JP2003334069A - アルコール脱水素酵素およびそれを用いた光学活性３−キヌクリジノールの製造法 - Google Patents
アルコール脱水素酵素およびそれを用いた光学活性３−キヌクリジノールの製造法Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 種々の医農薬品等の原料として有用である光
学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩を製造する
に際し、新規なアルコール脱水素酵素酵素およびその作
用による光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩
を製造する方法を提供する。 【解決手段】 次の（１）および（２）に示す理化学的
性質を有するアルコール脱水素酵素。 （1） ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンある
いはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成
する。 （2） ３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐ
Ｈが7.0〜9.0の範囲内にある。
学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩を製造する
に際し、新規なアルコール脱水素酵素酵素およびその作
用による光学活性３−キヌクリジノールあるいはその塩
を製造する方法を提供する。 【解決手段】 次の（１）および（２）に示す理化学的
性質を有するアルコール脱水素酵素。 （1） ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンある
いはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成
する。 （2） ３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐ
Ｈが7.0〜9.0の範囲内にある。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有用且つ新規なア
ルコール脱水素酵素酵素およびその作用による光学活性
３−キヌクリジノールあるいはその塩を製造する方法に
関する。これらの光学活性３−キヌクリジノールあるい
はその塩は種々の医農薬品等の原料として有用である。
ルコール脱水素酵素酵素およびその作用による光学活性
３−キヌクリジノールあるいはその塩を製造する方法に
関する。これらの光学活性３−キヌクリジノールあるい
はその塩は種々の医農薬品等の原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】酵素不斉還元による光学活性３−キヌク
リジノールは特開平10-243795、特開平11-196890および
特開2000-245495に微生物菌体を利用した方法が提案さ
れている。しかし、これらの方法で使用されている触媒
は、特開平10-243795では、ナカザワエア（Nakazawae
a）属、カンジダ（Candida）属、プロテウス（Proteu
s）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、シュー
ドモナス（Pseudomonas）属およびロドスポリジウム（R
hodosporidium）属の菌体のみであり、特開平11-196890
ではロドトルウラ（Rhodotorula）属、カンジダ（Candi
da）属、スポリジオボルウス（Sporidiobolus）属、ロ
ドスポリジウム（Rhodosporidium）属、スシゾサッカロ
マイセス（Schizosaccharomyces）属、クリプトコッカ
ス（Cryptococcus）属、トリコスポロン（Trichosporo
n）属、ゴルドナ（Gordona）属、ピキア（Pichia）属お
よびノカルデイア（Nocardia）属の菌体のみであり、ま
た、特開2000-245495ではアルアリゲネス（Alcaligene
s）属、コルネバクテリウム（Corynebacterium）属、
アースロバクター（Arthrobacter）属、フィロバシディ
ウム（Filobasidium）属、 ロドトルウラ（Rhodotorul
a）属、オウレオバシジウム（Aureobasidium）属および
ヤロウィア（Yarrowia）属の菌体のみを用いている。こ
れらの菌体での反応はそれ由来の不純物、あるいは他の
酵素による副反応等により、生成物の単離が煩雑になる
ことがしばしばある。
リジノールは特開平10-243795、特開平11-196890および
特開2000-245495に微生物菌体を利用した方法が提案さ
れている。しかし、これらの方法で使用されている触媒
は、特開平10-243795では、ナカザワエア（Nakazawae
a）属、カンジダ（Candida）属、プロテウス（Proteu
s）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、シュー
ドモナス（Pseudomonas）属およびロドスポリジウム（R
hodosporidium）属の菌体のみであり、特開平11-196890
ではロドトルウラ（Rhodotorula）属、カンジダ（Candi
da）属、スポリジオボルウス（Sporidiobolus）属、ロ
ドスポリジウム（Rhodosporidium）属、スシゾサッカロ
マイセス（Schizosaccharomyces）属、クリプトコッカ
ス（Cryptococcus）属、トリコスポロン（Trichosporo
n）属、ゴルドナ（Gordona）属、ピキア（Pichia）属お
よびノカルデイア（Nocardia）属の菌体のみであり、ま
た、特開2000-245495ではアルアリゲネス（Alcaligene
s）属、コルネバクテリウム（Corynebacterium）属、
アースロバクター（Arthrobacter）属、フィロバシディ
ウム（Filobasidium）属、 ロドトルウラ（Rhodotorul
a）属、オウレオバシジウム（Aureobasidium）属および
ヤロウィア（Yarrowia）属の菌体のみを用いている。こ
れらの菌体での反応はそれ由来の不純物、あるいは他の
酵素による副反応等により、生成物の単離が煩雑になる
ことがしばしばある。
【０００３】一方、光学活性３−キヌクリジノールの製
法として精製あるいは粗精製の酵素レベルでの本反応は
知られていない。本発明により提供されるような新規酵
素およびそれらを利用してのＲ−３−キヌクリジノール
あるいはその塩の有用な合成方法が望まれていた。
法として精製あるいは粗精製の酵素レベルでの本反応は
知られていない。本発明により提供されるような新規酵
素およびそれらを利用してのＲ−３−キヌクリジノール
あるいはその塩の有用な合成方法が望まれていた。
【０００４】その他、光学活性３-キヌクリジノールの
製法としては、これまでに、例えば、光学活性酒石酸等
を分割剤とする優先晶析法により光学活性３−キヌクリ
ジノール誘導体に導く方法（ Acta. Pharm. Suec., 16,
281-3 (1979) ）等が報告されている。微生物等の触媒
を利用する方法としては、３−キヌクリジノールの低級
脂肪酸エステルを酵素により不斉加水分解して光学活性
３−キヌクリジノールに分割する方法（米国特許5,215,
918、特開平10-136995、特開平10-210997および Life S
ic. 21, 1293-1302 (1977)）が知られている。しかし、
これらの方法は、ラセミ体を出発原料とし、光学分割し
て目的の光学異性体を得る手法であり、目的としない対
掌体が残存するため、生産コストが高くなる傾向にあ
る。
製法としては、これまでに、例えば、光学活性酒石酸等
を分割剤とする優先晶析法により光学活性３−キヌクリ
ジノール誘導体に導く方法（ Acta. Pharm. Suec., 16,
281-3 (1979) ）等が報告されている。微生物等の触媒
を利用する方法としては、３−キヌクリジノールの低級
脂肪酸エステルを酵素により不斉加水分解して光学活性
３−キヌクリジノールに分割する方法（米国特許5,215,
918、特開平10-136995、特開平10-210997および Life S
ic. 21, 1293-1302 (1977)）が知られている。しかし、
これらの方法は、ラセミ体を出発原料とし、光学分割し
て目的の光学異性体を得る手法であり、目的としない対
掌体が残存するため、生産コストが高くなる傾向にあ
る。
【０００５】一方、ルイス酸付加物をロジウム錯化合物
