecto, la secuencia de ADN seleccionada también puede diferir de la secuencia objetivo por más de un nucleótido, por ejemplo, difiere de la secuencia objetivo por un número de nucleótidos de modo que la secuencia de ADN seleccio nada tiene una región dispareja , por ejemplo, una región de espiral. Por ejemplo, la secuencia de ADN seleccionada puede ser recombinada en forma homologa con un elemento seleccionado previar? ente del objetivo, por ejemplo , si uno es un elemento regulador y el otro es una secuencia que codifica una proteína, el elemento regulador controla la expresión de la secuencia de codificación de proteína. La secuencia de ADN seleccionada puede ser una secuencia reguladora, por ejemplo, una secuencia reguladora exógena. Las secuencias reguladoras incluyen un promotor, un aumentador, un UAS, una región de adhesión de andamio y un sitio de enlace de1 transcripción. Además, la secuencia de ADN seleccionada también puede incluir un exón, un intrón, un sitio CAP, una secuencia de nucleótidos ATG, un marcador, por ejemplo, un marcador de selección, un sitio de empalme de donante y/o ADN de codificación en ci adro con la secuencia objetivo. La secuencia de ADN seleccionada también puede incluir una región de codificación, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica una proteína. La secuencia de codificación puede ser endógena, por ejemplo, la secuencia de ADN seleccion«?da es una secuencia reguladora, o la secuencia de ADN seleccionada puede incluir la región de codificación, por ejemplo, la región de codificación es exógena. La región de codificación puede codificar varias proteínas. Los ejemplos de tales proteínas incluyen: eritropoyetina, calcitonina, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similar a insulina, hormona para tiroides, interferón-a2, (IFNA2), interferón-ß, interferón-?, factores de crecimiento nervioso, FSHß, TGF-ß, factor de necrosis de tumor, glucagon , factor-2 de crecimiento de huesos, factor- 7 de crecimiento de huesos, TSH-ß, interleucina 1 , interleucina 2, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 1 1 , interleucina 12 granulocito-CSF (GCSF), ma,crófago-CSF, granulocito/macrofago-CSF, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, cinasa de proteína C, glucocerebrosidasa, dismutasa de superóxido, activador de p asminogen de tejido, uroquinasa, antitrombina l l l , ADNse, gala ictosidasa-a, hidroxilasa de tirosina, factor de coagulación de sangre V, factor de coagulación de sangre Vi l , factor de coagulación de sangre VI I I , factor de coagulación de sangre IX, factor de coagulación de sangre X, factor de coagulación de sangre XI I I , apolipoproteína E, apolipoproteína A-l , globinas, receptor de lipoproteína d ie baja densidad, receptor IL-2, antagonistas IL-2, antitripsin ?a-a-1 , modificadores de respuesta inmunológica, glucoceramidas ;a-ß, iduronidasa-a, iduronidasa-a-L, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoensimaA: a-glucpsamina-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa galactosidasa-ß, glucuronidasa-ß, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa i, y CD4 soluble. Se conocen las secuencias que codifican estas proteínas. El término exógeno, se refiere a una secuencia la cual se introduce en una célula a través de los métodos aquí descritos. La secuencia exógena puede tener una secuencia idéntica o diferente a una secuencia endógena presente en la célula. Preferentemente, la secuencia de ADN es una secuencia lineal. Secuencia o Secuencias de Dirección La secuencia o secuencias de dirección son secuencias de ADN que permiten la recombin ación homologa en el genoma de una célula que contiene la secuencia dirigida, por ejemplo, el gen dirigido. El término "secuer cia de dirección" y "secuencia de flanqueo", se utilizan de ma nera intercambiable en la presente invención . La secuencia de dirección son , generalmente secuencias de ADN que son homologas con (por ejemplo, idénticas o lo suficientemente similares con ADN celular de modo que la secuencia de dirección y el ADN celular pueden pasar por recombinación homologa) secuencias de ADN normalmente presentes en el genoma de las células como se obtienen . Por ejemplo, la secuencia de dirección puede ser lo sufic entemente homologa con: ADN de codificación o no-codificación, una corriente ascendente falsa de la secuencia del sitio de inicio de la transcripción , dentro, o en la corriente descendente del sitie de detención de la transcripción de un gen de interés, o estar pre isente en el genoma a través de una modificación previa. La secuencia o secuencias de dirección utilizadas, se seleccionan co n referencia al sitio en el cual la secuencia de ADN seleccionad la será insertada, o el sitio en el cual se alterará la secuencia dirig iída. Se pueden emplear una o más secuencias de dirección . Preferentemente, la secuencia de ADN seleccionada está flanqueada por dos secuencias de dirección . Una secuencia de dirección puede e star dentro de un gen o secuencia de codificación (tal como, las se cuencias de un éxon y/o intrón ), en forma inmediatamente adyacente a una secuencia de codificación de un gen (por ejemplo, con menos de 10, 5, 4, 3, 2, 1 o ningún nucleótido adicional entre la secuencia de dirección y la región de codificación del gen), la corriente ascendente de una secuencia de codificación de un gen (tal como las secuencias de la región de no-codificación o de corriente ascendente o secuencias promotoras endógenas), o la corriente descendente y a una distancia de la secuencia de codificación de un gen (tal como corriente descendente de las secuencias del promotor endógeno). La secuencia o secuencias de dirección pueden incluir aquellas regiones de la secuencia dirigida actualmente conocidas o secuenciadas y/o regiones adicionales de corriente ascendente las cuales estructuralmente no están cara cterizadas pero pueden ser mapeadas utilizando enzimas de restricción y ser determinadas por un experto en la técnica. Se puede utilizar una secuencia de dirección para insertar una secuencia de ADN que incluye una secuencia reguladora en forma inmediatamente adyacente a, la corriente ascendente, o a una distancia substancial de la secuencia de codificación de un gen endógeno. De manera alternativa o adicional, se pueden reemplazar, remover, agregar o modificar de otra manera mediante dirección las secuencias que afectan la estructura o estabilidad del ARN o proteína producidas. Por ejemplo, los elementos de estabilidad de ARN , los sitios de empalme y/o secuencias conductoras de las moléculas de ARN , pueden ser modificadas para mejorar o alterar la función, estabilidad, y/o capacidad de traducción de una molécula de ARN . También se pueden alterar secuencias de proteína, tales como secuencias de señal , secuencias de propéptidos, sitios activos y/o secuencias estructurales para aumentar o modificar las propiedades de transporte, secreción, o funcionales de una proteína También se puede alterar una secuencia de proteína, por eje mplo, corregirla, dirig iendo a un sitio en el gen que codifica la proteína que incluye una mutación , por ejemplo, una mutación de puntee En un aspecto, la secuencia de dirección puede ser homologa a una parte de la hormona de estimulación de fol ículo humano ß (FSHß). La FSH es una gonadotropina que juega un papel esencial en la manutención y desarrollo de oocitos y espermatozoides en la fisiolog ía reproductiva normal . La FSH incluye dos subunidades, a y ß, siendo la última la responsable de la especificidad biológica de FSH's el sitio objetivo en el cual puede residir dentro de un exón y/o intrón del gen FSHß es homplogo, la corriente ascendente de, e inmediatamente adyacente a la región de codificación de FSH ß, o la corriente descendente de, y a una distancia de la región de codificación de FSHß. Por ejemplo, la primera de las dos secuencias de dirección (o toda la secuencia de dirección), sí existe únicamente una secuencia de dirección en la construcción, se puede derivar a partir de la corriente ascendente de regiones genómicas de las secuencias de codificación de FSH ß. Por ejemplo, esta secuencia de dirección puede incluir una par e de la SEQ I D NO: 1 , por ejemplo, al menos 20, 30, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos consecutivos de la secuencia correspondiente a las posiciones -7,454 a 1 ,417 (SEQ ID NO:2) o las posiciones -696 a 155 (SEQ I D NO:3). La segunda de las dos secuencias de dirección puede dirigir una corriente ascendente de la región genó nica de la secuencia de codificación (por ejemplo, también contener una parte de la SEQ I D NO:2 ó 3), o dirigir un exón o intrón del gon. Las secuencias que pueden ser utilizadas para dirigir la FSHß se describen de manera adicional en la solicitud Norteamericana sorie