KR20010075714A - 핵산 운반체 및 유전자 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

신규 핵산 운반체 및 유전자 치료용 약학적 조성물이 개시된다. 본 발명의 핵산 운반체는 적당한 잔기수의 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 핵산 운반체는 여러가지 치료 유전자와 안전, 또한 면역원성이 극히 낮은 복합체 (본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물) 를 형성하여, 여러가지 수단에 의하여 상기 치료 유전자를 세포에 효율적, 안전하게, 도입가능하게 하며, 이 세포내에서 상기 유전자의 높은 유전자 발현을 가능하게 한다.

Description

핵산 운반체 및 유전자 치료용 약학적 조성물{NUCLEIC ACID TRANSPORTERS AND MEDICINAL COMPOSITIONS FOR GENE THERAPY}

유전자 치료란 약제로서 작용하는 외래유전자 (이하, 「치료 유전자」라 한다) 를 체내에 도입하여 발현시킴으로써 질환의 치료를 행하는 완전히 새로운 치료방법이다. 유전자 치료에 의하여 치료효과를 기대할 수 있는 질환은 선천성, 후천성을 불문하고 유전자의 이상이 원인으로 증상이 발생하는 질환 모두가 포함되는데, 특히 치사적이며 또한 치료법이 확립되어 있지 않은 암이나 AIDS 에 대해서는 매우 유용성이 높은 치료방법이라 여겨지고 있다. 유전자 치료는 이상 (원인) 유전자를 그대로 하고, 새로운 (정상) 유전자를 부가하는 부가유전자요법 (Augmentation Gene Therapy) 과 이상유전자를 정상유전자로 치환하는 치환유전자요법 (Replacement Therapy) 으로 크게 구분된다.

유전자 치료의 임상응용으로는 1989 년 미국에서 처음으로 유전자 치료의 임상시험이 행해진 이래, 이미 이탈리아, 네덜란드, 프랑스, 영국, 중국에서도 임상시험이 개시되어 있다. 그러나, 유전자 치료의 임상응용에 있어서, 치료 유전자를 효율적이고 안전하게 표적세포에 도입하기 위한 최적의 유전자의 형태나 방법의 개발이 큰 기술적 과제중 하나가 되어 있다. 1980 년대 초기에는 마이크로인젝션 등, 물리적 수법의 응용이 시도되었으나, 질환치료를 위해 필요한 치료 유전자를 안정하고 효율적으로 도입할 수 없어, 임상응용에는 이르지 못하였다. 그 후, 치료 유전자를 효율적으로 세포에 도입하기 위한 담체가 되는 재조합 바이러스 (바이러스 벡터) 가 개발되어, 최초로 유전자 치료의 임상응용이 가능하게 되었다.

현재 가장 주목받고 있는 바이러스 벡터는 마우스 백혈병 바이러스 (Molony Murine Leukemia Virus : 이하, MoMLV) 유래의 레트로바이러스 벡터이며, 본 바이러스의 생활환(環)의 이점을 이용한 것이다. 레트로 바이러스는 숙주에 감염후, 자기 유전정보를 게놈 DNA 에 주입시키는 성질을 가지므로 (Miller D.G. et al., Mol. Cell. Biol., 10, 4293, 1990), 치료 유전자를 지속적으로 발현시키기 위해서는 적합하다. 또한, 여러가지 세포종에 감염가능하므로, 이들 다수 종류의 세포가 MoMLV 벡터를 이용한 치료의 대상이 될 수 있다. 한편, 이 성질은 바이러스 벡터의 생체로의 투여를 불가능하게 하고 있다. 숙주범위가 넓다는 것은 바꿔 말하면, 생체에 투여하였을 때 표적세포로의 집적성이 부족하다는 것이며, 치료효과나 부작용의 점에서 정맥내 투여법 등의 전신성 투여법은 행할 수 없다. 따라서, 현재의 치료법은 표적세포를 생체로부터 한 번 분리하고, 시험관내에서 유전자 도입을 행한 후, 다시 생체로 되돌리는 치료법 (US5399346) 이 행해지고 있다 (ex vivo 유전자 도입법). 이 방법은 표적세포에 대하여 확실히 치료 유전자를 도입할 수 있어 치료효과도 기대할 수 있으나, 바이러스 벡터를 취급하기 위한 특수한 설비나 세포를 대량으로 배양하는 설비를 필요로 하므로, 이와 같은 치료를 실시할 수 있는 시설은 한정되어 버린다.

이상과 같은 이유에서, in vivo 에서도 유전자 도입이 가능한 벡터의 개발이 요망되고 있다. 또한, 바이러스 벡터를 안정적으로 생산시키기 위해서는 바이러스 벡터 산생세포에 의한 생산이 효율적이기는 하나, 현재 개발되고 있는 바이러스 벡터 산생세포 (Miller A.D. and Buttlmore C., Mol. Cell. Biol., 6,2895, 1986) 에서는 치료에 필요한 양의 바이러스 벡터를 생산하기 위해서는 대량의 세포를 배양할 필요가 있으며, 일반적인 약제의 생산원가에 비하여 매우 고가가 되어 버린다는 결점도 있다. 또한, 바이러스 벡터를 사용하는 경우에 있어서는 면역원성이 높기 때문에 반복투여가 불가능한 (특히, 아데노바이러스 벡터) 점이나, 치료 유전자의 사이즈에 제한이 있다는 결점도 있다.

한편, 이와 같은 바이러스 벡터를 대신하는 유전자 도입을 위한 담체로서, 합성폴리아미노산을 이용하여 이 합성폴리아미노산에 송달해야 할 약제를 결합시켜, 목적 세포 또는 세포내로 송달하고자 하는 시도도 동시에 이루어지고 있다. WO79/00515 및 US5162505 에는 폴리아미노산과 송달해야 할 약제 (뉴클레오티드류연체, 효소 등) 를 공유결합시킨 복합체가 개시되어 있다. 그러나, 이들은 모두 폴리아미노산과 약제를 유지하는 수단의 공유결합이며, 세포내에 도입되었을 때 담체와 약제의 유리 (분리) 가 필요한 경우에는 바람직하지 않다. 또한, Wu 외 (G.Y.Wu and C.H.Wu, Advanced Drug Delivery Reviews, 12, 159, 1993) 는 폴리아미노산, 특히 폴리리신을 유전자의 담체로서 폴리아미노산/유전자복합체를 조제하여, 이를 세포에 작용시킴으로써 유전자를 도입하여 발현시키는 데 성공하였다. 그러나, 폴리아미노산, 특히 폴리리신을 담체로 한 복합체는 농도의 증가와 함께 침전을 발생시키기 쉬워, 실제의 질환의 치료에 대해서는 사용이 어렵다. 특히 정맥내로 침전을 발생시키는 입자를 포함하는 약액을 투여하는 것은 혈관의 색전이나 혈전 등을 일으키는 원인이 되며, 또한 국소적으로 투여되는 경우에도 주사바늘의 막힘 문제나, 표적세포에 대하여 치료를 하기 위하여 필요한 양의 유전자를 도입할 수 없는 등의 문제가 있다.

그래서, 침전을 발생시키는 일 없이 치료 유전자와 복합체를 형성할 수 있는 핵산 운반체 (담체) 로서 WO95/09009 에 있어서 폴리리신과 세린랜덤공중합체에 관하여 개시되어 있다. 그러나, 실제의 생체로의 투여, 안전성이 명확히 개시되어 있지 않다.

S.Ferrari 외 (Gene Therapy, 4, 1100, 1997) 는 폴리에틸렌이민이 효율적으로 유전자를 도입하는 것을 보고하고 있다. 그러나, 폴리에틸렌이민은 본래 생체에 존재하지 않는 물질이므로 생체로의 투여는 어렵다.

또한, 일본 공개특허공보 평9-173067 호는 1 내지 20 개의 양이온성 아미노산에 지방산을 부가한 리포펩티드를 유전자 도입에 사용하고 있으며, 이 지방산에 부가하는 아미노산으로는 리신, 오르니틴, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산 중에서 디아미노부티르산이 가장 효과적이라 보고하고 있다. 그러나, 이 공보에서는 디아미노부티르산에 C10-14 의 지방족 아실기를 부가한 담체와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 리포솜을 동시에 배양세포에 투여한 것만을 개시하고 있어, 실용성이 부족하고 또한 디아민부티르산을 포함하는 담체와 리포솜을 동시에 이용하는 점에서 조작이 번잡하여 원가가 높아지는 등의 문제가 발생한다.