を触媒として不斉還元により、３-キヌクリジノンか
ら、光学活性３-キヌクリジノールを製造する方法（特
開平９−１９４４８０）が報告されているが、この方法
は光学純度が低く、工業的に有利な製造方法とは言い難
い。従って、本発明のより提供されるような新規酵素に
よる有用な合成方法が望まれていた。
を触媒として不斉還元により、３-キヌクリジノンか
ら、光学活性３-キヌクリジノールを製造する方法（特
開平９−１９４４８０）が報告されているが、この方法
は光学純度が低く、工業的に有利な製造方法とは言い難
い。従って、本発明のより提供されるような新規酵素に
よる有用な合成方法が望まれていた。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】本発明は、新たなア
ルコール脱水素酵素を提供するとともに、医農薬合成中
間体として有用な光学活性３−キヌクリジノールあるい
はその塩を、その酵素による不斉還元反応により、工業
的に有利な製造方法を提供することである。
ルコール脱水素酵素を提供するとともに、医農薬合成中
間体として有用な光学活性３−キヌクリジノールあるい
はその塩を、その酵素による不斉還元反応により、工業
的に有利な製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特定の微
生物が３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用し、そ
のＲ体へ立体選択的に還元し、Ｒ−３−キヌクリジノー
ルあるいはその塩を生成する能力を有することに着目
し、さらにその酵素を精製し、その酵素化学的性質につ
いて鋭意検討を行った結果、高い立体選択性でＲ体を優
先的に還元する性状を有することを見出し、本発明を完
成させるに至った。
生物が３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用し、そ
のＲ体へ立体選択的に還元し、Ｒ−３−キヌクリジノー
ルあるいはその塩を生成する能力を有することに着目
し、さらにその酵素を精製し、その酵素化学的性質につ
いて鋭意検討を行った結果、高い立体選択性でＲ体を優
先的に還元する性状を有することを見出し、本発明を完
成させるに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、次の（１）および
（２）に示す性状を有するアルコール脱水素酵素であ
る。 （1）ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるい
はその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成す
る。 （2）３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐＨ
が7.0から9.0の範囲内にある。
（２）に示す性状を有するアルコール脱水素酵素であ
る。 （1）ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンあるい
はその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成す
る。 （2）３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐＨ
が7.0から9.0の範囲内にある。
【０００９】さらに、本発明は、該酵素、該酵素を産生
する微生物または、形質転換微生物もしくはそれらの処
理物を３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用させす
ることを特徴とするＲ−３−キヌクリジノールまたはそ
の塩の製造方法である。
する微生物または、形質転換微生物もしくはそれらの処
理物を３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用させす
ることを特徴とするＲ−３−キヌクリジノールまたはそ
の塩の製造方法である。
【００１０】
【発明の実施形態】以下、本発明を詳細に説明する。本
発明であるアルコール脱水素酵素はＮＡＤＨ（還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素とし
て、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−
３−キヌクリジノールを生成する能力を有する。補酵素
としては他にも、一般には数種類が知られているが、Ｎ
ＡＤＨ以外のもであってもＲ−３−キヌクリジノールを
生成能が発揮できれば特に制限はないが、ＮＡＤＨ依存
性であることが望ましい。
発明であるアルコール脱水素酵素はＮＡＤＨ（還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素とし
て、３−キヌクリジノンあるいはその塩を還元し、Ｒ−
３−キヌクリジノールを生成する能力を有する。補酵素
としては他にも、一般には数種類が知られているが、Ｎ
ＡＤＨ以外のもであってもＲ−３−キヌクリジノールを
生成能が発揮できれば特に制限はないが、ＮＡＤＨ依存
性であることが望ましい。
【００１１】本酵素は３−キヌクリジノンを基質とした
場合の至適ｐＨが7.0から9.0の範囲内にある。この範囲
内に至適ｐＨがあれば特に限定はないが、好ましくは至
適ｐＨが7.5〜8.0であることが望ましい。
場合の至適ｐＨが7.0から9.0の範囲内にある。この範囲
内に至適ｐＨがあれば特に限定はないが、好ましくは至
適ｐＨが7.5〜8.0であることが望ましい。
【００１２】さらに、本酵素の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで測定した場合が約52,000。ゲル濾過（高速液体クロ
マトグラフィー）で測定した場合、約220,000であるこ
とが好ましい。
Ｅで測定した場合が約52,000。ゲル濾過（高速液体クロ
マトグラフィー）で測定した場合、約220,000であるこ
とが好ましい。
【００１３】本発明におけるアルコール脱水素酵素の供
給源としては特に制限されるものではないが、微生物等
の生体細胞から得ることができる。そのような微生物と
しては、Microbacterium属等に属する微生物が挙げられ
る。好ましくは、Microbacterium estevoaromaticum IF
O 3751、Microbacterium arabinogalactanolyticum JCM
9171、Microbacterium luteolum JCM 9174が挙げられ
る。特に好ましくはMicrobacterium luteolum JCM 9174
が挙げられる。
給源としては特に制限されるものではないが、微生物等
の生体細胞から得ることができる。そのような微生物と
しては、Microbacterium属等に属する微生物が挙げられ
る。好ましくは、Microbacterium estevoaromaticum IF
O 3751、Microbacterium arabinogalactanolyticum JCM
9171、Microbacterium luteolum JCM 9174が挙げられ
る。特に好ましくはMicrobacterium luteolum JCM 9174
が挙げられる。
【００１４】なお、IFO番号およびJCM番号が付された菌
株は公知で、それぞれ財団法人発酵研究所および理化学
研究所微生物系統保存施設から容易に入手することがで
きる。
株は公知で、それぞれ財団法人発酵研究所および理化学
研究所微生物系統保存施設から容易に入手することがで
きる。
【００１５】本酵素の単離精製方法は、蛋白質の溶解度
による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析
など）や陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水
性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを
用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の
方法を適当に組み合わせることにより精製することがで
きる。たとえば、菌体を破砕後、硫安沈澱、Blue-Sepha
rose カラム、DEAT-Toyopearl 、Hiload Superdex 200
pg FPLC カラム、HAP-C-BEADA hydroxyapatiteFPLC カ
ラム、Pros HQ/M FPLC カラム、BioAssistQ FPLCカラム
