JP2003514912A

JP2003514912A - トランスフェクション薬剤としてのリン含有デンドリマー

Info

Publication number: JP2003514912A
Application number: JP2001540098A
Authority: JP
Inventors: ジャン−ピエールマヨーラル; ベルナルドムニエル; アン−マリーカミナーデ; クリストフループ; マリー−アントワネットザンタ−ブシッフ
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 2000-11-23
Publication date: 2003-04-22
Also published as: ES2194794T3; DE60002603D1; DE60002603T2; ATE239749T1; US6969528B1; CA2392697A1; WO2001038335A1; EP1232165A1; EP1232165B1; FR2801592A1; FR2801592B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、リン含有デンドリマーならびにヒトおよび動物疾患の処置に含まれるインビトロおよびインビボにおける遺伝子トランスフェクション薬剤としてのそれらの使用に関する。該薬剤またはベクターは、好適な標的細胞へ問題の核酸配列を送達するに特に好適である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、リン含有デンドリマーならびヒトおよび動物疾患の処置を含むイン
ビトロおよびインビボにおける遺伝子トランスフェクション薬剤としてのその使
用に関する。該薬剤またはベクターは、好適な標的細胞へ送達するに特に好適で
ある。

【０００２】遺伝子治療は、核酸の治療的投与に基づき；それは、治療的遺伝子の運搬（tr
ansfer）およびその成功のための有効で安全なベクターの使用を必要とし、従っ
て所望の細胞への遺伝子運搬の効率に依存する。

【０００３】選択的遺伝物質で真核細胞をトランスフェクトし得る多くの組成物は、既に記
載されており、そして本質的に２つの主要なタイプのトランスフェクションベク
ターに属する： − ウイスルトランスフェクションベクター、これは、効果的であるが、使用
について制限を有する：組織特異的でない、問題の各遺伝子についての構築物を
得る必要性、患者および職員についての高価でかつ制限的臨床基盤設備の設定へ
導く環境についての潜在的危険性、ならびに免疫応答、相同組換えによるウイル
ス粒子の産生、および潜在的癌遺伝子効果の問題； − 真核細胞における化学物質（例えば、ＤＮＡ）の運搬および発現を促進し
得る、非ウイルス薬剤（合成ベクター）。

【０００４】これらの合成ベクターは、本質的に２つの機能を有さなければならない：トラ
ンスフェクトされるＤＮＡを濃縮し、そしてその細胞付着（attachment）ならび
に原形質膜および必要に応じて核膜を介してのその通過を促進する；従って、有
効であるために、このようなベクターは、ウイルスの機能を模倣しなければなら
ない。しかし、先行技術において提供された種々のベクターは、最適にはこれら
２つの機能を示さず、そしてまた場合によって細胞について毒性であり得る。

【０００５】これらの非ウイルスベクターの中でも、特にカチオン性脂質の調製が言及され
得、これは、特に細胞障害性であり（１５〜１８）、リポソーム（９〜１１）お
よびポリ（Ｌ−リシン）プロタミン、ポリエチレンイミン（１２）またはカチオ
ン性デンドリマー（ポリアミドアミン）（１３、１４、２７）のようなポリカチ
オン性ポリマーにＤＮＡを封入するための技術であり、これらはポリプレックス
（polyplex）と呼ばれる粒子を作製し、各々は、それらの構造および細胞タイプ
に依存して可変のトランスフェクション効率を与える、協同性（cooperativity
）のプロセスを引き起こす多重の静電的相互作用を介してＤＮＡと結合する（２
５）。

【０００６】より詳細には、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）タイプのデンドリマーは、球
状かつ分岐の構造を有するポリマーであり；それらは、水溶液に可溶であり、そ
してそれらの表面に第一級アミンの層を有し；それらは、それらの表面でイソ分
子（isomolecular）でありそして高度に帯電している。記載される種々のデンド
リマーは、種々のタイプのコア：アンモニウムまたはエチレンジアミン（ＥＤＡ
）を有し、これらから重合プロセスが開始される。これらＰＡＭＡＭデンドリマ
ーは、該ポリマーの表面に規定数のアミノ基を含み、これらは、生理的ｐＨで正
に帯電している。このような分子はアニオン（例えば、核酸）と相互作用するこ
と、およびＤＮＡ／デンドリマー複合体は、ＤＮＡ／ポリリシン複合体で観察さ
れるものと類似の様式であるが、それらの溶解度およびそれらの構造にリンクし
たより大きな効率で、細胞をトランスフェクトし得ることが示された。特に、コ
アとしてＮＨ₃基またはＥＤＡ基のいずれかを含むＧ₃−Ｇ₅ＰＡＭＡＭデンドリ
マーは、生理的条件下でＤＮＡと安定な複合体を形成し得、そしてＧ₅−Ｇ₁₀デ
ンドリマーは、遺伝子をトランスフェクトし得る。トランスフェクションの能力
がデンドリマーのこの基に限定されるという事実は、恐らく、それらの表面に存
在するアミノ基の数およびそれらの球状形に関連する。後者の効率は、熱処理に
よる最初のデンドリマー構造に対する化学的修飾に依存し、これは、ヘテロ拡散
の（heterodispersed）化合物の集団を生じさせる（１５、２１）。

