JP2003522973A

JP2003522973A - 定量蛍光顕微鏡検査法

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Publication number: JP2003522973A
Application number: JP2001558777A
Authority: JP
Inventors: ジーンアイ．モンタグ，
Original assignee: アフィメトリックスインコーポレイテッド
Priority date: 2000-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2003-07-29
Also published as: ATE385322T1; WO2001059503A3; WO2001059503A9; US6472671B1; US20030015668A1; DE60132656T2; WO2001059503A2; US20070012885A1; US20050206893A1; DE60132656D1; US20070190566A1; EP1254392B1; EP1254392A2; CA2399627A1; US6984828B2; US20030057379A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、顕微鏡検査法で使用される較正装置、較正方法、較正ツールに関連する。蛍光顕微鏡検査法のための較正ツールは、支持体、蛍光物質を含む固体表層、および表層の部分を露出する選択された寸法を有する参照形状開口部を規定する非蛍光物質の薄い不透明マスクを備える。この較正ツールの第１の型は、支持体の表面と蛍光物質を含む固体表層との間の接触を促進する付着プロモータを備え得る。これは薄い不透明マスクに接触している。本較正ツールの第２の型は、支持体上に組立てられた（付着プロモータを備えた、または備えない）薄い不透明マスク、およびこの不透明マスク上に設置された蛍光物質を含む固体表層がある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術の分野）本発明は、顕微鏡検査法に関し、そしてさらに詳細には、顕微鏡の光学素子に
対するサンプルの位置の較正および／または顕微鏡における蛍光検出の較正に関
する。

【０００２】（背景）試験または較正の標的が、従来の顕微鏡のシステム性能を評価するために使用
される。これらは、異なった顕微鏡システム間でベースラインを確立し、そして
以下のその従来の構成要素によって画質を特徴づけるために使用される：解像度
、コントラスト、被写界深度、およびひずみ。従来の顕微鏡について一般的に提
供されるものは、ＵＳＡＦＦｅｉｌｄＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＴａｒｇｅｔ
、ＵＳＡＦＣｏｎｔｒａｓｔＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＴａｇｅｔｓ、Ｓｔａ
ｒＴａｒｇｅｔ、ＲｏｎｃｈｉＲｕｌｉｎｇＴａｒｇｅｔｓ、Ｍｏｄｕｌ
ａｔｉｏｎＴｒａｎｓｆｅｒＦｕｎｃｔｉｏｎＴａｒｇｅｔｓ、Ｄｅｐｔ
ｈｏｆＦｉｅｌｄＴａｒｇｅｔｓならびにＤｏｓｔｏｒｔｉｏｎおよびＡ
ｂｂｅｒａｔｉｏｎＴａｒｇｅｔｓである。

【０００３】他のものも存在する。

【０００４】標的は、代表的には、プラスチックまたはガラスの基材の上に印刷または蒸着
されたパターンである。標的上の光学的な形状は、好ましくは試験される光学系
の解像度より微細である。この参照形状（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｅａｔｕｒｅ
）が，顕微鏡で検査する標本より小さい大きさのオーダーの寸法またはパラメー
タを有していることが所望される一方、実施者が、検査される標本の寸法または
パラメータよりも１／４または１／５以下しかない参照寸法または参照パラメー
タを受け入れなけらばならなかった。

【０００５】標本の蛍光顕微鏡検査法は、従来の顕微鏡検査法と異なっており、そして要求
がより多い。これは、蛍光顕微鏡検査法が、標本の照明により励起される比較的
低いレベルの蛍光発光に基いているからであり、これは比較的微弱な信号をピン
ホールなどを通して検出するために共焦点配置（ｃｏｎｆｏｃａｌａｒｒａｎ
ｇｍｅｎｔｓ）を代表的には用いる。例は、蛍光発光する生物学的物質を含む可
能性がある乾燥液体スポット（ｄｒｉｅｄｌｉｑｕｉｄｓｐｏｔ）からの蛍
光の検出であり、この乾燥スポット（乾燥スポットの厚さは数ミクロン未満）は
、本質的に機器の焦点面に位置する。別の例は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）
ような生物学的マクロアレイからの蛍光である。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）
は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．製であり、この中の蛍光物質は比較的微々
たる厚さである。

【０００６】蛍光顕微鏡検査法のための試験または較正の標的について、多くの従来の画質
の構成要素の他に、蛍光発光に関してシステムの光学的効率を試験する要件があ
る。これは多大な複雑性を導き出す。なぜならば、蛍光は、励起された光化学的
効果を含み、検出器における電圧または信号レベルを生み出すからである。この
ことは、較正と関連する様々な光学部品での計測と相互作用する、信号対雑音比
の問題を導く。一般には、信号対雑音比は、申し分のない操作を得るために少な
くとも３対１でなければならない。

【０００７】広い範囲の機器および使用条件で定量化することが所望される蛍光活性を適切
にシミュレートする較正の標的を見出すことは、未解決の問題である。一般には
、顕微鏡の被写界深度内に位置し、そして生物学的物質の極小のドット（ｄｏｔ
ｓ）の場合には、本質的には平面上に位置する（例えば、たった数ミクロンまた
はそれよりかなり小さい深度にある）蛍光発光する標本をシミュレートすること
が所望される。画像化される個々の標本の寸法は、マイクロアレイ技術の進歩に
従ってますます小さくなるので、適切な較正ツールを有さないことの重大性が、
ますます深刻になってきた。

【０００８】蛍光顕微鏡に纏わる困難は、所望の程度の較正が得られない場合、異なった機
器を使用して実施された生物学的研究または他の研究で得られた結果を比較する
ことが難しくなり、従って異なった研究室（異なった機関の研究室であろうと、
または同じ機関の別個の研究室設備であろうと）の結果を比較し、そして統合す
ることにおいて深刻な困難を生み出すことである。同様に、所定の機器をもちい
てさえ、較正における不確定性が、比例発現などのような重要な作用（ａｃｔｉ
ｏｎ）の測定における誤差を導き得る。特に、良好な参照および較正の欠如が、
結果があまりにも新しく、そして信頼し得る基準を作り出すには時間または経験
が不充分である、研究の最前線にあるように感じられる。真の定量蛍光顕微鏡検
査法の開発は、この要求を満たし得る。

