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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung der Qualität von Mikroskopen, wobei das Mikroskop mindestens eine Lichtquelle, einen das Licht zur Probe führenden Beleuchtungsstrahlengang, einen Detektor und einen das Detektionslicht von der Probe zum Detektor führenden Detektionsstrahlengang aufweist.
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Will man ein Mikroskop auf die Funktionstüchtigkeit und Qualität der jeweiligen Baugruppen prüfen, ist es grundsätzlich möglich, als Prüfeinheit eine kalibrierte Lichtquelle definierter Flächen- und/oder Volumenleuchtdichte zu verwenden. Zum Einsatz kommen könnte hier eine kalibrierte LED, die man in das Bildfeld des Mikroskops verbringt und anhand derer man die Helligkeit des so entstehenden Bildes misst. Die Effizienz von Mikroskopen wird derzeit jedoch nicht gemessen bzw. geprüft, nämlich in Ermangelung einer Standardisierung und somit in Ermangelung eines objektiven Vergleichs.
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Wollte man ein Mikroskop anhand einer Lichtquelle prüfen, müsste die Lichtquelle auf jeden Fall kalibriert sein. Sie müsste auf genau die gleiche Weise wie bei ihrer Kalibrierung betrieben werden und müsste dabei in die gleiche Raumrichtung abstrahlen. Eine solche Lichtquelle ist teuer. Im Vorfelde der Prüfung wären aufwendige Einrichtarbeiten erforderlich. Außerdem unterliegt eine konventionelle Lichtquelle der Alterung, so dass deren Einsatz auch insoweit begrenzt ist.
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Aus dem Stand der Technik ist für sich gesehen bekannt, Fluoreszenzdetektionssysteme zu prüfen, indem dort als Marker dienende Fluorophore als zu detektierende Objekte verwendet werden (vgl.
DE 202 173 40 U1 ). Eine entsprechende Prüfung oder gar Kalibrierung anhand der so erhaltenden Fluoreszenzsignale ist jedoch in der Praxis problematisch, da die durch Bestrahlung erreichte Fluoreszenz von typischer Weise 10 ns nicht ausreicht, um eine komplette Prüfung eines Mikroskopsystems vorzunehmen. Folglich wird es unter Zugrundelegung einer fluoreszierenden Probe erforderlich sein, diese ständig zu beleuchten, wobei das Messergebnis vom Einfluss der Lichtquelle des Systems abhängt. Die dort stattfindende Alterung wird bei der Messung ebenfalls berücksichtigt, wodurch eine zuverlässige und reproduzierbare Kalibrierung jedenfalls nicht möglich ist.
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Aus der
DE 100 44 308 A1 ist ein Verfahren zur Detektion von Fluoreszenzlicht bekannt. Dabei werden fluoreszierende Moleküle des zu untersuchenden Objekts durch Mehrphotonenanregung zur Fluoreszenz angeregt und die Betriebsparameter der die Mehrphotonenanregung bewirkenden Lichtquelle zur optimalen Fluoreszenzausbeute auf die Eigenschaften der fluoreszierenden Materialien abgestimmt.
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Die
DE 199 06 763 A1 betrifft ein Verfahren zum Kalibrieren eines Laserscanmikroskops mit in der Ebene einer Zwischenabbildung angeordneten Referenzobjekten.
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Das Dokument
WO 01/59503 A2 offenbart eine Kalibriervorrichtung mit einer Trägervorrichtung, auf der eine dünne Schicht fluoreszierenden Materials aufgebracht ist.
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Die
DE 101 00 246 A1 zeigt ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops. Dabei wird ein Referenzobjekt zur Verfügung gestellt, das entweder eine reflektierende oder eine lumineszierende Beschichtung aus Fluoreszens- und/oder Phosphoreszenzmolekülen aufweist.