【０００７】約１０年にわたって、デンドリマーの化学に関する研究が、それらの構造（秩
序だった多官能ポリマー）、ならびにそれらの末端のかなりの数の官能基（これ
は、多数の表面および境界面を提供する）の存在および多様な分子の封入を可能
にする空領域（empty zones）の存在に関連するそれらの特性のために、かなり
行われた；この研究は、C. Galliotら（１８）、C. Larreら（１９）またはD. P
revoteら（２８）によって記載されるもののようなリン含有デンドリマーに対応
する他の構造の合成を導いた。

【０００８】しかし、該文献から、水溶性でないこれらのリン含有デンドリマーはトランス
フェクション薬剤として使用され得ないことが分かる。

【０００９】彼らの研究のコンテクストにおいて、本発明者らは、ここで、内層のレベルで
官能化され、末端にプロトン化された第三級アミンを含む新規のリン含有デンド
リマーが、核酸を運搬するためのベクターとして特に有利な特性を有することを
示す。

【００１０】本発明の主題は、以下からなることを特徴とするポリカチオン性リン含有デン
ドリマーである： − ２〜８の官能基ならびに特に一般式Iaの基（また、Ｎ₃Ｐ₃と呼ばれる）：

【００１１】

【化５】

【００１２】または一般式Ibの基：

【００１３】

【化６】

【００１４】を含むコアＰ₀の形態の中心層、 − ｎの中間層、これは同一または異なり得、該中間層の各々は、以下の式II
に対応するユニットＰ１からなる：

【００１５】

【化７】

【００１６】ここで：Ｌは、酸素、リンまたは硫黄原子である。

【００１７】Ｍは、以下の基の１つを示す：・アルキル基、アルコキシ基またはＣ₁−Ｃ₁₂オレフィン、アゾもしくはア
セチレンタイプの不飽和基でジ−、トリ−またはテトラ−置換された芳香族基。
全てのこれらの基は、場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン原
子を含む、あるいは、・Ｍが芳香族基である場合に定義される通りのいくつかの置換基を含むアル
キルまたはアルコキシ基、Ｒ₁およびＲ₂は、同一または異なり得、水素原子または以下の基の１つを示
す：場合によってはリン、酸素、硫黄、窒素またはハロゲン原子を含む、アルキ
ル、アルコキシ、アリール；Ｒ₂は最も一般的にはＲ₁と異なる。

【００１８】ｎは、１と１１の間の整数である。

【００１９】Ｅは、酸素、硫黄または窒素原子であり、該窒素原子は、アルキル、アルコ
キシまたはアリール基へ場合によっては連結されており、全てのこれらの基は、
場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン原子を含む。

【００２０】 − ユニットＰ２からなる外層、これは同一または異なり得、式IIIに対応す
る：

【００２１】

【化８】

【００２２】ここで：Ｒ₅は、水素原子または以下の基：アルキル、アルコキシ、アリールの１つ
を示し、これらの基は、場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン
原子を含む。

【００２３】Ｗは、以下の基：アルキル、アルコキシ、アリールの１つを示し、全てのこ
れらの基は、場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン原子を含む
。

【００２４】Ｒ₃およびＲ₄は、同一または異なり得、Ｃ₁−Ｃ₅アルキル基を示す。

【００２５】Ｘは、水素原子またはＣ₁−Ｃ₅アルキル基を示すかまたは存在しない。そし
て、Ｚは、ハロゲン化物イオン、アルキルＣＯＯ^-基または炭素、酸素、硫黄、
窒素、リンもしくはハロゲン原子を含む任意の他のアニオン性基を示すか、ある
いは存在しない。

【００２６】式IIの好ましい基は、特に以下の基である：

【００２７】

【化９】

【００２８】式IIIの好ましい基は、特に以下の基である：

【００２９】

【化１０】

【００３０】ここでｐ＝１〜５。

【００３１】このような化合物は、デンドリマーを示し、そして特に図１〜３に示される。

【００３２】表現“アルコキシ“は、一般式Ｒ’Ｏ−の基、例えばメトキシ、エトキシ、プ
ロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ基を
意味する。

【００３３】表現“アルキル”は、８炭素原子までを含む直鎖または分枝鎖基を意味する。
これらの基の中でも、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ
ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルま
たはオクチル基が言及され得る。

【００３４】表現“アリール”は、例えば、必要に応じて１以上のアルコイル（alkoyl）ま
たはアルコキシル基あるいは塩素、臭素またはフッ素原子で置換されたフェニル
基、あるいは、１〜２ヘテロ原子（例えば、窒素または酸素）を含む５または６
員の芳香族ヘテロ環式基を意味する。これらのアリール基の中でも、（ｏ−、ｍ
−、またはｐ−）フェニル、（３，４−、２，６−、２，３−）メトキシフェニ
ル、（ｏ−、ｍ−、またはｐ−）ジメトキシフェニル、トルイル、チエニルまた
はピリジル基が言及され得る。