No. 09/305,639, cuyo contenido está incorporado en su totalidad a la presente invención como referencia. La secuencia de dirección puede ser homologa a una parte del interferón -a2 humano (I FNa2). El interferón-a constituye una familia de genes compleja con 14 genes agrupados en el brazo corto del cromosoma 9. En ningunp de estos genes, incluyendo el gen I NFa2, tiene intrones. El interferón-a se produce mediante macrófagos, células T células B así como muchos otros tipos de células. El interferón-a tiene considerables efectos antivirales, y se ha mostrado como eficaz en el tratamiento de infecciones por viruses de hepatitis B y C, vaccina, virus de herpes simple, virus de herpes variceloso zoster y rinovirus. Es homólogo el sitio en el cual una secuencia de dirección determinada puede residir dentro de la región de codificación del gen I NFa2, la corriente ascendente de, e inmediatamente adyacente a la región de codificación, o a la corrientes ascendente y a una distancia de la región de codificación. Por ejemplo, la primera de las dos secuencias de dirección (o toda la secuencia de dirección), si existe únicamente una secuencia de dirección en la construcción , se puede derivar de la corriente ascendente de las regiones genómicas de las secuencias de codificación de I NFa2. Por ejemplo, esta secuencia de dirección puede incluir una parte (por ejemplo, al menos 20, 50, 1 00 ó 1 000 nucleótidos consecutivos) de SEQ I D NO: 4, que corresponde a los nucleótidos -4, 074 a -51 1 del gen I N Fa2. La segunda de las dos secuencias de dirección , puede di rigir una corriente ascendente en la reg ion genómica de la propia secuencia de codificación . A manera d 3 ejemplo, la segunda secuencia de dirección puede contener e n su extremo 3' , una región de codificación exógena idéntica a algunos de los primeros codones de la secuencia de codificación I N Fa2. En la recombinación homologa, la región de codificación exógena se recombina con la parte dirigida de la secuencia de codificación de I N Fa2 endógena. Las secuencias que se pueden utilizar para dirigir I N Fa2, se describen de manera adicional en la solicitud Norteé mericana serie No. 09/305,638 , cuyo contenido se encuentra incorporado en su totalidad a la presente invención como referencia . En otro aspecto, la secuencia de dirección puede ser homologa a una parte del factor de est mulación de colonias de granulocito (GCSF). El GCSF es una citocina que estimula la proliferación y diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas comprometidas con el linaje dol neutrófilo/granulocito. El GCSF se utiliza en forma rutinaria en la prevención de neutropenia inducida por quimioterapias y en asociación con transplante de médula ósea.

Los padecimientos idiopáticos crónicos y neutropénicos congénitos también muestran mejora después de la inyección de GCSF. Es homólogo el sitio objetivo en el cual una secuencia de dirección determinada puede residir dentro de un exón y/o intrón del gen GCSF, la corriente ascendente de, e inmediatamente adyacente a la región de codificación GCSF, o la corriente ascendente de, y a una distancia de la región de codific ación GCSF. Por ejemplo, la primera de las dos secuencias de dirección en la construcción (o todas las secuencias de dirección, sí existe únicamente una secuencia de dirección en la construcción), puede ser homologa con la corriente ascendente de las regiones genómicas de las secuencias de codificación de GCSF. Por ejemplo, esta secuencia de dirección puede contener una parte de SEQ I D NO:5, que corresponde a los nucleótidos -6,578 a 101 del gen GCSF humano (por ejemplo, al menos 20, 50, 100 ó 1000 nuc eótidos consecutivos procedentes de la secuencia que corresponde a las posiciones -6,578 a-364 (SEQ I D NO:6)). La segunda de las dos secuencias de dirección en la construcción puede dirigir una corriente ascendente de región genómica de la secuencia de codificación (por ejemplo, contener también una parte de SEQ I D NO:6), o dirigir un exón o intrón del gen. Las secuencias que se pueden utilizar para dirigir GCSF se describen de manera adicional en la solicitud Norteamericana serie No. 09/305,384, cuyo contenido se encuentra incorporado en su totalidad a la presente invención como referencia.

SECUENCIA REGULADORA Una secuencia de ADN puede incluir una secuencia reguladora . La secuencia reguladora puede incluir uno o más promotores (tal como un promotor constitutivo o inducible), aumentadores, un UAS, regiones de adhesión de anda mio o sitios de adhesión a la matriz, elementos reguladores negativos, sitios de enlace del factor de transcripción o combinaciones de estas secuencias. La secuencia reguladora puede comprender un promotor inducible, de modo que las células se pueden inducir para expresar un producto conforme se producen o se introducen en u n individuo, por ejemplo, la célula no expresa el producto sino que puede inducir a expresarlo. La secuencia reguladora puede contener un promotor inducible, de modo que el producto sea expresado al momento de la introducción de la secuencia reguladora . Le secuencia reguladora puede ser una secuencia celular o viral . Tal es secuencias reguladoras incluyen , pero no se limitan a , aquella s que regulan la expresión de los primeros o últimos genes de SV40, de los últimos genes del adenovirus principal , del gen de metalotioneina-l de ratón , el gen de factor- 1 a de extensión , genes de citomegalovirus, genes de colágeno, genes de actina, genes de inmunoglobulina, gen de actina ?, gen YY1 activador de transcipción, gen de fibronectina, o el gen de reductasa HMG-CoA. La secuencia reguladora puede contener además un sitio de enlace del factor de transcripción , tal como un sitio de enlace de TATA Box, CCAAT Box, AP 1 , Sp 1 , ó N F-?B. ELEMENTOS ADICIONALES DE SECU ENCIA DE ADN La secuencia de ADN puede incluir uno o más exónes. Un exón es una secuencia de ADN que se copia en el un ARN y está presente en una molécula m adura de mARN. Un exón puede contener ADN que codifica u no o más aminoácidos y/o codifica parcialmente un aminoácido (por ejemplo, una o dos bases de un codón). De manera alternativa, un exón contiene ADN que corresponde a una región de nc -codificación, por ejemplo, una región de no-codificación 5'. Cuando el exón o exones exógenos codifican uno o más aminoácidos y/o una parte de un aminoácido, la secuencia de ADN puede ser diseñada de modo que al momento de la transcripción o empalme, el cuadro de lectura esté en cuadro con el segundo exón o región de codi icación de un gen dirigido. Tal como se utiliza en la presente invención, en cuadro significa que las secuencias de codificación de un primer exón y un segundo exón, cuando se fusionan, unen juntps nucleótidos en una forma que no cambia el cuadro de lectura adecuado de la parte del mARN derivado del segundo exón. Sí el primer exón del geh dirigido contiene la secuencia ATG para iniciar la traducción, el exc-n exógeno contiene preferentemente un ATG. Además, un exón exógeno que contiene un ATG puede incluir además uno o más nucleótidos de modo que la región de codificación resultante del m?RN que incluye el segundo y un subsecuente exón del gen dirigido está en cuadro. Los ejemplos de tales genes dirigidos en los cuales el primer exón contiene un ATG, incluye los genes que codifican eritropoyetina humana, hormona de crecimiento humano, granulocito/macrófago de factor de estimulación de colonia humana (hGM-CSF), y granulocito del factor de estimulación de colonia humana (hG-CSF). Un sitio de empalme del donante es una secuencia que dirige el empalme de un exón con otro exón. Normalmente, el primer exón se deposita en 5' en un segurdo exón, y un sitio de empalme del donante que se traslapa y flanquea el primer exón en su lado 3', reconoce un sitio de empalme del donante que flanquea el segundo exón en su lado 5' del segundo exón. Un sitio de empalme del donante puede tener una secuencia de consenso característica representada como: (A/C)AG GURAGU (en donde R denota un nucleótido de purina) siendo requerido el GU en la cuarta y quinta posiciones (Jackson 1991) Nuoleic Acids Res. 19:3715-3798). Las primeras tres bases del sitio de consenso de empalme del donante son al menos tres bases del exón. Los sitios de empalme del donante pueden ser definidos funcionalmente por su capacidad de llevar a cabo la reacción adecuada dentro de la trayectoria de empalme del mARN. Un sitio disparejo, es un sitio de empalme del donante que está presente en una secuencia dirigida y no está acompañado en la secuencia de ADN por un sitio de empalme con el receptor colocado en el lado 3' con el sitio de em alme del donante disparejo. El sitio de empalme del donante disparejo puede dar como resultado un empalme con un sitio de empalme del receptor endógeno.