【０００９】他方では、強力な較正ツールの利用可能性は、診断および処置についての臨床
的な設定のための安価でかつ信頼性のある蛍光計装および手順の可能性を開き得
る。

【００１０】従来の顕微鏡検査法のための既存の較正ツールは、この蛍光顕微鏡検査法につ
いての要求を十分に満足していない。多くの特別な技術が提案されてきた。

【００１１】１つの技術は、ＭａｘＬｅｖｙＲｅｐｒｏｇｒａｐｈｉｃｓによって提供
され、これは有機蛍光物質の層（例えば、３ミクロンの厚さの層で、広い波長ス
ペクトルにわたって蛍光発光を有し、蛍光を発しないガラスの基材（例えば、合
成した石英）の上に配置される）を使用する。その後、適切なパターンが、蛍光
物質の中にエッチングされ、その結果、この参照の臨界的エッジ（ｃｒｉｔｉｃ
ａｌｅｄｇｅ）が露出された蛍光物質のエッジ（ｅｄｇｅ）により規定される
。この技術の短所は、配置され得る蛍光物質の最小の厚さが、ほぼ３ミクロン程
度であり、そしてこのような厚さである場合、パターンのエッジが、明確にエッ
チングされない。この物質の中に形成される最も微細な参照の細部は、中心にて
８ミクロンの間隔を開けた、約４ミクロンの幅の線であると考えられる。これは
、従来の５ミクロンのスポットサイズを用いる機器に関する較正としては不充分
であり、そしてこれは直径で１／２ミクロン、空気中で０．７ＮＡ対物レンズ（
ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を備える顕微鏡を用いて達成可能、または直径１／４ミク
ロン、１．７ＮＡの油液浸系対物レンズを用いて達成可能である、光スポット（
ｏｐｔｉｃａｌｓｐｏｔ）を評価するために必要とされるより大きい大きさで
ある。蛍光発光層の比較的大きな厚さは、エッジの鮮明度（ｅｄｇｅｄｅｆｉ
ｎｉｔｉｏｎ）の問題を保有する。これは、特に、蛍光線が表面に対して鋭角で
放射され、そしてこの物質のエッジによってブロックされ得、または、他方で、
エッジそのものが蛍光発光して、錯乱を引き起こすからである。

【００１２】蛍光顕微鏡を試験するための別の技術は、基材として、大変薄い（例えば、２
００〜３００Åの厚さの）金属層がその上に配置された蛍光発光ガラスを使用す
る。好ましくは、ニッケル層が使用される。適切なパターンが、引き続いてこの
金属でエッチングされ、寸法が１／２ミクロンほどの小ささの微細な形状が作ら
れる。この技術は先述のエッジの問題を有さないが、本発明者は、このアプロー
チにたいする欠点の存在を認識している。この欠点は、このガラスが蛍光発光す
るかなりの体積、すなわち被写界深度をはるかに超える実質的な厚さ、１ミリメ
ートルを構成する（とりわけ、５ミクロンまたは１１／２ミクロンのスポット
の大きさついて、被写界深度は代表的には、それぞれ約５０ミクロンおよび４．
５ミクロンであり、そしてより小さいスポットサイズに対して次第に小さくなっ
ていく）という事実に起因する。この体積から放射される蛍光発光は、正確に焦
点を規定することを難しくし、そして従って、多くの目的に対して不充分な基準
である。従って、較正ツール、較正装置、較正方法、顕微鏡検査方法において使
用される方法とツールについての要求が存在する。

【００１３】（発明の要旨）本発明は、顕微鏡検査法で使用される較正装置、較正方法、較正ツールに関す
る。本発明は、光学素子に対してサンプルの位置を較正するため、および顕微鏡
検査法において蛍光検出の較正を行うために別個に使用される。

【００１４】１つの局面に従って、蛍光顕微鏡検査法のための較正ツールは、支持体、蛍光
発光物質を含む固体表層、および非蛍光発光物質の薄い不透明マスクを備え、こ
の不透明マスクは選択された寸法を有する参照形状開口部を規定し、この開口部
は固体層の部分を露出する。

【００１５】好ましくは、この較正ツールの第１の型は、支持体の表面と蛍光物質を含む固
体表層との間の接触を促進する付着プロモータを備え得る。この固体表層は、そ
の薄い不透明マスクと接触している。あるいは、本較正ツールの第２の型は、支
持体上に組立てられた（付着プロモータを備えたか、または備えない）薄い不透
明マスク、およびこの不透明マスク上に設置された、蛍光物質を有した固体表層
を備え得る。

【００１６】この局面の好ましい実施形態は、以下のうちの１つ以上を含み得る：薄い不透
明マスクが付着プロモータの使用により、支持体上に組立てられている。支持体
が平面状であり、かつ硬い。支持体が溶融された石英を備える。表層は不透明で
ある。このマスクは、薄い金属フィルムを含む。支持体はカセットの光窓を形成
する。カセットのいくつかの適切な型は、米国特許第６，１４０，０４４号にお
いて記載されており、この特許は参考として援用される。

【００１７】発蛍光団は、支持体および／またはマスクの開口部を透過した光学的放射によ
り、励起され得る。発蛍光団は、支持体および／またはマスクの開口部を透過す
る光学的放射により励起され、そして支持体が、励起された蛍光放射を吸収する
。

【００１８】固体表層は、広い帯域の蛍光エミッタを提供する。固体表層は、少なくとも２
つの波長で活性でありかつＣｙ３およびＣｙ５に類似の蛍光色素に類似の発光特
性を有する、蛍光エミッタ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｍｉｔｔｅｒ）を提
供する。固体表層は、顕微鏡の較正についてフルスケールの応答を生じる得る効
果的な蛍光放射力（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｅｍｉｔｔａｎｃｅ）を有する蛍
光エミッタを提供する。蛍光物質を含む固体表層は、約２ミクロンから約２５０
ミクロンの範囲にある厚さを有する。この固体表層は、ポリイミドである。