【００３５】一般的に、式Ａ−［Ｇ_n］（ここで、Ａは末端ユニットのタイプを定義し、そ
してＧ_nは中間ユニットＰ１の層の数を定義する）によって示される数タイプの
生成物を得ることが可能である（世代（generation）の数に対応する）： − 化合物２−［Ｇ_n］の系列は、前記式IIIの末端ユニットを有し、ここでＸ
は水素原子を示し、ｐは２に等しく、Ｒ₃およびＲ₄は同一でありそしてエチル基
を示し、Ｚは塩化物イオンであり、そしてｎは１と１１の間好ましくは１と１０
の間の整数である（図３を参照のこと）； − 化合物３−［Ｇ_n］の系列は、式IIIの末端ユニットを有し、ここでＸは空
（empty）であり、ｐは２に等しく、Ｒ₃およびＲ₄は同一でありそしてエチル基
を示し、Ｚは空であり、そしてｎは１と１１の間好ましくは１と１０の間の整数
である（図３を参照のこと）； − 化合物４−［Ｇ_n］の系列は、式IIIの末端ユニットを有し、ここでＸはメ
チル基を示し、ｐは２に等しく、Ｒ₃およびＲ₄は同一でありそしてエチル基を示
し、Ｚはヨウ化物イオンであり、そしてｎは１と１１の間好ましくは１と１０の
間の整数である（図３を参照のこと）； − 化合物５−［Ｇ_n］の系列は、式IIIの末端ユニットを有し、Ｘはメチル基
を示し、ｐは２に等しく、Ｒ₃およびＲ₄は同一でありそしてエチル基を示し、Ｚ
は基ＣＨ₃ＣＯＯ^-であり、そしてｎは１と１１の間好ましくは１と１０の間の整
数である（図３を参照のこと）； − 化合物１−［Ｇ_n］の系列は、Ｃｌ₂末端ユニットを有し、そしてｎは１と
１１の間好ましくは１と１０の間の整数である（図３を参照のこと）（本発明に
従うデンドリマーの調製のための中間体産物）。

【００３６】本発明に従うポリカチオン性リン含有デンドリマーは、遺伝子ベクターとして
使用される先行技術のデンドリマーと比較して特定数の利点を有する： − それらは、イソ分子（isomolecular）であり、そして結果として再現性可
能である（高度の純度）、 − それらは帯電しており、これは、トランスフェクトされる核酸に関して特
定の親和性、そして従って良好なトランスポーター（transporter）品質をそれ
らに与える、 − それらは、表面および内部層の両方で官能化され得る、 − それらは、大きなｐＨ範囲（３〜１２）内で分解せずに水溶性である（７
ヶ月間水溶液中で安定）。これは、トランスフェクションにおいて活性である化
合物を与えるために熱分解（比較的乏しい再現性の工程）させなければならない
ＰＡＭＡＭタイプのデンドリマーと比較して、明らかな利点を示す。

【００３７】 − それらは、比較的非細胞障害性である（８０％よりも大きなトランスフェ
クトされた細胞の生存能力）。

【００３８】本発明に従うリン含有デンドリマーは、式VIII（式IIの産物の例）のモチーフ
またはユニットＨ₂Ｎ−Ｎ（Ｒ₂）−Ｐ（Ｓ）Ｃｌ₂の連続層の付加によるデンド
リマー構造の制御された成長によって、再現可能な様式で得られ得る。式VIIの
中心コアまたはブロック（図１および２を参照のこと）は、４−ヒドロキシベン
ズアルデヒドのトリエチルアンモニウムで修飾されたヘキサクロロシクロトリホ
スファゼンユニット（Ｃｌ₆Ｎ₃Ｐ₃）に対応する。６の末端アルデヒド官能基を
含むこのコアは、式VIII Ｈ₂Ｎ−Ｎ（Ａｌｋ）−Ｐ（Ｓ）Ｃｌ₂のジクロロホス
ホノアルキルヒドラジド（dichlorophosphonoalkylhydrazide）と接触されて、
ジクロロチオホスフィン、Ｐ（Ｓ）Ｃｌ₂、末端ユニットを含むデンドロン（den
dron）を生成し、これは式VIの４−ヒドロキシベンズアルデヒド塩ともう一度接
触され得、反復によって各デンドリマー世代を生成する。第１、第２、第３、第
４および第５デンドリマー世代は、それぞれ、６、１２、２４、４８および９６
のＣｌ₂末端ユニットを含み、これは、Ｎ，Ｎ−ジアルキルエチレンジアミンで
処理され得、プロトン化後にカチオン性デンドリマーを生成する：図３に従って
、２−［Ｇ₁］〜２−［Ｇ₅］。

【００３９】ポリカチオン性リン含有デンドリマーは、第１、第２、第３、第４および第５
デンドリマー世代について、それぞれ、１２、２４、４８、９６または１９２周
辺（peripheral）正電荷を有する。

【００４０】メチル化形態（５−［Ｇ₁］〜５−［Ｇ₅］）は、対応の中性末端アミン（３−
［Ｇ₁］〜３−［Ｇ₅］）から、ヨウ化メチルの存在下でのメチル化、続いての好
適な樹脂を使用してのヨージド／アセテート交換によって、調製される（実施例
１を参照のこと）。

【００４１】デンドリマーの純度および完全性（integrity）は、分光分析（¹Ｈ、¹³Ｃおよ
び³¹ＰＮＭＲ）によって証明される。

【００４２】メチル化デンドリマー（５−［Ｇ₁］〜５−［Ｇ₅］）のたった８〜１０％の末
端枝が、メチル基における欠陥（deficit）を示す。

【００４３】より詳細には、本発明に従うデンドリマーは、以下の様式で調製され得る：（１）６のアルデヒド官能基含む式VIIの生成物：Ｎ₃Ｐ₃（ＯＣ₆Ｈ₄ＣＨＯ）₆ （コアＰ₀からなる中心層；図３）を得るための、式Ｖの生成物（また、Ｎ₃Ｐ₃
と呼ばれる）の反応