따라서 현재, 생체내에 안전하게 효율적으로 도입할 수 있고, 게다가 치료 유전자의 효과를 충분히 발현할 수 있는 핵산 운반체 및 그것을 이용한 유전자 치료용 약학적 조성물의 연구개발이 강하게 요망되고 있다.

본 발명은 세포에 치료 유전자를 도입하기 위한 핵산 운반체 및 이 핵산 운반체와 치료 유전자를 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 핵산 운반체와 이 핵산 운반체와 상호작용하는 핵산 및/또는 뉴클레오티드 유도체로 이루어지는 치료 유전자를 세포내에 효율적이고 안전하게 도입할 수 있고, 또한 기대되는 효과를 가지며, 게다가 장기간 그 효과를 발현시킬 수 있는 유전자 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

도 1 은 본 발명의 핵산 운반체의 합성경로의 1 예를 나타내는 도이다.

도 2 는 실시예 2 에서 측정한, 발현한 루시페라아제의 활성측정결과를 나타낸다. 도중, 12, 26, 49, 62, 170, 348 은 각각 표 2 의 합성예 1, 2, 3, 4, 5, 7 에서 얻어진 MW (분자량) 1,900, 4,200, 7,800, 9,900, 27,200, 55,700 의 pDBA 를 나타낸다.

도 3 은 실시예 3 에서 측정한, 발현한 루시페라아제의 활성측정결과를 나타낸다. 도중, pDBA 는 표 2 의 합성예 3 에서 얻어진 것으로, pDBApeg 는 합성예 8 에서 얻어진 것이다.

도 4 는 실시예 4 에서 측정한, 발현한 루시페라아제의 활성측정결과를 나타내는 도이다. 도중, non-T.f. 는 트랜스펙션되지 않음 (non-transfection) 을 나타낸다. 또한, 12, 26, 49, 62, 170 은 각각 표 2 의 합성예 1, 2, 3, 4, 5 에서 얻어진 MW (분자량) 1,900, 4,200, 7,800, 9,900, 27,200 의 pDBA 를 나타낸다.

도 5 는 실시예 5 에서 얻어진 결과를 나타낸 도이다. 도 5A 는 2 일후의 결과를 , 도 5B 는 21 일후의 결과를 나타낸다. 도중, pDBA-49 는 표 2 의 합성예 3 에서 얻어진 것을 나타낸다.

도 6 은 실시예 6 에서 얻어진 결과를 나타내는 도이다.

도 7 은 실시예 7 에서 얻어진 결과를 나타낸 도이다. 도중, 12, 26, 49, 62, 170 은 각각 표 2 의 합성예 1, 2, 3, 4, 5 에서 얻어진 MW (분자량) 1,900, 4,200, 7,800, 9,900, 27,200 의 pDBA 를 나타낸다.

도 8 은 실시예 8 에서 얻어진 결과를 나타낸 도이다. 도중, pDBA 는 표 2 의 합성예 3 에서 얻은 것을 나타낸다.

도 9 는 실시예 10 에서 얻어진 정맥내 투여후 1 시간까지 발현하는 증상을 관찰한 결과를 나타내는 도이다.

도 10 은 실시예 10 에서 얻어진 정맥내 투여의 30 분후에 피부에 나타난 색소반점의 직경을 측정한 결과를 나타내는 도이다.

도 11 은 실시예 11 에서 얻어진 플로우사이트미터로 측정한 결과를 나타내는 도이다. 도 11A 는 콘트롤로서의 FITC Oligo 만을 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 또한, 도 11B 는 FITC Oligo 와 pDBA#49 (표 2 의 합성예 3 에서 얻어진 MW (7,800) 의 것) 을 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 11C 는 FITC Oligo 와 pDBA#170 (표 2 의 합성예 5 에서 얻어진 MW (27,200) 의 것) 을 이용한 경우의 결과를 나타낸다.

도 12 는 실시예 11 에서 얻어진, 도입된 세포의 비율을 평가한 결과를 나타내는 도이다. 도중, 12, 49, 170 은 각각 표 2 의 합성예 1, 3, 5 에서 얻어진 MW (분자량) 1,900, 7,800, 27,200 의 pDBA 를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

(핵산 운반체의 구조)

본 발명의 핵산 운반체가 갖는 구조는 디아미노부티르산으로 이루어지는 폴리펩티드이며, 화학식 1 로 표시되는 (여기서, n 은 자연수를 나타낸다) 구조를 포함하는 것이다.

또한, 본 발명의 핵산 운반체가 갖는 다른 구조는 디아미노부티르산의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 폴리펩티드이며, 화학식 2 로 표시되는 (여기서, n 은 자연수를 나타낸다) 구조를 포함하는 것이다.

또한, 본 발명의 핵산 운반체는 상기 2 개의 구조를 임의의 비율로 포함하는 구조이어도 된다. 즉, 임의의 비율로 디아미노부티르산 또는 그 염의 형태로 존재하는 것도 포함된다.

또한, 상기 디아미노부티르산은 광학이성체인 D 체 및 L 체가 존재가능한데, 본 발명의 핵산 운반체는 D 체 또는 L 체, 또는 그들의 임의로 혼합된 폴리펩티드도 포함하는 것이다. 즉, 폴리-L-디아미노부티르산, 폴리-D-디아미노부티르산, 및 폴리-DL-디아미노부티르산 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드면 된다.

본 발명과 관련되는 핵산 운반체의 잔기란 이 폴리펩티드를 형성하는 단량체인 디아미노부티르산 (또는 그 염) 기를 의미하며, 잔기수란 그들의 분자수를 의미하는 것으로 한다 (상기식의 n 으로 표시된다). 본 발명과 관련되는 핵산 운반체의 바람직한 잔기수는 적어도 10 잔기 이상이다. 더욱 바람직하게는 적어도 20 잔기 이상이며, 가장 바람직하게는 25 잔기 이상이다. 또한, 본 발명과 관련되는 핵산 운반체의 바람직한 잔기수는 280 잔기 이하가 바람직하다. 또한,더욱 바람직하게는 250 잔기 이하이다. 잔기수가 너무 많은 경우는 합성이 어려워지며, 또한 취급이 불편해 진다. 또한, 너무 잔기수가 적으면 핵산 운반체로서는 성능이 불충분해진다. 또한, 바람직한 잔기수는 사용하는 치료 유전자에 따라서, 또는 동시에 사용될 수 있는 성분의 성질 등으로부터, 당업자라면 용이하게 최적으로 선택할 수 있다.

디아미노부티르산염으로는 의학적으로 허용가능한 염이면 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는 염산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산염, 초산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 옥살산, 호박산, 주석산, 말론산, 푸말산, 사과산 등의 유기산염을 들 수 있으며, 이 중에서도 특히 초산염이 바람직하다. 또한, 핵산 운반체인 폴리펩티드를 폴리디아미노부티르산·초산염으로 하면 디아미노부티르산·초산염은 분자량 160 이므로, 상기 잔기수를 분자량으로 나타내는 것도 가능하다.

본 발명의 핵산 운반체의 다른 형태는 상기 설명한 디아미노부티르산으로 이루어지는 폴리펩티드에, 추가로 폴리에틸렌글리콜을 결합시킨 블록공중합체구조를 갖는 것이 포함되며, 화학식 3 으로 표시된다 (여기서, n, m 은 각각 자연수를 나타낸다).

또한, 상기 폴리펩티드가 카르복실산기를 한 개 가지므로, 상기 블록공중합체구조를 갖는 것에는 화학식 4 로 표시되는 공중합체도 가능하다 (여기서, n, n', m 은 각각 자연수를 나타낸다).

여기서 에틸글리콜의 분자량 (또는 수 m) 에 관해서는 특별히 한정은 없으나, 후술하는 이유에서 통상적으로는 200 내지 25,000 정도인 것이 바람직하다.