【００１９】薄い不透明のマスクは、約１０ｎｍ〜約１０ミクロンの範囲の厚さを有してい
る。薄い不透明のマスクは、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の厚さを有してい
る。

【００２０】別の局面に従って、蛍光顕微鏡検査法のための較正ツールを作製するプロセス
は、支持体を提供する工程、蛍光物質を含む固体表層を提供する工程、および固
体層の部分を露出する選択された寸法を有する参照形状開口部を規定する非蛍光
物質の薄い不透明なマスクを組立てる工程を包含する。

【００２１】この局面の好ましい実施形態は、以下のうち１つ以上を含み得る：固体表層が
、蛍光物質を含む支持体上に配置された固体表層である。これが、蛍光物質を含
む固体表層を形成するために付着を促進する層を支持体上に配置する工程を含み
得る。この配置が、蛍光物質を含む固体表層を形成する蒸気を送達する工程を包
含する（例えば、蒸着またはスパッタリング）。この配置する工程は、蛍光物質
を含む固体表層を形成するためにスピンコーティング（ｓｐｉｎｃｏａｔｉｎ
ｇ）することを含む。

【００２２】薄い不透明マスクの組立は、支持体上に非蛍光物質を配置する工程、および非
蛍光物質をパターン化（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）して、参照形状開口部を形成す
る工程を包含する。その後、この蛍光物質を含む固体表層は、この薄い不透明マ
スク上に配置される。

【００２３】この支持体は溶融石英であり得る。この薄い不透明マスクは金属を含み得る。
この支持体は、生物学的物質の検査において使用されるカセットのための光窓と
して使用され得る。

【００２４】固体表層は、広い帯域の蛍光エミッタを提供する。

【００２５】固体表層は、少なくとも２つの波長で活性でありかつＣｙ３蛍光色素およびＣ
ｙ５蛍光色素に類似の発光特性を有する、蛍光エミッタを提供する。

【００２６】別の局面に従って、顕微鏡の較正の方法は、顕微鏡を提供する工程、上述の較
正ツールを使用する工程、参照形状開口部を調べることによって、顕微鏡の対物
レンズから放射された励起ビームの焦点を合わせる工程、および顕微鏡の検出強
度を較正する工程を包含する。

【００２７】この焦点を合わせる工程は、較正ツールが配置されるサンプルテーブルの位置
を調整する工程を包含し得る。顕微鏡は、軸上フライングオブジェクティブマイ
クロスコープ（ｆｌｙｉｎｇｏｂｊｅｃｔｉｖｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で
あり得る。この顕微鏡は、揺動回転アーム（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇｒｏｔａ
ｒｙａｒｍ）によって運ばれるマイクロレンズの対物レンズを有する。

【００２８】この較正ツールは、制限された被写界深度を有する共焦点顕微鏡を使用する用
途に適しており、そしてこの発蛍光団を含む固体表層は、共焦点顕微鏡の被写界
深度未満の有効深度を有し、好ましくは、この表層は、この顕微鏡のフルスケー
ルの応答を生じ得る有効蛍光放射力を有する。

【００２９】さらに別の局面に従って、定量蛍光顕微鏡検査法の方法は、蛍光検出顕微鏡を
提供する工程、上記のような顕微鏡を較正するための較正ツールを使用する工程
、および標本の蛍光顕微鏡検査法を、較正された顕微鏡を使用して実施する工程
を包含する。好ましくは、この顕微鏡は軸上フライングオブジェクティブマイク
ロスコープであり、そして最も好ましくは、この顕微鏡は高速（ｒａｐｉｄｌｙ
）揺動回転アーム上で、運ばれるマイクロ対物レンズを有する。

【００３０】好ましい実施形態において、蛍光較正ツールは、一定の厚さの適切に蛍光固体
表層を用いて組立てられる。この固体表層は、不透明であり、有機物質または無
機物質から作られ、適切な支持体上にえられる。生来、不透明でない物質につい
ては、色素または顔料を添加する。極薄の金属層が、続いて不透明な蛍光物質上
に配置され、そしてフォトレジスト（ｐｈｏｔｏ−ｒｅｓｉｓｔ）層で被覆され
る。次いで、適切なパターンが、フォトレジスト上でイメージングされ、そして
化学的にエッチングされる。エッチングされた開口部を通して見える生じた蛍光
パターンは、極めて微細な形状を有する。なぜならば、この金属層は、ミクロン
の何分の１厚さ（好ましくは約１００〜３００Åの厚さ）と同程度薄い。

【００３１】パターン生成のプロセスは、集積回路を製作するために使用されるプロセスと
同一であり得る。現在、この科学技術は、同じ寸法の間隙を隔てられた０．２ミ
クロン幅の線と同程度に細い形態の形成が可能である。

【００３２】この較正ツールにおいて、蛍光発光が、表面での発光現象を引き起こし、この
ことは、信頼性のある焦点合わせ、および蛍光の較正を可能にする。この蛍光の
較正は標準として使用され得、そして全ての機器を同じ標準に設定することが可
能となる。好ましくは、較正ツールは、非常に安定した発光物質を使用し、この
発光物質は光退色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）に対して不感受性である。

【００３３】広い帯域の蛍光応答を有する重要な蛍光物質は、液体形態で入手可能なＫａｐ
ｔｏｎ^ＴＭのような選択されたポリイミドであり、そして、スピンコーティング
基材に、および１〜１０ミクロンの厚さのシートの作成のために使用される。適
切な製品が、商品記号（ｔｒａｄｅｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＷＥ−ＩＩＩＩ
またはＰ−ＩＩＩＩの下、Ｈ．Ｄ．Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇ
ｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅから入手可能である。この物質は、特定の芳香族デカ
ニドリド（ｄｅｃａｎｙｄｒｉｄｅ）および芳香族ジアミンからなる高分子量ポ
リイミック酸（ｐｏｌｙｉｍｉｃａｃｉｄ）前駆体を、骨格として有する。