【００４４】

【化１１】

【００４５】ここでＲ₁は、式VI

【００４６】

【化１２】

【００４７】のアルデヒド官能基を含む基を示す。

【００４８】（２）Ｃｌ₂末端ユニットを含む１−［Ｇ_n］タイプのデンドロンの生成するた
めの、（１）において得られた式VIIの生成物と式VIII：Ｈ₂Ｎ−Ｎ（Ｒ₂）−Ｐ
（Ｓ）Ｃｌ₂との反応、；（３）（２）で得られた生成物に基づいての工程（１）および（２）の反復、
数ｎの中間層を生成する；第１、第２、第３、第４および第５デンドリマー世代
は、それぞれ、６、１２、２４、４８および９６のＣｌ₂末端ユニットを含む；
ならびに、（４）プロトン化後に本発明に従うカチオン性デンドリマーを生成するための
該Ｃｌ₂末端ユニットのＮ，Ｎ−ジアルキルエチレンジアミンでの処理。

【００４９】本発明の主題はまた、核酸および該核酸へ結合された上記に定義のポリカチオ
ン性リン含有デンドリマーを含むことを特徴とする、真核細胞へ核酸配列をトラ
ンスフェクトするための薬剤として作用し得る組成物である。

【００５０】該組成物の有利な実施形態によれば、それはまた、少なくとも１つの薬学的に
許容されるビヒクルを含む。

【００５１】該組成物の別の有利な実施形態によれば、Ｎ／Ｐ比［ここで、Ｎはデンドリマ
ーの末端カチオン性基（帯電アミン）に対応し、そしてＰは該核酸のリン酸基に
対応する］は５〜１０の間である。

【００５２】該組成物の別の有利な実施形態によれば、それはまた、該真核細胞の細胞質膜
またはエンドソーム膜を通って該核酸を運搬し得る、膜を透過させるための薬剤
を含む。

【００５３】該組成物のなお別の有利な実施形態によれば、該ポリカチオン性リン含有デン
ドリマーは、該核酸と非共有結合的に結合される。

【００５４】有利には、系列２−［Ｇ_n］（ここで、ｎ＝３〜５）において選択される本発
明に従うポリカチオン性リン含有デンドリマーは、核酸を運搬するためのベクタ
ーとして特に有利であり、一方、系列５−［Ｇ_n］のデンドリマーは、毒性であ
りそして血清の存在および非存在の両方において核酸を真核細胞へトランスフェ
クトすることにおいて比較的非効率的である。

【００５５】この現象は、恐らく、高密度の安定な正電荷に関連し、これは、細胞膜の破裂
（rupture）を引き起こしそして従って細胞死へ導き得る。デンドリマーを分解
させることなしにアルキル化生成物についての電荷密度を減少させることは可能
でなく、一方、系列２−［Ｇ_n］の電荷密度は、細胞膜のレベルでのｐＨの微小
環境修飾（microenvironmental modifications）によって調節され得る。さらに
、この系列のデンドリマーの電荷密度を調節することの可能性は、エンドソーム
において運搬された遺伝子の放出における重要な因子を構築し得る。従って、こ
れらのデンドリマーは、恐らく、細胞コンパートメントにおけるプロトンリザー
バ（proton reservoir）として作用し、それらの電荷密度はＡＴＰアーゼ−依存
プロトンポンプおよび細胞内塩化物濃度の改変によって制御される。細胞の外側
および内側のこれらのデンドリマーのカチオン性電荷密度を減少させる可能性は
、インビボでの使用に好ましいであろう。

【００５６】上記のアレンジメントに加えて、本発明はまた他のアレンジメントを含み、こ
れは、本発明の主題である方法の実施例およびまた添付の図面に言及する以下の
説明から明らかとなる。

【００５７】しかし、これらの実施例は本発明の主題の例示によってのみ与えられ、ここで
それらは決して限定を構成しないことが、明らかに理解されるべきである。

【００５８】実施例１：本発明に従うデンドリマーの調製 − 使用される一般的な方法および産物全ての操作を、強真空の条件下またはアルゴン下での一般的技術を使用して行
った。¹Ｈ、³¹Ｐおよび¹³ＣＮＭＲスペクトルを、Brucker分光計（AC80、AC200
およびAC250）において記録した。試薬の³¹ＰＮＭＲ化学シフトは、８５％のＨ ₃ ＰＯ₄に対するｐｐｍで表現される。ＮＭＲについて使用される番号付け（numb
ering）は、図１において詳述される。１−［Ｇ_n］デンドリマーを、公開された
プロトコル（１６、１７）に従って合成した。省略形１−［Ｇ_n］において、番
号１は、末端Ｃｌを有するデンドリマーに対応し、２、３、４または５は、それ
ぞれ、−ＮＨ（Ｅｔ）₂ ⁺Ｃｌ^-、−Ｎ（Ｅｔ）₂、−ＮＭｅ（Ｅｔ）₂ ⁺Ｉ^-または
−ＮＭｅ（Ｅｔ）₂ ⁺ＯＡｃ^-についてであり、そしてｎは、デンドリマーの世代
（generations）の数（中間層の数）に対応する。ヨウ化メチルおよびＮ，Ｎ−
ジエチルエチレンジアミンはＡｌｄｒｉｃｈから供給され、そしてＡＧ１−Ｘ８
樹脂（これは、アニオン交換について高い能力（high capacity）を有する）は
Ｂｉｏｒａｄから供給された。