(핵산 운반체의 합성방법)

상기 설명한 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 본 발명의 핵산 운반체의 합성방법에 관해서는 특별히 한정은 없으며, 통상 공지의 여러가지 폴리펩티드 합성방법 (신실험화학강좌 19 고분자화학Ⅰ 1980 년 발행, 마루젠가부시키가이샤) 을 포함하는 유기화학반응을 바람직하게 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 있어서는 단량체성분을 적당한 반응에 의하여 중합하여 핵산 운반체를 얻는 것이 바람직하다. 이 경우, 사용하는 단량체로는 디아미노부티르산, γ아미노기에 보호기가 도입된 디아미노부티르산, 또는 펩티드기 형성을 위하여 활성화된 아미노기 및/또는 카르복실산기를 갖는 디아미노부티르산을 바람직하게 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 있어서는 γ아미노기를 보호하고, 또한 펩티드 결합형성을 용이하게 하기 위하여 디아미노부티르산을 산무수물화하는 것이 바람직하다 (신실험화학강좌 19 고분자화학Ⅰ 1980 년 발행, 마루젠가부시키가이샤).

관련 단량체를 중합하려면, 여러 종류, 적당한 양의 개시제를 사용하는 것이 가능하다. 구체적으로는 여러가지 아민화합물, 알코올화합물이 사용가능하다. 상기 아민화합물에는 알킬아민류를 들 수 있으며, 특히 부틸아민이 바람직하다. 또한, 알코올류로서 폴리에틸렌글리콜류를 사용하면, 폴리에틸렌글리콜기가 부가된 본 발명의 핵산 운반체가 얻어진다.

본 발명과 관련되는 폴리펩티드의 합성에 특히 바람직한 합성경로를 도 1 에 예시하였다. 즉, γ아미노기를 적당한 보호기로 보호하고, 또한 아미노산 부분을 포스겐을 이용하여 산무수물로 하여 축중합의 단량체 (도 1 의 (10)) 로서 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 이 단량체를 사용함으로써, 축중합반응은 적당한 개시제를 이용할 수 있게 되어 바람직한 수의 단량체수를 도입할 수 있게 된다. 개시제에는 특별히 제한은 없으나, 여러가지 아민화합물이 바람직하며, 특히 부틸아민의 사용이 바람직하다. 또한, 적당한 에틸렌글리콜류를 개시제에 사용함으로써, 마찬가지로 바람직한 수의 단량체를 갖는 폴리펩티드이며, 또한 에틸렌글리콜기를 갖는 블록공중합체를 얻을 수 있게 된다. 구체적으로는 Helv. Chim. Acta. 43, 270 (1960) 또는 「신실험화학강좌 19 고분자화학Ⅰ 1980 년 발행, 마루젠가부시키가이샤」에 기재된 방법에 따르거나 준하여 행할 수 있다.

(핵산 운반체의 검출)

본 발명의 핵산 운반체의 구조는 이미 설명한 바와 같은 특징을 갖는 것이다. 따라서 관련 구조상의 특징에 기초하여 본 발명과 관련되는 핵산 운반체를 검출할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 핵산 운반체, 또는 그것을 이용한 유전자 치료용 약학적 조성물이 여러가지 사용형태로 사용되고 있는 경우에 있어서도, 적당한 전처리를 함으로써 마찬가지로 본 발명과 관련되는 핵산 운반체를 검출할 수 있게 된다. 당업자가 필요간 전처리를 선택하는 것은 용이하다.

검출방법에 관해서도 특별히 제한은 없으며, 여러가지 통상 공지의 폴리펩티드 분석방법 (J. Controlled Release 54, 39-48, 1998) 을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 펩티드의 아미노산 분석방법에 의한 디아미노부티르산의 정성 및 정량분석, 여러가지 액체 크로마토그래피를 이용한 분자량 측정에 의한 잔기수의 결정, 폴리에틸렌글리콜기의 존재를 검출하는 여러가지 스펙트럼분석 (적외선흡수 스펙트럼, 핵자기공명흡수 스펙트럼), 질량분석 또는 화학적인 정성분석방법을 사용할 수 있다.

(유전자 치료용 약학적 조성물, 치료 유전자)

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 상기 설명한 본 발명의 핵산 운반체와 치료 유전자를 적어도 포함하는 것이다. 여기서 치료 유전자란 이하에 설명하는 여러가지 핵산 및/또는 뉴클레오티드 유도체를 의미한다.

핵산 운반체와 치료 유전자는 여러가지 비로 복합체를 형성하여 유전자 치료용 약학적 조성물로서 제조할 수 있는데, 치료 유전자/핵산 운반체 (중량(w)/중량(w)) 가 2/1 내지 1/50 의 범위이면 유효한 효과를 얻을 수 있으며, 더욱 바람직하게는 치료 유전자/핵산 운반체 (w/w) 가 1/1 내지 1/30 의 범위에서혼합됨으로써 더욱 유효한 효과를 얻을 수 있다. 치료 유전자/핵산 운반체 (w/w) 의 비가 1/50 이상이면 치료 유전자와의 복합체에 관여하지 않는 유리된 핵산 운반체의 양이 증가하여 바람직하지 않으며, 2/1 이하에서는 도입되어야 할 세포의 세포표면과의 친화성이 저하됨으로 인한 치료 유전자 도입효율의 저하가 일어나기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명의 핵산 운반체는 정의 전하를 가질수 있으므로, 주로 부의 전하를 갖는 치료 유전자 (예를 들면, 핵산) 를 정전적 결합에 의하여 유지할 수 있다. 따라서, 목적의 세포 또는 세포내로 운반된 후에, 이 치료 유전자를 효과적으로 유리시켜, 치료 유전자를 발현시킬 수 있게 된다. 이와 같은 작용은 치료 유전자/핵산 운반체의 전하비를 적절히 선택함으로써 제어할 수 있게 된다. 본 발명에 있어서는 예를 들면, 1/1 내지 1/40 의 범위로 함으로써 더 높은 효과가 얻어진다. 전하비가 1/1 이하에서는 세포표면과의 친화성이 저하됨으로 인한 치료 유전자 도입효율의 저하가 일어나며, 1/40 이상에서는 치료 유전자와의 복합체에 관여하지 않는 유리된 핵산 운반체의 양이 증가하여 바람직하지 않다.

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물에 의하여 세포내로 도입될 수 있는 치료 유전자의 핵산 및/또는 뉴클레오티드 유도체의 종류, 분자량, 형상, 코딩되는 유전자의 서열 등에는 특별히 제한은 없다. 구체적으로는 핵산의 분자량은 20 염기 정도의 올리고뉴클레오티드에서 수십킬로 염기의 코스미드 유전자까지 특별히 제한은 없다. 핵산의 형상은 1 중쇄 유전자, 2 중쇄 유전자, 3 중쇄형성 유전자, DNA, RNA, DNA/RNA 키메라형 유전자, 포스포로티오에이트형 유전자, 직쇄상 유전자, 환상 유전자 등 제한없이 이용할 수 있다. 코딩되는 유전자의 서열은 치료 유전자 외에, 치료 유전자를 전사하기 위한 프로모터나 인핸서, 폴리A 시그널, 유전자가 도입된 세포의 표식 및/또는 선별을 위한 마커 유전자, 세포의 게놈 DNA 서열내에 효율적으로 유전자를 삽입하기 위한 바이러스 유래의 유전자 서열, 약제로서 작용하는 물질을 세포밖으로 분비 및/또는 세포내의 국소에 체류시키기 위한 시그널 서열 등, 어떠한 서열에서도 이용할 수 있다.

치료 유전자는 질환에 대응하는 유전자, 즉 질환에 대하여 길항적으로 작용하는 유전자나 질환에 있어서의 결여를 보충하는 유전자가 이용된다. 예를 들면, 염증성질환에 대해서는 SOD, 항염증성 싸이토카인류, 세포접착인자에 길항적으로 작용하는 펩티드를 코딩하는 유전자, 효소결손증에 대해서는 정상의 효소를 코딩하는 유전자, 수용체결손증에 대해서는 정상의 수용체를 코딩하는 유전자, 바이러스 감염증에 대해서는 바이러스 감염세포를 살상하기 위한 티미딘키나제, 디프테리아톡신 등의 독소를 코딩하는 유전자나 바이러스의 복제 등을 저해하는 안티센스, 트리플헬릭스, 리보자임, 데코이, 트랜스도미넌트뮤턴트 등을 코딩하는 유전자, 암에 대해서는 암세포를 살상하기 위한 티미딘키나제, 디프테리아톡신 등의 독소를 코딩하는 유전자나 암유전자를 불활성화하기 위한 안티센스, 리보자임, 트리플헬릭스 등을 코딩하는 유전자나 암세포를 정상화하기 위한 p 53 등의 암억제유전자, 항암제에 대한 다제내성에 관여하는 유전자를 불활성화하기 위한 안티센스, 트리플헬릭스, 리보자임 등을 코딩하는 유전자, 가족성 고콜레스테롤혈증에 대해서는 LDL 리셉터를 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다.