クロマトグラフィー等を行うことによりポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一バ
ンドにまで精製することができる。
による分画（有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析
など）や陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水
性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを
用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の
方法を適当に組み合わせることにより精製することがで
きる。たとえば、菌体を破砕後、硫安沈澱、Blue-Sepha
rose カラム、DEAT-Toyopearl 、Hiload Superdex 200
pg FPLC カラム、HAP-C-BEADA hydroxyapatiteFPLC カ
ラム、Pros HQ/M FPLC カラム、BioAssistQ FPLCカラム
クロマトグラフィー等を行うことによりポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一バ
ンドにまで精製することができる。
【００１６】本発明において、３−キヌクリジノンおよ
び３−キヌクリジノールの塩とは、その窒素原子を、有
機酸あるいは鉱酸等の塩を形成させたものを意図する。
具体的には鉱酸塩として塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸
塩、硝酸塩、リン酸塩等が例示できる。有機酸塩として
は酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸、マロン
酸、シュウ酸等の脂肪族有機酸塩、安息香酸等の芳香族
有機酸塩等が例示される。本発明において、酵素とは、
精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物等も含まれ
る。また、本発明において、形質転換微生物とは本発明
の酵素をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現
した組換え微生物をいう。その宿主としては、例えば、
エシェリキア（Escherichia）属、バチルス（Bacillu
s）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ピキア（Pi
chia）属、カンジダ（Candida）属、アスペルギルス（A
spergillus）属などが挙げられる。さらに、形質転換微
生物処理物とは、アセトン乾燥微生物菌体、凍結乾燥微
生物菌体、機械的並びに酵素的方法により細胞壁を破砕
した無細胞抽出物、界面活性剤、有機溶媒などにより処
理したものあるいはそれらの固定化物などをいう。
び３−キヌクリジノールの塩とは、その窒素原子を、有
機酸あるいは鉱酸等の塩を形成させたものを意図する。
具体的には鉱酸塩として塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸
塩、硝酸塩、リン酸塩等が例示できる。有機酸塩として
は酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、フマル酸、マロン
酸、シュウ酸等の脂肪族有機酸塩、安息香酸等の芳香族
有機酸塩等が例示される。本発明において、酵素とは、
精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物等も含まれ
る。また、本発明において、形質転換微生物とは本発明
の酵素をコードする遺伝子が導入され、該遺伝子が発現
した組換え微生物をいう。その宿主としては、例えば、
エシェリキア（Escherichia）属、バチルス（Bacillu
s）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ピキア（Pi
chia）属、カンジダ（Candida）属、アスペルギルス（A
spergillus）属などが挙げられる。さらに、形質転換微
生物処理物とは、アセトン乾燥微生物菌体、凍結乾燥微
生物菌体、機械的並びに酵素的方法により細胞壁を破砕
した無細胞抽出物、界面活性剤、有機溶媒などにより処
理したものあるいはそれらの固定化物などをいう。
【００１７】本発明において、不斉還元反応によるＲ−
３−キヌクリジノールあるいはその塩の生産は、以下の
方法で行うことができる。必要に応じて補酵素（NADH、
NADPH、NAD+、NADP+）あるいは／およびグルコース、シ
ュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー
源の存在下、水または緩衝液等の反応溶媒中で３−キヌ
クリジノンあるいはその塩に酵素、形質転換微生物、ま
たは該菌体処理物を接触させることにより行うことがで
きる。そして、反応温度、必要により反応液のpHを制御
しながら反応を行う。場合によっては反応の途中で反応
基質（３−キヌクリジノンあるいはその塩）あるいは／
および前記補酵素、エネルギー源を適宜加え、反応を継
続させることもある。
３−キヌクリジノールあるいはその塩の生産は、以下の
方法で行うことができる。必要に応じて補酵素（NADH、
NADPH、NAD+、NADP+）あるいは／およびグルコース、シ
ュークロース、エタノール、メタノール等のエネルギー
源の存在下、水または緩衝液等の反応溶媒中で３−キヌ
クリジノンあるいはその塩に酵素、形質転換微生物、ま
たは該菌体処理物を接触させることにより行うことがで
きる。そして、反応温度、必要により反応液のpHを制御
しながら反応を行う。場合によっては反応の途中で反応
基質（３−キヌクリジノンあるいはその塩）あるいは／
および前記補酵素、エネルギー源を適宜加え、反応を継
続させることもある。
【００１８】また、還元反応に付随してＮＡＤＨから生
成するＮＡＤ+の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つ
ＮＡＤ+還元能（解糖系など）を用いて行うことができ
る場合がある。これらＮＡＤ+還元能は、反応系にグル
コースやエタノールを添加することにより増強すること
が可能である。また、ＮＡＤ+からＮＡＤＨを生成する
能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加
することによっても行うことができる。
成するＮＡＤ+の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つ
ＮＡＤ+還元能（解糖系など）を用いて行うことができ
る場合がある。これらＮＡＤ+還元能は、反応系にグル
コースやエタノールを添加することにより増強すること
が可能である。また、ＮＡＤ+からＮＡＤＨを生成する
能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加
することによっても行うことができる。
【００１９】反応液の基質濃度は、０．０１〜５０重量
％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．
０５〜３０重量％の濃度で実施するのが好ましい。反応
液中の酵素等の触媒の濃度は、その形状およびその活性
により適宜決定され、特に制限はない。反応液のpHは用
いる酵素の至適pH等を考慮し、総合的に決定され、特に
制限はないが、好ましくはpH５〜１０である。本酵素の
至適ｐＨ7.0から9.0の範囲で実施することがさらに好ま
しい。また、反応が進行するに従いpHが変化してくる
が、この場合は適当な中和剤を添加して最適pHに調整す
ることが望ましい。反応温度は０〜６０℃が好ましく、
５〜５０℃がより好ましい。
％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．
０５〜３０重量％の濃度で実施するのが好ましい。反応
液中の酵素等の触媒の濃度は、その形状およびその活性
により適宜決定され、特に制限はない。反応液のpHは用
いる酵素の至適pH等を考慮し、総合的に決定され、特に
制限はないが、好ましくはpH５〜１０である。本酵素の
至適ｐＨ7.0から9.0の範囲で実施することがさらに好ま
しい。また、反応が進行するに従いpHが変化してくる
が、この場合は適当な中和剤を添加して最適pHに調整す
ることが望ましい。反応温度は０〜６０℃が好ましく、
５〜５０℃がより好ましい。
【００２０】反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等