【００５９】 − ２−［Ｇ_n］タイプの生成物を合成するための一般的手順Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（ｎ＝１、９３μｌ、０．６６ｍｍｏｌ；
ｎ＝２、７１μｌ、０．５ｍｍｏｌ；ｎ＝３、６８μｌ、０．４８ｍｍｏｌ；ｎ
＝４、６１μｌ、０．４３ｍｍｏｌ；ｎ＝５、６０μｌ、０．４２ｍｍｏｌ）を
、シリンジを使用して、１５ｍｌの蒸留されたＴＨＦ（ＴＨＦΔ）中に１００ｍ
ｇのデンドリマー１−［Ｇ_n］（ｎ＝１、５５μｍｏｌ；ｎ＝２、２１μｍｏｌ
；ｎ＝３、１０μｍｏｌ；ｎ＝４、４．５μｍｏｌ；ｎ＝５、２．２μｍｏｌ）
を含有する溶液へ、激しく攪拌しながら滴下した。室温（ＲＴ）で一晩攪拌した
後、溶媒を濾過によって除去した。得られた白色粉末を２０ｍｌの蒸留されたＴ
ＨＦで２回洗浄し、そして蒸発によって乾燥させた。カップリング反応の間に生
成されたプロトンを、末端第三級アミン残基によって捕捉し、結果として、２−
［Ｇ_n］デンドリマーを塩化物の形態で得た。

【００６０】デンドリマー２−［Ｇ₁］の第１世代は、収率８０％で得られる。ＮＭＲデー
タは以下の通りである：

【００６１】

【数１】

【００６２】デンドリマー２−［Ｇ₂］の第２世代（収率＝９５％）：

【００６３】

【数２】

【００６４】デンドリマー２−［Ｇ₃］の第３世代（収率＝９５％）：

【００６５】

【数３】

【００６６】デンドリマー２−［Ｇ₄］の第４世代（収率＝９５％）：

【００６７】

【数４】

【００６８】デンドリマー２−［Ｇ₅］の第５世代（収率＝９５％）：

【００６９】

【数５】

【００７０】 − ３−［Ｇ_n］タイプの生成物を合成するための一般的手順水酸化ナトリウム規定液（ｎ＝１、３７２ｍｌ、０．３７ｍｍｏｌ；ｎ＝２、
３１２ｍｌ、０．３１ｍｍｏｌ；ｎ＝３、２８８ｍｌ、０．２９ｍｍｏｌ；ｎ＝
４、２８８ｍｌ、０．２８ｍｍｏｌ；ｎ＝５、２８８ｍｌ、０．２８ｍｍｏｌ）
を、３０ｍｌの蒸留水中に１００ｍｇのデンドリマー２−［Ｇ_n］を含む溶液（
ｎ＝１、３１ｍｍｏｌ；ｎ＝２、１３ｍｍｏｌ；ｎ＝３、６ｍｍｏｌ；ｎ＝４、
３ｍｍｏｌ；ｎ＝５、１．５ｍｍｏｌ）へ、激しく攪拌しながら滴下した。沈殿
物を遠心分離によって単離し、そしてクロロホルムに溶解させ、そして次いで有
機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。最後に、生成物を濾過しそして蒸発によっ
て乾燥させた。

【００７１】デンドリマー３−［Ｇ₁］（収率＝８０％）：

【００７２】

【数６】

【００７３】デンドリマー３−［Ｇ₂］（収率＝９５％）：

【００７４】

【数７】

【００７５】デンドリマー３−［Ｇ₃］（収率＝９５％）：

【００７６】

【数８】

【００７７】デンドリマー３−［Ｇ₄］（収率＝９５％）：

【００７８】

【数９】

【００７９】デンドリマー３−［Ｇ₅］（収率＝９５％）：

【００８０】

【数１０】

【００８１】 − ４−［Ｇ_n］タイプの生成物を合成するための一般的手順１５ｍｌのＤＭＦ中に１００ｍｇの中性デンドリマー３−［Ｇ_n］（ｎ＝１、
３６ｍｍｏｌ；ｎ＝２、１５ｍｍｏｌ；ｎ＝３、７ｍｍｏｌ；ｎ＝４、３．３ｍ
ｍｏｌ；ｎ＝５、１．６ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（ｎ＝１、２７μｌ、０
．４３ｍｍｏｌ；ｎ＝２、２２μｌ、０．３６ｍｍｏｌ；ｎ＝３、２１μｌ、０
．３４ｍｍｏｌ；ｎ＝４、２０μｌ、０．３２ｍｍｏｌ；ｎ＝５、１９μｌ、０
．３１ｍｍｏｌ）を含む溶液を、室温で一晩攪拌した。溶液を蒸発によって乾燥
させた。得られたペーストを２０ｍｌのペンタン／エーテル（１／１、ｖ／ｖ）
混合液で洗浄し、４−［Ｇ_n］と呼ばれるメチル化デンドリマーの黄色粉末を得
た。