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Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Prüfung der Qualität von Mikroskopen anzugeben, wonach es mit einfachen Mitteln möglich ist, Mikroskope zuverlässig und dabei reproduzierbar zu prüfen und unter Zugrundelegung der Prüfergebnisse zu kalibrieren.
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Das erfindungsgemäße Verfahren löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruches 1.
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Erfindungsgemäß ist in verfahrensmäßiger Hinsicht zunächst einmal erkannt worden, dass man Mikroskope unter Nutzung der einzelnen Funktionsgruppen des Mikroskops auf ihre Funktionstüchtigkeit hin überprüfen kann, wenn man nämlich eine standardisierte oder standardisierbare Prüfprobe verwendet, durch deren Detektion eine Charakterisierung des Mikroskops und somit eine Prüfung des Mikroskops möglich ist.
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Als Prüfmittel wird hier eine ganz besondere Prüfprobe zur Verfügung gestellt, nämlich aus phosphoreszierendem Material. Phosphoreszierendes Material hat nämlich den großen Vorteil, dass es nach seiner Anregung längere Zeit leuchtet, ohne dass eine weitere Anregung erforderlich ist. Während man bis zu einer Nachleuchtdauer von etwa 10 ns von Fluoreszenz spricht, handelt es sich über diesen Zeitraum hinweg um Phosphoreszenz, die nach Anregung und in Abhängigkeit von dem konkreten Material wesentlich länger andauert.
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Typisch für die Phosphoreszenz ist, dass bei der Anregung der angeregte Zustand in Sättigung geht. Folglich erhält man nach der Anregung in die Sättigung stets die gleiche Lichtausbeute, und zwar unabhängig davon, wie intensiv die Anregung ist bzw. war. Folglich ist – quasi automatisch – die Reproduzierbarkeit gegeben. Im Verlaufe der Zeit nimmt zwar die Lichtausbeute auch bei der Phosphoreszenz allmählich ab, jedoch ist die Lichtausbeute über eine lange Zeit hinweg nahezu konstant. Die Abnahme der Lichtausbeute erfolgt auf relativ langen Zeitskalen, die für die Prüfung des Mikroskops unerheblich sind. Je nach Zusammensetzung der Phosphore liegen die Nachleuchtdauern der Stoffe zwischen Millisekunden und mehreren Stunden. In erfindungsgemäßer Weise wird das Phänomen phosphoreszierender Materialien genutzt.
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Entsprechend den voranstehenden Ausführungen wird in erfindungsgemäßer Weise eine Prüfprobe aus phosphoreszierendem Material zur Verfügung gestellt. Die Prüfprobe wird bis in die Sättigung angeregt. Anschließend wird das von der Probe emittierte und über den Detektionsstrahlengang des Mikroskops zum Detektor gelangende Licht detektiert, verarbeitet bzw. ausgewertet sowie mit vorgegebenen oder vorgebbaren Daten verglichen. Eine Prüfung der Qualität des Mikroskops, so beispielsweise der Optik, des Detektionsstrahlengangs, aber auch des Detektors, ist somit möglich.
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Die phosphoreszierendes Material enthaltende Prüfprobe lässt sich auf unterschiedliche Arten anregen. So könnte die Anregung beispielsweise über radioaktiven Zerfall erfolgen. Eine thermische Anregung der Prüfprobe ist für die Praxis denkbar, wobei im Konkreten die thermische Anregung über eine die Prüfprobe tragende Heizeinrichtung, so beispielsweise über einen Heiztisch, erfolgen kann.
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Am einfachsten lässt sich die Phosphoreszenz durch Licht anregen. So könnte die Prüfprobe durch das über den Beleuchtungsstrahlengang von der Lichtquelle des Mikroskops kommende Licht angeregt werden. Eine externe Lichtquelle ist nicht erforderlich.