の水性媒体を使用するが、３−キヌクリジノンあるいは
その塩の溶解を促進させるために有機溶媒あるいは界面
活性剤を含んだ系でも反応を行うことができる。有機溶
媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノー
ル、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアル
コール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタ
ン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キ
シレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロ
ロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化
炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル
系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエ
ステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチル
イソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニト
リル、N,N-ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
の水性媒体を使用するが、３−キヌクリジノンあるいは
その塩の溶解を促進させるために有機溶媒あるいは界面
活性剤を含んだ系でも反応を行うことができる。有機溶
媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノー
ル、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアル
コール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタ
ン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キ
シレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロ
ロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化
炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエ
ーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル
系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエ
ステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチル
イソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニト
リル、N,N-ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００２１】また、これらの有機溶媒あるいは界面活性
剤を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うこと
も可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、
選択率、変換率、収率などが向上することも多い。反応
時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜72時間
であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選
択することが好ましい。尚、以上のような基質濃度、補
酵素濃度、酵素濃度、pH、温度、溶媒、反応時間および
その他の反応条件はその条件における反応収率等を考慮
して目的とする光学活性３−キヌクリジノールあるいは
その塩が最も多く採取できる条件を適宜選択することが
望ましい。
剤を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うこと
も可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、
選択率、変換率、収率などが向上することも多い。反応
時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜72時間
であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選
択することが好ましい。尚、以上のような基質濃度、補
酵素濃度、酵素濃度、pH、温度、溶媒、反応時間および
その他の反応条件はその条件における反応収率等を考慮
して目的とする光学活性３−キヌクリジノールあるいは
その塩が最も多く採取できる条件を適宜選択することが
望ましい。
【００２２】反応終了混合液からの目的物の単離は除菌
後、濃縮、抽出、カラム分離、結晶化等通常の公知の方
法によって行うことができる。例えば、ｐＨをアルカリ
性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテ
ル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサ
ン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類；塩化メチレン
等のハロゲン化炭化水素類； ブタノール、イソブタノ
ール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒等一般
的な溶媒により抽出分離することができる。
後、濃縮、抽出、カラム分離、結晶化等通常の公知の方
法によって行うことができる。例えば、ｐＨをアルカリ
性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテ
ル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサ
ン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類；塩化メチレン
等のハロゲン化炭化水素類； ブタノール、イソブタノ
ール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒等一般
的な溶媒により抽出分離することができる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定され
るものではない。
るが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定され
るものではない。
【００２４】＜実施例１＞ Microbacterium luteolum
JCM 9174の培養 ペプトン1.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム0.3％、スクロース1.0
％（ｐＨ7.0）を含む培地により、30℃で前培養を行
い、続いて本培養は同前培養培地に消泡剤0.1％添加し
た組成の培養液3リットルを使用し、30℃24時間実施し
た。
JCM 9174の培養 ペプトン1.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム0.3％、スクロース1.0
％（ｐＨ7.0）を含む培地により、30℃で前培養を行
い、続いて本培養は同前培養培地に消泡剤0.1％添加し
た組成の培養液3リットルを使用し、30℃24時間実施し
た。
【００２５】＜実施例２＞ 本酵素の精製を以下に示
す。なお全工程を4℃にて行った。 １）粗酵素液の調製 前記培養方法により６リットルの培養液から菌体湿重量
33.8gを得た。170mlの1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、
1ｍＭMgCl2、プロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ ＦＲＥＥ(Ro
che社製；1 tablet/50ml)を含む20ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ7.0で懸濁し、菌体破砕を超音波破砕装置(201M ultra
sonic oscillator，久保田製作所)を用いて180Ｗ、0℃