Un sitio de empalme de receptor es una secuencia la cual, similar al sitio de empalme del donante, dirige el empalme de un exón con otro exón. Al actuar junto con un sitio del empalme del donante, el aparato de empalme utiliza un sitio de empalme del receptor para llevar a cabo la remoción de un intrón. Los sitios de empalme del receptor pueden tener una secuencia característica representada como: YYYYYYYYYYNYAG, en donde Y denota cualquier pirimidina y N denota cualquier nucleótido (Jackson (1991) Nucleic Acids Res. 19:3715-3793). Un intrón se define como una secuencia de uno o más nucleótidos que se depositan entre dos exónes y que se remueven, mediante empalme, de una molécula de ARN precursora en la formación de una molécula de m ARN. La secuencia reguladora puede ser enlazada a un codón de inicio ATG, para iniciar la trasllación. Opcionalmente, un sitio CAP (un sitio de inicio de mARN es specífico que está asociado con y es utilizado por la región reguladora) puede estar enlazado a la secuencia reguladora y al cpdón de inicio ATG. De manera alternativa, el sitio CAP asocie do con y utilizado por la secuencia reguladora, no está incluido en a secuencia objetivo, y el aparato de transcripción proporciona un nuevo sitio CAP. Un sitio CAP normalmente puede encontrarse en aproximadamente 25 nucleótidos 3' del cuadro TATA. El sitio de empalme del donante puede ser colocado en forma inmediata mente adyacente a un ATG, por ejemplo, cuando no se requ ¡ere la presencia de uno o más nucleótidos para que el exón exógeno esté en cuadro con el segundo exón del gen dirigido. El ADN que codifica uno o más aminoácidos o partes de un aminoácido o partes de un aminoácido en cuadro con la secuencia de codificación del gen dirigido, puede colocarse en forma inmediatamente adyacente al ATG en su lado 3'. Como tal, el sitio de empalme del donante puede colocarse en forma inmediatamente adyacente al ADN de codificación en su lado 3'. Una parte de la codificación de una secuencia de ADN (por ejemplo, en el exón 1 de la secjencia de ADN, puede codificar uno o más aminoácidos, y/o una parte de un aminoácido, las cuales son las mismas que la de la proteína endógena. Por ejemplo, la secuencia de ADN de codificación puede corresponder al primer exón del gen de interés. El ADN de cocificación puede codificar en forma alternativa uno o más aminoácidos o una parte de un aminoácido diferente al primer exón de la proteína de interés, por ejemplo, en donde los aminoácidos del primer exón de la proteína de interés no son importantes para la actividad o actividades de la proteína. Por ejemplo, cuando se construyen fusiones para un gen de eritropoyetina humana endógena (EPO), se pueden emplear las secuencias de codificación dol primer exón de la hormona de crecimiento humano (hGH). En este ejemplo, la fusión del exón hGH1 con el exón EPO2, da como resultado la formación de un péptido de señal híbrida que e! s funcional. Sin embargo, se puede utilizar cualquier exón de origen humano o no humano, en el cual los aminoácidos codificados no eviten la función del péptido de señal híbrida. Cuando el producto deseado es una proteína de fusión de la proteína endógena y codifican secuencias en la secuencia de ADN, el ADN de codificación exógen a incorporado en las células, puede incluir ADN que codifique uno o más exónes o una secuencia de cADN que corresponde a un producto de traducción o transcripción que se da fusionado con el producto del gen dirigido endógeno. Por lo tanto, la dirección se pue de utilizar para preparar proteínas quiméricas o multifunsiona es que combinen propiedades estructurales, enzimáticas o de enlace de ligando o receptor de dos o más proteínas en un polipéptido. Por ejemplo, la secuencia de ADN exógena puede codifica r, por ejemplo, una ancla con la membrana para la proteína d rigida o un péptido de señal para proporcionar o mejorar la secre ción celular, secuencias conductoras, regiones enzimáticas, regiones de dominio de transmembrana, regiones de enlace de cofacto r u otras regiones funcionales. Los ejemplos de proteínas que normalmente no son segregadas, aunque pueden ser fusionadas con una proteína de señal para proporcionar secreción, incluyen dopa-deca rboxilasa, proteínas reguladoras de transcripción e hidroxilasa de tirosina. La secuencia de ADN s puede obtener de fuentes en las cuales esto ocurre por naturaleza o pueden ser producidas, utilizando técnicas de ingeniería genética o procesos sintéticos. Secuencia Objetiva La secuencia de ADN , cuando se transfecta en células, tales como células primarias, secundarias o inmortalizadas, puede controlar la expresión de un producto deseado, por ejemplo, la parte activa o funcional de la proteína o ARN. La secuencia de ADN también puede codificar un producto deseado. El producto puede ser, por ejemplo, una hormona, una citosina, un antígeno, un anticuerpo, una enzima, un factor de coagulación, una proteína de transporte, un receptor, una proteína reguladora, una proteína estructural, un factor de tranécripción, un ARN antisentido o una ribozima. Además, el producto puede ser una proteína o un ácido nucleico que no ocurra en forma natural (por ejemplo, una proteína de fusión o ácido nucleico). Tales productos incluyen: eritropoyetina, calcitonina, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similar a insulina, hormona para tiroides, interferón-a2, (I FNA2), interferón-ß, interferón-?, factpres de crecimiento nervioso, FSHß, TGF-ß, factor de necrosis de tumor, glucagon, factor-2 de crecimiento de huesos, factor- 7 de crecimiento de huesos, TSH-ß, interleucina 1 , interleucina 2, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 1 1 , interleucina 12 granulocito-CSF (GCSF), macrófago- CSF, granulocíto/macrofago-GSF, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, cinasa de proteína C, glucocerebrosidasa, dismutasa de superóxido, activador de p asminogen de tejido, uroquinasa, antitrombina l l l , ADNse, gala ctosidasa-a, hidroxilasa de tirosina, factor de coagulación de sangre V, factor de coagulación de sangre Vil, factor de coagulación de sangre VIII, factor de coagulación de sangre IX, factor de coagulación de sangre X, factor de coagulación de sangre XIII, apolipoproteí ha E, apolipoproteína A-l, globinas, receptor de lipoproteína de baja densidad, receptor I L-2, antagonistas I L-2, antitripsin a-a-1, modificadores de respuesta inmunológica, glucoceramidas a-ß, iduronidasa-a, iduronidasa-a-L, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoensimaA: a-glucpsamina-N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, galactosidasa-ß, glucuronidasa-ß, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa, y CD4 soluble. Marcadores Seleccionables v A mplificación La identificación del evento de dirección puede facilitarse mediante el uso de uno o mas genes marcadores seleccionables.