【００３４】この蛍光物質は、好ましくは別のポリイミド生成物であるＰｒｏｂｏｎｉｄｅ
１１６Ａであり、これはＡｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓｏｆＰｏｒｔｓｍ
ｏｕｔｈ、ＮｅｗＨａｍｐｈｉｒｅから入手可能である。この物質は、Ｈ．Ｄ
．Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓの製品の約４分の１の強度の広い帯域の蛍光を提示
し、これは十分に使用し得る。

【００３５】あるいは、蛍光ポリイミド物質は、セルフプライミング（ｓｅｌｆ−ｐｒｉｍ
ｉｎｇ）として、非感光性のポリイミック酸処方物として半導体産業へ提供され
ている物質である。このポリイミック酸処方物は、熱硬化後に完全に安定なポリ
イミドコーティングとなる。

【００３６】この表層のため別の物質は、目的の特定波長に適切であって、例えば、エバポ
レーション（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によってか、またはゾル−ゲルプロセス
によって、非蛍光支持体上に配置された蛍光ガラスの極めて薄い層である。ゾル
−ゲルの場合、物質のガラス状タイプの大きな分子は、水またはアルコールキャ
リア中の選択された発蛍光団と共に懸濁され、そして支持体に対するフィルムコ
ーティングとして塗布される。

【００３７】これを、比較的低温度で焼いて、薄いガラス状の蛍光フィルムを形成する。こ
れら、または、他の場合において、特定の波長に関する蛍光色素は、適切な非蛍
光発光で、そして好ましくは、不透明な結合剤中に取り込まれ、薄く、一様な厚
さのコーティングとして塗布される。蛍光色素の例としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５お
よびフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ）が挙げられる。

【００３８】全ての事象において、表層の物質は、蛍光標本を検査するための機器を操作す
る際に使用する通常の方法で検出するのに十分な蛍光発光を生じるように選択さ
れなければならない。蛍光参照物質の特定の選択は、多数パラメータに依存して
いいる（例えば、機器の応答、選択した波長、検査する形状のサイズおよび励起
ビームのスポットのサイズ）。添付の添付物中の実施例に記載されたような市販
の機器の場合、この蛍光物質は、百万回のオーダーの、検出器で検出される放射
を生じなければならない。上述したポリイミド物質は、広い帯域で存在し、それ
ゆえに、重要な実験が実施される選択された波長の範囲のに亘って、単一の参照
として適切である点で、他を凌ぐ多大な利益を提供する。

【００３９】いくつかの蛍光顕微鏡検査法の適用は、検査中の物質が、代表的には、人工合
成された石英のような非蛍光性の光学ガラス製の透明な保護窓の後方に配置され
ることを要求する。このような場合、アライメントツールは、好ましくは、適用
を二連にし、そしてメタライズされた標的が、最初にこのガラス上に作成され、
そしてこの蛍光媒体が、メタライゼーションならびにガラスを被覆するコーティ
ングとして塗布されるか、またはこの蛍光媒体が、第１の光学的平面部材上の金
属層に対面して取付けられる第２の光学的平面部材上の平面状のコーティングと
して提供される。

【００４０】重要なことに、多くの場合で、検出器に到達する光子を生成するために有効な
発蛍光団は、実質的に表層にのみ存在する。（本明細書中で使用される場合、用
語「有効な発蛍光団」は、顕微鏡の検出器に到達し得る表層の面からの意味のあ
る蛍光発光を生成するのに有効であるこれらの発蛍光団の、実質的に全てを包含
すること意味し、そして、このマトリックスの不透明性に起因して、この顕微鏡
の励起発光の範囲外であるか、または、この顕微鏡の有効な励起発光の範囲内で
あるが、例えば、不透明マトリックス物質による吸収に起因してこの顕微鏡の検
出器に到達する蛍光発光を生じないかのいずれかである、発蛍光団は言及しない
。表面の発蛍光団は、１ミクロンの何分の１ほどの厚さの生物学的標本物質のド
ットが、入射した励起ビームに応答して蛍光発光を生じるときに何が起こるかを
見積る。

【００４１】現在の較正ツールにおいて、所定の適用のために適切な表層に対する蛍光発光
の制限は、１つの技術または技術の組合せによって達成され得る。１つの場合に
おいて、較正発蛍光団が含まれる固体マトリックスを形成すための結合剤物質は
、本質的には、励起波長もしくは検出波長またはそれらの両方において、不透明
であり、検出された蛍光発光のうちの大部分（例えば、８０％以上、またより好
ましくは９９％程）は、深度Δ_ｔの表層から発せられる。このΔ_ｔは、検査され
る標本の厚さのオーダーしかなく、そしてこの機器の被写界深度内にある。

【００４２】別の場合、発蛍光団が含まれている層のミクロンの厚さが、高い程度の均一性
で制御されて、不透明な支持体上にある層は発蛍光団を欠き、その結果、たとえ
いくつかの蛍光が好ましい区域を超えた深さから生じたときでさえ、この区域の
外側で生じた僅かなルミネセンスは、コーティングの厚さの均一性に起因して、
このツールに亘って一様であり、従って、較正を有意に妨害するほど有効ではな
い。

【００４３】別の場合において、この発蛍光団は、表層を前もって形成した後に、この表層
の中に（例えば、発蛍光団を、本質的には、パターンにおける開口部により露出
される表面に限定するような拡散技術、スプレー技術、または移植技術により）
導入される。従って、較正ツールにおいて、検査される標本の代用物としての役
割を果たし得る、有効な固体蛍光表層が提供される。

【００４４】参照パターンを形成する薄い金属層または他の物質の厚さはまた、重要である
。なぜならば、検出された蛍光発光の多くの光線は、検査される表面と４５度と
同程度の角度を形成し、そして、これは、パターンエレメント（ｐａｔｔｅｒｎ
ｅｌｅｍｅｎｔ）が厚すぎる場合に、このパターンエレメントのエッジの壁に
よってブロックされ得、パターンエッジの検出の解像度を損ない得る。検査する
形状が微細になるぼど、機器の較正は微細でなければなれない。従って、薄い不
透明のマスクに含まれる、パターンエレメントの厚さ（すなわち、参照線；円な
ど）がより臨界に近づく。