で8分間行った。破砕液を9000g、20分4℃で遠心を行
い、上清を粗酵素液として回収した。以後特に述べない
限りでは、緩衝液は1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、1
ｍＭMgCl2を含む20ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を使用
した。(以降、緩衝液Ａ)
す。なお全工程を4℃にて行った。 １）粗酵素液の調製 前記培養方法により６リットルの培養液から菌体湿重量
33.8gを得た。170mlの1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、
1ｍＭMgCl2、プロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ ＦＲＥＥ(Ro
che社製；1 tablet/50ml)を含む20ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ7.0で懸濁し、菌体破砕を超音波破砕装置(201M ultra
sonic oscillator，久保田製作所)を用いて180Ｗ、0℃
で8分間行った。破砕液を9000g、20分4℃で遠心を行
い、上清を粗酵素液として回収した。以後特に述べない
限りでは、緩衝液は1ｍＭ 2-メルカプトエタノール、1
ｍＭMgCl2を含む20ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を使用
した。(以降、緩衝液Ａ)
【００２６】２）硫安分画
粗酵素液について硫安分画を行い、0〜55％飽和画分の
沈殿を回収した。得られら沈殿を緩衝液Ａに溶解し、さ
らに同緩衝液にて透析した。
沈殿を回収した。得られら沈殿を緩衝液Ａに溶解し、さ
らに同緩衝液にて透析した。
【００２７】３）Blue-Sepharose カラムクロマトグラ
フィー 緩衝液Ａで平衡化した Blue-Sepharose(φ2.5mm×24mm)
に酵素液を供し、同緩衝液にて非吸着成分を洗い流した
ところ、酵素活性は未吸着画分に溶出された。
フィー 緩衝液Ａで平衡化した Blue-Sepharose(φ2.5mm×24mm)
に酵素液を供し、同緩衝液にて非吸着成分を洗い流した
ところ、酵素活性は未吸着画分に溶出された。
【００２８】４）DEAT-Toyopearl カラムクロマトグラ
フィー 緩衝液Ａで平衡化したDEAT-Toyopearl 650Ｍ（東ソー、
φ20mm×210mm）に、酵素液を吸着させた後、同緩衝液
にてカラムを洗浄した後、NaClの0〜0.8Ｍ濃度勾配に
て、カラムに結合した酵素を溶出した。溶出パターンを
図１に示す。
フィー 緩衝液Ａで平衡化したDEAT-Toyopearl 650Ｍ（東ソー、
φ20mm×210mm）に、酵素液を吸着させた後、同緩衝液
にてカラムを洗浄した後、NaClの0〜0.8Ｍ濃度勾配に
て、カラムに結合した酵素を溶出した。溶出パターンを
図１に示す。
【００２９】５）Hiload Superdex 200 pg FPLC カラム
クロマトグラフィー 活性画分を限外ろ過膜(旭化成ペンシル型モジュール；
分画分子量 6000)により濃縮後50ｍＭ NaClを含む緩衝
液Ａ（ｐＨ7.5）で平衡化したHiload Superdex200 pg(P
hamacia Biotech、φ16mm×600mm)に吸着させた。酵素
液は流速2ml/minにて溶出を行い、4ml/fractionにて分
取した。溶出パターンを図２に示す。
クロマトグラフィー 活性画分を限外ろ過膜(旭化成ペンシル型モジュール；
分画分子量 6000)により濃縮後50ｍＭ NaClを含む緩衝
液Ａ（ｐＨ7.5）で平衡化したHiload Superdex200 pg(P
hamacia Biotech、φ16mm×600mm)に吸着させた。酵素
液は流速2ml/minにて溶出を行い、4ml/fractionにて分
取した。溶出パターンを図２に示す。
【００３０】６）HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLC カ
ラムクロマトグラフィー 活性画分を5ｍＭ緩衝液Ａ（ｐＨ7.7）で限外ろ過膜にて
濃縮および透析を行い、同緩衝液にて平衡化した HAP-C
-BEADS hydroxypatite(Sangi社製)クロマトグラフィー
(Sangi、φ16mm×100mm)に吸着させた。同緩衝液を流速
2ml/minで洗浄後、0〜1Ｍの緩衝液Ａ(pH7.7)の直線濃度
勾配により溶出し、活性画分を集めた。溶出パターンを
図３に示す。
ラムクロマトグラフィー 活性画分を5ｍＭ緩衝液Ａ（ｐＨ7.7）で限外ろ過膜にて
濃縮および透析を行い、同緩衝液にて平衡化した HAP-C
-BEADS hydroxypatite(Sangi社製)クロマトグラフィー
(Sangi、φ16mm×100mm)に吸着させた。同緩衝液を流速
2ml/minで洗浄後、0〜1Ｍの緩衝液Ａ(pH7.7)の直線濃度
勾配により溶出し、活性画分を集めた。溶出パターンを
図３に示す。
【００３１】７）Pros HQ/M FPLC カラムクロマトグラ
フィー 限外ろ過法によって濃縮透析した酵素液を10ｍＭ緩衝液
Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M(PerSeptive Biosys
tems MA、USA、φ4.6mm×100mm)に吸着させた。カラム
を同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配によ
り、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、2ml/fractio
n)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パターンを図４
に示す。
フィー 限外ろ過法によって濃縮透析した酵素液を10ｍＭ緩衝液
Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M(PerSeptive Biosys
tems MA、USA、φ4.6mm×100mm)に吸着させた。カラム
を同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線濃度勾配によ
り、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、2ml/fractio
n)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パターンを図４
に示す。
【００３２】８）BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラ
フィー 活性画分を限外ろ過膜（アミコン centriprep；分画分
子量 6000）により濃縮透析し、緩衝液Ａ(pH7.0)にて平
衡化したBioAssistQ (東ソー、φ4.6mm×50mm)に吸着さ
せた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線
濃度勾配により、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、
1ml/fraction)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パ
ターンを図５に示す。
フィー 活性画分を限外ろ過膜（アミコン centriprep；分画分
子量 6000）により濃縮透析し、緩衝液Ａ(pH7.0)にて平
衡化したBioAssistQ (東ソー、φ4.6mm×50mm)に吸着さ
せた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M NaClの直線
濃度勾配により、タンパク質を溶出した(流速1ml/min、
1ml/fraction)。活性画分を集め酵素液とした。溶出パ
ターンを図５に示す。
【００３３】９）（２回目） Pros HQ/M FPLC カラム
クロマトグラフィー 活性画分を限外ろ過膜によりにより濃縮透析し、10mM緩
衝液Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M (φ4.6mm×100
mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M
NaClの直線濃度勾配により、たんぱく質を溶出した(流
速1ml/min、2ml/fraction)。活性画分を集め精製酵素と