【００８２】デンドリマー４−［Ｇ₁］（収率＝９０％）：

【００８３】

【数１１】

【００８４】デンドリマー４−［Ｇ₂］（定量的収率）：

【００８５】

【数１２】

【００８６】デンドリマー４−［Ｇ₃］（定量的収率）：

【００８７】

【数１３】

【００８８】デンドリマー４−［Ｇ₄］（定量的収率）：

【００８９】

【数１４】

【００９０】デンドリマー４−［Ｇ₅］（定量的収率）：

【００９１】

【数１５】

【００９２】 − ５−［Ｇ_n］タイプの生成物を合成するための一般的手順アニオン交換についての高い能力を有する樹脂、ＡＧ１−Ｘ８を、蒸留水（ｎ
＝１、２５ｍｌ；ｎ＝２、２３ｍｌ；ｎ＝３、２２ｍｌ；ｎ＝４、２１ｍｌ；ｎ
＝５、２０ｍｌ）中の１００ｍｇのメチル化デンドリマー４−［Ｇ_n］（ヨウ化
物の形態）（ｎ＝１、２２μｍｏｌ；ｎ＝２、１０μｍｏｌ；ｎ＝３、４．７μ
ｍｏｌ；ｎ＝４、２１μｍｏｌ；ｎ＝５、１．１μｍｏｌ）の懸濁液へ、示され
る割合（ｎ＝１、１．２４ｇ；ｎ＝２、１．１３ｇ；ｎ＝３、１．０６ｇ；ｎ＝
４、１．０３ｇ；ｎ＝５、１ｇ）で添加し、そして１時間穏やかに混合した。得
られたペーストを２０ｍｌのペンタン／エーテル（１／１、ｖ／ｖ）混合液で洗
浄し、５−［Ｇ_n］と呼ばれる、アセテート形態の、メチル化デンドリマーの白
色粉末を得た。８〜１０％の末端枝を樹脂での対イオン交換の間に修飾し、そし
てＮＭＲ結果が第三級アミンを保有する中性デンドリマー（３−［Ｇ_n］）のも
のと同一であったので仮に脱メチル化形態と考えた。これらのマイナー（minor
）末端枝は、以下にあるＮＭＲ結果におけるアスタリスクで示され、そして収率
は全デンドリマーのものに対応する。

【００９３】デンドリマー５−［Ｇ₁］（収率＝９０％）：

【００９４】

【数１６】

【００９５】デンドリマー５−［Ｇ₂］（収率＝９５％）：

【００９６】

【数１７】

【００９７】デンドリマー５−［Ｇ₃］（収率＝９５％）：

【００９８】

【数１８】

【００９９】デンドリマー５−［Ｇ₄］（収率＝９５％）：

【０１００】

【数１９】

【０１０１】デンドリマー５−［Ｇ₅］（収率＝９５％）：

【０１０２】

【数２０】

【０１０３】実施例２：トランスフェクション実験これらの種々のポリカチオン性リン含有デンドリマーで得られた結果は、常に
、５（図４）〜１０（図５）のＮ／Ｐ電荷比（Ｎ／Ｐ比＝ＤＮＡの１リン酸当た
りのデンドリマーの末端窒素原子の数）を有する最適効率（optimum efficiency
）を示した。従って、任意の様式で、リン含有デンドリマー（Ｐ−デンドリマー
）の種々の世代のトランスフェクション効率（transfection efficiency）を、
１ヌクレオチド当たり５〜１０アミン当量を有する線形ＰＥＩＥｘＧｅｎ５０
０のものと比較することが決定された。

【０１０４】ＤＮＡの１リン酸当たり５正電荷当量で、塩酸塩の形態で試験された２−［Ｇ _n ］タイプの５の異なる世代のプロトン化デンドリマーは、トランスジーンの顕
著な発現を得ることを可能にした。１０⁵〜ほぼ１０⁹相対光単位（relative lig
ht units）（ＲＬＵ）／タンパク質１ｍｇの増加が観察された。トランスフェク
ション効率は、デンドリマーのサイズ（世代数）に伴って増加し、しかし１０⁸
と１０⁹ＲＬＵの間の値で第３世代からプラトーに達する（図４）。従って、２
−［Ｇ₄］を選択してより詳細にこれらの新規のカチオン性リン含有デンドリマ
ー（この構造を図２に与える）を研究する。

【０１０５】血清の存在下で行われるトランスフェクションはより少ない毒性を生じること
に注意するべきである。結果として、より高いレベルの発現が、血清無しで行わ
れるものと比較して、血清の存在下で行われるトランスフェクションについて観
察される（それぞれ、図４Ａおよび図４Ｂ、右および左のパネル）。

【０１０６】それらのトランスフェクション条件をさらに最適化しようとしないで、第３〜
第５世代のデンドリマーは、最適条件下で使用される線形ＰＥＩと同じぐらい効
率的であると分かる。

【０１０７】他方で、メチル化形態５−［Ｇ_n］は、むしろ毒性でありそして真核細胞へ核
酸をトランスフェクトすることについて比較的非効率的であると分かる（図５Ａ
および図５Ｂ）。この現象は、細胞膜を乱し（disturb）そして細胞死を引き起
こし得る安定な正電荷密度によって説明され得る。デンドリマーを分解（degrad
e）することなしにメチル化形態の電荷密度を減少させることは可能でなく；他
方で、塩化物誘導体（２−［Ｇ_n］）の電荷密度は、それらが細胞膜へアプロー
チする場合にｐＨの微小環境修飾（microenvironmental modifications）によっ
て調節され得る。さらに、デンドリマーの塩化物誘導体の電荷密度を調節する可
能性は、エンドソームからのルシフェラーゼ遺伝子の放出において重大な役割を
果たし得る。これらのデンドリマーは、恐らく、細胞コンパートメントにおける
プロトンリザーバのように振舞い、それらの電荷密度は、第一にＡＴＰアーゼ共
役プロトンポンプによって、第二に塩化物濃度の細胞内調節によって制御される
。細胞の内側または外側でのこれらのリン含有デンドリマーのカチオン性電荷密
度を減少させる可能性は、以前に記述されたように（２６）、インビボで実験を
行うための利点である。