Estos marcadores pueden este r incluidos en la secuencia de ADN o pueden presentarse en una co nstrucción diferente. Los marcadores seleccionables pueden estar divididos en dos categorías: seleccionables en forma positiva y seleccionables en forma negativa (en otras palabras, marcado es ya sea de selección positiva o selección negativa). En la selección positiva, las células que expresan el marcador selecc ionable en forma positiva tienen la capacidad de sobrevivir al tra tamiento con un agente selectivo (tal como neo, transferasa de fosfpribosilo de xantina-guanina (gpt), dhfr, deaminasa de adenina (ada) puromicina (pac), higromicina (hyg), CAD que codifica sintasa de fosfato de carbamilo, transcarbamilasa de aspartato, y sintasa de glutamina de dihidro-orotasa (GS), resistencia a múltiples fármacos 1 (mdr1) e histidina D (hisD), que permiten la selección de célu as en las cuales la construcción de dirección se integró en el ge moma de la célula huésped. En la selección negativa, las cé ulas que expresan el marcador seleccionado en forma negativa, se destruyen en la presencia del agente selectivo. La identificación del evento de dirección puede facilitarse mediante el uso de! uno o más genes marcadores que exhiben la propiedad de la selección negativa, de modo que el marcador seleccionado en forma negativa está enlazado a la secuencia de ADN exógena, aunque configurado de modo que el marcador seleccionable en forma negativa flanqueé la secuencia de dirección, y de modo que un evento de recombinación homólogo correcta consecuencias en el gsnoma de célula huésped, no de cómo resultado la integración estable del marcador seleccionado en forma negativa (Mansour y asociadcs (1988) Nature 336:348-352). Los marcadores útiles para éste uopósito incluyen gen de cinasa de timidina del Virus de Herpes Simple (TK), el gen gpt bacteriano, toxina de difteria y ARN antis entido o ribosima para el mARN que codifica con un gen esencial pa ra la supervivencia de la célula. Se puede incorporar una variedad de marcadores seleccionables en células primarias, secundarias o inmortalizadas.

Por ejemplo, se puede utilizar un marcador seleccionable que confiera un fenotipo selección able tal como resistencia al fármaco, auxotropía nutricional, resisten cia a un agente citotóxico o expresión de una proteína de superficie Los genes marcadores seleccionables que pueden utilizarse incluyen neo, gpt, dhfr, ada, pac, hyg, CAD, GS, mdr1, y hisD. El fenotipo seleccionable conferido hace posible identificar e aislar las células receptoras. Los genes que codifican marcadores seleccionables (por ejemplo, ada, GS, dhfr, y el gen CAD multifuncional), tienen la característica adicional de que permiten la selección de células que contienen copias implementadas del marcador seleccionable y flanquean la secuencia genómica. Esta característica proporciona un mecanismo para implementar en forma significativa el número de copias de un gen adyacente o enlazado para el cual se desean copias incrementadas. También se pueden utilizar versiones mutadas de estas secuencias que muestran propiedades de selección mejoradas y otras secuencias que conducen a copias incrementadas. El orden y número de componentes en la secuencia de ADN puede variar. Por ejemplo, el orden puede ser: una primera secuencia de dirección — marcador seleccionable — secuencia reguladora — un exón — un sit io de empalme del donante — una segunda secuencia de direccic n o en forma alternativa, una primera secuencia de dirección — secue ncia reguladora — un exón — un sitio de empalme del donante — ADN que codifica un marcador seleccionable — una segund'a s ecuencia de dirección. Las células que integran de manera estable la construcción, sobrevivirán al tratamiento con el agente selectivo; un subgrupo de células transfectadas en forma estable serán células recombinantes en forma homologa. Las células recombinantes en forma homologa pueden ser identificadas por una variedad de técnicas, incluyendo PCR, hibridación Southern y cl asificación fenotípica. El orden de la construcción puede ser, una primera secuencia de dirección — marcador seleccionable — secue ncia reguladora — un exón — un sitio de empalme del donante — un intrón — un sitio de empalme de receptor — una segunda secuencia de dirección. Como alternativa, el orden de componentes en la secuencia de ADN puede ser, por ejemplo: una primera secuencia de dirección — marcador seleccionable 1 — seq uencia reguladora — un exón — un sitio de empalme del donante — un segunda secuencia de dirección — marcador seleccionable 2, o, como alternativa, una primera secuencia de dirección — secue icia reguladora — un exón — un sitio de empalme del donante — mareé dor seleccionable 1 — una segunda secuencia de dirección — ma rc ador seleccionable 2. En esta adaptación, el marcador se eccionable 2 puede desplegar la propiedad de la selección nega tiva. Esto es, el producto del gen del marcador seleccionable 2 pued e seleccionarse en contra mediante el crecimiento en una formulación de medio adecuado que contiene un agente (normalmente un fárm acó o análogo de metabolitos) que extermina células que expre san el marcador seleccionable: la recombinación entre las secuencias de dirección que flanquean el marcador seleccionable 1, con secuencias homologas en el genoma de célula huésped, dan como resultado la integración dirigida del marcador seleccionable 1, en tanto que el marcador seleccionable 2 no está integrado. Tales even ítos de recombinación generan células que son transfectadas en forma estable con el marcador seleccionable 1, aunque no so ?n transfectadas en forma estable con el marcador seleccionable 2, y tales células pueden ser seleccionadas mediante el crecimiento en el medio que contiene el agente selectivo el cual selecciona el marcador seleccionable 1 y el agente selectivo que selecciona contra el marcador seleccionable 2.