した。溶出パターンを図６に示す。各精製の結果を表１
に示す。
クロマトグラフィー 活性画分を限外ろ過膜によりにより濃縮透析し、10mM緩
衝液Ａ(pH7.5)にて平衡化したPros HQ/M (φ4.6mm×100
mm)に吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄後、0〜0.8M
NaClの直線濃度勾配により、たんぱく質を溶出した(流
速1ml/min、2ml/fraction)。活性画分を集め精製酵素と
した。溶出パターンを図６に示す。各精製の結果を表１
に示す。
【００３４】＜表１＞
各精製時におけるタンパク質濃度は280nmにおける吸収
又はProtein Assay Kit(Bio Rad)を用い算出した。な
お、３−キヌクリジノン還元酵素の活性測定は必要に応
じて以下の２法により適宜実施した。
又はProtein Assay Kit(Bio Rad)を用い算出した。な
お、３−キヌクリジノン還元酵素の活性測定は必要に応
じて以下の２法により適宜実施した。
【００３５】（活性測定方法A）ガスクロマトグラフィ
ーを用いた活性測定 50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌク
リジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02
Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、酵素液を250μｌ
加え全量を1.0ｍｌとした。25℃、6時間の反応の後、6
Ｎの水酸化ナトリウム30μｌにより、ｐＨを12.0にして
反応を停止し、1-ブタノールにより生成物を抽出した
後、硫酸ナトリウムで脱水し測定サンプルを調整した。
キラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー（Hewlet
t Packard HP 6890 Series、CP-cyclodextrin-N19カラ
ム、0.25mmID×25m）により、生成したＲ-3-キヌクリジ
ノールを定量した。なお、1分間あたりに1ｎｍｏｌの3-
キヌクリジノンｍＭを生成する酵素活性量を1unitと定
義した。
ーを用いた活性測定 50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌク
リジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02
Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、酵素液を250μｌ
加え全量を1.0ｍｌとした。25℃、6時間の反応の後、6
Ｎの水酸化ナトリウム30μｌにより、ｐＨを12.0にして
反応を停止し、1-ブタノールにより生成物を抽出した
後、硫酸ナトリウムで脱水し測定サンプルを調整した。
キラルカラムを用いたガスクロマトグラフィー（Hewlet
t Packard HP 6890 Series、CP-cyclodextrin-N19カラ
ム、0.25mmID×25m）により、生成したＲ-3-キヌクリジ
ノールを定量した。なお、1分間あたりに1ｎｍｏｌの3-
キヌクリジノンｍＭを生成する酵素活性量を1unitと定
義した。
【００３６】（活性測定方法B）分光光学法を用いた活
性測定 50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、0.3ｍＭ ＮＡＤ
Ｈ、酵素液20μｌを加えブランク反応を確認した後、基
質である20ｍＭ 3-キヌクリジノンを添加して全量1.5ｍ
ｌとした。ＮＡＤＨの340ｎｍのおける吸収の減少を測
定し25℃で1分間あたりに1ｎｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ
＋に変換する酵素活性量を1unitと定義した。酵素の総
活性（Ｕ）は下記の計算式を用いて算出した。
性測定 50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、0.3ｍＭ ＮＡＤ
Ｈ、酵素液20μｌを加えブランク反応を確認した後、基
質である20ｍＭ 3-キヌクリジノンを添加して全量1.5ｍ
ｌとした。ＮＡＤＨの340ｎｍのおける吸収の減少を測
定し25℃で1分間あたりに1ｎｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ
＋に変換する酵素活性量を1unitと定義した。酵素の総
活性（Ｕ）は下記の計算式を用いて算出した。
【００３７】
＊6220：ＮＡＤＨの340ｎｍにおける分子吸光係数
【００３８】＜実施例３＞ アルコール脱水素酵素の安
定化剤の検討 本酵素の粗酵素を用い、図７に示す各種添加剤を1ｍＭ
になるように加え（一部濃度が異なる）、4℃中におけ
る0、12、24、48、60、216時間後の粗酵素の安定性を調
べた。酵素活性測定はA法により実施した。ＦＡＤ、Ｆ
ＭＮ、Pyridoxal-5’-phosphateの３添加剤については
0.1ｍＭになるよう加えた。その結果を図７に示す。
定化剤の検討 本酵素の粗酵素を用い、図７に示す各種添加剤を1ｍＭ
になるように加え（一部濃度が異なる）、4℃中におけ
る0、12、24、48、60、216時間後の粗酵素の安定性を調
べた。酵素活性測定はA法により実施した。ＦＡＤ、Ｆ
ＭＮ、Pyridoxal-5’-phosphateの３添加剤については
0.1ｍＭになるよう加えた。その結果を図７に示す。
【００３９】＜実施例４＞ アルコール脱水素酵素のミ
カエリス定数（Km）の測定 酵素量を一定にとし、ＮＡＤＨおよび３−キヌクリジノ
ン濃度を各々変化させて、それぞれにおける生成ＮＡＤ
＋の量を測定した。得られたデータについてLineweaver
-Burkの両逆数プロットを行うことでＮＡＤＨおよび３
−キヌクリジノンに対するKm値を算出した（図８および
９を参照）。３−キヌクリジノンおよびＮＡＤＨに対す
るKm値はそれぞれ7.5mMおよび9.0μMであった。
カエリス定数（Km）の測定 酵素量を一定にとし、ＮＡＤＨおよび３−キヌクリジノ
ン濃度を各々変化させて、それぞれにおける生成ＮＡＤ
＋の量を測定した。得られたデータについてLineweaver
-Burkの両逆数プロットを行うことでＮＡＤＨおよび３
−キヌクリジノンに対するKm値を算出した（図８および
９を参照）。３−キヌクリジノンおよびＮＡＤＨに対す
るKm値はそれぞれ7.5mMおよび9.0μMであった。
【００４０】＜実施例５＞ アルコール脱水素酵素の至
適ｐＨの検討 本酵素活性の至適pHの測定はは各100mMの酢酸ナトリウ
ムpH5.0〜6.0リン酸カリウムpH6.0〜7.5、Tris-HCl pH
7.5〜9.0、グリシン-KOH pH 9.0〜10.0の各緩衝液を使
用した。なお活性測定は活性測定方法Aよって行った。
結果を図10に示す。本酵素の３−キヌクリジノンに対す
る至適ｐHは7.5〜8.0付近であることが示された。
適ｐＨの検討 本酵素活性の至適pHの測定はは各100mMの酢酸ナトリウ
ムpH5.0〜6.0リン酸カリウムpH6.0〜7.5、Tris-HCl pH
7.5〜9.0、グリシン-KOH pH 9.0〜10.0の各緩衝液を使
用した。なお活性測定は活性測定方法Aよって行った。
結果を図10に示す。本酵素の３−キヌクリジノンに対す
る至適ｐHは7.5〜8.0付近であることが示された。
【００４１】＜実施例６＞ アルコール脱水素酵素の分
子量およびポリアクリルアミドゲル電気泳動 本酵素の分子量は、高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）を用い、以下の条件で検討した。カラムにTSK-GEL G
3000SW×X（東ソー株式会社）、溶離液に0.1M NaClを含
む0.1M リン酸緩衝液(pH7.0)を使用し、流速1.0ml/mi
n、で行った。溶出液を分別回収し、各画分における本
酵素の活性化のアッセイ結果によりR-3-キヌクリジノー
ルの溶出時間を求め、分子量マーカー(MW-Marker；オリ
エンタル酵母工業株式会社)の溶出時間と比較し分子量
を求めた。図11および12を参照。native 電気泳動は5〜
20％濃度勾配の電気泳動既製ゲルPAGEL(ATOO CORPORATI
ON)のを使用した。またSDS-PAGEは12.5％(w/v)ポリアク
リルアミドゲルを使用した。タンパク質の検出はクマジ
ーブリリアントブルーR-250を用いて行った。native-PA
GEおよびSDS-PAGEの結果をそれぞれ図13（A）および
（B）に示す。これらの結果から、本酵素の分子量は約2