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Will man das Prüfergebnis unabhängig von der eigenen Lichtquelle des Mikroskops machen, so könnte die Prüfprobe über eine externe Lichtquelle angeregt werden. Das Licht der externen Lichtquelle lässt sich in den Beleuchtungsstrahlengang – über einen geeigneten Strahlvereiniger – einkoppeln. Ebenso ist es denkbar, die externe Lichtquelle unterhalb der Prüfprobe anzuordnen, so dass das Licht der externen Lichtquelle von unterhalb der Prüfprobe auf diese trifft und das phosphoreszierende Material anregt.
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Zur punktuellen Anregung der Prüfprobe könnte ein beliebiger Punkt über einen vorgebbaren Zeitraum hinweg beleuchtet werden. Erfolgt die Anregung über den Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops, könnte der Scanner „geparkt” werden, so dass der Lichtstrahl stets einen Punkt bestrahlt bzw. anregt, bis dieser in die Sättigung geht. Über einen materialspezifischen Zeitraum hinweg lässt sich dieser Punkt in idealer Weise durchgehend detektieren.
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Zuvor ist bereits angemerkt worden, dass die Phosphoreszenz – ausgehend von dem Zustand der Sättigung – über einen Zeitraum hinweg konstant bleibt und danach in der Lichtausbeute schwächer wird. Wenngleich die Lichtausbeute im Laufe der Zeit – auf relativ langen Zeitskalen – abnimmt, sind Nachleuchtdauern zwischen Millisekunden und mehreren Stunden zu verzeichnen. Die Lichtausbeute lässt sich sogar noch in der Phase der Degradation messen, wobei es dann von Vorteil ist, wenn die Auswertung durch eine mathematische Kompensation der Degradation erfolgt, so beispielsweise über ein Anfitten einer e-Funktion.
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Durch Detektion des von der Prüfprobe emittierten Lichts und durch entsprechende Auswertung, die einen Vergleich mit hinterlegten „Gutwerten” umfasst, werden mikroskopspezifische Eigenschaften wie Bildhelligkeit, Auflösung, Bildausleuchtung, Effizienz überprüft. Das Rauschen eines oder mehrer Bildpunkte oder das Rauschen zu einem Zeitpunkt innerhalb einer Fläche oder zwischen mehreren Punkten wird über die Zeit bestimmt und zum Erhalt des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses des Detektionsstrahlengangs mit den detektierten Signalen ins Verhältnis gesetzt. Die Güte des Detektionsstrahlengangs ist somit prüfbar bzw. messbar.
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Im Lichte der voranstehenden Ausführungen ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren zum Zwecke der Werksprüfung oder werksseitigen Geräteabnahme zu nutzen. Ebenso ist es denkbar, die Prüfung zum Zwecke der Kalibrierung des Mikroskops zu verwenden. So könnte die Prüfung nach Aktivieren eines Prüfprogramms unter Verwendung auswählbarer Prüfproben – beispielsweise aus einem vorgegebenen Sortiment von Prüfproben – automatisch durchführbar sein, nämlich unter Zugrundelegung einer geeigneten Prozesssteuerung.
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Nach der Prüfung wird in weiter vorteilhafter Weise ein Prüfprotokoll erstellt, welches Auskunft über die Qualität einzelner Baugruppen des Mikroskops liefert.
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Schließlich ist es denkbar, dass das Ergebnis der Prüfung in den Vorgang einer Gerätekalibrierung – automatisch – einfließt, wobei die Kalibrierung dann ebenfalls automatisch vorgenommen wird. Auf diese Weise lässt sich eine Art selbstkalibrierendes System realisieren.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung verschiedener Ausführungsbeispiele von Prüfproben anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung verschiedener Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigt
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1 in einem schematischen Blockdiagram den grundsätzlichen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und die grundsätzliche Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens,
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2a ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Prüfprobe mit einem Punkt der Dimension 0 (ideal),
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2b ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Prüfprobe mit einer Fläche der Dimension 2,
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2c ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Prüfprobe mit einer Punktmatrix,
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3 in einem schematischen Diagramm den Verlauf der Lichtausbeute eines phosphoreszierenden Materials in Abhängigkeit von der Anregung und
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4 in einem schematischen Diagramm den Verlauf der Lichtausbeute über den Zustand der Sättigung hinweg im Zeitverlauf.