【０１０８】 − 化学生成物線形２２ｋＤａＰＥＩ（ＥｘＧｅｎ５００）はＥｕｒｏｍｅｄｅｘ（Ｓｏ
ｕｆｆｅｌｗｅｙｅｒｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）によって供給された。

【０１０９】 − 細胞系および培養ＮＩＨ３Ｔマウス線維芽細胞はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ，ＵＳＡ
）に由来し、そしてダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養する。培
養培地に、１０％のウシ胎児血清（Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ，Ｂｒｕｎａｔｈ，Ｆ
ｒａｎｃｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１００ユニッ
ト／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）および１００μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補足した。細胞を３７℃で、５％のＣＯ ₂ を含む湿潤雰囲気において維持する。細胞が８０％コンフルエンシーに達した
時、それらをトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の生理食塩水溶液で
分離し、１０倍に希釈し、そして新しいフラスコ中に培養させた。

【０１１０】 − プラスミドサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー配列の制御下でＰｈｏｔ
ｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼをコードするＰＣＭＶ−ｌｕｃは、親
切にもＤｒ．Ｍ．Ｓｃａｒｐａ（ＣＲＩＢＩ，Ｐａｄｏｕａ、Ｉｔａｌｙ）から
提供された。プラスミドを、形質転換大腸菌株ＸＬ１から、Ｑｉａｇｅｎカラム
（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）において精製した。

【０１１１】 − 細胞のトランスフェクション接着細胞（adherence cells）を、トランスフェクションの前日に、２４−ウ
ェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）へ播種し
、トランスフェクションの日に６０〜７０％のコンフルエンシーに達した。全て
の実験を３重で行った。細胞をトランスフェクション前にリンスし、そして血清
を含むまたは含まない１ｍｌの培地を各ウェルへ添加した。２μｇのプラスミド
（１０ｍＭＴｒｉｓ−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）中の１．５ｍｇ
／ｍｌ溶液）を、５０μｌの０．１５ＭＮａＣｌに希釈した。

【０１１２】Ｎ／Ｐ（窒素／リン酸）比は、核酸ホスフェート（Ｍ_w３３０）当たり１つの
アミン残基を有する必要のあるポリマーの量に対応する（４３Ｄａ＝ＰＥＩにつ
いての平均分子量（Ｍ_w）；デンドリマーについて、アミン残基の窒素モル濃度
は、Ｍｗを各世代についての電荷数によって割ることによって計算された）（１
２）。必要量の線形ＰＥＩ（ＥｘＧｅｎ５００）およびデンドリマー（滅菌Ｍｉ
ｌｌｉＱ水中の、ＰＥＩおよびアミン形態の１０ｍＭの窒素に対応するデンドリ
マーの、ストック溶液由来）を、５０μｌの０．１５ＭＮａＣｌに希釈し、穏
やかにボルテックスし（vortexed）そして遠心分離した。１５分後、カチオン性
ベクターを１工程でプラスミド溶液へ添加し［そして逆の順序でない（１２）］
、そして次いで混合物をボルテックスしそして遠心分離した。上記に示される量
および容量は、１ウェルに対応し、そして実際には３で乗じられ、そして３つの
ウェルへ分配した。１０分後、混合物を細胞へ添加し、そして上澄みを僅かに水
平な手動の回転によって均一に分配させた。その直後に、培養プレートを５分間
１５００ｒｐｍ（２８０ｇ）で遠心分離した（Ｓｉｇｍａ，３Ｋ１０，Ｂｉｏｂ
ｌｏｋ，Ｆｒａｎｃｅ）。２〜３時間のインキュベーション後、１１０μｌのウ
シ胎児血清を、血清を含まないウェルへ添加した。細胞を２４時間培養し、そし
て次いでレポーター遺伝子の発現を試験した。

【０１１３】 − ルシフェラーゼ測定ルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ルミネッセンスによって測定した。培養培地
を除去し、そして細胞溶解物を、１×溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）中
室温で３０分間のインキュベーション後に収穫した。溶解物を穏やかにボルテッ
クスし、そして１４００００ｒｐｍ（１７５３０ｇ）で５分間４℃で遠心分離
した。２０μｌの溶解物を１００μｌのルシフェラーゼ反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ，ＵＳＡ）に希釈し、そしてルミネッセンスを１０秒間測定した（Ｍｅｄｉ
ａｔｏｒｓＰｈＬ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）。結果を、タンパク質ｍ
ｇ当たりのルミネッセンスの単位として表現する（ＢＣＡ試験，Ｐｉｅｒｃｅを
使用しての測定）。

【０１１４】実施例３：実施例２に従ってトランスフェクトした細胞の生存度（viability
）のパーセンテージ

【０１１５】

【表１】

【０１１６】

【表２】

【０１１７】

【表３】

【０１１８】上記から明らかであるように、本発明は、より明示的にまさに記載された実施
、調製および適用のその方法に決して限定されず；他方で、それは、本発明のコ
ンテクストまたは範囲から逸脱することなしに、当業者に予想され得るその全て
の変形物を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、中心コアＰ₀（Ｎ₃Ｐ₃）の構造および３−［Ｇ₂］タイプの本発明に従
うデンドリマーを例示する。