20,000であることが示された。また、SDS-PAGEの結果よ
り、サブユニット分子量52,000の４量体と推定された。
子量およびポリアクリルアミドゲル電気泳動 本酵素の分子量は、高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）を用い、以下の条件で検討した。カラムにTSK-GEL G
3000SW×X（東ソー株式会社）、溶離液に0.1M NaClを含
む0.1M リン酸緩衝液(pH7.0)を使用し、流速1.0ml/mi
n、で行った。溶出液を分別回収し、各画分における本
酵素の活性化のアッセイ結果によりR-3-キヌクリジノー
ルの溶出時間を求め、分子量マーカー(MW-Marker；オリ
エンタル酵母工業株式会社)の溶出時間と比較し分子量
を求めた。図11および12を参照。native 電気泳動は5〜
20％濃度勾配の電気泳動既製ゲルPAGEL(ATOO CORPORATI
ON)のを使用した。またSDS-PAGEは12.5％(w/v)ポリアク
リルアミドゲルを使用した。タンパク質の検出はクマジ
ーブリリアントブルーR-250を用いて行った。native-PA
GEおよびSDS-PAGEの結果をそれぞれ図13（A）および
（B）に示す。これらの結果から、本酵素の分子量は約2
20,000であることが示された。また、SDS-PAGEの結果よ
り、サブユニット分子量52,000の４量体と推定された。
【００４２】＜実施例７＞ アルコール脱水素酵素の金
属塩の影響 表２に示す各種金属化合物を反応液へ１ｍＭになるよう
添加し、活性測定方法Aに従い、その影響を検討した。
ごくわずかであるがＭｇイオンにより活性化をうけた一
方、ＺｎＳＯ4では強い阻害が見られた。
属塩の影響 表２に示す各種金属化合物を反応液へ１ｍＭになるよう
添加し、活性測定方法Aに従い、その影響を検討した。
ごくわずかであるがＭｇイオンにより活性化をうけた一
方、ＺｎＳＯ4では強い阻害が見られた。
【００４３】＜表２＞
【００４４】＜実施例８＞ アルコール脱水素酵素の基
質特異性 表３に示す各種基質化合物を活性測定法Ｂに従い反応液
を調整し、その相対活性を検討した。
質特異性 表３に示す各種基質化合物を活性測定法Ｂに従い反応液
を調整し、その相対活性を検討した。
【００４５】＜表３＞
【００４６】＜実施例９＞ アルコール脱水素酵素のN
末端アミノ酸配列の解析 精製酵素を定法に従い、N末端アミノ酸配列を決定し
た。具体的には、SDS-PAGEにて分離した精製酵素を電気
的にポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜にブロッ
トした。PVDF膜に吸着した酵素蛋白質のＮ末配列をエド
マン分解法により、アプライドバイオシステム社製のPr
ocise491シ-ケンサを使用して決定した。その結果、以
下に示す配列が確認された。
末端アミノ酸配列の解析 精製酵素を定法に従い、N末端アミノ酸配列を決定し
た。具体的には、SDS-PAGEにて分離した精製酵素を電気
的にポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜にブロッ
トした。PVDF膜に吸着した酵素蛋白質のＮ末配列をエド
マン分解法により、アプライドバイオシステム社製のPr
ocise491シ-ケンサを使用して決定した。その結果、以
下に示す配列が確認された。
【００４７】N末端アミノ酸配列：ＰＥＡＳＡＮＩＧＶ
ＶＧＬＡＭＧＳＮＬＡ
ＶＧＬＡＭＧＳＮＬＡ
【００４８】＜実施例10＞ アルコール脱水素酵素によ
るＲ−３−キヌクリジノールの合成 50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌク
リジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02
Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、精製酵素液を250
μｌ加え全量を1.0ｍｌとした。この反応液を25℃で反
応させた。経時的にＲ−３−キヌクリジノールの生成量
および光学純度を定量した。定量はキラルカラムを用い
たガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard HP 6890
Series、CP-cyclodextrin-N19カラム、0.25mmID×25m）
により実施した。生成量の経時変化を図14に示す。尚、
光学純度はＲ体100％eeであった。
るＲ−３−キヌクリジノールの合成 50ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に、10ｍＭ 3-キヌク
リジノン、ギ酸脱水酵素（ＦＤＨ、Roche社製）0.02
Ｕ、ギ酸200ｍＭ、ＮＡＤＨ0.5ｍＭ、精製酵素液を250
μｌ加え全量を1.0ｍｌとした。この反応液を25℃で反
応させた。経時的にＲ−３−キヌクリジノールの生成量
および光学純度を定量した。定量はキラルカラムを用い
たガスクロマトグラフィー（Hewlett Packard HP 6890
Series、CP-cyclodextrin-N19カラム、0.25mmID×25m）
により実施した。生成量の経時変化を図14に示す。尚、
光学純度はＲ体100％eeであった。
【００４９】
【図１】 DEAT-Toyopearl カラムクロマトグラフィー
の溶出パターンを示す図である。
の溶出パターンを示す図である。
【図２】 Hiload Superdex 200 pg FPLC カラムクロマ
トグラフィーの溶出パターンを示す図である。
トグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図３】 HAP-C-BEADA hydroxyapatite FPLCカラムク
ロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
ロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。
【図４】 Pros HQ/M FPLCカラムクロマトグラフィーの
溶出パターンを示す図である。
溶出パターンを示す図である。
【図５】 BioAssistQ FPLCカラムクロマトグラフィー
の溶出パターンを示す図である。
の溶出パターンを示す図である。
【図６】 （２回め）Pros HQ/M FPLC カラムクロマト
グラフィーカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図である。
グラフィーカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図である。
【図７】 アルコール脱水素酵素の安定化剤の検討結果
を示す図である。
を示す図である。
【図８】 アルコール脱水素酵素の３−キヌクリジノン
に対するミカエリス定数（Km）の測定結果を示す図であ
る。
に対するミカエリス定数（Km）の測定結果を示す図であ
る。
【図９】 アルコール脱水素酵素のＮＡＤＨに対するミ
カエリス定数（Km）の測定結果を示す図である。
カエリス定数（Km）の測定結果を示す図である。
【図10】 アルコール脱水素酵素の至適ｐＨの検討結果
を示す図である。
を示す図である。
【図11】 アルコール脱水素酵素の高速液体クロマトグ
ラフィー溶出パターンを示す図である。
ラフィー溶出パターンを示す図である。
【図12】 高速液体クロマトグラフィーによる標準蛋白
質の検量線およびアルコール脱水素酵素の分子量測定結
果を示す図である。
質の検量線およびアルコール脱水素酵素の分子量測定結
果を示す図である。
【図13】 （A）は精製アルコール脱水素酵素のnative-
PAGEにおけるパターンを示す図である。（B）は精製ア
ルコール脱水素酵素のSDS-PAGEにおけるパターンを示す
図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製
アルコール脱水素酵素を示す。
PAGEにおけるパターンを示す図である。（B）は精製ア
ルコール脱水素酵素のSDS-PAGEにおけるパターンを示す
図である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は精製
アルコール脱水素酵素を示す。
【図14】 アルコール脱水素酵素を用いたＲ−３−キヌ
クリジノールの生成量の経時変化結果を示す図である。
クリジノールの生成量の経時変化結果を示す図である。
【００５０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Mitsubishi Rayon Co., LTD.