【００４５】重要な局面は、蛍光発光表層によって生じる蛍光波長である。好ましくは、較
正ツールが、広い帯域の蛍光物質を用いて作製され、従って、この較正ツールは
、顕微鏡で使用される様々なレーザおよび波長、ならびに科学的または産業的な
調査の様々なラインに使用される異なるタイプの発蛍光団を用いて有用である。
１つの例において、ポリイミド物質が選択される。このポリイミド物質は、本質
的には可視スペクトル全体に及ぶように、４７３ｎｍ〜８５０ｎｍ、またより好
ましくは、４５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長での参照としての用途に有効な蛍光発
光を有する。（可視スペクトルは重要である。なぜならば、歴史的な生物学的デ
ータの多くは、その領域で生成されており、そして研究を進める場合の参考およ
び比較に利用可能であるからである。）しかし、近赤外、および紫外の発蛍光団
は、生物学ならびに利用可能な照明源および検出に関して適切な環境が与えられ
た場合に、使用され得る。

【００４６】別の局面に従って、この較正ツールは、フライングオブジェクティブ（ｆｌｙ
ｉｎｇｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）、軸上スキャナと組合せて使用され、高度な再現
性をもつ定量蛍光顕微鏡検査法を達成する。レンズ、好ましくはマイクロレンズ
を移動する任意の手段を有する顕微鏡が含まれる一方、意義深いさらなる利点が
、揺動回転アームを使用して標本または較正ツール上にマイクロレンズを運ぶす
ることにより得られ得る。蛍光検出顕微鏡の較正、軸上の較正、広い視野の視野
スキャニング蛍光顕微鏡および最後に定量蛍光顕微鏡検査法は、ゲノム研究およ
び創薬の最前線から臨床的用途に至る適用を有する。本発明は、バイオチップお
よびマイクロアレイの精確な読取りへの特定の適用を有する。

【００４７】（好ましい実施例の詳細な説明）図１および図２を参照すれば、アライメントツール２ａは、機器の較正に適切
な光学的形状の微細なパターンをその面上に保有する一般に平面状の硬い部材を
含む。この硬い部材は、代表的には顕微鏡スライド、マイクロアレイチップ、ま
たは他の検査される対象物と同じ寸法であり、機器の同じ位置に適合する。この
アライメントツールの光学的形状は、様々な寸法の線および円状のドットを含み
、検査される生物学的物質または他の物質のドットおよび線である形状の様々な
サイズをエミュレートする。最も微細な形状は、１ミクロン以下のオーダーの寸
法を有し、数ミクロン以下の寸法の形状の検出のための適切な較正を行う。

【００４８】図１および図２で示した較正ツールは、Ｔ−１、Ｔ−２、Ｔ−３、Ｔ−４、お
よびＴ−５の領域を含む。領域Ｔ−１は、２ミクロン、４ミクロン、６ミクロン
、８ミクロン、１０ミクロン、および１２ミクロンの厚さを有する１セットの「
バーコード」線を含み、それらは、それらの２倍のサイズで分離される。領域Ｔ
−２は、５ミクロンおよび１０ミクロンの長さの横線を有する。領域Ｔ−３は、
蛍光発光物質の固体層を含む。領域Ｔ−４は、直径が３００ミクロン〜２５ミク
ロンの円形形状の３つのアレイおよびサイズが３００ミクロン〜２５ミクロンの
正方形を含む。領域Ｔ−５は、固体金属領域である。

【００４９】図３を参照すれば、１つの実施形態において、較正ツールの製造における第１
の工程は、付加的な厚さのみを持つ固体表層４に閉じ込められた、有効な発蛍光
団を有する硬い支持体プレートを提供することである。図２を参照のこと。代表
的には、この深さ、Δ_ｔは、無視し得、従って、蛍光発光は、本質的に、表面の
現象として起こる。この層上に、第２の工程として、ニッケルまたは他の適切な
極薄でかつ不透明な金属フィルムが適用される。この金属フィルムは、参照パタ
ーンを形成するために、エッチングされ得る。スパッタコーティング（ｓｐｕｔ
ｔｅｒｃｏａｔｉｎｇ）、真空金属蒸着、または他の公知の技術が使用され得
る。フォトレジストは、次いで、一般的に、金属層に適用され、このツールの予
備成形物におけるフォトレジストは、アライメント形状を規定する精密なマスク
を通して露出され、次いで、この表面が、化学的にエッチングされて、その結果
生じる参照パターンを形成する。得られたツールを使用して、蛍光測定ならびに
蛍光顕微鏡における従来の画像の構成要素の較正行う。

【００５０】図４を参照すれば、揺動アーム１９は、軸Ａの回りを回転し、検査される標本
によって通常は占有される場所に位置付けれるアライメントツール２Ａ上の軸上
スキャニングのための軸上マイクロ対物レンズ１８を有する。鏡１５および１７
は、静止レーザー源からの励起光を、回転軸Ａに沿って導入し、そこからこのア
ームに沿ってレンズ１８へ、またそこから標本へ（この場合は、較正ツールへ）
導入する効果がある。

【００５１】このツールの表層４に到達した光は、有効な発蛍光団を励起する。この発蛍光
団は、全方向に異なる波長で放射する。重大な特徴は、この放射がマイクロレン
ズ１８（これの軸は常に物体平面に対して垂直である）で捕らえられ、そして、
光路を逆に、そしてピンホールのような絞りを通して、検出器Ｄ、９５、代表的
には光電子倍増管（ＰＭＴ）へ方向付けられることである。