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1 zeigt im Rahmen eines schematischen Diagramms eine erfindungsgemäße Vorrichtung sowie die Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Prüfung von Mikroskopen, wobei hier – schematisch – ein konfokales Mikroskop dargestellt ist.
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Das Mikroskop umfasst eine Lichtquelle 1, einen das Licht über ein Beleuchtungspinhole 2, einen Strahlteiler 3 und einen Scanner 4 zur Probe 5 führenden Beleuchtungsstrahlengang 6. Das Detektionslicht wird von der Probe 5 über den Scanner 4 und den Strahlteiler 3 durch ein Detektionspinhole 8 zum Detektor 7 geführt.
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Erfindungsgemäß wird eine ganz besondere Probe verwendet, nämlich eine Prüfprobe 5. Die Prüfprobe 5 umfasst einen Träger 9, der als Glasplatte ausgeführt ist. Auf dem Träger 9 befindet sich das Prüfmaterial 10, bei dem es sich erfindungsgemäß um ein phosphoreszierendes Material handelt.
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Bei dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel dient die Lichtquelle 1 des Mikroskops zum Anregen des Prüfmaterials 10. Ebenso ist es möglich, zu diesem Zwecke eine gesonderte Lichtquelle zu verwenden, die in 1 nicht gezeigt ist.
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Die 2a, 2b und 2c zeigen Prüfproben 5, auf deren Träger 9 Prüfmaterial 10 unterschiedlich angeordnet ist. Das Prüfmaterial 10 ist als dünne Schicht ausgeführt. 2a zeigt – schematisch – eine punktuelle Anordnung des Prüfmaterials 10, woraus sich bei hinreichend dünner Ausgestaltung ein Leuchtpunkt der Dimension 0 ergibt.
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In 2b ist das Prüfmaterial 10 flächenförmig angelegt, wobei auch hier in idealer Weise eine möglichst dünne Aufbringung des Prüfmaterials 10 vorliegt. Folglich handelt es sich um eine Fläche der Dimension 2.
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Gemäß der Darstellung in 2c ergeben einzelne Punkte des Prüfmaterials 10 eine Punktmatrix.
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Die in den 2a, 2b und 2c gezeigten Prüfproben lassen sich als Standards zur reproduzierbaren Prüfung des Mikroskops verwenden.
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3 zeigt in einem Diagramm den Verlauf der Lichtausbeute 11 des phosphoreszierenden Materials durch die unterbrochene Linie (I phosphoresc.). Sobald durch Anregung, beispielsweise mittels Beleuchtung, die Sättigung erreicht ist, erhält man eine nahezu gleich bleibende Lichtausbeute 11. Die erreichte Sättigung ist in 3 durch „I saturat” gekennzeichnet. Auf der Ordinate ist die Lichtausbeute bzw. die Intensität der Lichtausbeute abgetragen.
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4 zeigt die Lichtausbeute 11 im Zeitverlauf. Sobald sich der angeregte Zustand des phosphoreszierenden Materials in Sättigung 12 befindet (I saturat), ist die Lichtausbeute 11 (I phosphoresc) zumindest über einen gewissen Zeitraum hinweg (Δt measure) konstant, wobei dieser Zeitraum zur Messung bzw. Prüfung gemäß der voranstehenden Beschreibung genutzt wird. Danach klingt die Lichtausbeute nach und nach ab, wobei auch in der Phase der Degradation eine Messung der Lichtausbeute und somit Prüfung des Mikroskops möglich ist. Der Kompensation dienende Funktionen finden Anwendung.
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Schließlich sei angemerkt, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele zum Verständnis der erfindungsgemäßen Lehre beitragen, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiele einschränken.