또한, 치료 유전자에 이용되는 발현 카세트는 표적세포내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 것이면, 특별히 제한되는 것 없이 어느 것이라도 이용할 수 있다. 당업자는 그와 같은 발현 카세트를 용이하게 선택할 수 있다. 바람직하게는 동물 유래의 세포내에서 유전자 발현이 가능한 발현 카세트이며, 더욱 바람직하게는 포유류 유래의 세포내에서 유전자 발현이 가능한 발현 카세트이며, 특히 바람직하게는 인간 유래의 세포내에서 유전자 발현이 가능한 발현 카세트이다. 발현 카세트에 이용되는 유전자 프로모터는, 예를 들면 아데노바이러스, 싸이토메갈로바이러스, 인간면역부전바이러스, 시미안바이러스40, 라우스육종바이러스, 단순헤르페스바이러스, 마우스백혈병바이러스, 신비스바이러스, 센다이바이러스, A형간염 바이러스, B형간염 바이러스, C형간염 바이러스, 파필로마바이러스, 인간T세포 백혈병 바이러스, 인플루엔자바이러스, 일본뇌염바이러스, JC바이러스, 파르보바이러스B19, 폴리오바이러스 등의 바이러스 유래의 프로모터, 알부민이나 열쇼크단백질 등의 포유류 유래의 프로모터, CAG 프로모터 등의 키메라형 프로모터 등을 포함한다.

치료 유전자에 의하여 코딩된 약제를 세포밖으로 분비 및/또는 세포내의 국소에 체류시키기 위한 시그널 서열로는, 세포밖으로의 분비를 보조하는 인터로이킨2 유래의 시그널펩티드 (고마다후사오, 니혼야쿠가쿠카이 제 115 년회 강연요지집 4, 12, 1995) 나 핵국재화를 촉진하는 아데노바이러스 E1a 유래의 펩티드, 폴리오머 바이러스 라지T 항원 유래의 펩티드, SV40 라지T 항원 유래의 펩티드, 뉴클레오플라스민 유래의 펩티드, HTLV1p24 전사후 조절단백질 유래의 펩티드(Kalderon, D., et al., Cell, 39, 499, 1984) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 예를 들면, 상기에 나타내는 바와 같은 치료용으로 디자인된 치료 유전자와 핵산 운반체를 혼합함으로써 조제된다. 더욱 구체적으로 말하면, 핵산 운반체와 치료용으로 디자인된 치료 유전자를 각각 물, 생리식염수, 등장화한 완충액 등의 적당한 용매에 용해한 후, 혼화하고 10 분내지 30 분 방치함으로써 조제할 수 있다. 이 때 이용되는 치료 유전자를 구성하는 핵산과 핵산 운반체의 비는 한정되는 것은 아니나, 이 핵산 1 ㎍ 에 대하여 약 0.5~50 ㎍, 바람직하게는 약 1~30 ㎍ 의 핵산 운반체를 사용한다.

(유전자 치료용 약학적 조성물의 사용방법)

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 먼저 환자로부터 표적세포를 체외로 채출하고, 목적으로 하는 치료 유전자를 도입한 후에 다시 그 세포를 환자의 체내로 되돌리는 자가이식에 의한 유전자치료 (ex vivo 유전자치료) 에 사용가능하다. 또한, 치료 유전자를 직접 환자에게 투여하는 유전자치료 (in vivo 유전자치료) 에도 사용가능하다.

유전자치료의 방법으로서, 이상 (원인) 유전자를 그대로 하고 새로운 (정상) 유전자를 부가하는 방법 (Augmentation Gene Therapy) 과 이상유전자를 정상유전자로 치환하는 방법 (Replacement Gene Therapy) 으로 크게 구별할 수 있는데, 본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 어느 쪽에도 사용가능하다.

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물의 생체로의 투여방법에 관해서는 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 비경구적 투여, 예컨대 주사투여함으로써 바람직하게 실시할 수 있다.

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물의 용량은 그 사용방법, 사용목적 등에 따라 달라지며, 당업자는 용이하게 적절히 선택, 최적화할 수 있다. 예를 들면, 주사투여하여 사용하는 경우에는 1 일량 약 0.1 ㎍/kg~1000 mg/kg 을 투여하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1 일량 약 1 ㎍/kg~100 mg/kg 이다.

본 발명의 핵산 운반체는 치료 유전자와의 복합체 형성시, 침전생성을 발생시키지 않는다. 따라서, 혈관에 직접 유전자 치료용 약학적 조성물을 투여해도 혈전을 일으킬 위험성은 없으며, 효율적으로 정밀도 높게 치료 유전자를 투여할 수 있게 된다.

본 발명의 핵산 운반체 및 유전자 치료용 약학적 조성물은 치료 유전자를 생체내에 투여한 경우에 통상 인정되는 항원성을 발생시키지 않는다. 따라서, 생체에서의 치료효과를 유지하기 위하여 일정기간을 두고 반복투여할 수 있게 된다.

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 생체내의 조직, 예를 들면 신장, 비장, 폐, 기관지, 심장, 간장, 뇌, 신경, 근육, 골수, 소장, 결장, 대장, 피부, 혈관내피 등에 대하여 우수한 효과를 갖는다. 특히, 전신투여, 예를 들면 정맥투여한 경우에는 간장에 특이적으로 흡수된다. 따라서, 특히 간장에 안전하게, 또한 효과적으로 치료 유전자를 발현시킬 수 있게 된다.

또한, 효과적인 조직특이적 흡수를 목적으로 하는 경우는 조직특이적 리간드를 핵산 운반체에 결합시키는 것도 가능하다. 예를 들면, 간장을 표적으로 하는 경우는 당류 (갈락토스, 락토스, 아시알로글리코프로테인, 올릭고갈락토스, 히알루론산 등) 를 핵산 운반체에 결합시켜 간장에 대한 친화성을 상승시켜, 보다 효과적으로 할 수 있다. 또한, 세포독성의 경감, 혈중체류, 용매로의 한층 더 높은 용해성의 향상을 목적으로 하여 이 핵산 운반체중의 디아미노부티르산과 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 에 의하여 블록공중합체를 형성하여 수식을 하는 것도 가능하다 (합성방법은 이미 설명하였다). 그 경우, PEG 의 분자량은 200 이상의 것을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 1000 이상의 것이다. 또한, PEG 의 분자량은 25,000 이하인 것이 바람직하나, 더욱 바람직하게는 10,000 이하이며, 가장 바람직하게는 5,000 이하이다. 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 25,000 이상에서는 세포표면과 친화성이 저하됨으로 인한 핵산도입효율의 저하가 일어나며, 200 이하에서는 목적으로 하는 폴리에틸렌글리콜에 의한 효과가 작아져 바람직하지 않다.

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 전신투여한 후, 생체의 새포내에서 치료 유전자 발현을 장기간 계속시킬 수 있는 것이다. 구체적으로는 50 일 이상, 약 210 일에 걸쳐 발현시키는 것도 가능하다. 이 지속시간은 또한 본 발명의 핵산 운반체를 적절히 선택함으로써 조정가능하게 된다. 따라서, 투여가 용이하게 될 뿐만 아니라, 환자의 투여시의 부담을 감소시킨다는 점에서 매우 유익하다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 세포에 치료 유전자를 효율적이고 안전하게 도입하기 위한 핵산 운반체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 세포에 치료 유전자를 효율적이고 안전하게 도입하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는 상기 과제해결을 위한 예의 연구를 거듭한 결과, 치료 유전자를 운반하기 위한 핵산 운반체로서 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 담체를 이용하면 치료 유전자를 세포내에 효율적이고 안전하게 도입할 수 있으며, 또한 도입한 유전자의 핵산 등의 기능을 장기간에 걸쳐 발현시킴을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 여기서 「안전하게」란 불용성 침전을발생시키지 않는 것 및 항원성이 낮은 것 등을 의미한다.

구체적으로는, 본 발명은 염기성 아미노산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 핵산 운반체를 제공한다.