<120> Alcohol dehydrogenase
<130> p140379000
<140>
<141>
<160> 1
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Microbacterium luteolum
<400> 1
Pro Glu Ala Ser Ala Asn Ile Gly Val Val Gly Leu Ala Met Gly Ser
1 5 10 15
Asn Leu Ala
19
【００５１】
【発明の効果】本発明により、医農薬合成中間体として
重要なＲ−３−キヌクリジノールの製造能を有する有用
なアルコール脱水素酵素が提供されるとともに、それら
を利用してに効率的な生産が可能となる。
重要なＲ−３−キヌクリジノールの製造能を有する有用
なアルコール脱水素酵素が提供されるとともに、それら
を利用してに効率的な生産が可能となる。
Claims (4)
- 【請求項１】 次の（１）および（２）に示す理化学的
性質を有するアルコール脱水素酵素。 （1） ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド）を補酵素として、３−キヌクリジノンある
いはその塩を還元し、Ｒ−３−キヌクリジノールを生成
する。 （2） ３−キヌクリジノンを基質とした場合の至適ｐ
Ｈが7.0から9.0の範囲内にある。 - 【請求項２】 分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場
合約52,000であり、ゲル濾過で測定した場合約220,000
である請求項１記載のアルコール脱水素酵素。 - 【請求項３】 ミクロバクテリウム（Microbacterium）
属に属する微生物より産生される請求項１または２記載
のアルコール脱水素酵素。 - 【請求項４】 請求項１〜３に記載の酵素、該酵素を産
生する微生物または、形質転換微生物もしくはそれらの
処理物を３−キヌクリジノンあるいはその塩に作用させ
することを特徴とするＲ−３−キヌクリジノールまたは
その塩の製造方法。
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|---|---|---|---|---|
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| JP2008212144A (ja) * | 2007-02-08 | 2008-09-18 | Nagase & Co Ltd | アルコール脱水素酵素、これをコードする遺伝子、およびそれを用いた光学活性（ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 |
| WO2010123062A1 (ja) | 2009-04-23 | 2010-10-28 | 株式会社カネカ | (ｒ)-３-キヌクリジノールの製造方法 |
| JP2011147349A (ja) * | 2010-01-19 | 2011-08-04 | Toyama Prefecture | キヌクリジノン還元酵素及びそれを用いた光学活性３−キヌクリジノールの製造方法 |
| JP2011205921A (ja) * | 2010-03-29 | 2011-10-20 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換体及びそれを用いた光学活性（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 |
| JP2016517690A (ja) * | 2013-04-30 | 2016-06-20 | カンブレックス、イーエーペー、ゲゼルシャフト、ミット、ベシュレンクテル、ハフツングＣａｍｂｒｅｘ Ｉｅｐ Ｇｍｂｈ | （ｒ）−３−キヌクリジノールの製造のための生体触媒法 |
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2002
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Cited By (8)
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| JP2002153293A (ja) * | 2000-11-21 | 2002-05-28 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 光学活性３−キヌクリジノールの製造法 |
| JP2008212144A (ja) * | 2007-02-08 | 2008-09-18 | Nagase & Co Ltd | アルコール脱水素酵素、これをコードする遺伝子、およびそれを用いた光学活性（ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 |
| WO2010123062A1 (ja) | 2009-04-23 | 2010-10-28 | 株式会社カネカ | (ｒ)-３-キヌクリジノールの製造方法 |
| EP2423320A1 (en) * | 2009-04-23 | 2012-02-29 | Kaneka Corporation | Process for production of (r)-3-quinuclidinol |
| EP2423320A4 (en) * | 2009-04-23 | 2013-07-31 | Kaneka Corp | PROCESS FOR PRODUCING (R) -3-QUINUCLIDINOL |
| JP2011147349A (ja) * | 2010-01-19 | 2011-08-04 | Toyama Prefecture | キヌクリジノン還元酵素及びそれを用いた光学活性３−キヌクリジノールの製造方法 |
| JP2011205921A (ja) * | 2010-03-29 | 2011-10-20 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換体及びそれを用いた光学活性（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 |
| JP2016517690A (ja) * | 2013-04-30 | 2016-06-20 | カンブレックス、イーエーペー、ゲゼルシャフト、ミット、ベシュレンクテル、ハフツングＣａｍｂｒｅｘ Ｉｅｐ Ｇｍｂｈ | （ｒ）−３−キヌクリジノールの製造のための生体触媒法 |
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