【００５２】図４の場合、表層４は、固体で、光学的に（ｏｐｔｉｃａｌｌｙ）平面であり
、不透明な支持体プレートに適用された一様な最小限の厚さの別々に適用された
層である。好ましくは、表層４はまた、不透明であって、その結果、励起光が実
質的にその表層でさえ透過せず；しかし、励起光が、ある程度透過した場合でさ
えも、この層の卓越した均一性、およびこの支持体の非発光特性に起因して、表
層_ｔの下からの任意の付随的な蛍光は全体として一様であり、従ってこの妨害す
る効果は、多くの例において許容され得る。特定の機器と適用に依存して、ある
場合には、固体表層が極端に薄く、そして発蛍光団の厚さと分布が十分に一様で
あり、表層は、不透明である必要はなく、そして本質的に表面での発光のみを生
成するために、なお適切に機能する。

【００５３】図５および図５ｂの代替的なプロセスは、自己説明的であり、両方とも較正ツ
ールを作製する。この較正ツールは、使用の際、透明パターン支持体を透過した
光により、照射される。図５Ａのツールは、図５の工程によって、作製される一
方、図５Ｄおよび６のツールは、図５Ｂの工程を使用して作製される。図５Ｄお
よび６は、上述の図４と図４Ａのツールが異なるのと同じ点で、お互いに異なる
。

【００５４】得られたツールは、図８または９において示された顕微鏡のような視野蛍光ス
キャニング顕微鏡（ｖｉｅｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｃａｎｎｉｎｇｍ
ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の幅広い視野の標準化を可能にするのに有効である。この
顕微鏡は、詳細には、ＷＯ９９／４７９６４として公開され、タイトルが「Ｗｉ
ｄｅＦｉｅｌｄｏｆＶｉｅｗａｎｄＨｉｇｈＳｐｅｅｄＳｃａｎ
ｎｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」である、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０
６９７に記載されており、これらは、本明細書中で全体が参考として援用される
。これは、軸上スキャニングのために回転アーム１９に取り付けられたマイクロ
対物レンズ１８が、検流計または揺動モータ（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇｍｏｔ
ｏｒ）３による迅速な回転揺動動作で駆動されることを言うのに十分である。こ
の位置は、データ取得と標本上の位置とを関連付けるために、位置センサー４３
により検知される。光センサー９５の前のピンホールまたは他の絞り１０３の使
用によって、得られた共焦点顕微鏡は、有意に被写界深度が制限され、これは従
来技術では十分に較正し得なかったが、本明細書中で記載したような蛍光による
広い帯域の表面発光を特徴付ける較正ツールを使用して高い精度で容易に較正し
得る。図９は、フライングオブジェクティブマイクロスコープ（ｆｌｙｉｎｇ
ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いた上記の較正ツールの使用
を示し、一方で、図１０では、同じ方法で較正した他の顕微鏡により生じた結果
と容易に比較し得る定量蛍光顕微鏡検査法を得るための、較正された同じ機器の
使用による、マイクロアレイの引き続くスキャニングを示す。

【００５５】現実の標本をシミュレートするために必要とされる蛍光発光量の基礎的な分析
が、迅速な揺動アームで運ばれるマイクロレンズに基いた、市販の共焦点蛍光ス
キャニング顕微鏡である、ＧｅｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ
．から入手可能な４１８ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ^ＴＭに関する以下の添付
物にて提供される。他の機器についての同様に解析に従うことにより、それらの
機器とって適切な蛍光レベルに到達し得る；全ての機器についてのデータのセッ
トを考慮することにより、標準的な較正ツールを得ることが可能である。

【００５６】（添付物）（軸上スキャニングを用いたフライングオブジェクティブマイクロスコープ（
ＧｅｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な４１８
ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒ^ＴＭ）の実用的な広域視野のために必要な蛍光の分
析）

【００５７】

【表１】この表において、照射出力（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｐｏｗｅｒ）は、蛍
光発光を励起するために顕微鏡スライドに代表的に送達される電力量を表す。こ
の送達効率（２）は、３つの値で定義される。第１のものは、レンズの幾何学的
集光効率（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
）であり、これは共焦点ピンホールのサイズおよび顕微鏡スライドまでの距離に
基く。本実施例の機器については、放射された蛍光の１３％は、集光される。す
なわち、蛍光が、球形の分布をもって標的において放射され、そしてこの機器が
、その光の１３％を集光する。この光は、二色性ミラーを通過し、必然的に損率
が関与し、したがって光の９０％が透過され、１０％がこの系の他のところで反
射され、そして消耗される。最後には、光電子増倍管の前で、エミッションフィ
ルター（ｅｍｉｓｓｉｏｎｆｉｌｔｅｒ）が、この蛍光の約６０％を透過させ
る。このエミッションフィルターは、一般に、励起レーザーエネルギーの波長か
ら約２５〜３０ｎｍ離れて集中される蛍光エネルギーを伴う、励起光を跳ね返す
多層光学フィルターである。

【００５８】４１８ＡｒｒａｙＳｃａｎｎｅｒモデルの機器は、５３２ｎｍおよび６３
７ｎｍで動作する。別の有用な波長は、４７３ｎｍである。これらの波長で、こ
の機器について、較正ツールにおける蛍光物質の表層は、標本に到達する照射出
力の、少なくとも１００万分の１のオーダーで表面から発する蛍光出力（ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｏｗｅｒ）を生じなければならない。

【００５９】議論された３つの数の積、つまり０．１３×０．９×０．６によって、この送
達効率が約０．０７０であることが示される。さらに表を参照すると、３行目は
、４１８ＡｒｒａｙＳｃｃａｎｅｒに使用された、光電子増倍管モジュール
の増幅率（ｇａｉｎ）に関する。最も少ない増幅率を有するモジュールは、１ｎ
Ｗ当たり５Ｖの増幅率を有し、これは代表的には、約６３７ｎｍΣを意味し、こ
のＰＭＴは、これに到達した光の１ｎＷ毎に５ボルトの信号を生じる。

【００６０】４行目で、４１８ＡｒｒａｙＳｃｃａｎｅｒシステムは、全長シグナル（
ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｓｉｇｎａｌ）が得られた場合、この機器は、光電子
増倍管にて１／２Ｖを生じるようなシステムである。