또한, 본 발명은 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 핵산 운반체를 제공한다.

또한, 본 발명은 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 폴리펩티드와 폴리에틸렌글리콜과의 블록공중합체를 포함하는 핵산 운반체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 잔기수 20 이상 280 이하인 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 상기 핵산 운반체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기중 어느 하나의 핵산 운반체와 치료 유전자를 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 전신투여한 경우, 간장에 특이적으로 치료 유전자를 발현시킬 수 있는 상기 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에 따르면, 전신투여한 경우에 양호한 지속성을 유지하는 유전자 치료용 약학적 조성물에 관계되는 것으로, 특히 상기 지속성이 적어도 50 일 이상, 약 210 일까지 계속되는 것을 특징으로 하는 상기 유전자 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명은 상기 치료 유전자가 여러가지 핵산 (천연물 유래의 것, 화학합성된 것도 포함) 또는 여러가지 뉴클레오티드 유도체 (그들의 화학적으로 수식된 유도체도 포함) 인 것을 특징으로 하는 상기 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 유도체가 안티센스 또는 TFO (Triplex Forming Oligonucleotide) 인 것을 특징으로 하는 상기 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 치료용 약학적 조성물이며, 또한 면역원성이 낮은 것을 특징으로 하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 필요하다면 다른 성분을 추가로 포함해도 된다.

또한, 본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물은 효과적이고 조직특이적인 흡수를 목적으로 하며, 이 조직을 특이적으로 인식가능하게 하는 여러 리간드가 결합된 핵산 운반체를 포함해도 된다.

이하의 실시예에 있어서 이용한 핵산 운반체의 합성은 K. Vogeler 외의 방법(Helv. Chim. Acta, 43, 270 (1960)) 에 준하여 행하였다. 그 합성경로를 도 1 에 나타내었다.

본 명세서에 있어서는 폴리-디아미노부티르산 (Poly(2,4-diaminobutyric acid) 및 폴리-디아미노부티르산 초산염을 pDBA 라 약칭한다. 또한, pDBA 에는 가능한 모든 광학이성체에 기초하는 것도 포함하는 것으로 한다. 또한, 폴리에틸렌글리콜과의 블록공중합체를 마찬가지로 pDBApeg (또는 pDBA-PEG) 라 약칭한다.

(실시예 1) 핵산 운반체의 합성

(1) 단량체로서의 Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 NCA (4N-Carbobenzoxy-DL-2,4-diaminobutyric acid N-carboxy-anhydride (10) 의 합성.

(Ⅰ-1) Nγ카르보벤족시-DL-디아미노부티르산

(4N-Carbobenzoxy-DL-2,4-Diaminobutyric acid) (8) 의 합성:

DL-2,4-디아미노부티르산 2 염산염 (DL-2,4-Diamino-n-butyric acid Dihydrochloride) (1) 15 g (시그마사 제조) 을 물 75 ㎖ 에 용해하고, 이것에 염기성 탄산구리 (2) 11.7 g 을 첨가하여 방치후, 자비(煮沸)환류한 후 여과하였다. 여액에 탄산수소나트륨 16.6 g, 카르보벤족시클로리드 (4) (와코준야쿠사 제조) 17.8 ㎖ 를 첨가하여 교반하여, 생성물을 침전으로서 얻었다. 얻어진 생성물을 여과하고, 아세톤 및 디에틸에테르로 세척한 후 건조하여 15 g 의 Nγ카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 구리 착체 (4N-Carbobenzoxy-DL-2,4-Diaminobutyric acid Copper Complex; 이하 Dba(Z)-Cu 라 한다) (5) 를 얻었다.

상기 얻어진 착체 (5) 11 g 을 35 % HCl 9.3 ㎖, 물 22 ㎖, 메탄올 11 ㎖ 의혼합액에 넣고, 황화수소 (H₂S) 가스의 존재하에서 교반하였다. 실온에 정치후, 과잉 황화수소를 제거한 후 여과에 의하여 불용물을 제거하였다. 여액은 감압하고 물과 메탄올을 첨가하여 냉각하였다. 또한, 메탄올을 첨가한 후, 디에틸아민 (7) (Diethylamine) 을 첨가하여 용액의 pH 를 7 로 조정하였다. 석출한 결정을 여과하여 분리하고, 디에틸에테르를 이용하여 깔때기상에서 세척 및 건조하여, 백색의 결정으로서 4 g 의 생성물을 얻었다. 또한, 상기 여액을 농축하여 냉각함으로써 석출한 결정을 여과하여 분리하고, 디에틸에테르를 이용하여 깔때기상에서 세척 및 건조하여, 백색결정으로서 1.5 g 의 생성물을 얻었다. 이들을 합하여 합계 5.5 g (원료 아미노산에서 계산하여 수율 31 %) 의 Nγ카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 (8) 을 얻었다.

(Ⅰ-2) Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 NCA

(4N-Carbobenzoxy-DL-2,4-diaminobutyric acid N-carboxy-anhydride (10) 의 합성:

상기에서 얻어진 (8) 의 5 g 을 테트라히드로푸란 (THF) 200 ㎖ 에 용해하고, 거기에 트리포스겐 (9) (Triphosgene, Bis (tricholoromethyl) carbonate, Aldrich 사 제조) 4.5 g 을 40 ㎖ 의 THF 에 용해한 것을 첨가하고, 또한 40 ℃ 에서 60 분 교반하였다. 감압으로 용매를 제거한 후, 얻어진 조생성물에 헥산을 첨가하여 용해한 후 냉각하였다. 다시 감압으로 충분히 헥산을 제거한 후, 얻어진 조생성물에 초산에틸을 첨가하여 용해하고, 불용물을 여과하여 제거하였다.얻어진 여액에 헥산을 첨가하여 냉각함으로써 생성물이 백색결정으로 침전하였다. 석출한 결정을 여과하여 분리하고, 감압으로 건조하였다. 또한, 상기 여액도 감압농축한 후, 동일하게 처리하여 생성물을 결정으로서 얻었다. 이들 얻어진 결정을 디에틸에테르로부터 재결정함으로써 정제된 생성물 (10) 이 2.7 g (수율 50 %) 얻어졌다.

(Ⅱ) 중합반응.

여러가지 잔기수의 핵산 운반체는 상기에서 얻어진 Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 NCA (10) 을 여러가지 비율의 개시제를 이용하여 축중합시키고, 그 후 아미노기의 보호기를 탈보호함으로써 얻어졌다.

여기서, 본 발명에 있어서의 잔기수란 이하의 식 (Arieh Yaron 외, Biochim. Biophys. Acta, 69, 397-399, 1963) 으로 산출한 것을 의미한다 (마지막에 0.9 를 곱하는 이유는 보호기를 제거하는 반응조건에서 약 10 % 분자량이 저하되는 것에 기인한다). 또한, 본 발명에 있어서의 분자량은 이하의 식으로 표시되는 것을 의미한다.

잔기수=중합도 (n)=[Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 NCA (10) 의 양 (몰수)/개시제의 양 (몰수)]×수율(%)/100×0.9

분자량=n (중합도)×잔기량 (초산염으로서, DBA 초산염의 잔기량=160)

이하, 표 1, 표 2 의 합성예 3 (잔기수 49) 폴리-DL-디아미노부티르산 (Poly(DL-2,4-diaminobutyric acid) 및 그 초산염의 합성예를 나타내었는데, 표 1 에 나타내는 이외의 조건을 이용하여 동일하게 합성예 1 (잔기수 12), 2 (잔기수26), 4 (잔기수 62), 5 (잔기수 170), 6 (잔기수 278), 7 (잔기수 348) 의 pDBA 를 얻었다. 또한, 합성예 3 의 폴리디아미노부티르산 및 그 초산염에 폴리에틸렌글리콜 (14) (PEG, 분자량 1000) 을 말단에 결합시킨 폴리디아미노부티르산-PEG (15) 의 합성조건도 합성예 8 로서 표 1 및 표 2 에 나타내었다.