La secuencia de ADN también puede incluir un marcador seleccionable en forma positiv ra que permite la selección de células que contienen copias ¡ncrem3ntadas del marcador. Las copias incrementadas de tal marcador, dan como resultado la coamplificación de las secuencias de ADN de flanqueo. Por ejemplo, el orden de componentes puece ser: una primera secuencia de dirección— -un marcador seleccionable en forma positiva que incremente el número de copias — un segundo marcador seleccionable (opcional)— secu encía reguladora — un exón — un sitio de empalme del donante — una segunda secuencia de ADN de dirección. El gen activado puede ser incrementado de manera adicional mediante la inclusió i de un gen marcador seleccionable que tiene la propiedad de que se pueden seleccionar las células que contienen copias incrementad as del gen marcador seleccionable cultivando las células en la presencia del agente seleccionable adecuado. El gen endógeno a ctivado incrementará en conjunto con el gen marcador seleccionable Las células que contienen muchas copias del gen endógeno activado pueden producir niveles muy altos de la prote ína deseada y son ú tiles para la prod ucción de proteína in vitro y terapia genética. Los genes marcadores s eleccionables y otros, no tienen que depositarse en forma inmediata mente adyacente entre sí. Complejos de Secuencia de ADN/Agente gue Aumenta la Recombinación Homologa/Agente gue I nhibe la U nión del Extremo no Homólogo La recombinación homól oga entre una secuencia de ADN de hilo doble y un ADN objetivo seleccionado, por ejemplo, ADN cromosómico en una célula, pu ede ser promovida proporcionando un agente que aumente la recom binación homologa, por ejemplo, una proteína Rad52 y un agente que inhiba la unión del extremo no homólogo, por ejemplo un agente que inactiva el Ku (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ku), en una proximidad lo suficientemente cercana con la secuencia de ADN y el s itio dirigido. El término "proximidad lo suficientemente cercana" tal como se utiliza en la presente invención , se refiere a la introducción de un agente de aumento de recombinación homologa o un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo o ambos, de mod D que la concentración del agente que aumenta la recombinación ho móloga y/o el agente que inhibe la unión del extremo no homólog o, es suficiente para proporcionar un rango más alto de una alteraci D ? en un sitio dirigido, por ejemplo, la recombinación homologa ent •e una secuencia de ADN y una secuencia objetivo. Se pu edén utilizar varios métodos para proporcionar varios métodos para proporcionar la inducción de la secuencia de ADN , el agente para aumentar la recombinación homologa, y un agente que inh ibe la unión del extremo no homólogo dentro de una proximidad cer¡cana entre sí. Al administrar estos compuestos en una proximidad cercana entre sí y el ADN objetivo, la actividad de los compuestos tales como Rad52 de moléculas que inactivan el Ku , por ejemplo u n anticuerpo anti-Ku se localiza en el sitio de la recombinación homologa. Por ejemplo, la inhibición local de la actividad Ku puede ser preferentemente en la inhibición de actividades Ku de toda la célula La proximidad cercana dé la secuencia de ADN , un agente que aumenta la recombinación hom óloga y un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, se puede mantener introduciendo estos elementos como parte de un complejo. Por ejemplo, se pueden utilizar complejos de proteína ADN . El núcleo de un complejo de proteína y un ADN puede estar compuesto de una secuencia de ADN de hilo doble que será introduc ida en el sitio seleccionado en el ADN objetivo. Se puede adherir un agente que aumenta la recombinación homologa, por ejemplo, una proteína Rad52 o fragmento de la misma, por ejemplo se puede recubrir en la secuencia de ADN , por ejemplo, en toda la secuencia o solo en los extremos de la secuencia de ADN , por ejemplo en al menos una parte de un extremo que sobresale de un solo hilo de la secuencia de ADN . El complejo de proteína-ADN puede incluir además un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, por ejemplo, un agente que inactiva el Ku , tal como un anticuerpo anti-Ku el cual está enlazado en forma covalente ya sea a la secuenci a de ADN o al agente que aumenta la recombinación homologa. El a «gente que inhibe la unión del extremo no homólogo también puede eí;tar enlazado en forma no covalente a la secuencia de ADN o al agente que aumenta la recombinación homologa Los compuestos también se pueden mantener en proximidad cercana entre sí, proporcionando la secuencia de ADN , el agente que aumenta la recombinación hom ologa y el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo en ijn liposoma o vesícula. Por ejemplo, también se pueden utilizar suspensiones de liposomas como transportadores farmacéuticam lente aceptables de estos elementos. Las suspensiones de liposoma > s se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos para lo ) s expertos en la técnica, por ejemplo, como el que se describe en la Patente Norteamericana No. 4,522,81 1 La secuencia de ADN , el agente que aumenta la recombinación homologa y el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, también pueden ser parte de u na solución mezclada que pueden ser microinyectada en una célula o cada uno de estos compuestos se puede introducir en una suces ion rápida , de modo que los tres de estos compuestos estén presentes en la célula al mismo tiempo.

Otros métodos para introducir uno o más de estos compuestos, incluyen administración transm tida por el receptor, electroporación y precipitación de fosfato de calcio. Células Las células primarias y secundarias que serán transfectadas, se pueden obtener a partir de una variedad de tejidos e incluyen tipos celulares que se pueden mantener y propagar en el cultivo.

Por ejemplo, las células prim íarias y secundarias que pueden ser transferidas, incluyendo f ííbroblastos, keratinocitos, células epiteliales (por ejemplo célu as epiteliales de mamífero, células epiteliales del intestino), células endoteliales, células guales, células neurales, elementos formados de la sangre, (por ejemplo, linfocítos, células de la médula ósea), células de músculo y precursores de estos tipos de células somáticas. Las células primarias se obtienen preferentemente a partir de individuos a quienes se les administran células primarias o secundar as transfectadas (por ejemplo, una célula autóloga). Sin embargo, se pueden obtener células primarias a partir de un donante (diferente al receptor) de la misma especie (por ejemplo, una célula alogénica) u otra especie (por ejemplo, una célula xenogeneíca) (por ejem plo, ratón, rata, conejo, gato, perro, cerdo, vaca, pájaro, abeja, cabra, caballo). Las células primarias o secundarias de origen vertebrado, particularmente mamíferos se pueden transfectar con una secuencia de ADN exógena, por ejemplo una secuencia de ADN exógena que codifica una proteína terapéutiica, y se puede producir una proteína terapéutica codificada en forma estable y reproducible tanto in vitro como in vivo, durante períodos de tiempo extendidos. Además, las células primarias y secundarias transfectadas pueden expresar el producto codificado in vivo en niveles fisiológicamente relevantes, las células pueden ser recuperadas después del implante y al momento del nuevo cultivo, crecer y desplegar sus propiedades de implantación previa. En forma alternativa, las células primarias o secundarias de origen vertebrado, particula rmente de mamífero pueden ser transfectadas con una secuencia de ADN exógena que incluye una secuencia reguladora. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen uno o más de: un p motor, un aumentador, un UAS, una región de adhesión de andamie o un sitio de enlace de transcripción. El evento de dirección puede dar como resultado la inserción de la secuencia reguladora de la socuencia de ADN , colocando un gen endógeno dirigido bajo su cont rol (por ejemplo, mediante la inserción ya sea de un promotor o un aumentador o ambos, corriente ascendente del gen endógeno o región reguladora). De manera opcional, el evento de dirección puede dar como resultado en forma simultánea la eliminación de una secuencia reguladora endógena, tal como la eliminación de una sec uencia reguladora negativa específica de tejido, de un gen. El evento de dirección puede reemplazar una secuencia reguladora existente; por ejemplo un aumentador específico de tejido puede ser reemplazado por un aumentador que tiene una especificidad de tipo celular más amplia o diferente a los elementos que ocurren en fo rma natural, o despliega un patrón de regulación o inducción que es diferente a la célula no transfectada correspondiente. A este resp ecto, se eliminan las secuencias que ocurren en forma natural y se : gregan secuencias nuevas. En forma alternativa, las secuencias reg uladora endógenas no se remueven o reemplazan, sino que son in terrumpidas o deshabilitadas por el evento de dirección, tal como la dirección de secuencias exógenas dentro de los elementos reguladores endógenos. La introducción de una secuencia reguladora med ¡ante recombinación homologa, puede dar como resultado células p imarias o secundarias que expresan una proteína terapéutica la cual no se expresa de manera normal. Además, la introducción dirigida de una secuencia reguladora, se puede utilizar para células que elaboran o contienen la proteína terapéutica, pero en cantida des más bajas de lo normal (en cantidades menores al nivel inferior fisiológicamente normal) o en forma defectuosa, y para célul as que laboran la proteína terapéutica en niveles fisiológicamente normales, pero que serán aumentados o mejorados en su contenido o producción. Las células primarias o secundarias transfectadas, también pueden incluir una secuencia de ADN que codifica un marcador seleccionable que confiere un fenotipo seleccionable en ellos, facilitando su identificación y aislamiento. Los métodos para producir células primarias, sec : undarias transfectadas, que expresan de manera estable la secuencia de ADN , cepas de células clónales y cepas de células heterogéneas de tales células transfectadas, métodos para producir las cepas de células clónales y heterogéneas, y métodos para tratar de evitar una condición anormal o indeseable a través del uso de poblaciones de células primarias o secundarias transfectadas, son parte de la presente invención.

Transfección de Células Primarias o Secundarias. Recombinación Homologa y Producción de Cepas de Células Clónales Heterogéneas Se puede obtener tejid lo vertebrado a través de métodos estándares tales como, biopsia por perforación u otros métodos quirúrgicos para obtener una fuente de tejido del tipo de célula primaria de interés. Por ejemp o, la biopsia por perforación se utiliza para obtener piel como una fuente de fibroblastos o keratinocitos.