【００６１】従って、所望の試験物質が、最も弱い光電子増倍管を飽和するを前提とするこ
とにより、この物質の性能を示す等式がつくられる。光電子増倍管の応答は、増
幅率×信号（光電子増倍管に当たる光の量）に等しい。これは、５Ｖ／ｎＷで１
／２Ｖを割った値に等しい信号を与えるか、または０．１ｎＷの光が光電子倍増
管で得られる。この０．１ｎＷを取って、そしてこれをこの効率である０．０７
で割ることにより、顕微鏡スライドにおいて１．４ｎＷの蛍光の光、またはそれ
より僅かに多い光が生成されることを決定する。従って、蛍光生成率は、約１．
４×１０^−９または約１．５×１０^−９であり、これは３ｍＷに等しい３×１０ ^−３でこのナノワット数を割ったものである。これによって、約１／２×１０⁻ ^６または１００万の数が得られ、これは、ＰＭＴに到達した蛍光発光する光子の
各々に対して、約１００万の光子が、蛍光物質の表層に衝突する必要があること
を意味する。

【００６２】これは、発蛍光団の蛍光効率は、約１×１０^−６以上である必要があることを
示している。これが放射した光子それぞれについて、１０^６の光子を受け取るこ
とが必要である。

【００６３】従って、適切な蛍光参照物質の変換効率は、１０^−６以上のオーダーである必
要がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、顕微鏡検査法において使用されるアライメントツールの平面図である
。

【図２】図２は、図１の線２−２に沿った特定のアライメントの形状を通して取り上げ
た、ツールの断面である。

【図３】図３は、図１のアライメントツールの組立を示した図である。

【図４】図４は、顕微鏡ともに使用するアライメントツールの１つの実施形態を示す。

【図４Ａ】図４Ａは、顕微鏡ともに使用するアライメントツールの代替的な実施形態を示
す。

【図５】図５は、アライメントツールの組立のための別の方法を図式的に説明し、その
一方、図５Ａは、生じたツールを示す。

【図５Ａ】図５は、アライメントツールの組立のための別の方法を図式的に例証し、その
一方、図５Ａは、生じたツールを示す。

【図５Ｂ】図５Ｂは、アライメントツールの組立の別の方法を図示し、その一方で、図５
Ｃおよび５Ｄは、ツールの組立の概略断面図である。

【図５Ｃ】図５Ｂは、アライメントツールの組立の別の方法を図示し、その一方で、図５
Ｃおよび５Ｄは、ツールの組立の概略断面図である。

【図５Ｄ】図５Ｂは、アライメントツールの組立の別の方法を図示し、その一方で、図５
Ｃおよび５Ｄは、ツールの組立の概略断面図である。

【図６】図６は、図５Ｂで示したツールの構築の代替物の図をである。

【図７】図７は、図５Ｂおよび図６で示したツールの使用を例証する。

【図８】図８および図８Ａは、迅速に回転する揺動アーム上にある、フライングマイク
ロ対物レンズを使用する広角蛍光スキャニング顕微鏡を、図示する。

【図８Ａ】図８および図８Ａは、迅速に回転する揺動アーム上にある、フライングマイク
ロ対物レンズを使用する広角蛍光スキャニング顕微鏡を、図示する。

【図９】図９は、アライメントツールを使用する、図８で示したスキャニング顕微鏡の
揺動アームの斜視図である。

【図１０】図１０は、図９で示したスキャニング顕微鏡の較正の後で、ガラススライドま
たはバイオチップ上の生物学的物質のマイクロアレイをスキャニングするために
使用した、図９で示した揺動アームの図式的な平面図である。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年８月２７日（２００２．８．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図４Ａ】