(Ⅱ-1) 폴리-Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 (Poly(4-N-Carbobenzoxy-DL-2,4-diaminobutyric acid) (11) 의 합성:

Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 NCA (10) 의 1 g (3.6 mmol) 을 아세토니트릴 (acetonitrile) 19 ㎖ 에 용해하였다. 개시제로서 부틸아민 (butylamine) 4.38 mg (0.06 mmol) 을 첨가하여, 30 ℃ 에서 307 시간 정치하였다. 얻어진 중합체를 여과하여 아세토니트릴로 세척하였다. 속스레이 추출기를 이용하여 디에틸에테르로 추출한 후, 감압으로 건조하여 폴리-Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 (11) 0.77 g (중합률 91 %) 를 얻었다.

(Ⅱ-2) 폴리-DL-디아미노부티르산 (Poly(DL-2,4-diaminobutyric acid) 초산염 (13) 의 합성:

폴리Nγ-카르보벤족시-DL-디아미노부티르산 (11) 의 0.5 g 을 트리플루오로초산 (trifuluoroacetic acid) 2 ㎖ 에 용해하고, 이것에 25 % 브롬화수소초산용액 (12) 을 첨가하여 흔들어 섞었다. 정치한 후, 디에틸에테르를 첨가하여 상층 에테르상을 경사에서 제거하고, 다시 디이소프로필에테르로 동일한 조작을 행하여 상층 에테르상을 경사에서 제거하였다. 얻어진 침전물을 감압으로 충분히 건조고체화하였다. 얻어진 고체에 초산나트륨과 물을 첨가하여 얻은 혼합액을 분자량 1,000 이하 제거의 투석튜브를 이용하여 흐르는 물에서 투석을 행한 후, 20,000 G 로 1 시간 원심분리를 행하여 침전물을 제거하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 폴리-DL-디아미노부티르산 초산염 (13) 을 0.34 g (수율 91 %) 얻었다.

a) BA ; 부틸아민

PEG1000 ; 폴리에틸렌 글리콜 MW 1000

b) N-카르복시 무수물 (NCA)/개시제 몰비

c) ACN ; 아세토니트릴

a)

폴리(Dba(Z)) ; 폴리(4-N-카르보벤족시-DL-2,4-디아미노부티르산)

폴리(Dba(Z))-PEG ; 폴리(4-N-카르보벤족시-DL-2,4-디아미노부티르산)-PEG1000

(실시예 2) 각종 분자량의 pDBA 에서의 HepG2 세포로의 유전자도입

플라스미드/pDBA 복합체의 조제 :

루시페라아제 유전자를 코딩하는 플라스미드 (약 5.25 kb. 미리 루시페라아제 유전자를 삽입한 피커진콘트롤벡터 (도요인키사 제조), 이하 플라스미드 A 라 약기한다) 의 용액과 핵산 운반체 용액를 각각 원하는 농도의 2 배 농도로 조제하였다. 투여 약 30 분전에 플라스미드 용액을 교반하면서 핵산 운반체용액을 서서히 적하하여 플라스미드/핵산 운반체 복합체용액을 조제하였다. 용매는 DMEM 배지 (Sigma 사 제조) 를 사용하였다. 구체적으로는 25 ㎍/㎖ 의 플라스미드 용액을 조제하고, 플라스미드 농도가 12.5 ㎍/㎖ 인 플라스미드/핵산 운반체 복합체용액을 투여용 검체로 하였다.

플라스미드/pDBA 복합체용액의 HepG2 세포로의 투여 및 측정법 :

시험전날에 12 구멍의 멀티웰플레이트 (코스타사 제조) 의 1 웰당 1 ×10⁵개 접종한 HepG2 세포에 10 % 소태아혈청 (산코쥰야쿠 제조) 존재하에서 플라스미드/pDBA 복합체용액을 투여 (플라스미드의 최종농도는 2.5 ㎍/㎖) 하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이션하였다. 신선한 배양액으로 교환하여 다시 48 시간 인큐베이션하였다. PBS 로 2 회 세척후, 세포용해제 (도요인키 제조) 를 첨가하여,동결융해를 1 번 실시하였다. 세포용해액을 회수하여 원심분리 (12,000 rpm ×10 min) 하고, 상청중의 루시페라아제 활성을 루시페라아제 어세이 시스템 (도요인키 제조) 을 사용하여 루미노미터 (Lumit LB9501; berthold 사 제조) 로 측정하였다. 또한, 원심상청의 단백질 농도는 프로테인 어세이 키트 (Bio-Rad 사 제조) 를 사용하여 마이크로플레이트리더 (Rainbow Thermo ; Tecan 제조) 로 측정하였다.

pDBA 는 합성예 1, 합성예 2, 합성예 3, 합성예 4, 합성예 5, 합성예 7 (모두 표 2) 에 의하여 얻어진 것을 사용하였다. 또한, 플라스미드 A 와 pDBA 의 중량비 (플라스미드/pDBA) 는 1/5 (w/w) 의 복합체용액을 조제하여 시험에 이용하였다. 발현한 루시페라아제의 활성측정 결과를 도 2 에 나타내었다. 잔기수가 많을수록 즉, 분자량이 큰 pDBA 일수록 유전자 발현이 높음이 명백하며, pDBA 에 있어서 디아미노부티르산의 중합도가 어느 정도 이상인 것이 바람직함이 확인되었다.

(실시예 3) 플라스미드에 대한 pDBA 의 중량비를 변경한 복합체에 의한 HepG2 세포로의 유전자도입

실시예 2 와 동일한 방법을 이용하여, HepG2 세포로의 유전자도입을 검토하였다. pDBA 는 합성예 3 에 의하여 얻어진 것과 합성예 8 에 의하여 얻어진 pDBApeg 를 사용하였다. 또한, 플라스미드와 pDBA 의 중량비 (플라스미드/pDBA) 가 1/1, 1/3, 1/5, 1/7, 1/10, 1/20 (w/w) 가 되도록 복합체용액을 조제하여 시험에 이용하였다. pDBApeg 경우에는, 이 비가 1/1, 1/5, 1/10(w/w) 가 되도록 복합체 용액을 조제하여 시험에 이용하였다.

발현한 루시페라아제의 활성측정 결과가 도 3 에 나타나 있는데, 플라스미드에 대한 pDBA 의 양의 증가와 함께 유전자의 발현이 증가한다.

(실시예 4) 사이즈가 큰 플라스미드를 이용하여 pDBA 에 의한 HepG2 세포로의 유전자도입

실시예 1, 실시예 2 에서 이용한 플라스미드 A 와 동일하게 루시페라아제 유전자를 코딩하고, 플라스미드 A 보다도 사이즈가 큰 플라스미드 (약 11.1 kb ; EBV 벡터)(pREP7 ; 후나코시사 제조) 의 멀티클로닝사이트에 일반적인 유전자 재조합방법 (Sambrook 외, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 으로 루시페라아제 유전자를 삽입한 것, 이하 플라스미드 B 라 약기) 의 유전자도입을 확인하기 위하여, 실시예 1 과 동일한 방법을 이용하여 HepG2 세포로의 유전자도입을 검토하였다.

사용한 5 종류의 pDBA 는 합성예 1, 합성예 2, 합성예 3, 합성예 4, 합성예 5 (모두 표 2) 에 의하여 얻어진 것을 사용하였다. 플라스미드 B 와 pDBA 의 중량비 (플라스미드/pDBA) 가 1/5 와 1/10 (w/w) 인 복합체용액을 조제하여 시험에 이용하였다.

발현한 루시페라아제의 활성측정 결과를 도 4 에 나타내었다. pDBA 는 실시예 2 에서 이용한 플라스미드 (5.25 kb) 와 동일하게, 더 사이즈가 큰 플라스미드 (11.1 kb) 를 이용해도 유전자를 발현시킴이 나타났다.

이 결과는 본 발명의 핵산 운반체를 이용하여 치료용 유전자를 도입하는 경우에 이 유전자의 사이즈에 제한되지 않음을 의미한다.

(실시예 5) pDBA 복합체를 이용한 마우스로의 유전자도입

플라스미드/pDBA 복합체의 조제 ;

플라스미드 A 의 용액과 pDBA 용액을 각 원하는 농도의 2 배 농도로 조제하였다. 투여 약 30 분전에 플라스미드 용액을 교반하면서 pDBA 용액을 서서히 적하하여 플라스미드/pDBA 복합체용액을 조제하였다. 용매에는 DMEM 배지를 사용하였다. 구체적으로는 50 ㎍/㎖ 의 플라스미드 용액을 조제하고, 플라스미드 농도가 25 ㎍/㎖ 인 플라스미드/pDBA 복합체용액을 투여용 검체로 하였다.