【図２】図２は、２−［Ｇ₄］タイプの本発明に従うデンドリマーを例示する。

【図３】図３は、本発明に従うデンドリマーを調製するための方法を例示する。

【図４】図４は、血清の存在下（図４Ａおよび４Ｂの右手側部分）または血清の非存在
下（図４Ａおよび４Ｂの左手側部分）での、２−［Ｇ_n］タイプのデンドリマー
の遺伝子運搬特性を例示する。

【図５】図５は、血清の存在下（図５Ａおよび５Ｂの右手側部分）または血清の非存在
下（図５Ａおよび５Ｂの左手側部分）での、５−［Ｇ_n］タイプのデンドリマー
の遺伝子運搬特性を例示する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ムニエルベルナルドフランス国エフ−31320 カスタネットインパセデムニエル７ (72)発明者カミナーデアン−マリーフランス国エフ−31400 トゥールーズルデレステラル 17 (72)発明者ループクリストフフランス国エフ−31000 トゥールーズルデレトワール５ (72)発明者ザンタ−ブシッフマリー−アントワネットフランス国エフ−67000 ストラスブールルデストックホルム６Ｆターム(参考） 4C076 CC41 EE59 4C084 AA13 MA05 NA13 4C086 AA02 EA16 MA02 MA05 NA13 4H050 AA01 AB20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下からなることを特徴とする、ポリカチオン性リン含有デ
ンドリマー： − ２〜８の官能基を含む中心コアＰ₀の形態の中心層、 − ｎの中間層、これは同一または異なり得、該中間層の各々は、以下の式II
に対応するユニットＰ₁からなる：【化１】ここで：Ｌは、酸素、リンまたは硫黄原子である；Ｍは、以下の基の１つを示す：・アルキル基、アルコキシ基またはＣ₁−Ｃ₁₂オレフィン、アゾもしくはア
セチレンタイプの不飽和基でジ−、トリ−またはテトラ−置換された芳香族基。
全てのこれらの基は、場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン原
子を含む、あるいは、・Ｍが芳香族基である場合に定義される通りのいくつかの置換基を含むアル
キルまたはアルコキシ基、Ｒ₁およびＲ₂は、同一または異なり得、水素原子または以下の基の１つを示
す：場合によってはリン、酸素、硫黄、窒素またはハロゲン原子を含む、アルキ
ル、アルコキシ、アリール；Ｒ₂は最も典型的にはＲ₁と異なる；ｎは、１と１１の間の整数である；Ｅは、酸素、硫黄または窒素原子であり、該窒素原子は、アルキル、アルコ
キシまたはアリール基へ場合によっては連結されており、全てのこれらの基は、
場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン原子を含む； − ユニットＰ２からなる外層、これは同一または異なり得、式IIIに対応す
る：【化２】ここで：Ｒ₅は、水素原子または以下の基：アルキル、アルコキシ、アリールの１つ
を示し、これらの基は、場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン
原子を含む；Ｗは、以下の基：アルキル、アルコキシ、アリールの１つを示し、全てのこ
れらの基は、場合によってはリン、酸素、窒素、硫黄またはハロゲン原子を含む
；Ｒ₃およびＲ₄は、同一または異なり得、Ｃ₁−Ｃ₅アルキル基を示す。Ｘは、水素原子またはＣ₁−Ｃ₅アルキル基を示すかまたは存在しない。そし
て、Ｚは、ハロゲン化物イオン、アルキルＣＯＯ^-基または炭素、酸素、硫黄、
窒素、リンもしくはハロゲン原子を含む任意の他のアニオン性基を示すか、ある
いは存在しない。
【請求項２】前記中心コアＰ₀が、一般式Iaの基：【化３】または一般式Ib：【化４】の基からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のデンドリマ
ー。
【請求項３】Ｘが水素原子を示し、Ｒ₅が水素原子であり、Ｗが基（ＣＨ₂ ）₂を示し、Ｒ₃およびＲ₄が同一でありそしてエチル基を示し、Ｚが塩化物イオ
ンであり、そしてｎが１と１１の間の整数である、式IIIの末端ユニットを有す
ることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のデンドリマー。
【請求項４】Ｘがメチル基を示し、Ｒ₅が水素原子であり、Ｗが基（ＣＨ₂ ）₂を示し、Ｒ₃およびＲ₄が同一でありそしてエチル基を示し、Ｚが基ＣＨ₃ＣＯ
Ｏ^-であり、そしてｎが１と１１の間の整数である、式IIIの末端ユニットを有す
ることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のデンドリマー。
【請求項５】核酸および該核酸へ結合された請求項１〜４のいずれか１項
に記載のポリカチオン性リン含有デンドリマーを含むことを特徴とする、核酸配
列を真核細胞へトランスフェクトするための薬剤として作用し得る組成物。
【請求項６】少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルをまた含むこ
とを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】Ｎ／Ｐ比［ここで、Ｎは前記デンドリマーの末端カチオン性
基（帯電アミン）に対応し、そしてＰは前記核酸のリン酸基に対応する］が５〜
１０の間であることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の組成物。
【請求項８】前記真核細胞の細胞質膜またはエンドソーム膜を通って前記
核酸を輸送し得る、前記膜を透過させるための薬剤をまた含むことを特徴とする
、請求項５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】前記ポリカチオン性リン含有デンドリマーが前記核酸と非共
有結合的に結合されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の
組成物。