Se obtiene una mezcla de células primarias a partir del tejido, utilizando métodos conocidos, tales como digestión o explantación enzimática. Si se utiliza digestión enzimática, se pueden utilizar enzimas tales como colágena sa, hialuronidasa, dispasa, pronasa, tripsina, elastasa, y quimotripsi na. La mezcla de célula prim aria resultante puede ser transfectada directamente o puede ser cultivada primero, removida de la placa de cultivo y suspendida nuevame nte antes de que se lleve a cabo la transfección. Las células pri marias o las células secundarias se combinan con la secuencia de ADN que será introducida en sus genomas, que incluyen opciona Imente ADN que codifica un marcador seleccionable, y se tratan con el objeto de lograr la trasfección.

Además, las células primarias o secundarias se combinan con una proteína Rad52 o fragmento de la misma y una molécula que inactiva el Ku, por ejemplo, un anticue •po anti-Ku, ya sea solo o como parte de un complejo.

Las células primarias o secundarias transfectadas, pueden ser elaboradas mediante electroforasión. La electroforasión se lleva a cabo en un voltaje y capacitancia adecuados (y constante de tiempo correspondiente) para dar como resultado la entrada de la construcción (s) de ADN en las células primarias o secundarias. Se puede llevar a cabo la electroporación en un amplio rango de voltajes (por ejemplo, de 50 a 200° voltios) y capacitancia correspondiente. Generalmente se utiliza el ADN total de aproximadamente 0.1 a 500 µg. Preferentemente, las células primarias o secundarias son transfectadas utilizando micro nyección. De manera alternativa se pueden utilizar métodos con ocidos tales como precipitación de fosfato de calcio, precipitació n de fosfato de calcio modificado y precipitación de polibreno, fus ion de liposomas y administración de gen transmitido por receptor para transfectar las células. Una célula transfectada en forma estable se aisla y cultiva y subcultiva, bajo condiciones de cultivo y duran e un tiempo suficiente, para propagar las células secundarias transfectadas de manera estable y producir una cepa de células clónales de células secundarias transfectadas. Como alternativa, se cultiva y subcultiva más de una célula transfectada, dando como resultado la producción de una cepa de célula heterogénea. Después de la transfección, la célula se mantiene bajo condiciones que permiten la ecombinación homologa, tal como la conocida en la técnica (Capecchi (1989) Science 244: 1288-1292.

Las células primarias o secundarias recombinadas en forma homologa pueden pasar por u in número suficiente de doblamientos para producir ya sea una cepa de célula clonal o una cepa de célula heterogénea de un tamaño su nciente para proporcionar la proteína terapéutica a un individuo en cantidades efectivas. En general, se toma la biopsia de 0.1 cm2 de piel y se asume que contiene 100,000 células; una célula se utiliza para producir una cepa de célula clonal y pasa por aproximadamente 27 doblamientos para producir 100 millones de células secundarias recombinadas en forma homologa. Si una cepa de célula heterogénea será producida a partir de una población recombinada en forma homologa original de aproximadamente 100,000 cé Huías, se necesitan únicamente 10 doblamientos para producir 100 millones de células, El número de células equeridas en una cepa de células clónales o heterogéneas recombinadas en forma homologa es variable y depende de una var edad de factores, incluyendo pero sin limitarse a, el uso de las célu as recombinadas en forma homologa, el nivel funcional de la secuencia de ADN exógena en las células, el nivel funcional de la secuencia de ADN alterada en la célula, el sitio de implante de las células re combinadas en forma homologa (por ejemplo, el número de células que pueden ser utilizadas, se limita por el sitio anatómico del impl ante), y la edad, área de superficie y condiciones clínicas del paciente. Para poner estos factores en perspectiva, para administrar niveles terapéuticos de administración de hormona de crecimiento humano en un paciente de 10 kg saludable con deficiencia de hormona de crecimiento aislada, será necesario aproximadamente de uno a cinco mil millones de fibroblastos recombinados en orma homologa (el volumen de estas células es aproximado según la punta del dedo pulgar del paciente Se pueden utilizar varios métodos para determinar la eficacia de los métodos aquí descritos, para aumentar la recombinación homologa en una célula. Por ejemplo, se puede diseñar un sistema experimental para detectar uñé substitución no conservadora en una célula, por ejemplo, una célula humana. La substitución puede ser una substitución de C a T en el codón CGA del exón 3 del gen HPRT, el cual es parte de un sitio Xnol . Esta mutación crea una señal de terminación TGA que da como resultado un fenotipo negativo-HPRT marcado como resistente para tioguanina-6 (6-TG). Esta mutación también se logra mediante una pérdida del sitio Xhol correspondiente. En síntesis, una secuencia de ADN que incluye la substitución C a T, se puede introducir mediante microinyección en una célula de fibroblasto humano como parte de un complejo que incluye un agente que aumenta la recombinación homologa y un agente que inactiva el Ku. La s células se cultivan y dejan propagar antes de introducir las células en el medio que incluye 6-TG. Los clones resistentes a 6-TG posteriormente pueden ser marcados para determinar la presencia de a secuencia de ADN mutada. La presencia de un evento de recombinación homologa puede ser detectada mediante análisis de manchado Southern de ADN genómico digerido por Xhol utilizando una sonda específica de HPRT. Los resultados tambié i se pueden comparar para controlar células en las cuales se introdi ce la secuencia de ADN mutada en la ausencia de un agente que au menta la recombinación homologa y un agente que inactiva el Ku. Implantación de Cepa de Célula Clonal o Cepa de célula Heterogénea de Células Secundarias Recombinadas en forma Homologa Las células recombinada s en forma homologa producidas tal como se describió anteriorme nte, pueden ser introducidas en un individuo a quién se le administrará la proteína terapéutica, utilizando métodos conocidos. La cepa de célula clonal o cepa de célula heterogénea, se introduce posteriormente a un individuo, utilizando métodos conocidos, utilizando varias rutas de y varios sitios de administración (por ej jemplo renal, subcpasular, subcutánea, sistema nervioso central (ii ncluyendo intratecal), intravascular, intrahepático, intraesplénico, intraperitoneal (incluyendo intraomental), o implante intramuscular). Una vez implantadas en el individuo, las células recombir adas en forma homologa producen el producto terapéutico codificad D por el ADN sintético exógeno o las células recombinadas en forma homologa expresan una proteína terapéutica codificada por una secuencia de ADN endógena bajo el control de una secuencia reguladora exógena. Por ejemplo, un individuo a quien se la ha diagnosticado hemofilia B, un padecimiento de sangrado que es originado por una deficiencia en el factor IX, y una proteína encon trada normalmente en la sangre, es un candidato para una cura de terapia genética. Al paciente se le ha realizado una pequeña biopsi a de piel; esto es un procedimiento simple que se puede llevar a cabo en una base de paciente externo. La pieza de piel, aproximadamente del tamaño de una cabeza de cerillo, se toma por ejemplo de la parte inferior del brazo y requiere aproximadamente un minuto para removerla. La muestra es procesada, dando como resultado el aislamiento de las células del paciente (en este caso fibroblasto), y es construida en forma genética para producir el factor IX faltante. Con base en la edad, peso y condición clínica del p aciente, se desarrollan el número de células requeridas en un cult vo a gran escala. Todo el proceso debe requerir de 4-6 semanas, y al final de este tiempo, se introduce el número apropiado de células construidas en forma genética en el individuo, nuevamente como un paciente externo (por ejemplo, inyectándolas nuevamente debajo de la piel del paciente). Ahora el paciente tiene la capacidad de producir su propia factor IX y ya no será más un hemofílico. Se puede utilizar un método similar para tratar otras condiciones o enfermedades. Por ejemplo, la baja estatura se puede tratar administrando hormona de crecimiento humana a un individuo implantando células primaria s o secundarias que expresan la hormona de crecimiento huma ino. Como este ejemplo lo sugiere, las células utilizadas serán cé llulas construidas en forma genética específicas para el paciente Sin embargo, es posible obtener células de otros individuos de la misma especie o de diferentes especies. El uso de tales células puede requerir la administración de un inmunosupresor, alteración de histocompatibilidad de antígenos o uso de un aparato protector para evitar el rechazo de las células implantadas. Para muchas en fermedades, esto será un tratamiento de una vez, y para otros, se requerirán múltiples tratamientos de terapia genética. Las células primarias o secundarias transfectadas se pueden administrar solas o junto con una protección o agente que inhibe la respuesta inmune contra la célula en un sujeto receptor. Por ejemplo, se puede administrar jn agente inmunosupresor a un sujeto para inhibir o interferir con la respuesta normal en el sujeto. Preferentemente, el agente inmunosupresor es un fármaco inmunosupresivo que inhibe la actividad de la célula T/o célula B en un sujeto. Los ejemplos de tales fármacos inmunosupresores comercialmente disponibles s n (por ejemplo, ciclosporina A que está disponible en Sandoz Core East Hanover, NJ). Un agente inmunosupres or, por ejemplo, o fármaco, puede ser administrado a un sujeto en un a dosis suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado (por ejem Dio, inhibir el rechazo de las células), Los rangos de dosificación ara fármacos inmunosupresores se conocen en la técnica. Se dejbe ver por ejemplo la publicación de Freed y asociados, (9912) N Engl. J . Med. 327: 1549; Spencer y asociados (1992) N. Engl. J. Med. 327: 1541 ' Widner y asociados (1992) n. Engl. J. Med. 327 1556). Los valores de dosificación invención, se refiere a un apa rato que sirve como una protección entre la célula administrada y las células involucradas en la respuesta inmune en un sujeto. Por ejemplo, las células pueden ser administradas en un aparato implantable. Un aparato implantable puede incluir las células cor tenidas dentro de una protección semipermeable, por ejemplo, una que deja nutrientes y el producto difuso dentro y fuera de la protección, pero que evita la entrada de componentes del sistema inmune más grandes, por ejemplo, anticuerpos o complementos. Un aparato con capacidad de implante incluye normalmente una matriz, por ejemplo, un hidrogel o núcleo en donde se colocan las células. De manera opcional , un recubrimiento semipermeable p üede encerrar el gel . Si se coloca dentro del núcleo de gel, las células administradas deben ser secuestradas de las células del sistema inmune y deben ser rodeadas de las células de a nticuerpos citotóxicos del huésped .