합성예 3 에서 얻어진 pDBA 와 플라스미드 A 를 플라스미드/pDBA 의 중량비가 1/7 (w/w) 가 되도록 복합체용액을 조제하고, Balb/C 마우스에 꼬리정맥투여하였다. 마우스 한 마리당 플라스미드 A 투여량은 12.5 ㎍/0.5 ㎖ 이었다. 투여 2 일후와 21 일후의 폐, 간장, 비장에서 보여지는 루시페라아제 활성을 측정함으로써 각각의 조직으로의 유전자도입을 측정하였다.

얻어진 결과를 도 5 에 나타내었다. 도 5A 에 나타내는 바와 같이, 투여 2 일후에는 간장에 있어서 pDBA 를 핵산 운반체로서 사용한 군에서는 플라스미드만을 투여한 군과 비교하여 현저히 높은 루시페라아제 활성이 측정되었다. 이 결과는 본 발명과 관련된 유전자 운반체를 이용하여 전신에 투여한 경우, 특히 간장에 유전자를 도입하는 것이 가능함을 의미한다. 또한, 이 결과는 본 발명과 관련된 유전자 운반체를 최적화함으로써, 전신에 투여하여 특정한 조직에 집중적으로 유전자를 도입하는 것이 가능하다는 것도 의미한다. 또한, 도 5B 에 나타내는바와 같이, 투여후 21 일째에 있어서도 간장에서의 루시페라아제 활성은 유지되어 있다. 이 결과는 본 발명과 관련된 핵산 운반체를 이용하여 전신에 투여한 경우, 특정한 조직에서의 이 유전자의 발현을 장기간 지속시킬 수 있음을 의미한다. 또한, 이 결과는 본 발명과 관련된 핵산 운반체를 최적화함으로써, 전신에 투여하여 특정한 조직에서의 특정한 유전자 발현의 지속시간을 최적화하는 것이 가능하게 된다는 것도 의미한다.

(실시예 6) 플라스미드에 대한 pDBA 의 중량비를 변경한 복합체를 이용한 마우스로의 유전자도입

실시예 4 와 동일한 방법으로 각종 중량비로 조제한 플라스미드 A 와 pDBA 의 복합체에 의한 유전자도입을 루시페라아제 활성의 발현으로 평가하였다.

합성예 3 에서 얻어진 pDBA 와 플라스미드 A 를 각종 중량비 (플라스미드/pDBA=1/0, 1/1, 1/5, 1/10, 1/20) 가 되도록 복합체용액을 조제하여 Balb/C 마우스에 꼬리정맥투여하였다.

투여 2 일후의 간장에서 보여지는 루시페라아제 활성을 측정함으로써 각각의 조직으로의 유전자도입을 측정하였다.

얻어진 결과를 도 6 에 나타내었다. 플라스미드에 대한 pDBA 의 양이 증가함에 따라 유전자의 발현이 높아지는 경향을 명백히 확인할 수 있었다.

(실시예 7) 각종 분자량의 pDBA 에 의한 마우스로의 유전자도입

실시예 4 와 동일한 방법으로 조제한 플라스미드 A 와 pDBA 의 복합체에 의한 유전자도입을 루시페라아제 활성의 발현으로 평가하였다.

합성예 1, 합성예 2, 합성예 3, 합성예 4, 합성예 5 (모두 표 2) 에서 얻어진 5 종류의 pDBA 와 플라스미드 A 를 플라스미드/pDBA 의 중량비가 1/5 (w/w) 가 되도록 복합체를 조제하여 Balb/C 마우스에 꼬리정맥투여하였다. 투여 2 일후의 간장의 루시페라아제 활성을 측정하였다.

얻어진 결과를 도 7 에 나타내었다. 간장에서의 유전자 발현은 pDBA 의 잔기수가 많아짐에 따라 높아지는 경향이 명백히 보여져, 실시예 5 에서의 결과와 동일하게, 디아미노부티르산의 중합도가 어느 정도 이상인 것이 바람직함을 확인할 수 있었다.

(실시예 8) 마우스에 꼬리정맥투여한 유전자의 발현기간

실시예 4 와 동일한 방법으로 조제한 플라스미드/pDBA 복합체용액을 Balb/C 마우스 (수컷, 생후 8 주간) 에 꼬리정맥투여 (0.5 ㎖) 하고, 투여후의 간장에서의 유전자 발현을 루시페라아제 활성을 측정함으로써 평가하였다. 표 2 의 합성예 3 에서 얻어진 pDBA 를 사용하여, 플라스미드/pDBA=1/5 (w/w) 가 되도록 복합체용액을 조제하여, 이것을 상기 투여에 사용하였다.

얻어진 결과를 도 8 에 나타내었다. 플라스미드/pDBA 복합체를 투여한 군에서는 투여후 2 일째에서 7 개월까지 유전자 발현을 확인할 수 있었다. 즉, 1 회의 투여로 7 개월 이상에 걸쳐, 간장에 있어서 유전자를 발현함을 확인할 수 있었다. 또한, 비교를 위하여, 플라스미드만의 투여와 시판의 유전자도입 시약인 ExGen500 (Euromedex 제조) 와 플라스미드와의 복합체의 투여를 실시하였다. 얻어진 결과를 도 8 에 나타내었다. 양자 모두 플라스미드/pDBA 복합체 투여군에 비하여 유전자의 발현은 낮고, 플라스미드만의 투여에서는 1 개월 이내, ExGen500 과 플라스미드와의 복합체의 투여군에서도 3 개월 이내에 유전자 발현을 검출할 수 없게 되었다.

이 결과는 본 발명의 핵산 운반체를 최적화함으로써, 특정한 조직에서 특정한 유전자의 발현의 지속시간을 최적화하는 것이 가능하게 된다는 것도 의미한다.

(실시예 9) 1 회 투여한 고용량 pDBA 에 의한 마우스의 생존율

고용량의 pDBA 용액을 마우스에 직접 투여한 경우의 마우스의 생존율을 이하와 같이 조사하였다.

pDBA 를 생리식염수에 용해하여 각종 농도의 pDBA 용액을 조제하고, Balb/C 마우스에 꼬리정맥투여하여 증상을 관찰하였다. pDBA 는 합성예 1-7 (모두 표 2) 에서 얻어진 것을 이용하였다. 결과를 표 3 에 나타내었다.

- ; 수행하지 않음 <아미노산 잔기수 ; 합성예 번호, 분자량>

12 ; 합성예 1 (MW 2,000)

26 ; 합성예 2 (MW 4,200)

49 ; 합성예 3 (MW 7,900)

62 ; 합성예 4 (MW 9,900)

170 ; 합성예 5 (MW 27,200)

278 ; 합성예 6 (MW 44,500)

348 ; 합성예 7 (MW 55,700)

또한 비교를 위하여, 1 회 투여한 고용량 폴리에틸렌이민 (PEI) 에 의한 마우스의 생존율을 상기와 동일한 방법에 의하여 조사하였다. 이 경우, ExGen500 의 주성분이며, 양이온성 중합체인 폴리에틸렌이민 (PEI) (Gene Therapy, 4, 1100, 1997) 을 이용하였다. 분자량 1,800 과 10,000 인 PEI (모두 와코준야쿠 제조) 를 생리식염수로 희석하여 사용하였다. 비교결과를 표 4 에 나타내었다.

표 3 및 표 4 로부터, pDBA 의 안전성은 PEI 보다도 높음을 알 수 있다. PEI 를 단체(單體)로 투여한 경우, 분자량이 큰 (MW10,000) PEI 를 고용량 투여하면 소화기계의 장기로의 장애를 일으키기 쉬우며, 분자량이 작은 (MW1,800) PEI 쪽은 폐에서의 출혈을 일으키기 쉬운 경향이 관찰되었다.

pDBA 의 안전성은 다른 양이온성 폴리아민산과 같은 정도라 여겨지는데, 비교예의 폴리에틸렌이민 (PEI) 보다도 높다. 또한, 실시예 3 이나 실시예 6 에서 나타내는 바와 같이, 효과면에서는 아미노산의 중합도가 높은 편이 바람직하나, 중합도가 높아질수록 고용량의 투여에서는 간장에서의 장애를 일으키기 쉽게 되는 것으로 일반적으로는 여겨져, 효과와 안전면을 고려하면 핵산 운반체로서의 pDBA 의 잔기수에는 바람직한 범위가 있어, 10 내지 280 의 사이가 바람직한 범위로 여겨진다. 또한, 20 내지 280 의 사이가 가장 바람직한 범위로 여겨진다.