【図５】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図６】

【図７】

【図８】

【図８Ａ】

【図９】

【図１０】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛍光顕微鏡検査法ための較正ツールであって、該較正ツール
が、支持体、蛍光物質を含む固体表層、および該固体表層の部分を露出する選択
された寸法を有する参照形状開口部を規定する非蛍光物質の薄い不透明マスクを
備える、較正ツール。
【請求項２】請求項１に記載の較正ツールであって、該較正ツールが、前
記支持体の表面と前記蛍光物質を含む前記固体表層との接触を促進する付着プロ
モータを備え、該固体表層は、前記薄い不透明マスクと接触している、較正ツー
ル。
【請求項３】請求項１に記載の較正ツールであって、ここで前記薄い不透
明マスクが、前記支持体上に組立てられ、そしてここで、前記蛍光物質を含む前
記固体表層が該薄い不透明マスク上に配置される、較正ツール。
【請求項４】請求項３に記載の較正ツールであって、ここで前記薄い不透
明マスクが、付着プロ−モータを使用して、前記支持体上に組立てられる、較正
ツール。
【請求項５】前記支持体が、平面状であって、そして硬い請求項２または
３に記載の、較正ツール。
【請求項６】前記支持体が溶融石英を含む、請求項２または請求項３に記
載の較正ツール。
【請求項７】前記表層が不透明である、請求項１に記載の較正ツール。
【請求項８】前記マスクが薄い金属フィルムを含む、請求項２または請求
項３に記載の較正ツール。
【請求項９】前記支持体がカセットの光窓を形成する、請求項３に記載の
較正ツール。
【請求項１０】発蛍光団が前記支持体を透過した光学的放射によって励起
される、請求項３に記載の較正ツール。
【請求項１１】発蛍光団が前記支持体を透過した、そして前記マスク中の
前記開口部を透過した光学的放射によって励起される、請求項３に記載の較正ツ
ール。
【請求項１２】前記３に記載の較正ツールであって、ここで発蛍光団が、
前記支持体を透過した、そして前記マスク中の前記開口部を透過した光学的放射
によって励起され、そして該支持体が励起された蛍光放射を吸収する、較正ツー
ル。
【請求項１３】前記固体表層が広い帯域の蛍光エミッタを提供する、請求
項１に記載の較正ツール。
【請求項１４】請求項１に記載の較正ツールであって、ここで該固体表層
が、少なくとも２つの波長で活性でありそしてＣｙ３蛍光色素およびＣｙ５蛍光
色素に類似の発光特性を有する蛍光エミッタを提供する、較正ツール。
【請求項１５】請求項１に記載の較正ツールであって、ここで前記固体表
層が、顕微鏡較正についてフルスケールの応答を生じ得る効果的な蛍光放射力を
有する蛍光エミッタを提供する、較正ツール。
【請求項１６】請求項２または請求項３に記載の較正ツールであって、こ
こで前記蛍光物質を含む前記固体表層が、約２μｍから約２５０μｍの範囲の厚
さを有する、較正ツール。
【請求項１７】前記固体表層がポリイミドである、請求項１、請求項２、
または、請求項３に記載の較正ツール。
【請求項１８】前記薄い不透明マスクが、約１０ｎｍ〜約１０μｍの範囲
の厚さを有する、請求項２または請求項３に記載の較正ツール。
【請求項１９】前記薄い不透明マスクが約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲
の厚さを有する、請求項１８に記載の較正ツール。
【請求項２０】蛍光顕微鏡検査法のための較正ツールを生成するためのプ
ロセスであって、該プロセスは、以下：支持体を提供する工程；蛍光物質を含む固体表層を提供する工程；および該固体表層の部分を露出する選択された寸法を有する参照形状開口部を規定する
非蛍光物質の薄い不透明マスクを組立てる工程、を包含する、プロセス。
【請求項２１】請求項２０に記載のプロセスであって、ここで前記固体表
層を提供する工程が、前記支持体上に、前記蛍光物質を含む該固体表層を配置す
る工程を包含する、プロセス。
【請求項２２】請求項２１に記載のプロセスであって、該プロセスが、前
記蛍光物質を含む前記固体表層を形成するために、付着促進する層を前記支持体
上に配置する工程を包含する、プロセス。
【請求項２３】請求項２１に記載のプロセスであって、ここで前記配置す
る工程が前記蛍光物質を含む前記固体表層を形成する蒸気を送達する工程を包含
する、プロセス。
【請求項２４】請求項２３に記載のプロセスであって、ここで前記蒸気を
送達する工程が、前記支持体上に、物質を蒸着して、前記蛍光物質を含む前記固
体表層を形成する工程を包含する、プロセス。
【請求項２５】請求項２３に記載のプロセスであって、ここで前記蒸気を
送達する工程が、前記支持体上に、物質をスパッタリングし、前記蛍光物質を含
む固体表層を形成する工程を包含する、プロセス。
【請求項２６】請求項２１に記載のプロセスであって、ここで前記配置す
る工程がスピンコーティングして、前記蛍光物質を含む前記固体表層を形成する
工程を包含する、プロセス。
【請求項２７】請求項２０に記載のプロセスであって、ここで前記薄い不
透明マスクを組立てる工程が、前記支持体上に前記非蛍光物質を配置する工程、
および該非蛍光物質をパターン化して、前記参照形状開口部を形成する工程を包
含する、プロセス。
【請求項２８】請求項２７に記載のプロセスであって、ここで前記固体表
層を提供する工程が、前記薄い不透明マスク上に前記蛍光物質を含む該固体表層
を配置する工程を包含する、プロセス。
【請求項２９】前記支持体が溶融石英である、請求項２０、２１、または
２７に記載のプロセス。
【請求項３０】前記薄い不透明マスクが金属を含む、請求項２０、２１、
または２７に記載のプロセス。
【請求項３１】生物学的物質の検査において使用されるカセットのための
光窓として前記支持体を使用する工程を包含する、請求項２７に記載のプロセス
。
【請求項３２】前記固体表層が、広い帯域の蛍光エミッタを提供する、請
求項２０、２１、または２７に記載のプロセス。
【請求項３３】請求項２０、２１、または２７に記載のプロセスであって
、ここで、前記固体表層が、少なくとも２つの波長で活性であり、そしてＣｙ３
蛍光色素およびＣｙ５蛍光色素に類似の発光特性を有する蛍光エミッタを提供す
る、プロセス。
【請求項３４】請求項２０、２１、または２７に記載のプロセスであって
、ここで、前記固体表層が、顕微鏡較正についてフルスケールの応答を生じる得
る効果的な蛍光発光を有する蛍光エミッタを提供する、プロセス。
【請求項３５】請求項２０、２１、または２７に記載のプロセスであって
、ここで、前記蛍光物質を含む前記固体表層が、約２μｍ〜約２５０μｍの範囲
の厚さを有する、プロセス。
【請求項３６】前記固体表層が、ポリイミドである、請求項２０、２１、
または２７に記載のプロセス。
【請求項３７】前記薄い不透明マスクが、約１０ｎｍ〜約１０μｍの範囲
の厚さを有する、請求項２０、２１、または２７に記載のプロセス。
【請求項３８】前記薄い不透明マスクが、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範
囲の厚さを有する、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】顕微鏡を較正する方法であって、該方法が、顕微鏡を提供
する工程、請求項１、請求項２、または請求項３に記載の較正ツールを使用する
工程、前記参照形状開口部を調べることによって、該顕微鏡の対物レンズから放
射された励起ビームの焦点を合わせる工程、および該顕微鏡の検出強度を較正す
る工程、を包含する、方法。
【請求項４０】前記焦点を合わせる工程が、前記較正ツールが位置するサ
ンプルテーブルの位置を調整する工程を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記顕微鏡が、軸上フライングオブジェクティブマイクロ
スコープである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】前記顕微鏡が、揺動回転アームに維持されているマイクロ
レンズ対物鏡を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】定量蛍光顕微鏡検査法の方法であって、該方法が、以下の
工程：蛍光検出顕微鏡を提供する工程、請求項１、２、または３に記載の較正ツールを、該顕微鏡に較正するため使用
する工程、および該較正した顕微鏡を使用して標本の蛍光顕微鏡検査法を実施する工程、を含む、方法。