Preferentemente, se utiliza un recubrimiento permoselectivo tal como PLL o PLO. Con frecuencia el r acubrimiento tiene una porosidad que evita que los componentes del sistema inmune del receptor entren y aparato implantable. En la técnica se conoce i muchos métodos para encapsular células. Por ejemplo, la encapsulación utilizando goma soluble en agua para obtener un gel insoluble en agua semipermeable para encapsular células para la producción y otros métodos de encapsulación , se describen on la Patente Norteamericana No. 4, 352, 883. Otros aparatos im lantables que se pueden utilizar, se describen en la Patente Norteamericana No. 5,084,350, Patente Norteamericana No. 5,427,935, publicación WO 95/19743 publicada en julio 27, 1995, Patente Norteamericana No. 5,545,423, Patente Norteamericana No. 4,409,331 , Patente Norteamericana No. 4,663,286, y la Patente Europea No. 301 ,777. Usos de Células Primarias y Secundarias Recombinadas en Forma Homologa y Cepas de Célula Las células primarias o Secundarias recombinadas en forma homologa o cepas de células tienen una amplia capacidad de aplicación, un vehículo o sistema de administración para proteínas terapéuticas, tales como enzimas, hormonas, citocinas, antígenos, anticuerpos, factores de coagulación, ARN antisentido, proteínas reguladoras, proteínas de transcripción, receptores, proteínas estructurales, proteínas novedo sas (no optimizadas) y productos de ácido nucleico, y ADN construi do. Por ejemplo, se pueden utilizar células primarias o secundaria s recombinadas en forma homologa para suministrar una proteíne terapéutica, incluyendo pero sin limitarse a eritropoyetina, ca lcitonina, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similar a insulina, hormona para tiroides, interferón-a2, (I FNA2), interferón-ß, interferón-?, factores de crecim iento nervioso, FSHß, TGF-ß, factor de necrosis de tumor, glucagon , factor-2 de crecimiento de huesos, factor-7 de crecimiento de huesos, TSH-ß, ¡nterleucina 1 , interleucina 2, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 1 1 , interleucina 12, granulocito-CSF (GCSF), macrófago-CSF, granulocito/macrofago CSF, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, cinasa de proteína C, glucocerebrosidasa, dismu asa de superóxido, activador de plasminogen de tejido, uroquinasa, antitrombina l l l , ADNse, galactosidasa-a, hidroxilasa de tirosina, factor de coagulación de sangre V, factor de coagulación de sangre Vi l , factor de coagulación de sangre VI I I , factor de coagulación de sangre IX, factor de coagulación de sangre X, fac or de coagulación de sangre XI I I , apolipoproteína E, apolipoproteína A-l , globinas, receptor de lipoproteína de baja densidad , receptor I L-2, antagonistas IL-2, antitripsina-a-1 , modificadore s de respuesta inmunológica, glucoceramidasa-ß, iduronidasa a, iduronidasa-a-L, glucosamina-N-sulfatasa, a-N-acetilglucosaminidasa, acetilcoensimaA: a-glucosamina-N-acetiltransferasa N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, galactosidasa-ß, glucuronidasa- 3, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa, y CD4 soluble. Todas las patentes y referencias aqu í nombradas, están incorporadas en su totalidad como referencia. Otras modalidades se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. consiste de: un anticuerpo anti-Ku y un oligómero de enlace a Ku , y un polipéptido de enlace a Ku . 7. El complejo de conformidad con la reivindicación 5, en donde el agente que inactiva el <u es un anticuerpo anti-Ku . 8. El complejo de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia de ADN lineal . 9. El complejo de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la secuencia de ADN está flanqueada por al menos una secuencia de dirección. 1 0. El complejo de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora exógena. 1 1 . El complejo de conformidad con la reivindicación 1 0, en donde la secuencia reguladora es un promotor, un aumentador, una secuencia de activación de corriente ascendente, una región de adhesión de andamio o un sitio de enlace del factor de transcripción. 1 2. El complejo de conf c-rmidad con la reivindicación 1 1 , en donde la secuencia reguladora e ÍS un promotor y un aumentador. 1 3. El complejo de conformidad con la reivindicación 1 1 , en donde la secuencia reguladora es un promotor y una secuencia que activa la corriente ascendente. 14. El complejo de conformidad con la reivindicación 3, en donde la proteína Rad52 o fragmento funcional de la misma se recubre en la secuencia de ADN 15. El complejo de con ormidad con la reivindicación 3, en donde la proteína Rad52 es un proteína o fragmento de la misma es Rad52 humana. 16. El complejo de conformidad con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo anti-Ku es un anticuerpo anti-Ku70. 17. El complejo de conformidad con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo anti-Ku es un anticuerpo anti-Ku80. 18. El complejo de conformidad con la reivindicación 7, en donde al menos un anticuerpo anti-Ku está enlazado en forma covalente a la secuencia de ADN. 19. El complejo de conformidad con la reivindicación 7, en donde al menos un anticuerpo anti-Ku está enlazado en forma covalente al agente para aumentar la recombinación homologa. 20. El complejo de conformidad con la reivindicación 7, en donde el complejo comprende un anticuerpo anti-Ku70 y un anticuerpo anti-Ku80. 21 . El complejo de conformidad con la reivindicación 9, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora y la secuencia de dirección se de iva de una secuencia 5' de la región de codificación de proteína del g en FSHß. 22. El complejo de conformidad con la reivindicación 9, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora y la secuencia de dirección se de iva de una secuencia 5' de la región de codificación de proteína del gen IFNa 23. El complejo de con ormidad con la reivindicación 9, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora y la secuencia de dirección se de iva de una secuencia 5' de la región de codificación de proteína del c en GCSF. 24. El complejo de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende además un agente que inhibe una proteína de reparación de mal emparejamiento. 25. Un método para promover una alteración en un sitio seleccionado en un ADN objetivo de una célula, que comprende: introducir en la céUla una secuencia de ADN de hilo doble, un agente que aument a la recombinación homologa y un agente que inhibe la unión del extremo no homólogo, para promover de este modo la alteración del ADN de cromosomas, para promover de este modo la alteración en un sitio seleccionado en el ADN de cromosoma. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia de ADN lineal. 27. El complejo de conformidad con la reivindicación 25, en donde la secuencia de ADN está flanqueada por al menos una secuencia de dirección 28. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora exógena. 29. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde la secuencia reguladora es seleccionada del grupo que consiste de: un promotor, un aumentador, una secuencia de activación de corriente ascendente, una región de adhesión de andamio y un sitio de enlace del factor de transcripción. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde la secuencia reguladora es un promotor y un aumentador. 31 . El método de conformidad con la reivindicación 28, en donde la secuencia reguladora es un promotor y una secuencia de activación de corriente ascender te. 32. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el agente que aumenta la recombinación homologa es seleccionada del grupo que consiste de: una proteína Rad52 o fragmento funcional de la misrr a, una proteína Rad51 o fragmento funcional de la misma, una protoína Rad54 o fragmento funcional de la misma, y combinaciones de las mismas. 33. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el agente que aumenta la recombinación homologa es una proteína Rad52 o fragmento funcional de la misma. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde la proteína Rad52 o fragmento funcional de la misma está recubierto en la secuencia de ADN. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde la proteína Rad52 o fragrr ento de la misma es Rad52 humana. 36. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el agente que inhibe la unión del extremo no homólogo se selecciona del grupo que consiste de un agente que inactiva el hMre1 1 , un agente que inactiva el hRad50, un agente que inactiva el Nbs1 , un agente que inactiva el hLig4, un agente que inactiva hXrcc4, y un agente que inactive el Ku. 37. El método de confo rmidad con la reivindicación 25, en donde el agente que inhibe la i nión del extremo no-homólogo es un agente que inactiva el Ku. 38. El método de confo rmidad con la reivindicación 37, en donde el agente que inactiva el Ku es un anticuerpo anti-Ku, un oligómero de enlace a Ku, y un polipéptido de enlace a Ku. 39. El método de confo rmidad con la reivindicación 37, en donde el agente que inactiva el ku es una molécula antisentido Ku. 40. El método de confo rmidad con la reivindicación 37, en donde el agente que inactiva el ku es un anticuerpo anti-Ku. 41 . El método de confo rmidad con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo anti-Ku es u n anticuerpo anti-Ku70. 42. El método de confo rmidad con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo anti-Ku es u n anticuerpo anti-Ku80. 43. El método de confo rmidad con la reivindicación 40, en donde al menos un anticuerpo anti-Ku está enlazado en forma covalente a la secuencia de ADN. 44. El método de confo rmidad con la reivindicación 40, en donde al menos un anticuerp o anti-Ku está enlazado en forma covalente a la proteína Rad52 o fragmento de la misma, 45. El método de confo rmidad con la reivindicación 25, en donde la célula es de origen fún gico, de planta o animal. 46. El método de confo rmidad con la reivindicación 45, en donde la célula es de origen ve rte brado. 47. El método de confo rmidad con la reivindicación 46, en donde la célula es una célula me mífera primaria o secundaria. 48. El método de confo rmidad con la reivindicación 46 , en donde la célula es una célula hu mana primaria o secundaria . 49. El método de conformidad con la reivindicación 46, en donde la célula es una célula ma mífera inmortalizada. 50. El método de confo rmidad con la reivindicación 46, en donde la célula es una célula hu mana inmortalizada. 51 . El método de confo rmidad con la reivindicación 25, en donde la secuencia de ADN , el agente que aumenta la recombinación homologa y el agente que inhib a la unión del extremo no homólogo, se introducen en la célula en la orma de un complejo. 52. El método de confor midad con la reivindicación 25, que comprende además introducir un agente que inhibe una proteína de reparación de mal emparejamien to. 53. El método de confo rmidad con la reivindicación 52, en donde la proteína de reparación de mal emparejamiento se selecciona del grupo que cons ste de: Msh2 , Msh6, Msh3, M l h 1 y PMS2. 54. El método de confo rmidad con la reivindicación 52 , en donde el agente es un agente que inhibe la expresión de una proteína de reparación de mal emparejamiento. i.« 55. El método de confo rmidad con la reivindicación 54 , en donde el agente es un anticuerp o anti-proteína de reparación de mal emparejamiento 56. El método de confo >rmidad con la reivindicación 54, en donde al menos un anticuerpo anti-proteína de reparación de mal emparejamiento está enlazada en forma covalente a la secuencia de ADN . 57. El método de conformidad con la reivindicación 55, en donde al menos un anticuerpo anti-proteína de reparación de mal emparejamiento está enlazada en forma covalente a la proteína Rad52 o fragmento de la misma 58. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la secuencia de ADN cofmprende una secuencia reguladora y la secuencia de dirección se deriva de la región 5' de la región de codificación FSH ß 59. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la secuencia de ADN co mprende una secuencia reguladora y la secuencia de dirección se deriva de la región 5' de la región de codificación I FNa 60. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora y a secuencia de dirección se deriva de la región 5' de la región de codificación GCSF. 61 . El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el ADN objetivo compren de una mutación que tiene menos de 10 pares base que difieren de la secuencia de tipo natural. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61 , en donde la mutación es una mutaci ón de punto. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde la secuencia de ADN com prende una secuencia de tipo natural que puede corregir la mutación. 64. El método de confo rmidad con la reivindicación 63, en donde el ADN objetivo es un gen regulador de transmembrana de fibrosis quística (CFTR). 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, en donde la mutación cambia un aminoácido codificado por el codón 508 de la región de codificación del gen CFTR. 66. El método de conformidad con la reivindicación 63, en donde el ADN objetivo es un gen de globina-ß. 67. El método de confo rmidad con la reivindicación 66, en donde la mutación cambia un a minoácido codificado por el codón 6 de la región de codificación del gen de globina-ß 68. El método de confo rmidad con la reivindicación 63, en donde el ADN objetivo es un gen del factor VI I I . 69. El método de confo rmidad con la reivindicación 68, en donde la mutación cambia un aminoácido codificado por el codón 2209 de la región de codificación del gen de factor VI I I 70. El método de confo rmidad con la reivindicación 68, en donde la mutación cambia un aminoácido codificado por el codón 2229 de la región de codificación del gen de factor Vi l 71 El método de confo rmidad con la reivindicación 63, en donde el ADN objetivo es un gen de factor IX 72. El método de confo rmidad con la reivindicación 63, en donde el ADN objetivo es un gen del factor von Willebrand. 73. El método de confo rmidad con la reivindicación 63, en donde el ADN objetivo es un gen del grupo de xeroderma pigmentosa G. 74. Una célula recombinada en forma homologa elaborada a través del método de conformidad con la reivindicación 25. 75. Un método para altorar la expresión de una secuencia que codifica una proteína de un gen en una célula, en donde el método comprende: introducir el complejo de conformidad con la reivindicación 1 en la célula, en donde la secuencia de ADN comprende una secuencia reguladora; mantener la célula bajo condiciones que permitan la alteración de una secuencia genómica dirigida para producir una célula recombinada en forma homologa ; y mantener la célula reco mbinada en forma homologa bajo condiciones que permitan la expresión de la secuencia de codificación de proteína del gen bajo el control de la secuencia reguladora, alterando de este m odo la expresión de la secuencia que codifica la proteína del gen.