(실시예 10) 모르모트를 이용한 pDBA 의 항원성 시험

동물의 감작 :

Hartley 계 웅성 모르모트의 피하에 1 mg/kg 이 되도록 주 1 회, 4 주간에 걸쳐 pDBA (합성예 3 에서 얻어진 것) 을 투여하여 동물을 감작하였다. 최종투여의 5 일후에 동물을 에테르 마취하여 심장에서 채혈하여, 얻어진 혈청을 이용하여 무처치의 모르모트를 이용하여 4 시간 수신피하 아나필락시 시험을 실시하였다. 또한, 감작한 모르모트에 관해서는 채혈 3 일후에 능동적 전신성 아나필락시 시험을 실시하였다. 양성대조군으로서 소혈청 알부민 (BSA) 을 10 mg/kg 의 양으로 동일하게 투여하여 동물을 감작하였다.

능동적 전신성 아나필락시에 의한 항원성의 확인 :

최종감작 8 일후에 각 동물에 대하여 피검액 (pDBA, 1 mg/kg) 0.1 ㎖/100 g 을 귓바퀴 또는 앞다리내측의 정맥내에 투여하였다. 또한, 양성대조의 BSA 투여군에 관해서도 동일하게 처리하여, BSA 용액을 정맥내에 투여 (10 mg/kg) 하였다. 정맥내 투여후 1 시간까지 발현하는 증상을 아래에 나타낸 기준에 따라 관찰하였다. 얻어진 결과를 도 9 에 나타내었다. pDBA 의 면역원성은 낮음을 확인할 수 있었다. 능동적 전신성 아나필락시의 판정기준을 이하에 나타내었다.

증상 평가 스코어

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변화없음 0

입모(立毛), 소비(搔鼻), 불안감 1

상기에 더하여 떨림, 재채기, 운동항진 2

상기에 더하여 배뇨, 배변, 호흡곤란 3

상기에 더하여 경련, 정신산란 4

사망 5

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4 시간 수신피하 아나필락시에 의한 항원성의 확인 :

털을 깎은 미감작 모르모트의 등부위피부에 감작동물에서 얻은 원혈청 및 생리식염수액으로 10, 100, 1,000, 10,000 배 희석한 혈청 0.1 ㎖ 씩을 피내투여하였다. 피내투여 4 시간후에 0.5 % Evans blue 를 포함하는 피검액 (pDBA, 1 mg/kg) 0.1 ㎖/100 g 을 귓바퀴 또는 앞다리내측의 정맥내에 투여하였다. 또한, 양성대조군인 BSA 투여군에서 얻은 혈청도 동일하게 처리하여, 0.5 % Evansblue 를 포함하는 BSA 용액 (1 mg/kg) 을 정맥내 투여하였다. 정맥내 투여의 30 분후에 피부에 나타난 색소반점의 직경을 측정하였다. 얻어진 결과를 도 10 에 나타내었다. 양성대조인 BSA 군에서는 혈청을 100 배에서 1000 배 희석해도 피부반응이 검출된데 대하여, pDBA 군에서는 혈청원액을 투여해도 피부반응은 야기되지 않아, 전신성 아나필락시의 결과와 동일하였다. pDBA 의 면역원성은 매우 낮음이 명백해졌다.

(실시예 11) pDBA 를 이용한 올리고뉴클레오티드의 세포내로의 도입

FITC 표식한 올리고뉴클레오티드 (20 mer ; 파르마시아 제조) 를 이용하여 올리고뉴클레오티드와 여러가지 pDBA 의 복합체의 세포내도입능을 조사하였다.

HepG2 세포를 12 구멍 샬레에 1 ×10⁵개/well 로 접종하여 24 시간 배양하였다. FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 그 핵산 운반체로서 합성예 3, 합성예 5 에서 얻어진 pDBA 를 이용하였다. 이들 3 종류의 pDBA 와 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드/pDBA=1/1, 1/5, 1/10 (w/w) 가 되도록 복합체를 조제하였다. 복합체용액을 HepG2 세포에 첨가하여 4 시간 배양한 후, PBS (-) 로 2 회 세포를 세척하였다. PBS (-) 를 제거한 후, 세포 탈리 용액 (cell dissociation solution) (SIGMA 제조) 을 이용하여 세포를 샬레에서 떼어내고, 세포현탁액을 플로우사이트미터 (FACS Calibur ; 벡톤디킨슨 제조) 로 측정하였다. 결과를 도 11 (올리고뉴클레오티드/pDBA=1/5 (w/w)) 에 나타내었다 (도 11 에 있어서, M1 은 콘트롤 실험결과를 나타내며, M2 는 FITC 표식 올리고뉴클레오티드를 이용한 실험결과를 나타낸다). 또한, 10,000 개의 세포중의 FITC 표식 올리고뉴클레오티드가 도입된 세포의 비율을 평가한 결과를 도 12 (올리고뉴클레오티드/pDBA=1/1, 1/5, 1/10 (w/w)) 에 나타내었다.

도 11 로부터, 올리고뉴클레오티드만으로는 거의 세포내로 도입되지 않음이 확인되었다. 도 12 에서 FITC 표식 올리고뉴클레오티드가 도입된 세포의 비율을 산출하였는데, 올리고뉴클레오티드만으로는 거의 세포내로 도입되어 있지 않고, 또한, 합성예 1 (잔기수 12) 에서 얻어진 pDBA 를 핵산 운반체로서 사용한 군에서도 올리고뉴클레오티드의 흡수는 적었다. 이에 대하여 합성예 3 (잔기수 49) 와 합성예 5 (잔기수 170) 에서 얻어진 pDBA 와의 복합체군에서는 올리고뉴클레오티드/pDBA=1/5 (w/w) 이상에서, 측정한 10,000 개의 세포중 약 70 % ~ 90 % 의 세포에 FITC 표식 올리고뉴클레오티드의 흡수가 관찰되었다.

이 결과는 본 발명의 핵산 운반체 (pDBA) 는 안티센스, TFO (Triplex Forming Oligonucleotide) 등의 올리고뉴클레오티드에도 바람직하게 사용가능함이 확인되었다.

본 발명의 핵산 운반체는 여러가지 치료 유전자와 안전, 또한 면역원성이 극히 낮은 복합체 (본 발명의 유전자 치료용 약학적 조성물) 를 형성하여, 여러가지 수단에 의하여 상기 유전자를 세포에 효율적, 안전하게, 도입가능하게 하며, 이 세포내에서 상기 유전자의 높은 유전자 발현을 가능하게 하는 것이다. 또한, 적당한 잔기수를 선택함으로써 여러가지 크기의 유전자, 여러가지 종류의 치료 유전자 (안티센스, TFO (Triplex Forming Oligonucleotide) 등의 올리고뉴클레오티드를 포함한다) 도 발현시키는 것이 가능하게 된다.

또한, 본 발명의 핵산 운반체를 이용하여 치료 유전자를 전신에 투여함으로써, 특히 간장으로 이 유전자를 도입하는 것이 가능하게 된다.

또한, 본 발명의 핵산 운반체를 최적화함으로써, 치료 유전자를 전신에 투여하여 특정한 조직에 집중적으로 이 유전자를 도입하는 것이 가능하게 된다.

또한, 본 발명의 핵산 운반체를 이용하여 전신에 투여하여, 특정한 조직에서의 이 유전자의 발현을 장기간 지속시키는 것을 포함하여 지속시간을 최적화하는 것이 가능하게 된다.

Claims (7)

1. 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 핵산 운반체.
2. 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 폴리펩티드와 폴리에틸렌글리콜과의 블록공중합체를 포함하는 핵산 운반체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 잔기수 20 이상 280 이하인 디아미노부티르산 및/또는 그 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산 운반체.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 핵산 운반체와 치료 유전자를 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 치료 유전자가 핵산 및/또는 뉴클레오티드 유도체인 것을 특징으로 하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
6. 제 3 항에 기재된 핵산 운반체와 치료 유전자를 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 치료 유전자가 핵산 및/또는 뉴클레오티드 유도체인 것을 특징으로 하는 유전자 치료용 약학적 조성물.